JPWO2021081423A5

JPWO2021081423A5 -

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Publication number: JPWO2021081423A5
Application number: JP2022521657A
Authority: JP
Publication date: 2023-10-30

Description

別段の具体的な指示がない限り、本発明の任意の特徴、工程、要素、実施形態、または態様を、任意の他のものと組み合わせて使用することができる。本発明は、明確にする目的および理解させる目的で例証および例示としていくらか詳細に記載されてきたが、添付の特許請求の範囲の範囲内である特定の変更および改変が行われ得ることが明らかであろう。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
部分的に二本鎖のＤＮＡ断片を修復する方法であって、
（ａ）前記部分的に二本鎖のＤＮＡ断片をプライマー集団の１または複数のプライマーと接触させる工程であって、ここで、前記部分的に二本鎖のＤＮＡ断片が３’オーバーハングを含み、前記プライマー集団がランダム標的ハイブリッド形成配列を含む、工程；
（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼを使用して前記ＤＮＡ断片に沿って前記プライマー集団の１または複数のプライマーを伸長させる工程であって、それにより、前記ＤＮＡ断片にアニーリングした１または複数の伸長したプライマーが産生される、工程；および
（ｃ）１または複数の伸長したプライマーの３’末端を、伸長したプライマーまたは部分的に二本鎖のＤＮＡ断片の鎖の５’末端にライゲートする工程であって、それにより、修復されたＤＮＡ断片が得られる、工程
を含む、方法。
（項目２）
前記ＤＮＡポリメラーゼが３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠く、先行する項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目３）
前記ＤＮＡポリメラーゼが５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く、先行する項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目４）
前記ＤＮＡポリメラーゼが鎖置換活性を欠く、先行する項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目５）
前記ＤＮＡポリメラーゼがクレノウ断片である、先行する項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目６）
前記ＤＮＡポリメラーゼがエキソ－クレノウ断片である、直前の項目に記載の方法。
（項目７）
前記部分的に二本鎖のＤＮＡ断片が、各末端に３’オーバーハングを有する、先行する項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目８）
前記部分的に二本鎖のＤＮＡ断片が、３’オーバーハングおよび（ｉ）平滑末端または（ｉｉ）５’オーバーハングを有する、先行する項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目９）
前記５’オーバーハングが、前記５’オーバーハングに沿って前記３’末端を伸長させることによって修復される、直前の項目に記載の方法。
（項目１０）
前記部分的に二本鎖のＤＮＡ断片が、体液試料に由来する、先行する項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１）
前記体液が、全血、血清、血漿、または尿である、直前の項目に記載の方法。
（項目１２）
前記部分的に二本鎖のＤＮＡ断片がｃｆＤＮＡ断片である、先行する項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目１３）
前記部分的に二本鎖のＤＮＡ断片が哺乳動物由来である、先行する項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目１４）
前記部分的に二本鎖のＤＮＡ断片がヒト由来である、先行する項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目１５）
前記部分的に二本鎖のＤＮＡ断片が、組成物中のＤＮＡ断片集団の一部である、先行する項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目１６）
前記ＤＮＡ断片集団が剪断されたＤＮＡを含む、直前の項目に記載の方法。
（項目１７）
前記ＤＮＡ断片集団が、後成的に改変されたＤＮＡを含む、項目１５または１６に記載の方法。
（項目１８）
前記ＤＮＡ断片集団が、複数のゲノム遺伝子座由来の断片を含む、項目１５～１７のいずれか１項に記載の方法。
（項目１９）
前記ＤＮＡ断片集団が富化されていない、項目１５～１８のいずれか１項に記載の方法。
（項目２０）
前記ＤＮＡ断片集団が増幅されていない、項目１５～１９のいずれか１項に記載の方法。
（項目２１）
前記ランダム標的ハイブリッド形成配列の長さが、少なくとも４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドである、先行する項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目２２）
前記ランダム標的ハイブリッド形成配列の長さが、約４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２ヌクレオチドである、先行する項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目２３）
前記プライマー集団のプライマーが一本鎖である、先行する項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目２４）
前記プライマー集団のプライマーが３’オーバーハングを有する二本鎖であり、前記ランダム標的ハイブリッド形成配列が前記３’オーバーハング中に存在する、項目１～２０のいずれか１項に記載の方法。
（項目２５）
前記プライマー集団のプライマーが３’オーバーハングを有するヘアピンであり、前記ランダム標的ハイブリッド形成配列が前記３’オーバーハング中に存在する、項目１～２０のいずれか１項に記載の方法。
（項目２６）
前記プライマーのヘアピンまたは二本鎖領域がアダプターを含む、項目２１～２２のいずれか１項に記載の方法。
（項目２７）
前記プライマーのヘアピンまたは二本鎖領域がタグを含む、項目２１～２３のいずれか１項に記載の方法。
（項目２８）
前記タグがバーコードを含む、項目２４に記載の方法。
（項目２９）
前記プライマー集団が、複数の異なるバーコードを含む、項目２５に記載の方法。
（項目３０）
少なくとも工程（ａ）～（ｃ）を単一の管内で行う、先行する項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目３１）
前記二本鎖ＤＮＡ断片が組成物中に存在し、少なくとも工程（ａ）～（ｃ）について、構成要素が組成物から除去されない、先行する項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目３２）
前記修復されたＤＮＡ断片が１つまたは２つの平滑末端を含むか、前記方法が、前記修復されたＤＮＡ断片の１つまたは２つの末端を平滑末端化する工程をさらに含む、先行する項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目３３）
前記平滑末端化された核酸の３’末端にヌクレオチドを非テンプレート指向性に付加するポリメラーゼを使用して、修復されたＤＮＡ断片を末端テーリングする工程をさらに含み、必要に応じて、ＡがＧより優先され、ＧがＣまたはＴより優先されて付加される、直前の項目に記載の方法。
（項目３４）
前記修復されたＤＮＡ断片に（必要に応じて両端に）タグをライゲートする工程をさらに含み、必要に応じて、前記タグがバーコードおよび／またはアダプターを含む、先行する項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目３５）
前記修復されたＤＮＡ断片を精製する工程をさらに含む、先行する項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目３６）
工程（ｂ）および／または（ｃ）後に工程（ｂ）および／または（ｃ）で使用した１または複数の酵素を変性させる工程をさらに含む、先行する項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目３７）
前記修復されたＤＮＡ断片を増幅する工程をさらに含む、先行する項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目３８）
前記修復されたＤＮＡ断片が１または複数のアダプター（例えば、２つのアダプター）を含み、前記修復されたＤＮＡ断片を増幅する工程に前記１または複数のアタプターにアニーリングする１または複数の（例えば、２つの）増幅オリゴマーを使用する、直前の項目に記載の方法。
（項目３９）
前記修復されたＤＮＡ断片を目的の断片について富化する工程であって、それにより富化されたＤＮＡ断片が得られる、工程をさらに含み、必要に応じて、前記富化する工程を増幅する工程後に行う、先行する項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目４０）
前記目的の断片が、疾患または障害に関連する様式によって変動する遺伝子座を含み、必要に応じて、前記疾患または障害が癌である、直前の項目に記載の方法。
（項目４１）
前記変動が、一ヌクレオチド変動、コピー数変動、遺伝子融合、またはインデルのうちの１つまたは複数である、直前の項目に記載の方法。
（項目４２）
前記目的の断片が、疾患または障害に関連する一ヌクレオチド変動；疾患または障害に関連するコピー数の変動；疾患または障害に関連する遺伝子融合；または疾患または障害に関連するインデルを示すフラグメントのうちの１つ、２つ，３つ，または４つを含み、必要に応じて、前記疾患または障害が癌である、直前の項目に記載の方法。
（項目４３）
前記富化されたＤＮＡ断片を増幅する工程をさらに含む、項目３６～３９のいずれか１項に記載の方法。
（項目４４）
前記修復されたＤＮＡ断片を配列決定する工程をさらに含む、先行する項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目４５）
前記配列決定する工程が、部分的に二本鎖のＤＮＡ断片中に３’オーバーハングを形成したヌクレオチドを配列決定する、直前の項目に記載の方法。
（項目４６）
前記配列決定する工程がハイスループット配列決定である、項目４１または４２に記載の方法。
（項目４７）
複数の修復されたＤＮＡ断片が生成され、前記修復されたＤＮＡ断片の少なくとも一部がタグを含み、前記配列決定する工程が複数の修復されたＤＮＡ断片から複数の配列リードを生成する、項目４４～４６のいずれか１項に記載の方法。
（項目４８）
前記配列リードが、前記部分的に二本鎖のＤＮＡ断片中に３’オーバーハングを形成したヌクレオチドの配列およびタグの配列を含む、項目４７に記載の方法。

Claims

部分的に二本鎖のＤＮＡ断片を修復する方法であって、
（ａ）前記部分的に二本鎖のＤＮＡ断片をプライマー集団の１または複数のプライマーと接触させる工程であって、ここで、前記部分的に二本鎖のＤＮＡ断片が３’オーバーハングを含み、前記プライマー集団がランダム標的ハイブリッド形成配列を含む、工程；
（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼを使用して前記ＤＮＡ断片に沿って前記プライマー集団の１または複数のプライマーを伸長させる工程であって、それにより、前記ＤＮＡ断片にアニーリングした１または複数の伸長したプライマーが産生される、工程；および
（ｃ）１または複数の伸長したプライマーの３’末端を、伸長したプライマーまたは部分的に二本鎖のＤＮＡ断片の鎖の５’末端にライゲートする工程であって、それにより、修復されたＤＮＡ断片が得られる、工程
を含む、方法。
前記ＤＮＡポリメラーゼが、
ａ）３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠く；
ｂ）５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く；
ｃ）鎖置換活性を欠く；かつ／または
ｄ）クレノウ断片であり、例えば前記ＤＮＡポリメラーゼがエキソ－クレノウ断片である、
請求項１に記載の方法。
前記部分的に二本鎖のＤＮＡ断片が、
ａ）各末端に３’オーバーハングを有する；
ｂ）３’オーバーハングおよび（ｉ）平滑末端または（ｉｉ）５’オーバーハングを有し、例えば前記５’オーバーハングが、前記５’オーバーハングに沿って前記３’末端を伸長させることによって修復される；
ｃ）体液試料に由来し、例えば前記体液が、全血、血清、血漿、または尿である；
ｄ）ｃｆＤＮＡ断片である；
ｅ）哺乳動物である；
ｆ）ヒトである；かつ／または
ｇ）組成物中のＤＮＡ断片集団の一部であり、例えば前記ＤＮＡ断片集団が、
ｉ）剪断されたＤＮＡを含み；
ｉｉ）後成的に改変されたＤＮＡを含み；
ｉｉｉ）複数のゲノム遺伝子座由来の断片を含み；
ｉｖ）富化されていない；かつ／もしくは
ｖ）増幅されていない、
請求項１または請求項２に記載の方法。
前記ランダム標的ハイブリッド形成配列が、
ａ）少なくとも４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドの長さである；かつ／または
ｂ）約４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２ヌクレオチドの長さである、
先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
前記プライマー集団のプライマーが、
ａ）一本鎖である；
ｂ）３’オーバーハングを有する二本鎖であり、前記ランダム標的ハイブリッド形成配列が前記３’オーバーハング中に存在する；
ｃ）３’オーバーハングを有するヘアピンであり、前記ランダム標的ハイブリッド形成配列が前記３’オーバーハング中に存在する、
先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
前記プライマーのヘアピンまたは二本鎖領域が、
ａ）アダプターを含む；かつ／または
ｂ）タグを含み、必要に応じて前記タグがバーコードを含み、例えば前記プライマー集団が、複数の異なるバーコードを含む、
請求項５に記載の方法。
少なくとも工程（ａ）～（ｃ）を単一の管内で行う、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
前記二本鎖ＤＮＡ断片が組成物中に存在し、少なくとも工程（ａ）～（ｃ）について、構成要素が前記組成物から除去されない、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
前記修復されたＤＮＡ断片が１つまたは２つの平滑末端を含むか、前記方法が、前記修復されたＤＮＡ断片の１つまたは２つの末端を平滑末端化する工程をさらに含み；必要に応じて前記平滑末端化された核酸の３’末端にヌクレオチドを非テンプレート指向性に付加するポリメラーゼを使用して、修復されたＤＮＡ断片を末端テーリングする工程をさらに含み、必要に応じて、ＡがＧより優先され、ＧがＣまたはＴより優先されて付加される、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
ａ）前記修復されたＤＮＡ断片に（必要に応じて両端に）タグをライゲートする工程をさらに含み、必要に応じて、前記タグがバーコードおよび／またはアダプターを含む；
ｂ）前記修復されたＤＮＡ断片を精製する工程をさらに含む；
ｃ）工程（ｂ）および／または（ｃ）後に工程（ｂ）および／または（ｃ）で使用した１または複数の酵素を変性させる工程をさらに含む；かつ／または
ｄ）前記修復されたＤＮＡ断片を増幅する工程をさらに含み、例えば前記修復されたＤＮＡ断片が１または複数のアダプター（例えば、２つのアダプター）を含み、前記修復されたＤＮＡ断片を増幅する工程に前記１または複数のアタプターにアニーリングする１または複数の（例えば、２つの）増幅オリゴマーを使用する、
先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
前記修復されたＤＮＡ断片を目的の断片について富化する工程であって、それにより富化されたＤＮＡ断片が得られる、工程をさらに含み、必要に応じて、前記富化する工程を増幅する工程後に行う、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
ａ）前記目的の断片が、疾患または障害に関連する様式によって変動する遺伝子座を含み、必要に応じて、前記疾患または障害が癌であり；必要に応じて前記変動が、一ヌクレオチド変動、コピー数変動、遺伝子融合、またはインデルのうちの１つまたは複数である；かつ／または
ｂ）前記目的の断片が、疾患または障害に関連する一ヌクレオチド変動；疾患または障害に関連するコピー数の変動；疾患または障害に関連する遺伝子融合；または疾患または障害に関連するインデルを示すフラグメントのうちの１つ、２つ，３つ，または４つを含み、必要に応じて、前記疾患または障害が癌である、
請求項１１に記載の方法。
前記富化されたＤＮＡ断片を増幅する工程をさらに含む、請求項１１または請求項１２に記載の方法。
前記修復されたＤＮＡ断片を配列決定する工程をさらに含み、必要に応じて
ａ）前記配列決定する工程が、部分的に二本鎖のＤＮＡ断片中に３’オーバーハングを形成したヌクレオチドを配列決定する；
ｂ）前記配列決定する工程がハイスループット配列決定である；かつ／または
ｃ）複数の修復されたＤＮＡ断片が生成され、前記修復されたＤＮＡ断片の少なくとも一部がタグを含み、前記配列決定する工程が複数の修復されたＤＮＡ断片から複数の配列リードを生成し；例えば前記配列リードが、前記部分的に二本鎖のＤＮＡ断片中に３’オーバーハングを形成したヌクレオチドの配列およびタグの配列を含む、
先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。