JP6560088B2 - プライマーの設計方法、dna増幅方法および解析方法 - Google Patents
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Description
[1]PCR反応に供するプライマーの設計方法であって、
プライマーの5’末端側の塩基配列が、プライマーを用いたPCR反応によって得られる増幅産物をシークエンスして得られる塩基配列情報から増幅産物中のDNA分子がPCR反応におけるサーマルサイクルのNサイクル目に合成されたものであるかを特定する塩基配列またはその相補的な塩基配列を含んで、プライマーの5’末端側の塩基配列を規定するプライマー設計工程
を備え、Nは3以上の整数であり、
プライマー設計工程は、
プライマーが第N回目のサーマルサイクルで使用するプライマーであって、
第1回目のサーマルサイクルで使用するプライマー設計工程において、増幅対象DNA中の増幅対象領域の3’末端側と相補的に結合する塩基配列からなる相補DNA部分を規定し、増幅対象領域と相補的に結合しない塩基配列からなる非相補DNA部分を規定し、相補DNA部分の5’末端に非相補DNA部分を連結することを含み、
第2回目のサーマルサイクルで使用するプライマー設計工程において、増幅対象DNA中の増幅対象領域の3’末端側と相補的に結合する塩基配列からなる相補DNA部分を規定し、第1回目のサーマルサイクルで使用するプライマーの非相補DNA部分の塩基配列とは相違し、かつ、増幅対象領域と相補的に結合しない塩基配列からなる非相補DNA部分を規定し、相補DNA部分の5’末端に非相補DNA部分を連結することを含み、
第N回目のサーマルサイクルで使用するプライマー設計工程において、第N−2回目のサーマルサイクルで使用するプライマーの5’末端側の非相補DNA部分の塩基配列からなる相補DNA部分を規定し、第1回目から第N−1回目までのサーマルサイクルで使用するプライマーの5’末端側の非相補DNA部分の塩基配列のいずれとも相違し、かつ、増幅対象領域と相補的に結合しない塩基配列からなる非相補DNA部分を規定し、相補DNA部分の5’末端に非相補DNA部分を連結することを含む、PCR反応に供するプライマーの設計方法。
[2]上記[1]に記載のプライマー設計工程を含み、プライマー設計工程で設計されたプライマーセットをPCR反応に供する、DNA増幅方法。
[3]上記[1]に記載のプライマー設計工程を含み、プライマー設計工程で設計されたプライマーセットをPCR反応に供して複数の領域を増幅して得られた増幅産物の塩基配列情報の解析方法であって、
領域毎のカバレッジを、増幅産物のPCR成功回数によって補正する
ことを特徴とする解析方法。
[4]上記[1]に記載のプライマー設計工程を含み、プライマー設計工程で設計されたプライマーセットをPCR反応に供して少なくとも1つの座位を含む領域を増幅して得られた増幅産物の塩基配列情報の解析方法であって、
アレル毎のカバレッジを、増幅産物のPCR成功回数によって補正する
ことを特徴とする解析方法。
[5]プライマー設計工程を含み、プライマー設計工程で設計されたプライマーセットをPCR反応に供して複数の領域を増幅して得られた増幅産物の塩基配列情報の解析方法であって、
領域毎のカバレッジを、増幅産物のPCR成功回数によって補正する
ことを特徴とする解析方法であって、
プライマー設計工程は、
プライマーの5’末端側の塩基配列が、プライマーを用いたPCR反応によって得られる増幅産物をシークエンスして得られる塩基配列情報から増幅産物中のDNA分子がPCR反応におけるサーマルサイクルの第N又は第N+1サイクル目に合成されたものであるかを特定する塩基配列またはその相補的な塩基配列を含んで、プライマーの5’末端側の塩基配列を規定することを含み、Nは3以上の奇数であり、
プライマーが第N回目および第N+1回目のサーマルサイクルで使用するプライマーであって、
第1回目および第2回目のサーマルサイクルで使用するプライマーの設計工程において、増幅対象DNA中の増幅対象領域の3’末端側と相補的に結合する塩基配列からなる相補DNA部分を規定し、増幅対象領域と相補的に結合しない塩基配列からなる非相補DNA部分を規定し、相補DNA部分の5’末端に非相補DNA部分を連結することを含み、
第N回目および第N+1回目のサーマルサイクルで使用するプライマーの設計工程において、第N−2回目および第N−1回目のサーマルサイクルで使用するプライマーの5’末端側の非相補DNA部分の塩基配列からなる相補DNA部分を規定し、第1回目から第N−2回目および第N−1回目までのサーマルサイクルで使用するプライマーの5’末端側の非相補DNA部分の塩基配列のいずれとも相違し、かつ、増幅対象領域と相補的に結合しない塩基配列からなる非相補DNA部分を規定し、相補DNA部分の5’末端に非相補DNA部分を連結することを含む、
解析方法。
[6]プライマー設計工程を含み、プライマー設計工程で設計されたプライマーセットをPCR反応に供して少なくとも1つの座位を含む領域を増幅して得られた増幅産物の塩基配列情報の解析方法であって、
アレル毎のカバレッジを、増幅産物のPCR成功回数によって補正する
ことを特徴とする解析方法であって、
プライマー設計工程は、
プライマーの5’末端側の塩基配列が、プライマーを用いたPCR反応によって得られる増幅産物をシークエンスして得られる塩基配列情報から増幅産物中のDNA分子がPCR反応におけるサーマルサイクルの第N又は第N+1サイクル目に合成されたものであるかを特定する塩基配列またはその相補的な塩基配列を含んで、プライマーの5’末端側の塩基配列を規定することを含み、Nは3以上の奇数であり、
プライマーが第N回目および第N+1回目のサーマルサイクルで使用するプライマーであって、
第1回目および第2回目のサーマルサイクルで使用するプライマーの設計工程において、増幅対象DNA中の増幅対象領域の3’末端側と相補的に結合する塩基配列からなる相補DNA部分を規定し、増幅対象領域と相補的に結合しない塩基配列からなる非相補DNA部分を規定し、相補DNA部分の5’末端に非相補DNA部分を連結することを含み、
第N回目および第N+1回目のサーマルサイクルで使用するプライマーの設計工程において、第N−2回目および第N−1回目のサーマルサイクルで使用するプライマーの5’末端側の非相補DNA部分の塩基配列からなる相補DNA部分を規定し、第1回目から第N−2回目および第N−1回目までのサーマルサイクルで使用するプライマーの5’末端側の非相補DNA部分の塩基配列のいずれとも相違し、かつ、増幅対象領域と相補的に結合しない塩基配列からなる非相補DNA部分を規定し、相補DNA部分の5’末端に非相補DNA部分を連結することを含む、
解析方法。
〈SNP〉SNP(single nucleotide polymorphism;一塩基多型)とは、ある生物種集団のゲノム塩基配列中に見られる1塩基が変異した多様性であって、その変異が集団内で1%以上の頻度で見られるものをいう。
本発明のプライマー設計方法は、上記プライマーの5’末端側の塩基配列が、上記プライマーを用いたPCR反応によって得られる増幅産物をシークエンスして得られる塩基配列情報から上記増幅産物中のDNA分子が上記PCR反応におけるサーマルサイクルの何サイクル目に合成されたものであるかを特定する塩基配列またはその相補的な塩基配列を含んで、上記プライマーの5’末端側の塩基配列を規定するプライマー設計工程を備える。
本発明のプライマーは、上述した本発明のプライマー設計方法に従って設計された、PCR反応に供するプライマーである。
本発明のDNA増幅方法は、上述した本発明のプライマーセットをPCR反応に供する、DNA増幅方法である。
以下に、これら3態様のそれぞれについて説明する。
以下、適宜、図1を参照しながら説明する。
PCR反応の1サイクル目(図1のAを参照)では、ゲノムDNAを増幅対象DNA(鋳型DNA)として用いて、これに対して、増幅対象DNAの第1ストランドの増幅対象領域にアニーリングする塩基配列A0(図1中では「A0」と表記する。)からなる相補DNA部分と、その相補DNA部分の5’末端に連結し、かつ、増幅対象領域にアニーリングしない塩基配列A1(図1中では「A1」と表記する。)からなる非相補DNA部分とから構成されるプライマーF1(図1中では「プライマーF1」と表記する。)、および、増幅対象DNAの第2ストランドの増幅対象領域にアニーリングする塩基配列B0(図1中では「B0」と表記する。)からなる相補DNA部分と、その相補DNA部分の5’末端に連結し、かつ、増幅対象領域にアニーリングしない塩基配列B1(図1中では「B1」と表記する。)とから構成されるプライマーR1(図1中では「プライマーR1」と表記する。)からなるプライマーセットを用いる。
また、PCR反応の2(i+1)サイクル目で合成されたDNA分子とPCR反応の2(i+1)+1サイクル目で合成されたDNA分子とは、後者が5’末端にプライマーの非相補DNA部分の塩基配列Ai+2、Bi+2に由来する塩基配列を有することにより区別することができる。
また、合成されたDNA分子のそれぞれが何サイクル目で合成されたものであるかを特定することができるので、増幅対象領域の最大PCR回数を特定することもできる。
以下、適宜、図2を参照しながら説明する。
PCR反応の1サイクル目(図2のAを参照)では、ゲノムDNAを増幅対象DNA(鋳型DNA)として用いて、これに対して、増幅対象DNAの第1ストランドの増幅対象領域にアニーリングする塩基配列A0(図2中では「A0」と表記する。)からなる相補DNA部分と、その相補DNA部分の5’末端に連結し、かつ、増幅対象領域にアニーリングしない塩基配列A1(図2中では「A1」と表記する。)からなる非相補DNA部分とから構成されるプライマーF1(図2中では「プライマーF1」と表記する。)、および、増幅対象DNAの第2ストランドの増幅対象領域にアニーリングする塩基配列B0(図2中では「B0」と表記する。)からなる相補DNA部分と、その相補DNA部分の5’末端に連結し、かつ、増幅対象領域にアニーリングしない塩基配列B1(図2中では「B1」と表記する。)とから構成されるプライマーR1(図2中では「プライマーR1」と表記する。)からなるプライマーセットを用いる。
また、合成されたDNA分子のそれぞれが何サイクル目で合成されたものであるかを特定することができるので、増幅対象領域の最大PCR回数を特定することもできる。
以下、適宜、図3を参照しながら説明する。
PCR反応の1サイクル目(図3のAを参照)では、ゲノムDNAを増幅対象DNA(鋳型DNA)として用いて、これに対して、増幅対象DNAの第1ストランドの増幅対象領域にアニーリングする塩基配列A0(図3中では「A0」と表記する。)からなる相補DNA部分と、その相補DNA部分の5’末端に連結し、かつ、増幅対象領域にアニーリングしない塩基配列A1(図3中では「A1」と表記する。)からなる非相補DNA部分とから構成されるプライマーF1(図3中では「プライマーF1」と表記する。)、および、増幅対象DNAの第2ストランドの増幅対象領域にアニーリングする塩基配列B0(図3中では「B0」と表記する。)からなる相補DNA部分から構成されるプライマーR0(図3中では「プライマーR0」と表記する。)からなるプライマーセットを用いる。
また、合成されたDNA分子のそれぞれが何サイクル目で合成されたものであるかを特定することができるので、増幅対象領域の最大PCR回数を特定することもできる。
本発明の解析方法の一態様は、本発明のプライマーセットをPCR反応に供して複数の領域を増幅して得られた増幅産物の塩基配列情報の解析方法であって、領域毎のカバレッジを、上記増幅産物のPCR成功回数によって補正することを特徴とする解析方法である。
複数の領域をマルチプレックスPCRによって増幅し、次世代シーケンサを用いてシーケンスを行った場合、領域毎にカバレッジ(シーケンスのリード数)が異なる場合がある。
この解析方法は、領域毎の増幅産物中のDNA分子がPCR反応の何サイクル目で合成されたものであるかを特定して、領域毎のPCRの成功回数(最大PCR回数)を求め、その回数によって領域毎のカバレッジを補正するものである。
領域毎のカバレッジを補正し、領域毎のPCR増幅効率を揃えることで、例えば、染色体量定量精度を向上することができる。
SNP(single nucleotide polymorphism;一塩基多型)、CNV(copy number variation;コピー数多型、コピー数多様性)等の多型部位をPCRによって増幅し、次世代シーケンサを用いてシーケンスを行った場合、アレル毎にカバレッジ(シーケンスのリード数)が異なる場合がある。
この解析方法は、アレル毎の増幅産物中のDNA分子がPCR反応の何サイクル目で合成されたものであるかを特定して、アレル毎のPCRの成功回数(最大PCR回数)を求め、その回数によってアレル毎のカバレッジを補正するものである。
アレル毎のカバレッジを補正し、アレル毎のPCR増幅効率を揃えることで、例えば、その遺伝子多型部位の遺伝子型の確定精度を向上することができる。
ヒトゲノム上の領域Aおよび領域Bは、それぞれ、別々の染色体上に存在する。
領域Aおよび領域Bのそれぞれを増幅するためのプライマーのセットを、本発明のプライマー設計方法に従って設計し、プライマーを合成し、マルチプレックスPCRによって領域Aおよび領域Bの増幅産物を得る。
増幅産物を次世代シーケンサによってシーケンシングし、領域AのカバレッジCa、領域BのカバレッジCb、領域Aの最大PCR回数Ma、領域Bの最大PCR回数Mbを、それぞれ、測定する。
領域Aおよび領域BでのPCR増幅効率を揃え、染色体量定量精度を向上するために、領域Bの補正後カバレッジCb’を次式により算出する。
Cb’=Cb×2Ma−Mb
実際の値として、領域AのカバレッジCa=500、最大PCR成功回数Ma=12、領域BのカバレッジCb=100、最大PCR回数Mb=10が得られたとすると、領域Bの補正後カバレッジCb’は、
Cb’=100×2(12−10)=400
である。このように補正することによって、PCR前の染色体量を高精度に推定することができる。
ヒトゲノム上のSNP位置Aの遺伝子型としては、CC、CTおよびTTの3種類が存在する。
SNP位置Aを増幅するためのプライマーのセットを、本発明のプライマー設計方法に従って設計し、プライマーを合成し、PCRによってSNP位置Aの増幅産物を得る。
増幅産物を次世代シーケンサによってシーケンシングし、SNP位置AについてCを持つリードのカバレッジCc、Tを持つリードのカバレッジCt、Cを持つリードの最大PCR回数Mc、Tを持つリードの最大PCR回数Mtを、それぞれ、測定する。
Cを持つアレルとTを持つアレルとのPCR増幅効率を揃え、SNP位置Aの遺伝子型の確定精度を向上するために、Tを持つアレルの補正後カバレッジCt’を次式により算出する。
Ct’=Ct×2(Ma−Mb)
実際の値として、SNP位置AについてCを持つアレルのカバレッジCc=500、SNP位置AについてTを持つアレルのカバレッジCt=100、SNP位置AについてCを持つアレルの最大PCR回数Mc=12、SNP位置AについてTを持つアレルの最大PCR回数Mt=10が得られたとすると、Tを持つアレルの補正後カバレッジCt’は、
Ct’=100×2(12−10)=400
である。このように補正することによって、SNP位置Aの遺伝子型がCTであったと判定する確度が向上する。
Claims (6)
- PCR反応に供するプライマーの設計方法であって、
前記プライマーの5’末端側の塩基配列が、前記プライマーを用いたPCR反応によって得られる増幅産物をシークエンスして得られる塩基配列情報から前記増幅産物中のDNA分子が前記PCR反応におけるサーマルサイクルの第Nサイクル目に合成されたものであるかを特定する塩基配列またはその相補的な塩基配列を含んで、前記プライマーの5’末端側の塩基配列を規定するプライマー設計工程
を備え、Nは3以上の整数であり、
前記プライマー設計工程は、
前記プライマーが第N回目のサーマルサイクルで使用するプライマーであって、
第1回目のサーマルサイクルで使用するプライマー設計工程において、増幅対象DNA中の増幅対象領域の3’末端側と相補的に結合する塩基配列からなる相補DNA部分を規定し、前記増幅対象領域と相補的に結合しない塩基配列からなる非相補DNA部分を規定し、前記相補DNA部分の5’末端に前記非相補DNA部分を連結することを含み、
第2回目のサーマルサイクルで使用するプライマー設計工程において、増幅対象DNA中の増幅対象領域の3’末端側と相補的に結合する塩基配列からなる相補DNA部分を規定し、第1回目のサーマルサイクルで使用するプライマーの非相補DNA部分の塩基配列とは相違し、かつ、前記増幅対象領域と相補的に結合しない塩基配列からなる非相補DNA部分を規定し、前記相補DNA部分の5’末端に前記非相補DNA部分を連結することを含み、
第N回目のサーマルサイクルで使用するプライマー設計工程において、第N−2回目のサーマルサイクルで使用するプライマーの5’末端側の非相補DNA部分の塩基配列からなる相補DNA部分を規定し、第1回目から第N−1回目までのサーマルサイクルで使用するプライマーの5’末端側の非相補DNA部分の塩基配列のいずれとも相違し、かつ、前記増幅対象領域と相補的に結合しない塩基配列からなる非相補DNA部分を規定し、前記相補DNA部分の5’末端に前記非相補DNA部分を連結することを含む、
PCR反応に供するプライマーの設計方法。 - 請求項1に記載のプライマー設計工程を含み、前記プライマー設計工程で設計されたプライマーセットをPCR反応に供する、DNA増幅方法。
- 請求項1に記載のプライマー設計工程を含み、前記プライマー設計工程で設計されたプライマーセットをPCR反応に供して複数の領域を増幅して得られた増幅産物の塩基配列情報の解析方法であって、
領域毎のカバレッジを、前記増幅産物のPCR成功回数によって補正する
ことを特徴とする解析方法。 - 請求項1に記載のプライマー設計工程を含み、前記プライマー設計工程で設計されたプライマーセットをPCR反応に供して少なくとも1つの座位を含む領域を増幅して得られた増幅産物の塩基配列情報の解析方法であって、
アレル毎のカバレッジを、前記増幅産物のPCR成功回数によって補正する
ことを特徴とする解析方法。 - プライマー設計工程を含み、前記プライマー設計工程で設計されたプライマーセットをPCR反応に供して複数の領域を増幅して得られた増幅産物の塩基配列情報の解析方法であって、
領域毎のカバレッジを、前記増幅産物のPCR成功回数によって補正する
ことを特徴とする解析方法であって、
前記プライマー設計工程は、
前記プライマーの5’末端側の塩基配列が、前記プライマーを用いたPCR反応によって得られる増幅産物をシークエンスして得られる塩基配列情報から前記増幅産物中のDNA分子が前記PCR反応におけるサーマルサイクルの第N又は第N+1サイクル目に合成されたものであるかを特定する塩基配列またはその相補的な塩基配列を含んで、前記プライマーの5’末端側の塩基配列を規定することを含み、Nは3以上の奇数であり、
前記プライマーが第N回目および第N+1回目のサーマルサイクルで使用するプライマーであって、
第1回目および第2回目のサーマルサイクルで使用するプライマーの設計工程において、増幅対象DNA中の増幅対象領域の3’末端側と相補的に結合する塩基配列からなる相補DNA部分を規定し、前記増幅対象領域と相補的に結合しない塩基配列からなる非相補DNA部分を規定し、前記相補DNA部分の5’末端に前記非相補DNA部分を連結することを含み、
第N回目および第N+1回目のサーマルサイクルで使用するプライマーの設計工程において、第N−2回目および第N−1回目のサーマルサイクルで使用するプライマーの5’末端側の非相補DNA部分の塩基配列からなる相補DNA部分を規定し、第1回目から第N−2回目および第N−1回目までのサーマルサイクルで使用するプライマーの5’末端側の非相補DNA部分の塩基配列のいずれとも相違し、かつ、前記増幅対象領域と相補的に結合しない塩基配列からなる非相補DNA部分を規定し、前記相補DNA部分の5’末端に前記非相補DNA部分を連結することを含む、
解析方法。 - プライマー設計工程を含み、前記プライマー設計工程で設計されたプライマーセットをPCR反応に供して少なくとも1つの座位を含む領域を増幅して得られた増幅産物の塩基配列情報の解析方法であって、
アレル毎のカバレッジを、前記増幅産物のPCR成功回数によって補正する
ことを特徴とする解析方法であって、
前記プライマー設計工程は、
前記プライマーの5’末端側の塩基配列が、前記プライマーを用いたPCR反応によって得られる増幅産物をシークエンスして得られる塩基配列情報から前記増幅産物中のDNA分子が前記PCR反応におけるサーマルサイクルの第N又は第N+1サイクル目に合成されたものであるかを特定する塩基配列またはその相補的な塩基配列を含んで、前記プライマーの5’末端側の塩基配列を規定することを含み、Nは3以上の奇数であり、
前記プライマーが第N回目および第N+1回目のサーマルサイクルで使用するプライマーであって、
第1回目および第2回目のサーマルサイクルで使用するプライマーの設計工程において、増幅対象DNA中の増幅対象領域の3’末端側と相補的に結合する塩基配列からなる相補DNA部分を規定し、前記増幅対象領域と相補的に結合しない塩基配列からなる非相補DNA部分を規定し、前記相補DNA部分の5’末端に前記非相補DNA部分を連結することを含み、
第N回目および第N+1回目のサーマルサイクルで使用するプライマーの設計工程において、第N−2回目および第N−1回目のサーマルサイクルで使用するプライマーの5’末端側の非相補DNA部分の塩基配列からなる相補DNA部分を規定し、第1回目から第N−2回目および第N−1回目までのサーマルサイクルで使用するプライマーの5’末端側の非相補DNA部分の塩基配列のいずれとも相違し、かつ、前記増幅対象領域と相補的に結合しない塩基配列からなる非相補DNA部分を規定し、前記相補DNA部分の5’末端に前記非相補DNA部分を連結することを含む、
解析方法。
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