CN108192964A - Hla-c全长基因分型试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种HLA‑C全长基因分型试剂盒,包括HLA‑C基因特异性PCR扩增引物和基因外显子测序引物;HLA‑C基因特异性PCR扩增引物如SEQ ID NO.1~2所示;基因外显子测序引物包括HLA‑C基因的1、2、3、4、5、6号外显子的测序引物,如SEQ ID NO.3~12所示。一种进行HLA基因分型的方法:提取样本DNA;利用扩增引物进行扩增,利用基因外显子测序引物进行测序,并与标准序列进行对比,确定HLA基因的型别。本发明的方法能大大提高配型效果,还可发现新的等位基因,在检测通量、数据质量、成本控制等方面都有质的飞跃。该试剂盒适用于一代Sanger测序平台,还兼容二代测序平台和三代测序平台。
Description
技术领域
本发明涉及一种基因的特异性引物及利用该引物进行基因分型的方法和试剂盒,特别是 涉及一种HLA(人类白细胞抗原)基因C位点全长特异性引物及利用该引物进行HLA分型的方 法和试剂盒。
背景技术
人类白细胞抗原(HLA)基因位于人类第6号染色体短臂,是目前发现的人体多态性最高的 基因。HLA基因分成三类:I类、II类和III类基因。
HLA系统是目前所知人体最复杂的多态系统。自1958年发现(Jean Dausset)第一个HLA 抗原,到20世纪70年代,HLA便成为免疫遗传学、免疫生物学和生物化学等学科的一个重 要新兴研究领域。现在,已基本弄清其系统的组成、结构和功能,闸明了其理化性质和生物 学作用。这些研究成果不仅具有重要的理论意义,而且具有巨大的生物医学价值。
随着医学的发展,像白血病、地中海贫血等能用最新的基因技术进行分型检测,再寻找 合适的供体进行移植治疗。目前通过HLA高分辨分型的外周血干细胞移植技术能大大提高配 型效果,使患者的康复更快,更有保征。
目前国际上对HLA-C基因分型的方法有PCR-SSP(序列特异引物聚合酶链式反应),PCR-SSO(聚合酶链式反应寡核苷酸探针杂交)以及PCR-SBT(聚合链式反应产物直接测序分型)。其中,SSP法需要设计出一整套基因特异性引物,通过PCR技术获得特异性产物,通过电泳分析决定HLA-C基因型别;其缺点是不易、不能检测新的等位基因;试剂盒需不断升级;检测的信号也只说模拟的信号,不直观可靠。SSO法的原理设计HLA基因型别特异的寡核苷酸序列作为探针,对PCR产物进行标记,以PCR产物与探针进行杂交;通过检测信号判断HLA-C 基因型别;但该方法的缺点是不能检测新的等位基因,分辨率不高,检测信号为模拟信号。 SBT法是一种通过对扩增后的DNA进行核酸序列测序,从而判断HLA-C基因型别的方法;该 方法是一种最直观、最准确的方法,可广泛用于HLA-C基因的高分辨分型检测,但是该方法 对扩增过程的引物序列要求很高,引物序列直接关系到整个型别的确定,一对好的特异性引 物是该方法成功的关键。
因此,为改变目前落后的HLA-C基因分型方法,需研发一种更加有效,且在检测通量、 数据质量、成本控制等方面,更有优势的方法。
发明内容
针对上述现有技术,本发明提供了一种HLA-C基因特异性PCR扩增引物,及利用该引物 进行HLA-C分型的方法和试剂盒。利用该试剂盒,能快速、简便地确定HLA-C基因分型。通 过本发明的HLA-C分型方法能大大提高配型效果,使患者的康复更快,更有保征。由于该方 法应用测序技术,只需通过一次实验就能够确定HLA分型,并一次性达到HLA分型的最高分 辨率,同时,还可发现新的等位基因,在检测通量、数据质量、成本控制等方面都有质的飞 跃。该试剂盒不仅适用于一代Sanger测序平台,还兼容二代测序平台(Illumina miseq,miniseq,hiseq及Ion Proton,Ion S5)和三代测序平台(PacBio Sequel)。
本发明是通过以下技术方案实现的:
一种HLA-C全长基因分型试剂盒,包括HLA-C基因特异性PCR扩增引物和基因外显子测 序引物;
所述HLA-C基因特异性PCR扩增引物是用于扩增HLA-C基因的引物序列,由该引物序列 经PCR扩增所得到的产物的片段大小为3300bp;其序列如下所示(序列方向均为5'to3'):
HLA_CF:TTCTGGAAAGTTCTCAGGTC;
HLA_CR:TCCGCAGTCCCGGTT。
所述基因外显子测序引物,是由上述HLA-C基因特异性扩增得到的HLA-C基因扩增产物 的基因外显子测序引物,包括HLA-C基因的1、2、3、4、5、6号外显子的测序引物,其序列如下所示:
HLA-C1F:TCTCCCCAGACGCCGAGAT;
HLA-C1R:ACTTCATGGAGTGGGAGC;
HLA-C2F:GAGGGTCGGGCGGGTCTC;
HLA-C2R:GGGCCGTCCGTGGGGGAT;
HLA-C3F:GCGGGGCCAGGGTCTCACA;
HLA-C3R:CTCCCCACTGCCCCTGGTC;
HLA-C4F:GCAAGAGAGAAGCAAAGT;
HLA-C4R:TTCCCTGAGAAGACACATC;
HLA-C5F:GTCAGGGCCCCTCACC;
HLA-C6F:AGGAGGTTCCCCTAAG。
上述序列如表1所示,如SEQ ID NO.1~12所示。
表1
扩增引物名 | 5’---3’ |
HLA_CF | TTCTGGAAAGTTCTCAGGTC |
HLA_CR | TCCGCAGTCCCGGTT |
测序引物名 | 5’---3’ |
HLA-C1F | TCTCCCCAGACGCCGAGAT |
HLA-C1R | ACTTCATGGAGTGGGAGC |
HLA-C2F | GAGGGTCGGGCGGGTCTC |
HLA-C2R | GGGCCGTCCGTGGGGGAT |
HLA-C3F | GCGGGGCCAGGGTCTCACA |
HLA-C3R | CTCCCCACTGCCCCTGGTC |
HLA-C4F | GCAAGAGAGAAGCAAAGT |
HLA-C4R | TTCCCTGAGAAGACACATC |
HLA-C5F | GTCAGGGCCCCTCACC |
HLA-C6F | AGGAGGTTCCCCTAAG |
注:引物名称中的“F”和“R”分别表示引物的上游和下游。
进一步地,该试剂盒还包括常规的PCR扩增所需试剂。
一种进行HLA基因分型的方法(非诊断目的),包括以下步骤:
1)提取样本DNA;
2)利用上述HLA基因特异性PCR扩增引物,对样本DNA进行PCR扩增,纯化,得到纯化后的HLA基因扩增产物;
3)利用上述基因外显子测序引物,对纯化后的HLA基因扩增产物进行测序PCR扩增,纯 化,得到纯化后的测序扩增产物;
4)对纯化后的测序扩增产物进行HLA基因的外显子测序,并与HLA基因的外显子标准序 列进行对比,确定HLA基因的型别。
进一步地,所述步骤4)中,确定HLA基因的型别的操作步骤为:得到的测序结果与数据 库中的标准序列进行对比,来确定HLA-C基因的型别;所述数据库为国际组织IMGT数据库 (http://www.ebi.ac.uk/imgt/)。
本发明的测序过程中,以ABI公司Big Dye Terminator V3.1为主要试剂(含有dNTP、 ddNTP和荧光素),用纯化后的PCR扩增产物为模板,加入特异性测序引物进行循环扩增。HLA-C 基因检测常规位点为C(exon2F/R、exon3F/R、exon4F),非常规位点及引物扩增可根据需要 进行检测。测序扩增产物经过乙醇-EDTA-Na2沉淀纯化处理后,用去离子甲酰胺溶解变性, ABI3730XL测序仪毛细管电泳并自动对结果进行分析处理,获得所需片段碱基序列并以4色 峰图形式呈现。
通过本发明设计优化后的基因引物能高效扩增出相应的基因片段,因此,为后续的基因 分型奠定基础。较目前HLA-SBT方法所扩增出的片段来看,由本发明设计优化后的引物条带 具有更加单一、无杂带等优良特点。
本发明的改进的HLA-C基因分型方法(PCR-SBT分型方法),可以扩增出待测的HLA-C全 长。运用该方法,只需通过一次实验就能够读取大量样本的HLA序列数据,并一次性达到HLA 分型的最高分辨率,同时还可发现新的等位基因,以及在测序结果方面,与以前方法相比, 峰图质量等有较大的改善,从而对型别的判定更加合理和准确。因此,本发明在检测通量、 数据质量、成本控制等方面都有质的飞跃。应用这种新技术进行高分辨配型,本发明得到的 数据更加可靠、真实。
另外,与传统方法相比,由于使用本发明的方法和扩增引物能够将HLA-C全长基因扩增 出来,因此在接下来的分型过程中,能够避免当某些等位基因的核苷酸位于扩增区域之外时 无法分型的问题。
附图说明
图1:C全长基因分型试剂盒研发策略示意图。
图2:HLA-C基因的扩增产物示意图。
图3:小批量验证实验示意图(27个样本)。
图4:小批量验证实验示意图(32个样本)。
图5:大批量验证实验示意图(96个样本)。
图6:大批量验证实验示意图(96个样本)。
图7:C1R扩增产物测序结果。
图8:C2F扩增产物测序结果。
图9:C2R扩增产物测序结果。
图10:C3F扩增产物测序结果。
图11:C3R扩增产物测序结果。
图12:C4F扩增产物测序结果。
图13:C5F扩增产物测序结果。
图14:C6F扩增产物测序结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等,若无特别说明,均为现有技术中已有的常 规仪器、试剂、材料等,可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法,检测 方法等,若无特别说明,均为现有技术中已有的常规实验方法,检测方法等。
实施例
一种HLA-C全长基因分型试剂盒,包括HLA-C基因特异性PCR扩增引物和基因外显子测 序引物;其研发策略如图1所示。
所述HLA-C基因特异性PCR扩增引物是用于扩增HLA-C基因的引物序列,由该引物序列 经PCR扩增所得到的产物的片段大小为3300bp;其序列如下所示(序列方向均为5'to3'):
HLA_CF:TTCTGGAAAGTTCTCAGGTC;
HLA_CR:TCCGCAGTCCCGGTT。
所述基因外显子测序引物,是由上述HLA-C基因特异性扩增得到的HLA-C基因扩增产物 的基因外显子测序引物,包括HLA-C基因的1、2、3、4、5、6号外显子的测序引物,其序列如下所示:
HLA-C1F:TCTCCCCAGACGCCGAGAT;
HLA-C1R:ACTTCATGGAGTGGGAGC;
HLA-C2F:GAGGGTCGGGCGGGTCTC;
HLA-C2R:GGGCCGTCCGTGGGGGAT;
HLA-C3F:GCGGGGCCAGGGTCTCACA;
HLA-C3R:CTCCCCACTGCCCCTGGTC;
HLA-C4F:GCAAGAGAGAAGCAAAGT;
HLA-C4R:TTCCCTGAGAAGACACATC;
HLA-C5F:GTCAGGGCCCCTCACC;
HLA-C6F:AGGAGGTTCCCCTAAG。
上述序列如表1所示,如SEQ ID NO.1~12所示。
另外,该试剂盒还可包括:除引物外的其他PCR扩增所需试剂,除测序引物外的其他测 序扩增所需试剂。。
一种进行HLA基因分型的方法(非诊断目的),包括以下步骤:
1)提取样本DNA;
2)利用上述HLA基因特异性PCR扩增引物,对样本DNA进行PCR扩增,纯化,得到纯化后的HLA基因扩增产物(如图2所示);
3)利用上述基因外显子测序引物,对纯化后的HLA基因扩增产物进行测序PCR扩增,纯 化,得到纯化后的测序扩增产物;
4)对纯化后的测序扩增产物进行HLA基因的外显子测序,并与HLA基因的外显子标准序 列进行对比,确定HLA基因的型别。
进一步地,所述步骤4)中,确定HLA基因的型别的操作步骤为:得到的测序结果与数据 库中的标准序列进行对比,来确定HLA-C基因的型别;所述数据库为国际组织IMGT数据库 (http://www.ebi.ac.uk/imgt/)。
实验
小批量验证实验:选取27个样本进行C全长扩增实验,电泳图见附图3。
选取32个样本进行C全长扩增实验,电泳图见附图4。
电泳图目的条带单一明亮,扩增效果很好。验证结果与原结果一致。
大批量验证实验:选取2批大批量样本进行大批量验证实验,进行C全长基因分型及后 续实验,电泳图见附图5、图6。
两批大批量电泳扩增目的条带清晰单一明亮,扩增效果很好。大批量验证结果与原结果 一致,为了保证结果准确性,还需要选择特殊型别进行验证。
特殊型别验证实验:取特殊型别的44个已知样本按照本发明试剂盒方法进行C全长扩增 及后续上机测序,测序结果软件分型对比原结果均一致,见表2及图7~14。
表2
C全长试剂盒已排除漏型风险,测序结果与商业试剂盒结果一致,而且测序结果更精准。
给本领域技术人员提供上述实施例,以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方 案,而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权 利要求的范围内。本说明书引述的所有出版物、专利和专利申请通过引用并入本文,如同这 些出版物、专利和专利申请各自特别地和个别地表明通过引用并入本文。
序列表
<110> 银丰基因科技有限公司
银丰生物工程集团有限公司
<120> HLA-C全长基因分型试剂盒
<141> 2017-12-27
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
ttctggaaag ttctcaggtc 20
<210> 2
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
tccgcagtcc cggtt 15
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
tctccccaga cgccgagat 19
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
acttcatgga gtgggagc 18
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
gagggtcggg cgggtctc 18
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
gggccgtccg tgggggat 18
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
gcggggccag ggtctcaca 19
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
ctccccactg cccctggtc 19
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
gcaagagaga agcaaagt 18
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
ttccctgaga agacacatc 19
<210> 11
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
gtcagggccc ctcacc 16
<210> 12
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
aggaggttcc cctaag 16
Claims (6)
1.一种HLA-C全长基因分型试剂盒,其特征在于:包括HLA-C基因特异性PCR扩增引物和基因外显子测序引物;
所述HLA-C基因特异性PCR扩增引物序列如下所示:
HLA_CF:TTCTGGAAAGTTCTCAGGTC;
HLA_CR:TCCGCAGTCCCGGTT;
所述基因外显子测序引物,包括HLA-C基因的1、2、3、4、5、6号外显子的测序引物,其序列如下所示:
HLA-C1F:TCTCCCCAGACGCCGAGAT;
HLA-C1R:ACTTCATGGAGTGGGAGC;
HLA-C2F:GAGGGTCGGGCGGGTCTC;
HLA-C2R:GGGCCGTCCGTGGGGGAT;
HLA-C3F:GCGGGGCCAGGGTCTCACA;
HLA-C3R:CTCCCCACTGCCCCTGGTC;
HLA-C4F:GCAAGAGAGAAGCAAAGT;
HLA-C4R:TTCCCTGAGAAGACACATC;
HLA-C5F:GTCAGGGCCCCTCACC;
HLA-C6F:AGGAGGTTCCCCTAAG。
2.根据权利要求1所述的HLA-C全长基因分型试剂盒,其特征在于:所述试剂盒中还包括常规的PCR扩增所需试剂。
3.一种进行HLA基因分型的方法,其特征在于:包括以下步骤:
1)提取样本DNA;
2)利用上述HLA基因特异性PCR扩增引物,对样本DNA进行PCR扩增,纯化,得到纯化后的HLA基因扩增产物;
3)利用上述基因外显子测序引物,对纯化后的HLA基因扩增产物进行测序PCR扩增,纯化,得到纯化后的测序扩增产物;
4)对纯化后的测序扩增产物进行HLA基因的外显子测序,并与HLA基因的外显子标准序列进行对比,确定HLA基因的型别。
4.根据权利要求3所述的进行HLA基因分型的方法,其特征在于:所述数据库为国际组织IMGT数据库。
5.HLA-C基因特异性PCR扩增引物,其特征在于:序列如下所示:
HLA_CF:TTCTGGAAAGTTCTCAGGTC;
HLA_CR:TCCGCAGTCCCGGTT。
6.HLA-C基因外显子测序引物,其特征在于:C基因的1、2、3、4、5、6号外显子的测序引物,其序列如下所示:
HLA-C1F:TCTCCCCAGACGCCGAGAT;
HLA-C1R:ACTTCATGGAGTGGGAGC;
HLA-C2F:GAGGGTCGGGCGGGTCTC;
HLA-C2R:GGGCCGTCCGTGGGGGAT;
HLA-C3F:GCGGGGCCAGGGTCTCACA;
HLA-C3R:CTCCCCACTGCCCCTGGTC;
HLA-C4F:GCAAGAGAGAAGCAAAGT;
HLA-C4R:TTCCCTGAGAAGACACATC;
HLA-C5F:GTCAGGGCCCCTCACC;
HLA-C6F:AGGAGGTTCCCCTAAG。
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