ES2683037T3

ES2683037T3 - Diagnóstico de tumores malignos linfoides y detección de enfermedad residual mínima

Info

Publication number: ES2683037T3
Application number: ES12856015.8T
Authority: ES
Inventors: Anna M SHERWOOD; Harlan S ROBINS
Original assignee: Fred Hutchinson Cancer Research Center; Adaptive Biotechnologies Corp
Current assignee: Adaptive Biotechnologies Corp; Fred Hutchinson Cancer Center
Priority date: 2011-12-09
Filing date: 2012-12-07
Publication date: 2018-09-24
Anticipated expiration: 2032-12-07
Also published as: CA2858070A1; AU2012347460B2; WO2013086450A1; EP2788509B1; CA2858070C; EP3388535A1; US20130253842A1; AU2012347460A1; EP2788509A1; EP2788509A4; ES2867924T3; EP3388535B1; EP3904536A1; US9824179B2

Abstract

Un método para detectar enfermedad residual mínima para un tumor maligno hematológico linfoide en un sujeto después de la terapia, comprendiendo el método (a) amplificación de ADN extraído de una primera muestra en una reacción en cadena de polimerasa múltiple (PCR) utilizando cebadores del segmentos V y J para producir una multiplicidad de moléculas de ADN reordenado amplificado que comprenden cada una una región que codifica CDR3 de TCR, en donde la primera muestra se ha obtenido del sujeto antes de la terapia y comprende una pluralidad de células hematopoyéticas linfoides, (b) secuenciación de alto rendimiento de dicha multiplicidad de moléculas de ADN reordenado amplificado para determinar las frecuencias relativas de regiones que codifican CDR3 de TCR reordenadas de manera única en la primera muestra, identificando así la región que codifica CDR3 de TCR reordenada de manera única de los uno o más clones de células T malignas, (c) amplificación de ADN extraído de una segunda muestra en una reacción en cadena de polimerasa múltiple (PCR) utilizando los cebadores del segmento V y J para producir una multiplicidad de moléculas de ADN reordenado amplificado comprendiendo cada una una región que codifica CDR3 de TCR, en donde la segunda muestra se ha obtenido del sujeto después de la terapia y comprende una pluralidad de células hematopoyéticas linfoides, y (d) secuenciación de alto rendimiento de dicha multiplicidad de moléculas de ADN reordenado amplificado producidas a partir de la segunda muestra para determinar la frecuencia relativa de la región que codifica CDR3 de TCR reordenada de manera única de los uno o más clones de células T malignas en la segunda muestra, en donde la presencia de la región que codifica CDR3 de TCR reordenada de manera única de los uno o más clones de células T malignas a una frecuencia relativa de al menos una frecuencia de uno de cada 106 a uno de cada 105 regiones que codifican CDR3 de TCR indica enfermedad residual mínima para el tumor maligno hematológico linfoide; en donde la PCR múltiple comprende adicionalmente una pluralidad de oligonucleótidos molde que tiene una pluralidad de secuencias de oligonucleótidos de fórmula general 5'-U1-B1-V-B2-R-B3-J-B4-U2-3' [I] en donde (i) V es un polinucleótido que comprende al menos 20, 30, 60, 90, 120, 150, 180 o 210, y no más de 1000, 900, 800, 700, 600 o 500 nucleótidos contiguos de una secuencia génica que codifica la región variable (V) del receptor inmunitario adaptativo, o el complemento de la misma, y en cada una de la pluralidad de secuencias de oligonucleótidos V comprende una secuencia oligonucleotídica única, (ii) J es un polinucleótido que comprende al menos 15-30, 31-60, 61-90, 91-120 o 120-150, y no más de 600, 500, 400, 300 o 200 nucleótidos contiguos de una secuencia génica que codifica la región de empalme (J) del receptor inmunitario adaptativo, o el complemento de la misma, y en cada una de la pluralidad de secuencias de oligonucleótidos J comprende una secuencia oligonucleotídica única, (iii) U1 no es nada o comprende un oligonucleótido que tiene una secuencia que se selecciona entre (1) una primera secuencia de oligonucleótido adaptador universal, y (2) una primera secuencia oligonucleotídica específica de la plataforma de secuenciación que está conectada y posicionada 5' con respecto a la primera secuencia de nucleótido adaptador universal, (iv) U2 no es nada o comprende un oligonucleótido que tiene una secuencia que se selecciona entre (1) una segunda secuencia de oligonucleótido adaptador universal, y (2) una segunda secuencia oligonucleotídica específica de la plataforma de secuenciación que está conectada y posicionada 5' con respecto a una segunda secuencia de oligonucleótido adaptador universal, (v) B1, B2, B3 y B4 son cada uno independientemente nada o cada uno comprende un oligonucleótido B que comprende una secuencia código de barras de oligonucleótido de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25, nucleótidos contiguos, en donde en cada una de la pluralidad de secuencias de oligonucleótidos B comprende una secuencia oligonucleotídica única que identifica de forma única, como una combinación pareada, (1) la secuencia oligonucleotídica V única de (i) y (2) la secuencia oligonucleotídica J única de (ii), y (vi) R no es nada o comprende un sitio de reconocimiento para enzimas de restricción que comprende una secuencia oligonucleotídica que está ausente de (i) - (v).

Description

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DESCRIPCION

Diagnostico de tumores malignos linfoides y deteccion de enfermedad residual minima

Antecedentes

Campo tecnico

La presente descripcion se refiere en general a la cuantificacion altamente sensible de la representacion relativa de celulas inmunitarias adaptativas que tienen un reordenamiento del gen que codifica el receptor de celulas T (TCR) o inmunoglobulina (Ig) concreto (p.ej., clonotipo), en muestras obtenidas de un sujeto antes y/o despues de un tratamiento terapeutico. La determinacion de las frecuencias relativas de tales clonotipos se puede utilizar para diagnosticar ciertos tumores malignos hematologicos linfoides y otros trastornos. Ademas, la determinacion de las frecuencias relativas de tales clonotipos despues del tratamiento terapeutico proporciona una deteccion exquisitamente sensible de enfermedad residual minima (ERM).

Descripcion de la tecnica relacionada

El sistema inmunitario adaptativo protege a los organismos superiores contra infecciones y otros eventos patologicos que pueden ser atribuibles a sustancias foraneas, utilizando receptores inmunitarios adaptativos, las protemas de reconocimiento espedficas de antfgenos que son expresadas por celulas hematopoyeticas del linaje linfoide y que son capaces de distinguir las moleculas propias de las no propias en el anfitrion. Estos linfocitos se pueden encontrar en la circulacion y los tejidos de un anfitrion, y se ha descrito su recirculacion entre sangre y vasos linfaticos, incluida su extravasacion a traves de venulas endoteliales altas de nodulos linfaticos, asf como en sitios de infeccion, inflamacion, lesion tisular y otros insultos clmicos. (Vease, p.ej., Stein et al., 2005 Immunol. 116:1-12; DeNucci et al., 2009 Crit. Rev. Immunol. 29:87-109; Marelli-Berg et al., 2O1O Immunol. 130:158; Ward et al., 2009 Biochem. J. 418:13; Gonzalez et al., 2011 Ann. Rev. Immunol. 29:215; Kehrl et al., 2009 Curr. Top. Microb. Immunol. 334:107; Steinmetz et al., 2009 Front. Biosci. (Schol. Ed.) 1:13.)

En consecuencia, la naturaleza dinamica del movimiento de los linfocitos a traves de un organismo anfitrion se refleja en cambios en la distribucion cualitativa (p.ej., especificidad por el antfgeno del receptor inmunitario adaptativo expresado clonalmente (inmunoglobulina o receptor de celulas T), celula T frente a celula B, celula T colaboradora (Th) frente a celula T reguladora (Treg), celula T efectora frente a celula T de memoria, etc.) y cuantitativa de linfocitos entre tejidos, como una funcion de los cambios en el estado inmunitario del anfitrion.

El sistema inmunitario adaptativo emplea varias estrategias para generar un repertorio de receptores de antfgenos de celulas T y B con diversidad suficiente para reconocer el universo de posibles patogenos. Los linfocitos B maduran para expresar anticuerpos (inmunoglobulinas, Ig o Ig, tambien conocidas como receptores de celulas B, BCR) que se presentan como heterodfmeros de un polipeptido de cadena pesada (H) o ligera (L), mientras que los linfocitos T expresan receptores de celulas T (TCR) heterodimericos. La capacidad de las celulas T para reconocer el universo de antfgenos asociados con diversos canceres u organismos infecciosos es conferida por su receptor de antfgeno de celulas T (TCR), que es un heterodfmero que comprende una cadena a (alfa) y una cadena p (beta), o una cadena y (gamma) y una cadena 8 (delta). Las protemas que componen estas cadenas estan codificadas por ADN, que emplea un mecanismo unico para generar la tremenda diversidad del TCR. Este receptor de reconocimiento inmunitario de multiples subunidades se asocia con el complejo CD3 y se une a los peptidos presentados por las protemas de clase I y II del complejo mayor de histocompatibilidad (mHc) en la superficie de las celulas presentadoras de antfgeno (APC). La union de TCR al peptido antigenico en la APC es un evento central en la activacion de celulas T, que se produce en una sinapsis inmunologica en el punto de contacto entre la celula T y la APC.

Cada peptido de TCR contiene regiones determinantes de complementariedad (CDR) variables, asf como regiones estructurales (FR) y una region constante. La diversidad de secuencias de las celulas T ap esta determinada en gran parte por la secuencia de aminoacidos de los bucles de la tercera region determinante de la complementariedad (CDR3) de los dominios variables de la cadena a y p, cuya diversidad es el resultado de la recombinacion entre segmentos de genes variables (Vp), de diversidad (Dp), y de empalme (Jp) en el locus de la cadena p, y entre segmentos de genes Va y Ja analogos en el locus de la cadena a, respectivamente. La existencia de multiples de tales segmentos de genes en los loci de la cadena a y p de TCR permite codificar una gran cantidad de secuencias de CDR3 distintas. La diversidad de la secuencia de CDR3 aumenta adicionalmente mediante la adicion y delecion independiente de nucleotidos a las uniones Vp-Dp, Dp-Jp, y Va-Ja durante el proceso de reordenamiento del gen de TCR. A este respecto, la inmunocompetencia se refleja en la diversidad de los TCR.

El TCR y8 es distintivo del TCR ap porque codifica un receptor que interactua estrechamente con el sistema inmunitario innato. TCRy8, se expresa al inicio del desarrollo, tiene una distribucion anatomica especializada, tiene especificidades unicas de patogenos y moleculas pequenas, y tiene un amplio espectro de interacciones celulares

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innatas y adaptativas. En la ontogenia se establece temprano un patron sesgado de la expresion del segmento V y J de TCRy ya que los subconjuntos restringidos de celulas TCRy5 pueblan la boca, la piel, el intestino, la vagina y los pulmones prenatalmente. En consecuencia, el repertorio diverso de TCRy en tejidos adultos es el resultado de una amplia expansion periferica despues de la estimulacion por exposicion ambiental a patogenos y moleculas toxicas.

Las Ig (BCR) expresadas por las celulas B son protemas que consisten en cuatro cadenas polipeptfdicas, dos cadenas pesadas (cadenas H) y dos cadenas ligeras (cadenas L), que forman una estructura H2L2. Cada par de cadenas H y L contiene un dominio hipervariable, que consiste en una region Vl y una Vh, y un dominio constante. Las cadenas H de las Ig son de varios tipos, |j, 5, y, a y p. La diversidad de las Ig dentro de un individuo esta determinada principalmente por el dominio hipervariable. De manera similar al TCR, el dominio V de las cadenas H de Ig se crea mediante la union combinatoria de los segmentos genicos Vh, Dh y Jh. La diversidad de secuencias de los dominios hipervariables se incrementa adicionalmente mediante la adicion y delecion independientes de nucleotidos a las uniones Vh-Dh, Dh-Jh, y Vh-Jh durante el proceso de reordenamiento del gen Ig. A este respecto, la inmunocompetencia se refleja en la diversidad de las Ig.

La caracterizacion cuantitativa de las celulas inmunitarias adaptativas basada en la presencia en tales celulas de genes que codifican Ig y TCR funcionalmente reordenados que dirigen la expresion productiva de los receptores inmunitarios adaptativos se ha logrado utilizando muestras biologicas a partir de las cuales las celulas inmunitarias adaptativas pueden aislarse facilmente en cantidades significativas, tales como sangre, linfa u otros fluidos biologicos. En estas muestras, las celulas inmunitarias adaptativas se presentan como partmulas en suspension fluida. Vease, p.ej., el documento US 2010/0330571; vease tambien, p.ej., Murphy, Janeway's Immunobiology (8a Ed.), 2011 Garland Science, NY, Apendice I, pag. 717-762.

La leucemia/linfoma linfoblastico de celulas T agudo (T-ALL) es una neoplasia maligna, agresiva de celulas T inmaduras que afecta tanto a pacientes adultos como pediatricos. Aunque ha habido un progreso significativo en el tratamiento de estos pacientes con mejoras en la obtencion de respuestas duraderas, sigue estando claro que un subconjunto de estos pacientes no se tratan adecuadamente y con frecuencia presentan recafda de la enfermedad, mientras que otros pueden recibir un tratamiento excesivo debido a la incapacidad para individualizar suficientemente el tratamiento clmico. Varios estudios han confirmado la importancia de evaluar la posible presencia de enfermedad residual minima (ERM) despues de un regimen de tratamiento, para ayudar a predecir los resultados clmicos de los pacientes (1-3). Por ejemplo, los pacientes que demuestran una respuesta temprana a la terapia, y que no muestran una obtencion sostenida de ERM, tienen mejores resultados que los que no lo hacen (3).

De manera similar, la leucemia/linfoma linfoblastico de celulas p agudo (B-ALL) es una neoplasia maligna agresiva de celulas B inmaduras que afecta a pacientes adultos y pediatricos. Si bien se ha logrado un progreso significativo en el aumento del numero de pacientes que logran una remision duradera a largo plazo, un subconjunto de pacientes recae. Al igual que en T-ALL, multiples estudios han confirmado que la presencia y la frecuencia de enfermedad residual minima son marcadores pronosticos importantes en la B-ALL. Ademas, varios de estos estudios tambien respaldan el uso de estos datos para notificar e individualizar la terapia (p.ej., Yamaji et al., 2010 Pediatr. Blood Cane. 55(7):1287-95; Bhojwani et al., 2009 Clin. Lymphoma Myeloma 9 (Supl. 3):S222-30.

Las estrategias clmicas actuales para la evaluacion de la enfermedad residual minima incluyen citometna de flujo multiparametrica (mpFC) y metodos basados en PCR cuantitativa que utilizan cebadores espedficos del paciente (4, 5). La mpFC tfpicamente permite la deteccion de celulas potencialmente responsables de la enfermedad recurrente/persistente con una sensibilidad del orden de 10-4 a 10-5 celulas nucleadas. Sin embargo, la interpretacion de estos datos depende del operador y del laboratorio y, en consecuencia, esta limitada por una mala normalizacion. Ademas, la expresion variable de antfgenos leucemicos en el contexto posterior a la terapia confunde la deteccion de ERM mediante mpFC (6).

En comparacion, los metodos moleculares para la deteccion de enfermedad residual minima pueden lograr una sensibilidad relativamente mayor, del orden de 10-5 a 10-6 celulas (7, 8). Sin embargo, las configuraciones previas de estos ensayos moleculares, principalmente ensayos basados en PCR cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR) que utilizan cebadores espedficos del paciente que se dirigen a secuencias de empalme de la region variable del receptor inmunitario adaptativo (p.ej., receptor de celulas T (TCR) o inmunoglobulina (Ig)), o translocaciones espedficas del paciente, son complejas y diffciles de implementar en una materia uniforme (7). Por ejemplo, estos enfoques requieren la produccion y el uso de sondas oligonucleotfdicas individualizadas, espedficas del paciente para cada paciente, lo que es laborioso, costoso y lento, e incompatible con el marco temporal en el que deben tomarse decisiones clmicas.

La secuenciacion de alto rendimiento (HTS) es una tecnologfa emergente que puede proporcionar informacion sobre la complejidad de la respuesta inmunitaria adaptativa a traves del analisis de la reorganizacion del gen del receptor linfoide (9). Los estudios que utilizan esta tecnologfa han desafiado la comprension en la tecnica de la extension de la diversidad de los linfocitos que presentan, y comparten, los individuos (9, 10), y han proporcionado una vision mecanicista de los primeros eventos geneticos moleculares cnticos para la maduracion del linaje de celulas T (11).

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Recientemente, la secuenciacion de alto rendimiento de los genes del receptor inmunitario adaptativo de celulas linfoides se ha utilizado para controlar la diversidad de linfocitos despues de la inmunoterapia adoptiva con celulas T modificadas por receptor antigenico quimerico para el tratamiento de la leucemia linfocftica cronica refractaria a la quimioterapia (12). Por separado, la secuenciacion de alto rendimiento de los genes del receptor inmunitario adaptativo de las celulas linfoides se ha utilizado para controlar la enfermedad en los trastornos linfoproliferativos B (13). La HTS ha demostrado la capacidad de identificar clones de celulas T raras (una celula T en 100.000) con alta precision y reproducibilidad (14). Sherwood et al., 2001 describen la secuenciacion profunda de los repertorios de TCRa y TCRp humanos (Sci. Trans. Med. 2011, vol. 3, num. 90-93, paginas 90-96). Weng et al., 2011 describe la secuenciacion de alto rendimiento de TCR en pacientes con micosis fungoide y smdrome de Sezary (Blood (Resumenes de reuniones de ASH) 2011, 118, Resumen 3114).

Claramente, existe una necesidad de mejorar la sensibilidad y especificidad en el diagnostico de tumores malignos hematologicos linfoides y otras afecciones que se reflejan en la heterogeneidad y frecuencias relativas de aparicion de receptores inmunitarios adaptativos unicos concretos, y en la capacidad de detectar enfermedad residual minima (ERM). Las realizaciones descritas actualmente abordan estas necesidades y proporcionan otras ventajas relacionadas.

Breve compendio

La invencion proporciona un metodo para detectar enfermedad residual minima para un tumor maligno hematologico linfoide en un sujeto despues de la terapia, comprendiendo el metodo

(a) amplificacion de ADN extrafdo de una primera muestra en una reaccion en cadena de polimerasa multiple (PCR) utilizando cebadores del segmentos V y J para producir una multiplicidad de moleculas de aDn reordenado amplificado que comprenden cada una una region que codifica CDR3 de TCR, en donde la primera muestra se ha obtenido del sujeto antes de la terapia y comprende una pluralidad de celulas hematopoyeticas linfoides,

(b) secuenciacion de alto rendimiento de dicha multiplicidad de moleculas de ADN reordenado amplificado para determinar las frecuencias relativas de regiones que codifican CDR3 de TCR reordenadas de manera unica en la primera muestra, identificando asf la region que codifica CDR3 de TCR reordenada de manera unica de los uno o mas clones de celulas T malignas,

(c) amplificacion de ADN extrafdo de una segunda muestra en una reaccion en cadena de polimerasa multiple (PCR) utilizando los cebadores del segmento V y J para producir una multiplicidad de moleculas de aDn reordenado amplificado comprendiendo cada una una region que codifica CDR3 de TCR, en donde la segunda muestra ha sido obtenida del sujeto despues de la terapia y comprende una pluralidad de celulas hematopoyeticas linfoides, y

(d) secuenciacion de alto rendimiento de dicha multiplicidad de moleculas de ADN reordenado amplificado producidas a partir de la segunda muestra para determinar la frecuencia relativa de la region que codifica CDR3 de TCR reordenada de manera unica de los uno o mas clones de celulas T malignas en la segunda muestra, en donde la presencia de la region que codifica CDR3 de TCR reordenada de manera unica de los uno o mas clones de celulas T malignas a una frecuencia relativa de al menos una frecuencia de una de cada 106 a una de cada 105 regiones que codifican CDR3 de TCR indica enfermedad residual minima para el tumor maligno hematologico linfoide;

en donde la PCR multiple comprende adicionalmente una pluralidad de oligonucleotidos molde que tiene una pluralidad de secuencias de oligonucleotidos de formula general

[I] 5'-U1 -B1-V-B2-R-B3-J-B4-U2-3'

en donde

(i) V es un polinucleotido que comprende al menos 20, 30, 60, 90, 120, 150, 180 o 210, y no mas de 1000, 900, 800, 700, 600 o 500 nucleotidos contiguos de una secuencia genica que codifica la region variable (V) del receptor inmunitario adaptativo, o el complemento de la misma, y en cada una de la pluralidad de secuencias de oligonucleotidos V comprende una secuencia oligonucleotfdica unica,

(ii) J es un polinucleotido que comprende al menos 15-30, 31-60, 61-90, 91-120 o 120-150, y no mas de 600, 500, 400, 300 o 200 nucleotidos contiguos de una secuencia genica que codifica la region de empalme (J) del receptor inmunitario adaptativo, o el complemento de la misma, y en cada una de la pluralidad de secuencias de oligonucleotidos J comprende una secuencia oligonucleotfdica unica,

(iii) U1 no es nada o comprende un oligonucleotido que tiene una secuencia que se selecciona entre (1) una primera secuencia de oligonucleotido adaptador universal, y (2) una primera secuencia oligonucleotfdica espedfica de la plataforma de secuenciacion que esta conectada y posicionada 5' con respecto a primera secuencia de oligonucleotido adaptador universal,

(iv) U2 no es nada o comprende un oligonucleotido que tiene una secuencia que se selecciona entre (1) una

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segunda secuencia de oligonucleotido adaptador universal, y (2) una segunda secuencia oligonucleotfdica espedfica de la plataforma de secuenciacion que esta conectada y posicionada 5' con respecto a una segunda secuencia de oligonucleotido adaptador universal,

(v) B1, B2, B3 y B4 son cada uno independientemente nada o cada uno comprende un oligonucleotido B que comprende una secuencia codigo de barras de oligonucleotido de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25, nucleotidos contiguos, en donde en cada una de la pluralidad de secuencias de oligonucleotidos B comprende una secuencia oligonucleotfdica unica que identifica de forma unica, como una combinacion emparejada, (1) la secuencia oligonucleotfdica V unica de (i) y (2) la secuencia oligonucleotfdica J unica de (ii), y

(vi) R no es nada o comprende un sitio de reconocimiento para enzimas de restriccion que comprende una secuencia oligonucleotfdica que esta ausente de (i)-(v).

En la presente memoria se describe un metodo para diagnosticar un tumor maligno hematologico linfoide en un sujeto antes de la terapia, y para detectar enfermedad residual minima para el tumor maligno hematologico linfoide en el sujeto despues de la terapia, comprendiendo el metodo: (I) para cada uno de (i) una o una pluralidad de muestras biologicas que comprenden cada una una pluralidad de celulas hematopoyeticas linfoides y que se obtienen cada una del sujeto en uno o mas puntos temporales antes de la terapia, y (ii) una o una pluralidad de muestras biologicas que comprenden cada una una pluralidad de celulas hematopoyeticas linfoides y que se obtienen cada una del sujeto en uno o mas puntos temporales despues de la terapia, (a) amplificar ADN extrafdo de la muestra biologica en una reaccion en cadena de la polimerasa multiple (PCR) que comprende: (i) una pluralidad de cebadores oligonucleotfdicos del segmento V que son capaces cada uno independientemente de hibridar espedficamente con al menos un polinucleotido que codifica un polipeptido de la region V del receptor de celulas T (TCR) humano, en donde cada cebador del segmento V comprende una secuencia de nucleotidos de al menos 15 nucleotidos contiguos que es complementaria a al menos un segmento genico funcional que codifica Vy de TCR o que codifica Vp de TCR y en donde la pluralidad de cebadores del segmento V hibridan espedficamente sustancialmente con todos los segmentos genicos funcionales que codifican Vy de TCR o que codifica Vp de TCR que estan presentes en la muestra, y (ii) una pluralidad de cebadores oligonucleotfdicos del segmento J que son capaces cada uno independientemente de hibridar espedficamente con al menos un polinucleotido que codifica un polipeptido de la region J del receptor de celulas T (TCR) humano, en donde cada cebador del segmento J comprende una secuencia de nucleotidos de al menos 15 nucleotidos contiguos que es complementaria a al menos un segmento genico funcional que codifica Jy de TCR o que codifica Jp de TCR y en donde la pluralidad de cebadores del segmento J hibrida espedficamente sustancialmente con todos los segmentos genicos funcionales que codifican Jy de TCR o que codifican Jp de TCR que estan presentes en la muestra, en donde los cebadores del segmento V y del segmento J son capaces de promover la amplificacion en dicha reaccion en cadena de la polimerasa multiple (PCR) de sustancialmente todas las regiones que codifican CDR3 de TCRy reordenadas o sustancialmente todas las regiones que codifican CDR3 de TCRp en la muestra para producir una multiplicidad de moleculas de ADN reordenado amplificado a partir de una poblacion de celulas T en la muestra, siendo suficiente dicha multiplicidad de moleculas de ADN reordenado amplificado para cuantificar la diversidad de la region que codifica cDR3 de TCRy o la region que codifica CDR3 de TCRy en la poblacion de celulas T, y en donde cada molecula de ADN reordenado amplificado en la multiplicidad de moleculas de ADN reordenado amplificado tiene menos de 600 nucleotidos de longitud; y (b) secuenciar dicha multiplicidad de moleculas de ADN reordenado amplificado para determinar, para cada molecula unica de ADN reordenado en dicha multiplicidad de moleculas de ADN reordenado amplificado, (i) una secuencia de ADN reordenado y (ii) una frecuencia de aparicion relativa de la secuencia de ADN reordenado; y (II) comparar (i) la frecuencia de aparicion relativa para cada secuencia unica de ADN reordenado de dichas una o una pluralidad de muestras biologicas que se obtienen cada una del sujeto en uno o mas puntos temporales antes de la terapia, con (ii) la frecuencia de aparicion relativa para cada secuencia unica de ADN reordenado de dichas una o una pluralidad de muestras biologicas que se obtienen cada una del sujeto en uno o mas puntos temporales despues de la terapia, en donde (A) la presencia, en una muestra obtenida del sujeto antes de la terapia, de al menos una secuencia unica de ADN reordenado que tiene una frecuencia relativa de al menos 15% de regiones que codifican CDR3 de TCRy reordenadas o regiones que codifican CDR3 de TCRp reordenadas es diagnostica de un tumor maligno hematologico linfoide clonal en el sujeto antes de la terapia, y en donde (B) la presencia, en una muestra obtenida del sujeto despues de la terapia, de dicha al menos una secuencia unica de ADN reordenado que es diagnostica del tumor maligno hematologico linfoide clonal a una frecuencia relativa de al menos una de cada 105 regiones que codifican CDR3 de TCR indica enfermedad residual minima para el tumor maligno hematologico linfoide.

En ciertas realizaciones adicionales, cada segmento genico funcional que codifica V de TCR comprende una secuencia senal de recombinacion (RSS) del gen V y cada segmento genico que codifica J de TCR comprende una RSS del gen J, y en donde cada molecula de ADN reordenado amplificado comprende (i) al menos 10, 20, 30 o 40 nucleotidos contiguos de una hebra efectora del segmento genico que codifica V de TCR, estando situados dichos al menos 10, 20, 30 o 40 nucleotidos contiguos 5' respecto a la RSS del gen V y (ii) al menos 10, 20 o 30 nucleotidos contiguos de una hebra efectora del segmento genico que codifica J de TCR, estando situados dichos al menos 10, 20 o 30 nucleotidos contiguos 3' con respecto a la RSS del gen J.

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En ciertas realizaciones la pluralidad de cebadores oligonucleotidicos del segmento V y la pluralidad de cebadores oligonucleotfdicos del segmento J comprenden al menos una de (1) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 55795643, (2) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 5644-5792, (3) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 57935816, (4) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 5817-6123, (5) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 61246127 y 6212-6215, (6) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 6128-6211 y 6216-6221, (7) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 6222-6286, y (8) las secuencias expuestas en SeQ ID NO: 6222-6351. En ciertas realizaciones cualquiera o ambos de: (i) los cebadores oligonucleotfdicos del segmento V comprenden uno o una pluralidad de oligonucleotidos que exhiben al menos 90% de identidad de secuencia con una o mas de las secuencias de nucleotidos expuestas en SEQ ID NO:5579-5630, 5644-5779, 5799-5816, 6124-6127, y 6222-6273, y (ii) los cebadores del segmento J comprenden uno o una pluralidad de oligonucleotidos que exhiben al menos 90% de identidad de secuencia con una o mas de las secuencias de nucleotidos expuestas en SEQ ID NO:5631-5643, 5780-5798, 6212-6215, y 6274-6286.

En la presente memoria se describe un metodo para diagnosticar un tumor maligno hematologico linfoide en un sujeto, que comprende (I) para cada uno de (i) una o una pluralidad de muestras biologicas que se obtienen del sujeto y que comprenden cada una una pluralidad de celulas hematopoyeticas linfoides, (a) amplificar ADN extrafdo de la muestra biologica en una reaccion en cadena de polimerasa multiple (PCR) que comprende: (i) una pluralidad de cebadores oligonucleotfdicos del segmento V que son capaces cada uno independientemente de hibridar espedficamente con al menos un polinucleotido que codifica un polipeptido de la region V del receptor de celulas T (TCR) humano, en donde cada cebador del segmento V comprende una secuencia de nucleotidos de al menos 15 nucleotidos contiguos que es complementaria a al menos un segmento genico funcional que codifica Vy de TCR o que codifica Vp de TCR y en donde la pluralidad de cebadores del segmento V hibrida espedficamente sustancialmente con todos los segmentos genicos funcionales que codifican Vy de TCR o que codifican Vp de TCR que estan presentes en la muestra, y (ii) una pluralidad de cebadores oligonucleotfdicos del segmento J que son capaces cada uno independientemente de hibridar espedficamente con al menos un polinucleotido que codifica un polipeptido de la region J del receptor de celulas T (TCR) humano, en donde cada cebador del segmento J comprende una secuencia de nucleotidos de al menos 15 nucleotidos contiguos que es complementaria a al menos un segmento genico funcional que codifica Jy de TCR o que codifica Jp de TCR y en donde la pluralidad de cebadores del segmento J hibridan espedficamente sustancialmente con todos los segmentos genicos funcionales que codifican Jy de TCR o que codifican Jp de TCR que estan presentes en la muestra, en donde los cebadores del segmento V y del segmento J son capaces de promover la amplificacion en dicha reaccion en cadena de la polimerasa multiple (PCR) de sustancialmente todas las regiones que codifican CDR3 de TCRy o sustancialmente todas las regiones que codifican CDR3 de TCRp reordenadas en la muestra para producir una multiplicidad de moleculas de ADN reordenado amplificado de una poblacion de celulas T en la muestra, siendo suficiente dicha multiplicidad de moleculas de ADN reordenado amplificado para cuantificar la diversidad de la region que codifica CDR3 de TCRy o CDR3 de TCRy en la poblacion de celulas T, y en donde cada molecula de ADN reordenado amplificado en la multiplicidad de moleculas de ADN reordenado amplificado tiene menos de 600 nucleotidos de longitud; y (b) secuenciar dicha multiplicidad de moleculas de ADN reordenado amplificado para determinar, para cada molecula unica de ADN reordenado en dicha multiplicidad de moleculas de ADN reordenado amplificado, (i) una secuencia de ADN reordenado y (ii) una frecuencia de aparicion relativa de la secuencia de ADN reordenado; y (II) determinar la frecuencia de aparicion relativa para cada secuencia unica de ADN reordenado a partir de dichas una o una pluralidad de muestras biologicas que se obtienen cada una del sujeto, en donde (A) la presencia, en una muestra obtenida del sujeto, de al menos una secuencia unica de ADN reordenado que tiene una frecuencia relativa de al menos 15% de las regiones que codifican CDR3 de TCRy reordenadas o las regiones que codifican CDR3 de TCRp reordenadas es diagnostica de un tumor maligno hematologico linfoide clonal en el sujeto, en donde (B) la presencia, en una muestra obtenida del sujeto, de dicha al menos una secuencia unica de ADN reordenado que es diagnostica del tumor maligno hematologico linfoide clonal a una frecuencia relativa de al menos una de cada 105 regiones que codifican CDR3 de TCR, indica enfermedad residual minima para el tumor maligno hematologico linfoide, y en donde (C) la ausencia en la muestra obtenida del sujeto de al menos una secuencia unica de ADN reordenado que tiene una frecuencia relativa de al menos 15% de regiones que codifican CDR3 de TCRy reordenadas o regiones que codifican CDR3 de TCRp reordenadas indica que el sujeto debe evaluarse para detectar el inmunofenotipo dej precursor tfmico temprano.

En ciertos casos, cada segmento genico funcional que codifica V de TCR o Ig comprende una secuencia senal de recombinacion (RSS) del gen V y cada segmento genico funcional que codifica J de TCR o Ig comprende una RSS del gen J, y en donde cada molecula de ADN reordenado amplificado comprende (i) al menos 10, 20, 30 o 40 nucleotidos contiguos de una hebra efectora del segmento genico que codifica V de TCR o Ig, estando situados dichos al menos 10, 20, 30 o 40 nucleotidos contiguos 5' con respecto a la RSS del gen V y (ii) al menos 10, 20 o 30 nucleotidos contiguos de una hebra efectora del segmento genico que codifica J de TCR o Ig, estando situados dichos al menos 10, 20 o 30 nucleotidos contiguos 3' con respecto a la RSS del gen J. En ciertos casos, la pluralidad de cebadores oligonucleotfdicos del segmento V y la pluralidad de cebadores oligonucleotfdicos del segmento J comprende al menos una de (1) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 5579-5643, (2) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 5644-5792, (3) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 5793-5816, (4) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 5817-6123, (5) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 6124-6127 y 6212-6215, (6) las

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secuencias expuestas en SEQ ID NO: 6128-6211 y 6216-6221, (7) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 62226286, y (8) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 6222-6351. En ciertos casos, cualquiera o ambos de (i) los cebadores oligonucleotfdicos del segmento V comprenden uno o una pluralidad de oligonucleotidos que exhiben al menos 90% de identidad de secuencia con una o mas de las secuencias de nucleotidos expuestas en SEQ ID NO:5579-5630, 5644-5779, 5799-5816, 6124-6127, y 6222-6273, y (ii) los cebadores del segmento J comprenden uno o una pluralidad de oligonucleotidos que exhiben al menos 90% de identidad de secuencia con una o mas de las secuencias de nucleotidos expuestas en SeQ ID NO:5631-5643, 5780-5798, 6212-6215, y 6274-6286.

En la presente memoria se describe un metodo para detectar enfermedad residual minima para un tumor maligno hematologico linfoide en un sujeto despues de la terapia, comprendiendo el metodo: (I) para cada una de (i) una o una pluralidad de muestras biologicas que comprenden cada una una pluralidad de celulas hematopoyeticas linfoides y que son obtenidas cada una del sujeto en uno o mas puntos temporales antes de la terapia, y (ii) una o una pluralidad de muestras biologicas que comprenden cada una una pluralidad de celulas hematopoyeticas linfoides y que son obtenidas cada una del sujeto en uno o mas puntos temporales despues de la terapia, (a) amplificar ADN extrafdo de la muestra biologica en una reaccion en cadena de polimerasa multiple (PCR) que comprende: (i) una pluralidad de cebadores oligonucleotfdicos del segmento V que son capaces de hibridar espedficamente por separado con al menos un polinucleotido que codifica un polipeptido de la region V del receptor de celulas T (TCR) humano, en donde cada cebador del segmento V comprende una secuencia de nucleotidos de al menos 15 nucleotidos contiguos que es complementaria a al menos un segmento genico funcional que codifica Vy de TCR o que codifica Vp de TCR y en donde la pluralidad de cebadores del segmento V hibridan espedficamente sustancialmente con todos los segmentos genicos funcionales que codifican Vy de TCR o que codifican Vp de TCR que estan presentes en la muestra, y (ii) una pluralidad de cebadores oligonucleotfdicos del segmento J que son capaces cada uno independientemente de hibridar espedficamente con al menos un polinucleotido que codifica un polipeptido de la region J del receptor de celulas T (TCR) humano, en donde cada cebador del segmento J comprende un secuencia de nucleotidos de al menos 15 nucleotidos contiguos que es complementaria a al menos un segmento genico funcional que codifica Jy de TCR o que codifica Jp de TCR y en donde la pluralidad de cebadores del segmento J hibridan espedficamente sustancialmente con todos los segmentos genicos funcionales que codifican Jy de TCR o que codifican Jp de TCR que estan presentes en la muestra, en donde los cebadores del segmento V y del segmento J son capaces de promover la amplificacion en dicha reaccion en cadena de la polimerasa multiple (PCR) de sustancialmente todas las regiones que codifican CDR3 de TCRy reordenadas o sustancialmente todas las regiones que codifican CDR3 de TCRp en la muestra para producir una multiplicidad de moleculas de ADN reordenado amplificado de una poblacion de celulas T en la muestra, siendo suficiente dicha multiplicidad de moleculas de ADN reordenado amplificado para cuantificar la diversidad de la region que codifica CDR3 de TCRy o de la region que codifica CDR3 de TCRy en la poblacion de celulas T, y en donde cada molecula de ADN reordenado amplificado en la multiplicidad de moleculas de ADN reordenado amplificado tiene menos de 600 nucleotidos de longitud; y (b) secuenciar dicha multiplicidad de moleculas de ADN reordenado amplificado para determinar, para cada molecula unica de ADN reordenado en dicha multiplicidad de moleculas de ADN reordenado amplificado, (i) una secuencia de ADN reordenado y (ii) una frecuencia de aparicion relativa de la secuencia de ADN reordenado; y (II) comparar (i) la frecuencia de aparicion relativa para cada secuencia unica de ADN reordenado de dichas una o una pluralidad de muestras biologicas que se obtienen cada una del sujeto en uno o mas puntos temporales antes de la terapia, con (ii) la frecuencia de aparicion relativa para cada secuencia unica de ADN reordenado de dichas una o una pluralidad de muestras biologicas que se obtienen cada una del sujeto en uno o mas puntos temporales despues de la terapia, en donde (A) la presencia, en una muestra obtenida del sujeto antes de la terapia, de al menos una secuencia unica de ADN reordenado que tiene una frecuencia relativa de al menos 15% de regiones que codifican CDR3 de TCRy reordenadas o regiones que codifican CDR3 de TCRp reordenadas es diagnostica de un tumor maligno hematologico linfoide clonal en el sujeto antes de la terapia, y en donde (B) la presencia, en una muestra obtenida del sujeto despues de la terapia, de dicha al menos una secuencia unica de ADN reordenado que es diagnostica de tumor maligno hematologico linfoide clonal a una frecuencia relativa de al menos una de cada 106 o de al menos una de cada 105 regiones que codifican CDR3 de TCR indica enfermedad residual minima para el tumor maligno hematologico linfoide.

En ciertos casos, cada segmento genico funcional que codifica V de TCR o Ig comprende una secuencia senal de recombinacion (RSS) del gen V y cada segmento genico funcional que codifica J de TCR o Ig comprende una RSS del gen J, y en donde cada molecula de ADN reordenado amplificado comprende (i) al menos 10, 20, 30 o 40 nucleotidos contiguos de una hebra efectora del segmento genico que codifica V de TCR o Ig, estando situados dichos al menos 10, 20, 30 o 40 nucleotidos contiguos 5' con respecto a la RSS del gen V y (ii) al menos 10, 20 o 30 nucleotidos contiguos de una hebra efectora del segmento genico que codifica J de TCR o Ig, estando situados dichos al menos 10, 20 o 30 nucleotidos contiguos 3' con respecto a la RSS del gen J. En ciertos casos, la pluralidad de cebadores oligonucleotfdicos del segmento V y la pluralidad de cebadores oligonucleotfdicos del segmento J comprende al menos una de (1) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 5579-5643, (2) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 5644-5792, (3) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 5793-5816, (4) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 5817-6123, (5) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 6124-6127 y 6212-6215, (6) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 6128-6211 y 6216-6221, (7) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 62226286, y (8) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 6222-6351. En ciertos casos cualquiera o ambos de (i) los

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cebadores oligonucleotfdicos del segmento V comprenden uno o una pluralidad de oligonucleotidos que exhiben al menos 90% de identidad de secuencia con una o mas de las secuencias de nucleotidos expuestas en SEQ ID NO:5579-5630, 5644-5779, 5799-5816, 6124-6127, y 6222-6273, y (ii) los cebadores del segmento J comprenden uno o una pluralidad de oligonucleotidos que exhiben al menos 90% de identidad de secuencia con una o mas de las secuencias de nucleotidos expuestas en SeQ ID NO:5631-5643, 5780-5798, 6212-6215, y 6274-6286.

En la presente memoria se describe un metodo para diagnosticar un tumor maligno hematologico linfoide en un sujeto antes de la terapia, y para detectar enfermedad residual minima para el tumor maligno hematologico linfoide en el sujeto despues de la terapia, comprendiendo el metodo (I) para cada uno de (i) una o una pluralidad de muestras biologicas que comprenden cada una una pluralidad de celulas hematopoyeticas linfoides y que se obtienen cada una del sujeto en uno o mas puntos temporales antes de la terapia, y (ii) una o una pluralidad de muestras biologicas que comprenden cada una una pluralidad de celulas hematopoyeticas linfoides y que se obtienen cada una del sujeto en uno o mas puntos temporales despues de la terapia, (a) amplificar el ADN extrafdo de la muestra biologica en una reaccion en cadena de polimerasa multiple (PCR) que comprende: (i) una pluralidad de cebadores oligonucleotfdicos del segmento V que son capaces cada uno independientemente de hibridar espedficamente con al menos un polinucleotido que codifica un polipeptido de la region V del receptor de celulas T (TCR) humano o un polipeptido de la region V de inmunoglobulina (Ig) humano, en donde cada cebador del segmento V comprende una secuencia de nucleotidos de al menos 15 nucleotidos contiguos que es complementaria a al menos un segmento genico funcional que codifica la region V de TCR o que codifica la region V de Ig y en donde la pluralidad de cebadores del segmento V hibrida espedficamente sustancialmente con todos los segmentos genicos funcionales que codifican V de TCR o que codifican V de Ig que estan presentes en la muestra, y (ii) una pluralidad de cebadores oligonucleotfdicos del segmento J que son capaces cada uno independientemente de hibridar espedficamente con al menos un polinucleotido que codifica un polipeptido de la region J del receptor de celulas T (TCR) humano o un polipeptido de la region J de Ig humano, en donde cada cebador del segmento J comprende una secuencia de nucleotidos de al menos 15 nucleotidos contiguos que es complementaria a al menos un segmento genico funcional que codifica J de TCR o que codifica J de Ig y en donde la pluralidad de cebadores del segmento J hibridan espedficamente sustancialmente con todos los segmentos genicos funcionales que codifican J de TCR o que codifica J de Ig que estan presentes en la muestra, en donde los cebadores del segmento V y del segmento J son capaces de promover la amplificacion en dicha reaccion en cadena de la polimerasa multiple (PCR) de sustancialmente todas las regiones que codifican CDR3 de TCR reordenadas o sustancialmente todas las regiones que codifican CDR3 de Ig en la muestra para producir una multiplicidad de moleculas de ADN reordenado amplificado de una poblacion de celulas linfoides en la muestra, siendo suficiente dicha multiplicidad de moleculas de ADN reordenado amplificado para cuantificar la diversidad de la region que codifica CDR3 de TCR o la region que codifica CDR3 de Ig en la poblacion de celulas linfoides, y en donde cada molecula de ADN reordenado amplificado en la multiplicidad de moleculas de ADN reordenado amplificado tiene menos de 600 nucleotidos de longitud; y (b) secuenciar dicha multiplicidad de moleculas de ADN reordenado amplificado para determinar, para cada molecula unica de ADN reordenado en dicha multiplicidad de moleculas de ADN reordenado amplificado, (i) una secuencia de ADN reordenado y (ii) una frecuencia de aparicion relativa de la secuencia de ADN reordenado; y (II) comparar (i) la frecuencia de aparicion relativa para cada secuencia unica de ADN reordenado de dichas una o una pluralidad de muestras biologicas que se obtienen cada una del sujeto en uno o mas puntos temporales antes de la terapia, con (ii) la frecuencia de aparicion relativa para cada secuencia unica de ADN reordenado de dichas una o una pluralidad de muestras biologicas que se obtienen cada una del sujeto en uno o mas puntos temporales despues de la terapia, en donde (A) la presencia, en una muestra obtenida del sujeto antes de la terapia, de al menos una secuencia unica de ADN reordenado que tiene una frecuencia relativa de al menos 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26 %, 27%, 28%, 29% o 30% de las regiones que codifican CDR3 de TCR reordenadas o las regiones que codifican CDR3 de Ig reordenadas es diagnostica para un tumor maligno hematologico linfoide clonal en el sujeto antes de la terapia, y en donde (B) la presencia, en una muestra obtenida del sujeto despues de la terapia, de dicha al menos una secuencia unica de ADN reordenado que es diagnostica de neoplasia maligna hematologica linfoide clonal a una frecuencia relativa de al menos una de cada 105 regiones que codifican CDR3 de TCR o de Ig indica enfermedad residual minima para el tumor maligno hematologico linfoide.

En ciertos casos, cada segmento genico funcional que codifica V de TCR o Ig comprende una secuencia senal de recombinacion (RSS) del gen V y cada segmento genico funcional que codifica J de TCR o Ig comprende una RSS del gen J, y en donde cada molecula de ADN reordenado amplificado comprende (i) al menos 10, 20, 30 o 40 nucleotidos contiguos de una hebra efectora del segmento genico que codifica V de TCR o Ig, estando situados dichos al menos 10, 20, 30 o 40 nucleotidos contiguos 5' con respecto a la RSS del gen V y (ii) al menos 10, 20 o 30 nucleotidos contiguos de una hebra efectora del segmento genico que codifica J de TCR o Ig, estando situados dichos al menos 10, 20 o 30 nucleotidos contiguos 3' con respecto a la RSS del gen J. En ciertos casos, las regiones que codifican CDR3 de TCR o Ig reordenadas se seleccionan entre regiones que codifican CDR3 de TCRa, regiones que codifican CDR3 de TCRp, regiones que codifican CDR3 de TCRy, regiones que codifican CDR3 de TCR5, regiones que codifican CDR3 de IgH, regiones que codifican CDR3 de IgK, y regiones que codifican CDR3 de IgA reordenadas. En ciertos casos, la pluralidad de cebadores oligonucleotfdicos del segmento V y la pluralidad de cebadores oligonucleotfdicos del segmento J comprende al menos una de (1) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 5579-5643, (2) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 5644-5792, (3) las secuencias expuestas en SEQ ID

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NO: 5793-5816, (4) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 5817-6123, (5) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 6124-6127 y 6212-6215, (6) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 6128-6211 y 6216-6221, (7) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 6222-6286, y (8) las secuencias expuestas en SEQ iD NO: 6222-6351. En ciertos casos cualquiera o ambos de (i) los cebadores oligonucleotfdicos del segmento V comprenden uno o una pluralidad de oligonucleotidos que exhiben al menos 90% de identidad de secuencia con una o mas de las secuencias de nucleotidos expuestas en SEQ ID NO:5579-5630, 5644-5779, 5799-5816, 5833-6211, y 6222-6273, y (ii) los cebadores del segmento J comprenden uno o una pluralidad de oligonucleotidos que exhiben al menos 90% de identidad de secuencia con una o mas de las secuencias de nucleotidos expuestas en SEQ ID NO:5631-5643, 5780-5798, 5817-5832, 6212-6221, y 6274-6286.

En ciertos casos de los metodos descritos anteriormente, cualquiera o ambos de (i) los cebadores oligonucleotfdicos del segmento V comprenden uno o una pluralidad de oligonucleotidos que exhiben al menos 90% de identidad de secuencia con uno o mas de: (1) las secuencias de nucleotidos expuestas en SEQ ID NO:5579-5630, (2) las secuencias de nucleotidos expuestas en SEQ ID NO:5644-5779, (3) las secuencias de nucleotidos expuestas en SEQ ID NO:5799-5816, (4) las secuencias de nucleotidos expuestas en SEQ ID NO:5833-6123, (5) las secuencias de nucleotidos expuestas en SEQ ID NO:6124-6127, (6) las secuencias de nucleotidos expuestas en SEQ ID NO:6128-6211, (7) las secuencias de nucleotidos expuestas en SEQ ID NO:6222-6273, y (8) las secuencias de nucleotidos expuestas en SEQ ID NO:6287-6351; y (ii) los cebadores del segmento J comprenden uno o una pluralidad de oligonucleotidos que exhiben al menos 90% de identidad de secuencia con uno o mas de: (1) las secuencias de nucleotidos expuestas en SEQ ID NO:5631-5643, (2) las secuencias de nucleotidos expuestas en SEQ ID NO:5780-5792, (3) las secuencias de nucleotidos expuestas en SEQ ID NO:5793-5798, (4) las secuencias de nucleotidos expuestas en SEQ ID NO:5817-5832, (5) las secuencias de nucleotidos expuestas en SEQ ID NO:6212-6215, (6) las secuencias de nucleotidos expuestas en SEQ ID NO:6216-6221, y (7) las secuencias de nucleotidos expuestas en SEQ ID NO:6274-6286.

En ciertas realizaciones de los metodos descritos anteriormente, el tumor maligno hematologico linfoide se selecciona entre leucemia linfoblastica de celulas T aguda (T-ALL), leucemia linfoblastica de celulas p (B-ALL), mieloma multiple, plasmacitoma, macroglobulinemia, leucemia linfocftica cronica (CLL), leucemia linfoblastica aguda (ALL), mieloma multiple, plasmacitoma, macroglobulinemia, leucemia linfocftica cronica (CLL), linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, linfoma cutaneo de celulas T, linfoma de celulas del manto, linfoma de celulas T periferico, leucemia linfocftica de celulas pilosas, linfoma prolinfocftico de celulas T, linfoma angioinmunoblastico de celulas T, leucemia/linfoma linfoblastico de celulas T, linfoma periferico de celulas T, leucemia/linfoma de celulas T adultas, micosis fungoide, smdrome de Sezary, leucemia linfoblastica de celulas T, neoplasia mieloproliferativa y smdrome mielodisplasico.

En ciertas realizaciones de los metodos descritos anteriormente, la PCR multiple comprende adicionalmente una composicion molde para la determinacion del factor de amplificacion en el que esta presente un numero conocido de una pluralidad de oligonucleotidos molde quetienen una secuencia oligonucleotidica unica, comprendiendo el molde una pluralidad de oligonucleotidos molde que tiene una pluralidad de secuencias de oligonucleotidos de formula general: 5'-U1-B1-V-B2-R-B3-J-B4-U2-3' [I] en donde: (a) V es un polinucleotido que comprende al menos 20, 30, 60, 90, 120, 150, 180 o 210, y no mas de 1000, 900, 800, 700, 600 o 500 nucleotidos contiguos de una secuencia genica que codifica la region variable (V) del receptor inmunitario adaptativo, o el complemento de los mismos, y en cada una de la pluralidad de secuencias de oligonucleotidos V comprende una secuencia oligonucleotfdica unica; (b) J es un polinucleotido que comprende al menos 15-30, 31-60, 61-90, 91-120 o 120-150, y no mas de 600, 500, 400, 300 o 200 nucleotidos contiguos de una secuencia genica que codifica la region de empalme (J) de un receptor inmunitario adaptativo, o el complemento de la misma, y en cada una de la pluralidad de secuencias de oligonucleotidos J comprende una secuencia oligonucleotfdica unica; (c) U1 no es nada o comprende un oligonucleotido que tiene una secuencia que se selecciona entre (i) una primera secuencia de oligonucleotido adaptador universal, y (ii) una secuencia oligonucleotfdica espedfica de la primera secuencia de secuenciacion que esta conectada y posicionada 5' con respecto a la primera secuencia de oligonucleotido adaptador universal; (d) U2 no es nada o comprende un oligonucleotido que tiene una secuencia que se selecciona entre (i) una segunda secuencia de oligonucleotido adaptador universal, y (ii) una segunda secuencia oligonucleotfdica espedfica de la plataforma de secuenciacion que esta conectada y posicionada 5' con respecto a una segunda secuencia de oligonucleotido adaptador universal; (e) B1, B2, b3 y B4 son cada uno independientemente nada o cada uno comprende un oligonucleotido B que comprende una secuencia codigo de barras de oligonucleotido de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25, nucleotidos contiguos, en donde en cada una de la pluralidad de secuencias de oligonucleotidos B comprende una secuencia oligonucleotfdica unica que identifica de forma unica, como una combinacion pareada, (i) la secuencia oligonucleotfdica de V unica de (a) y (ii) la secuencia oligonucleotfdica de J unica (b); (f) R es o bien nada o comprende un sitio de reconocimiento para enzimas de restriccion que comprende una secuencia oligonucleotfdica que esta ausente de (a) - (e), y en donde: (g) al menos uno de: (i) la pluralidad de oligonucleotidos molde comprende al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51-100, 101-200, 201-300, 301-400, 401 -500, 501-600, 601-700, 701-800, 801-900, 901-1000, 10011100, 1101-1200, 1201-1300, 1301-1400, 1401-1500, 1501-1600, 1601-1700, 1701-2000, o 2001-2500 secuencias

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de oligonucleotididos unicas, (ii) la pluralidad de oligonucleotidos molde comprende al menos un oligonucleotido molde que tiene una secuencia oligonucleotidica de formula general (I) con la que cada cebador oligonucleotfdico del segmento V puede hibridar espedficamente y al menos un oligonucleotido molde que tiene una secuencia oligonucleotfdica de formula general (I) con la que cada cebador oligonucleotido del segmento J puede hibridar espedficamente, o (iii) la pluralidad de oligonucleotidos molde comprende al menos a o al menos b secuencias de oligonucleotidos unicas, la que sea mayor, donde a es la cantidad de segmentos genicos que codifican la region V del receptor inmunitario adaptativo unico en el sujeto y b es la cantidad de segmentos genicos que codifican la region J del receptor inmunitario adaptativo unico en el sujeto, y la composicion comprende al menos un oligonucleotido molde para cada polinucleotido V unico y al menos un oligonucleotido molde para cada polinucleotido J unico; comprendiendo adicionalmente dicho metodo cuantificar moleculas de ADN reordenado que codifican uno o una pluralidad de receptores inmunitarios adaptativos en el ADN extrafdo de la muestra biologica mediante las etapas de: (1) secuenciar cuantitativamente la totalidad o una porcion suficiente de cada una de dichas moleculas de ADN molde amplificado y cada una de dichas moleculas de ADN reordenado amplificado para cuantificar (a) una cantidad de producto molde de moleculas de ADN modificado que contienen al menos una secuencia codigo de barras de oligonucleotidos, y (b) una cantidad de producto reordenado de moleculas de ADN reordenado amplificado que carecen de una secuencia codigo de barras de oligonucleotidos; (2) calcular un factor de amplificacion dividiendo la cantidad de producto molde de (1) (a) por la cantidad conocida de cada uno de la pluralidad de oligonucleotidos molde que tienen una secuencia oligonucleotfdica unica; y (3) dividir la cantidad de producto reordenado de (1) (b) por el factor de amplificacion calculado en (2) para cuantificar las moleculas de ADN que codifican el receptor inmunitario adaptativo unico en la muestra.

En ciertas realizaciones adicionales, en la composicion molde para la determinacion del factor de amplificacion, todos los oligonucleotidos molde en la pluralidad de oligonucleotidos molde son de longitud sustancialmente identica. En determinadas realizaciones, cada cebador en el conjunto de cebadores de amplificacion oligonucleotfdicos es capaz de hibridar espedficamente con al menos un oligonucleotido molde en la pluralidad de oligonucleotidos de la composicion molde. En ciertas realizaciones, cada oligonucleotido molde en la pluralidad de oligonucleotidos molde comprende adicionalmente un codon de parada entre V y B2. En ciertas realizaciones, en la composicion molde para la determinacion del factor de amplificacion, cada oligonucleotido molde en la pluralidad de oligonucleotidos molde esta presente en una cantidad sustancialmente equimolar. En ciertas realizaciones, el receptor inmunitario adaptativo se selecciona entre TCRB, TCRG, TCRA, TCRD, IGH, IGK e IGL, en donde (i) el polinucleotido V de (a) codifica, respectivamente, un polipeptido de la region V del receptor TCRB, TCRG, TCRA, TCRD, IGH, IGK, o IGL, y (ii) el polinucleotido J de (b) codifica, respectivamente, un polipeptido de la region J del receptor TCRB, TCRG, TCRA, TCRD, IGH, IGK o IGL.

En determinadas realizaciones, el conjunto de cebadores de amplificacion oligonucleotfdicos es capaz de amplificar ADN reordenado productivamente que codifica uno o una pluralidad de receptores inmunitarios adaptativos, en donde en dicha etapa (A) de amplificacion, el conjunto de cebadores de amplificacion oligonucleotfdicos no incluye ningun cebador oligonucleotfdico que hibride espedficamente con un pseudogen u orfon de la region V o con un pseudogen u orfon de la region J. En ciertas realizaciones, la pluralidad de oligonucleotidos molde tienen una pluralidad de secuencias de formula general (I) que se seleccionan entre: (1) la pluralidad de secuencias de oligonucleotidos de formula general (I) en donde los polinucleotidos V y J tienen las secuencias V y J de TCRB expuestas en al menos un conjunto de 68 SEQ ID NO de V y J de TCRB, respectivamente, como se expone en la Figura 9 como Conjunto 1 de V/J de TCRB, Conjunto 2 de V/J de TCRB, Conjunto 3 de V/J de TCRB, Conjunto 4 de V/J de TCRB, Conjunto 5 de V/J de TCRB, Conjunto 6 de V/J de TCRB, Conjunto 7 de V/J de TCRB, Conjunto 8 de V/J de TCRB, Conjunto 9 de V/J de TCRB, Conjunto 10 de V/J de TCRB, Conjunto 11 de V/J de TCRB, Conjunto 12 de V/J de TCRB y Conjunto 13 de V/J de TCRB; (2) la pluralidad de secuencias oligonucleotfdicas de formula general (I) en donde los polinucleotidos V y J tienen las secuencias V y J de TCRG expuestas en al menos un conjunto de 14 SEC ID NO de V y J de TCRg, respectivamente, como se expone en la Figura 10 como conjunto 1 de V/J de TCRG, conjunto 2 de V/J de TCRG, conjunto 3 de V/J de TCRG, conjunto 4 de V/J de TCRG y conjunto 5 de V/J de TCRG; (3) la pluralidad de secuencias de oligonucleotidos de formula general (I) en donde los polinucleotidos V y J tienen las secuencias V y J de IGH expuestas en al menos un conjunto de 127 SEQ ID NO de V y J de IGH, respectivamente, como se expone en Figura 11 como conjunto 1 de V/J de IGH, conjunto 2 de V/J de IGH, conjunto 3 de V/J de IGH, conjunto 4 de V/J de IGH, conjunto 5 de V/J de IGH, conjunto 6 de V/J de IGH, conjunto 7 de V/J de IGH, conjunto 8 de V/J de IGH y conjunto 9 de V/J de IGH; (4) la pluralidad de secuencias de oligonucleotidos de formula general (I) como se expone en SEQ ID NO: 3157-4014; (5) la pluralidad de secuencias de oligonucleotidos de formula general (I) como se expone en SEQ ID NO: 4015-4084; y (6) la pluralidad de secuencias de oligonucleotidos de formula general (I) como se expone en SEQ ID NO: 4085-5200.

En ciertas realizaciones de los metodos descritos anteriormente, la pluralidad de cebadores oligonucleotfdicos del segmento V y del segmento J es capaz de amplificar el ADN reordenado productivamente que codifica uno o una pluralidad de receptores inmunitarios adaptativos, y en dicha etapa (a) de amplificacion, los cebadores oligonucleotfdicos del segmento V y del segmento J no incluyen ningun cebador oligonucleotfdico que hibride espedficamente con un pseudogen u orfon de la region V o con un pseudogen u orfon de la region J.

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Por consiguiente, en ciertas realizaciones de algunos de los metodos descritos anteriormente, el metodo comprende adicionalmente cuantificar moleculas de ADN reordenado que codifican uno o una pluralidad de receptores inmunitarios adaptativos en ADN extrafdo de cada muestra biologica que comprende ADN de celulas linfoides del sujeto, comprendiendo cada receptor inmunitario adaptativo una region variable y una region de empalme, comprendiendo dicha etapa de cuantificacion: (A) amplificar ADN en una reaccion en cadena de polimerasa multiple (PCR) que comprende: (1) ADN de la muestra biologica que comprende celulas linfoides del sujeto, (2) un conjunto de cebadores de amplificacion oligonucleotidicos que es capaz de amplificar ADN reordenado que codifica uno o una pluralidad de receptores inmunitarios adaptativos en el ADN de la muestra biologica, comprendiendo el conjunto de cebadores: (a) en cantidades sustancialmente equimolares, una pluralidad de cebadores oligonucleotfdicos del segmento V que son capaces cada uno independientemente de hibridar espedficamente con al menos un polinucleotido que codifica un polipeptido de la region V del receptor inmunitario adaptativo o con el complemento del mismo, en donde cada cebador del segmento V comprende una secuencia de nucleotidos de al menos 15 nucleotidos contiguos que es complementaria a al menos un segmento genico funcional que codifica la region V del receptor inmunitario adaptativo y en donde la pluralidad de cebadores del segmento V hibrida espedficamente con todos los segmentos genicos funcionales que codifican la region V del receptor inmunitario adaptativo que estan presentes en la composicion molde, y (b) en cantidades sustancialmente equimolares, una pluralidad de cebadores oligonucleotfdicos del segmento J que son capaces cada uno independientemente de hibridar espedficamente con al menos un polinucleotido que codifica un polipeptido de la region J del receptor inmunitario adaptativo o con el complemento del mismo, donde cada cebador del segmento J comprende una secuencia de nucleotidos de al menos 15 nucleotidos contiguos que es complementaria a al menos un segmento genico funcional que codifica la region J del receptor inmunitario adaptativo y en donde la pluralidad del cebadores del segmento J hibridan espedficamente sustancialmente con todos los segmentos genicos que codifican la region J del receptor inmunitario adaptativo que estan presentes en la composicion molde, en donde los cebadores oligonucleotfdicos del segmento V y del segmento J son capaces de promover la amplificacion en dicha reaccion en cadena de la polimerasa multiple (PCR) de (i) sustancialmente todos los oligonucleotidos molde en la composicion molde para producir una multiplicidad de moleculas de ADN molde amplificado, siendo dicha multiplicidad de moleculas de ADN molde amplificado suficientes para cuantificar la diversidad de los oligonucleotidos molde en la composicion molde, y (ii) sustancialmente todas las moleculas de ADR reordenado que codifican receptores inmunitarios adaptativos en la muestra biologica para producir una multiplicidad de moleculas de ADN reordenado amplificado, siendo dicha multiplicidad de moleculas de ADN reordenado amplificado suficiente para cuantificar la diversidad de las moleculas de ADN reordenado en el ADN de la muestra biologica, y en donde cada molecula de ADN amplificada en la multiplicidad de moleculas de ADN molde amplificado y en la multiplicidad de moleculas de ADN reordenado amplificado es inferior a 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100, 90, 80 o 70 nucleotidos de longitud, y (3) una composicion molde para la determinacion del factor de amplificacion en la que esta presente un numero conocido de una pluralidad de oligonucleotidos molde que tienen una secuencia oligonucleotfdica unica, comprendiendo la composicion molde: una pluralidad de oligonucleotidos molde que tienen una pluralidad de secuencias oligonucleotfdicas de formula general 5'-U1-B1-V-B2-R-B3-J-B4-U2-3' [I] en donde: (a) V es un polinucleotido que comprende al menos 20, 30, 60, 90, 120, 150, 180, o 210, y no mas de 1000, 900, 800, 700, 600 o 500 nucleotidos contiguos de una secuencia genica que codifica una region variable (V) del receptor inmunitario adaptativo, o el complemento de la misma, y en cada una de la pluralidad de secuencias de oligonucleotidos V comprende una secuencia oligonucleotfdica unica; (b) J es un polinucleotido que comprende al menos 15-30, 31-60, 61-90, 91-120 o 120-150, y no mas de 600, 500, 400, 300 o 200 nucleotidos contiguos de una secuencia genica que codifica la region de empalme (J) del receptor inmunitario adaptativo, o el complemento de la misma, y en cada una de la pluralidad de secuencias de oligonucleotidos J comprende una secuencia oligonucleotfdica unica; (c) U1 no es nada o comprende un oligonucleotido que tiene una secuencia que se selecciona entre (i) una primera secuencia de oligonucleotido adaptador universal, y (ii) una primera secuencia oligonucleotfdica espedfica de la plataforma de secuenciacion que esta conectada y posicionada 5' con respecto a una primera secuencia de oligonucleotido adaptador universal; (d) U2 no es nada o comprende un oligonucleotido que tiene una secuencia que se selecciona entre (i) una segunda secuencia de oligonucleotido adaptador universal, y (ii) una segunda secuencia oligonucleotfdica espedfica de la plataforma de secuenciacion que esta conectada y posicionada 5' con respecto a una segunda secuencia de oligonucleotido adaptador universal; (e) B1, b2, B3 y B4 son cada uno independientemente, nada o cada uno comprende un oligonucleotido B que comprende una secuencia codigo de barras de oligonucleotido de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25, nucleotidos contiguos, en donde en cada una de la pluralidad de secuencias de oligonucleotidos B comprende una secuencia oligonucleotfdica unica que identifica de forma unica, como una combinacion emparejada, (i) la secuencia oligonucleotfdica V unica de (a)) y (ii) la secuencia oligonucleotfdica J unica de (b); (f) R no es nada o comprende un sitio de reconocimiento para enzimas de restriccion que comprende una secuencia oligonucleotfdica que esta ausente de (a) - (e), y en donde: g) al menos uno de: (i) la pluralidad de oligonucleotidos molde comprende al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51-100, 101-200, 201-300, 301-400, 401-500, 501-600, 601-700, 701-800, 801-900, 901-1000, 1001-1100, 1101-1200, 1201-1300, 1301-1400, 1401-1500, 1501-1600, 1601-1700, 1701-2000 o 2001-2500 secuencias de oligonucleotidos unicas, (ii) la pluralidad de oligonucleotidos molde comprende al menos un oligonucleotido molde que tiene una secuencia oligonucleotfdica de formula general (I) con la que puede hibridar espedficamente cada cebador oligonucleotido del segmento V y al menos un

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oligonucleotido molde que tiene una secuencia oligonucleotfdica de formula general (I) con la cual puede hibridar espedficamente cada cebador oligonucleotfdico del segmento J, o (iii) la pluralidad de oligonucleotidos molde comprende al menos a o al menos b secuencias de oligonucleotfdidos unicas, la que sea mayor, donde a es la cantidad de segmentos genicos que codifican la region V del receptor inmunitario adaptativo unico en el sujeto y b es la cantidad de segmentos genicos que codifican la region J del receptor inmunitario adaptativo unico en el sujeto, y la composicion comprende al menos un oligonucleotido molde para cada polinucleotido V unico y al menos un oligonucleotido molde para cada polinucleotido J unico; (B) secuenciar cuantitativamente toda o una porcion suficiente de cada una de dichas moleculas de ADN molde amplificado y cada una de dichas moleculas de ADN reordenado amplificado para cuantificar (i) una cantidad de producto molde de moleculas de ADN molde amplificado que contienen al menos una secuencia codigo de barras de oligonucleotido, y (ii) una cantidad de producto reordenado de moleculas de ADN reordenado amplificado que carecen de una secuencia codigo de barras de oligonucleotido; (C) calcular un factor de amplificacion dividiendo la cantidad de producto molde de (B)(i) por la cantidad conocida de cada uno de la pluralidad de oligonucleotidos molde que tienen una secuencia oligonucleotfdica unica de (A)(2); y (D) dividir la cantidad de producto reordenado de (B)(ii) por el factor de amplificacion calculado en (C) para cuantificar las moleculas de aDn que codifican el receptor inmunitario adaptativo unico en la muestra.

En ciertas realizaciones adicionales, en la composicion molde para la determinacion del factor de amplificacion, todos los oligonucleotidos molde en la pluralidad de oligonucleotidos molde tienen una longitud sustancialmente identica. En ciertas otras realizaciones adicionales, cada cebador en el conjunto de cebadores de amplificacion oligonucleotfdicos es capaz de hibridar espedficamente con al menos un oligonucleotido molde en la pluralidad de oligonucleotidos de la composicion molde. En ciertas otras realizaciones adicionales, cada oligonucleotido molde en la pluralidad de oligonucleotidos molde comprende adicionalmente un codon de parada entre V y B2. En ciertas otras realizaciones adicionales, en la composicion molde para la determinacion del factor de amplificacion, cada oligonucleotido molde en la pluralidad de oligonucleotidos molde esta presente en una cantidad sustancialmente equimolar. En ciertas otras realizaciones adicionales, el receptor inmunitario adaptativo se selecciona entre TCRB, TCRG, TCRA, TCRD, IGH, IGK e IGL, en donde (i) el polinucleotido V de (a) codifica, respectivamente, un TCRB, TCRG, TCRA, TCRD, IGH, IGK o polipeptido de la region V del receptor IGL, y (ii) el polinucleotido J de (b) codifica, respectivamente, un polipeptido de la region J del receptor TCRB, TCRG, TCRa, TCRd, IGH, IGK o IGL. En ciertas otras realizaciones adicionales, el conjunto de cebadores de amplificacion oligonucleotfdicos es capaz de amplificar ADN reordenado productivamente que codifica uno o una pluralidad de receptores inmunitarios adaptativos, y en donde en dicha etapa (A) de amplificacion, el conjunto de cebadores de amplificacion oligonucleotfdicos no incluye ningun cebador oligonucleotfdico que hibride espedficamente con un pseudogen u orfon de la region V o con un pseudogen u orfon de la region J. En ciertas otras realizaciones adicionales, la pluralidad de oligonucleotidos molde tienen una pluralidad de secuencias de formula general (I) que se selecciona entre: (1) la pluralidad de secuencias de oligonucleotidos de formula general (I) en donde los polinucleotidos V y J tienen las secuencias V y J de TCRB expuestas en al menos un conjunto de 68 SEQ ID NO de V y J de TCRB, respectivamente, como se expone en la Figura 9 como Conjunto 1 de V/J de TCRB, Conjunto 2 de V/J de TCRB, Conjunto 3 de V/J de TCRB, Conjunto 4 de V/J de TCRB, Conjunto 5 de V/J de TCRB, Conjunto 6 de V/J de TCRB, Conjunto 7 de V/J de TCRB, Conjunto 8 de V/J de TCRB, Conjunto 9 de V/J de TCRB, Conjunto 10 de V/J de TCRB, Conjunto 11 de V/J de TCRB, Conjunto 12 de V/J de TCRB y Conjunto 13 de V/J de TCRB; (2) la pluralidad de secuencias oligonucleotidicas de formula general (I) en donde los polinucleotidos V y J tienen las secuencias V y J de TCGR expuestas en al menos un conjunto de 14 SEC ID NO de V y J de TCRg, respectivamente, como se expone en la Figura 10 como conjunto 1 de V/J de TCRG, conjunto 2 de V/J de TCRG, conjunto 3 de V/J de TCRG, conjunto 4 de V/J de TCRG y conjunto 5 de V/J de TCRG; (3) la pluralidad de secuencias de oligonucleotidos de formula general (I) en donde los polinucleotidos V y J tienen las secuencias V y J de IGH expuestas en al menos un conjunto de 127 SEQ ID NO de V y J de IGH, respectivamente, como se expone en Figura 11 como conjunto 1 de V/J de IGH, conjunto 2 de V/J de IGH, conjunto 3 de V/J de IGH, conjunto 4 de V/J de IGH, conjunto 5 de V/J de IGH, conjunto 6 de V/J de IGH, conjunto 7 de V/J de IGH, conjunto 8 de V/J de IGH y conjunto 9 de V/J de IGH; (4) la pluralidad de secuencias de oligonucleotidos de formula general (I) como se expone en SEQ ID NO: 3157-4014; (5) la pluralidad de secuencias de oligonucleotidos de formula general (I) como se expone en SEQ ID NO: 4015-4084; ; y (6) la pluralidad de secuencias de oligonucleotidos de formula general (I) como se expone en SEQ ID NO: 4085-5200.

En la presente memoria se describe un metodo que comprende recibir un conjunto de datos que comprende datos de secuenciacion para una pluralidad de amplicones obtenidos a partir de una primera muestra que comprende secuencias de ADN reordenado de una region que codifica la region determinante de la complementariedad 3 (CDR3) del receptor de celulas T (TCR) reordenada, obtenida la primera muestra de un sujeto; determinar a partir del conjunto de datos: la presencia de al menos una secuencia unica de ADN reordenado indicativa de un tumor maligno hematologico linfoide clonal en la primera muestra, y una frecuencia de aparicion relativa de la al menos unica secuencia de ADN reordenado en la primera muestra; y comparar la frecuencia de aparicion relativa de la al menos unica secuencia de ADN reordenado en la primera muestra con una frecuencia de aparicion relativa de la secuencia unica de ADN reordenado en una segunda muestra, en donde una frecuencia de aparicion relativa de la al menos una secuencia unica de ADN reordenado de al menos 1 de cada 105 regiones codificantes de CDR-3 DE TCR es diagnostica de enfermedad residual minima para tumor maligno hematologico linfoide en el sujeto.

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En ciertos casos, la primera muestra comprende celulas T. En ciertos casos, la segunda muestra comprende celulas T. En ciertos casos, la primera muestra comprende una pluralidad de celulas hematopoyeticas linfoides obtenidas del sujeto en un momento posterior al tratamiento del tumor maligno hematologico linfoide. En ciertos casos, la segunda muestra comprende una pluralidad de celulas hematopoyeticas linfoides obtenidas del sujeto en un punto temporal anterior al tratamiento. En ciertos casos, la etapa para determinar a partir del conjunto de datos la presencia de al menos una secuencia unica de ADN reordenado indicativa de un tumor maligno hematologico linfoide clonal en la primera muestra comprende identificar una secuencia clonal que tiene una frecuencia relativa de al menos 15% de regiones que codifican CDR3 de TCRy reordenadas o regiones que codifican CDR3 de TCRp reordenadas. En ciertos casos, el conjunto de datos se obtiene amplificando mediante una reaccion en cadena de polimerasa multiple (PCR) una pluralidad de segmentos genicos de una region que codifica CDR3 de TCRy reordenada o una region que codifica CDR3 de TCRp reordenada, comprendiendo cada segmento genico una region variable (V) y una region de empalme (J), utilizando una pluralidad de cebadores oligonucleotfdicos del segmento V, cada cebador oligonucleotfdico de segmento V capaz de hibridar con uno o mas polinucleotidos de la region V de TCR de los segmentos genicos; una pluralidad de cebadores oligonucleotidicos del segmento J, cada cebador del segmento J capaz de hibridar con uno o mas polinucleotidos de la region J de TCR de los segmentos genicos; en donde la pluralidad de cebadores oligonucleotfdicos del segmento V y cebadores oligonucleotidicos del segmento J promueven la amplificacion de las regiones que codifican CDR3 de TCRy o las regiones que codifican CDR3 de TCRp en la primera muestra para producir una pluralidad de amplicones; y secuenciar la pluralidad de amplicones para determinar una secuencia de nucleotidos para cada uno de la pluralidad de amplicones.

En una realizacion adicional, el polinucleotido de la region V de TCR codifica un polipeptido Vy de TCR o un polipeptido Vp de TCR. En otra realizacion adicional, el polinucleotido de la region J de TCR codifica un polinucleotido J de TCRy o un polipeptido J de TCRp. En otra realizacion adicional, cada uno de la pluralidad de cebadores oligonucleotfdicos del segmento V comprende una secuencia de nucleotidos de al menos l5 nucleotidos contiguos. En ciertas realizaciones, la secuencia de nucleotidos es complementaria a un segmento genico que codifica V de TCRy funcional o un segmento genico que codifica Vp de TCR funcional. En ciertas realizaciones, el segmento genico que codifica V de TCRy funcional o el segmento genico que codifica Vp de TCR funcional comprenden una secuencia senal de recombinacion (RSS) del gen V. En ciertas realizaciones, cada uno de la pluralidad de cebadores oligonucleotfdicos del segmento J comprende una secuencia de nucleotidos de al menos 15 nucleotidos contiguos. En ciertas realizaciones, la secuencia de nucleotidos es complementaria a un segmento genico que codifica J de TCRy funcional o un segmento genico que codifica J de TCRp funcional. En ciertas realizaciones adicionales, el segmento genico que codifica J de TCRy funcional o el segmento genico que codifica J de TCRp funcional comprenden una RSS del gen J.

De acuerdo con ciertas realizaciones, la pluralidad de cebadores oligonucleotidicos del segmento V son complementarios a al menos 10, 20, 30 o 40 nucleotidos contiguos de un segmento genico que codifica TCRV. En una realizacion adicional, los al menos 10, 20, 30 o 40 nucleotidos contiguos estan situados 5' con respecto a un gen V de RSS. En ciertas otras realizaciones, la pluralidad de cebadores oligonucleotidicos del segmento J es complementaria a al menos 10, 20 o 30 nucleotidos contiguos de un segmento genico que codifica J de TCR. En ciertas realizaciones adicionales, los al menos 10, 20 o 30 nucleotidos contiguos de un segmento genico que codifica J de TCR estan situados 3' con respecto a la RSS del gen J.

En otra realizacion, la etapa de amplificacion comprende amplificar sustancialmente todos los segmentos genicos que comprenden regiones que codifican CDR3 de TCRy reordenadas o regiones CDR3 de TCRp reordenadas en la primera muestra. En otra realizacion, la pluralidad de cebadores oligonucleotidicos del segmento V hibrida sustancialmente con todos los segmentos genicos funcionales que codifican Vy de TCR o segmentos genicos que codifican Vp de TCR en la primera muestra. En otra realizacion, la pluralidad de cebadores oligonucleotidicos del segmento J hibrida sustancialmente con todos los segmentos genicos funcionales que codifican Jy de TCR o segmentos genicos que codifican Jp de TCR en la primera muestra. En otra realizacion, la pluralidad de amplicones es suficiente para cuantificar la diversidad de las regiones que codifican CDR3 de TCRy o la region que codifica CDR3 de TCRp en la primera muestra. En otra realizacion, cada amplicon secuenciado tiene una longitud inferior a 600 nucleotidos. En otra realizacion, la pluralidad de cebadores oligonucleotfdicos del segmento V y la pluralidad de cebadores oligonucleotidicos del segmento J se seleccionan entre: (1) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 5579-5643, (2) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 5644-5792, (3) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 5793-5816, (4) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 5817-6123, (5) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 6124-6127 y 6212-6215, (6) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 6128-6211 y 6216-6221, (7) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 6222-6286, y (8) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 6222-6351.

En otra realizacion, uno o mas de los cebadores oligonucleotidicos del segmento V comprenden una secuencia de nucleotidos que comprende al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleotidos de SEQ ID NO: 5579-5630, 5644-5779, 5799-5816, 6124-6127, o 6222-6273. En otra realizacion, uno o mas de los cebadores oligonucleotidicos del segmento J comprenden una secuencia de nucleotidos que comprende al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleotidos de SEQ ID NO: 5631-5643, 5780-5798, 6212-6215 o 62746286. En otra realizacion, uno o mas de los cebadores oligonucleotfdicos del segmento V comprenden una

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secuencia de nucleotidos que comprende al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleotidos de SEQ ID NO: 5579-5630, 5644-5779, 5799-5816, 6124-6127, o 6222-6273 y en donde uno o mas de los cebadores oligonucleotfdicos del segmento J comprenden una secuencia de nucleotidos que comprende al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleotidos de SEQ ID NO: 5631-5643, 5780-5798, 6212-6215 o 6274- 6286.

En la presente memoria se describe un metodo que comprende: recibir un conjunto de datos que comprende datos de secuenciacion para una pluralidad de amplicones obtenidos a partir de una primera muestra que comprende secuencias de ADN reordenado de una region que codifica la region determinante de la complementariedad 3 (CDR3) del receptor de celulas T reordenada, obtenida la primera muestra de un sujeto; determinar a partir del conjunto de datos una frecuencia de aparicion relativa de cada amplicon secuenciado unico; y determinar si el sujeto tiene un tumor maligno hematologico linfoide clonal basandose en la presencia o ausencia de al menos una secuencia unica de ADN reordenado que tiene una frecuencia de aparicion relativa que excede del 15% de regiones que codifican CDR3 de TCR reordenadas en la primera muestra, en donde la frecuencia de aparicion relativa de la al menos unica secuencia de ADN reordenado que excede del 15% es diagnostica de un tumor maligno hematologico linfoide clonal en el sujeto. En otro caso, la frecuencia de aparicion relativa de al menos una secuencia genica reordenada unica es al menos 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29% o 30% de las regiones que codifican CDR3 de TCRy o las regiones que codifican CDR3 de TCRp reordenadas en la muestra. En otro caso, el metodo comprende adicionalmente determinar una ausencia de la muestra de al menos una secuencia unica de ADN reordenado que tiene una frecuencia relativa de al menos 15% de regiones que codifican CDR3 de TCRy reordenadas o regiones que codifican CDR3 de TCRp reordenadas. En ciertos casos, la etapa de determinacion indica que el sujeto debe evaluarse para determinar un inmunofenotipo tfmico precursor temprano.

En ciertos casos, el conjunto de datos se obtiene amplificando mediante una reaccion en cadena de polimerasa multiple (PCR) una pluralidad de segmentos genicos de una region que codifica CDR3 de TCRy reordenada o una region que codifica CDR3 de TCRp reordenada, comprendiendo cada segmento genico una region variable (V) y una region de empalme (J), utilizando: una pluralidad de cebadores oligonucleotfdicos del segmento V, cada cebador oligonucleotfdico de segmento V capaz de hibridar con uno o mas polinucleotidos de la region V de TCR de los segmentos genicos; una pluralidad de cebadores oligonucleotfdicos del segmento J, cada cebador del segmento J capaz de hibridar con uno o mas polinucleotidos de la region J de TCR de los segmentos genicos; en donde la pluralidad de cebadores oligonucleotfdicos del segmento V y cebadores oligonucleotfdicos del segmento J promueven la amplificacion de las regiones que codifican CDR3 de TCRy reordenadas o las regiones que codifican CDR3 de TCRp reordenadas en la muestra para producir una pluralidad de amplicones; y secuenciar la pluralidad de amplicones para determinar una secuencia de nucleotidos para cada uno de la pluralidad de amplicones. En ciertos casos adicionales, la pluralidad de cebadores oligonucleotfdicos del segmento V y la pluralidad de cebadores oligonucleotfdicos del segmento J se seleccionan entre: (1) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 5579-5643, (2) las secuencias expuestas en SEQ. ID NOs: 5644-5792, (3) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 5793-5816, (4) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 5817-6123, (5) las secuencias expuestas en SEQ ID NO : 6124-6127 y 6212-6215, (6) las secuencias expuestas en SEQ ID nO: 6128-6211 y 6216-6221, (7) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 6222-6286, y (8) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 6222-6351. En algunos otros ejemplos adicionales, uno o mas de los cebadores oligonucleotfdicos del segmento V comprenden una secuencia de nucleotidos que comprende al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleotidos de SEQ ID NO: 5579-5630, 5644-5779, 5799-5816, 6124- 6127, o 6222-6273.

De acuerdo con un caso relacionado, uno o mas de los cebadores oligonucleotidicos del segmento J comprenden una secuencia de nucleotidos que comprende al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleotidos de SEQ ID NO: 5631-5643, 5780-5798, 6212-6215 o 6274-6286. En otro caso, uno o mas de los cebadores oligonucleotfdicos del segmento V comprenden una secuencia de nucleotidos que comprende al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleotidos de SEQ ID NO: 5579-5630, 5644-5779, 5799-5816, 6124-6127, o 6222-6273 y en donde uno o mas de los cebadores oligonucleotidicos del segmento J comprenden una secuencia de nucleotidos que comprende al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleotidos de SEQ ID NO: 5631-5643, 5780-5798, 6212-6215 o 6274- 6286.

En la presente memoria se describe un metodo que comprende recibir un conjunto de datos que comprende datos de secuenciacion para una pluralidad de amplicones obtenidos a partir de una primera muestra que comprende secuencias de ADN reordenado de una region que codifica la region determinante de la complementariedad 3 (CDR3) del receptor de celulas T (TCR) reordenada o una region que codifica CDR3 de inmunoglobulina (Ig), obtenida la primera muestra de un sujeto; determinar a partir del conjunto de datos: la presencia de al menos una secuencia unica de ADN reordenado indicativa de un tumor maligno hematologico linfoide clonal en la primera muestra, y una frecuencia de aparicion relativa de la al menos unica secuencia de ADN reordenado en la primera muestra; determinar si el sujeto tiene enfermedad residual minima comparando la frecuencia de aparicion relativa de al menos una secuencia unica de ADN reordenado en la muestra con una frecuencia de aparicion relativa de la secuencia unica de ADN reordenado en una segunda muestra, en donde una frecuencia de aparicion relativa de al

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menos 1 en 105 regiones que codifican CDR-3 de TCR o CDR-3 de Ig en la primera muestra es diagnostica de enfermedad residual mmima para un tumor maligno hematologico linfoide. En otro caso, el conjunto de datos se obtiene amplificando mediante una reaccion en cadena de polimerasa multiple (PCR) una pluralidad de segmentos genicos de regiones que codifican la region determinante de la complementariedad 3 del receptor de celulas T (TCR) reordenadas o regiones que codifican CDR3 de inmunoglobulina (Ig), comprendiendo cada segmento genico una region variable (V) y una region de empalme (J), utilizando: una pluralidad de cebadores oligonucleotfdicos del segmento V, cada cebador oligonucleotfdico del segmento V capaz de hibridar con una o mas polinucleotidos de la region V de TCR o uno o mas polinucleotidos de la region V de Ig; una pluralidad de cebadores oligonucleotidicos del segmento J, cada cebador del segmento J capaz de hibridar con uno o mas polinucleotidos de la region J de TCR o uno o mas polinucleotidos de la region J de Ig de los segmentos genicos; en donde la pluralidad de cebadores oligonucleotidicos del segmento V y cebadores oligonucleotidicos del segmento J promueven la amplificacion de las regiones que codifican CDR3 de TCR o las regiones codificantes de CDR3 de Ig en la primera muestra para producir una pluralidad de amplicones; y secuenciar la pluralidad de amplicones para determinar una secuencia de nucleotidos para cada uno de la pluralidad de amplicones.

En un caso, el polinucleotido de la region V de TCR codifica un polipeptido de la region V de TCR o un polipeptido de la region V de Ig. En un caso, el polinucleotido de la region J de TCR codifica un polinucleotido de la region J de TCR o un polipeptido de la region J de Ig. En otro caso, la pluralidad de cebadores oligonucleotfdicos del segmento V y la pluralidad de cebadores oligonucleotidicos del segmento J se seleccionan entre: (1) las secuencias expuestas en SeQ ID NO: 5579-5643, (2) las secuencias expuestas en la SEC ID NO: 5644-5792, (3) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 5793-5816, (4) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 5817-6123, (5) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 6124-6127 y 6212-6215, (6) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 6128-6211 y 6216-6221, (7) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 6222-6286, y (8) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 6222-6351. En otro caso, uno o mas de los cebadores oligonucleotidicos del segmento V comprenden una secuencia de nucleotidos que comprende al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleotidos de SEQ ID NO: 5579-5630, 5644-5779, 5799-5816, 6124-6127, o 6222-6273. En otro caso, uno o mas de los cebadores oligonucleotfdicos del segmento J comprenden una secuencia de nucleotidos que comprende al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleotidos de SEQ ID NO: 5631-5643, 5780-5798, 6212-6215 o 62746286. En otro caso, uno o mas de los cebadores oligonucleotidicos del segmento V comprenden una secuencia de nucleotidos que comprende al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleotidos de SEQ ID NO: 5579-5630, 5644-5779, 5799-5816, 6124-6127, o 6222-6273 y en donde uno o mas de los cebadores oligonucleotfdicos del segmento J comprenden una secuencia de nucleotidos que comprende al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleotidos de SEQ ID NO: 5631-5643, 5780-5798, 6212-6215 o 62746286.

De acuerdo con ciertos casos adicionales de los metodos descritos anteriormente, el tumor maligno hematologico linfoide se selecciona entre: leucemia linfoblastica de celulas T aguda (T-ALL), leucemia linfoblastica de celulas p aguda (B-ALL), mieloma multiple, plasmacitoma, macroglobulinemia, leucemia linfocftica cronica (CLL), leucemia linfoblastica aguda (ALL), mieloma multiple, plasmacitoma, macroglobulinemia, leucemia linfocftica cronica (CLL), linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, linfoma cutaneo de celulas T, linfoma de celulas del manto, linfocitos T perifericos linfoma, leucemia de celulas pilosas, linfoma prolinfocftico T, linfoma de celulas T angioinmunoblastico, leucemia/linfoma linfoblastico de celulas T, linfoma de celulas T periferico, leucemia/linfoma de celulas T adultas, micosis fungoide, smdrome de Sezary, leucemia linfoblastica de celulas T, neoplasia mieloproliferativa y smdrome mielodisplasico.

En ciertos casos de los metodos descritos anteriormente, el metodo comprende adicionalmente: recibir un segundo conjunto de datos que comprende secuenciar datos para normalizar las eficacias de amplificacion de una pluralidad de conjuntos de cebadores, comprendiendo el segundo conjunto de datos de secuenciacion para una pluralidad de amplicones molde. En ciertos casos adicionales, el segundo conjunto de datos se obtiene amplificando mediante PCR multiple una pluralidad de oligonucleotidos molde unicos para producir una pluralidad de amplicones molde unicos, teniendo cada oligonucleotido molde unico una concentracion conocida de moleculas y una secuencia codigo de barras unica, y comprendiendo la pluralidad de conjuntos de cebadores una pluralidad de cebadores oligonucleotfdicos del segmento V y una pluralidad de cebadores oligonucleotfdicos del segmento J; y secuenciando cuantitativamente la pluralidad de amplicones molde unicos. En un caso, el metodo comprende adicionalmente el ajuste de la concentracion de uno o mas cebadores oligonucleotfdicos del segmento V y uno o mas cebadores oligonucleotfdicos del segmento J para reducir la amplificacion sesgada de segmentos de genes que codifican TCR o Ig en la primera muestra. En ciertos casos, la amplificacion por PCR multiple de una pluralidad de oligonucleotidos molde unicos comprende el uso de concentraciones equimolares de cebadores oligonucleotidicos del segmento V y cebadores oligonucleotfdicos del segmento J. En ciertos casos, la pluralidad de cebadores oligonucleotfdicos del segmento V y la pluralidad de cebadores oligonucleotidicos del segmento J se seleccionan entre: (1) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 5579-5643, (2) las secuencias expuestas en la SEC ID NO: 5644-5792, (3) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 5793-5816, (4) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 5817-6123, (5) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 6124-6127 y 6212-6215, (6) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 6128-6211 y 62166221, (7) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 6222-6286, y (8) las secuencias expuesto en SEQ ID NO: 6222-

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En otro caso, el metodo descrito anteriormente comprende adicionalmente: cuantificar basandose en el primer conjunto de datos y el segundo conjunto de datos: (a) una cantidad de producto molde de amplicones molde que contienen al menos una secuencia codigo de barras de oligonucleotidos, y (b) una cantidad de producto reordenado amplicones secuenciados que carecen de una secuencia codigo de barras de oligonucleotidos; calcular un factor de amplificacion dividiendo la cantidad de producto molde por la cantidad conocida de cada una de la pluralidad de oligonucleotidos molde unicos; y determinar la cantidad de secuencias que codifican TCR o Ig reordenadas unicas en la primera muestra dividiendo la cantidad de producto reordenado por el factor de amplificacion. En un caso, el metodo comprende ademas determinar la cantidad de genomas unicos de celulas T o genomas de celulas B en la primera muestra.

De acuerdo con ciertos metodos relacionados, la pluralidad de oligonucleotidos molde unicos comprende una formula general: 5'-U1-B1-V-B2-R-B3-J-B4-U2-3' (Formula I), en donde V comprende un polinucleotido que comprende al menos 20, 30, 60, 90, 120, 150, 180 o 210, y no mas de 1000, 900, 800, 700, 600 o 500 nucleotidos contiguos de una secuencia genica que codifica la region V, o un complemento de la misma, y donde V comprende una secuencia oligonucleotfdica unica, en donde J es un polinucleotido que comprende al menos 15-30, 31-60, 6190, 91-120, o 120-150, y no mas de 600, 500, 400, 300 o 200 nucleotidos contiguos de una secuencia genica que codifica la region J, o un complemento de la misma, y en donde J comprende una secuencia oligonucleotidica unica, en donde U1 no es nada o comprende un oligonucleotido que tiene una secuencia que se selecciona entre (i) una primera secuencia de oligonucleotido adaptador universal, y (ii) una primera secuencia oligonucleotfdica espedfica de la plataforma de secuenciacion que esta conectada y posicionada en 5' con respecto a una primera secuencia de oligonucleotido adaptador universal, en donde U2 no es nada o comprende un oligonucleotido que tiene una secuencia que se selecciona entre (i) una segunda secuencia de oligonucleotido adaptador universal, y (ii) una segunda secuencia oligonucleotfdica espedfica de la plataforma de secuenciacion que esta conectada y posicionada 5' con respecto a una segunda secuencia de oligonucleotido adaptador universal, en donde B1, B2, b3 y B4 son cada uno independientemente nada o cada uno comprende un oligonucleotido B que comprende una secuencia codigo de barras de oligonucleotido de 3-25 nucleotidos contiguos, en donde en cada una de la pluralidad de secuencias de oligonucleotidos B comprende una secuencia oligonucleotfdica unica que identifica de forma unica, como una combinacion emparejada, una secuencia oligonucleotfdica V unica y una secuencia oligonucleotfdica J unica, y en donde R no es nada o comprende un sitio de reconocimiento para enzimas de restriccion que comprende una secuencia oligonucleotfdica no encontrada en el oligonucleotido molde.

Breve descripcion de las diversas vistas de los dibujos

La Figura 1 (Fig. 1A-1B) representa la comparacion de la evaluacion de la clonalidad de celulas T en muestras de sangre de pacientes con T-ALL, mediante secuenciacion de alto rendimiento (HTS) y citometna de flujo multiparametrica (mpFC), antes del tratamiento (Dfa 0) y 29 dfas despues del tratamiento (dfa 29). Los clones detectados mediante HTS (color rojo) se encontraron en las 12 muestras post-tratamiento informativas que fueron positivas para ERM mediante mpFC (color azul), asf como en un nivel inferior en 10 pacientes adicionales, lo que sugiere una sensibilidad superior para HTS frente a mpFC. Los pacientes 39 y 52 teman un inmunofenotipo proximo al del precursor tfmico temprano (nETP); todos los demas teman leucemia linfoblastica aguda de celulas T (T-ALL) tipica. La Fig. 1A muestra la clonalidad de las celulas T segun se detecto el dfa 0 utilizando citometna de flujo multiparametrica (mpFC) y secuenciacion de alto rendimiento (HTS) de regiones de ADN que codifican cDR3 de TCRp amplificadas y reordenadas. Las muestras con una poblacion clonal fueron identificadas mediante secuenciacion TCRB. Los datos se representan como la frecuencia de la secuencia clonal en la poblacion total de celulas T. La Fig. 1B muestra la deteccion de enfermedad residual minima (ERM) el dfa 29 en muestras de pacientes que exhibieron un reordenamiento de TCRp clonal identificable el dfa 0.

La Figura 2 muestra la deteccion de ERM en casos de precursores tfmicos tempranos (ETP) o proximos a ETP (nETP) el dfa 29. Todos los casos (5/5) designados como precursor timico temprano ETP (color amarillo), y la mayona de los casos (6/8) designados como proximos a ETP (nETP, color verde) caredan de un reordenamiento de genes de TCRB clonal, completo el dfa 0, segun se evaluo mediante HTS de regiones de ADN que codifican CDR3 de TCRp amplificadas y reordenadas. Estos casos, sin embargo, teman ERM detectable mediante mpFC.

La Figura 3 muestra inmunofenotipos representativos de T-ALL caracterizados mediante mpFC de subtipo ETP (fila superior), subtipo proximo a ETP (fila central) y subtipo ALL tfpica/no ETP (fila inferior). Las poblaciones de linfoblastos T se muestran en color verde azulado. Se utilizaron los criterios referidos para el inmunofenotipo ETP (5). Cinco de 43 casos teman un inmunofenotipo ETP. Ocho de 43 casos teman un inmunofenotipo proximo a ETP. Los otros 30 casos fueron T-ALL tfpica y no fueron ni ETP ni proximos a ETP. La Figura 4 (Fig. 4A-4B) muestra secuencias de genes de TCRB clonales caracterizadas en muestras del Dfa 0 (pretratamiento) mediante secuenciacion de alto rendimiento (HTS) de regiones de ADN que codifican CDR3 de TCRp amplificadas y reordenadas. Las secuencias CDR3 de TCRB (TCRp) se muestran para casos tfpicos de T-ALL. 31 de 43 (72,1%) muestras de pretratamiento teman una secuencia de TCRB clonal

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detectable; al menos 27 tambien teman una secuencia TCRG (TCRy) clonal. Se muestran secuencias de CDR3 de TCRB con regiones de inserciones de nucleotidos (subrayado simple) y gen D (subrayado doble) destacadas.

La Figura 5 muestra una comparacion de los repertorios de TCRB clonales normal y T-ALL por medio de la frecuencia de aparicion relativa de los cinco clones de TCRB de frecuencia mas alta basados en secuencias de TCRB identificadas mediante HTS en muestras de sangre de seis sujetos normales sanos (izquierda) y seis casos diagnosticados de T-ALL (derecha).

La Figura 6 muestra un diagrama esquematico de un oligonucleotido molde sintetico ilustrativo para su uso en la determinacion de un factor de amplificacion para estimar la cantidad de secuencias codificantes del receptor inmunitario adaptativo reordenado (TCR o BCR) en una muestra. U1, U2, oligonucleotidos adaptadores universales; B1-4, oligonucleotidos codigo de barras; V, oligonucleotido de la region variable; J, oligonucleotido de la region de empalme; R, sitio de reconocimiento para enzimas de restriccion; S, codon de parada opcional.

La Figura 7 muestra los resultados del calculo de un factor de amplificacion para cada par VJ en una composicion molde que se anadio a una amplificacion mediante PCR multiplexada de secuencias de IGH, y de la posterior realizacion del promedio del factor de amplificacion en todos los moldes sinteticos para estimar la multiplicidad de cobertura de secuencia. Cada barra representa la cantidad total de moleculas sinteticas con la misma multiplicidad de cobertura de secuencia estimada. La mediana de la multiplicidad de cobertura de secuencia estimada fue de 3,25.

La Figura 8 muestra un grafico del numero de celulas B que se estimaron mediante PCR multiplexada utilizando una composicion molde sintetica y un factor de amplificacion calculado como se describe en la presente memoria, frente al numero conocido de celulas B utilizadas como fuente de moldes de ADN natural. Se anadieron cantidades constantes de ADN total, de las cuales una proporcion variada era ADN de celulas B, a reacciones de PCR multiplexadas. Ademas, se anadieron aproximadamente 5.000 moleculas de oligonucleotido molde sintetico de formula general (I) (aproximadamente 4-5 moleculas de cada secuencia) en cada reaccion. El numero de genomas de celulas B presentes en el ADN anadido a cada reaccion de PCR, segun se estima por medio de la amplificacion de las moleculas de oligonucleotidos molde sinteticas, se representa en el eje Y. En el eje X se muestra la cantidad real de ADN anadido a cada reaccion de PCR. La correlacion entre los valores reales y esperados fue r2 = 0,9988.

La Figura 9 (Figuras 9A-9L) muestra conjuntos de V/J de TCRB ilustrativos (68 V + 13 J) para su uso en composiciones molde que comprenden una pluralidad de secuencias de oligonucleotidos de formula general 5'-Ul-B1-V-B2-R-B3-J-B4-U2-3' [I], para su uso en la determinacion de un factor de amplificacion cuando se amplifica ADN reordenado que codifica uno o una pluralidad de polipeptidos de la cadena p del receptor de celulas T humanas (TCRB).

La Figura 10 (Figuras 10A-10B) muestra conjuntos de V/J de TCRG ilustrativos (14 V + 5 J) para su uso en composiciones molde que comprenden una pluralidad de secuencias de oligonucleotidos de formula general 5'-Ul-B1-V-B2-R-B3-J-B4-U2-3' [I], para su uso en la determinacion de un factor de amplificacion cuando se amplifica ADN reordenado que codifica uno o una pluralidad de polipeptidos de la cadena y del receptor de celulas T humanas (TCRG).

La Figura 11 (Figuras 11A-11M) muestra conjuntos de V/J de IGH ilustrativos (127 V + 9 J) para su uso en composiciones molde que comprenden una pluralidad de secuencias de oligonucleotidos de formula general 5'-U1-B1-V-B2-R-B3-J-B4-U2-3' [I], para su uso en la determinacion de un factor de amplificacion cuando amplifica ADN reordenado que codifica uno o una pluralidad de polipeptidos de cadena pesada de inmunoglobulina humana (IGH).

La Figura 12 es un diagrama de bloques de alto nivel que ilustra una vista funcional de un sistema informatico tfpico para su uso en metodos de acuerdo con ciertas realizaciones de la invencion.

Breve descripcion de las secuencias

SEQ ID NO: 1-871 son secuencias oligonucleotfdicas molde de TCRB de una composicion molde para la determinacion del factor de amplificacion.

SEQ ID NO: 872-1560 son secuencias oligonucleotidicas molde de TCRB de una composicion molde para la determinacion del factor de amplificacion.

SEQ ID NO: 1561-1630 son secuencias oligonucleotidicas molde de TCRG de una composicion molde para la determinacion del factor de amplificacion.

SEQ ID NO: 1631-1695 son secuencias de oligonucleotidos cebadores para la amplificacion de TCRB (TCRB- J, SEQ ID NO: 1631-1643; TCRB-V, SEQ ID NO: 1644-1695).

SEQ ID NO: 1696-1709 son secuencias de oligonucleotidos cebadores para secuenciacion de ADN.

SEQ ID NO: 1710-1731 son secuencias de oligonucleotidos adaptadores.

SEQ ID NO: 1732-1745 son secuencias de oligonucleotidos cebadores para la amplificacion de TCRG (TCRG-V, SEQ ID NO: 1732-1741; TCRG-J, SEQ ID NO: 1742-1745).

SEQ ID NO: 1746-1747 son secuencias de oligonucleotidos adaptadores.

SEQ ID NO: 1748 es una secuencia codigo de barras de oligonucleotido ilustrativa.

SEQ ID NO: 1749 es una secuencia de polinucleotido V ilustrativa.

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SEQ ID NO: 1750 es una secuencia de polinucleotido J ilustrativa.

SEQ ID NO: 1751-1752 son secuencias de oligonucleotidos adaptadores Illumina Nextera™.

SEQ ID NO: 1753-1804 son secuencias de oligonucleotidos cebadores para la amplificacion de TCRB.

SEQ ID NO: 1805-2920 son secuencias oligonucleotidicas molde de iGh de una composicion molde para la determinacion del factor de amplificacion.

SEQ ID NO: 2921-2988 son secuencias de polinucleotidos de V de TCRB para uso en una composicion molde para la determinacion del factor de amplificacion.

SEQ ID NO: 2989-3001 son secuencias de polinucleotidos de J de TCRB para utilizar en una composicion molde para la determinacion del factor de amplificacion.

SEQ ID NO: 3002-3015 son secuencias de polinucleotidos de V de TCRG para uso en una composicion molde para la determinacion del factor de amplificacion.

Las SEQ ID NO: 3016-3020 son secuencias de polinucleotidos de J de TCRG para uso en una composicion molde para la determinacion del factor de amplificacion.

Las SEQ ID NO: 3021-3147 son secuencias de polinucleotidos de V de IGH para utilizar en una composicion molde para la determinacion del factor de amplificacion.

SEQ ID NO: 3148-3156 son secuencias de polinucleotidos J de IGH para uso en una composicion molde para la determinacion del factor de amplificacion.

SEQ ID NO: 3157-4014 son secuencias oligonucleotidicas molde de TCRB de una composicion molde para la determinacion del factor de amplificacion.

SEQ ID NO: 4015-4084 son secuencias oligonucleotidicas molde de TCRG de una composicion molde para la determinacion del factor de amplificacion.

SEQ ID NO: 4085-5200 son secuencias oligonucleotidicas molde de IGH de una composicion molde para la determinacion del factor de amplificacion.

SEQ ID NO: 5201-5286 son cebadores directos de oligonucleotidos para la amplificacion de IGH.

SEQ ID NO: 5287-5293 son cebadores inversos de oligonucleotidos para la amplificacion de IGH.

SEQ ID NO: 5294-5386 son secuencias de oligonucleotidos cebadores para la amplificacion de IGH (V de IGH, SEQ ID NO: 5294-5379; J de IGH, SEQ ID NO: 5380-5386).

SEQ ID NO: 5387-5578 son secuencias de oligonucleotidos para cebadores de cola adaptadores.

SEQ ID NO: 5579-6382 son secuencias de oligonucleotidos cebadores para la amplificacion de secuencias que codifican el receptor inmunitario adaptativo.

SEQ ID NO: 6383-6388 son ejemplos de cebadores oligonucleotidicos para amplificar secuencias de genes de control ("constitutivos").

Descripcion detallada

La presente invencion proporciona, en ciertas realizaciones y como se describe en la presente memoria, metodos sorprendentemente ventajosos para detectar enfermedad residual minima (ERM) para tumores malignos hematologicos linfoides en sujetos que siguen el tratamiento para tales afecciones. Estas y otras realizaciones relacionadas estan dirigidas en la parte pertinente al uso de metodologfas de secuenciacion de alto rendimiento (HTS) recientemente desarrolladas para la caracterizacion cualitativa y cuantitativa de secuencias de ADN reordenado de genes que codifican receptores de celulas T (TCR).

La amplificacion multiplexada y la secuenciacion de alto rendimiento de las secuencias de ADN que codifican TCR y BCR (IG) reordenadas son descritas, por ejemplo, por Robins et al., 2009 Blood 114, 4099; Robins et al., 2010 Sci. Translat. Med. 2: 47ra64; Robins et al., 2011 J. Immunol. Meth. doi: 10.1016/j.jim.2011.09. 001; Sherwood et al. 2011 Sci. Translat. Med. 3: 90ra61; Publicacion de Estados Unidos Num. 2012/0058902, Publicacion de Estados Unidos Num. 2010/0330571, documento WO/2010/151416, documento WO/2011/106738 y documento WO2012/027503.

Ciertas realizaciones presentes pueden beneficiar de forma util el tratamiento clmico en trastornos linfoides tales como tumores malignos hematologicos linfoides u otros trastornos linfoproliferativos, por ejemplo, leucemia/linfoma linfoblastico agudo de celulas T (T-ALL), facilitando el diagnostico de la enfermedad y/o permitiendo la evaluacion de enfermedad residual minima en los pacientes despues del tratamiento. Como se describe en la presente memoria, la secuenciacion de alto rendimiento de los loci del gen del receptor de celulas T ofrece ventajas significativas sobre la evaluacion previa del estado de ERM mediante citometna de flujo multiparametrica de nueve colores (mpFC), que incluye una normalizacion mas sencilla de las metodologfas de ensayo de prueba.

Por ejemplo, los presentes metodos proporcionan ventajas en uno o mas de sensibilidad, especificidad, tiempo, coste, preparacion de reactivos, configuracion y calibracion del equipo, superacion de la falta de fiabilidad de los metodos anteriores debido a la dependencia de manipulaciones subjetivas del operador y otros factores, en comparacion ya sea con mpFC o con enfoques moleculares espedficos del paciente para la evaluacion de ERM. Como se describe en la presente memoria en los Ejemplos, los presentes metodos permitieron inesperadamente la deteccion de ERM con una sensibilidad comparable o mayor que la mpFC, asf como una sorprendente deteccion de ERM en muestras de pacientes para las cuales la mpFC no identifico ERM. Ademas, las metodologfas HTS actuales

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identificaron casos de T-ALL que exhiben propiedades similares a las del precursor tfmico temprano (ETP). Los casos de ETP/T-ALL descritos en la presente memoria caredan de un reordenamiento del gen TCRB clonal en el momento del diagnostico, como se identifica utilizando los metodos descritos en la presente memoria. En vista del curso clmico agresivo de ETP/T-ALL, la gestion mejorada de la enfermedad y otras ventajas sin precedentes asociadas con la clasificacion temprana de ETP/T-ALL se proporcionan de este modo por medio de ciertas realizaciones que se divulgan en la presente memoria.

De acuerdo con algunas de las presentes realizaciones, la capacidad para caracterizar cualitativamente (p.ej., identificando secuencias unicas de regiones genicas que codifican CDR3 de TCR reordenadas en una muestra) y cuantitativamente (p.ej., determinando la frecuencia de aparicion relativa de cualquier secuencia de ADN que codifica CDR3 de TCR unica reordenada como una proporcion del numero total de secuencias codificantes de tCr en la muestra) la diversidad de receptores inmunitarios adaptativos proporciona los medios para diagnosticar enfermedades de celulas linfoides (p.ej., un tumor maligno hematologico linfoide), y tambien proporciona medios para detectar la presencia de enfermedad residual minima (ERM) en un sujeto durante y despues del tratamiento.

Los ejemplos ilustrativos y no limitantes de enfermedades de celulas linfoides para las que las realizaciones de la presente invencion divulgadas pueden ayudar utilmente en el diagnostico y/o deteccion de ERM incluyen tumores malignos hematologicos linfoides tales como leucemia linfoblastica aguda (ALL), mieloma multiple, plasmacitoma, macroglobulinemia, leucemia linfodtica cronica (CLL), otros linfomas y leucemias incluyendo linfoma Hodgkin y no Hodgkin, linfoma cutaneo de celulas T, linfoma de celulas del manto, linfoma periferico de celulas T, leucemia de celulas pilosas, linfoma prolinfodtico de celulas T, linfoma angioinmunoblastico de celulas T, leucemia linfoblastica T/linfoma, linfoma de celulas T periferico-no especificado de otro modo, leucemia/linfoma de celulas T adultas, micosis fungoide, smdrome de Sezary, leucemia linfoblastica de celulas T y cualquier otro cancer que implique celulas T o celulas B; y tambien puede incluir otros trastornos linfoproliferativos, incluyendo neoplasmas mieloproliferativos, smdrome mielodisplasico y otros.

La deteccion de ERM puede jugar un papel importante no solo en el control de la respuesta de un paciente a la terapia, sino tambien en el diagnostico preciso de la causa subyacente de los principales signos clmicos. La ERM tfpicamente se refiere a la presencia de celulas malignas (generalmente en referencia a celulas leucemicas) que no son detectables basandose en la morfologfa celular. Varios estudios han demostrado que la deteccion cuantitativa de ERM en las neoplasias linfoides predice el resultado clmico. (Szczepanski T, et al., Lancet Oncol 2001; 2:409-17; van Dongen JJ, et al., Lancet 1998; 352:1731-8; Bruggemann M, et al., Acta Haematol 2004; 112:111-9; Cave H, et al., N Engl J Med 1998; 339:591-8; Coustan-Smith E, et al., Blood 2000; 96:2691-6; Coustan-Smith E, et al., Blood 2002; 100:52-8; Wells DA, et al., Am J Clin Pathol 1998; 110:84-94; Radich J, et al., Biol Blood Marrow Transplant 1995; 1:24-31; Bahloul M, et al., Best Pract Res Clin Haematol 2005; 18:97-111; Hoshino A, et al., Tohoku J Exp Med. 2004; 203:155-64; Ciudad J, et al., Br J Haematol 1999; 104:695-705; Lucio P, et al., Leukemia 1999; 13:41927). Ciertas realizaciones contempladas que se relacionan con el diagnostico, por ejemplo, pueden incluir la deteccion de ERM en linfomas realizando en primer lugar secuenciacion de alto rendimiento (HTS) como se describe en la presente memoria de ADN que codifica uno o mas receptores inmunitarios adaptativos (p.ej., TCR) en una muestra que contiene celulas linfoides obtenidas de linfa o ganglios linfaticos, sangre periferica u otros tejidos, para identificar una o mas secuencias clonales de TCR, y pueden implicar adicionalmente el seguimiento de la frecuencia de aparicion de tales secuencias clonales de tCr en muestras de sangre en uno o mas puntos temporales posteriores.

El control de la respuesta de un paciente con cancer a un tratamiento terapeutico basado en la cuantificacion de la carga tumoral (p.ej., mediante la deteccion de ERM) puede ayudar a la evaluacion de un riesgo relativo de recafda y tambien puede utilizarse para identificar pacientes que pueden beneficiarse de la reduccion de la terapia, la intensificacion de la terapia, la reduccion de la inmunosupresion para el efecto de injerto contra leucemia despues de un trasplante de celulas madre o terapia de celulas T adoptivas. (Bradfield SM, et al., Leukemia 2004; 18: 1156-8). Tambien se puede encontrar enfermedad minima en situaciones de diagnostico. Por ejemplo, los bajos niveles de celulas B monoclonales en pacientes que se presentan clmicamente con citopenia pueden levantar sospechas para un diagnostico de smdrome mielodisplasico. (Wells et al., Blood 2003; 102: 394-403). La deteccion de enfermedad minima tambien se encuentra en la estadificacion del linfoma, que puede implicar la deteccion de niveles bajos de celulas tumorales sobre un fondo de celulas normales. La deteccion de enfermedad minima como se describe en la presente memoria (p.ej., como la deteccion de ERM en pacientes con cancer linfoide despues del tratamiento) no necesita limitarse a la verificacion de los efectos del tratamiento, sino que tambien puede encontrar usos en entornos de diagnostico donde no hay disponible una poblacion de referencia para la comparacion.

De acuerdo con ciertas realizaciones, se proporciona asf un metodo para detectar enfermedad residual minima que comprende amplificar el ADN extrafdo de una primera muestra (p.ej., medula osea, linfa o sangre, dependiendo del tipo de cancer) obtenida del paciente en una reaccion en cadena de la polimerasa multiple (PCR) utilizando conjuntos de cebadores del segmento V y J como se describe en la presente memoria y en uno o mas de Robins et al., 2009 Blood 114, 4099; Robins et al., 2010 Sci. Translat. Med. 2:47ra64; Robins et al., 2011 J. Immunol. Meth. doi:10.1016/j.jim.2011.09. 001; Sherwood et al. 2011 Sci. Translat. Med. 3:90ra61; Publicacion de Estados Unidos

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Num. 2012/0058902, Publicacion de Estados Unidos Num. 2010/0330571, documento WO/2010/151416, documento WO/2011/106738 y documento WO2012/027503, en donde la primera muestra setoma en un primer punto temporal antes o durante un tratamiento terapeutico, y en donde la primera muestra comprende una poblacion de celulas T, en donde los cebadores del segmento V y del segmento J permiten la amplificacion de sustancialmente todas las combinaciones de segmentos V y J de un locus de TCR reordenado en la PCR multiple para producir una multiplicidad de moleculas de ADN amplificadas que comprenden cada una una region que codifica cDR3 de TCR; medir una frecuencia relativa de las regiones que codifican CDR3 de TCR reordenadas de manera unica, identificando de este modo la region que codifica CDR3 de TCR reordenada de manera unica de los uno o mas clones de celulas T malignas; amplificar con los cebadores del segmento V y los cebadores del segmento J el ADN extrafdo de una segunda muestra del paciente, en una reaccion en cadena de la polimerasa multiple (PCR), en donde la segunda muestra se toma en un punto temporal posterior a la primera muestra y en donde la segunda muestra comprende una poblacion de celulas T, que mide la frecuencia relativa de la region que codifica CDR3 de TCR reordenada de manera unica de los uno o mas clones de celulas T malignas en la segunda muestra; en donde la presencia de la region que codifica CDR3 de TCR reordenada de manera unica de los uno o mas clones de celulas T malignas en la segunda muestra indica la presencia de enfermedad residual minima.

En ciertas realizaciones, la presencia de la region que codifica CDR3 reordenada de manera unica de los uno o mas clones malignos en la segunda muestra a una frecuencia relativa mayor que 10-6 regiones que codifican CDR3 de TCR indica la presencia de enfermedad residual minima. En ciertas otras realizaciones, la frecuencia relativa puede ser mayor que 1 x 10-5.

Los presentes metodos se pueden utilizar, adicional o alternativamente, para diagnosticar un trastorno que afecta a celulas linfoides tales como un tumor maligno hematologico linfoide, por ejemplo una enfermedad maligna asociada con clones de celulas T espedficos, donde se puede identificar al menos un clonotipo maligno espedfico en un paciente. Se puede detectar un clonotipo por la presencia en ADN extrafdo de una muestra de al menos una molecula de ADN reordenado que codifica una CDR3 de TCR y que tiene una secuencia de ADN unica, donde la frecuencia relativa de la secuencia unica de ADN reordenado se determina cuantificando la diversidad del receptor inmunitario adaptativo de acuerdo con los metodos descritos en la presente memoria.

Preferiblemente y en ciertas realizaciones, la deteccion de al menos una secuencia de ADN que codifica CDR3 reordenada unica que tiene una frecuencia relativa de al menos 15% de la frecuencia de aparicion de todas las secuencias que codifican CDR3 reordenadas detectables para un polipeptido del receptor inmunitario adaptativo concreto (p.ej. TCRa, TCRp, TCRy o TCR8) indica la presencia de un clonotipo asociado a tumor maligno. En ciertas otras realizaciones, la deteccion de al menos una secuencia de ADN que codifica CDR3 reordenada unica que tiene una frecuencia relativa de al menos 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29% o 30% de la frecuencia de aparicion de todas las secuencias codificantes de CDR3 reordenadas detectables para un polipeptido receptor inmunitario adaptativo concreto, indica la presencia de un clonotipo asociado a tumor maligno.

En ciertas otras realizaciones, se identifica un clonotipo que es diagnostico para un tumor maligno hematologico linfoide clonal determinando primero un valor normalizado Rc (± desviacion tfpica, DT) para la frecuencia de aparicion relativa de la secuencia que codifica CDR3 reordenada unica mas abundante detectable para un polipeptido receptor inmunitario adaptativo concreto (p.ej., TCRa, TCRp, TCRy o TCR8) en una muestra de uno o mas sujetos de control sanos normales, apropiadamente emparejados. A continuacion, se determina Rx (± DT), la frecuencia de aparicion relativa de secuencias codificantes de CDR3 reordenadas detectables para el polipeptido receptor inmunitario adaptativo concreto en una muestra de un sujeto que se sabe que tiene o se sospecha que tiene un tumor maligno hematologico linfoide. La muestra puede obtenerse del sujeto antes, durante o despues del tratamiento, tal como tratamiento terapeutico dirigido al tumor maligno linfoide. Se puede considerar que existe tumor maligno hematologico linfoide clonal presente, de acuerdo con ciertas realizaciones independientes contempladas en la presente memoria, cuando Rx tiene al menos 2,5, 3,0, 3,25, 3,5, 3,75, 4,0, 4,25, 4,5, 4,75 o 5,0 desviaciones tfpicas mas altas que Rc. Para una muestra obtenida durante o despues del tratamiento, Rx por lo tanto, se puede utilizar como un indicador de ERM. Por consiguiente, se puede identificar un clonotipo maligno en estas y en realizaciones relacionadas mediante la presencia, a un nivel relativo estadfsticamente significativo, de un clonotipo en la poblacion de regiones que codifican CDR3 reordenadas de manera unica que se han amplificado y secuenciado utilizando los metodos de la presente memoria.

Ciertas realizaciones divulgadas actualmente permiten de forma ventajosa la determinacion de el numero de celulas inmunitarias adaptativas (p.ej., linfocitos T o B) en una muestra que contiene celulas linfoides y que tambien puede contener celulas no linfoides, donde el ADN se extrae de la muestra para su uso como fuente de moldes para la amplificacion multiplexada de ADN de acuerdo con los presentes metodos. En estas y otras realizaciones relacionadas, que se describen con mayor detalle en otra parte de la presente memoria, se incluye (o se "incorpora") a la reaccion de amplificacion multiplexada una composicion molde artificial para la determinacion del factor de amplificacion. La secuenciacion cuantitativa de los productos de amplificacion de la composicion molde (cuyos productos son identificables en virtud de secuencias unicas codigo de barras de oligonucleotidos contenidas en ella) permite el calculo de un factor de amplificacion que es una caractenstica de la reaccion de amplificacion

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multiplexada concreta (p.ej., moldes, cebadores de amplificacion, condiciones de reaccion, etc.) que se ha realizado. El factor de amplificacion se puede utilizar para calcular, a partir de los datos de secuenciacion cuantitativa, la cantidad de moleculas unicas de ADN que codifican el receptor inmunitario adaptativo (p.ej., genomas de celulas linfoides que contienen el ADN del receptor inmunitario adaptativo reordenado que codifica el ADN) en la muestra.

Estas y otras realizaciones relacionadas comprenden adicionalmente cuantificar moleculas de ADN reordenado que codifican uno o una pluralidad de receptores inmunitarios adaptativos en ADN extrafdo de muestras biologicas que comprenden ADN de celulas linfoides de un sujeto como se proporciona en la presente memoria, realizando las etapas de amplificacion en presencia de un cantidad conocida de la composicion molde para la determinacion del factor de amplificacion; secuenciar cuantitativamente los productos de amplificacion del ADN que codifica el receptor inmunitario adaptativo reordenado en la muestra y de la composicion molde; calcular un factor de amplificacion; y dividir el numero de productos reordenados amplificados del ADN que codifica el receptor inmunitario adaptativo reordenado por el factor de amplificacion para cuantificar las moleculas de ADN que codifican el receptor inmunitario adaptativo unico que estan presentes en la muestra.

Muestras y sujetos

El sujeto o la fuente biologica, a partir de los cuales se puede obtener una muestra biologica de prueba, puede ser un animal humano o no humano, o un organismo transgenico o clonado o modificado mediante ingeniena tisular (incluso a traves del uso de celulas madre). En ciertas realizaciones preferidas de la invencion, se puede conocer que el sujeto o fuente biologica tiene, o puede sospecharse que tiene o esta en riesgo de tener, un cancer hematopoyetico linfoide u otra afeccion maligna, o una enfermedad autoinmunitaria, o una afeccion inflamatoria, y en ciertas realizaciones preferidas de la invencion, se puede conocer que el sujeto o fuente biologica esta libre de un riesgo o presencia de dicha enfermedad.

Ciertas realizaciones preferidas contemplan un sujeto o fuente biologica que es un sujeto humano tal como un paciente que ha sido diagnosticado de o esta en riesgo de desarrollar o adquirir cancer de acuerdo con criterios de diagnostico clmico aceptados en la tecnica, tales como los del U.S. National Cancer Institute (Bethesda, MD, EE. UU.) o como describen DeVita, Hellman y Rosenberg en Cancer: Principles and Practice of Oncology (2008, Lippincott, Williams y Wilkins, Filadelfia/Ovid, Nueva York); Pizzo y Poplack, Principles and Practice of Pediatric Oncology (Cuarta edicion, 2001, Lippincott, Williams y Wilkins, Filadelfia/Ovid, Nueva York); Vogelstein y Kinzler, The Genetic Basis of Human Cancer (Segunda edicion, 2002, McGraw Hill Professional, Nueva York)); Dancey et al. (2009 Semin. Oncol. 36 Supl.3: S46); ciertas realizaciones contemplan un sujeto humano que se sabe que esta libre de riesgo de tener, desarrollar o adquirir cancer de acuerdo con dichos criterios.

Ciertas otras realizaciones contemplan un sujeto no humano o una fuente biologica, por ejemplo, un primate no humano tal como un macaco, chimpance, gorila, vervet, orangutan, mandril u otro primate no humano, incluyendo tales sujetos no humanos que pueden ser conocidos en la tecnica como modelos preclmicos, que incluyen modelos preclmicos para tumores solidos y/u otros canceres. Ciertas otras realizaciones contemplan un sujeto no humano que es un mairnfero, por ejemplo, un raton, rata, conejo, cerdo, oveja, caballo, bovino, cabra, jerbo, hamster, cobaya u otro mamffero; muchos de tales mamfferos pueden ser sujetos que se conocen en la tecnica como modelos preclmicos para ciertas enfermedades o trastornos, incluyendo tumores malignos hematopoyeticos linfoides y/u otros canceres (p.ej., Li et al., 2011 Dis. Model. Mech. 4:311; von Euler et al., 2011 Vet. Comp. Oncol. 9:1; Goldstein et al., 2010 Expert Rev. Hematol. 3:301; Diamond et al., 2009 J. Bone Min. Res. 24:1150; Macor et al., 2008 Curr. Pharm. Des. 14:2023; Talmadge et al., 2007 Am. J. Pathol. 170:793; Kerbel, 2003 Cane. Biol. Therap. 2 (4 Supl 1): S134; Man et al., 2007 Cane. Met. Rev. 26:737; Cespedes et al., 2006 Clin. Transl. Oncol. 8:318). Sin embargo, no se pretende que el intervalo de realizaciones este tan limitado, de modo que tambien se contemplan otras realizaciones en las que el sujeto o la fuente biologica puede ser un vertebrado no mam^era, por ejemplo, otro vertebrado superior, o un anfibio aviar o especies de reptiles, u otro sujeto o fuente biologica.

Segun se menciona tambien en otra parte de la presente memoria, se han establecido criterios de diagnostico clmico aceptados en la tecnica para estos y otros tipos de cancer, tales como los promulgados por el U.S. National Cancer Institute (Bethesda, MD, USA) o como describen DeVita, Hellman, y Rosenberg en Cancer: Principles and Practice of Oncology (2008, Lippincott, Williams y Wilkins, Philadelphia/ Ovid, New York); Pizzo y Poplack, Principles and Practice of Pediatric Oncology (Fourth edition, 2001, Lippincott, Williams y Wilkins, Philadelphia/ Ovid, New York); y Vogelstein y Kinzler, The Genetic Basis of Human Cancer (Second edition, 2002, McGraw Hill Professional, New York). Por ejemplo Ignatiadis et al. (2008Pathobiol 75:104); Kunz (2008 Curr. Drug Discov. Technol. 5:9); y Auman et al. (2008 Drug Metab. Rev. 40:303) describen otros ejemplos no limitantes de tipificacion y caracterizacion de canceres concretos.

Se pueden proporcionar muestras biologicas obteniendo una muestra de sangre, una muestra de biopsia, un explante de tejido, un cultivo de organo, un fluido biologico o cualquier otro tejido o preparacion celular de un sujeto o una fuente biologica. Las celulas B y las celulas T pueden asf obtenerse de una muestra biologica, tal como de una variedad de muestras de tejidos y fluidos biologicos que incluyen medula osea, timo, ganglios linfaticos, nodulos

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linfaticos, tejidos perifericos y sangre, pero se accede mas facilmente a la sangre periferica. Se puede muestrear cualquier tejido periferico para detectar la presencia de celulas B y T y, por lo tanto, se contempla su uso en los metodos descritos en la presente memoria. Los tejidos y fluidos biologicos a partir de los cuales se pueden obtener celulas inmunitarias adaptativas incluyen, entre otros, piel, tejidos epiteliales, colon, bazo, secrecion de la mucosa, mucosa oral, mucosa intestinal, mucosa vaginal o secrecion vaginal, tejido cervical, ganglios, saliva, lfquido cefalorraqmdeo (LCR), medula osea, sangre del cordon umbilical, suero, lfquido seroso, plasma, linfa, orina, lfquido asdtico, lfquido pleural, Kquido pericardico, Kquido peritoneal, Kquido abdominal, medio de cultivo, medio de cultivo acondicionado o fluido de lavado. En ciertas realizaciones, celulas inmunitarias adaptativas (p.ej., celulas hematopoyeticas de linaje linfoide tales como celulas T y celulas B) pueden aislarse a partir de una muestra de aferesis. Las muestras de sangre periferica pueden obtenerse por flebotoirna de los sujetos. Las celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) se afslan mediante mecanismos conocidos por los expertos en la tecnica, p.ej., por separacion de gradiente de densidad Ficoll-Hypaque®. En ciertas realizaciones, se utilizan PBMC completas para el analisis.

En ciertas realizaciones relacionadas, se pueden preparar preparaciones que comprenden predominantemente linfocitos (p.ej., celulas T y B) o que comprenden predominantemente celulas T o predominantemente celulas B, incluyendo preparaciones en las que estan presentes celulas de un tumor maligno hematologico linfoide, para su uso como una muestra biologica como se proporciona en la presente memoria, de acuerdo con lo establecido en el art. metodologfas aceptadas. En otras realizaciones relacionadas, pueden aislarse subpoblaciones espedficas de celulas T o B antes del analisis utilizando los metodos descritos en la presente memoria. Diversos metodos y kits disponibles comercialmente para aislar diferentes subpoblaciones de celulas T y B son conocidos en la tecnica e incluyen, pero no se limitan a, seleccion de subconjuntos, separacion de esferas inmunomagneticas o clasificacion de celulas mediante inmunocitometna de flujo utilizando anticuerpos espedficos para uno o mas de cualquiera de una variedad de marcadores de la superficie de celulas T y B conocidos. Los marcadores ilustrativos incluyen, pero no estan limitados a, uno o una combinacion de CD2, CD3, CD4, CD8, CD14, CD19, CD20, CD25, CD28, CD45RO, CD45RA, CD54, CD62, CD62L, CDw137 (41BB), CD154, GITR, FoxP3, CD54 y CD28. Por ejemplo, y como es sabido por los expertos, se pueden utilizar los marcadores de superficie celular, tales como CD2, CD3, CD4, CD8, CD14, CD19, CD20, CD45Ra y CD45RO para determinar los linajes y subpoblaciones de T, B y monocitos. en citometna de flujo. De forma similar, los marcadores de dispersion de luz frontal, de dispersion lateral y/o de superficie celular tales como CD25, CD62L, CD54, CD137, CD154 se pueden utilizar para determinar el estado de activacion y las propiedades funcionales de las celulas.

Las combinaciones ilustrativas utiles en algunos de los metodos descritos en la presente memoria pueden incluir CD8+CD45RO+ (celulas T citotoxicas de memoria), CD4+CD45RO+ (T colaboradoras de memoria), CD8+CD45RO" (CD8+CD62L+CD45RA+ (celulas T citotoxicas de tipo no tratado previamente); CD4+CD25+CD62LhiGITR+FoxP3+ (celulas T reguladoras). Los anticuerpos ilustrativos para su uso en separaciones de celulas inmunomagneticas o clasificacion de celulas por inmunocitometna de flujo incluyen anticuerpos antihumanos marcados fluorescentemente, p.ej., CD4 FITC (clon M-T466, Miltenyi Biotec), CD8 PE (clon RPA-T8, BD Biosciences), CD45RO ECD (clon UCHL-1, Beckman Coulter), y CD45RO APC (clon UCHL-1, BD Biosciences). La tincion de PBMC totales se puede realizar con la combinacion apropiada de anticuerpos, seguida de lavado de las celulas antes del analisis. Los subconjuntos de linfocitos se pueden aislar por clasificacion celular activada por fluorescencia (FACS), p.ej., mediante un sistema de clasificacion de celulas BD FACSAria™ (BD Biosciences) y analizando los resultados con el soporte logico FlowJo™ (Treestar Inc.), y tambien mediante metodos conceptualmente similares que implican anticuerpos espedficos inmovilizados en superficies o esferas.

Para la extraccion de acidos nucleicos, el ADN genomico total se puede extraer de las celulas utilizando metodos conocidos en la tecnica y/o kits disponibles comercialmente, p.ej., mediante el uso de QIAamp® DNA Blood Mini Kit (QIAGEN®). La masa aproximada de un solo genoma haploide es de 3 pg. Preferiblemente, se utilizan para el analisis de al menos 25.000 a 250.000 celulas, por ejemplo, de al menos 50.000 a 125.000 celulas, o de al menos 75.000 a 150.000 celulas, o de al menos 100.000 a 200.000 celulas, es dedr., de aproximadamente 0,15 a 1,5 pg, o por ejemplo, de 0,6 a 1,2 pg de ADN de celulas T o B diploides. El numero de celulas T o B presentes en una muestra puede variar considerablemente cuando la muestra se obtiene de un paciente que tiene un tumor maligno hematologico linfoide, tal como leucemia linfoblastica de celulas T aguda (T-ALL). Usando PBMC de un ser humano adulto sano normal como fuente, se puede estimar que el numero de celulas T es aproximadamente 30% del total de celulas; tambien se puede estimar que el numero de celulas B es aproximadamente 10% del total de celulas en una preparacion de PBMC.

Receptores adaptativos de celulas inmunitarias

El TCR nativo es una protema de superficie celular heterodimerica de la superfamilia de inmunoglobulinas que esta asociada a protemas invariables del complejo CD3 implicado en la mediacion de la transduccion de senales. Los TCR existen en formas ap y y§, que son estructuralmente similares pero tienen ubicaciones anatomicas y probablemente funciones bastante distintas. Los ligandos MHC clase I y clase II, que se unen al TCR, tambien son protemas de la superfamilia de inmunoglobulinas pero estan especializados para la presentacion de antfgenos, con

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un sitio de union de peptidos altamente polimorficos que les permite presentar una matriz diversa de fragmentos de peptidos cortos en la superficie de la celula APC.

Las porciones extracelulares de los TCR ap y y§ heterod^ericos nativos consisten en dos polipeptidos, cada uno de los cuales tiene un dominio constante proximal a la membrana y un dominio variable distal a la membrana. Cada uno de los dominios constantes y variables incluye un enlace disulfuro intracatenario. Los dominios variables contienen los bucles altamente polimorficos analogos a las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de los anticuerpos. Las CDR3 de los TCR ap interaccionan con el peptido presentado por MHC, y las CDR 1 y 2 de los TCR ap interaccionan con el peptido y el MHC. La diversidad de las secuencias de TCR se genera a traves de la reorganizacion somatica de los genes variable (V), de diversidad (D), de empalme (J) y constante.

Los loci del gen de Ig y TCR contienen muchos segmentos diferentes de genes variable (V), de diversidad (D) y de empalme (J), que se someten a procesos de reordenamiento durante la diferenciacion linfoide temprana. Las secuencias de segmentos genicos V, D y J de Ig y TCR, son conocidas en la tecnica y estan disponibles en bases de datos publicas tales como GENBANK. Los ejemplos no limitantes de secuencias del segmentos genicos de la region V de TCRB se exponen en el listado de secuencias de SEQ ID NO: 5579-5630, 5644-5779, 6222-6273 y 6287-6351, y se exponen ejemplos de secuencias de segmento de la region J de TCRB en SEQ ID NO: 5631-5643, 5780-5792 y 6274-6286. Las secuencias del segmento genico de la region J de TCRG ilustrativas se exponen en SEQ ID NO: 5793-5798 y 6212-6215. Las secuencias del segmento genico de la region V de TCRG ilustrativas se exponen en SEQ ID NO: 5799-5816 y 6124-6127. Las secuencias del segmento genico de la region J de IgH ilustrativas se exponen en SEQ ID NO: 5817-5832 y 6216-6221; las secuencias del segmento genico de la region V de IgH se exponen en SEQ ID NO: 5833-6123 y 6128-6211.

Los reordenamientos VDJ estan mediados a traves de un complejo enzimatico de recombinasa en el que las protemas RAG1 y RAG2 juegan un papel clave al reconocer y cortar el ADN en las secuencias senal de recombinacion (RSS), que se encuentran aguas abajo de los segmentos genicos V, a ambos lados de los segmentos genicos D, y aguas arriba de los segmentos genicos J. La RSS inapropiada reduce o incluso evita por completo el reordenamiento. La secuencia senal de recombinacion (RSS) consiste en dos secuencias conservadas (heptamero, 5'-CACAGTG-3' y nonamero, 5'-ACAAAAACC-3'), separadas por un espaciador de 12 +/- 1 pb ("senal 12") o 23 +/- 1 pb ("senal 23"). Se han identificado varias posiciones de nucleotidos como importantes para la recombinacion, incluyendo el dinucleotido de CA en la posicion uno y dos del heptamero, y tambien se ha mostrado que una C en la posicion tres del heptamero es muy preferible, asf como un nucleotido A en las posiciones 5, 6, 7 del nonamero. (Ramsden et. al 1994 Nucl. C.A. Res. 22:1785; Akamatsu et. al. 1994 J. Immunol. 153:4520; Hesse et. al. 1989 Genes Dev. 3:1053). Las mutaciones de otros nucleotidos tienen efectos mmimos o inconsistentes. El espaciador, aunque es mas variable, tambien tiene un impacto sobre la recombinacion, y se ha demostrado que las sustituciones de un solo nucleotido tienen un impacto significativo sobre la eficacia de la recombinacion (Fanning et. al. 1996 Cell. Immunol. Immumnopath. 79:1, Larijani et. al 1999 Nucl. C.A. Res. 27:2304; Nadel et. al. 1998 J. Immunol. 161:6068; Nadel et al., 1998 J. Exp. Med. 187:1495). Se han descrito los criterios para identificar secuencias de polinucleotidos de RSS que tienen eficacias de recombinacion significativamente diferentes (Ramsden et. al 1994 Nucl. C.A. Res. 22:1785; Akamatsu et. al. 1994 J. Immunol. 153:4520; Hesse et. al. 1989 Genes Dev. 3:1053 y Lee et al., 2003 PLoS 1(1): E1).

El proceso de reordenamiento generalmente comienza con un reordenamiento de D a J seguido de un reordenamiento de V a DJ en el caso de genes de cadena pesada de Ig (IgH), TCR beta (TCRB) TCR y delta (TCRD) o afecta a los reordenamiento de V a J directos en el caso de genes Ig kappa (IgK), Ig lambda (IgL), TCR alfa (TCRA) y TCR gamma (TCRG). Las secuencias entre los segmentos genicos que se reordenan generalmente se eliminan en forma de un producto de escision circular, tambien denominado cfrculo de escision TCR (TREC) o cfrculo de escision del receptor de celulas B (BREC).

Las muchas combinaciones diferentes de segmentos de genes V, D y J representan el llamado repertorio combinatorio, que se estima que es ~2x106 para moleculas de Ig, ~3x106 para TCRap y ~5x103 para moleculas de TCRy5. En los sitios de union de los segmentos genicos V, D y J, la delecion y la insercion aleatoria de nucleotidos se produce durante el proceso de reordenamiento, lo que da como resultado regiones de empalme muy diversas, que contribuyen significativamente al repertorio total de moleculas de Ig y TCR, estimadas en > 1012.

Los linfocitos B maduros amplfan adicionalmente su repertorio de Ig tras el reconocimiento del antfgeno en los centros del folfculo mediante hipermutacion somatica, un proceso que conduce a la maduracion por afinidad de las moleculas de Ig. El proceso de hipermutacion somatica se centra en el exon V- (D-) J de los genes de cadena ligera de IgH e Ig y se refiere a mutaciones de un unico nucleotido y, a veces, tambien a inserciones o deleciones de nucleotidos. Los genes de Ig mutados somaticamente tambien se encuentran en tumores malignos de celulas B maduras de origen folicular o posfolicular.

En ciertas realizaciones preferidas descritas en la presente memoria, se pueden emplear cebadores del segmento V y del segmento J en una reaccion de PCR para amplificar regiones de ADN que codifican CDR3 de TCR

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reordenadas en una muestra biologica de prueba, en donde cada segmento genico funcional que codifica V de TCR comprende un secuencia de senal de recombinacion (RSS) del gen V y cada segmento genico funcional que codifica J de TCR comprende una RSS del gen J. En estas realizaciones y en realizaciones relacionadas, cada molecula de ADN reordenado amplificado puede comprender (i) al menos aproximadamente 10, 20, 30 o 40 nucleotidos contiguos de una hebra efectora del segmento genico que codifica V de TCR, estando situados al menos aproximadamente 10, 20, 30 o 40 nucleotidos contiguos 5' con respecto a la RSS del gen V y/o cada molecula de ADN reordenado amplificado puede comprender (ii) al menos aproximadamente 10, 20 o 30 nucleotidos contiguos de una hebra efectora del segmento genico que codifica J de TCR, estando situados al menos aproximadamente 10, 20 o 30 nucleotidos contiguos 3' con respecto a la RSS del gen J. En ciertas realizaciones preferidas, cada region codificante de CDR3 de TCR amplificada esta presente en una molecula de ADN reordenado amplificado que tiene una longitud inferior a 600 nucleotidos. Sin desear estar limitados por la teona, estas caractensticas de diseno para amplificar regiones de empalme VJ que codifican CDR3 permiten la hibridacion de cebadores del segmento V a sustancialmente todos los segmentos genicos funcionales que codifican V de TCR, y tambien permiten la hibridacion de cebadores del segmento J a sustancialmente todos los segmentos funcionales que codifican J de TCR, y tambien permiten la amplificacion de regiones que codifican CDR3 que son susceptibles de secuenciarse mediante las plataformas HTS descritas en la presente memoria, al tiempo que incluyen informacion de secuencia adecuada para identificartodas las posibles combinaciones VDJ y VJ.

PCR cuantitativa multiple

Como se describe en la presente memoria y en vista de Robins et al., 2009 Blood 114, 4099; Robins et al., 2010 Sci. Translat. Medi. 2:47ra64; Robins et al., 2011 J. Immunol. Meth. doi:10.1016/j.jim.2011.09. 001; Sherwood et al. 2011 Sci. Translat. Med. 3:90ra61; la Publicacion de Estados Unidos Num. 2012/0058902, la Publicacion de Estados Unidos Num. 2010/0330571, el documento WO/2010/151416, el documento WO/2011/106738 y el documento WO2012/027503, se proporciona un metodo para cuantificar la representacion relativa del ADN de celulas inmunitarias adaptativas en ADN a partir de una muestra biologica de prueba, y asf determinar la frecuencia de aparicion relativa para cada secuencia de ADN que codifica TCR reordenada unica en una muestra que contiene celulas linfoides. De acuerdo con ciertas realizaciones preferidas, el metodo implica un metodo de PCR multiple que utiliza un conjunto de cebadores directos que hibridan espedficamente con los segmentos V y un conjunto de cebadores inversos que hibridan espedficamente con los segmentos J, donde la reaccion de PCR multiple permite la amplificacion de todas las combinaciones VJ (y VDJ) posibles dentro de una poblacion dada de celulas T o B.

Se puede extraer ADN o ARN de celulas en una muestra, tal como una muestra de sangre o linfa u otra muestra de un sujeto que se sabe que tiene o se sospecha que tiene un tumor maligno hematologico linfoide, utilizando metodos convencionales o kits comercialmente disponibles conocidos en la tecnica. Se puede utilizar un sistema de PCR multiple para amplificar los loci del receptor de celulas inmunitarias adaptadas reordenados a partir de ADN genomico, preferiblemente de una region CDR3. En ciertas realizaciones, la region CDR3 se amplifica a partir de una region CDR3 de TCRa, TCRp, TCRy o TCR8. Se proporcionan composiciones que comprenden una pluralidad de cebadores del segmento V y del segmento J que son capaces de promover la amplificacion en una reaccion en cadena de polimerasa multiple (PCR) de sustancialmente todas las regiones que codifican CDR3 del receptor inmunitario adaptativo reordenadas productivamente en la muestra para una clase dada de tales receptores (p.ej., TCRy, TCRp, etc.), para producir una multiplicidad de moleculas de ADN reordenado amplificado de una poblacion de celulas T (para TCR) en la muestra. Preferiblemente y en ciertas realizaciones, los cebadores se disenan de modo que cada molecula de ADN reordenado amplificado en la multiplicidad de moleculas de ADN reordenado amplificado tiene menos de 600 nucleotidos de longitud, excluyendo de este modo los productos de amplificacion de loci adaptativos del receptor inmunitario no reordenados.

En el genoma humano actualmente se cree que hay aproximadamente 70 segmentos de genes Va de TCR y aproximadamente 61 Ja, aproximadamente 52 segmentos de genes Vp de TCR, aproximadamente 2 Dp y

aproximadamente 13 Jp, aproximadamente 9 segmentos de genes Vy de TCR y aproximadamente 5 Jy, y

aproximadamente 46 cadena pesada de inmunoglobulina (IGH) Vh, aproximadamente 23 segmentos de genes Dh y aproximadamente 6 Jh. Por consiguiente, cuando se conocen secuencias genomicas para estos loci de manera que se pueden producir facilmente sondas moleculares espedficas para cada uno de ellos, se cree de acuerdo con la teona no limitante que las presentes composiciones y metodos se refieren sustancialmente a todos (p.ej., mas de

90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99%) estos segmentos genicos que codifican la region V, D y J

de receptores inmunitarios adaptativos conocidos y facilmente detectables.

Los genes de TCR e Ig pueden generar millones de protemas distintas a traves de mutacion somatica. Debido a este mecanismo generador de diversidad, las regiones determinantes de complementariedad hipervariables (CDR) de estos genes pueden codificar secuencias que pueden interactuar con millones de ligandos, y estas regiones estan unidas a una region constante que puede transmitir una senal a la celula que indica la union del ligando cognado de la protema. El sistema inmunitario adaptativo emplea varias estrategias para generar un repertorio de receptores de antigenos de celulas T y B con diversidad suficiente para reconocer el universo de posibles patogenos. En las celulas T ap y y§, que reconocen principalmente antfgenos peptfdicos presentados por moleculas del MHC, la mayor

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parte de esta diversidad de receptores esta contenida dentro de la tercera region determinate de complementariedad (CDR3) de las cadenas a y p del receptor de celulas T (o cadenas y y 6)

La tecnolog^a de ensayo utiliza dos conjuntos de cebadores para proporcionar una reaccion de PCR altamente multiplexada. El primer agrupamiento "directo" (p.ej., a modo de ilustracion y no de limitacion, los cebadores oligonucleotfdicos del segmento V descritos en la presente memoria se pueden utilizar en ciertas realizaciones preferidas como cebadores "directos" cuando los cebadores oligonucleotidicos del segmento J se utilizan como cebadores "inversos" de acuerdo con la terminologfa de PCR comunmente utilizada, pero el experto en la tecnica apreciara que en ciertas otras realizaciones los cebadores del segmento J pueden considerarse cebadores "directos" cuando se utilizan con cebadores "inversos" del segmento V) incluye un cebador oligonucleotfdico que es espedfico para (p.ej., que tiene una secuencia de nucleotidos complementaria a una region de secuencia unica de) cada segmento codificante de la region V ("segmento V) en el locus del gen de TCR o Ig respectivo. En ciertas realizaciones, se utilizan cebadores que se dirigen a una region altamente conservada, para capturar simultaneamente muchos segmentos V, reduciendo asf la cantidad de cebadores requeridos en la PCR multiple. De manera similar, en ciertas realizaciones, los cebadores de grupo "inverso" hibridan con una secuencia conservada en el segmento de empalme ("J").

Cada cebador puede disenarse de manera que se obtenga un segmento de ADN amplificado respectivo que incluya una porcion de secuencia de longitud suficiente para identificar cada segmento J ineqmvocamente basandose en las diferencias de secuencia entre segmentos de genes codificantes de la region J en la base de datos del genoma humano, y tambien incluya una porcion de secuencia con la que un cebador espedfico del segmento J pueda hibridar para su resecuenciacion. Este diseno de cebadores espedficos del segmento V y J permite la observacion directa de una gran fraccion de los reordenamientos somaticos presentes en el repertorio del gen del receptor inmunitario adaptativo dentro de un individuo. Esta caractenstica a su vez permite la comparacion rapida de los repertorios de TCR y/o Ig (i) en individuos que tienen una enfermedad, trastorno, afeccion u otra indicacion de interes en particular (p.ej., cancer, una enfermedad autoinmunitaria, un trastorno inflamatorio u otra afeccion) con (ii) los repertorios de TCR y/o Ig de sujetos de control que estan libres de tales enfermedades, trastornos, afecciones o indicaciones.

El termino "gen" significa el segmento de ADN implicado en la produccion de una cadena polipeptfdica tal como la totalidad o una porcion de un polipeptido de TCR o Ig (p.ej., un polipeptido que contiene CDR3); incluye regiones que preceden y siguen a la region codificante "lfder y trailer", asf como secuencias intermedias (intrones) entre segmentos codificantes individuales (exones), y tambien puede incluir elementos reguladores (p.ej., promotores, potenciadores, sitios de union represores y similares), y tambien puede incluir secuencias senal de recombinacion (RSS) como se describe en la presente memoria.

Los acidos nucleicos para su uso en las presentes realizaciones, a los que tambien se hace referencia en la presente memoria como polinucleotidos, y que incluyen oligonucleotidos, pueden estar en forma de ARN o en forma de ADN, cuyo ADN incluye ADNc, ADN genomico y ADN sintetico. El ADN puede ser de doble hebra o de hebra sencilla, y si es de hebra sencilla puede ser la hebra codificante o la hebra no codificante (antisentido). Una secuencia codificante que codifica un TCR o una region del mismo (p.ej., una region V, un segmento D, una region J, una region C, etc.) puede ser identica a la secuencia codificante conocida en la tecnica para cualquier region de gen de TCR o dominios de polipeptido dados (p.ej., dominios de la region V, dominios CDR3, etc.), o puede ser una secuencia codificante diferente, que, como resultado de la redundancia o degeneracion del codigo genetico, codifica la misma region o polipeptido de TCR.

En una realizacion, los metodos pueden utilizar una pluralidad de cebadores del segmento V y una pluralidad de cebadores del segmento J, en donde la pluralidad de cebadores del segmento V y la pluralidad de cebadores del segmento J amplifican sustancialmente todas las combinaciones de los segmentos V y J de un locus del receptor inmunitario reordenado. Por sustancialmente todas las combinaciones se entiende al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mas de todas las combinaciones de los segmentos V y J de un locus del receptor inmunitario reordenado. En ciertas realizaciones, la pluralidad de cebadores del segmento V y la pluralidad de cebadores del segmento J amplifican todas las combinaciones de los segmentos V y J de un locus del receptor inmunitario reordenado.

En general, un sistema de PCR multiple puede utilizar al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25, y en ciertas realizaciones, al menos 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 o 39, y en otras realizaciones 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 65, 70, 75, 80, 85, o mas cebadores directos, en el que cada cebador directo hibrida espedficamente o es complementario a una secuencia correspondiente a uno o mas segmentos de la region V. Los cebadores de la region V ilustrativos para la amplificacion de TCRp se muestran en SEQ ID NO: 5579-5630. Los cebadores de la region V de TCRy ilustrativos se proporcionan en SEQ ID NO: 6124-6127. Los cebadores de la region V de IgH ilustrativos se proporcionan en SEQ ID NO: 6128-6211. Por lo tanto, las secuencias del segmento genico de la region V se pueden utilizar para disenar cebadores de la region V. Las secuencias del segmento genico de la region V de TCRB ilustrativos se exponen en la lista de secuencias en SEQ ID NO: 5579-5630, 5644-5779, 6222-6273 y 6287-6351. Las secuencias

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del segmento genico de la region V de TCRG ilustrativos se exponen en SEQ ID NO: 5799-5816 y 6124-6127. Las secuencias del segmento genico de la region V de IgH ilustrativas se exponen en SEQ ID NO: 5833-6123 y 61286211. En SEQ ID NO: 5579-5643, en los oligonucleotidos RN2, "r" representa una base ribonucleotidica en la secuencia oligonucleotfdica y "/3SpC3/' representa un espaciador 3' de tres carbonos en el grupo hidroxilo, que evita la extension y amplificacion por la polimerasa. La endonucleasa de reparacion del ADN escinde el oligonucleotido en el ribonucleotido despues de la hibridacion con una secuencia complementaria, creando un grupo hidroxilo no bloqueado que se puede extender mediante una polimerasa.

El sistema de PCR multiple tambien usa al menos 3, 4, 5, 6 o 7, y en ciertas realizaciones, 8, 9, 10, 11, 12 o 13 cebadores inversos, en los que cada cebador inverso hibrida espedficamente con o es complementario a una secuencia correspondiente a uno o mas segmentos de la region J. Los cebadores ilustrativos del segmento J de TCRp se proporcionan en SEQ ID NO: 5631-5643. Los cebadores del segmento TCRy J ilustrativos se proporcionan en SEQ iD NO: 6212-6215. Los cebadores del segmento J de IgH ilustrativos se proporcionan en SEQ ID No: 62166221. Por lo tanto, las secuencias del segmento genico de la region J se pueden utilizar para disenar cebadores de la region J. Las secuencias de segmentos de regiones J de TCRB ilustrativas se exponen en SEQ ID NO: 56315643, 5780-5792 y 6274-6286. Las secuencias del segmento genico de la region J de TCRG ilustrativas se exponen en SEQ ID NO: 5793-5798 y 6212-6215. Las secuencias del segmento genico de la region J de IgH ilustrativas se exponen en SEQ ID NO: 5817-5832 y 6216-6221. En una realizacion, existe un cebador del segmento J para cada segmento J.

Los oligonucleotidos o polinucleotidos que son capaces de hibridar o reasociarse espedficamente con una secuencia de acido nucleico diana mediante la complementariedad de bases de nucleotidos pueden hacerlo bajo condiciones de rigurosidad de moderada a alta. Con fines ilustrativos, las condiciones de rigurosidad moderada a alta adecuadas para la amplificacion por PCR espedfica de una secuencia de acido nucleico diana senan de entre 25 y 80 ciclos de PCR, consistiendo cada ciclo en una etapa de desnaturalizacion (p.ej., aproximadamente 10-30 segundos a mas de aproximadamente 95°C), una etapa de reasociacion (p.ej., aproximadamente 10-30 s aproximadamente a 60-68°C), y una etapa de extension (p.ej., aproximadamente 10-60 s a aproximadamente 60- 72°C), opcionalmente de acuerdo con ciertas realizaciones, combinando las etapas de recocido y extension para proporcionar una PCR en dos etapas. Como reconocena el experto en la tecnica, se pueden anadir o cambiar otros reactivos de PCR en la reaccion de PCR para aumentar la especificidad del emparejamiento del cebador y la amplificacion, tal como alterando la concentracion de magnesio, opcionalmente anadiendo DMSO, y/o utilizando cebadores bloqueados, nucleotidos modificados, acidos peptidonucleicos y similares.

En ciertas realizaciones, se pueden utilizar tecnicas de hibridacion de acidos nucleicos para evaluar la especificidad de hibridacion de los cebadores descritos en la presente memoria. Las tecnicas de hibridacion son bien conocidas en la tecnica de la biologfa molecular. Con fines de ilustracion, las condiciones moderadamente restrictivas adecuadas para someter a ensayo la hibridacion de un polinucleotido como se proporciona en la presente memoria con otros polinucleotidos incluyen prelavado en una solucion de 5 X SSC, SDS al 0,5%, EDTA 1,0 mM (pH 8,0); hibridacion a 50°C-60°C, 5 X SSC, durante la noche; seguido de un lavado dos veces a 65°C durante 20 minutos con cada uno de 2X, 0,5X y 0,2X SSC que contiene SDS al 0,1%. Un experto en la tecnica entendera que la rigurosidad de la hibridacion puede manipularse facilmente, por ejemplo alterando el contenido de sal de la solucion de hibridacion y/o la temperatura a la que se realiza la hibridacion. Por ejemplo, en otra realizacion, las condiciones de hibridacion altamente rigurosas adecuadas incluyen las descritas anteriormente, con la excepcion de que se aumenta la temperatura de hibridacion, p.ej., a 60°C-65°C o65°C-70°C.

CEBADORES. De acuerdo con la presente descripcion, se proporcionan cebadores oligonucleotfdicos en un conjunto de cebadores oligonucleotfdicos que comprende una pluralidad de cebadores del segmento V y una pluralidad de cebadores del segmento J, donde el conjunto de cebadores es capaz de amplificar el ADN reordenado que codifica receptores inmunitarios adaptativos en una muestra biologico que comprende ADN de celulas linfoides. En la tecnica se conocen conjuntos de cebadores adecuados y se describen en esta memoria, por ejemplo, los conjuntos de cebadores de los documentos U.S.A.N. 13/217,126; U.S.A.N. 12/794,507; PCT/US2011/026373; o PCT/US2011/049012; o similares; o aquellos mostrados en la Tabla 1. En ciertas realizaciones, el conjunto de cebadores esta disenado para incluir una pluralidad de cebadores espedficos de secuencia V que incluye, para cada gen de la region V unico (incluyendo pseudogenes) en una muestra, al menos un cebador que se puede reasociar espedficamente con una secuencia de la region V unica; y para cada gen unico de la region J en la muestra, al menos un cebador que pueda reasociarse espedficamente con una secuencia de la region J unica.

El diseno del cebador puede lograrse mediante metodologfas rutinarias a la vista de las secuencias genomicas conocidas de TCR y BCR. Por consiguiente, el conjunto de cebadores es preferiblemente capaz de amplificar todas las posibles combinaciones V-J que pueden resultar de reordenamientos de ADN en el locus de TCR o BCR. Como tambien se describe a continuacion, ciertas realizaciones contemplan conjuntos de cebadores en los cuales uno o mas cebadores para V pueden ser capaces de reasociarse espedficamente con una secuencia "unica" que puede ser compartida por dos o mas regiones V pero que no es comun a todas las regiones V, y/o en donde uno o mas cebadores J pueden ser capaces de reasociarse espedficamente con una secuencia "unica" que puede ser

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1. Un metodo para detectar enfermedad residual mmima para un tumor maligno hematologico linfoide en un sujeto despues de la terapia, comprendiendo el metodo

(a) amplificacion de ADN ex^do de una primera muestra en una reaccion en cadena de polimerasa multiple (PCR) utilizando cebadores del segmentos V y J para producir una multiplicidad de moleculas de aDn reordenado amplificado que comprenden cada una una region que codifica CDR3 de TCR, en donde la primera muestra se ha obtenido del sujeto antes de la terapia y comprende una pluralidad de celulas hematopoyeticas linfoides,

(b) secuenciacion de alto rendimiento de dicha multiplicidad de moleculas de ADN reordenado amplificado para determinar las frecuencias relativas de regiones que codifican CDR3 de TCR reordenadas de manera unica en la primera muestra, identificando asf la region que codifica CDR3 de TCR reordenada de manera unica de los uno o mas clones de celulas T malignas,

(c) amplificacion de ADN extrafdo de una segunda muestra en una reaccion en cadena de polimerasa multiple (PCR) utilizando los cebadores del segmento V y J para producir una multiplicidad de moleculas de aDn reordenado amplificado comprendiendo cada una una region que codifica CDR3 de TCR, en donde la segunda muestra se ha obtenido del sujeto despues de la terapia y comprende una pluralidad de celulas hematopoyeticas linfoides, y

(d) secuenciacion de alto rendimiento de dicha multiplicidad de moleculas de ADN reordenado amplificado producidas a partir de la segunda muestra para determinar la frecuencia relativa de la region que codifica CDR3 de TCR reordenada de manera unica de los uno o mas clones de celulas T malignas en la segunda muestra, en donde la presencia de la region que codifica CDR3 de TCR reordenada de manera unica de los uno o mas clones de celulas T malignas a una frecuencia relativa de al menos una frecuencia de uno de cada 106 a uno de cada 105 regiones que codifican CDR3 de TCR indica enfermedad residual minima para el tumor maligno hematologico linfoide;

en donde la PCR multiple comprende adicionalmente una pluralidad de oligonucleotidos molde que tiene una pluralidad de secuencias de oligonucleotidos de formula general

5'-U1 -B1-V-B2-R-B3-J-B4-U2-3' [I]

en donde

(i) V es un polinucleotido que comprende al menos 20, 30, 60, 90, 120, 150, 180 o 210, y no mas de 1000, 900, 800, 700, 600 o 500 nucleotidos contiguos de una secuencia genica que codifica la region variable (V) del receptor inmunitario adaptativo, o el complemento de la misma, y en cada una de la pluralidad de secuencias de oligonucleotidos V comprende una secuencia oligonucleotfdica unica,

(ii) J es un polinucleotido que comprende al menos 15-30, 31-60, 61-90, 91-120 o 120-150, y no mas de 600, 500, 400, 300 o 200 nucleotidos contiguos de una secuencia genica que codifica la region de empalme (J) del receptor inmunitario adaptativo, o el complemento de la misma, y en cada una de la pluralidad de secuencias de oligonucleotidos J comprende una secuencia oligonucleotfdica unica,

(iii) U1 no es nada o comprende un oligonucleotido que tiene una secuencia que se selecciona entre (1) una primera secuencia de oligonucleotido adaptador universal, y (2) una primera secuencia oligonucleotfdica espedfica de la plataforma de secuenciacion que esta conectada y posicionada 5' con respecto a la primera secuencia de nucleotido adaptador universal,

(iv) U2 no es nada o comprende un oligonucleotido que tiene una secuencia que se selecciona entre (1) una segunda secuencia de oligonucleotido adaptador universal, y (2) una segunda secuencia oligonucleotfdica espedfica de la plataforma de secuenciacion que esta conectada y posicionada 5' con respecto a una segunda secuencia de oligonucleotido adaptador universal,

(v) B1, B2, B3 y B4 son cada uno independientemente nada o cada uno comprende un oligonucleotido B que comprende una secuencia codigo de barras de oligonucleotido de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25, nucleotidos contiguos, en donde en cada una de la pluralidad de secuencias de oligonucleotidos B comprende una secuencia oligonucleotfdica unica que identifica de forma unica, como una combinacion pareada, (1) la secuencia oligonucleotfdica V unica de (i) y (2) la secuencia oligonucleotfdica J unica de (ii), y

(vi) R no es nada o comprende un sitio de reconocimiento para enzimas de restriccion que comprende una secuencia oligonucleotfdica que esta ausente de (i) - (v).
2. El metodo de la reivindicacion 1, en donde la region que codifica CDR3 de TCR reordenada de manera unica de los uno o mas clones de celulas T malignas se identifica por su presencia en la primera muestra a una frecuencia relativa de al menos 15% de las regiones que codifican CDR3 de TCR reordenadas.
3. El metodo de la reivindicacion 1 en donde la PCR multiple comprende:

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

(i) una pluralidad de cebadores oligonucleotidicos del segmento V que son capaces cada uno

independientemente de hibridar espedficamente con al menos un polinucleotido que codifica un polipeptido de la region V del receptor de celulas T (TCR) humano, en donde cada cebador del segmento V comprende una secuencia de nucleotidos de al menos 15 nucleotidos contiguos que es complementaria a al menos un segmento genico funcional que codifica Vy de TCR o que codifica Vp de TCR y en donde la pluralidad de cebadores del segmento V hibrida espedficamente sustancialmente con todos los segmentos genicos funcionales que codifican Vy de TCR o que codifican Vp de TCR que estan presentes en la muestra; y

(ii) una pluralidad de cebadores oligonucleotfdicos del segmento J que son capaces cada uno

independientemente hibridar espedficamente con al menos un polinucleotido que codifica un polipeptido de la region J del receptor de celulas T (TCR) humano, en donde cada cebador del segmento J comprende una secuencia de nucleotidos de al menos 15 nucleotidos contiguos que es complementaria a al menos un segmento genico funcional que codifica Jy de TCR o que codifica Jp de TCR y en donde la pluralidad de cebadores del segmento J hibrida espedficamente sustancialmente con todos los segmentos genicos funcionales que codifican Jy de TCR o que codifican Jp de TCR que estan presentes en la muestra.
4. El metodo de la reivindicacion 3, en donde los cebadores del segmento V y del segmento J son capaces de

promover la amplificacion en dicha reaccion en cadena de la polimerasa multiple (PCR) de sustancialmente todas las regiones que codifican CDR3 de TCRy reordenadas o sustancialmente todas las regiones que codifican CDR3 de TCRp en la muestra para producir una multiplicidad de moleculas de ADN reordenado amplificado de una poblacion de celulas T en la muestra, siendo suficiente dicha multiplicidad de moleculas de ADN reordenado amplificado para

cuantificar la diversidad de la region que codifica CDR3 de TCRy o CDR3 de TCRp en la poblacion de celulas T, y

en donde cada molecula de ADN reordenado amplificado en la multiplicidad de moleculas de ADN reordenado amplificado tiene menos de 600 nucleotidos de longitud.
5. El metodo de la reivindicacion 3 o 4:

(a) en donde cada segmento genico funcional que codifica V de TCR comprende una secuencia senal de recombinacion (RSS) del gen V y cada segmento genico funcional que codifica J de TCR comprende una RSS del gen J, y en donde cada molecula de ADN reordenado amplificado comprende (i) al menos 10, 20, 30 o 40 nucleotidos contiguos de una hebra efectora del segmento genico que codifica V de TCR, estando situados dichos al menos 10, 20, 30 o 40 nucleotidos contiguos 5' respecto a la RSS del gen V y (ii) al menos 10, 20 o 30 nucleotidos contiguos de una hebra efectora del segmento genico que codifica J de TCR, estando situados dichos al menos 10, 20 o 30 nucleotidos contiguos 3' con respecto a la RSS del gen J;

(b) la pluralidad de cebadores oligonucleotfdicos del segmento V y la pluralidad de cebadores oligonucieotfdicos del segmento J comprenden al menos una de (1) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 5579-5643, (2) las secuencias expuestas en SEQ. ID NOs: 5644-5792, (3) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 5793-5816, (4) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 5817-6123, (5) las secuencias expuestas en SEQ ID NO : 6124-6127 y 6212-6215, (6) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 6128-621 1 y 6216-6221, (7) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 6222-6286 y (8) las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 62226351;

(c) uno o ambos de:

(i) los cebadores oligonucleotidicos del segmento V comprenden uno o una pluralidad de oligonucleotidos que exhiben al menos 90% de identidad de secuencia con una o mas de las secuencias de nucleotidos expuestas en SEQ ID NO: 5579-5630, 5644-5779, 5799-5816, 6124-6127 y 6222-6273, y

(ii) los cebadores del segmento J comprenden uno o una pluralidad de oligonucleotidos que exhiben al menos 90% de identidad de secuencia con una o mas de las secuencias de nucleotidos expuestas en SEQ ID NO: 5631-5643, 5780-5798, 6212-6215, y 6274-6286.
6. El metodo de la reivindicacion 1, en donde al menos uno de:

(i) la pluralidad de oligonucleotidos molde comprende al menos un oligonucleotido molde que tiene una

secuencia oligonucleotfdica de formula general (I) con la que puede hibridar espedficamente cada cebador oligonucleotfdico del segmento V y al menos un oligonucleotido molde que tiene una secuencia

oligonucleotfdica de formula general (I) con la que puede hibridar espedficamente cada cebador

oligonucleotfdico del segmento J; o

(ii) la pluralidad de oligonucleotidos molde comprende al menos a o al menos b secuencias de

oligonucleotidos unicas, la que sea mayor, donde a es la cantidad de segmentos genicos que codifican la

region V del receptor inmunitario adaptativo unico en el sujeto y b es la cantidad de segmentos genicos que codifican la region J del receptor inmunitario adaptativo unico en el sujeto, y la composicion comprende al menos un oligonucleotido molde para cada polinucleotido V unico y al menos un oligonucleotido molde para cada polinucleotido J unico.
7. El metodo de la reivindicacion 1, que comprende adicionalmente cuantificar moleculas de ADN reordenado que codifican uno o una pluralidad de receptores inmunitarios adaptativos en el ADN extrafdo de la muestra biologica mediante las etapas de:

5 (i) secuenciar cuantitativamente toda o una porcion suficiente de cada una de dichas moleculas de ADN

molde amplificado y cada una de dichas moleculas de ADN reordenado amplificado para cuantificar (a) una cantidad de producto molde de moleculas de ADN molde amplificado que contienen al menos una secuencia codigo de barras de oligonucleotido, y (b) una cantidad de producto reordenado de moleculas de ADN reordenado amplificado que carecen de una secuencia codigo de barras de oligonucleotido;

10 (ii) calcular un factor de amplificacion dividiendo la cantidad de producto molde de (i)(a) por la cantidad

conocida de cada uno de la pluralidad de oligonucleotidos molde que tienen una secuencia oligonucleotfdica unica; y

(iii) dividir la cantidad de producto reordenado de (i)(b) por el factor de amplificacion calculado en (ii) para cuantificar las moleculas de ADN que codifican el receptor inmunitario adaptativo unico en la muestra.

15
8. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicho tumor maligno hematologico linfoide se selecciona entre: leucemia linfoblastica de celulas T aguda (T-ALL), leucemia linfoblastica de celulas p aguda (B-ALL), mieloma multiple, plasmacitoma, macroglobulinemia, leucemia linfocftica cronica (CLL), leucemia linfoblastica aguda (ALL), linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, linfoma cutaneo de celulas T, linfoma de celulas

20 del manto, linfoma periferico de celulas T, leucemia de celulas pilosas, linfoma prolinfodtico de celulas T, linfoma angioinmunoblastico de celulas T, leucemia/linfoma de celulas T linfoblastico, leucemia/linfoma de celulas T adultas, micosis fungoide, smdrome de Sezary, neoplasia mieloproliferativa y smdrome mielodisplasico.

Frecuencia Frecuencia

t o

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Post-tratamiento, dia 29 nent,ctey29

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Fig. 1