CN106978479A - 一种基于高通量测序检测t细胞白血病微小残留病的方法 - Google Patents

一种基于高通量测序检测t细胞白血病微小残留病的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于分子生物学检测领域，特别是涉及一种基于高通量测序构建T细胞白血病微小残留病T细胞受体（TCR）高通量测序文库的RNA接头和单对引物，以及DNA文库制备方法，包括获取人血液样本10mL于EDTA抗凝管、利用淋巴细胞分离液Ficoll‑1077进行外周血单核细胞(PBMC)的分离、利用Trizol的方法提取PBMC的总RNA，所用试剂为RNAzol RT、RNA反转录成cDNA，并同时在cDNA 5’端添加接头、PCR1、PCR2和纯化和进行高通量测序等步骤，通过从接头的上游引物到C区的下游引物，获得TCR基因序列的全长信息。

Description

一种基于高通量测序检测T细胞白血病微小残留病的方法
技术领域
本发明属于分子生物学检测领域，特别是涉及一种基于高通量测序检测T细胞白血病微小残留病的方法。
背景技术
白血病是一类造血干细胞恶性克隆性疾病。克隆性白血病细胞因为增殖失控、分化障碍、凋亡受阻等机制在骨髓和其他造血组织中大量增殖累积，并浸润其他非造血组织和器官，同时抑制正常造血功能，T细胞白血病属于T细胞的恶性克隆性增值。
随着化疗、特异靶向治疗、造血干细胞移植(HSCT)治疗等技术的不断改进，白血病的治疗效果日益改善，然而复发仍是困扰白血病治愈的一个难点，究其原因主要与白血病细胞微小残留病(MRD)有关。MRD是指经过诱导治疗达到完全缓解时，患者体内残存的少量白血病细胞。
近年来研究表明，白血病复发与MRD密切相关，MRD升高可提前预示白血病的全面复发。因此，采用灵敏度高、特异性强及稳定可靠的试验方法对白血病患者进行定期MRD检测，对评估疾病状态、判断疗效、预测复发、指导治疗具有重要的临床意义。T细胞白血病患者有>50％的复发率，因此要定期检测MRD，来帮助设计个性化的治疗方法。
目前检测MRD的方法主要依赖于分子免疫学技术如流式细胞仪术(flowcytometry)，但其灵敏度最高仅可达10-4数量级(0.01％)，且该方法对MRD结果的判断在很大程度上有赖于每个实验室的实验条件和操作者的个人经验，标准化程度低，而且有研究表明在化疗过程中由于化疗药物的影响使白血病细胞的免疫表型发生变化，即“免疫漂移”现象，可影响MRD结果的可靠性和准确性。
T细胞基因座上大量的V(可变区)、D(多变区)、J(连接区)基因片段在T细胞受体的形成中会产生各种多样性重组。这种V-D-J基因的重组赋予了每一种T细胞自己独特的T细胞受体(TCR)，从而使得每一个TCR的序列能有效的成为一个T细胞克隆的唯一生物标志物。因此对T细胞TCR基因的序列组成进行测序，可以很好的定位每一种T细胞，其中包括白血病癌变的T细胞，并且灵敏度最高可达10-6(0.0001％)。
由于TCR基因的最大特点是V、D、J基因片段的随机重组，所以，针对未知基因序列，很难设计一个上游引物用于识别TCR基因的5’端序列，所以也无法利用PCR技术扩增TCR 基因和测序。
而另外一种TCR测序方法，即多重引物PCR的方法，只能测序TCR基因中的部分序列信息，这样使得测序基因信息不完整。另外，多重引物PCR方法的引物是根据已知V，J基因设计的，但在癌症病人中，癌细胞的基因突变是很常见的，如果白血病癌细胞的TCR产生了突变，那么已知序列的引物就有可能无法识别突变后的基因，对检测结果来说，就容易造成假阴性。
发明内容
为了解决以上技术问题，本发明提供一种基于高通量测序检测T细胞白血病微小残留病的方法,通过高通量测序构建T细胞白血病微小残留病TCR文库,以及构建的cDNA接头和单对引物，以及文库制备方法，通过从接头的上游引物到C区的下游引物，获得TCR基因序列的全长信息。
解决以上技术问题的一种利用高通量测序检测T细胞白血病微小残留病的方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)获取人血液样本10mL于EDTA抗凝管；
(2)利用淋巴细胞分离液Ficoll-1077(美国Sigma公司#10771)进行外周血单核细胞(PBMC)的分离；
淋巴细胞分离液的作用在于可以从全血里分离淋巴细胞，分离后的细胞群所获得的RNA是除去了红细胞、血小板等细胞的RNA的。所以建库使用的总RNA内含T细胞RNA模板纯度更高。
(3)利用Trizol的方法提取PBMC的总RNA，所用试剂为RNAzol RT(美国MRC公司#RN190)；
步骤如下：
收获细胞，转移入1.5ml离心管中，加入1ml Trizol，混匀，室温静置5min。
加入0.2ml氯仿，振荡15s，静置2min。
加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min。
4℃离心，12000g×10min，弃上清。
加入1ml 75％乙醇，轻轻洗涤沉淀。4℃离心，7500g×5min，弃上清。
自然风干，加入50ul的DEPC H2O溶解，得到淋巴细胞总RNA。
(4)RNA反转录成cDNA，并同时在cDNA 5’端添加接头,用于后面PCR扩增时5’端引物结合；
在反转录时，同时添加接头，可以最小化RNA在多步反应过程中的丢失。RNA在操作中稳定性极差，非常容易降解，少量的步骤可以最大程度上减少降解，同时也节约了可用于扩增的cDNA制备时间。
接头即cDNA 5‘端的核酸接头，为TCR 5’Oligo接头。
(5)PCR1:通过单对引物的方式扩增重组TCR cDNA；
(6)PCR2和纯化：为PCR1产物(扩增后的TCR序列)添加Illumina高通量测序仪的上机接头和标签，同时为增加更多的上机基因量再次扩增；PCR反应结束后，利用磁珠进行DNA纯化。
PCR产物一般都含有过量的引物、Taq DNA酶及dNTP。这些成分的存在将直接影响到后续的文库质检、测序反应等过程，纯化可以去除这些影响后续实验的副产物。同时，纯化的过程也是一个片段大小筛选的过程，本发明中的DNA片段是在700bp左右，可利用不同体积的磁珠与PCR产物混合，磁珠/DNA不同的体积比例可以吸附不同大小的片段，利用上述磁珠体积，可以成功去掉PCR扩增时的错误(误差)片段和引物双聚体，让我们的测序上机文库只有我们的测序目标DNA片段，使得测序结果更加准确，减少误差。
如图3所示，通过文库质检只发现了一个片段的峰。
(7)进行高通量测序：将所得的cDNA文库通过Illumina MiSeq平台进行测序，测序模式为PE300，文库变性浓度为2nM，上机浓度为20pM，并通过生物信息学分析高通量测序结果；
根据得出特有的TCR序列是否大于10-4(0.01％)，即某种特有的T细胞是否大于10-4(0.01％)，从而判断受试者的微小残留病是呈阳性还是阴性，若MRD>10-4(0.01％)则为阳性，若MRD<10-4(0.01％)则为阴性。
所述步骤(4)中接头为TCR 5’Oligo接头，其碱基序列为：5’ATGCATCGGATCTTCAGCATGAACTTrGrGrG 3’。
所述步骤(5)中单对引物及引物序列为：
TCR 5’端接头引物：
5’GTCTCGTGGGCTGGGCGATGTGTATGAGAGACAGCATGCATCGGATCTTCAGCATGA 3’
TCR C区引物：
5’TCGTCGCCAGCGTCGGAAGTGTATAAGAGACAGTCGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG 3’。
本发明中所述步骤(四)中按照以下比例混合每一个RNA样本：
试剂 体积1X(μL)，
RNA 8(0.1μg～1μg)，
TCR 3’Oligo(dT)引物(10μM) 1，
孵化于72℃ 3分钟，接着4℃ 1分钟。
按照以下比例制备PCR反应缓冲液
混合PCR反应缓存液与RNA样本，按照下面反应程序开始cDNA反转录
42℃ 60分钟
70℃ 10分钟
4℃ 永久
反应结束后，就可获得已在5’端添加了接头的总cDNA(如图1)。
所述步骤(五)中具体步骤如下：按照以下比例制备反应体系：
按照上述的反应体系制备反应体系，混合上述5样试剂于PCR试管，混匀，离心数秒，把管壁上的液体残留离心于管底。放置试管于PCR扩增仪中，按照上述反应程序开始运行。
所述步骤(5)中PCR 1反应程序为:
95℃ 3分钟；95℃ 30秒；65℃ 1分钟，25循环；72℃ 1分钟；4℃永久。
所述步骤(6)中具体步骤如下：
按照以下比例制备反应体系：
所述步骤(6)中PCR 2反应程序为:
94℃ 3分钟；94℃ 30秒；55℃ 30秒，15循环；72℃ 20分钟，72℃ 1分钟，4℃永久。
所述步骤(6)中具体纯化步骤如下：
A、添加80μL AMPure XP Beads进入PCR2反应产物，混匀。
B、在室温孵化10分钟。
C、放置磁珠-PCR2产物混合物试管于磁力架上，等待所有磁珠吸附于磁力架上后，用移液器吸去所有上清液，丢弃。
D、添加150μL 70％乙醇于磁珠上，孵化30秒，用移液器吸去所有上清液，丢弃。
E、重复第四步2次。
F、打开试管盖，等待5分钟，待磁珠风干，没有任何乙醇残留于试管内。
J、把试管从磁力架上取下，并添加50μL去核酸酶水，利用移液器吹打悬浮磁珠。
H、把试管放回磁力架，等待所有磁珠都吸附于磁力架后，转移上清液于新的试管中。上清液里就包含了纯化之后的PCR2产物。
本发明基于高通量测序技术，TCR测序单对引物的文库构建方法，通过在获得T细胞RNA后，在进行RNA至cDNA反转录的同时，给cDNA的5’端添加一个接头，从而通过这个已知序列的接头设计TCR扩增上游引物，再配合TCR基因3’端C区基因(不变区)设计下游引物，从而达到扩增整个TCR序列全长基因的目的。
本发明中检测灵敏度可达10-6(0.0001％)，高于目前临床检测方法100倍。
本发明提供了一种如第一方面所述的基于高通量测序构建白血病微小残留病TCR文库的cDNA接头和单对PCR引物或第二方面所述基于高通量测序构建白血病微小残留病TCR文库的构建方法在检测白血病微小残留病TCR克隆性中的应用。
本发明提供基于高通量测序构建白血病微小残留病TCR文库的接头，引物及方法的有益效果为：1.获得了人TCR全转录组序列；2.获得了人特异性CDR1、CDR2和CDR3序列；3.获得了人克隆性增值了后的TCR序列，以便作为白血病微小残留病的检测生物标记物，尤其是提高了低于10-4(0.01％)的低拷贝数的T细胞克隆的检出率。
本发明在高通量测序平台的基础上，通过对人TCR基因测序结果进行全面的生物信息学分析，获得了TCR在VDJ重组时的基因偏好性，VDJ基因组合信息，TCR克隆种类信息，TCR多样性信息，CDR1、CDR2、CDR3的核酸序列和氨基酸序列信息，基因上的突变信息，等。正是这些因素形成数量庞大且种类多样的TCR组库。
提供详细的测序后生物信息学数据分析，并且对整个实验提供有效的质量监控，能最大程度减少实验误差及错误。通过对TCR的测序评估可以快速的，非侵入性的帮助医疗工作者和癌症病人早期预测T细胞白血病微小残留病(MRD)水平，MRD是指癌症在在完全缓解后，体内仍有残留的癌变细胞，此为疾病复发的根源。为争取患者长期无病生存和痊愈，必须对MRD进行动态监测，实时疗效评估，治疗指导及复发预测。
附图说明
图1本发明中RNA反转录cDNA示意图
图2为本发明中利用两次PCR扩增TCR cDNA并添加测序上机接头示意图
图3为本发明中测序文库质检结果。
图4为本发明中TCR测序结果进行生物信息学分析比对，找出每条序列的信息(部分)
图5为本发明中TCR测序结果3D森林图。展示受试者TCR的多样性和克隆性情况，每一条柱代表一种TCR克隆，克隆性增值的TCR表示了白血病癌细胞的增值情况，增值的这一条TCR序列就可作为癌细胞的生物标志物，为将来每次的白血病微小残留病检测提供生物标记物。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细描述:
实施例1
一种利用高通量测序检测T细胞白血病微小残留病的方法，包括如下步骤：
(1)获取人血液样本10mL于EDTA抗凝管；
(2)利用淋巴细胞分离液Ficoll-1077(美国Sigma公司#10771)进行外周血单核细胞(PBMC)的分离；
(3)利用Trizol的方法提取PBMC的总RNA，所用试剂为RNAzol RT(美国MRC公司#RN190)；
(4)RNA反转录成cDNA，并在cDNA 5’端添加接头用于后面PCR扩增时5’端引物结合，
具体步骤如下，
所使用到的试剂：
·TCR 3’Oligo(dT)引物(10μM)
·5X反转录缓冲液(250mM Tris-HCl(pH 8.3),375mM KCl,15mM MgCl2)
·二硫苏糖醇，DTT(20mM)美国Thermo Scientific#R0861
·dNTP Mix(10mM)美国Invitrogen#18427088
·RNAse Out(40U/μL)美国Invitrogen#10777019
·TCR 5’Oligo接头(10μM)
·Superscript II RT(200U/μL)美国Invitrogen#18064022
按照以下比例混合每一个RNA样本：
试剂 体积1X(μL)
RNA 8
TCR 3’Oligo(dT)引物(10μM) 1
孵化于72℃ 3分钟，接着4℃ 1分钟。
按照以下比例制备PCR反应缓冲液
试剂 体积1X(μL)
5X反转录缓冲液 3.5
DTT(20mM) 1
dNTP(10mM) 1
RNAse Out 1
TCR 5’Oligo接头(10μM) 1
Superscript II RT 1
混合PCR反应缓存液与RNA样本，按照下面反应程序开始cDNA反转录
42℃ 60分钟
70℃ 10分钟
4℃ 永久
反应结束后，就可获得已在5’端添加了接头的总cDNA(如图)
(5)PCR1：通过“单对”引物的方式扩增重组TCR cDNA，具体步骤如下：
所使用到的试剂：
·Q5High-Fidelity 2X Master Mix(美国NEB#M0492L)
·TCR 5’端接头引物(上游引物)
·TCR C区引物(下游引物)
·去核酸酶水(美国Thermo Scientific AM9914G)
按照以下比例制备反应体系：
PCR 1反应程序为:
(6)PCR2(标签PCR)。为PCR1产物(扩增后的TCR序列)添加Illumina高通量测序仪的上机接头和标签，同时为增加更多的上机基因量再次扩增。具体步骤如下：
所使用到的试剂：
·Q5High-Fidelity 2X Master Mix(美国NEB#M0492L)
·标签上游引物
·标签下游引物
·去核酸酶水(美国Thermo Scientific AM9914G)
按照以下比例制备反应体系：
PCR 2反应程序为:
PCR2产物纯化。上述PCR反应结束后，利用磁珠进行DNA纯化，具体步骤如下：
所使用到的试剂：
Agencourt AMPure XP Beads(美国Beckman#A63882)
具体纯化步骤如下：
(1)添加80μL AMPure XP Beads进入PCR2反应产物，混匀。
(2)在室温孵化10分钟。
(3)放置磁珠-PCR2产物混合物试管于磁力架上，等待所有磁珠吸附于磁力架上后，用移液器吸去所有上清液，丢弃。
(4)添加150μL 70％乙醇于磁珠上，孵化30秒，用移液器吸去所有上清液，丢弃。
(5)重复第四步2次。
(6)打开试管盖，等待5分钟，待磁珠风干，没有任何乙醇残留于试管内。
(7)把试管从磁力架上取下，并添加50μL去核酸酶水，利用移液器吹打悬浮磁珠。
(8)把试管放回磁力架，等待所有磁珠都吸附于磁力架后，转移上清液于新的试管中。上清液里就包含了纯化之后的PCR2产物。
(7)进行高通量测序。将所得的cDNA文库通过Illumina平台(美国Illumina公司)进行测序，测序模式为PE300，文库变性浓度为2nM，上机浓度为20pM，并通过生物信息学分析高通量测序结果。
材料及试剂说明
T淋巴细胞相关白血病患者：来源浙江大学医学院附属医院，患者知情同意。非特殊说明，本发明采用的试剂均为市售商品，本发明实施例采用的数据库均为公开的在线数据库。
具体地，本发明反转录5’端接头序列、引物序列如下(5’-3’)：
反转录步骤
TCR 3’Oligo(dT)引物：
5’TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGA 3’
TCR 5’Oligo接头：
5’ATGCATCGGATCTTCAGCATGAACTTrGrGrG 3’
PCR1步骤
TCR 5’端接头引物：
5’GTCTCGTGGGCTGGGCGATGTGTATGAGAGACAGCATGCATCGGATCTTCAGCATGA 3’
TCR C区引物：
5’TCGTCGCCAGCGTCGGAAGTGTATAAGAGACAGTCGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG 3’
PCR2步骤
标签上游引物：
5’CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[index1]GTCTCGTGGGCTGG 3’
标签下游引物：
5’AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC[index2]TCGTCGCCAGCGTC 3’
rG＝RNA核苷酸
标签引物中下划线部分为Illumina测序标签序列，内序列可更换为下表序列，用于同时检测多个样本时，利用不同的index1-index2组合和生物信息学算法区分各个样本测序结果。
引物设计：针对RNA反转录时在TCR 5’端添加的接头序列和TCR C区基因进行分析，采用Oligo 7.36和Primer Premier 6.0对引物二聚体以及茎环错配进行分析，在TCR5’端人工接头设置了上游引物，针对C基因下游设计反向引物，扩增TCR全长转录子区域序列，其中包含了TCR的FR1,CDR1,FR2,CDR2,FR3,CDR3,FR4区域。
实施例2
本发明实施例1提供了一种T淋巴细胞受体(TCR)RNA样品的制备方法，包括如下步骤：
收集新鲜的外周血样本10毫升(mL)，按照Ficoll-1077(美国Sigma公司#10771)的说明书操作，获得相对较纯的外周血单核细胞(PBMC)；
采用Trizol的方法提取PBMC的总RNA，所用试剂为RNAzol RT(美国MRC公司#RN190)，所获得的总RNA，利用2.0Fluorometer(美国Thermo Fisher Scientific公司#Q32866)，配合RNA HS Assay Kit试剂盒(美国Thermo Fisher Scientific公司#Q32852)测定RNA浓度，然后反转录RNA；
实施例3
本发明实施例2提供了一种采用白血病微小残留病TCR文库的单对引物构建白血病微小残留病TCR高通量测序文库的方法，包括如下步骤：
以实施例1所得的RNA为反转录模板，按照上述“第二方面”中第四部分中的试剂和步骤获得加上了TCR 5’端接头的cDNA。再按照上述“第二方面”中第五、六、七部分中的试剂和步骤进行PCR 1、PCR 2和PCR 2的产物(文库)纯化。
文库纯化结束后，利用Agilent 2100Bioanalyzer(美国Agilent公司#G2939AA)检测文库的纯度和大小，使用的试剂盒是Agilent DNA 1000Kit(美国Agilent公司#5067-1504)，检测结果如图3所示，文库大小在686bp，并且文库纯度相当高，并未见到其他非特异性扩增序列。
利用2.0Fluorometer(美国Thermo Fisher Scientific公司#Q32866)，配合dsDNA HS Assay Kit试剂盒(美国Thermo Fisher Scientific公司#Q32851)测定DNA文库浓度，并送公司进行高通量测序(采用Illumina MiSeq，2*300pair-end)。
采用本发明的TCR 5’端接头、引物以及文库构建后，高通量测序得到大约几百万条TCR序列。
测序结果进行生物信息学分析(生物信息分析采用Bowtie 2aligner(Ver.2.1.0)，TCR数据库匹配来源于国际免疫基因信息系统 www.imgt.org)，部分分析比对结果如下图4、5所示。
通过生物信息学分析，可以准确地知道每条TCR序列的信息，氨基酸信息，条数以及所占比例。经过TCR对比分析，本发明获得了高通量测序TCR序列代表性克隆的统计分析结果，结果如图4和5所示，图5为TCR的重组基因V-J组合使用情况。由图5可知，通过本发明的TCR 5’端接头、PCR引物以及测序文库制备方法获得的近百万条的TCR序列中，可以得出特有的TCR序列是否大于10-4(0.01％)，也就某种特有的T细胞(癌细胞)是否大于10-4，从而判断受试者的微小残留病是阳性还是阴性(临床参考值以MRD>10-4(0.01％)为阳性，MRD<10-4(0.01％)为阴性)。
上述结果表明，利用本发明的方法构建白血病微小残留病TCR文库能够覆盖TCR基因的多样性信息，提高低拷贝数T细胞克隆的检出率。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表SEQUENCE LISTING
<110> 孙涛
<120> 一种基于高通量测序检测T细胞白血病微小残留病的方法
<160> 20
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<223>TCR 5’Oligo 接头
<400> 1
atgcatcggatcttcagcatgaacttrgrgrg 32
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<223> TCR 3’ Oligo (dT)引物
<400> 2
ttttttttttttttttttttga 22
<210> 3
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<223> TCR 5’端接头
<400> 3
gtctcgtgggctgggcgatgtgtatgagagacagcatgcatcggatcttcagcatga 57
<210> 4
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<223> TCR C区引物
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<213> 人工合成
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Claims (10)

1.一种基于高通量测序检测T细胞白血病微小残留病的方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)获取人血液样本10mL于EDTA抗凝管；
(2)利用淋巴细胞分离液Ficoll-1077进行外周血单核细胞(PBMC)的分离；
(3)利用Trizol的方法提取PBMC的总RNA，所用试剂为RNAzol RT；
(4)RNA反转录成cDNA，并同时在cDNA 5’端添加接头；
(5)PCR1:通过单对引物的方式扩增重组TCR cDNA；
(6)PCR2和纯化：为PCR1产物添加Illumina高通量测序仪的上机接头和标签，同时扩增,并利用磁珠进行DNA纯化；
(7)进行高通量测序：将所得的cDNA文库通过Illumina MiSeq平台进行测序，测序模式为PE300，文库变性浓度为2nM，上机浓度为20pM，并通过生物信息学分析高通量测序结果；若MRD>10-4(0.01％)则为阳性，若MRD<10-4(0.01％)则为阴性。
2.根据权利要求1所述的一种基于高通量测序检测T细胞白血病微小残留病的方法，其特征在于：所述步骤(4)中接头为TCR 5’Oligo接头，其碱基序列为：5’ATGCATCGGATCTTCAGCATGAACTTrGrGrG 3’。
3.根据权利要求1所述的一种基于高通量测序检测T细胞白血病微小残留病的方法，其特征在于：所述步骤(5)中单对引物及引物序列为：
TCR 5’端接头引物：
5’GTCTCGTGGGCTGGGCGATGTGTATGAGAGACAGCATGCATCGGATCTTCAGCATGA 3’
TCR C区引物：
5’TCGTCGCCAGCGTCGGAAGTGTATAAGAGACAGTCGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG 3’。
4.根据权利要求1所述的一种基于高通量测序检测T细胞白血病微小残留病的方法，其特征在于：所述步骤(4)中，具体步骤如下：
按照以下比例混合每一个RNA样本：
试剂 体积1X(μL)，
RNA 8(0.1～1μg)，
TCR 3’Oligo(dT)引物(10μM) 1，
孵化于72℃ 3分钟，接着4℃ 1分钟；
按照以下比例制备PCR反应缓冲液：
5.根据权利要求1或2所述的一种基于高通量测序检测T细胞白血病微小残留病的方法，其特征在于：所述混合PCR反应缓存液与RNA样本，按照下面反应程序开始反转录成cDNA：42℃ 60分钟；70℃ 10分钟；4℃永久。
6.根据权利要求1所述的一种基于高通量测序检测T细胞白血病微小残留病的方法，其特征在于：所述步骤(5)中，按照以下比例制备反应体系：
7.根据权利要求1或4中所述的一种基于高通量测序检测T细胞白血病微小残留病的方法，其特征在于：所述步骤(5)中，PCR 1反应程序为:
95℃ 3分钟；95℃ 30秒；65℃ 1分钟25循环；72℃ 1分钟；4℃永久。
8.根据权利要求1所述的一种基于高通量测序检测T细胞白血病微小残留病的方法，其特征在于：所述步骤(6)中，按照以下比例制备反应体系：
9.根据权利要求1或6所述的一种基于高通量测序检测T细胞白血病微小残留病的方法，其特征在于：所述步骤(6)中，PCR 2反应程序为:
94℃ 3分钟；94℃ 30秒；55℃ 30秒，15循环；72℃ 20分钟，72℃ 1分钟，4℃永久。
10.根据权利要求1所述的一种基于高通量测序检测T细胞白血病微小残留病的方法，其特征在于：所述步骤(6)中，具体纯化步骤如下：
(1)添加80μL AMPure XP Beads进入PCR2反应产物，混匀；
(2)在室温孵化10分钟；
(3)放置磁珠-PCR2产物混合物试管于磁力架上，等待所有磁珠吸附于磁力架上后，用移液器吸去所有上清液，丢弃；
(4)添加150μL 70％乙醇于磁珠上，孵化30秒，用移液器吸去所有上清液，丢弃；
(5)重复第四步2次；
(6)打开试管盖，等待5分钟，待磁珠风干，没有任何乙醇残留于试管内；
(7)把试管从磁力架上取下，并添加50μL去核酸酶水，利用移液器吹打悬浮磁珠；
(8)把试管放回磁力架，等待所有磁珠都吸附于磁力架后，转移上清液于新的试管中，上清液里就包含了纯化之后的PCR2产物。
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