CN105154440A - 一种基于高通量测序构建白血病微小残留病灶tcr文库的多重pcr引物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种基于高通量测序构建白血病微小残留病灶TCR文库的多重PCR引物，包括上游引物和下游引物，所述上游引物为比SEQ？ID？NO:1～SEQ？ID？NO:25所示的核苷酸序列多或少0～3个碱基的核苷酸序列组成的上游引物组；所述下游引物为比SEQ？ID？NO:26～SEQ？ID？NO:38所示的核苷酸序列多或少0～3个碱基的核苷酸序列组成的。本发明提供的多重PCR引物组能高效构建白血病患者的T淋巴细胞受体高通量测序文库，可获得丰富的白血病微小残留病灶TCR重排信息。

Description

一种基于高通量测序构建白血病微小残留病灶TCR文库的多重PCR引物和方法
技术领域
本发明属于分子生物学领域，特别是涉及一种基于高通量测序构建白血病微小残留病灶TCR文库的多重PCR引物和方法。
背景技术
白血病(leukemia)是以骨髓和/或外周血中幼稚细胞增多为特征的血液系统恶性克隆性疾病。在初诊时，病人体内白血病细胞总数约为1012，经化疗取得形态学的完全缓解(CompleteRemission，CR)后，残留的白血病细胞总数低于109，这种形态学方法难以检测、且体内仍残存着少量白血病细胞的状态称为白血病微小残留病(minimalresidualdisease，MRD)。体内残留的MRD使急性T淋巴白血病患者有>50％复发率。因此要定期检测MRD，对设计个体化的治疗方案显得更为重要。
T细胞基因座上大量V、J基因片段在受体的合成中会产生各种多样重排，在V-J，V-D和D-J接合体之间的核苷酸不依赖模板插入或删除，与高频变异类似，这进一步增加了受体潜在的多样性。受体的这种潜在多样性很难随机产生相同的CDR3序列，从而使每个CDR3序列有效地成为一个T细胞克隆的唯一标签。因此对于T淋巴细胞IGH基因CDR3区域的序列组成进行测序可以很好的反映TCR免疫组库的组成及应答状况。
目前临床上MRD的主要检测方法是：多参数流式细胞术(multiparametricflowcytometry，mpFC)和实时定量PCR技术。虽然mpFC对于复发疾病的检测灵敏度为10-4，但是复杂的多维数据依赖于实验人员分析，人为因素影响大，不利于临床标准化检测。此外，在化疗后白血病抗原的表达水平对MRD的mpFC检测具有干扰作用。依赖于分子手段可以提高检测MRD的灵敏度，可以达到10-5；然而，实时定量PCR需根据患者设计特殊的引物将多样性丰富的重排序列扩增出来，其检测费用昂贵、劳动力密集、很难形成标准化实验流程。
得益于下一代高通量测序技术的快速发展和广泛应用，DNA和RNA测序平台在基因组学的各个方面发挥着突出的推动作用。因此，提供一种基于高通量测序构建白血病微小残留病灶TCR文库的多重PCR引物和方法。
发明内容
鉴于此，本发明提供了一种基于高通量测序构建白血病微小残留病灶TCR文库的多重PCR引物和方法。
第一方面，本发明提供了一种基于高通量测序构建白血病微小残留病灶TCR文库的多重PCR引物，包括上游引物和下游引物，所述上游引物为比SEQIDNO:1～SEQIDNO:25所示的核苷酸序列多或少0～3个碱基的核苷酸序列组成的上游引物组；
所述下游引物为比SEQIDNO:26～SEQIDNO:38所示的核苷酸序列多或少0～3个碱基的核苷酸序列组成的。
如本发明所述的，“碱基”可代表核苷酸，比如，计数时，用1bp代表1个核苷酸。
如本发明所述的，“多或少0～3个碱基”，优选为在对应引物的3’端多或少0～3个碱基。
本发明通过针对人TCR的可变区V区(variable)设置至少25条上游引物序列，针对TCR的连接区(joining)J区设置至少13条下游引物序列，通过多重PCR扩增出目的链的PCR产物，获得高通量测序文库。
本发明采用至少13条下游引物序列与所述至少25条上游引物序列随机组合成配对引物，然后进行多重PCR反应，扩增TCRCDR3区。
优选地，所述上游引物为SEQIDNO:1～SEQIDNO:25所示的核苷酸序列组成的上游引物组，所述下游引物为SEQIDNO:26～SEQIDNO:38所示的核苷酸序列组成的下游引物组。
如本发明所述的，所述比SEQIDNO:1～SEQIDNO:17所示的核苷酸序列多出的1～3个碱基为与目的TCR互补的碱基。
如本发明所述的，本领域技术人员可以理解的，所述的“比SEQIDNO:1～SEQIDNO:25或SEQIDNO:26～SEQIDNO:38所示的核苷酸序列多或少0～3个碱基的核苷酸序列”为本领域技术人员在设计PCR引物时，在如“SEQIDNO:1～SEQIDNO:38所示的核苷酸序列”的基础上，适当的延长或截短PCR引物长度即可获得(延长部分仍然与相应的目的片段互补)；
本领域技术人员可以理解的，若摸索的多重PCR引物组(“SEQIDNO:1～SEQIDNO:38所示的核苷酸序列”)获得了较佳的扩增效果，在可预测范围内，适当的将各条引物延长或截短0～3个碱基后所得多重PCR引物组，也可以获得较佳的多重PCR扩增效果。
优选地，所述下游引物的5’端和上游引物的5’端分别包括标签序列，所述标签序列为由6～8个核苷酸序列组成的序列条码，其中，所述序列条码之间至少有一个核苷酸不同。
本发明提供的带标签序列的引物可以给待测样品中的每个RNA分子或DNA分子都加上了一个标签序列，所述标签序列由ATCG四种基本碱基随机组合，且所述标签序列互不相同，例如，标签序列的碱基个数是八个时(本发明实施例中表示为8N标签序列)，可以获得109个不同的标签序列组合；标签序列的碱基个数是七个时，可以获得108个不同的标签序列组合；标签序列的碱基个数是六个时，可以获得107个不同的标签序列组合，所述标签序列的碱基个数是八个，或者七个，或者六个。
第二方面，本发明提供了一种基于高通量测序构建白血病微小残留病灶TCR文库的多重PCR方法，包括如下步骤：
取待测样品；
采用多重PCR反应扩增待测样品获得多重PCR产物，其中，多重PCR反应采用的引物组包括上游引物和下游引物，所述上游引物为3’端比SEQIDNO:1～SEQIDNO:25所示的核苷酸序列多或少0～3个碱基的核苷酸序列组成的上游引物组；
所述下游引物为3’端比SEQIDNO:26～SEQIDNO:38所示的核苷酸序列多或少0～3个碱基的核苷酸序列组成的。
优选地，所述待测样品为DNA样品或RNA样品。
当所述取待测样品为DNA样品时，进行多重PCR的体系参照普通PCR体系进行配置；当所述取待测样品为RNA样品时，要先进行逆转录合成cDNA，再合成第二链DNA，此时，逆转录合成cDNA的步骤相当于一个循环的多重PCR(只采用上游引物组或下游引物组)，合成第二链DNA的步骤也相当于一个循环的多重PCR(只采用下游引物组或上游引物组)。
优选地，所述待测RNA样品为(优选采用RNA试剂盒)提取人外周血单个核细胞获得的总RNA。
优选地，当待测样品为RNA样品，所述的采用多重PCR反应，扩增待测样品，获得多重PCR产物的步骤为：先以下游引物组为反转录引物合成cDNA；然后以合成的cDNA为模板，加入上游引物组，进行多重PCR，扩增cDNA，获得多重PCR产物。
优选地，当待测样品为RNA样品，所述的采用多重PCR反应，扩增待测样品，获得多重PCR产物的步骤为：先以上游引物组为反转录引物合成cDNA；然后以合成的cDNA为模板，加入下游引物组，进行多重PCR，扩增cDNA，获得多重PCR产物。
优选地，所述上游引物为SEQIDNO:1～SEQIDNO:25所示的核苷酸序列组成的上游引物组，所述下游引物为SEQIDNO:26～SEQIDNO:38所示的核苷酸序列组成的下游引物组。
优选地，所述多重PCR反应的体系中，13条上游引物组成的上游引物组中，各上游引物等摩尔混合；4条下游引物组成的下游引物组中，各下游引物等摩尔混合。
优选地，所述下游引物的5’端和上游引物的5’端分别包括标签序列，所述标签序列为由6～8个核苷酸序列组成的序列条码，其中，所述序列条码之间至少有一个核苷酸不同。
优选地，所述多重PCR反应的体系中，模板量为1～3ug/50ul体系。
优选地，所述多重PCR反应的程序为：
上述程序具体为：95℃预变性15min，94℃变性15s，65℃退火90s，72℃延伸30s，循环25～30次，最后72℃后延伸10min。
优选地，所述多重PCR反应结束后，电泳，割胶回收片段长度为100-150bp的DNA片段。
本发明提供的TCR高通量测序文库能获得的长度和数量丰富的TCR序列，有利于TCR序列的多态性程度分析及TCR高克隆CDR3区长度多态性分布分析。
优选地，将所得多重PCR产物进行建库后进行高通量测序，并通过生物信息学分析高通量测序结果。
在高通量测序平台的基础上，通过对人TCR基因CDR3区域进行全面的生物信息学分析，获得了TCR在VDJ重组时的基因偏好性(usagepatterns)，基因组合、连接多样性信息，以及CDR3序列中氨基酸的偏好性(usagepatterns)、CDR3氨基酸序列的长度多样性以及连接处N端碱基的特性。正是这些因素形成数量庞大且种类多样的TCR受体库。
第三方面，本发明提供了一种检测白血病微小残留病灶TCR多样性的试剂盒，包括如第一方面所述的基于高通量测序构建白血病微小残留病灶TCR文库的多重PCR引物。
第四方面，本发明提供了一种如第一方面所述的基于高通量测序构建白血病微小残留病灶TCR文库的多重PCR引物或第二方面所述的基于高通量测序构建白血病微小残留病灶TCR文库的多重PCR方法在检测白血病微小残留病灶TCR多样性中的应用。
本发明提供的基于高通量测序构建白血病微小残留病灶TCR文库的多重PCR引物及方法的有益效果为：1)获得了人TCR序列；2)获得了人特异性的TCRCDR3序列，尤其提高了低拷贝数T细胞克隆的检出率。
附图说明
图1为本发明实施例提供的琼脂糖凝胶电泳图，其中，图1-a为基因组DNA；图1-b为多重PCR所得的PCR产物；
图2为本发明实施例所得序列的VDJ重组分析结果。
具体实施方式
材料及试剂说明：
T淋巴细胞相关白血病患者：来源于深圳市人民医院，患者知情同意。非特殊说明，本发明实施例采用的试剂均为市售商品，本发明实施例采用的数据库均为公开的在线数据库。
具体地，本发明引物如下(下划线部分为测序公司接头序列)：
表1.多重PCR引物序列
注，本领域技术人员可以理解的是，核苷酸缩写如下：
R＝A/G，Y＝C/T，M＝A/C，K＝G/T，S＝C/G，W＝A/T，H＝A/C/T，B＝C/G/T，V＝A/C/G，D＝A/G/T，N＝A/C/G/T。
设计引物：针对TCR所有的V和J基因进行了比对分析，采用Oligo7.0和MFEprimer-2.0对引物二聚体以及茎环错配进行分析，在TCR的CDR3区上游(即FR3区)设置了上游引物，针对J基因下游设计反向引物，扩增CDR3区域序列。
本实施例提供的引物组覆盖了大部分VDJ重组片段。由于很小的序列变化将导致引物扩增效果显著降低，发明人分别针对不同目的TCR区域的不同区段设计了2组多重PCR引物组，在经过2组预实验筛选后，本发明选取了扩增效果最佳的引物组，如上表所示。
实施例1
本发明实施例1提供了一种T淋巴细胞受体(TCR)DNA样品的制备方法，包括如下步骤：
(1)收集的新鲜外周血样本各10毫升(ml)，按LymphoPrep试剂盒(Axis-shield,Cat.No.AS1114544UK)说明书操作，获得相对较纯的PBMC；
(2)采用PureLinkGenomicDNAMiniKit(LifeTechnology,Cat.No:K1820-00)试剂盒提取步骤(1)所得细胞的基因组DNA，并用Nanodrop2000(Thermo)测定DNA的浓度及纯度，然后保存基因组DNA。
DNA提取电泳结果如图1-a所示(基因组DNA片段参见泳道1-2；M是DNAMarker)。
实施例2
本发明实施例2提供了一种采用白血病微小残留病灶TCR文库的多重PCR引物构建白血病微小残留病灶TCR高通量测序文库的方法，包括如下步骤：
以实施例1所得基因组DNA为扩增模板，取TCR引物，再采用QIAGEN公司MultiplexPCR试剂盒(货号：206143)，按试剂盒说明书配置多重PCR体系，其中，TCR引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物为SEQIDNO:1～SEQIDNO:25所示的核苷酸序列组成的上游引物组，所述下游引物为SEQIDNO:26～SEQIDNO:38所示的核苷酸序列组成的下游引物组。
各上游引物等摩尔混合，引物总浓度是10微摩尔，各下游引物等摩尔混合，引物总浓度是10微摩尔，模板量可以调整，本实施例中采用3ug。
为方便送测，若无特别说明，本发明实施例进行多重PCR时，分别在上游引物和下游引物加上测序接头，具体为：在上游引物的5’端分别接上illumina测序公司的上游引物接头序列(如SEQIDNO:39所示的核苷酸序列)，在下游引物的5’端分别接上illumina测序公司的下游引物接头序列(如SEQIDNO:40所示的核苷酸序列)，具体步骤参照illumina高通量测序文库构建说明书；
再按下述多重PCR的条件设置PCR仪器程序，进行多重PCR：
PCR结束后，4℃保存PCR产物并电泳检测，结果如图1-b所示，在紫外下切下约250bp左右的目的片段(目的片段参见泳道1-4；M是DNAMarker，横线是本发明为了让目的片段更突显添加的)。
挑选片段长度约为250bp的文库片段，割胶回收，得到纯化后的CDR3片段，胶回收步骤采用QIAGEN公司QIAquick胶纯化试剂盒，按常规实验室操作进行；Nanodrop2000测试DNA浓度，并送公司进行高通量测序(采用Illuminahiseq2000测序，2*100pair-end)。
采用本发明的引物组以及多重PCR构库后，高通量测序得到大约百万条序列。将测序结果进行生物信息学统计分析(生物信息学分析采用南方科技大学在线软件ImmuneRepertoireAnalysisPipeline(iRAP，http://www.sustc-genome.org.cn/irap/)，部分比对结果如下表2所示。其中，表2为CDR3unique克隆数量及分布，包括表2-1和表2-2。
表2-1.CDR3unique克隆数量及分布
Total reads number 632578 1446220 1290247 819400
immune sequences number 530520 1372065 1202415 744817
Unknown sequences numebr 102058 74155 87832 74583
productive sequences number 407301 1028722 853018 513292
Non_productive sequences number 123219 343343 349397 231525
In-frame sequences number 428029 1078737 918999 541143
Out-of_frame sequences number 100555 287854 269823 200430
Total CDR3 sequences number 398774 1003918 829923 493541
Unique cdr3 nt sequences number 19841 59699 77170 48323
Unique cdr3 aa sequences number 17896 50188 66465 41578
表2-2.CDR3unique克隆数量及分布
通过比对和生物信息学分析，可以准确的知道每条CDR3序列的序列信息，氨基酸信息，条数以及所占比例。经过TCR比对分析，本发明获得了高通量测序序列CDR3代表性克隆的统计分析结果，结果如图2所示，图2为TCRCD3区V-J组合使用情况。由图2可知，通过本发明的引物获得近白万条的TCR序列中，unique的CDR3序列大于104条。
上述结果表明，利用本发明的方法构建白血病微小残留病灶TCR文库能够覆盖CDR3基因的多样性信息，提高低拷贝数T细胞克隆的检出率。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于高通量测序构建白血病微小残留病灶TCR文库的多重PCR引物，其特征在于，包括上游引物和下游引物，所述上游引物为比SEQIDNO:1～SEQIDNO:25所示的核苷酸序列多或少0～3个碱基的核苷酸序列组成的上游引物组；
所述下游引物为比SEQIDNO:26～SEQIDNO:38所示的核苷酸序列多或少0～3个碱基的核苷酸序列组成的。
2.如权利要求1所述的基于高通量测序构建白血病微小残留病灶TCR文库的多重PCR引物，其特征在于，所述下游引物的5’端和上游引物的5’端包括标签序列，所述标签序列为由6～8个核苷酸序列组成的序列条码，其中，所述序列条码之间至少有一个核苷酸不同。
3.如权利要求1所述的基于高通量测序构建白血病微小残留病灶TCR文库的多重PCR引物，其特征在于，所述上游引物为SEQIDNO:1～SEQIDNO:25所示的核苷酸序列组成的上游引物组，所述下游引物为SEQIDNO:26～SEQIDNO:38所示的核苷酸序列组成的下游引物组。
4.一种基于高通量测序构建白血病微小残留病灶TCR文库的多重PCR方法，其特征在于，包括如下步骤：
取待测样品；
采用多重PCR反应扩增待测样品获得多重PCR产物，其中，多重PCR反应采用的引物组包括上游引物和下游引物，所述上游引物为3’端比SEQIDNO:1～SEQIDNO:25所示的核苷酸序列多或少0～3个碱基的核苷酸序列组成的上游引物组；
所述下游引物为3’端比SEQIDNO:26～SEQIDNO:38所示的核苷酸序列多或少0～3个碱基的核苷酸序列组成的。
5.如权利要求4所述的基于高通量测序构建白血病微小残留病灶TCR文库的多重PCR方法，其特征在于，所述下游引物的5’端和上游引物的5’端包括标签序列，所述标签序列为由6～8个核苷酸序列组成的序列条码，其中，所述序列条码之间至少有一个核苷酸不同。
6.如权利要求4所述的基于高通量测序构建白血病微小残留病灶TCR文库的多重PCR方法，其特征在于，所述上游引物为SEQIDNO:1～SEQIDNO:25所示的核苷酸序列组成的上游引物组，所述下游引物为SEQIDNO:26～SEQIDNO:38所示的核苷酸序列组成的下游引物组。
7.如权利要求4所述的基于高通量测序构建白血病微小残留病灶TCR文库的多重PCR方法，其特征在于，所述待测样品为DNA样品或RNA样品。
8.如权利要求4所述的基于高通量测序构建白血病微小残留病灶TCR文库的多重PCR方法，其特征在于，当待测样品为RNA样品，所述的采用多重PCR反应，扩增待测样品，获得多重PCR产物的步骤为：先以上或下游引物组为反转录引物合成cDNA；然后以合成的cDNA为模板，加入下或上游引物组，进行多重PCR，扩增cDNA，获得多重PCR产物。
9.一种检测白血病微小残留病灶TCR多样性的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的基于高通量测序构建白血病微小残留病灶TCR文库的多重PCR引物。
10.如权利要求1所述的基于高通量测序构建白血病微小残留病灶TCR文库的多重PCR引物在检测白血病微小残留病灶TCR多样性中的应用。
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