JP6714709B2 - 核酸配列決定のための新規アダプターおよび使用法 - Google Patents
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Description
さらに別の態様において、本発明は、核酸を配列決定する方法であって:試料中の各核酸に、一方の端に二本鎖部分、そして反対側の端に2つのハイブリダイズ不能鎖を含む一本鎖部分を含み、そして少なくとも1つのプライマー結合部位ならびに一本鎖部分の第一の鎖上の第一のバーコードおよび第二の鎖上の第二のバーコードをさらに含む、アダプターを連結し、ここでプール中の各アダプター上の第一および第二のバーコードは既知の関係にあり、核酸鎖の少なくとも一部の配列ならびに第一および第二のバーコードの配列を決定し、第一のバーコードを含有する核酸鎖の配列、および第二のバーコードを含有する核酸鎖の配列を比較して、完全には相補性でない配列を同定し、完全には相補性でない配列が、少なくとも1つの実験エラーを含有することを決定する工程を含む、前記方法である。方法は、配列決定の前に、連結された核酸を増幅して、第一および第二のバーコードを含有する別個の二本鎖配列を得る工程をさらに含むことも可能である。少なくとも1つの実験エラーを含有すると決定された配列を、配列決定結果から除外することも可能である。方法は、同じバーコードおよび核酸の同じゲノム座標を含有する配列をグループ分けし、グループ内の配列を比較して、非同一配列を同定し、そして非同一配列が少なくとも1つの実験エラーを含有することを決定する工程をさらに含むことも可能である。方法で用いる試料はセルフリーDNAを含有することも可能である。
用語「アダプター」は、核酸分子の一端または両端に付着可能なポリヌクレオチドを指す。アダプターは、二本鎖領域のみを含むことも可能であるし、または一本鎖領域もまた含むことも可能である。二本鎖領域は、2つの核酸鎖のハイブリダイズ可能な部分によって形成され、一方、一本鎖領域は、同じ2つの核酸鎖のハイブリダイズ不能な部分によって形成される。ハイブリダイズ不能部分はオープンである(Y型アダプター)ことも可能であるし、または未結合5’および3’末端を連結することによって、共有的に閉鎖していることも可能である(ダンベル型アダプター)。Y型アダプターの場合、アダプターの一本鎖部分は、ときに、「フォーク」と称され、一方、二本鎖部分は、ときに、「ステム」と称される。
用語「試料」は、被験体から単離される任意の生物学的試料を指す。例えば、試料には、体組織または体液が含まれることも可能である。試料はまた、腫瘍試料であることも可能である。試料は、被験体から直接、以前切除されるかまたは抜き取られた試料から、あるいは環境から(例えば法医学試料)得られることも可能である。
本発明には、核酸の一分子配列決定のためのアダプターが含まれる。核酸分子にコンジュゲート化されたアダプターを図1に示す。次世代シークエンシング(NGS)または超並列シークエンシング(MPS)と称される現在の核酸配列決定法は、試料中の各個々の分子の捕捉、場合によって増幅および配列決定を伴う。場合による増幅は、捕捉前、捕捉後、またはその両方であることも可能である。NGSは、さらに、普遍的配列決定プライマー、および場合によって普遍的増幅前プライマーを伴う。普遍的プライマー用の結合部位を生成するため、各ターゲット核酸分子をアダプターにコンジュゲート化する。アダプターは、典型的には、ターゲット核酸分子の両側にコンジュゲート化され、そして普遍的プライマー用の結合部位および配列決定に必要な他の配列を含有する。アダプターは、ターゲット分子が由来する試料をユニークに同定するバーコード(試料IDまたはSID)を含有することも可能である。アダプターは、各ターゲット分子をユニークに同定するバーコード(ユニーク分子IDまたはUID)を含有することも可能である。SIDおよびUIDは、別個に存在することも可能であるし、または単一バーコードに統合されることも可能である。
Claims (9)
- アダプターのプールであって、各アダプターが、一方の端に二本鎖部分、そして反対側の端に2つのハイブリダイズ不能鎖を含む一本鎖部分を含み、そして少なくとも1つのプライマー結合部位および各一本鎖部分中の少なくとも1つのバーコードをさらに含み、該プール中の各アダプター上のバーコード間が既知の関係にあり、バーコード間の該関係が逆相補性または相補性である、前記アダプターのプール。
- バーコード間の前記関係が参照表に捉えられている、請求項1のアダプターのプール。
- 請求項1または2のアダプターのプールを含む製品。
- 前記プールが単一バイアル中に含有される、請求項3の製品。
- 核酸を配列決定する方法であって:
a)試料中の各核酸に、一方の端に二本鎖部分、そして反対側の端に2つのハイブリダイズ不能鎖を含む一本鎖部分を含み、そして少なくとも1つのプライマー結合部位ならびに一本鎖部分の第一の鎖上の第一のバーコードおよび第二の鎖上の第二のバーコードをさらに含む、請求項1または2のアダプターのプールに由来するアダプターを連結し、ここでプール中の各アダプター上の該第一および該第二のバーコードは既知の関係にある、
b)核酸鎖の少なくとも一部ならびに第一および第二のバーコードの配列を決定し、
c)第一のバーコードを含有する核酸鎖の配列、および第二のバーコードを含有する核酸鎖の配列を比較して、完全には相補性でない配列を同定し、
d)完全には相補性でない配列が、少なくとも1つの実験エラーを含有することを決定する
工程を含む、前記方法。 - 配列決定の前に、連結された核酸を増幅して、第一および第二のバーコードを含有する別個の二本鎖配列を得る工程をさらに含む、請求項5の方法。
- 少なくとも1つの実験エラーを含有すると決定された配列を、配列決定結果から除外する、請求項5の方法。
- 同じバーコードおよび核酸の同じゲノム座標を含有する配列をグループ分けし、グループ内の配列を比較して、非同一配列を同定し、そして該非同一配列が少なくとも1つの実験エラーを含有することを決定する工程をさらに含む、請求項5の方法。
- 前記試料がセルフリーDNAを含有する、請求項5の方法。
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