JP6714709B2 - 核酸配列決定のための新規アダプターおよび使用法 - Google Patents

Description

本発明は、核酸分析、より具体的には、核酸配列決定に役立つアダプターに関する。

核酸配列決定の最新の方法、例えば次世代シークエンシング（ＮＧＳ）としても知られる超並列シークエンシング（ＭＰＳ）は、試料における個々の分子の分析を伴う。試料における各分子の分析は、普遍的プライマーを必要とする。さらに、単一分子分析の一部は、分子タグ付けまたはバーコード付けであり、それによって各分子はその起源および同一性に関する情報を所持する。アダプターを付加することによって、試料中のターゲット分子に、普遍的プライマー結合部位およびバーコードを付加することも可能である。アダプターは、アダプター配列を含有するプライマーを伸長させるかまたはアダプターを連結させることによって、付加可能である。

分子タグまたはバーコードは、ユニークな同定情報を含有する短い配列である。タグは特定の試料にユニークであってもよいし（試料由来のすべての分子に共有される）、またはタグを用いて個々の分子を同定してもよい（その分子の子孫にのみ共有される）。試料ＩＤタグ（ＳＩＤ）およびユニーク分子ＩＤタグ（ＵＩＤ）が当該技術分野に知られる。試料ＩＤは、配列決定実行において、試料をプールすることを可能にする一方、分子ＩＤは元来の試料中の各分子の子孫を追跡することを可能にする。

本発明は、最小限の資源の消費および最大限の感度で、エラーが減少した核酸配列決定を可能にする経済的なアダプターである。

１つの態様において、本発明は、一方の端に二本鎖部分、そして反対側の端に２つのハイブリダイズ不能鎖を含む一本鎖部分を含み、そして少なくとも１つのプライマー結合部位および各一本鎖部分中の少なくとも１つのバーコードをさらに含む、アダプターである。プライマー結合部位は一本鎖部分中にあることも可能である。

別の態様において、本発明は、アダプターのプールであって、各アダプターが、一方の端に二本鎖部分、そして反対側の端に２つのハイブリダイズ不能鎖を含む一本鎖部分を含み、そして少なくとも１つのプライマー結合部位および各一本鎖部分中の少なくとも１つのバーコードをさらに含み、プール中の各アダプター上のバーコードが既知の関係にある、前記プールである。同じアダプターの１つの鎖上のバーコードは少なくとも１編集距離離れていることも可能である。同じアダプター上のバーコード間の関係は逆相補性、相補性であることも可能であるし、あるいは参照表に捉えられていることも可能である。

別の態様において、本発明は、上述のアダプターのプールを含む製品である。プールは単一バイアル中に含有されることも可能である。
さらに別の態様において、本発明は、核酸を配列決定する方法であって：試料中の各核酸に、一方の端に二本鎖部分、そして反対側の端に２つのハイブリダイズ不能鎖を含む一本鎖部分を含み、そして少なくとも１つのプライマー結合部位ならびに一本鎖部分の第一の鎖上の第一のバーコードおよび第二の鎖上の第二のバーコードをさらに含む、アダプターを連結し、ここでプール中の各アダプター上の第一および第二のバーコードは既知の関係にあり、核酸鎖の少なくとも一部の配列ならびに第一および第二のバーコードの配列を決定し、第一のバーコードを含有する核酸鎖の配列、および第二のバーコードを含有する核酸鎖の配列を比較して、完全には相補性でない配列を同定し、完全には相補性でない配列が、少なくとも１つの実験エラーを含有することを決定する工程を含む、前記方法である。方法は、配列決定の前に、連結された核酸を増幅して、第一および第二のバーコードを含有する別個の二本鎖配列を得る工程をさらに含むことも可能である。少なくとも１つの実験エラーを含有すると決定された配列を、配列決定結果から除外することも可能である。方法は、同じバーコードおよび核酸の同じゲノム座標を含有する配列をグループ分けし、グループ内の配列を比較して、非同一配列を同定し、そして非同一配列が少なくとも１つの実験エラーを含有することを決定する工程をさらに含むことも可能である。方法で用いる試料はセルフリーＤＮＡを含有することも可能である。

さらに別の態様において、本発明は、核酸配列決定のためのアダプターのプールを作製する方法であって、核酸の一本鎖を対になる方式でアニーリングさせて、一方の端に二本鎖部分、そして反対側の端に２つのハイブリダイズ不能鎖を含む一本鎖部分を含み、そして少なくとも１つのプライマー結合部位および各一本鎖部分中の少なくとも１つのバーコードをさらに含む、アダプターを形成する工程を含む、ここでアニーリングの前に、核酸の一本鎖を、アダプターのプール中のバーコード間に既知の関係を確立する方式で組み合わせる、前記方法である。

試料核酸の両端に連結されたアダプターの図。

定義
用語「アダプター」は、核酸分子の一端または両端に付着可能なポリヌクレオチドを指す。アダプターは、二本鎖領域のみを含むことも可能であるし、または一本鎖領域もまた含むことも可能である。二本鎖領域は、２つの核酸鎖のハイブリダイズ可能な部分によって形成され、一方、一本鎖領域は、同じ２つの核酸鎖のハイブリダイズ不能な部分によって形成される。ハイブリダイズ不能部分はオープンである（Ｙ型アダプター）ことも可能であるし、または未結合５’および３’末端を連結することによって、共有的に閉鎖していることも可能である（ダンベル型アダプター）。Ｙ型アダプターの場合、アダプターの一本鎖部分は、ときに、「フォーク」と称され、一方、二本鎖部分は、ときに、「ステム」と称される。

用語「バーコード」および「インデックス」は、交換可能に用いられ、核酸分子を同定するために用いられる、ポリヌクレオチド内のヌクレオチドの配列を指す。例えば、バーコードは、いくつかの試料を合わせた際（いくつかの超並列シークエンシング技術において一般的であるように）、核酸分子が由来する試料を同定するために使用可能である。バーコードはまた、ユニークな核酸分子および増幅から生じるその子孫を同定するためにも使用可能である。バーコードは、核酸（例えばプライマーまたはアダプター）を合成する時点で合成可能である。バーコードは、あらかじめ定義されたまたはランダムな配列またはその組み合わせを含むことも可能である。用語「あらかじめ定義された」は、バーコードの配列が、バーコードを含む核酸を合成する時点で、知られていることを意味する。用語「ランダム」または「縮重配列」は、核酸内のバーコードを合成する際に、ヌクレオチドのランダムな混合物を用いることを意味する。非ランダム、すなわち塩基の偏向した混合物をオリゴヌクレオチド配列決定中に用いて、特定の塩基を優先的に含有するバーコードを生じてもよい。バーコードは、ときに、改変されないゲノムに存在する、内因性配列を含むことも可能である。内因性バーコードは、ランダムに断片化された核酸およびアダプターの接合部によって形成可能である。合成−内因性バーコードの組み合わせは、ランダムに断片化された核酸の開始および終了位のゲノム座標ならびにアダプター中の合成バーコードの組み合わせによって形成可能である。

用語、例えばアダプター内の、「一本鎖バーコード」は、相補配列にハイブリダイズしていないバーコードを意味する。「二本鎖バーコード」は、相補配列にハイブリダイズしたバーコードを意味する。例えば、一本鎖バーコードは、アダプターの一本鎖部分に位置することも可能であり、そして二本鎖バーコードはアダプターの二本鎖部分に位置することも可能である。

用語「ハイブリダイズ可能」は、二重鎖を形成可能な２つのポリヌクレオチド鎖を指す。二重鎖は、鎖が完全にまたは少なくとも部分的に相補的である場合に、形成可能である。相補性は、ワトソン−クリック水素結合によって定義可能である。完全なワトソン−クリック相補性の非存在下で、さらなる相互作用（例えばフーグスティーン対形成および疎水性相互作用）がハイブリダイゼーションを支持することも可能である。

用語「ハイブリダイズ不能」は、実験条件下で、二重鎖を形成不能な２つのポリヌクレオチド鎖を指す。鎖が部分的にさえ相補性を共有せず、そしてさらなる相互作用（例えばフーグスティーン対形成および疎水性相互作用）が特異的ハイブリダイゼーションを支持するには十分でない場合、二重鎖は形成不能である。

用語、２つの核酸配列間、特に２つのバーコード間の「編集距離」は、１つの配列を別のものに変化させるために必要な変化の数を指し、ここで、変化は、塩基の付加、除去または置換である。

バーコードに関連した用語「対形成した」は、アダプター分子の２つのオリゴ上の２つのバーコード配列間で既知の関係を有することを意味する。該用語には、相補性（塩基対形成）、逆相補性、ならびに任意の他の人工的関係、例えば参照表が含まれ、バーコード化された２つのアダプター鎖が、ハイブリダイゼーション工程中に、意図的に対形成されていることを示す。

用語「増幅」は、核酸配列のコピー数を増加させるための任意の方法を指す。例えば、増幅は、例えば１またはそれより多いポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）あるいは増幅の別の指数関数的方法または線形法において、ポリメラーゼを用いて実行可能である。用語「アンプリコン」は、増幅反応の核酸産物を意味する。

用語「普遍的プライマー」および「普遍的プライマー部位」は、いかなるターゲット配列中にも存在しないが、すべてのターゲット配列に付加された（例えばターゲット特異的プライマーの一部であることによって、またはアダプターの一部であることによって）、プライマーおよびプライマー結合性配列を指す。普遍的プライマー部位を付加した後、普遍的プライマーを、試料中のすべてのターゲット配列の増幅または配列決定に使用可能である。

用語「重複排除（ｄｅｄｕｐｉｎｇ）」は、核酸配列を、試料中に元来存在した単一分子の子孫からなる群にグループ分けする方法を指す。重複排除は、子孫分子の配列の分析をさらに含み、減少したエラー率で、元来の分子の配列を間接的に決定する。

用語「エラー」は、核酸配列決定の背景において、正しくない塩基読み取りを指す。該用語は、配列決定工程自体のエラーだけでなく、配列決定工程中に現れる任意のエラーを含む。エラーには、プライマー伸長またはターゲット増幅中のＤＮＡポリメラーゼのエラー、配列決定ポリメラーゼのエラー、および配列決定装置、例えば検出装置のエラーが含まれる。人工的な配列を読み取る場合（例えばアダプター配列）、エラーにはまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＤＮＡ合成（オリゴ合成）のエラーもまた含まれる。エラーには、塩基置換（誤った塩基）、取り込み欠如（塩基欠失）、または塩基付加（挿入塩基）が含まれる。用語「エラー率」は、正しい塩基読み取りあたりのエラー数を指す。用語、エラー防止手段による「エラー率減少」は、手段を伴わないエラー率に比較した、手段を伴うエラー率を指す。

用語「セルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）」は、収集した際、細胞内に含有されていない試料中のＤＮＡを指す。該用語は、細胞または組織のｉｎ ｖｉｔｒｏ破壊によって、セルフリーとなったＤＮＡを指さない。ｃｆＤＮＡは、正常細胞および癌細胞由来ＤＮＡの両方を含むことも可能である。ｃｆＤＮＡは、一般的に血液または血漿（「循環」）から得られる。ｃｆＤＮＡは、分泌あるいは細胞死プロセス、例えば細胞壊死またはアポトーシスを通じて、循環内に放出されうる。いくつかのｃｆＤＮＡはｃｔＤＮＡ（以下を参照されたい）である。

用語「循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）」または「循環癌ＤＮＡ」は、腫瘍から生じるセルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の分画を指す。
用語「試料」は、被験体から単離される任意の生物学的試料を指す。例えば、試料には、体組織または体液が含まれることも可能である。試料はまた、腫瘍試料であることも可能である。試料は、被験体から直接、以前切除されるかまたは抜き取られた試料から、あるいは環境から（例えば法医学試料）得られることも可能である。

用語「血液試料」は、全血、または血球、血清および血漿を含む、任意のその分画を指す。
本発明には、核酸の一分子配列決定のためのアダプターが含まれる。核酸分子にコンジュゲート化されたアダプターを図１に示す。次世代シークエンシング（ＮＧＳ）または超並列シークエンシング（ＭＰＳ）と称される現在の核酸配列決定法は、試料中の各個々の分子の捕捉、場合によって増幅および配列決定を伴う。場合による増幅は、捕捉前、捕捉後、またはその両方であることも可能である。ＮＧＳは、さらに、普遍的配列決定プライマー、および場合によって普遍的増幅前プライマーを伴う。普遍的プライマー用の結合部位を生成するため、各ターゲット核酸分子をアダプターにコンジュゲート化する。アダプターは、典型的には、ターゲット核酸分子の両側にコンジュゲート化され、そして普遍的プライマー用の結合部位および配列決定に必要な他の配列を含有する。アダプターは、ターゲット分子が由来する試料をユニークに同定するバーコード（試料ＩＤまたはＳＩＤ）を含有することも可能である。アダプターは、各ターゲット分子をユニークに同定するバーコード（ユニーク分子ＩＤまたはＵＩＤ）を含有することも可能である。ＳＩＤおよびＵＩＤは、別個に存在することも可能であるし、または単一バーコードに統合されることも可能である。

二本鎖ターゲット核酸にアダプターを付着させる好適な方法は、連結を介したものである。連結反応が起こるために、ターゲット核酸およびアダプターは、適合する端を持たなければならない。いくつかの態様において、ターゲット核酸は末端修復されて平滑端を含有し、そしてアダプターは二本鎖平滑端を有する。他の態様において、ターゲット核酸は末端修復されて、そしてターゲット核酸およびアダプターはどちらも、一塩基伸長を有するように操作される。例えば、Ｔ−Ａ対を生成する伸長によって、アダプター分子およびターゲット核酸の間の効率的な連結が可能になる。制限消化から生じるＤＮＡオーバーハングもまた、連結効率を改善するために使用可能である。

特に好適であるのは、例えば米国特許第６３９５８８７号に記載されるＹ型アダプターである。これらのアダプターは、一方の端に二本鎖部分を、そして反対側の端に２つのハイブリダイズ不能鎖を含む一本鎖部分を含む。二本鎖部分のみが、ターゲット核酸への連結が可能であり、連結された産物の正しい配向が確実になる。

１つの態様において、本発明は、核酸分析のための新規アダプターである（図１）。該アダプターは、一方の端に二本鎖部分、そして反対側の端に２つのハイブリダイズ不能鎖を含む一本鎖部分を含む。各部分の正確な長さは、アダプターが以下の特性を所持する限り、本質的ではない：１）以下に記載するすべての要素を収容するために十分な長さを有する；２）適切な融点を有する；そして３）一本鎖部分中で、アダプターの性能を妨害しうる、いかなる二次構造も形成しない。当業者は、特定のアッセイの必要性を満たすために、所望の融点を有するオリゴヌクレオチドを設計することも可能である。同様に、当業者は、最新技術のオリゴヌクレオチド設計ツールを用いて、少なくともいくつかの二次構造形成を回避するかまたは軽減することも可能である。いくつかの態様において、一本鎖部分の長さが２０ヌクレオチドを超えず、そして二本鎖の長さが室温でハイブリダイズしたままであり、そしてＤＮＡリガーゼの結合を可能にするために十分であることが望ましい。

アダプターは、１またはそれより多いプライマーのための結合部位を含む。プライマーは、配列決定プライマー、増幅プライマーまたはその両方であることも可能である。いくつかの態様において、同じプライマーが、配列決定プライマーおよび増幅プライマーであることも可能である。アダプターはまた、特定の配列決定技術に特異的な配列、例えば配列決定装置における固体支持体にハイブリダイズする配列（例えばＩｌｌｕｍｉｎａ装置におけるクラスター生成配列）も含むことも可能である。

アダプターは、天然存在塩基（例えばアデノシン（Ａ）、チミジン（Ｔ）、グアノシン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ））、他の天然塩基、例えばイノシン（Ｉ）およびメチル−シトシン（ｍＣ）、天然塩基の修飾型、ならびに非天然存在塩基、例えばアミノアリル−ウリジン、イソシトシン、イソグアニン、および２−アミノプリンを含有することも可能である。

本発明のアダプターは、さらにバーコードを含む。バーコードは、上述の天然または非天然ヌクレオチドを含有することも可能である。バーコードは、あらかじめ定義された配列、ランダム配列、または特定の塩基を優先的に含有する非ランダム偏向配列を有することも可能である。いくつかの態様において、偏向配列を用いて、誤りがちな塩基を回避する。他の態様において、偏向配列を用いて、バーコード含有核酸の融点を調節する。図１に示すように、各アダプターは、２つのバーコードまたはインデックスを、一本鎖部分の一本鎖各々の上に１つずつ含む。ターゲットＤＮＡ断片および２つのアダプターを含む連結産物は、４つのバーコードを含む。各アダプター中のバーコード（例えばインデックス１Ａおよび１Ｂ）は、１：１の関係の配列を有する。関係は、相補性；逆相補性；または１つのバーコード配列（例えばインデックス１Ａ）の同定が、第二のバーコード配列（インデックス１Ｂ）を明白に決定する任意の関係であってもよい。

いくつかの態様において、本発明は、図１に記載するアダプターのプールである。プール中、各アダプターは、一方の端に二本鎖部分を、そして反対側の端に２つのハイブリダイズ不能鎖を含む一本鎖部分を含む。プール中のアダプターは、１またはそれより多いプライマー、例えば配列決定プライマー、増幅プライマーまたはその両方のための結合部位をさらに含む。プール中のアダプターは、さらにバーコードを含む。具体的には、各アダプターは、一本鎖部分の一本鎖各々の上に１つずつ、２つのバーコードを含む。アダプター中のバーコードは、１：１の関係であり、１つのバーコード配列の同定は、第二のバーコード配列を明白に決定する。配列は、相補性、逆相補性であってもよいし、または上述のいずれでなくてもよい。

プール内のアダプターは、少なくとも１または少なくとも３編集距離離れたバーコードを有する。当業者は、特定の実験のために、どの編集距離が最適であるかを決定可能であろう。一般的に、編集距離がより大きいことは、１つのプール中により少ないバーコードが使用可能であることを意味する。しかし、アッセイまたは製造プロセスが高いエラー率を有する場合、より大きい編集距離が必要となるであろう。例えば、アダプターを作製するために用いるオリゴヌクレオチド製造プロセスは、高いエラー率を有しうる。同様に、合成ワークフローによる配列決定におけるＤＮＡ増幅またはプライマー伸長で用いる核酸ポリメラーゼは、高いエラー率を有しうる。これらのエラー率は、プールのアダプター中のバーコード間の編集距離を増加させる必要があるであろう。逆に、上述の方法各々の精度を改善すると、プールのアダプター中のバーコード間の編集距離を減少させることが可能であろう。

いくつかの態様において、本発明は、各々２つのアニーリングしたオリゴヌクレオチドからなる、Ｎの別個のアダプターのプール（プール中に２Ｎオリゴヌクレオチド）である。アダプター中のバーコードの長さに応じて、各試料は、Ａアダプターからなるプールを必要とするであろう。したがって、Ｎのプールは、Ｎ／Ａ＝Ｓ試料において使用可能である。いくつかの態様において、製品は、アダプターの全プールを含有する単一バイアルを含むことも可能である。あるいは、製品は、プールの１またはそれより多いアダプターが別個のバイアル中に存在するキットを含むことも可能である。

いくつかの態様において、本発明は、核酸分析のためのアダプターを作製する方法である。該方法は、核酸の２つの一本鎖を対方式で合わせ、そしてアニーリングさせて、各アダプターが、一方の端に二本鎖部分、そして反対側の端に２つのハイブリダイズ不能鎖を含む一本鎖部分を含むアダプターを形成する工程を含む。アダプターを形成する一本鎖は、１またはそれより多いプライマー、例えば配列決定プライマー、増幅プライマーまたは両方のための結合部位を含む。アダプターを形成する一本鎖は、さらにバーコードを含む。具体的には、各鎖は、非相補領域中にバーコードを含み、したがって、各アダプターは、一本鎖部分の各々の一本鎖の上に少なくとも１つずつ、少なくとも２つのバーコードを含む。アダプター中のバーコードが１：１関係であるように、一本鎖を合わせ、そしてアニーリングさせる。配列は、相補的、逆相補的であってもよいし、または上述のいずれでなくてもよく、すなわち２つの異なる配列であってもよい。後者の場合、１つの配列（例えば図１中のインデックス１Ａ）の同定が、第二の配列（図１中のインデックス１Ｂ）を明白に決定する参照を生成することを伴う方法において、アダプターを使用可能である。

いくつかの態様において、本発明は、一本鎖バーコードを含むアダプターを用いて、試料中の核酸を配列決定する方法である。該方法は、試料中の核酸に、アダプターのプールを付着させて、アダプター−ターゲット分子のプールを形成する工程を含む。付着は、ＤＮＡリガーゼ、例えばＴ４ ＤＮＡリガーゼ、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＤＮＡリガーゼ、哺乳動物リガーゼ、またはその任意の組み合わせを用いた連結を介してもよい。哺乳動物リガーゼは、ＤＮＡリガーゼＩ、ＤＮＡリガーゼＩＩＩ、またはＤＮＡリガーゼＩＶであってもよい。リガーゼはまた熱安定性リガーゼであってもよい。いくつかの態様において、連結効率を増加させるため、試料核酸を末端修復（例えばＤＮＡポリメラーゼを用いたもの）およびＡテール付加に供してもよく、また、ＤＮＡポリメラーゼまたは末端トランスフェラーゼに供してもよい。

各アダプターは、一方の端に二本鎖部分、そして反対側の端に２つのハイブリダイズ不能鎖を含む一本鎖部分を含む。アダプターは、一本鎖部分の一方の鎖に第一のバーコードを、そして一本鎖部分の他方の鎖に第二のバーコードを含み、そしてここで、各アダプター中の第一および第二のバーコードは、第一のバーコード各々が、第二のバーコード各々と明白に関連しうるように、既知の関係にある。各試料において、バーコードの多数の対を伴う多数のアダプターが存在するが、アダプターは各試料中のターゲット核酸分子よりも少ない。しかし、バーコードのユニークな対を伴うアダプターの数は、試料中の元来の核酸分子のすべて、ほぼすべて、または望ましい割合を同定するために十分である。同定は、以下に記載するように、ユニークなバーコードおよび各ターゲット核酸分子のゲノム座標（ブレイクポイント）の両方を利用する。アダプターは、１またはそれより多いプライマーの結合部位をさらに含む。いくつかの態様において、方法は、配列を決定する前に、アダプター−ターゲット分子の両方の鎖を増幅する工程をさらに含む。方法は、アダプター−ターゲット分子の配列を決定する工程をさらに含む。この工程において、ターゲット核酸の配列の少なくとも一部を決定し、そしてアダプター中のバーコードの配列を決定する。方法は、各々第一のバーコードを含有するアダプター−ターゲット配列を、第一のバーコードと既知の関係にある対応する第二のバーコードを含有するアダプター−ターゲット配列と対形成させる、エラー修正工程をさらに含む。図１に示すように、バーコード１Ａを含むアダプターに付着したターゲット配列は、バーコード１Ｂを含むアダプターに付着したターゲット配列と対形成する。バーコード１Ａを含む第一の分子は、元来の分子の第一の鎖に相当し、そしてバーコード１Ｂを含む第二の分子は、元来の分子の第二の鎖に相当する。バーコード１Ａおよび１Ｂの対形成は、エラー修正のため、元来の鎖のマッチングを可能にする。第一および第二の分子のターゲット配列が同一でない場合、例えば第一の分子にのみ塩基置換が存在するが、第二の分子には存在しない場合、変化は、実験エラーであると見なされる。実験エラーを含有する分子は結果から除外する。いくつかの態様において、生データファイルに見られる、実験エラーを含有する分子は、結果ファイルに含まれない。

同じ起源の配列もまた、同じアダプターバーコードおよびターゲット核酸の同じゲノム座標を有することによって同定される。同じ起源の分子のターゲット配列が同一でない場合、例えば同じ起源の分子の一部にのみ塩基置換が存在する場合、変化は実験エラーと見なされる。

いくつかの態様において、試料はセルフリー核酸、例えばセルフリー血漿核酸を含む。こうしたＤＮＡを断片化してもよく、例えば平均長さ約１７０ヌクレオチドであってもよく、これは単一ヌクレオソーム周囲に巻き付けられるＤＮＡの長さと一致していてもよい。試料核酸が天然に断片化されない態様において、核酸を、例えば超音波処理または制限消化を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで断片化してもよい。

Claims (9)

1. アダプターのプールであって、各アダプターが、一方の端に二本鎖部分、そして反対側の端に２つのハイブリダイズ不能鎖を含む一本鎖部分を含み、そして少なくとも１つのプライマー結合部位および各一本鎖部分中の少なくとも１つのバーコードをさらに含み、該プール中の各アダプター上のバーコード間が既知の関係にあり、バーコード間の該関係が逆相補性または相補性である、前記アダプターのプール。
2. バーコード間の前記関係が参照表に捉えられている、請求項１のアダプターのプール。
3. 請求項１または２のアダプターのプールを含む製品。
4. 前記プールが単一バイアル中に含有される、請求項３の製品。
5. 核酸を配列決定する方法であって：
   ａ）試料中の各核酸に、一方の端に二本鎖部分、そして反対側の端に２つのハイブリダイズ不能鎖を含む一本鎖部分を含み、そして少なくとも１つのプライマー結合部位ならびに一本鎖部分の第一の鎖上の第一のバーコードおよび第二の鎖上の第二のバーコードをさらに含む、請求項１または２のアダプターのプールに由来するアダプターを連結し、ここでプール中の各アダプター上の該第一および該第二のバーコードは既知の関係にある、
   ｂ）核酸鎖の少なくとも一部ならびに第一および第二のバーコードの配列を決定し、
   ｃ）第一のバーコードを含有する核酸鎖の配列、および第二のバーコードを含有する核酸鎖の配列を比較して、完全には相補性でない配列を同定し、
   ｄ）完全には相補性でない配列が、少なくとも１つの実験エラーを含有することを決定する
   工程を含む、前記方法。
6. 配列決定の前に、連結された核酸を増幅して、第一および第二のバーコードを含有する別個の二本鎖配列を得る工程をさらに含む、請求項５の方法。
7. 少なくとも１つの実験エラーを含有すると決定された配列を、配列決定結果から除外する、請求項５の方法。
8. 同じバーコードおよび核酸の同じゲノム座標を含有する配列をグループ分けし、グループ内の配列を比較して、非同一配列を同定し、そして該非同一配列が少なくとも１つの実験エラーを含有することを決定する工程をさらに含む、請求項５の方法。
9. 前記試料がセルフリーＤＮＡを含有する、請求項５の方法。