CN109486925A - 一种自制探针检测肿瘤11基因的技术 - Google Patents
一种自制探针检测肿瘤11基因的技术 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109486925A CN109486925A CN201811426675.7A CN201811426675A CN109486925A CN 109486925 A CN109486925 A CN 109486925A CN 201811426675 A CN201811426675 A CN 201811426675A CN 109486925 A CN109486925 A CN 109486925A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- probe
- gene
- tumour
- preparation
- library
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种自制探针检测肿瘤11基因的技术，包括如下步骤：扩增肿瘤11基因的目的片段，物理超声随机打断，生物素进行标记，链霉亲和素磁珠纯化，获得的捕获探针对构建好的文库进行捕获，上机测序，生物信息学分析。本发明提出的探针制备方法不仅克服了以往合成探针成本昂贵时间周期长的问题，而且制备方法简单，制备时间周期短，几天即可完成，极大的节约探针合成的时间，这种探针不仅克服了上述合成探针成本过大的问题，而且制备简单，且制备时间很短，几天即可制备完成，极大的节约探针合成的时间，从而解决了现有技术从定制到获得杂交捕获探针往往需要几个月，这不仅增加了制备成本，而且耗费了很多时间的问题。
Description
技术领域
本发明涉及基因技术领域，具体为一种自制探针检测肿瘤11基因的技术。
背景技术
自从2005年，下一代测序（NextGenerationSeqμencing，NGS）技术开始发展以来，在生物医学研究领域得到了越来越广泛的应用。NGS技术相比于传统Sanger测序而言，优势在于其规模大、通量高。在文库构建时或捕获后目标序列扩增阶段均可引入序列标签，从而可实现多样本的平行分析。
目前研究得知，在所有肿瘤中，有90-95％的肿瘤是由复杂的基因、环境共同作用引发的，但仍有5％-10％的是由遗传的变异基因引起。而现在，基因检测通过新一代测序技术同时检测成千上万个基因位点，能够对肿瘤易感性进行预测、对临床治疗进行针对性的指导。我们挑选了针对检测肿瘤相关的十一个基因：ROS1、ALK、RET、KRAS、TP53、ERBB2、PIK3CA、EGFR、MET、BRAF、MAP2K1。运用下一代测序技术对其进行测序分析。为节约成本，首先需用探针对目标区段进行杂交捕获，但是目前市面上常用的杂交捕获探针主要是通过合成的方法，其制备原理主要针对感兴趣的区域设计一定长度的探针序列，每个序列沿着基因位置移动一定距离，然后采用人工合成的方式大量合成上述序列。该方法最大的缺点是成本过于昂贵，由于每次合成的探针不存在小规格型号，每次都需几百次反应起，合成的成本高达几十万元。同时，随着目标区域的增大，探针合成的成本急速上升。这极大的提高了二代测序的成本，不利于二代测序向普通民众普及，以及不利于提高此项测序服务的价格市场竞争力。除成本过于高昂外，该方法还有其它缺点，如制备条件复杂，需要大量专业仪器，提高了探针制备的门槛，使得很多情况下都要从特定供应商处定制购买。从定制到获得杂交捕获探针往往需要几个月，这不仅增加了制备成本，而且耗费了很多的时间，为此，我们提出一种自制探针检测肿瘤11基因的技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种自制探针检测肿瘤11基因的技术，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种自制探针检测肿瘤11基因的技术，包括如下步骤：扩增肿瘤11基因的目的片段，物理超声随机打断，生物素进行标记，链霉亲和素磁珠纯化，获得的捕获探针对构建好的文库进行捕获，上机测序，生物信息学分析。
优选的，所述扩增肿瘤11基因时选用67对特异性引物，将肿瘤11基因扩增出来。
优选的，所述物理超声随机打断是采用物理方法将其扩增好的产物超声打断为90-250bp的片段，然后切取100-200bp片段进行胶回收，以获得目的条带。
优选的，所述生物素标记是对目的条带进行生物素标记，进而用链霉亲和素磁珠进行纯化，以获得生物素标记的肿瘤11基因捕获探针。
优选的，所述捕获是用制备好的肿瘤11基因捕获探针对基因组文库进行捕获，并上机测序，进行生物信息学分析。
优选的，所述制备好的探针用于高通量测序中肿瘤11基因进行检测，检测方法包括如下步骤：
（1）提取基因组DNA或血液游离cfDNA；
（2）将提取好的DNA进行随机打断；
（3）利用相关文库构建试剂盒进行文库构建；
（4）对构建好的文库进行质控；
（5）用制备好的肿瘤11基因探针对质控好的文库进行捕获；
（6）采用二代测序仪，如IonTorrent平台或Illμmina平台的相关测序仪进行上机测序；
（7）采用相关软件对测序结果进行生物信息学分析。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提出的探针制备方法不仅克服了以往合成探针成本昂贵时间周期长的问题，而且制备方法简单，制备时间周期短，几天即可完成，极大的节约探针合成的时间，通过制备的基因肿瘤11基因探针用于检测中，绕过传统杂交捕获探针的合成方法，降低合成过程中所需要的成本问题，这种探针不仅克服了上述合成探针成本过大的问题，而且制备简单，且制备时间很短，几天即可制备完成，极大的节约探针合成的时间，从而解决了现有技术从定制到获得杂交捕获探针往往需要几个月，这不仅增加了制备成本，而且耗费了很多时间的问题。
附图说明
图1为本发明工艺流程图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1，本发明提供一种技术方案：一种自制探针检测肿瘤11基因的技术，包括如下步骤：扩增肿瘤11基因的目的片段，物理超声随机打断，生物素进行标记，链霉亲和素磁珠纯化，获得的捕获探针对构建好的文库进行捕获，上机测序，生物信息学分析。
制备好的探针用于高通量测序中肿瘤11基因进行检测，检测方法包括如下步骤：
（1）提取基因组DNA或血液游离cfDNA；
（2）将提取好的DNA进行随机打断；
（3）利用相关文库构建试剂盒进行文库构建；
（4）对构建好的文库进行质控；
（5）用制备好的肿瘤11基因探针对质控好的文库进行捕获；
（6）采用二代测序仪，如IonTorrent平台或Illμmina平台的相关测序仪进行上机测序；
（7）采用相关软件对测序结果进行生物信息学分析。
实施例一：
扩增肿瘤11基因的目的片段，物理超声随机打断，生物素进行标记，链霉亲和素磁珠纯化，获得的捕获探针对构建好的文库进行捕获，上机测序，生物信息学分析。
实施例二：
在实施例一中，再加上下述工序：
扩增肿瘤11基因时选用67对特异性引物，将肿瘤11基因扩增出来。
扩增肿瘤11基因的目的片段，扩增肿瘤11基因时选用67对特异性引物，将肿瘤11基因扩增出来，物理超声随机打断，生物素进行标记，链霉亲和素磁珠纯化，获得的捕获探针对构建好的文库进行捕获，上机测序，生物信息学分析。
实施例三：
在实施例二中，再加上下述工序：
物理超声随机打断是采用物理方法将其扩增好的产物超声打断为90-250bp的片段，然后切取100-200bp片段进行胶回收，以获得目的条带。
扩增肿瘤11基因的目的片段，扩增肿瘤11基因时选用67对特异性引物，将肿瘤11基因扩增出来，物理超声随机打断，物理超声随机打断是采用物理方法将其扩增好的产物超声打断为90-250bp的片段，然后切取100-200bp片段进行胶回收，以获得目的条带，生物素进行标记，链霉亲和素磁珠纯化，获得的捕获探针对构建好的文库进行捕获，上机测序，生物信息学分析。
实施例四：
在实施例三中，再加上下述工序：
生物素标记是对目的条带进行生物素标记，进而用链霉亲和素磁珠进行纯化，以获得生物素标记的肿瘤11基因捕获探针。
扩增肿瘤11基因的目的片段，扩增肿瘤11基因时选用67对特异性引物，将肿瘤11基因扩增出来，物理超声随机打断，物理超声随机打断是采用物理方法将其扩增好的产物超声打断为90-250bp的片段，然后切取100-200bp片段进行胶回收，以获得目的条带，生物素进行标记，生物素标记是对目的条带进行生物素标记，进而用链霉亲和素磁珠进行纯化，以获得生物素标记的肿瘤11基因捕获探针，链霉亲和素磁珠纯化，获得的捕获探针对构建好的文库进行捕获，上机测序，生物信息学分析。
实施例五：
在实施例四中，再加上下述工序：
捕获是用制备好的肿瘤11基因捕获探针对基因组文库进行捕获，并上机测序，进行生物信息学分析。
扩增肿瘤11基因的目的片段，扩增肿瘤11基因时选用67对特异性引物，将肿瘤11基因扩增出来，物理超声随机打断，物理超声随机打断是采用物理方法将其扩增好的产物超声打断为90-250bp的片段，然后切取100-200bp片段进行胶回收，以获得目的条带，生物素进行标记，生物素标记是对目的条带进行生物素标记，进而用链霉亲和素磁珠进行纯化，以获得生物素标记的肿瘤11基因捕获探针，链霉亲和素磁珠纯化，获得的捕获探针对构建好的文库进行捕获，捕获是用制备好的肿瘤11基因捕获探针对基因组文库进行捕获，并上机测序，进行生物信息学分析。
提取人全血基因组DNA：
共67个片段中64个扩增，为保证模板全面性，选择二十人的血液基因组DNA混合，作为PCR扩增的模板。使用诺维赞的TaqDNAPolymerase（P101-01）进行扩增，体系如下表（50μl）：
| 试剂 | 体积μl |
| 10xPCRBuffer | 5 |
| dNTPs | 1 |
| F/R(10μmol/L) | 2 |
| TAQ | 0.5 |
| 全血基因组DNA | 1 |
| 去离子水 | 38.5 |
PCR反应条件：
64对引物延伸时间和TM分别为：
1、2、7、8、9、10、11、12、13、15、16、17、18、19、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、44、45、46、47、51、53、55、62、63、64：延伸时间20s，TM为55℃；
52、56、65：延伸时间20s，TM为58℃；
3、14、20、50：延伸时间20s，TM为62℃；
43、66：延伸时间30s，TM为55℃；
6、21、24、54：延伸时间30s，TM为62℃；
4、23、48、61：延伸时间1min10s，TM为62℃；
57、58、60：延伸时间2min，TM为59℃；
59：延伸时间2min，TM为62℃；
49：延伸时间3min，TM为62℃。
67对中3对引物（5a、5b、22）使用翊胜2×HieffPCRMasterMix（2×HieffPCRMasterMix）进行扩增，体系如下表（50μl）：
| 试剂 | 体积μl |
| 模板DNA | 1 |
| 引物1 | 2 |
| 引物2 | 2 |
| 2×HieffPCRMasterMix | 25 |
| 去离子水 | 20 |
PCR反应条件：
22延伸时间15s，TM为62；
5a、5b延伸时间30s，TM为62。
PCR产物琼脂糖凝胶电泳后进行回收：
产物用0.8％琼脂糖凝胶电泳分离，切下目的片段，放入1.5ml离心管中，再按照DNA胶回收试剂盒（omega货号：D2500-01）说明操作：a.根据胶块大小加入约400μlbindingbμffer，55-60度水浴5-10min，期间每3min将离心管上下颠倒混匀，直至胶块完全融化；b.将a中液体转移到吸附柱中，16000g离心1min，弃置收集管中的废液；c.向吸附柱中加入300μlbindingbμffer，再次放入离心机中16000g离心1min，弃置收集管中的废液；d.向吸附柱中加入700μlwashbμffer，16000g离心1min，弃置收集管中的废液；e.将吸附柱放入离心机中16000g空离2min，彻底去除washbμffer；f.将吸附柱转移至一个新的1.5ml离心管中，向吸附柱膜中央加入15-30μlddH2O，室温放置2min后，16000g离心1min，得到胶回收产物。
片段化：
将回收的PCR产物按片段大小分为9个区段：124-230bp，241-260bp，280-295bp，321-349bp，351-370bp，390-421bp，488-546bp，700-900bp，1000-3046bp，其中124-230bp无需打断，其余8个区段按照摩尔比1:1:1进行加样，补水至50ul后，分别使用超声打断器将其打断为90-250的片段。
超声片段化产物0.8％琼脂糖凝胶电泳，切取120-220bp片段的胶块，用omega试剂盒进行胶回收（步骤同2），再按照每个区段覆盖的总长度，计算摩尔数，根据摩尔比1：1：1加样，按照下述罗氏生物素标记试剂盒进行生物素连接。
加生物素标记：
取产物16μL，100℃变性5min后，迅速插入冰上；完全冷却后，加入4μLBiotin-highprime，充分混匀，37℃孵育20h，65℃加热10min使变性。
使用链霉亲和磁珠纯化生物素探针：
链霉亲和素磁珠清洗：
（1）将链霉亲和磁珠（DynabeadsM-270Streptavidinbeads）取出，并室温平衡至少30min；
（2）涡旋15s使磁珠充分混匀；
（3）将适量体积的磁珠置于新的1.7ml的低吸附管中，一次纯化需加100μL亲和素包被的磁珠（一管中最多加600μl磁珠）；
（4）将管子置于磁力架上，使磁珠与上清完全分离；
（5）弃上清，尽量避免吸到磁珠；
（6）每100μl起始量的磁珠加入200μl1×beadwashbμffer，涡旋震荡10s后置于磁力架上，待上清澄清，移除上清；
（7）重复步骤6一次；
（8）加入100μl1×beadwashbμffer，涡旋混匀；
（9）转移100μl重悬的磁珠到0.2ml的低吸附管中；
（10）将管置于磁力架上，待上清澄清后吸除上清（少量washbμffer残留不影响实验结果）。
链霉亲和素磁珠纯化探针：
将生物素标记探针产物加入到亲和素包被的磁珠中，震荡混匀后瞬离，65℃孵育1h（热盖温度设置为75℃），期间每间隔12min涡旋混匀样本3s，在涡旋震荡器正中涡旋（涡旋时略加力压紧，震荡速度调至中速，这样可避免液体四处飞散后的离心步骤），弃上清(此时生物素标记的DNA片段结合在亲和素包被的磁珠上)。
50μL1.25M的NaOH洗涤3次，涡旋震荡，瞬离后置于磁力架上，待上清澄清后吸除上清。（去掉未标记的DNA单链，此时亲和素包被的磁珠上结合的是生物素标记的DNA单链）100μL去离子甲酰胺重悬磁珠（使DNA变性：它可使碱基间形成H键），金属浴中95度孵育10min。使标记生物素的DNA单链与亲和素分离。吸取上清转移到一个新的管中，上清即为获得的生物素标记的探针。
使用DNA纯化试剂盒纯化上述DNA，获得生物素标记的DNA探针。
探针稀释及捕获上机：
将探针稀释到1nM作为工作液，对构建好的文库进行捕获，并上机测序。
生物信息学分析：
下机数据质控：
数据下机后，得到原始下机数据，称之为RawData。首先用软件fastqc对RawData进行检测，主要统计和查看数据量、adapter、碱基分布、GC含量等信息；之后用软件trimmomatic-0.36对RawData进行去除adapter、去除低质量数据、去除N含量较高的数据等，并得到CleanData；然后，用软件fastqc对CleanData进行检测，主要统计和查看数据量、adapter、碱基分布、GC含量等信息；最后，用内部程序统计和比较质控前后数据信息，主要包括数据量、Reads数、Reads长度、Q20、Q30、GC含量等，对于质控合格的数据，进行下游分析。
质控合格数据比对：
对质控合格数据（CleanData），用软件BWA，以人类基因组hg19为参考，进行比对，并用内部程序进行比对信息统计，主要包括比对率、重复率、插入片段大小、比对质量值、覆盖度、平均测序深度等信息。
探针捕获率统计和分析：
根据探针目标区域，用bedtools、samtools以及内部程序，对目标区域进行捕获情况统计和分析，主要包括上靶率、目标区域覆盖度、目标区域平均测序深度等信息。
引物信息（SEQIDNO.1-67）
| 编号 | 基因 | F | R | 长度 |
| 1 | ALK-1 | ATCCCGAAGTCTCCAATCTTG | GAAATATAGGGAAGGGAAGGAAC | 196 |
| 2 | ALK-2 | AGGCTGCCCACTCTTGCT | CTTTGTATCCTGTTCCTCCCAG | 291 |
| 3 | ALK-3 | GGACAACACGATTTCCCT | GGTGTATGAAGGCCAGGTG | 340 |
| 4 | ALK-4 | TTGCCAGCAAAGCAGTAG | AGGGACAGGATAATAGGAGC | 1365 |
| 5a | ALK-5a | CGAGCACGTAGTAACCATGC | TGGGACCTGTCTTCCAGTGT | 870 |
| 5b | ALK-5b | GGGCAGAGGTCACCACAGA | CGCTTCCCAGGTTCAAACAAT | 906 |
| 6 | ALK-6 | GGCAACAACAGTGAAACTCC | AAGCCACAAGGTCATCTGC | 536 |
| 7 | BRAF-1 | GACTCTAAGAGGAAAGATGAAGTAC | TAGTAACTCAGCAGCATCTCAG | 331 |
| 8 | BRAF-2 | GAGTGATGATTGGGAGATTCC | GTCACAATGTCACCACATTACATAC | 124 |
| 9 | EGFR-1 | CAGGATTCCAAACCATGG | CAATGAGCAGTCCACTGC | 241 |
| 10 | EGFR-2 | TTCAACTGGGCGTCCTAG | GGTGGAATTGAGTGACAAGC | 370 |
| 11 | EGFR-3 | GGACCCTGCTTTACGATG | TGCTTCCAACGAAACCAC | 351 |
| 12 | EGFR-4 | ACGAAGCCACGTGCAAGGA | ACAGGGTCGCCTCCTCCAA | 259 |
| 13 | EGFR-5 | GCCTGAACATAACATCCTTGG | AAGGACCCATTAGAACCAACTC | 225 |
| 14 | EGFR-6 | GCTTTCCCCACTCACACACAC | CCAGACCAGGGTGTTGTTTTC | 208 |
| 15 | EGFR-7 | GGCGTACATTTGTCCTTCC | GTTTCCCAAACACTCAGTGAAAC | 416 |
| 16 | EGFR-8 | AATATCAGCCTTAGGTGCGG | ATGTGGAGATGAGCAGGGTCTAG | 349 |
| 17 | EGFR-9 | TCCCACTGCATCTGTCACTTC | TCCCTTCCCTGATTACCTTTG | 399 |
| 18 | EGFR-10 | AATGGTCAGCAGCGGGTTAC | GTCCCTGGTGTCAGGAAAATG | 397 |
| 19 | ERBB2-1 | CACGGTAATGCTGCTCATGG | AGGGCTTGCTGCACTTCTC | 181 |
| 20 | ERBB2-2 | TTTCGGAACCCGCACCA | TGCAGTGAGGAGGAAGGGA | 418 |
| 21 | ERBB2-3 | CCCTTCCGACTTCCCTTTC | CATCAGAACTGCCGACCAC | 533 |
| 22 | ERBB2-4 | ACGCTCTTCTCACTCATATCCTC | CGCTTGTAATCCCAGCTACTCA | 390 |
| 23 | ERBB2-5 | GTCCAGGCTGGTACTTTGAGC | TCCCTCCCTTCACATGCTG | 914 |
| 24 | ERBB2-6 | TGGCTGAAGACCCCAGAG | AGGTGACAGTTGAGGGAACAT | 698 |
| 25 | KRAS-1 | AGTGTTACTTACCTGTCTTGTC | TTGTGTTACTAATGACTGTGCTAT | 216 |
| 26 | KRAS-2 | CTCATGTACTGGTCCCTCATTG | AAGGTGCACTGTAATAATCCAGAC | 150 |
| 27 | KRAS-3 | GAAACCCAAGGTACATTTCAG | GGTACTGGTGGAGTATTTGA | 349 |
| 28 | MAP2K1-1 | TACTTCTTTGGGTTGACTTCTCTGG | AATCAGTCTTCCTTCTACCCTGGTC | 357 |
| 29 | MAP2K1-2 | CTTAACCTGTTTCTCCTCCC | CCTCCCAGACCAAAGATTAG | 343 |
| 30 | MET-1 | TAATTTGGCAGTTGGAGAGG | TGAAAGCGACAGAATAAACCC | 295 |
| 31 | MET-2 | GCACTAGCAAAGTCCGAGAT | TGTTGACGCTGCCACAG | 328 |
| 32 | MET-3 | TTCCTACATGGAAATGCCTC | CCCTATTAAAGCAGTGCTCA | 335 |
| 33 | MET-4 | GTTACCGTGAAGATCCCATTG | CAAACTACACTCAGAACCTGA | 230 |
| 34 | MET-5 | ATAAAGTTGCTATGGATGTTGCC | TTTCCAGTACATTTTCATTGCCC | 280 |
| 35 | MET-6 | GTGGCTGAAAAAGAGAAAGC | CACAACCCACTGAGGTATATG | 421 |
| 36 | MET-7 | CGACAAGTGCAGTATCCTCTG | AGCTGAGTGGAAATACTTACCTC | 216 |
| 37 | MET-8 | CCAAGTTCTTTCTTTTGCACAGG | CAAGGGGAAAGTGTAAATCAACG | 198 |
| 38 | MET-9 | GTCAATAGAGGCCAGATGAAATAC | AAGAGGAGAAACTCAGAGATAACC | 342 |
| 39 | MET-10 | ACTTGAACAGTAACCTACTCG | AGGTAGATGCTGTAATTGCTG | 321 |
| 40 | PIK3CA-1 | GAAAGGGACAACAGTTAAGC | CCCCCAAGAATCCTAGTAGA | 366 |
| 41 | PIK3CA-2 | CCATCTGAAAACATACTACAGG | CCCCCTTAATCTCTTACAGT | 369 |
| 42 | PIK3CA-3 | CACATAAGGGTTCTCCTCCA | ATCTGAACAAAAATTCCGTGG | 149 |
| 43 | PIK3CA-4 | TGCTCTTCAATCACTGACAT | GAAAAAGGAAAGAATGGGCT | 488 |
| 44 | PIK3CA-5 | TAATGTGCCAACTACCAATG | ATCATCTGTGAATCCAGAGG | 407 |
| 45 | PIK3CA-6 | ACACAAACTAGAGTCACACA | ACTCATGGTGGTTTTGTTTC | 364 |
| 46 | PIK3CA-7 | CTTGTCCATCGTCTTTCACC | GCACCCTGTTTTCTTTTCTC | 196 |
| 47 | PIK3CA-8 | CAATTCCTATGCAATCGGTC | CAGGAGATGTGTTACAAGGC | 358 |
| 48 | RET-1 | TGTGCCGAACTTCACTACATGG | ACACCTGCCTGTTGGGGAG | 825 |
| 49 | RET-2 | GCTATGGCACCTGCAACTGCT | TCCAAATTCGCCTTCTCCTAGAGT | 3046 |
| 50 | RET-3 | CTTCAAAGATGTGTGTGGC | CAACACCCACACTTACACAT | 245 |
| 51 | TP53-1 | CTCCTCTGTTGCTGCAGATCC | AGGAAGGGGCTGAGGTCACT | 149 |
| 52 | TP53-2 | AAGGGTGGTTGGGAGTAGATG | GAAAGAGGCAAGGAAAGGTGA | 324 |
| 53 | TP53-3 | GTGTTATCTCCTAGGTTGGC | TGGAGTCTTCCAGTGTGATG | 123 |
| 54 | TP53-4 | TGGGTTGCAGGAGGTGCTTAC | GCCACTGACAACCACCCTTAAC | 546 |
| 55 | TP53-5 | TGCTCTTTTCACCCATCTAC | CATTGAAGTCTCATGGAAGC | 342 |
| 56 | TP53-6 | TTGGAAGTGTCTCATGCTGG | TCCAATGGATCCACTCACAG | 162 |
| 57 | ROS1-1 | GAGTAGTAGCTGCAAATAATCTAGG | GCCCTTGCAAGTAGTTTTATC | 2221 |
| 58 | ROS1-2 | CAAGGGCACCAACTTTTAGG | AGTGGTCTGCCCTAGTTGTA | 2141 |
| 59 | ROS1-3 | TACAACTAGGGCAGACCACT | TGTGTCAAGGAGTTCGAAGA | 2123 |
| 60 | ROS1-4 | GGGGTTGATCTTCTCGTGG | TCAGCTTTCTCCCACTGTATTG | 2155 |
| 61 | ROS1-5 | GTGGACACCCTTGTCTTGTAC | CTCAAATCGTCACCCTAACATC | 1053 |
| 62 | ROS1-6 | AGTTTGAAGTCAGGTAGCATGATGC | CCCATGGACAGGAATAATGAGTATC | 219 |
| 63 | ROS1-7 | TAGTTGCCATTCTGACTCGC | GAAAAAGACAGACAACCCCATC | 176 |
| 64 | ROS1-8 | TGACTTCCAGCTTCATCCATG | CATACCCAAAGGAGTATAAATCACT | 219 |
| 65 | ROS1-9 | GGAGGGAAAATGCTCCAAAAC | TATACCTATGTAACAACCCTGCACG | 247 |
| 66 | ROS1-10 | TGGTGGTTTATAAGACGGGA | GGTTCTAGATCTTTGTTCCTTCC | 509 |
本发明提出的探针制备方法不仅克服了以往合成探针成本昂贵时间周期长的问题，而且制备方法简单，制备时间周期短，几天即可完成，极大的节约探针合成的时间，通过制备的基因肿瘤11基因探针用于检测中，绕过传统杂交捕获探针的合成方法，降低合成过程中所需要的成本问题，这种探针不仅克服了上述合成探针成本过大的问题，而且制备简单，且制备时间很短，几天即可制备完成，极大的节约探针合成的时间，从而解决了现有技术从定制到获得杂交捕获探针往往需要几个月，这不仅增加了制备成本，而且耗费了很多时间的问题。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (6)
1.一种自制探针检测肿瘤11基因的技术，其特征在于：包括如下步骤：扩增肿瘤11基因的目的片段，物理超声随机打断，生物素进行标记，链霉亲和素磁珠纯化，获得的捕获探针对构建好的文库进行捕获，上机测序，生物信息学分析。
2.根据权利要求1所述的一种自制探针检测肿瘤11基因的技术，其特征在于：所述扩增肿瘤11基因时选用67对特异性引物，将肿瘤11基因扩增出来。
3.根据权利要求1所述的一种自制探针检测肿瘤11基因的技术，其特征在于：所述物理超声随机打断是采用物理方法将其扩增好的产物超声打断为90-250bp的片段，然后切取100-200bp片段进行胶回收，以获得目的条带。
4.根据权利要求1所述的一种自制探针检测肿瘤11基因的技术，其特征在于：所述生物素标记是对目的条带进行生物素标记，进而用链霉亲和素磁珠进行纯化，以获得生物素标记的肿瘤11基因捕获探针。
5.根据权利要求1所述的一种自制探针检测肿瘤11基因的技术，其特征在于：所述捕获是用制备好的肿瘤11基因捕获探针对基因组文库进行捕获，并上机测序，进行生物信息学分析。
6.根据权利要求1所述的一种自制探针检测肿瘤11基因的技术，其特征在于：所述制备好的探针用于高通量测序中肿瘤11基因进行检测，检测方法包括如下步骤：
（1）提取基因组DNA或血液游离cfDNA；
（2）将提取好的DNA进行随机打断；
（3）利用相关文库构建试剂盒进行文库构建；
（4）对构建好的文库进行质控；
（5）用制备好的肿瘤11基因探针对质控好的文库进行捕获；
（6）采用二代测序仪，如IonTorrent平台或Illμmina平台的相关测序仪进行上机测序；
（7）采用相关软件对测序结果进行生物信息学分析。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201811426675.7A CN109486925A (zh) | 2018-11-27 | 2018-11-27 | 一种自制探针检测肿瘤11基因的技术 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201811426675.7A CN109486925A (zh) | 2018-11-27 | 2018-11-27 | 一种自制探针检测肿瘤11基因的技术 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN109486925A true CN109486925A (zh) | 2019-03-19 |
Family
ID=65697874
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201811426675.7A Withdrawn CN109486925A (zh) | 2018-11-27 | 2018-11-27 | 一种自制探针检测肿瘤11基因的技术 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN109486925A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110240999A (zh) * | 2018-03-09 | 2019-09-17 | 林云富 | 一种提高循环肿瘤dna检出率的检测装置及方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104278022A (zh) * | 2014-09-12 | 2015-01-14 | 中国人民解放军第四军医大学 | 一种dna捕获探针的制备方法及应用 |
| CN105647907A (zh) * | 2016-03-04 | 2016-06-08 | 杭州联川生物技术有限公司 | 一种用于靶向杂交捕获的修饰性dna杂交探针的制备方法 |
| CN106283199A (zh) * | 2016-08-27 | 2017-01-04 | 大连晶泰生物技术有限公司 | 检测肿瘤相关的50个热点突变基因的捕获文库和试剂盒 |
| US20180119216A1 (en) * | 2016-10-28 | 2018-05-03 | Grail, Inc. | Methods for single-stranded nucleic acid library preparation |
-
2018
- 2018-11-27 CN CN201811426675.7A patent/CN109486925A/zh not_active Withdrawn
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104278022A (zh) * | 2014-09-12 | 2015-01-14 | 中国人民解放军第四军医大学 | 一种dna捕获探针的制备方法及应用 |
| CN105647907A (zh) * | 2016-03-04 | 2016-06-08 | 杭州联川生物技术有限公司 | 一种用于靶向杂交捕获的修饰性dna杂交探针的制备方法 |
| CN106283199A (zh) * | 2016-08-27 | 2017-01-04 | 大连晶泰生物技术有限公司 | 检测肿瘤相关的50个热点突变基因的捕获文库和试剂盒 |
| US20180119216A1 (en) * | 2016-10-28 | 2018-05-03 | Grail, Inc. | Methods for single-stranded nucleic acid library preparation |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| JOSHUA V. PENALBA ET AL.: "Sequence capture using PCR‐generated probes:a cost-effective method of targeted high-throughput sequencing for nonmodel organisms", 《MOLECULAR ECOLOGY RESOURCES》 * |
| TOMISLAV MARICIC ET AL.: "Multiplexed DNA Sequence Capture of Mitochondrial Genomes Using PCR Products", 《PLOS ONE》 * |
| 戴五敏，韩晓红: "《中国肿瘤内科进展 中国肿瘤医师教育 2016版》", 31 July 2016 * |
| 翟玉龙等: "一种新的线粒体基因组DNA捕获探针的制备及初步应用", 《现代生物医学进展》 * |
| 黄建锋肖华胜: "目标序列捕获技术及其应用", 《生物产业技术》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110240999A (zh) * | 2018-03-09 | 2019-09-17 | 林云富 | 一种提高循环肿瘤dna检出率的检测装置及方法 |
| CN110240999B (zh) * | 2018-03-09 | 2022-09-06 | 浙江品级基因科技有限公司 | 一种提高循环肿瘤dna检出率的检测装置及方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN105087789B (zh) | 一种检测血浆cfDNA中BCR和TCR免疫组库的方法 | |
| CN106676182A (zh) | 一种低频率基因融合的检测方法及装置 | |
| CN105063032A (zh) | 一种基于高通量测序构建白血病微小残留病灶bcr文库的多重pcr引物和方法 | |
| CN107619857B (zh) | 一种检测肉牛klf8基因cnv标记的方法及其应用 | |
| CN105154440A (zh) | 一种基于高通量测序构建白血病微小残留病灶tcr文库的多重pcr引物和方法 | |
| CN108753954B (zh) | 痴呆相关基因的捕获探针组、试剂盒、文库构建方法和用途 | |
| CN105132407B (zh) | 一种脱落细胞dna低频突变富集测序方法 | |
| CN106399535A (zh) | 一种高通量测序检测无创亲子鉴定的方法 | |
| US20130189684A1 (en) | Quantification of cell-specific nucleic acid markers | |
| CN110656157B (zh) | 用于高通量测序样本溯源的质控品及其设计和使用方法 | |
| CN105734679B (zh) | 核酸靶序列捕获测序文库的制备方法 | |
| CN105926043A (zh) | 一种提高孕妇血浆游离dna测序文库中胎儿游离dna占比的方法 | |
| CN104598773B (zh) | 基于RAD-seq开发濒危羊踯躅SSR引物的方法 | |
| CN111662981A (zh) | 一种基于二代测序探针捕获方法的癌症的基因检测试剂盒 | |
| CN104789687A (zh) | 用于多基因捕获测序的探针制备方法 | |
| CN108192893B (zh) | 基于转录组测序开发艾纳香ssr引物的方法 | |
| CN108315404A (zh) | 确定胎儿beta地中海贫血基因单体型的方法及系统 | |
| CN108192964A (zh) | Hla-c全长基因分型试剂盒 | |
| CN109913539A (zh) | 一种靶向捕获hla基因序列并测序的方法 | |
| CN105925680B (zh) | 一种四倍体马铃薯高通量测序开发标记的方法及其应用 | |
| CN109486925A (zh) | 一种自制探针检测肿瘤11基因的技术 | |
| CN108060237A (zh) | 基于55个y染色体snp遗传标记的法医学复合检测试剂盒 | |
| CN106755486A (zh) | 无创产前胎儿β 型地贫基因突变检测文库构建方法、检测方法和试剂盒 | |
| CN107603971A (zh) | 一种原位杂交探针的制备方法 | |
| CN109207600A (zh) | 鉴定生物样本间亲缘关系的方法和系统 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20200120 Address after: 210032 5 floors of Building C, Phase II, Zhongdan Eco-life Science Industrial Park, 3-1 Xinjinhu Road, Jiangbei New District, Nanjing City, Jiangsu Province Applicant after: Nanjing Jiliang Biotechnology Co., Ltd. Address before: Room 507-511, Block A, Zhongdan Eco-life Science and Technology Industrial Park, 3-1 Xinjinhu Road, Nanjing High-tech Zone, Jiangsu Province Applicant before: Jiangsu Su Bo biomedical science and technology Nanjing Co., Ltd. Applicant before: Jiangsu biomedical Limited by Share Ltd |
|
| TA01 | Transfer of patent application right | ||
| WW01 | Invention patent application withdrawn after publication |
Application publication date: 20190319 |
|
| WW01 | Invention patent application withdrawn after publication |