JP6560088B2

JP6560088B2 - Primer design method, DNA amplification method and analysis method

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Publication number: JP6560088B2
Application number: JP2015194734A
Authority: JP
Inventors: 尭之辻本
Original assignee: Fujifilm Corp
Current assignee: Fujifilm Corp
Priority date: 2015-09-30
Filing date: 2015-09-30
Publication date: 2019-08-14
Anticipated expiration: 2035-09-30
Also published as: JP2017063728A; US20180201988A1; WO2017056931A1; US11299775B2; EP3358009A1; EP3358009A4

Description

本発明は、プライマーの設計方法、プライマー、プライマーセット、ＤＮＡ増幅方法および解析方法に関する。 The present invention relates to a primer design method, a primer, a primer set, a DNA amplification method, and an analysis method.

近年発達してきたＤＮＡシーケンサ等により遺伝子解析が手軽に行えるようになっている。しかし、ゲノムの総塩基長は一般に膨大であり、一方でシーケンサのリード能力には制約がある。そこで、必要な特定の遺伝子領域のみを増幅し、その塩基配列に限定してリードを行うことで、効率的かつ精度よく遺伝子解析を行う技術としてＰＣＲ法が普及している。特に、ある１つのＰＣＲ反応系に複数種類のプライマーを同時に供給することで、複数の遺伝子領域を選択的に増幅する手法をマルチプレックスＰＣＲと称する。 Gene analysis can be easily performed by a DNA sequencer or the like that has been developed in recent years. However, the total base length of the genome is generally enormous, while the read capability of the sequencer is limited. Thus, the PCR method is widely used as a technique for efficiently and accurately performing gene analysis by amplifying only a necessary specific gene region and performing reading only in the base sequence. In particular, a method of selectively amplifying a plurality of gene regions by simultaneously supplying a plurality of types of primers to a certain PCR reaction system is called multiplex PCR.

しかしながら、一般にマルチプレックスＰＣＲによる増幅性は領域毎に異なるため、染色体数定量等の解析に悪影響が生じてしまう。また例えばヒトのような２倍体の場合には、アレルごとに増幅性が異なるため、ＳＮＰの遺伝子型特定に悪影響を及ぼしてしまう。これはシングルセル解析のような、標的とするＤＮＡ量が少ない場合に特に顕著になる。 However, in general, amplification by multiplex PCR varies from region to region, which adversely affects analysis such as chromosome number quantification. In addition, for example, in the case of a diploid such as a human, since the amplification property differs for each allele, it adversely affects the genotyping of the SNP. This is particularly noticeable when the target DNA amount is small, such as single cell analysis.

特許文献１には、プライマー同士が干渉しない安定的なマルチプレックスＰＣＲを行うため、プライマー同士のローカルアライメントを行い、プライマー同士がアニーリングしダイマーを形成するようなプライマーセットを避け、相補性が十分低いプライマーを用いて、効率的なマルチプレックスＰＣＲを行うことが記載されている。 In Patent Document 1, in order to perform stable multiplex PCR in which primers do not interfere with each other, local alignment between primers is performed, primer sets that are annealed to form dimers are avoided, and complementarity is sufficiently low. It is described that efficient multiplex PCR is performed using primers.

国際公開第２００８／００４６９１号International Publication No. 2008/004691

しかしながら、プライマー同士のローカルアライメントを行い、プライマー同士の相補性が十分低くなるように、プライマーを慎重に設計しても、領域毎、アレル毎にＰＣＲ増幅効率に差異が存在してしまい、染色体量定量や遺伝子型確定に悪影響が生じてしまう。特にシングルセル解析のような少量ＤＮＡを標的とする場合には顕著になる。 However, even if the primers are carefully designed so that the primers are sufficiently aligned and the complementarity between the primers is sufficiently low, there is a difference in PCR amplification efficiency between regions and alleles. It will adversely affect quantification and genotyping. This is particularly noticeable when targeting small amounts of DNA, such as single cell analysis.

そこで、本発明は、ＰＣＲ反応による領域毎のＤＮＡ増幅のばらつきやアレル毎のＤＮＡ増幅のばらつきを補正し、染色体量定量や遺伝子型確定を高精度に行うことができるプライマーを設計しうる、プライマーの設計方法を提供することを課題とする。 Therefore, the present invention corrects the variation in DNA amplification for each region and the variation in DNA amplification for each allele due to the PCR reaction, and can design a primer that can perform chromosomal quantity quantification and genotype determination with high accuracy. It is an object to provide a design method.

本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、プライマーの５’末端側の塩基配列が、プライマーを用いたＰＣＲ反応によって得られる増幅産物をシークエンスして得られる塩基配列情報から増幅産物中のＤＮＡ分子がＰＣＲ反応におけるサーマルサイクルの何サイクル目に合成されたものであるかを特定する塩基配列またはその相補的な塩基配列を含んで、プライマーの５’末端側の塩基配列を規定するプライマー設計工程を備える、ＰＣＲ反応に供するプライマーの設計方法によって設計したプライマーによれば、ＰＣＲ反応による領域毎のＤＮＡ増幅のばらつきやアレル毎のＤＮＡ増幅のばらつきを補正し、染色体量定量や遺伝子型確定を高精度に行うことができることを知得し、本発明を完成させた。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventor has determined that the base sequence information obtained by sequencing the amplification product obtained by the PCR reaction using the primer for the base sequence on the 5 ′ end side of the primer. The base sequence on the 5 'end side of the primer is included, including the base sequence that specifies the DNA cycle in the PCR product that is synthesized at the thermal cycle in the PCR reaction or its complementary base sequence. According to the primer designed by the primer design method for the PCR reaction, which includes the primer design process to be defined, the variation in DNA amplification by region and the variation in DNA amplification by allele due to the PCR reaction are corrected, It was learned that genotyping can be performed with high accuracy, and the present invention has been completed.

すなわち、本発明は次の［１］〜［６］を提供する。
［１］ＰＣＲ反応に供するプライマーの設計方法であって、
プライマーの５’末端側の塩基配列が、プライマーを用いたＰＣＲ反応によって得られる増幅産物をシークエンスして得られる塩基配列情報から増幅産物中のＤＮＡ分子がＰＣＲ反応におけるサーマルサイクルのＮサイクル目に合成されたものであるかを特定する塩基配列またはその相補的な塩基配列を含んで、プライマーの５’末端側の塩基配列を規定するプライマー設計工程
を備え、Ｎは３以上の整数であり、
プライマー設計工程は、
プライマーが第Ｎ回目のサーマルサイクルで使用するプライマーであって、
第１回目のサーマルサイクルで使用するプライマー設計工程において、増幅対象ＤＮＡ中の増幅対象領域の３’末端側と相補的に結合する塩基配列からなる相補ＤＮＡ部分を規定し、増幅対象領域と相補的に結合しない塩基配列からなる非相補ＤＮＡ部分を規定し、相補ＤＮＡ部分の５’末端に非相補ＤＮＡ部分を連結することを含み、
第２回目のサーマルサイクルで使用するプライマー設計工程において、増幅対象ＤＮＡ中の増幅対象領域の３’末端側と相補的に結合する塩基配列からなる相補ＤＮＡ部分を規定し、第１回目のサーマルサイクルで使用するプライマーの非相補ＤＮＡ部分の塩基配列とは相違し、かつ、増幅対象領域と相補的に結合しない塩基配列からなる非相補ＤＮＡ部分を規定し、相補ＤＮＡ部分の５’末端に非相補ＤＮＡ部分を連結することを含み、
第Ｎ回目のサーマルサイクルで使用するプライマー設計工程において、第Ｎ−２回目のサーマルサイクルで使用するプライマーの５’末端側の非相補ＤＮＡ部分の塩基配列からなる相補ＤＮＡ部分を規定し、第１回目から第Ｎ−１回目までのサーマルサイクルで使用するプライマーの５’末端側の非相補ＤＮＡ部分の塩基配列のいずれとも相違し、かつ、増幅対象領域と相補的に結合しない塩基配列からなる非相補ＤＮＡ部分を規定し、相補ＤＮＡ部分の５’末端に非相補ＤＮＡ部分を連結することを含む、ＰＣＲ反応に供するプライマーの設計方法。
［２］上記［１］に記載のプライマー設計工程を含み、プライマー設計工程で設計されたプライマーセットをＰＣＲ反応に供する、ＤＮＡ増幅方法。
［３］上記［１］に記載のプライマー設計工程を含み、プライマー設計工程で設計されたプライマーセットをＰＣＲ反応に供して複数の領域を増幅して得られた増幅産物の塩基配列情報の解析方法であって、
領域毎のカバレッジを、増幅産物のＰＣＲ成功回数によって補正する
ことを特徴とする解析方法。
［４］上記［１］に記載のプライマー設計工程を含み、プライマー設計工程で設計されたプライマーセットをＰＣＲ反応に供して少なくとも１つの座位を含む領域を増幅して得られた増幅産物の塩基配列情報の解析方法であって、
アレル毎のカバレッジを、増幅産物のＰＣＲ成功回数によって補正する
ことを特徴とする解析方法。
［５］プライマー設計工程を含み、プライマー設計工程で設計されたプライマーセットをＰＣＲ反応に供して複数の領域を増幅して得られた増幅産物の塩基配列情報の解析方法であって、
領域毎のカバレッジを、増幅産物のＰＣＲ成功回数によって補正する
ことを特徴とする解析方法であって、
プライマー設計工程は、
プライマーの５’末端側の塩基配列が、プライマーを用いたＰＣＲ反応によって得られる増幅産物をシークエンスして得られる塩基配列情報から増幅産物中のＤＮＡ分子がＰＣＲ反応におけるサーマルサイクルの第Ｎ又は第Ｎ＋１サイクル目に合成されたものであるかを特定する塩基配列またはその相補的な塩基配列を含んで、プライマーの５’末端側の塩基配列を規定することを含み、Ｎは３以上の奇数であり、
プライマーが第Ｎ回目および第Ｎ＋１回目のサーマルサイクルで使用するプライマーであって、
第１回目および第２回目のサーマルサイクルで使用するプライマーの設計工程において、増幅対象ＤＮＡ中の増幅対象領域の３’末端側と相補的に結合する塩基配列からなる相補ＤＮＡ部分を規定し、増幅対象領域と相補的に結合しない塩基配列からなる非相補ＤＮＡ部分を規定し、相補ＤＮＡ部分の５’末端に非相補ＤＮＡ部分を連結することを含み、
第Ｎ回目および第Ｎ＋１回目のサーマルサイクルで使用するプライマーの設計工程において、第Ｎ−２回目および第Ｎ−１回目のサーマルサイクルで使用するプライマーの５’末端側の非相補ＤＮＡ部分の塩基配列からなる相補ＤＮＡ部分を規定し、第１回目から第Ｎ−２回目および第Ｎ−１回目までのサーマルサイクルで使用するプライマーの５’末端側の非相補ＤＮＡ部分の塩基配列のいずれとも相違し、かつ、増幅対象領域と相補的に結合しない塩基配列からなる非相補ＤＮＡ部分を規定し、相補ＤＮＡ部分の５’末端に非相補ＤＮＡ部分を連結することを含む、
解析方法。
［６］プライマー設計工程を含み、プライマー設計工程で設計されたプライマーセットをＰＣＲ反応に供して少なくとも１つの座位を含む領域を増幅して得られた増幅産物の塩基配列情報の解析方法であって、
アレル毎のカバレッジを、増幅産物のＰＣＲ成功回数によって補正する
ことを特徴とする解析方法であって、
プライマー設計工程は、
プライマーの５’末端側の塩基配列が、プライマーを用いたＰＣＲ反応によって得られる増幅産物をシークエンスして得られる塩基配列情報から増幅産物中のＤＮＡ分子がＰＣＲ反応におけるサーマルサイクルの第Ｎ又は第Ｎ＋１サイクル目に合成されたものであるかを特定する塩基配列またはその相補的な塩基配列を含んで、プライマーの５’末端側の塩基配列を規定することを含み、Ｎは３以上の奇数であり、
プライマーが第Ｎ回目および第Ｎ＋１回目のサーマルサイクルで使用するプライマーであって、
第１回目および第２回目のサーマルサイクルで使用するプライマーの設計工程において、増幅対象ＤＮＡ中の増幅対象領域の３’末端側と相補的に結合する塩基配列からなる相補ＤＮＡ部分を規定し、増幅対象領域と相補的に結合しない塩基配列からなる非相補ＤＮＡ部分を規定し、相補ＤＮＡ部分の５’末端に非相補ＤＮＡ部分を連結することを含み、
第Ｎ回目および第Ｎ＋１回目のサーマルサイクルで使用するプライマーの設計工程において、第Ｎ−２回目および第Ｎ−１回目のサーマルサイクルで使用するプライマーの５’末端側の非相補ＤＮＡ部分の塩基配列からなる相補ＤＮＡ部分を規定し、第１回目から第Ｎ−２回目および第Ｎ−１回目までのサーマルサイクルで使用するプライマーの５’末端側の非相補ＤＮＡ部分の塩基配列のいずれとも相違し、かつ、増幅対象領域と相補的に結合しない塩基配列からなる非相補ＤＮＡ部分を規定し、相補ＤＮＡ部分の５’末端に非相補ＤＮＡ部分を連結することを含む、
解析方法。 That is, the present invention provides the following [1] to [ 6 ].
[1] A method for designing a primer to be used in a PCR reaction,
The DNA sequence in the amplification product is synthesized at the Nth cycle of the thermal cycle in the PCR reaction based on the nucleotide sequence information obtained by sequencing the amplification product obtained by the PCR reaction using the primer. A primer design step that defines a base sequence on the 5 ′ end side of the primer, including a base sequence that specifies whether or not the base sequence is complementary, and N is an integer of 3 or more,
The primer design process
The primer is a primer used in the Nth thermal cycle,
In the primer design process used in the first thermal cycle, a complementary DNA portion consisting of a base sequence that complementarily binds to the 3 ′ end side of the amplification target region in the amplification target DNA is defined and complementary to the amplification target region Defining a non-complementary DNA portion consisting of a base sequence that does not bind to, and linking the non-complementary DNA portion to the 5 ′ end of the complementary DNA portion,
In the primer design process used in the second thermal cycle, a complementary DNA portion consisting of a base sequence that binds complementarily to the 3 ′ end side of the amplification target region in the amplification target DNA is defined, and the first thermal cycle The non-complementary DNA portion is different from the base sequence of the non-complementary DNA portion of the primer used in the above and is defined as a non-complementary DNA portion consisting of a base sequence that does not complementarily bind to the amplification target region. Ligating DNA portions,
In the primer design step used in the Nth thermal cycle, a complementary DNA portion consisting of the base sequence of the non-complementary DNA portion on the 5 ′ end side of the primer used in the N-2th thermal cycle is defined, A non-complementary DNA sequence that is different from any of the nucleotide sequences of the non-complementary DNA portion on the 5 ′ end side of the primer used in the thermal cycle from the 1st to the (N-1) th cycle, and that does not complementarily bind to the amplification target region. A method for designing a primer for PCR reaction, which comprises defining a complementary DNA portion and ligating a non-complementary DNA portion to the 5 ′ end of the complementary DNA portion .
[2] A DNA amplification method comprising the primer design step according to [1 ] above, wherein the primer set designed in the primer design step is subjected to a PCR reaction.
[3] A method for analyzing the base sequence information of an amplification product obtained by amplifying a plurality of regions by subjecting the primer set designed in the primer design step to a PCR reaction, comprising the primer design step described in [1 ] above Because
The coverage for each region is corrected by the number of successful PCRs of amplification products.
An analysis method characterized by that.
[4] A base sequence of an amplification product obtained by amplifying a region containing at least one locus by subjecting the primer set designed in the primer design step to a PCR reaction, comprising the primer design step described in [1 ] above An information analysis method,
The coverage of each allele is corrected by the number of successful PCRs of amplification products.
An analysis method characterized by that.
[5] A method for analyzing base sequence information of an amplification product obtained by amplifying a plurality of regions by subjecting a primer set designed in the primer design step to a PCR reaction, including a primer design step,
The coverage for each region is corrected by the number of successful PCRs of amplification products.
An analysis method characterized by
The primer design process
From the base sequence information obtained by sequencing the amplification product obtained by the PCR reaction using the primer, the DNA sequence in the amplification product is the Nth or N + 1th thermal cycle in the PCR reaction. Including a base sequence specifying whether it is synthesized at the cycle or a complementary base sequence thereof, and defining a base sequence on the 5 ′ end side of the primer, wherein N is an odd number of 3 or more ,
A primer used in the Nth and (N + 1) th thermal cycles,
In the design process of primers used in the first and second thermal cycles, a complementary DNA portion consisting of a base sequence that complementarily binds to the 3 ′ end side of the amplification target region in the amplification target DNA is defined and amplified. Defining a non-complementary DNA portion consisting of a base sequence that does not bind complementarily to the target region, and linking the non-complementary DNA portion to the 5 ′ end of the complementary DNA portion;
In the design process of primers used in the Nth and (N + 1) th thermal cycles, the base sequence of the non-complementary DNA portion on the 5 ′ end side of the primers used in the (N−2) th and (N−1) th thermal cycles Which is different from any of the nucleotide sequences of the non-complementary DNA portion on the 5 ′ end side of the primer used in the thermal cycle from the 1st to the (N-2) th and (N-1) th times. Defining a non-complementary DNA portion consisting of a base sequence that does not complementarily bind to the amplification target region, and linking the non-complementary DNA portion to the 5 ′ end of the complementary DNA portion,
analysis method.
[6] A method for analyzing the base sequence information of an amplification product obtained by amplifying a region containing at least one locus by subjecting the primer set designed in the primer design step to a PCR reaction by including a primer design step. ,
The coverage of each allele is corrected by the number of successful PCRs of amplification products.
An analysis method characterized by
The primer design process
From the base sequence information obtained by sequencing the amplification product obtained by the PCR reaction using the primer, the DNA sequence in the amplification product is the Nth or N + 1th thermal cycle in the PCR reaction. Including a base sequence specifying whether it is synthesized at the cycle or a complementary base sequence thereof, and defining a base sequence on the 5 ′ end side of the primer, wherein N is an odd number of 3 or more ,
A primer used in the Nth and (N + 1) th thermal cycles,
In the design process of primers used in the first and second thermal cycles, a complementary DNA portion consisting of a base sequence that complementarily binds to the 3 ′ end side of the amplification target region in the amplification target DNA is defined and amplified. Defining a non-complementary DNA portion consisting of a base sequence that does not bind complementarily to the target region, and linking the non-complementary DNA portion to the 5 ′ end of the complementary DNA portion;
In the design process of primers used in the Nth and (N + 1) th thermal cycles, the base sequence of the non-complementary DNA portion on the 5 ′ end side of the primers used in the (N−2) th and (N−1) th thermal cycles Which is different from any of the nucleotide sequences of the non-complementary DNA portion on the 5 ′ end side of the primer used in the thermal cycle from the 1st to the (N-2) th and (N-1) th times. Defining a non-complementary DNA portion consisting of a base sequence that does not complementarily bind to the amplification target region, and linking the non-complementary DNA portion to the 5 ′ end of the complementary DNA portion,
analysis method.

本発明によれば、ＰＣＲ反応による領域毎のＤＮＡ増幅のばらつきやアレル毎のＤＮＡ増幅のばらつきを補正し、染色体量定量や遺伝子型確定を高精度に行うことができるプライマーを設計しうる、プライマーの設計方法が提供される。 According to the present invention, a primer capable of correcting a variation in DNA amplification in each region due to a PCR reaction and a variation in DNA amplification in each allele, and designing a primer capable of performing chromosomal quantity quantification and genotype determination with high accuracy. A design method is provided.

図１は、対になるプライマーの両方が本発明のプライマーであり、奇数番目とその直後の偶数番目のＰＣＲ反応サイクルで同じプライマーセットを用いるＤＮＡ増幅方法を模式的に説明する図である。FIG. 1 is a diagram schematically illustrating a DNA amplification method in which both of the paired primers are the primers of the present invention and the same primer set is used in the odd-numbered and even-numbered PCR reaction cycles immediately thereafter. 図２は、対になるプライマーの両方が本発明のプライマーであり、各ＰＣＲ反応サイクルで異なるプライマーセットを用いるＤＮＡ増幅方法を模式的に説明する図である。FIG. 2 is a diagram schematically illustrating a DNA amplification method in which both of the paired primers are the primers of the present invention and different primer sets are used in each PCR reaction cycle. 図３は、対になるプライマーの一方のみが本発明のプライマーであり、各ＰＣＲ反応サイクルで異なるプライマーセットを用いるＤＮＡ増幅方法を模式的に説明する図である。FIG. 3 is a diagram schematically illustrating a DNA amplification method in which only one of the paired primers is the primer of the present invention and a different primer set is used in each PCR reaction cycle.

〈ＰＣＲ〉ＰＣＲ（polymerase chain reaction；ポリメラーゼ連鎖反応）は、ＤＮＡ（deoxyribonucleic acid；デオキシリボ核酸）を増幅するための原理、手法または反応である。手法を指す場合はＰＣＲ法、反応を指す場合はＰＣＲ反応と呼ばれる場合がある。ＰＣＲ反応はサーマルサイクルを連続して行う必要はなく、各サーマルサイクルの開始時、途中、終了時等に反応溶液に物質を追加したり除去したりしてもよい。
〈ＳＮＰ〉ＳＮＰ（single nucleotide polymorphism；一塩基多型）とは、ある生物種集団のゲノム塩基配列中に見られる１塩基が変異した多様性であって、その変異が集団内で１％以上の頻度で見られるものをいう。 <PCR> PCR (polymerase chain reaction) is a principle, technique or reaction for amplifying DNA (deoxyribonucleic acid). When referring to a technique, it may be called a PCR method, and when referring to a reaction, it may be called a PCR reaction. The PCR reaction does not need to be performed continuously, and substances may be added to or removed from the reaction solution at the start, midway, or end of each thermal cycle.
<SNP> SNP (single nucleotide polymorphism) is a diversity in which one base found in the genome sequence of a certain species population is mutated, and the variation is 1% or more in the population. This is what is seen by frequency.

［プライマーの設計方法］
本発明のプライマー設計方法は、上記プライマーの５’末端側の塩基配列が、上記プライマーを用いたＰＣＲ反応によって得られる増幅産物をシークエンスして得られる塩基配列情報から上記増幅産物中のＤＮＡ分子が上記ＰＣＲ反応におけるサーマルサイクルの何サイクル目に合成されたものであるかを特定する塩基配列またはその相補的な塩基配列を含んで、上記プライマーの５’末端側の塩基配列を規定するプライマー設計工程を備える。 [Design method of primer]
In the primer designing method of the present invention, the DNA sequence in the amplification product is obtained from the nucleotide sequence information obtained by sequencing the amplification product obtained by PCR reaction using the primer. Primer design step for defining the base sequence on the 5 ′ end side of the primer, including a base sequence that specifies what cycle of the thermal cycle in the PCR reaction is synthesized or a complementary base sequence thereof Is provided.

ＰＣＲ反応では、通常、二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに分離する変性ステップ、一本鎖ＤＮＡにプライマーを結合するアニーリングステップ、およびプライマーの３’末端を起点として一本鎖ＤＮＡと相補的なＤＮＡを合成する伸長ステップの３ステップを含むサーマルサイクルを複数サイクル繰り返すことによって増幅対象ＤＮＡの増幅対象領域が増幅される。したがって、プライマーの５’末端にそのプライマーを識別できる識別タグ配列を組み込んでおくと、そのプライマーを使用したＰＣＲ反応で生成された増幅産物中のＤＮＡ分子は、その塩基配列中に識別タグ配列と同一の塩基配列または相補的な塩基配列を有することとなる。すなわち、このタグ配列が、プライマーを用いたＰＣＲ反応によって得られる増幅産物をシークエンスして得られる塩基配列情報から上記増幅産物中のＤＮＡ分子が上記ＰＣＲ反応におけるサーマルサイクルの何サイクル目に合成されたものであるかを特定する塩基配列またはその相補的な塩基配列である。 In a PCR reaction, usually, a denaturation step that separates double-stranded DNA into single-stranded DNA, an annealing step that binds a primer to single-stranded DNA, and a complementary to single-stranded DNA starting from the 3 ′ end of the primer. The amplification target region of the amplification target DNA is amplified by repeating a plurality of thermal cycles including three steps of the elongation step for synthesizing DNA. Therefore, if an identification tag sequence that can identify the primer is incorporated at the 5 ′ end of the primer, the DNA molecule in the amplification product generated by the PCR reaction using the primer will have the identification tag sequence in the base sequence. It has the same base sequence or a complementary base sequence. That is, this tag sequence was synthesized from the base sequence information obtained by sequencing an amplification product obtained by PCR using a primer, and the DNA molecule in the amplification product was synthesized at what cycle of the thermal cycle in the PCR reaction. It is a base sequence specifying whether it is a thing or its complementary base sequence.

上記何サイクル目に合成されたものであるかを特定する塩基配列またはその相補的な塩基配列については、本発明のＤＮＡ増幅方法について説明する際に、より具体的に説明する。 The base sequence specifying the cycle of the synthesis or the complementary base sequence thereof will be described more specifically when the DNA amplification method of the present invention is described.

本発明のプライマー設計方法は、プライマー同士がアニーリングしてダイマーを形成しないようにプライマーを設計することができる。例えば、特許文献１の開示に従って、プライマー同士のローカルアラインメントを行い、プライマー同士がアニーリングしダイマーを形成するようなプライマーの組合せを避けるようにプライマーを設計することができる。 In the primer designing method of the present invention, primers can be designed so that the primers do not anneal to form a dimer. For example, according to the disclosure of Patent Document 1, it is possible to design primers so as to avoid primer combinations in which primers are locally aligned and primers are annealed to form a dimer.

上記プライマー設計工程においては、増幅対象ＤＮＡ中の増幅対象領域と相補的に結合する塩基配列からなる相補ＤＮＡ部分を規定し、上記増幅対象領域と相補的に結合しない塩基配列からなる非相補ＤＮＡ部分を規定し、上記相補ＤＮＡ部分の５’末端に上記非相補ＤＮＡ部分を連結することを含んでもよい。ここで、上記非相補ＤＮＡ部分の塩基配列は、上記何サイクル目に合成されたものであるかを特定する塩基配列またはその相補的な塩基配列からなる。 In the primer designing step, a non-complementary DNA portion consisting of a base sequence that defines a complementary DNA sequence that binds complementarily to the amplification target region in the amplification target DNA and that does not bind complementary to the amplification target region And linking the non-complementary DNA portion to the 5 ′ end of the complementary DNA portion. Here, the base sequence of the non-complementary DNA portion is composed of a base sequence for specifying the cycle of the synthesis or a complementary base sequence thereof.

また、上記プライマー設計工程は、上記プライマーが第Ｎ回目および第Ｎ＋１回目のサーマルサイクルで使用するプライマーである場合、Ｎを１以上の奇数として、Ｎ＝１であるとき、増幅対象ＤＮＡ中の増幅対象領域の３’末端側と相補的に結合する塩基配列からなる相補ＤＮＡ部分を規定し、上記増幅対象領域と相補的に結合しない塩基配列からなる非相補ＤＮＡ部分を規定し、上記相補ＤＮＡ部分の５’末端に上記非相補ＤＮＡ部分を連結することを含み、Ｎ≧３であるとき、第Ｎ−２回目のサーマルサイクルで使用するプライマーの非相補ＤＮＡ部分の塩基配列からなる相補ＤＮＡ部分を規定し、第１回目から第Ｎ−２回目までのサーマルサイクルで使用するプライマーの非相補ＤＮＡ部分の塩基配列のいずれとも相違し、かつ、上記増幅対象領域と相補的に結合しない塩基配列からなる非相補ＤＮＡ部分を規定し、上記相補ＤＮＡ部分の５’末端に上記非相補ＤＮＡ部分を連結することを含むことが好ましい。 In the primer designing step, when the primer is a primer used in the Nth and (N + 1) th thermal cycles, N is an odd number of 1 or more, and N = 1, amplification in the amplification target DNA A complementary DNA portion comprising a base sequence that complementarily binds to the 3 ′ end of the target region; a non-complementary DNA portion comprising a base sequence that does not complementarily bind to the amplification target region; and the complementary DNA portion Linking the non-complementary DNA portion to the 5 ′ end of the primer, and when N ≧ 3, a complementary DNA portion comprising the base sequence of the non-complementary DNA portion of the primer used in the N-2th thermal cycle It differs from any of the nucleotide sequences of the non-complementary DNA portion of the primer defined and used in the first to N-2th thermal cycles, and The non-complementary DNA segment amplified region and consists complementarily unbound nucleotide sequence specified, it is preferable that includes coupling the non-complementary DNA portion to the 5 'end of the complementary DNA portion.

この方法でプライマーを設計する場合、サーマルサイクル毎にプライマーを設計する場合に比べて、設計するプライマーの数を減らすことができるというメリットがある（ここで、Ｎは１以上の奇数である）。 When designing primers by this method, there is an advantage that the number of primers to be designed can be reduced as compared to designing primers for each thermal cycle (N is an odd number of 1 or more).

また、上記プライマー設計工程は、上記プライマーが第Ｎ回目のサーマルサイクルで使用するプライマーである場合、Ｎを１以上の整数として、Ｎ＝１であるとき、増幅対象ＤＮＡ中の増幅対象領域の３’末端側と相補的に結合する塩基配列からなる相補ＤＮＡ部分を規定し、上記増幅対象領域と相補的に結合しない塩基配列からなる非相補ＤＮＡ部分を規定し、上記相補ＤＮＡ部分の５’末端に上記非相補ＤＮＡ部分を連結することを含み、Ｎ＝２であるとき、増幅対象ＤＮＡ中の増幅対象領域の３’末端側と相補的に結合する塩基配列からなる相補ＤＮＡ部分を規定し、第１回目のサーマルサイクルで使用するプライマーの非相補ＤＮＡ部分の塩基配列とは相違し、かつ、上記増幅対象領域と相補的に結合しない塩基配列からなる非相補ＤＮＡ部分を規定し、上記相補ＤＮＡ部分の５’末端に上記非相補ＤＮＡ部分を連結することを含み、Ｎ≧３であるとき、第Ｎ−２回目のサーマルサイクルで使用するプライマーの非相補ＤＮＡ部分の塩基配列からなる相補ＤＮＡ部分を規定し、第１回目から第Ｎ−１回目までのサーマルサイクルで使用するプライマーの非相補ＤＮＡ部分の塩基配列のいずれとも相違し、かつ、上記増幅対象領域と相補的に結合しない塩基配列からなる非相補ＤＮＡ部分を規定し、上記相補ＤＮＡ部分の５’末端に上記非相補ＤＮＡ部分を連結することを含むことが好ましい。 In the primer designing step, when the primer is a primer used in the Nth thermal cycle, N is an integer of 1 or more, and when N = 1, 3 of the amplification target regions in the amplification target DNA 'Specify a complementary DNA portion consisting of a base sequence that complementarily binds to the terminal side, define a non-complementary DNA portion consisting of a base sequence that does not complementarily bind to the amplification target region, and 5' end of the complementary DNA portion Linking the above non-complementary DNA portion, and when N = 2, defining a complementary DNA portion comprising a base sequence that complementarily binds to the 3 ′ end side of the amplification target region in the amplification target DNA, Non-complementary nucleotide sequence that is different from the non-complementary DNA portion of the primer used in the first thermal cycle and does not bind complementarily to the amplification target region A non-complementary DNA of a primer for use in the N-2th thermal cycle when N ≧ 3, wherein the NA portion is defined and linking the non-complementary DNA portion to the 5 ′ end of the complementary DNA portion A complementary DNA portion consisting of the base sequence of the portion, which is different from any of the base sequences of the non-complementary DNA portion of the primer used in the first to (N-1) th thermal cycles, and the amplification target region Preferably, the method includes defining a non-complementary DNA portion consisting of a base sequence that does not bind complementarily to the DNA, and linking the non-complementary DNA portion to the 5 ′ end of the complementary DNA portion.

この方法でプライマーを設計する場合、プライマーの５’末端側の塩基配列はそれぞれのサーマルサイクルに特有のものとなるので、増幅産物中のＤＮＡ分子が何サイクル目で合成されたものであるかを、より容易に特定することができる。 When designing a primer by this method, the base sequence on the 5 'end side of the primer is unique to each thermal cycle, so it is possible to determine at what cycle the DNA molecule in the amplification product was synthesized. Can be identified more easily.

［プライマーおよびプライマーセット］
本発明のプライマーは、上述した本発明のプライマー設計方法に従って設計された、ＰＣＲ反応に供するプライマーである。 [Primers and primer sets]
The primer of the present invention is a primer for PCR reaction designed according to the above-described primer design method of the present invention.

したがって、本発明のプライマーは、ＰＣＲ反応に供するプライマーであって、上記プライマーの５’末端側の塩基配列は、上記プライマーを用いたＰＣＲ反応によって得られる増幅産物をシークエンスして得られる塩基配列情報から上記増幅産物中のＤＮＡ分子が上記ＰＣＲ反応におけるサーマルサイクルの何サイクル目に合成されたものであるかを特定する塩基配列またはその相補的な塩基配列を含む。 Therefore, the primer of the present invention is a primer used for PCR reaction, and the base sequence on the 5 ′ end side of the primer is the base sequence information obtained by sequencing the amplification product obtained by the PCR reaction using the primer. To the DNA sequence in the amplification product includes a base sequence that identifies the cycle of the thermal cycle in the PCR reaction or a complementary base sequence thereof.

また、本発明のプライマーは、増幅対象ＤＮＡ中の増幅対象領域と相補的に結合する塩基配列からなる相補ＤＮＡ部分と、上記相補ＤＮＡ部分の５’末端に連結し、かつ、上記増幅対象領域と相補的に結合しない塩基配列からなる非相補ＤＮＡ部分とから構成されるプライマーであってもよい。ここで、上記非相補ＤＮＡ部分の塩基配列は、上記プライマーを用いたＰＣＲ反応によって得られる増幅産物をシークエンスして得られる塩基配列情報から上記増幅産物中のＤＮＡ分子が上記ＰＣＲ反応におけるサーマルサイクルの何サイクル目に合成されたものであるかを特定する塩基配列またはその相補的な塩基配列からなる。 Further, the primer of the present invention comprises a complementary DNA portion consisting of a base sequence that complementarily binds to the amplification target region in the amplification target DNA, the 5 'end of the complementary DNA portion, and the amplification target region A primer composed of a non-complementary DNA portion consisting of a base sequence that does not bind complementarily may be used. Here, the base sequence of the non-complementary DNA portion is determined from the base sequence information obtained by sequencing the amplification product obtained by the PCR reaction using the primers, and the DNA molecules in the amplification product are subjected to the thermal cycle in the PCR reaction. It consists of a base sequence that specifies what cycle was synthesized or a complementary base sequence thereof.

Ｎを１以上の奇数として、上記プライマーが第Ｎ回目および第Ｎ＋１回目のサーマルサイクルで使用するプライマーである場合、本発明のプライマーは、Ｎ＝１であるとき、増幅対象ＤＮＡ中の増幅対象領域の３’末端側と相補的に結合する塩基配列からなる相補ＤＮＡ部分と、上記相補ＤＮＡ部分の５’末端に連結し、かつ上記増幅対象領域と相補的に結合しない塩基配列からなる非相補ＤＮＡ部分とから構成され、Ｎ≧３であるとき、第Ｎ−２回目のサーマルサイクルで使用するプライマーの非相補ＤＮＡ部分の塩基配列からなる相補ＤＮＡ部分と、上記相補ＤＮＡ部分の５’末端に連結し、第Ｎ−２回目のサーマルサイクルで使用するプライマーの非相補ＤＮＡ部分の塩基配列とは相違し、かつ、上記増幅対象領域と相補的に結合しない塩基配列からなる非相補ＤＮＡ部分とから構成されるプライマーであることが好ましい。 When N is an odd number of 1 or more and the primer is a primer used in the Nth and (N + 1) th thermal cycles, the primer of the present invention has a region to be amplified in DNA to be amplified when N = 1 A non-complementary DNA consisting of a complementary DNA portion consisting of a base sequence that complementarily binds to the 3 ′ end side of the DNA, and a base sequence linked to the 5 ′ end of the complementary DNA portion and not complementary to the amplification target region When N ≧ 3, the complementary DNA portion consisting of the base sequence of the non-complementary DNA portion of the primer used in the (N-2) th thermal cycle is linked to the 5 ′ end of the complementary DNA portion. However, it differs from the base sequence of the non-complementary DNA portion of the primer used in the (N-2) th thermal cycle and does not bind to the amplification target region in a complementary manner. It is preferred from the non-complementary DNA segment consisting of a nucleotide sequence is a primer constructed.

Ｎを１以上の整数として、上記プライマーが第Ｎ回目のサーマルサイクルで使用するプライマーである場合、本発明のプライマーは、Ｎ＝１であるとき、増幅対象ＤＮＡ中の増幅対象領域の３’末端側と相補的に結合する塩基配列からなる相補ＤＮＡ部分と、上記相補ＤＮＡ部分の５’末端に連結し、かつ上記増幅対象領域と相補的に結合しない塩基配列からなる非相補ＤＮＡ部分とから構成され、Ｎ＝２であるとき、増幅対象ＤＮＡ中の増幅対象領域の３’末端側と相補的に結合する塩基配列からなる相補ＤＮＡ部分と、上記相補ＤＮＡ部分の５’末端に連結し、第１回目のサーマルサイクルで使用するプライマーの非相補ＤＮＡ部分の塩基配列とは相違し、かつ上記増幅対象領域と相補的に結合しない塩基配列からなる非相補ＤＮＡ部分とから構成され、Ｎ≧３であるとき、第Ｎ−２回目のサーマルサイクルで使用するプライマーの非相補ＤＮＡ部分の塩基配列からなる相補ＤＮＡ部分と、上記相補ＤＮＡ部分の５’末端に連結し、第１回目から第Ｎ−１回目までのサーマルサイクルで使用するプライマーの非相補ＤＮＡ部分の塩基配列のいずれとも相違し、かつ、上記増幅対象領域と相補的に結合しない塩基配列からなる非相補ＤＮＡ部分とから構成されるプライマーであることが好ましい。 When N is an integer of 1 or more and the primer is a primer used in the Nth thermal cycle, the primer of the present invention has a 3 ′ end of the amplification target region in the amplification target DNA when N = 1 Complementary DNA portion consisting of a base sequence that complementarily binds to the side, and a non-complementary DNA portion consisting of a base sequence that is linked to the 5 'end of the complementary DNA portion and does not complementarily bind to the amplification target region When N = 2, a complementary DNA portion consisting of a base sequence that complementarily binds to the 3 ′ end side of the amplification target region in the amplification target DNA is linked to the 5 ′ end of the complementary DNA portion, Non-complementary DNA portion consisting of a base sequence that is different from the base sequence of the non-complementary DNA portion of the primer used in the first thermal cycle and does not bind complementarily to the amplification target region When N ≧ 3, the complementary DNA portion consisting of the base sequence of the non-complementary DNA portion of the primer used in the N-2nd thermal cycle is linked to the 5 ′ end of the complementary DNA portion, Non-complementary DNA consisting of a base sequence that is different from any of the base sequences of the non-complementary DNA portion of the primer used in the first to N-1th thermal cycles and does not bind complementarily to the amplification target region A primer composed of a portion is preferred.

本発明のプライマーは、上述した本発明のプライマー設計方法によって設計されたオリゴヌクレオチドの塩基配列に従って、従来公知のオリゴヌクレオチド合成方法により製造することができる。 The primer of the present invention can be produced by a conventionally known oligonucleotide synthesis method according to the nucleotide sequence of the oligonucleotide designed by the above-described primer design method of the present invention.

本発明のプライマーセットは、上述した本発明のプライマーを含む、ＰＣＲ反応に供するプライマーセットである。 The primer set of the present invention is a primer set for PCR reaction, which includes the above-described primer of the present invention.

本発明のプライマーセットは、好ましくは、上述した本発明のプライマーからなる群から選択される第１のプライマーと、第２のプライマーとを組み合わせてなり、上記第１のプライマーと上記第２のプライマーとの対を用いて増幅対象ＤＮＡの増幅対象領域をＰＣＲ反応によって増幅することができる、ＰＣＲ反応に供するプライマーセットである。より好ましくは、上記第２のプライマーは上述した本発明のプライマーからなる群から選択される。 The primer set of the present invention is preferably a combination of a first primer selected from the group consisting of the above-described primers of the present invention and a second primer, and the first primer and the second primer Is a primer set for PCR reaction, which can amplify the amplification target region of the amplification target DNA by PCR reaction. More preferably, the second primer is selected from the group consisting of the primers of the present invention described above.

第１のプライマーおよび第２のプライマーの両方が上述した本発明のプライマーからなる群から選択されたプライマーである場合には、ＰＣＲ反応による増幅産物中のＤＮＡ分子の５’末端側にプライマーの塩基配列を、３’末端側にプライマーの塩基配列と相補的な塩基配列を付加することができるので、ＤＮＡ分子が何回目のサイクルで合成されたものであるか、より正確に特定することができたり、奇数回目と偶数回目のサイクルで同じプライマーセットを使用して工数を削減することができたりする。 When both the first primer and the second primer are primers selected from the group consisting of the primers of the present invention described above, the base of the primer on the 5 ′ end side of the DNA molecule in the amplification product by the PCR reaction Since a sequence complementary to the base sequence of the primer can be added to the 3 ′ end side, it is possible to more accurately identify the number of cycles the DNA molecule was synthesized. Or, it is possible to reduce the man-hours by using the same primer set in the odd-numbered and even-numbered cycles.

第１のプライマーのみが上述した本発明のプライマーからなる群から選択されたプライマーである場合には、ＰＣＲ反応の全サイクルで同一のプライマーを第２のプライマーとして使用することができ、プライマー設計に係る工数を削減することができる。 When only the first primer is a primer selected from the group consisting of the primers of the present invention described above, the same primer can be used as the second primer in the entire cycle of the PCR reaction. Such man-hours can be reduced.

本発明のプライマーセットは、また、上述した本発明のプライマーセットを複数含む、ＰＣＲ反応に供するプライマーセットである。 The primer set of the present invention is also a primer set for use in a PCR reaction including a plurality of the above-described primer sets of the present invention.

このプライマーセットは、マルチプレックスＰＣＲに用いる際に好適である。 This primer set is suitable for use in multiplex PCR.

［ＤＮＡ増幅方法］
本発明のＤＮＡ増幅方法は、上述した本発明のプライマーセットをＰＣＲ反応に供する、ＤＮＡ増幅方法である。 [DNA amplification method]
The DNA amplification method of the present invention is a DNA amplification method in which the primer set of the present invention described above is subjected to a PCR reaction.

本発明のＤＮＡ増幅方法によって生成した増幅産物をシーケンスすることによって、増幅産物中のＤＮＡ分子がＰＣＲ反応の何サイクル目で合成されたものであるかを特定することができる。 By sequencing the amplification product generated by the DNA amplification method of the present invention, it is possible to specify at which cycle of the PCR reaction the DNA molecule in the amplification product is synthesized.

本発明のＤＮＡ増幅方法は、概していえば、（１）対になるプライマーの両方が非相補ＤＮＡ部分を５’末端側に有するプライマーであり、奇数番目とその直後の偶数番目のＰＣＲ反応サイクルで同じプライマーセットを用いる方法（図１参照）、（２）対になるプライマーの両方が非相補ＤＮＡ部分を５’末端側に有するプライマーであり、各ＰＣＲ反応サイクルで異なるプライマーセットを用いる方法（図２参照）、（３）対になるプライマーの一方のみが非相補ＤＮＡ部分を５’末端側に有するプライマーであり、各ＰＣＲ反応サイクルで異なるプライマーセットを用いる方法（図３参照）の３態様を含む。
以下に、これら３態様のそれぞれについて説明する。 In general, the DNA amplification method of the present invention (1) is a primer in which both of the paired primers have a non-complementary DNA portion on the 5′-end side, The method using the same primer set (see FIG. 1), (2) The paired primers are both primers having a non-complementary DNA portion at the 5 ′ end, and a different primer set is used in each PCR reaction cycle (FIG. 1). 2), (3) Only one of the paired primers is a primer having a non-complementary DNA portion on the 5 ′ end side, and three modes of the method using different primer sets in each PCR reaction cycle (see FIG. 3) Including.
Below, each of these three aspects is demonstrated.

〈（１）対になるプライマーの両方が非相補ＤＮＡ部分を５’末端側に有するプライマーであり、奇数番目とその直後の偶数番目のＰＣＲ反応サイクルで同じプライマーセットを用いる方法〉
以下、適宜、図１を参照しながら説明する。
ＰＣＲ反応の１サイクル目（図１のＡを参照）では、ゲノムＤＮＡを増幅対象ＤＮＡ（鋳型ＤＮＡ）として用いて、これに対して、増幅対象ＤＮＡの第１ストランドの増幅対象領域にアニーリングする塩基配列Ａ_０（図１中では「Ａ０」と表記する。）からなる相補ＤＮＡ部分と、その相補ＤＮＡ部分の５’末端に連結し、かつ、増幅対象領域にアニーリングしない塩基配列Ａ_１（図１中では「Ａ１」と表記する。）からなる非相補ＤＮＡ部分とから構成されるプライマーＦ_１（図１中では「プライマーＦ１」と表記する。）、および、増幅対象ＤＮＡの第２ストランドの増幅対象領域にアニーリングする塩基配列Ｂ_０（図１中では「Ｂ０」と表記する。）からなる相補ＤＮＡ部分と、その相補ＤＮＡ部分の５’末端に連結し、かつ、増幅対象領域にアニーリングしない塩基配列Ｂ_１（図１中では「Ｂ１」と表記する。）とから構成されるプライマーＲ_１（図１中では「プライマーＲ１」と表記する。）からなるプライマーセットを用いる。 <(1) A method in which both of the paired primers are primers having a non-complementary DNA portion on the 5 ′ end side, and the same primer set is used in the odd-numbered and even-numbered PCR reaction cycles immediately after that.
Hereinafter, description will be given with reference to FIG.
In the first cycle of the PCR reaction (see A in FIG. 1), the genomic DNA is used as the amplification target DNA (template DNA) and the base is annealed to the amplification target region of the first strand of the amplification target DNA. A complementary DNA portion consisting of the sequence A ₀ (indicated as “A0” in FIG. 1), and a base sequence A ₁ that is linked to the 5 ′ end of the complementary DNA portion and that does not anneal to the amplification target region (FIG. 1) A primer F ₁ (indicated as “primer F1” in FIG. 1) composed of a non-complementary DNA portion consisting of a non-complementary DNA portion, and amplification of the second strand of the DNA to be amplified A complementary DNA portion consisting of a base sequence B ₀ (indicated as “B0” in FIG. 1) that anneals to the target region, and is linked to the 5 ′ end of the complementary DNA portion and amplified. A primer set consisting of a primer R ₁ (denoted as “primer R1” in FIG. 1) composed of a base sequence B ₁ (denoted as “B1” in FIG. 1) that does not anneal to the target region is used. .

ＰＣＲ反応の１サイクル目（図１のＡを参照）では、５’末端にプライマーＦ_１の非相補ＤＮＡ部分に由来する塩基配列Ａ_１を有するＤＮＡ分子、および、５’末端にプライマーＲ_１の非相補ＤＮＡ部分に由来する塩基配列Ｂ_１を有するＤＮＡ分子が合成される。 In the first cycle of the PCR reaction (see A in FIG. 1), a DNA molecule having a base sequence A ₁ derived from the non-complementary DNA portion of primer F _{1 at} the 5 ′ end and a primer R _{1 at} the 5 ′ end. DNA molecules having the nucleotide sequence _{B 1} derived from the non-complementary DNA moiety is synthesized.

ＰＣＲ反応の２サイクル目（図１のＢを参照）では、ＰＣＲ反応の１サイクル目で生成された増幅産物を増幅対象ＤＮＡとして用いて、これに対して、１サイクル目と同じプライマーＦ_１およびプライマーＲ_１からなるプライマーセットを用いる。 In the second cycle of the PCR reaction (see B in FIG. 1), the amplification product generated in the first cycle of the PCR reaction is used as the amplification target DNA, whereas the same primer F ₁ and ₁ as in the first cycle are used. using a primer set consisting of primers R _1.

ＰＣＲ反応の２サイクル目（図１のＢを参照）では、５’末端にプライマーＦ_１の非相補ＤＮＡ部分に由来する塩基配列Ａ_１、３’末端にプライマーＲ_１の非相補ＤＮＡ部分の塩基配列Ｂ_１に相補的な塩基配列ｂ_１（図１中では「ｂ１」と表記する。）を有するＤＮＡ分子、および、５’末端にプライマーＲ_１の非相補ＤＮＡ部分に由来する塩基配列Ｂ_１、３’末端にプライマーＦ_１の非相補ＤＮＡ部分の塩基配列Ａ_１に相補的な塩基配列ａ_１（図１中では「ａ１」と表記する。）を有するＤＮＡ分子が合成される。 In the second cycle of the PCR reaction (see FIG. 1B), the base sequence A ₁ derived from the non-complementary DNA portion of primer F ₁ at the 5 ′ end and the base of the non-complementary DNA portion of primer R _{1 at} the 3 ′ end sequence _{B 1} complementary to the nucleotide sequence _{b 1} (in FIG. 1 is referred to as "b1".) DNA molecule with, and, the base sequence _{B 1} derived from the 5 'end non-complementary DNA portion of the primer _{R 1} A DNA molecule having a base sequence a ₁ (denoted as “a1” in FIG. 1) complementary to the base sequence A ₁ of the non-complementary DNA portion of the primer F _{1 at} the 3 ′ end is synthesized.

ＰＣＲ反応の３サイクル目（図１のＣを参照）では、ＰＣＲ反応の２サイクル目で生成された増幅産物を増幅対象ＤＮＡ（鋳型ＤＮＡ）として用いて、これに対して、増幅対象ＤＮＡの第１ストランドの増幅対象領域の３’末端側にアニーリングする塩基配列Ａ_１からなる相補ＤＮＡ配列と、その相補ＤＮＡ部分の５’末端に連結し、かつ、増幅対象領域にアニーリングしない塩基配列Ａ_２（図１中では「Ａ２」と表記する。）からなる非相補ＤＮＡ部分とから構成されるプライマーＦ_２（図１中では「プライマーＦ２」と表記する。）、および、増幅対象ＤＮＡの第２ストランドの増幅対象領域の３’末端側にアニーリングする塩基配列Ｂ_１からなる相補ＤＮＡ配列と、その相補ＤＮＡ部分の５’末端に連結し、かつ、増幅対象領域にアニーリングしない塩基配列Ｂ_２（図１中では「Ｂ２」と表記する。）からなる非相補ＤＮＡ部分とから構成されるプライマーＲ_２（図１中では「プライマーＲ２」と表記する。）からなるプライマーセットを用いる。 In the third cycle of the PCR reaction (see C in FIG. 1), the amplification product generated in the second cycle of the PCR reaction is used as the amplification target DNA (template DNA). 'a complementary DNA sequence of the nucleotide sequence a ₁ that annealed to the end side, 5 of the complementary DNA 3' portion of the amplified region of one strand is linked to the end, and does not anneal to the amplified target region nucleotide sequence a ₂ ( In FIG. 1, the primer F ₂ (indicated as “primer F2” in FIG. 1) composed of a non-complementary DNA portion consisting of “A2”) and the second strand of the DNA to be amplified amplification 'and complementary DNA sequences comprising the nucleotide sequence B ₁ that annealed to the end side, 5 of the complementary DNA 3' portion of the target region linked to the end, and Annie the amplified region of A primer comprising a primer R ₂ (indicated as “primer R2” in FIG. 1) composed of a non-complementary DNA portion consisting of a base sequence B ₂ that is not ringed (indicated as “B2” in FIG. 1). Use a set.

ＰＣＲ反応の３サイクル目（図１のＣを参照）では、５’末端にプライマーＦ_２の非相補ＤＮＡ部分に由来する塩基配列Ａ_２を有するＤＮＡ分子、および、５’末端にプライマーＲ_２の非相補ＤＮＡ部分に由来する塩基配列Ｂ_２を有するＤＮＡ分子が合成される。 Third cycle of the PCR reaction (see the C of FIG. 1), 5 'DNA molecules having the nucleotide sequence _{A 2} derived from non-complementary DNA portion of the primer _{F 2} at the end, and, 5' end of the primer _{R 2} DNA molecules having the nucleotide sequence _{B 2} derived from non-complementary DNA moiety is synthesized.

ＰＣＲ反応の４サイクル目（図１のＤを参照）では、ＰＣＲ反応の３サイクル目で生成された増幅産物を増幅対象ＤＮＡ（鋳型ＤＮＡ）として用いて、これに対して、３サイクル目（図１のＣ）と同じプライマーＦ_２およびプライマーＲ_２からなるプライマーセットを用いる。 In the fourth cycle of the PCR reaction (see D in FIG. 1), the amplification product generated in the third cycle of the PCR reaction is used as the amplification target DNA (template DNA). 1 of C) a primer set consisting of the same primer _{F 2} and primer _{R 2} and used.

ＰＣＲ反応の４サイクル目（図１のＤを参照）では、５’末端にプライマーＦ_２の非相補ＤＮＡ部分に由来する塩基配列Ａ_２、３’末端にプライマーＲ_２の非相補ＤＮＡ部分の塩基配列Ｂ_２に相補的な塩基配列ｂ_２（図１中では「ｂ２」と表記する。）を有するＤＮＡ分子、および、５’末端にプライマーＲ_２の非相補ＤＮＡ部分に由来する塩基配列Ｂ_２、３’末端にプライマーＦ_２の非相補ＤＮＡ部分の塩基配列Ａ_２に相補的な塩基配列ａ_２（図１中では「ａ２」と表記する。）を有するＤＮＡ分子が合成される。 In the fourth cycle of the PCR reaction (see D in FIG. 1), the base sequence A ₂ derived from the non-complementary DNA portion of primer F ₂ at the 5 ′ end and the base of the non-complementary DNA portion of primer R _{2 at} the 3 ′ end sequence _{B 2} to complementary base sequence _{b 2} (in FIG. 1 is referred to as "b2".) DNA molecule with, and, the base sequence _{B 2} derived from the 5 'end non-complementary DNA portion of the primer _{R 2} A DNA molecule having a base sequence a ₂ (indicated as “a2” in FIG. 1) complementary to the base sequence A ₂ of the non-complementary DNA portion of the primer F _{2 at} the 3 ′ end is synthesized.

ＰＣＲ反応の５サイクル目以降、ｉを１以上の整数として、２（ｉ＋１）＋１サイクル目および２（ｉ＋１）＋２サイクル目でも、同様にして、プライマーＦ_ｉ＋２およびＲ_ｉ＋２からなる同じプライマーセットを用いる。 After the 5th cycle of the PCR reaction, i is an integer of 1 or more, and the same primer set consisting of primers F _{i + 2} and R _{i + 2} is used in the 2 (i + 1) +1 cycle and 2 (i + 1) +2 cycle in the same manner. .

プライマーＦ_ｉ＋２は、塩基配列Ａ_ｉ＋１からなる相補ＤＮＡ部分と、その相補ＤＮＡ部分の５’末端に連結し、かつ、増幅対象領域に相補的に結合しない塩基配列Ａ_ｉ＋２からなる非相補ＤＮＡ部分とから構成される。プライマーＦ_ｉ＋２の相補ＤＮＡ部分の塩基配列Ａ_ｉ＋１は、プライマーＦ_ｉ＋１の非相補ＤＮＡ部分の塩基配列Ａ_ｉ＋１と同一であり、プライマーＦ_ｉ＋２の非相補ＤＮＡ部分の塩基配列Ａ_ｉ＋２は、プライマーＦ_ｉからプライマーＦ_ｉ＋１までの非相補ＤＮＡ部分の塩基配列Ａ_１からＡ_ｉ＋１までのいずれとも相違し、プライマーＦ_ｉ＋３の相補ＤＮＡ部分の塩基配列Ａ_ｉ＋２と同一である。 Primer F _{i + 2} comprises a complementary DNA portion consisting of base sequence A _{i + 1,} a non-complementary DNA portion consisting of base sequence A _{i + 2} that is linked to the 5 ′ end of the complementary DNA portion and does not bind complementarily to the amplification target region. Consists of Nucleotide sequence _{A i + 1} of the complementary DNA portion of the primer _{F i + 2} is identical to the nucleotide sequence _{A i + 1} non-complementary DNA portion of the primer _{F i + 1,} the base sequence _{A i + 2} non-complementary DNA portion of the primer _{F i + 2,} the primer _{F i} Is different from any of the base sequences A ₁ to A _{i + 1} of the non-complementary DNA portion from to F _{i + 1} and is identical to the base sequence A _{i + 2} of the complementary DNA portion of primer F _{i + 3} .

プライマーＲ_ｉ＋２は、塩基配列Ｂ_ｉ＋１からなる相補ＤＮＡ部分と、その相補ＤＮＡ部分の５’末端に連結し、かつ、増幅対象領域に相補的に結合しない塩基配列Ｂ_ｉ＋２からなる非相補ＤＮＡ部分とから構成される。プライマーＲ_ｉ＋２の相補ＤＮＡ部分の塩基配列Ｂ_ｉ＋１は、プライマーＲ_ｉ＋１の非相補ＤＮＡ部分の塩基配列Ｂ_ｉ＋１と同一であり、プライマーＲ_ｉ＋２の非相補ＤＮＡ部分の塩基配列Ｂ_ｉ＋２は、プライマーＲ_ｉ＋１の非相補ＤＮＡ部分の塩基配列Ｂ_ｉ＋１とは相違し、プライマーＦ_ｉ＋３の相補ＤＮＡ部分の塩基配列Ａ_ｉ＋２と同一である。 Primer R _{i + 2} includes a complementary DNA portion consisting of base sequence B _{i + 1,} a non-complementary DNA portion consisting of base sequence B _{i + 2} that is linked to the 5 ′ end of the complementary DNA portion and does not bind complementarily to the amplification target region Consists of Nucleotide sequence _{B i + 1} of the complementary DNA portion of the primer _{R i + 2} is identical to the nucleotide sequence _{B i + 1} non-complementary DNA portion of the primer _{R i + 1,} the base sequence _{B i + 2} non-complementary DNA portion of the primer _{R i + 2,} the primer _{R i + 1} Is different from the base sequence B _{i + 1} of the non-complementary DNA portion, and is identical to the base sequence A _{i + 2} of the complementary DNA portion of the primer F _{i + 3} .

ＰＣＲ反応の２（ｉ＋１）＋１サイクル目では、５’末端にプライマーＦ_ｉ＋２の非相補ＤＮＡ部分に由来する塩基配列Ａ_ｉ＋２を有するＤＮＡ分子、および、５’末端にプライマーＲ_ｉ＋２の非相補ＤＮＡ部分に由来する塩基配列Ｂ_ｉ＋２を有するＤＮＡ分子が合成される。また、ＰＣＲ反応の２（ｉ＋１）＋２サイクル目では、５’末端にプライマーＦ_ｉ＋２の非相補ＤＮＡ部分に由来する塩基配列Ａ_ｉ＋２、３’末端にプライマーＲ_ｉ＋２の非相補ＤＮＡ部分の塩基配列Ｂ_ｉ＋２に相補的な塩基配列ｂ_ｉ＋２を有するＤＮＡ分子、および、５’末端にプライマーＲ_ｉ＋２の非相補ＤＮＡ部分に由来する塩基配列Ｂ_ｉ＋２、３’末端にプライマーＦ_ｉ＋２の非相補ＤＮＡ部分の塩基配列Ａ_ｉ＋２に相補的な塩基配列ａ_ｉ＋２を有するＤＮＡ分子が合成される。 In the 2 (i + 1) +1 cycle of the PCR reaction, a DNA molecule having a base sequence A _{i + 2} derived from the non-complementary DNA portion of primer F _{i + 2 at} the 5 ′ end, and a non-complementary DNA portion of primer R _{i + 2 at} the 5 ′ end A DNA molecule having the base sequence B _{i + 2} derived from is synthesized. In the 2 (i + 1) +2 cycle of the PCR reaction, the base sequence A _{i + 2} derived from the non-complementary DNA portion of the primer F _{i + 2 at} the 5 ′ end and the base sequence B of the non-complementary DNA portion of the primer R _{i + 2 at} the 3 ′ end _{i + 2} to the DNA molecule having a complementary base sequence _{b i + 2,} and the 5 'end nucleotide sequence derived from a non-complementary DNA portion of the primer _{R i + 2} in _{B i +} 2, 3' end to the non-complementary DNA portion of the primer _{F i + 2} bases A DNA molecule having a base sequence a _{i + 2} complementary to the sequence A _{i + 2} is synthesized.

ＰＣＲ反応の２（ｉ＋１）＋１サイクル目で合成されたＤＮＡ分子とＰＣＲ反応の２（ｉ＋１）＋２サイクル目で合成されたＤＮＡ分子とは、後者が３’末端にプライマーの非相補ＤＮＡ部分の塩基配列Ａ_ｉ＋２、Ｂ_ｉ＋２と相補的な塩基配列ａ_ｉ＋２、ｂ_ｉ＋２を有することにより区別することができる。
また、ＰＣＲ反応の２（ｉ＋１）サイクル目で合成されたＤＮＡ分子とＰＣＲ反応の２（ｉ＋１）＋１サイクル目で合成されたＤＮＡ分子とは、後者が５’末端にプライマーの非相補ＤＮＡ部分の塩基配列Ａ_ｉ＋２、Ｂ_ｉ＋２に由来する塩基配列を有することにより区別することができる。 The DNA molecule synthesized in the 2 (i + 1) +1 cycle of the PCR reaction and the DNA molecule synthesized in the 2 (i + 1) +2 cycle of the PCR reaction are the base of the non-complementary DNA portion of the primer at the 3 ′ end. It can be distinguished by having base sequences a _{i + 2} and b _{i + 2} complementary to the sequences A _{i + 2} and B _{i + 2} .
In addition, the DNA molecule synthesized in the 2 (i + 1) +1 cycle of the PCR reaction and the DNA molecule synthesized in the 2 (i + 1) +1 cycle of the PCR reaction are the latter in which the non-complementary DNA portion of the primer is at the 5 ′ end. It can be distinguished by having a base sequence derived from the base sequences A _{i + 2} and B _{i + 2} .

このように、ＰＣＲ反応の各サイクルで合成されるＤＮＡ分子は、５’末端または３’末端に、そのＤＮＡ分子が何サイクル目で合成されたものであるかを特定する塩基配列を有する。 Thus, the DNA molecule synthesized in each cycle of the PCR reaction has a base sequence that specifies at what cycle the DNA molecule was synthesized at the 5 'end or 3' end.

したがって、ＰＣＲ反応によって得られる増幅産物をシークエンスして得られる塩基配列情報から増幅産物中のＤＮＡ分子がＰＣＲ反応におけるサーマルサイクルの何サイクル目に合成されたものであるかを特定することができる。
また、合成されたＤＮＡ分子のそれぞれが何サイクル目で合成されたものであるかを特定することができるので、増幅対象領域の最大ＰＣＲ回数を特定することもできる。 Therefore, it is possible to specify at which cycle of the thermal cycle in the PCR reaction the DNA molecule in the amplification product is derived from the base sequence information obtained by sequencing the amplification product obtained by the PCR reaction.
In addition, since it is possible to specify in which cycle each synthesized DNA molecule is synthesized, the maximum number of PCRs of the amplification target region can also be specified.

なお、ＰＣＲ反応の最終サイクルは偶数番目のサイクルであってもよいし、奇数番目のサイクルであってもよい。 The final cycle of the PCR reaction may be an even-numbered cycle or an odd-numbered cycle.

〈（２）対になるプライマーの両方が非相補ＤＮＡ部分を５’末端側に有するプライマーであり、各ＰＣＲ反応サイクルで異なるプライマーセットを用いる方法〉
以下、適宜、図２を参照しながら説明する。
ＰＣＲ反応の１サイクル目（図２のＡを参照）では、ゲノムＤＮＡを増幅対象ＤＮＡ（鋳型ＤＮＡ）として用いて、これに対して、増幅対象ＤＮＡの第１ストランドの増幅対象領域にアニーリングする塩基配列Ａ_０（図２中では「Ａ０」と表記する。）からなる相補ＤＮＡ部分と、その相補ＤＮＡ部分の５’末端に連結し、かつ、増幅対象領域にアニーリングしない塩基配列Ａ_１（図２中では「Ａ１」と表記する。）からなる非相補ＤＮＡ部分とから構成されるプライマーＦ_１（図２中では「プライマーＦ１」と表記する。）、および、増幅対象ＤＮＡの第２ストランドの増幅対象領域にアニーリングする塩基配列Ｂ_０（図２中では「Ｂ０」と表記する。）からなる相補ＤＮＡ部分と、その相補ＤＮＡ部分の５’末端に連結し、かつ、増幅対象領域にアニーリングしない塩基配列Ｂ_１（図２中では「Ｂ１」と表記する。）とから構成されるプライマーＲ_１（図２中では「プライマーＲ１」と表記する。）からなるプライマーセットを用いる。 <(2) A method in which both of the paired primers are primers having a non-complementary DNA portion at the 5 ′ end, and different primer sets are used in each PCR reaction cycle>
Hereinafter, description will be given with reference to FIG.
In the first cycle of the PCR reaction (see A in FIG. 2), the genomic DNA is used as the amplification target DNA (template DNA), and the base that anneals to the amplification target region of the first strand of the amplification target DNA. A complementary DNA portion consisting of the sequence A ₀ (indicated as “A0” in FIG. 2) and a base sequence A ₁ (FIG. 2) that is linked to the 5 ′ end of the complementary DNA portion and that does not anneal to the amplification target region. The primer F ₁ (indicated as “primer F1” in FIG. 2) composed of a non-complementary DNA portion consisting of “A1” and the second strand of the amplification target DNA A complementary DNA portion consisting of a base sequence B ₀ (denoted as “B0” in FIG. 2) that anneals to the target region, and is linked to the 5 ′ end of the complementary DNA portion and amplified. A primer set consisting of a primer R ₁ (denoted as “primer R1” in FIG. 2) composed of a base sequence B ₁ (denoted as “B1” in FIG. 2) that does not anneal to the target region is used. .

ＰＣＲ反応の１サイクル目（図２のＡを参照）では、５’末端にプライマーＦ_１の非相補ＤＮＡ部分に由来する塩基配列Ａ_１を有するＤＮＡ分子、および、５’末端にプライマーＲ_１の非相補ＤＮＡ部分に由来する塩基配列Ｂ_１を有するＤＮＡ分子が合成される。 In the first cycle of the PCR reaction (see A in FIG. 2), a DNA molecule having a base sequence A ₁ derived from the non-complementary DNA portion of primer F _{1 at} the 5 ′ end and a primer R _{1 at} the 5 ′ end. DNA molecules having the nucleotide sequence _{B 1} derived from the non-complementary DNA moiety is synthesized.

ＰＣＲ反応の２サイクル目（図２のＢを参照）では、ＰＣＲ反応の１サイクル目で生成された増幅産物を増幅対象ＤＮＡとして用いて、これに対して、増幅対象ＤＮＡの第１ストランドの増幅対象領域にアニーリングする塩基配列Ａ_０からなる相補ＤＮＡ部分と、その相補ＤＮＡ部分の５’末端に連結し、かつ、増幅対象領域にアニーリングしない塩基配列Ａ_２（図２中では「Ａ２」と表記する。）からなる非相補ＤＮＡ部分とから構成されるプライマーＦ_２（図２中では「プライマーＦ２」と表記する。）、および、増幅対象ＤＮＡの第２ストランドの増幅対象領域にアニーリングする塩基配列Ｂ_０からなる相補ＤＮＡ部分と、その相補ＤＮＡ部分の５’末端に連結し、かつ、増幅対象領域にアニーリングしない塩基配列Ｂ_２（図２中では「Ｂ２」と表記する。）とから構成されるプライマーＲ_２（図２中では「プライマーＲ２」と表記する。）からなるプライマーセットを用いる。 In the second cycle of the PCR reaction (see B in FIG. 2), the amplification product generated in the first cycle of the PCR reaction is used as the amplification target DNA, while the first strand of the amplification target DNA is amplified. a complementary DNA portion comprising the nucleotide sequence a ₀ which anneals to the target region, linked to the 5 'end of the complementary DNA portion, and the base sequence a ₂ which does not anneal to the amplification target region _(in FIG. 2 as "A2" index to in from the non-complementary DNA portion consisting.) composed primer F _{2 (in} FIG. 2 is referred to as "primer F2".), and the nucleotide sequence that anneals to the amplified region of the second strand of the amplified DNA A complementary DNA portion consisting of B ₀ and a base sequence B ₂ linked to the 5 ′ end of the complementary DNA portion and not annealed to the amplification target region (in FIG. 2) Is expressed as “B2”) and a primer set consisting of a primer R ₂ (indicated as “primer R2” in FIG. 2) is used.

ＰＣＲ反応の２サイクル目（図２のＢを参照）では、５’末端にプライマーＦ_２の非相補ＤＮＡ部分に由来する塩基配列Ａ_２、３’末端にプライマーＲ_１の非相補ＤＮＡ部分の塩基配列Ｂ_１に相補的な塩基配列ｂ_１（図２中では「ｂ１」と表記する。）を有するＤＮＡ分子、および、５’末端にプライマーＲ_２の非相補ＤＮＡ部分に由来する塩基配列Ｂ_２、３’末端にプライマーＦ_１の非相補ＤＮＡ部分の塩基配列Ａ_１に相補的な塩基配列ａ_１（図２中では「ａ１」と表記する。）を有するＤＮＡ分子が合成される。 In the second cycle of the PCR reaction (see FIG. 2B), the base sequence A ₂ derived from the non-complementary DNA portion of primer F ₂ at the 5 ′ end and the base of the non-complementary DNA portion of primer R _{1 at} the 3 ′ end sequence _{B 1} complementary to the nucleotide sequence _{b 1} (in FIG. 2 is referred to as "b1".) DNA molecule with, and, the base sequence _{B 2} derived from the 5 'end non-complementary DNA portion of the primer _{R 2} A DNA molecule having a base sequence a ₁ complementary to the base sequence A ₁ of the non-complementary DNA portion of primer F _{1 at} the 3 ′ end (denoted as “a1” in FIG. 2) is synthesized.

ＰＣＲ反応の３サイクル目（図２のＣを参照）では、ＰＣＲ反応の２サイクル目で生成された増幅産物を増幅対象ＤＮＡ（鋳型ＤＮＡ）として用いて、これに対して、増幅対象ＤＮＡの第１ストランドの増幅対象領域の３’末端側にアニーリングする塩基配列Ａ_１からなる相補ＤＮＡ配列と、その相補ＤＮＡ部分の５’末端に連結し、かつ、増幅対象領域にアニーリングしない塩基配列Ａ_３（図２中では「Ａ３」と表記する。）からなる非相補ＤＮＡ部分とから構成されるプライマーＦ_３（図２中では「プライマーＦ３」と表記する。）、および、増幅対象ＤＮＡの第２ストランドの増幅対象領域の３’末端側にアニーリングする塩基配列Ｂ_１からなる相補ＤＮＡ配列と、その相補ＤＮＡ部分の５’末端に連結し、かつ、増幅対象領域にアニーリングしない塩基配列Ｂ_３（図２中では「Ｂ３」と表記する。）からなる非相補ＤＮＡ部分とから構成されるプライマーＲ_３（図２中では「プライマーＲ３」と表記する。）からなるプライマーセットを用いる。 In the third cycle of the PCR reaction (see C in FIG. 2), the amplification product generated in the second cycle of the PCR reaction is used as the amplification target DNA (template DNA). 'and a base sequence a ₁ that annealed to the distal complementary DNA sequence, 5 of the complementary DNA portion' 1 strands 3 of amplified target region linked to the end, and the base sequence a ₃ which does not anneal to the amplified target region ( In FIG. 2, a primer F ₃ (indicated as “primer F3” in FIG. 2) composed of a non-complementary DNA portion consisting of “A3”) and the second strand of the DNA to be amplified. amplification 'and complementary DNA sequences comprising the nucleotide sequence B ₁ that annealed to the end side, 5 of the complementary DNA 3' portion of the target region linked to the end, and Annie the amplified region of A primer comprising a primer R ₃ (indicated as “primer R3” in FIG. 2) composed of a non-complementary DNA portion consisting of a base sequence B ₃ that is not ringed (indicated as “B3” in FIG. 2). Use a set.

ＰＣＲ反応の３サイクル目（図２のＣを参照）では、５’末端にプライマーＦ_３の非相補ＤＮＡ部分に由来する塩基配列Ａ_３、３’末端に２サイクル目で使用したプライマーＲ_２の非相補ＤＮＡ部分の塩基配列Ｂ_２に相補的な塩基配列ｂ_２（図２中では「ｂ２」と表記する。）を有するＤＮＡ分子、および、５’末端にプライマーＲ_３の非相補ＤＮＡ部分に由来する塩基配列Ｂ_３、３’末端に２サイクル目で使用したプライマーＦ_２の非相補ＤＮＡ部分の塩基配列Ａ_２に相補的な塩基配列ａ_２（図２中では「ａ２」と表記する。）を有するＤＮＡ分子が合成される。 In the third cycle of the PCR reaction (see C in FIG. 2), the base sequence A ₃ derived from the non-complementary DNA portion of the primer F ₃ at the 5 ′ end and the primer R ₂ used in the second cycle at the 3 ′ end A DNA molecule having a base sequence b ₂ (indicated as “b2” in FIG. 2) complementary to the base sequence B ₂ of the non-complementary DNA portion, and a non-complementary DNA portion of the primer R _{3 at} the 5 ′ end Base sequence a ₂ complementary to base sequence A ₂ of the non-complementary DNA portion of primer F ₂ used in the second cycle at the derived base sequence B _{3 and} 3 ′ end (denoted as “a2” in FIG. 2). ) Is synthesized.

ＰＣＲ反応の４サイクル目（図２のＤを参照）では、ＰＣＲ反応の３サイクル目で生成された増幅産物を増幅対象ＤＮＡ（鋳型ＤＮＡ）として用いて、これに対して、増幅対象ＤＮＡの第１ストランドの増幅対象領域の３’末端側にアニーリングする塩基配列Ａ_２からなる相補ＤＮＡ配列と、その相補ＤＮＡ部分の５’末端に連結し、かつ、増幅対象領域にアニーリングしない塩基配列Ａ_４（図２中では「Ａ４」と表記する。）からなる非相補ＤＮＡ部分とから構成されるプライマーＦ_４（図２中では「プライマーＦ４」と表記する。）、および、増幅対象ＤＮＡの第２ストランドの増幅対象領域の３’末端側にアニーリングする塩基配列Ｂ_２からなる相補ＤＮＡ配列と、その相補ＤＮＡ部分の５’末端に連結し、かつ、増幅対象領域にアニーリングしない塩基配列Ｂ_４（図２中では「Ｂ４」と表記する。）からなる非相補ＤＮＡ部分とから構成されるプライマーＲ_４（図２中では「プライマーＲ４」と表記する。）からなるプライマーセットを用いる。 In the fourth cycle of the PCR reaction (see D in FIG. 2), the amplification product generated in the third cycle of the PCR reaction is used as the amplification target DNA (template DNA). 1 'and the complementary DNA sequence of the nucleotide sequence a ₂ which annealed to the end side, 5 of the complementary DNA 3' portion of the amplified region of the strand and ligated to the ends, and the base sequence a ₄ which does not anneal to the amplified target region ( In FIG. 2, a primer F ₄ (indicated as “primer F4” in FIG. 2) composed of a non-complementary DNA portion consisting of “A4”) and the second strand of the DNA to be amplified. amplification 'and complementary DNA sequences comprising the nucleotide sequence B ₂ which annealed to the end side, 5 of the complementary DNA 3' portion of the target region linked to the end, and Annie the amplified region of A primer comprising a primer R ₄ (indicated as “primer R4” in FIG. 2) composed of a non-complementary DNA portion consisting of a base sequence B ₄ that is not ringed (indicated as “B4” in FIG. 2). Use a set.

ＰＣＲ反応の４サイクル目（図２のＤを参照）では、５’末端にプライマーＦ_４の非相補ＤＮＡ部分に由来する塩基配列Ａ_４、３’末端にプライマーＲ_３の非相補ＤＮＡ部分の塩基配列Ｂ_３に相補的な塩基配列ｂ_３（図２中では「ｂ３」と表記する。）を有するＤＮＡ分子、および、５’末端にプライマーＲ_４の非相補ＤＮＡ部分に由来する塩基配列Ｂ_４、３’末端にプライマーＦ_３の非相補ＤＮＡ部分の塩基配列Ａ_３に相補的な塩基配列ａ_３（図２中では「ａ３」と表記する。）を有するＤＮＡ分子が合成される。 In the fourth cycle of the PCR reaction (see D in FIG. 2), the base sequence A ₄ derived from the non-complementary DNA portion of primer F ₄ at the 5 ′ end and the base of the non-complementary DNA portion of primer R _{3 at} the 3 ′ end complementary nucleotide sequences _{b 3} to the sequence _{B 3} (in FIG. 2 is referred to as "b3".) DNA molecule with, and, the base sequence _{B 4} derived from the 5 'end non-complementary DNA portion of the primer _{R 4} A DNA molecule having a base sequence a ₃ (denoted as “a3” in FIG. 2) complementary to the base sequence A ₃ of the non-complementary DNA portion of the primer F _{3 at} the 3 ′ end is synthesized.

ＰＣＲ反応の５サイクル目以降、ｊを１以上の整数として、ｊ＋４サイクル目でも同様にして、プライマーＦ_ｊ＋４およびＲ_ｊ＋４からなるプライマーセットを用いる。 After the fifth cycle of the PCR reaction, a primer set consisting of primers F _{j + 4} and R _{j + 4} is used in the same manner in the j + 4 cycle, where j is an integer of 1 or more.

プライマーＦ_ｊ＋４は、塩基配列Ａ_ｊ＋２からなる相補ＤＮＡ部分と、その相補ＤＮＡ部分の５’末端に連結し、かつ、増幅対象領域に相補的に結合しない塩基配列Ａ_ｊ＋４からなる非相補ＤＮＡ部分とから構成される。プライマーＦ_ｊ＋４の相補ＤＮＡ部分の塩基配列Ａ_ｊ＋２は、プライマーＦ_ｊ＋２の非相補ＤＮＡ部分の塩基配列Ａ_ｊ＋２と同一であり、プライマーＦ_ｊ＋４の非相補ＤＮＡ部分の塩基配列Ａ_ｊ＋４は、プライマーＦ_１からプライマーＦ_ｊ＋３までの非相補ＤＮＡ部分の塩基配列Ａ_１からＡ_ｊ＋３までのいずれとも相違し、プライマーＦ_ｊ＋６の相補ＤＮＡ部分の塩基配列Ａ_ｊ＋４と同一である。 Primer F _{j + 4} comprises a complementary DNA portion consisting of base sequence A _{j + 2} and a non-complementary DNA portion consisting of base sequence A _{j + 4} that is linked to the 5 ′ end of the complementary DNA portion and that does not bind complementarily to the amplification target region. Consists of Nucleotide sequence _{A j + 2} complementary DNA portion of the primer _{F j + 4} is the same as the nucleotide sequence _{A j + 2} non-complementary DNA portion of the primer _{F j + 2,} the base sequence _{A j + 4} non-complementary DNA portion of the primer _{F j + 4} is Primer _{F 1} To the base sequence A _{j + 4} of the complementary DNA portion of the primer F _{j + 6} , which is different from any of the base sequences A ₁ to A _{j + 3} of the non-complementary DNA portion of the primer F _{j + 3} to the primer F _{j + 3} .

プライマーＲ_ｊ＋４は、塩基配列Ｂ_ｊ＋２からなる相補ＤＮＡ部分と、その相補ＤＮＡ部分の５’末端に連結し、かつ、増幅対象領域に相補的に結合しない塩基配列Ｂ_ｊ＋４からなる非相補ＤＮＡ部分とから構成される。プライマーＲ_ｊ＋４の相補ＤＮＡ部分の塩基配列Ｂ_ｊ＋２は、プライマーＲ_ｊ＋２の非相補ＤＮＡ部分の塩基配列Ｂ_ｊ＋２と同一であり、プライマーＲ_ｊ＋４の非相補ＤＮＡ部分の塩基配列Ｂ_ｊ＋４は、プライマーＲ_１からプライマーＲ_ｊ＋３までの非相補ＤＮＡ部分の塩基配列Ｂ_１からＢ_ｊ＋３までのいずれとも相違し、プライマーＲ_ｊ＋６の相補ＤＮＡ部分の塩基配列Ｂ_ｊ＋４と同一である。 Primer R _{j + 4} includes a complementary DNA portion consisting of base sequence B _{j + 2} and a non-complementary DNA portion consisting of base sequence B _{j + 4} that is linked to the 5 ′ end of the complementary DNA portion and does not bind complementarily to the amplification target region. Consists of Nucleotide sequence _{B j + 2} complementary DNA portion of the primer _{R j + 4} is the same as the nucleotide sequence _{B j + 2} non-complementary DNA portion of the primer _{R j + 2,} the base sequence _{B j + 4} non-complementary DNA portion of the primer _{R j + 4} is Primer _{R 1} from with any differences from the nucleotide sequence _{B 1} non-complementary DNA portion up primer _{R j + 3} to _{B j + 3,} is identical to the nucleotide sequence _{B j + 4} complementary DNA portion of the primer _{R j + 6.}

ＰＣＲ反応のｊ＋４サイクル目では、５’末端にプライマーＦ_ｊ＋４の非相補ＤＮＡ部分に由来する塩基配列Ａ_ｊ＋４、３’末端にプライマーＲ_ｊ＋３の非相補ＤＮＡ部分の塩基配列Ｂ_ｊ＋３に相補的な塩基配列ｂ_ｊ＋３を有するＤＮＡ分子、および、５’末端にプライマーＲ_ｊ＋４の非相補ＤＮＡ部分に由来する塩基配列Ｂ_ｊ＋４を、３’末端にプライマーＦ_ｊ＋３の非相補ＤＮＡ部分の塩基配列Ａ_ｊ＋３に相補的な塩基配列ａ_ｊ＋３を有するＤＮＡ分子が合成される。 In the j + 4th cycle of the PCR reaction, the base sequence A _{j + 4} derived from the non-complementary DNA portion of primer F _{j + 4 at} the 5 ′ end and the base complementary to the base sequence B _{j + 3} of the non-complementary DNA portion of primer R _{j + 3 at} the 3 ′ end A DNA molecule having the sequence b _{j + 3} and a base sequence B _{j + 4} derived from the non-complementary DNA portion of the primer R _{j + 4 at} the 5 ′ end and a base sequence A _{j + 3} of the non-complementary DNA portion of the primer F _{j + 3} at the 3 ′ end A DNA molecule having a typical base sequence a _{j + 3} is synthesized.

このように、ＰＣＲ反応の各サイクルで合成されるＤＮＡ分子は、５’末端に、そのＤＮＡ分子が何サイクル目で合成されたものであるかを特定することができる塩基配列を有する。 As described above, the DNA molecule synthesized in each cycle of the PCR reaction has a base sequence that can specify at what cycle the DNA molecule was synthesized at the 5 'end.

〈（３）対になるプライマーの一方のみが非相補ＤＮＡ部分を５’末端側に有するプライマーであり、各ＰＣＲ反応サイクルで異なるプライマーセットを用いる方法〉
以下、適宜、図３を参照しながら説明する。
ＰＣＲ反応の１サイクル目（図３のＡを参照）では、ゲノムＤＮＡを増幅対象ＤＮＡ（鋳型ＤＮＡ）として用いて、これに対して、増幅対象ＤＮＡの第１ストランドの増幅対象領域にアニーリングする塩基配列Ａ_０（図３中では「Ａ０」と表記する。）からなる相補ＤＮＡ部分と、その相補ＤＮＡ部分の５’末端に連結し、かつ、増幅対象領域にアニーリングしない塩基配列Ａ_１（図３中では「Ａ１」と表記する。）からなる非相補ＤＮＡ部分とから構成されるプライマーＦ_１（図３中では「プライマーＦ１」と表記する。）、および、増幅対象ＤＮＡの第２ストランドの増幅対象領域にアニーリングする塩基配列Ｂ_０（図３中では「Ｂ０」と表記する。）からなる相補ＤＮＡ部分から構成されるプライマーＲ_０（図３中では「プライマーＲ０」と表記する。）からなるプライマーセットを用いる。 <(3) A method in which only one of the paired primers is a primer having a non-complementary DNA portion on the 5 ′ end side, and a different primer set is used in each PCR reaction cycle>
Hereinafter, description will be given with reference to FIG.
In the first cycle of the PCR reaction (see A in FIG. 3), the genomic DNA is used as the amplification target DNA (template DNA) and the base is annealed to the amplification target region of the first strand of the amplification target DNA. A complementary DNA portion consisting of the sequence A ₀ (indicated as “A0” in FIG. 3) and a base sequence A ₁ (FIG. 3) that is linked to the 5 ′ end of the complementary DNA portion and that does not anneal to the amplification target region. The primer F ₁ (indicated as “primer F1” in FIG. 3) composed of a non-complementary DNA portion consisting of “A1” and the second strand of the amplification target DNA nucleotide sequence B ₀ which anneals to the target region _(in FIG. 3 referred to as "B0".) primer composed of complementary DNA portion consisting of R _{0 (} "plies in Figure 3 Referred to as over R0 ".) A primer set used consisting.

ＰＣＲ反応の１サイクル目（図３のＡを参照）では、５’末端にプライマーＦ_１の非相補ＤＮＡ部分に由来する塩基配列Ａ_１を有するＤＮＡ分子、および、５’末端にプライマーＲ_０の相補ＤＮＡ部分に由来する塩基配列Ｂ_０を有するＤＮＡ分子が合成される。 In the first cycle of the PCR reaction (see A in FIG. 3), a DNA molecule having the base sequence A ₁ derived from the non-complementary DNA portion of the primer F _{1 at} the 5 ′ end, and the primer R _{0 at} the 5 ′ end. A DNA molecule having a base sequence B ₀ derived from the complementary DNA portion is synthesized.

ＰＣＲ反応の２サイクル目（図３のＢを参照）では、ＰＣＲ反応の１サイクル目で生成された増幅産物を増幅対象ＤＮＡとして用いて、これに対して、増幅対象ＤＮＡの第１ストランドの増幅対象領域にアニーリングする塩基配列Ａ_０からなる相補ＤＮＡ部分と、その相補ＤＮＡ部分の５’末端に連結し、かつ、増幅対象領域にアニーリングしない塩基配列Ａ_２（図３中では「Ａ２」と表記する。）からなる非相補ＤＮＡ部分とから構成されるプライマーＦ_２（図３中では「プライマーＦ２」と表記する。）、および、増幅対象ＤＮＡの第２ストランドの増幅対象領域にアニーリングする塩基配列Ｂ_０からなる相補ＤＮＡ部分から構成されるプライマーＲ_０からなるプライマーセットを用いる。 In the second cycle of the PCR reaction (see FIG. 3B), the amplification product generated in the first cycle of the PCR reaction is used as the amplification target DNA, whereas the first strand of the amplification target DNA is amplified. a complementary DNA portion comprising the nucleotide sequence a ₀ which anneals to the target region, linked to the 5 'end of the complementary DNA portion, and the base sequence a ₂ which does not anneal to the amplification target region _(in FIG. 3 as "A2" index to in from the non-complementary DNA portion consisting.) composed primer F _{2 (in} FIG. 3 is referred to as "primer F2".), and the nucleotide sequence that anneals to the amplified region of the second strand of the amplified DNA the primer set consisting configured primer _{R 0} from complementary DNA portion consisting of B ₀ is used.

ＰＣＲ反応の２サイクル目（図３のＢを参照）では、５’末端にプライマーＦ_２の非相補ＤＮＡ部分に由来する塩基配列Ａ_２を有するＤＮＡ分子、および、３’末端にプライマーＦ_１の非相補ＤＮＡ部分の塩基配列Ａ_１に相補的な塩基配列ａ_１（図３中では「ａ１」と表記する。）を有するＤＮＡ分子が合成される。 Second cycle of the PCR reaction (see the B in FIG. 3), 5 'DNA molecules having the nucleotide sequence _{A 2} derived from non-complementary DNA portion of the primer _{F 2} at the end, and, 3' end of the primer _{F 1} A DNA molecule having a base sequence a ₁ (denoted as “a1” in FIG. 3) complementary to the base sequence A ₁ of the non-complementary DNA portion is synthesized.

ＰＣＲ反応の３サイクル目（図３のＣを参照）では、ＰＣＲ反応の２サイクル目で生成された増幅産物を増幅対象ＤＮＡ（鋳型ＤＮＡ）として用いて、これに対して、増幅対象ＤＮＡの第１ストランドの増幅対象領域の３’末端側にアニーリングする塩基配列Ａ_１からなる相補ＤＮＡ配列と、その相補ＤＮＡ部分の５’末端に連結し、かつ、増幅対象領域にアニーリングしない塩基配列Ａ_３（図３中では「Ａ３」と表記する。）からなる非相補ＤＮＡ部分とから構成されるプライマーＦ_３（図３中では「プライマーＦ３」と表記する。）、および、増幅対象ＤＮＡの第２ストランドの増幅対象領域の３’末端側にアニーリングする塩基配列Ｂ_０からなる相補ＤＮＡ配列から構成されるプライマーＲ_０からなるプライマーセットを用いる。 In the third cycle of the PCR reaction (see C in FIG. 3), the amplification product generated in the second cycle of the PCR reaction is used as the amplification target DNA (template DNA). 'and a base sequence a ₁ that annealed to the distal complementary DNA sequence, 5 of the complementary DNA portion' 1 strands 3 of amplified target region linked to the end, and the base sequence a ₃ which does not anneal to the amplified target region ( In FIG. 3, a primer F ₃ (denoted as “primer F3” in FIG. 3) composed of a non-complementary DNA portion consisting of “A3”) and the second strand of the amplification target DNA using a primer set consisting configured primer R ₀ from the 3 'end the nucleotide sequence B ₀ which anneals to the complementary DNA sequence of the amplified target region.

ＰＣＲ反応の３サイクル目（図３のＣを参照）では、５’末端にプライマーＦ_３の非相補ＤＮＡ部分に由来する塩基配列Ａ_３を有するＤＮＡ分子、および、３’末端に２サイクル目で使用したプライマーＦ_２の非相補ＤＮＡ部分の塩基配列Ａ_２に相補的な塩基配列ａ_２（図３中では「ａ２」と表記する。）を有するＤＮＡ分子が合成される。 In the third cycle of the PCR reaction (see C in FIG. 3), 5 'DNA molecules having the nucleotide sequence _{A 3} derived from the end to the non-complementary DNA portion of the primer _{F 3,} and 3' in the second cycle at the end A DNA molecule having a base sequence a ₂ (indicated as “a2” in FIG. 3) complementary to the base sequence A ₂ of the non-complementary DNA portion of the used primer F ₂ is synthesized.

ＰＣＲ反応の４サイクル目（図３のＤを参照）では、ＰＣＲ反応の３サイクル目で生成された増幅産物を増幅対象ＤＮＡ（鋳型ＤＮＡ）として用いて、これに対して、増幅対象ＤＮＡの第１ストランドの増幅対象領域の３’末端側にアニーリングする塩基配列Ａ_２からなる相補ＤＮＡ配列と、その相補ＤＮＡ部分の５’末端に連結し、かつ、増幅対象領域にアニーリングしない塩基配列Ａ_４（図３中では「Ａ４」と表記する。）からなる非相補ＤＮＡ部分とから構成されるプライマーＦ_４（図３中では「プライマーＦ４」と表記する。）、および、増幅対象ＤＮＡの第２ストランドの増幅対象領域の３’末端側にアニーリングする塩基配列Ｂ_０からなる相補ＤＮＡ配列から構成されるプライマーＲ_０からなるプライマーセットを用いる。 In the fourth cycle of the PCR reaction (see D in FIG. 3), the amplification product generated in the third cycle of the PCR reaction is used as the amplification target DNA (template DNA). 1 'and the complementary DNA sequence of the nucleotide sequence a ₂ which annealed to the end side, 5 of the complementary DNA 3' portion of the amplified region of the strand and ligated to the ends, and the base sequence a ₄ which does not anneal to the amplified target region ( In FIG. 3, a primer F ₄ (indicated as “primer F4” in FIG. 3) composed of a non-complementary DNA portion consisting of “A4”) and the second strand of the DNA to be amplified. using a primer set consisting configured primer R ₀ from the 3 'end the nucleotide sequence B ₀ which anneals to the complementary DNA sequence of the amplified target region.

ＰＣＲ反応の４サイクル目（図３のＤを参照）では、５’末端にプライマーＦ_４の非相補ＤＮＡ部分に由来する塩基配列Ａ_４を有するＤＮＡ分子、および、３’末端にプライマーＦ_３の非相補ＤＮＡ部分の塩基配列Ａ_３に相補的な塩基配列ａ_３（図３中では「ａ３」と表記する。）を有するＤＮＡ分子が合成される。 Fourth cycle of the PCR reaction (see the D in FIG. 3), 5 'DNA molecules having the nucleotide sequence _{A 4} derived from the end to the non-complementary DNA portion of the primer _{F 4,} and 3' end of the primer _{F 3} A DNA molecule having a base sequence a ₃ (denoted as “a3” in FIG. 3) complementary to the base sequence A ₃ of the non-complementary DNA portion is synthesized.

ＰＣＲ反応の５サイクル目以降、ｋを１以上の整数として、ｋ＋４サイクル目でも同様にして、プライマーＦ_ｋ＋４およびＲ_０からなるプライマーセットを用いる。 After the fifth cycle of the PCR reaction, k is an integer of 1 or more, and a primer set consisting of primers F _{k + 4} and R ₀ is used similarly in the k + 4 cycle.

プライマーＦ_ｋ＋４は、塩基配列Ａ_ｋ＋２からなる相補ＤＮＡ部分と、その相補ＤＮＡ部分の５’末端に連結し、かつ、増幅対象領域に相補的に結合しない塩基配列Ａ_ｋ＋４からなる非相補ＤＮＡ部分とから構成される。プライマーＦ_ｋ＋４の相補ＤＮＡ部分の塩基配列Ａ_ｋ＋２は、プライマーＦ_ｋ＋２の非相補ＤＮＡ部分の塩基配列Ａ_ｋ＋２と同一であり、プライマーＦ_ｋ＋４の非相補ＤＮＡ部分の塩基配列Ａ_ｋ＋４は、プライマーＦ_１からプライマーＦ_ｋ＋３までの非相補ＤＮＡ部分の塩基配列Ａ_１からＡ_ｋ＋３までのいずれとも相違し、プライマーＦ_ｋ＋６の相補ＤＮＡ部分の塩基配列Ａ_ｋ＋４と同一である。プライマーＲ_０は上述したとおり、増幅対象ＤＮＡの第２ストランドの増幅対象領域の３’末端側にアニーリングする塩基配列Ｂ_０から構成される。 Primer F _{k + 4} comprises a complementary DNA portion consisting of base sequence A _{k + 2,} a non-complementary DNA portion consisting of base sequence A _{k + 4} that is linked to the 5 ′ end of the complementary DNA portion and does not bind complementarily to the amplification target region Consists of Nucleotide sequence _{A k + 2} complementary DNA portion of the primer _{F k + 4} is the same as the nucleotide sequence _{A k + 2} of the non-complementary DNA portion of the primer _{F k + 2,} the base sequence _{A k + 4} of the non-complementary DNA portion of the primer _{F k + 4,} the primer _{F 1} from with any differences from the nucleotide sequence _{a 1} non-complementary DNA portion up primer _{F k + 3} to _{a k + 3,} is identical to the nucleotide sequence _{a k + 4} complementary DNA portion of the primer _{F k + 6.} As described above, the primer R ₀ is composed of the base sequence B ₀ that anneals to the 3 ′ end side of the amplification target region of the second strand of the amplification target DNA.

ＰＣＲ反応のｋ＋４サイクル目では、５’末端にプライマーＦ_ｋ＋４の非相補ＤＮＡ部分に由来する塩基配列Ａ_ｋ＋４を有するＤＮＡ分子、および、３’末端にプライマーＦ_ｊ＋３の非相補ＤＮＡ部分の塩基配列Ａ_ｊ＋３に相補的な塩基配列ａ_ｊ＋３を有するＤＮＡ分子が合成される。 In the k + 4 cycle of the PCR reaction, a DNA molecule having a base sequence A _{k + 4} derived from the non-complementary DNA portion of primer F _{k + 4 at} the 5 ′ end, and a base sequence A of the non-complementary DNA portion of primer F _{j + 3 at} the 3 ′ end DNA molecules having a complementary base sequence _{a j + 3} to _{j + 3} are synthesized.

［解析方法］
本発明の解析方法の一態様は、本発明のプライマーセットをＰＣＲ反応に供して複数の領域を増幅して得られた増幅産物の塩基配列情報の解析方法であって、領域毎のカバレッジを、上記増幅産物のＰＣＲ成功回数によって補正することを特徴とする解析方法である。
複数の領域をマルチプレックスＰＣＲによって増幅し、次世代シーケンサを用いてシーケンスを行った場合、領域毎にカバレッジ（シーケンスのリード数）が異なる場合がある。
この解析方法は、領域毎の増幅産物中のＤＮＡ分子がＰＣＲ反応の何サイクル目で合成されたものであるかを特定して、領域毎のＰＣＲの成功回数（最大ＰＣＲ回数）を求め、その回数によって領域毎のカバレッジを補正するものである。
領域毎のカバレッジを補正し、領域毎のＰＣＲ増幅効率を揃えることで、例えば、染色体量定量精度を向上することができる。 [analysis method]
One aspect of the analysis method of the present invention is a method for analyzing the base sequence information of an amplification product obtained by amplifying a plurality of regions by subjecting the primer set of the present invention to a PCR reaction, The analysis method is characterized in that the correction is performed based on the number of successful PCRs of the amplification product.
When a plurality of regions are amplified by multiplex PCR and a sequence is performed using a next-generation sequencer, the coverage (number of reads in the sequence) may differ from region to region.
This analysis method specifies the number of cycles of the PCR reaction in which the DNA molecules in the amplification products for each region are synthesized, determines the number of successful PCRs (maximum number of PCRs) for each region, The coverage for each area is corrected by the number of times.
By correcting the coverage for each region and aligning the PCR amplification efficiency for each region, for example, the chromosomal quantity quantification accuracy can be improved.

本発明の解析方法の別の一態様は、プライマーセットをＰＣＲ反応に供して少なくとも１つの座位を含む領域を増幅して得られた増幅産物の塩基配列情報の解析方法であって、アレル毎のカバレッジを、上記増幅産物のＰＣＲ成功回数によって補正することを特徴とする解析方法である。
ＳＮＰ（single nucleotide polymorphism；一塩基多型）、ＣＮＶ（copy number variation；コピー数多型、コピー数多様性）等の多型部位をＰＣＲによって増幅し、次世代シーケンサを用いてシーケンスを行った場合、アレル毎にカバレッジ（シーケンスのリード数）が異なる場合がある。
この解析方法は、アレル毎の増幅産物中のＤＮＡ分子がＰＣＲ反応の何サイクル目で合成されたものであるかを特定して、アレル毎のＰＣＲの成功回数（最大ＰＣＲ回数）を求め、その回数によってアレル毎のカバレッジを補正するものである。
アレル毎のカバレッジを補正し、アレル毎のＰＣＲ増幅効率を揃えることで、例えば、その遺伝子多型部位の遺伝子型の確定精度を向上することができる。 Another aspect of the analysis method of the present invention is a method for analyzing base sequence information of an amplification product obtained by subjecting a primer set to a PCR reaction to amplify a region containing at least one locus, The analysis method is characterized in that coverage is corrected by the number of successful PCRs of the amplification product.
When polymorphic sites such as SNP (single nucleotide polymorphism) and CNV (copy number variation) are amplified by PCR and sequenced using next-generation sequencers The coverage (number of reads in the sequence) may differ for each allele.
This analysis method specifies the number of cycles of the PCR reaction in which the DNA molecule in the amplification product for each allele is synthesized, determines the number of successful PCRs (maximum number of PCRs) for each allele, The coverage for each allele is corrected by the number of times.
By correcting the coverage for each allele and aligning the PCR amplification efficiency for each allele, for example, the accuracy of determining the genotype of the gene polymorphic site can be improved.

本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。 The present invention will be described more specifically with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.

［実施例１］
ヒトゲノム上の領域Ａおよび領域Ｂは、それぞれ、別々の染色体上に存在する。
領域Ａおよび領域Ｂのそれぞれを増幅するためのプライマーのセットを、本発明のプライマー設計方法に従って設計し、プライマーを合成し、マルチプレックスＰＣＲによって領域Ａおよび領域Ｂの増幅産物を得る。
増幅産物を次世代シーケンサによってシーケンシングし、領域ＡのカバレッジＣａ、領域ＢのカバレッジＣｂ、領域Ａの最大ＰＣＲ回数Ｍａ、領域Ｂの最大ＰＣＲ回数Ｍｂを、それぞれ、測定する。
領域Ａおよび領域ＢでのＰＣＲ増幅効率を揃え、染色体量定量精度を向上するために、領域Ｂの補正後カバレッジＣｂ’を次式により算出する。
Ｃｂ’＝Ｃｂ×２^{Ｍａ−Ｍｂ}
実際の値として、領域ＡのカバレッジＣａ＝５００、最大ＰＣＲ成功回数Ｍａ＝１２、領域ＢのカバレッジＣｂ＝１００、最大ＰＣＲ回数Ｍｂ＝１０が得られたとすると、領域Ｂの補正後カバレッジＣｂ’は、
Ｃｂ’＝１００×２^{（１２−１０）}＝４００
である。このように補正することによって、ＰＣＲ前の染色体量を高精度に推定することができる。 [Example 1]
Region A and region B on the human genome each exist on a separate chromosome.
A set of primers for amplifying each of region A and region B is designed according to the primer design method of the present invention, primers are synthesized, and amplification products of region A and region B are obtained by multiplex PCR.
The amplification products are sequenced by a next-generation sequencer, and the coverage Ca of the region A, the coverage Cb of the region B, the maximum PCR number Ma of the region A, and the maximum PCR number Mb of the region B are measured.
In order to align the PCR amplification efficiencies in the regions A and B and improve the chromosomal quantity quantification accuracy, the corrected coverage Cb ′ of the region B is calculated by the following equation.
Cb ′ = Cb × 2 ^Ma−Mb
As actual values, if coverage Ca of area A = 500, maximum PCR success count Ma = 12, coverage Bb of area B = 100, and maximum PCR count Mb = 10, corrected coverage Cb ′ of area B is ,
Cb ′ = 100 × 2 ^(12−10) = 400
It is. By correcting in this way, the amount of chromosomes before PCR can be estimated with high accuracy.

［実施例２］
ヒトゲノム上のＳＮＰ位置Ａの遺伝子型としては、ＣＣ、ＣＴおよびＴＴの３種類が存在する。
ＳＮＰ位置Ａを増幅するためのプライマーのセットを、本発明のプライマー設計方法に従って設計し、プライマーを合成し、ＰＣＲによってＳＮＰ位置Ａの増幅産物を得る。
増幅産物を次世代シーケンサによってシーケンシングし、ＳＮＰ位置ＡについてＣを持つリードのカバレッジＣｃ、Ｔを持つリードのカバレッジＣｔ、Ｃを持つリードの最大ＰＣＲ回数Ｍｃ、Ｔを持つリードの最大ＰＣＲ回数Ｍｔを、それぞれ、測定する。
Ｃを持つアレルとＴを持つアレルとのＰＣＲ増幅効率を揃え、ＳＮＰ位置Ａの遺伝子型の確定精度を向上するために、Ｔを持つアレルの補正後カバレッジＣｔ’を次式により算出する。
Ｃｔ’＝Ｃｔ×２^{（Ｍａ−Ｍｂ）}
実際の値として、ＳＮＰ位置ＡについてＣを持つアレルのカバレッジＣｃ＝５００、ＳＮＰ位置ＡについてＴを持つアレルのカバレッジＣｔ＝１００、ＳＮＰ位置ＡについてＣを持つアレルの最大ＰＣＲ回数Ｍｃ＝１２、ＳＮＰ位置ＡについてＴを持つアレルの最大ＰＣＲ回数Ｍｔ＝１０が得られたとすると、Ｔを持つアレルの補正後カバレッジＣｔ’は、
Ｃｔ’＝１００×２^{（１２−１０）}＝４００
である。このように補正することによって、ＳＮＰ位置Ａの遺伝子型がＣＴであったと判定する確度が向上する。 [Example 2]
There are three types of genotypes at SNP position A on the human genome: CC, CT and TT.
A set of primers for amplifying SNP position A is designed according to the primer design method of the present invention, a primer is synthesized, and an amplification product at SNP position A is obtained by PCR.
Amplification products are sequenced by a next-generation sequencer, and lead coverage Cc with C at SNP position A, lead coverage Ct with T, maximum PCR number Mc with lead C, maximum PCR number Mt with lead with T , Respectively.
In order to align the PCR amplification efficiencies of the allele with C and the allele with T and improve the accuracy of determining the genotype at SNP position A, the corrected coverage Ct ′ of the allele with T is calculated by the following equation.
Ct ′ = Ct × 2 ^(Ma−Mb)
As actual values, coverage Cc of allele with C for SNP position A = 500, coverage Ct = 100 for allele with T for SNP position A, maximum PCR number Mc = 12 for allele with C for SNP position A, SNP Assuming that the maximum number of PCRs Mt = 10 for an allele with T for position A is obtained, the corrected coverage Ct ′ for the allele with T is:
Ct ′ = 100 × 2 ^(12−10) = 400
It is. By correcting in this way, the accuracy of determining that the genotype at SNP position A is CT is improved.

本発明は、染色体数定量やＳＮＰ解析といった遺伝子解析を行う際に、カバレッジ情報等を補正し高精度な解析を行うことに利用可能である。 INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention can be used to perform high-precision analysis by correcting coverage information and the like when performing gene analysis such as chromosome number quantification and SNP analysis.

Claims

A method for designing a primer to be used in a PCR reaction,
From the base sequence information obtained by sequencing the amplification product obtained by the PCR reaction using the primer, the DNA sequence in the amplification product is converted into the DNA sequence in the thermal cycle in the PCR reaction. A primer design step that includes a base sequence that specifies whether it is synthesized in the Nth cycle or a complementary base sequence thereof, and defines a base sequence on the 5 ′ end side of the primer, wherein N is 3 or more And an integer
The primer design process includes:
The primer is a primer used in the Nth thermal cycle,
In the primer design process used in the first thermal cycle, a complementary DNA portion consisting of a base sequence that complementarily binds to the 3 ′ end side of the amplification target region in the amplification target DNA is defined and complemented with the amplification target region Defining a non-complementary DNA portion consisting of a base sequence that does not bind physically, and linking the non-complementary DNA portion to the 5 ′ end of the complementary DNA portion,
In the primer design process used in the second thermal cycle, a complementary DNA portion consisting of a base sequence that binds complementarily to the 3 ′ end side of the amplification target region in the amplification target DNA is defined, and the first thermal cycle A non-complementary DNA portion comprising a base sequence that is different from the base sequence of the non-complementary DNA portion of the primer used in the above and that does not complementarily bind to the amplification target region, and is defined at the 5 ′ end of the complementary DNA portion. Ligating the non-complementary DNA portions;
In the primer design step used in the Nth thermal cycle, a complementary DNA portion consisting of the base sequence of the non-complementary DNA portion on the 5 ′ end side of the primer used in the N-2th thermal cycle is defined, It consists of a base sequence that is different from any of the base sequences of the non-complementary DNA portion on the 5′-end side of the primer used in the thermal cycle from the 1st to the (N-1) th and does not bind complementary to the amplification target region. Defining a non-complementary DNA portion and ligating the non-complementary DNA portion to the 5 ′ end of the complementary DNA portion;
A method for designing primers to be used in a PCR reaction.

A DNA amplification method comprising the primer design step according to claim 1 , wherein the primer set designed in the primer design step is subjected to a PCR reaction.

A method for analyzing base sequence information of an amplification product obtained by amplifying a plurality of regions by subjecting a primer set designed in the primer design step to a PCR reaction, comprising the primer design step according to claim 1. ,
An analysis method comprising correcting the coverage for each region by the number of successful PCRs of the amplification product.

Analysis of the base sequence information of the amplification product obtained by amplifying a region containing at least one locus by subjecting the primer set designed in the primer design step to a PCR reaction using the primer design step according to claim 1 A method,
An analysis method, wherein coverage for each allele is corrected by the number of successful PCRs of the amplification product.

A method for analyzing base sequence information of an amplification product obtained by amplifying a plurality of regions by subjecting a primer set designed in the primer design step to a PCR reaction, comprising a primer design step,
The coverage for each region is corrected by the number of successful PCRs of the amplification product.
An analysis method characterized by
The primer design process includes:
From the base sequence information obtained by sequencing the amplification product obtained by the PCR reaction using the primer, the DNA sequence in the amplification product is converted into the DNA sequence in the thermal cycle in the PCR reaction. Including a base sequence specifying whether it is synthesized at the Nth or N + 1th cycle or a complementary base sequence thereof, and defining a base sequence on the 5 ′ end side of the primer, wherein N is 3 More than odd,
The primer used in the Nth and (N + 1) th thermal cycles,
In the step of designing primers used in the first and second thermal cycles, a complementary DNA portion consisting of a base sequence that complementarily binds to the 3 ′ end side of the amplification target region in the amplification target DNA is defined, Defining a non-complementary DNA portion consisting of a base sequence that does not bind complementarily to the amplification target region, and linking the non-complementary DNA portion to the 5 ′ end of the complementary DNA portion,
In the design process of primers used in the Nth and (N + 1) th thermal cycles, the base sequence of the non-complementary DNA portion on the 5 ′ end side of the primers used in the (N−2) th and (N−1) th thermal cycles Which is different from any of the nucleotide sequences of the non-complementary DNA portion on the 5 ′ end side of the primer used in the thermal cycle from the 1st to the (N-2) th and (N-1) th times. Defining a non-complementary DNA portion consisting of a base sequence that does not complementarily bind to the amplification target region, and linking the non-complementary DNA portion to the 5 ′ end of the complementary DNA portion,
analysis method.

A method for analyzing base sequence information of an amplification product obtained by subjecting a primer set designed in the primer design step to a PCR reaction to amplify a region containing at least one locus, comprising a primer design step,
The coverage for each allele is corrected by the number of successful PCRs of the amplification product.
An analysis method characterized by
The primer design process includes:
From the base sequence information obtained by sequencing the amplification product obtained by the PCR reaction using the primer, the DNA sequence in the amplification product is converted into the DNA sequence in the thermal cycle in the PCR reaction. Including a base sequence specifying whether it is synthesized at the Nth or N + 1th cycle or a complementary base sequence thereof, and defining a base sequence on the 5 ′ end side of the primer, wherein N is 3 More than odd,
The primer used in the Nth and (N + 1) th thermal cycles,
In the step of designing primers used in the first and second thermal cycles, a complementary DNA portion consisting of a base sequence that complementarily binds to the 3 ′ end side of the amplification target region in the amplification target DNA is defined, Defining a non-complementary DNA portion consisting of a base sequence that does not bind complementarily to the amplification target region, and linking the non-complementary DNA portion to the 5 ′ end of the complementary DNA portion,
In the design process of primers used in the Nth and (N + 1) th thermal cycles, the base sequence of the non-complementary DNA portion on the 5 ′ end side of the primers used in the (N−2) th and (N−1) th thermal cycles Which is different from any of the nucleotide sequences of the non-complementary DNA portion on the 5 ′ end side of the primer used in the thermal cycle from the 1st to the (N-2) th and (N-1) th times. Defining a non-complementary DNA portion consisting of a base sequence that does not complementarily bind to the amplification target region, and linking the non-complementary DNA portion to the 5 ′ end of the complementary DNA portion,
analysis method.