CN105063231A - 一种羊水中胎儿细胞vhl基因突变检测方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种羊水中胎儿细胞VHL基因突变检测方法及试剂盒，涉及基因突变检测领域。包括：先对羊水中提取的胎儿细胞DNA进行母体遗传物质污染与否的检测；若不存在母体遗传物质污染，则直接进行VHL基因突变检测；若存在母体遗传物质污染，则对胎儿细胞进行培养传代后再进行VHL基因突变检测；所述基因突变检测包括：采用PCR直接测序法对所述DNA溶液进行VHL基因点突变、小片段缺失或插入和剪切位点突变的检测和采用通用引物荧光定量PCR法对所述DNA溶液进行VHL基因大片段缺失的检测。本发明方法可以快速准确的检测羊水中胎儿细胞的VHL基因突变；本发明提供的试剂盒成本低，检测快速，结果准确可靠。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测领域，尤其涉及一种周期短、操作简单的检测羊水中胎儿细胞VHL基因突变的检测方法。
背景技术
VHL基因(MIM编号608537)定位于3p25-26，全长10KD，包含三个外显子和两个内含子，可转录形成两种mRNA。包含三个外显子转录产物的mRNA翻译出p30(213个氨基酸)和p19(159个氨基酸)蛋白。p19是VHL基因第二转录起始位点(54号密码子)转录形成的异构体，与p30功能相似。
VHL基因突变方式多样，包括点突变、大片段缺失、小片段缺失或插入、剪切位点突变等。目前检测VHL基因突变最常用的方法是PCR直接测序，准确率为38％～80％，这是由于PCR测序检测技术只能检测点突变、小片段缺失或插入、剪切位点突变，不能检测VHL基因大片段缺失；对于VHL基因大片段缺失的检测，可以采用通用引物荧光定量PCR(UPQFM-PCR)法，目前，这些检测技术多用于外周血样本的检测，尚没有对羊水中胎儿细胞VHL基因突变的检测方法，这一方面是由于羊水穿刺获得的胎儿细胞数量相对于外周血细胞要少的多，因此，对于检测技术的准确性要求高，另一方面是羊水穿刺过程中可能出现母体遗传物质污染胎儿细胞DNA的情况，导致检测结果不准确，因此，胎儿细胞VHL基因突变的检测，需要完善的检测母体遗传物质污染和排除母体遗传物质污染的方法。因此，目前亟需一种准确率高、检测结果准确的羊水中胎儿细胞VHL基因突变的检测方法。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述技术问题，提供一种用于羊水中胎儿细胞VHL基因突变检测方法，该方法一方面可以准确检测和排除母体遗传物质污染，另一方面可以快速准确的判断羊水中胎儿细胞VHL基因是否存在突变，且检测成本低。
为实现本发明的目的，本发明提供以下技术方案：
1、一种用于羊水中胎儿细胞VHL基因突变检测方法。
2、一种用于检测羊水中胎儿细胞VHL基因突变的试剂盒。
为实现本发明的技术目的，本发明提供的一种羊水中胎儿细胞VHL基因突变检测方法包括：
通过提取羊水中胎儿细胞的DNA，获得DNA溶液；
对所述的DNA溶液进行母体遗传物质污染的检测，判断DNA溶液中是否存在母体遗传物质污染；
若判断DNA溶液中不存在母体遗传物质污染，则直接对羊水中胎儿细胞进行VHL基因突变检测；
若判断DNA溶液中存在母体遗传物质污染，则对羊水中胎儿细胞培养后进行VHL基因突变检测。
其中，所述VHL基因突变检测包括：
利用VHL基因的三个外显子E1、E2、E3和内参Bg的扩增引物和Univ通用引物对所述DNA溶液进行VHL基因大片段缺失的检测，获得所述DNA溶液中是否存在大片段缺失的检测结果。
其中，所述VHL基因突变检测还包括：
采用VHL基因的三个外显子VHL-1、VHL-2和VHL-3的扩增引物对所述DNA溶液进行VHL基因点突变、小片段缺失或插入、剪切位点突变的检测，获得所述DNA溶液中是否存在点突变、小片段缺失或插入、剪切位点突变的检测结果。
其中，所述母体遗传物质污染检测包括：
人工合成人类性别决定基因SRY和X染色体上的3个短串联重复序列DXS6797、DXS6807、AR的扩增引物对1-4：
利用所述引物对1-4和所述DNA溶液建立PCR扩增反应体系，进行PCR反应，得到PCR扩增产物；
对所述PCR扩增产物中的SRY基因扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，对所述PCR扩增产物中的DXS6797、DXS6807和AR基因的扩增产物进行STR分析，根据所述SRY基因扩增产物的电泳结果和STR分析结果判断所述DNA溶液中是否存在母体遗传物质污染；
特别是，所述人类性别决定基因SRY和X染色体上的3个短串联重复序列DXS6797、DXS6807、AR的扩增引物对1-4如SEQIDNo.1-8所示，分别为：
扩增引物对1：SRY-F：5’-gagtgaagcgacccatgaac-3’
SRY-R：5’-tcttgagtgtgtggctttcg-3’
扩增引物对2：DXS6797-F：5’-ttccctctctccctctgtct-3’
DXS6797-R：5’-acacacacccaaaaccagat-3’
扩增引物对3：DXS6807-F：5’-gagcaatgatctcatttgca-3’
DXS6807-R：5’-aagtaaacatgtataggaaaaagct-3’
扩增引物对4：AR-F：5’-tccagaatctgttccagagcgtgc-3’
AR-R：5’-gctgtgaaggttgctgttctccat-3’
其中，所述扩增引物对2中DXS6797-F引物的5’端标记FAM荧光；
其中，所述扩增引物对3中DXS6807-F引物的5’端标记FAM荧光；
其中，所述扩增引物对4中AR-F引物的5’端标记FAM荧光。
其中，扩增反应体系是：总体积为25μl，包括12.5μl的PCRmix、20-80ng的DNA模板、0.5μl的扩增引物和余量的ddH2O；扩增反应条件为：在95℃温度条件下预变性5min；95℃变性20s，SRY基因、DXS6797、DXS680755℃退火20s，AR58℃退火20s，72℃延伸20s，30个循环后72℃复性5min；4℃保存。
其中，所述利用VHL基因的三个外显子E1、E2、E3、内参Bg的扩增引物和Univ通用引物所述DNA溶液进行VHL基因大片段缺失的检测包括：
人工合成VHL基因的三个外显子E1、E2、E3和内参Bg的扩增引物对8-11：
利用所述引物对8-11和所述DNA溶液建立第一轮PCR扩增反应体系，进行第一轮PCR反应，获得VHL基因的三个外显子和内参的扩增产物；
人工合成VHL基因的三个外显子和内参在第二轮PCR中共用的Univ通用引物对12：
利用所述通用引物对12和所述第一轮PCR反应中VHL基因的三个外显子和内参的扩增产物建立第二轮PCR扩增反应体系并进行第二轮PCR扩增反应，得到带有荧光的第二轮PCR扩增产物；
将所述得到的带有荧光的第二轮PCR扩增产物进行毛细管电泳，根据毛细管电泳分析结果，判断所述DNA是否存在VHL基因的大片段缺失。
其中，所述VHL基因的三个外显子E1、E2、E3、内参Bg的扩增引物对8-11及Univ通用引物对12如SEQIDNo.15-24所示，分别为：
扩增引物对8E1F:5’-tccgtcttagctgagtggcgtatacggccctgaagaagacg-3’
E1R:5’-aggcagaatcgactcaccgctatacctcggtagctgtggatg-3’
扩增引物对9E2F:5’-tccgtcttagctgagtggcgtaagacgaggtttcaccacgtt-3’
E2R:5’-aggcagaatcgactcaccgctagggcttaatttttcaagtggtc-3’
扩增引物对10E3F:5’-tccgtcttagctgagtggcgtatactgagaccctagtctgtcactg-3’
E3R:5’-aggcagaatcgactcaccgctactaaggaaggaaccagtcctgtat-3’
扩增引物对11BgF:5’-tccgtcttagctgagtggcgtacacaccctagggttggccaa-3’
BgR:5’-aggcagaatcgactcaccgctaacctgtcttgtaaccttgatac-3’
通用引物对12Univ-F:5’-tccgtcttagctgagtggcgta-3
Univ-R:5’-FAM-aggcagaatcgactcaccgcta-3’；
其中，所述通用引物对12中的Univ-R引物的5’端标记有FAM荧光。
特别是，所述第一轮PCR反应的反应条件为：94℃预变性10min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃聚合30s，9个循环后，72℃延长聚合5min。
特别是，所述第二轮PCR反应的反应条件为：94℃预变性10min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃聚合30s，20个循环后，72℃延长聚合5min，
其中，所述采用VHL基因的三个外显子VHL-1、VHL-2和VHL-3的扩增引物对所述DNA溶液进行VHL基因点突变、小片段缺失或插入、剪切位点突变的检测包括以下步骤：
人工合成VHL基因的三个外显子VHL-1、VHL-2和VHL-3的扩增引物对5-7；
利用所述引物对5-7和所述DNA溶液建立PCR扩增反应体系，进行PCR反应，获得PCR产物；
将得到的PCR产物进行纯化处理和测序分析，判断所述DNA是否发生了VHL基因点突变、小片段缺失或插入和剪切位点突变。
其中，所述扩增VHL基因的三个外显子VHL-1、VHL-2和VHL-3的扩增引物对5-7如SEQIDNo.9-14所示，分别为：
引物对5：VHL-1F5’-ggtggtctggatcgcgga-3’
VHL-1R5’-ggcttcagaccgtgctatcg-3’
引物对6：VHL-2F5’-gtggctctttaacaacctttgc-3’
VHL-2R5’-cctgtacttaccacaacaaccttatc-3’
引物对7：VHL-3F5’-gcaaagcctcttgttcgttc-3’
其中，所述PCR扩增反应体系是：总体积为25μl，包括12.5μl的PCRmix、100ng的DNA模板、1μl的引物和余量的ddH2O；反应条件为：94℃10min预变性；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃复性5min；4℃保存，获得PCR产物。
其中，所述羊水中胎儿细胞的培养传代是将所述羊水中的细胞在预先配制的胎儿细胞培养液中进行培养，其中培养温度为37℃，空气条件为5％的CO2。
尤其是，所述胎儿细胞培养液由70-79％的hyclonedmem/f12培养基、20-28％胎牛血清FBS和1-2％的青霉素和链霉素双抗PS配制而成。
优选地，所述胎儿细胞培养液由74％的hyclonedmem/f12培养基、25％胎牛血清FBS和1％的青霉素和链霉素双抗PS配制而成。
为实现本发明的目的，本发明另一方面提供一种适用于检测VHL基因突变的试剂盒，包括：用于提取羊水中细胞DNA的试剂；包含如SEQIDNO.1-8所示的性别决定基因和X染色体短串联重复序列的扩增引物，用于检测所述羊水细胞是否存在母体遗传物质的试剂；包含如SEQIDNO.9-14所示的扩增引物，用于进行VHL基因点突变、小片段缺失或插入、剪切位点突变的检测以获得是否存在VHL基因点突变、小片段缺失或插入、剪切位点突变的检测结果的试剂；包含如SEQIDNO.15-24所示的扩增引物，用于进行VHL基因大片段缺失的检测以获得是否存在大片段缺失的检测结果的试剂。
其中，所述提取羊水中细胞DNA的试剂可以从市售得到，还可以通过配制得到的其他任意可以从羊水细胞中提取DNA的试剂，根据本发明的一个实施例，本发明所使用的试剂购自Promega公司的A1120基因组DNA提取试剂盒。
其中，所述用于检测所述羊水细胞是否存在母体遗传物质的试剂包括：用于扩增人类性别决定基因和X染色体短串联序列的PCRmix和引物。
其中，所述引物是如SEQNo.1-8所示的用于扩增人类性别决定基因SRY的扩增引物对1和用于扩增X染色体上的3个短串联重复序列DXS6797、DXS6807、AR的扩增引物对2-4：
扩增引物对1：SRY-F：5’-GAGTGAAGCGACCCATGAAC-3’
SRY-R：5’-TCTTGAGTGTGTGGCTTTCG-3’
扩增引物对2：DXS6797-F：5’-TTCCCTCTCTCCCTCTGTCT-3’
DXS6797-R：5’-ACACACACCCAAAACCAGAT-3’
扩增引物对3：DXS6807-F：5’-GAGCAATGATCTCATTTGCA-3’
DXS6807-R：5’-AAGTAAACATGTATAGGAAAAAGCT-3’
扩增引物对4：AR-F：5’-TCCAGAATCTGTTCCAGAGCGTGC-3’
AR-R：5’-GCTGTGAAGGTTGCTGTTCTCCAT-3’。
其中，所述扩增引物对2中DXS6797-F引物的5’端标记FAM荧光。
其中，所述扩增引物对3中DXS6807-F引物的5’端标记FAM荧光。
其中，所述扩增引物对4中AR-F引物的5’端标记FAM荧光。
其中，所述用于进行VHL基因点突变、小片段缺失或插入、剪切位点突变检测的试剂包括：用于扩增VHL基因的三个外显子的PCRmix和引物。
其中，所述引物是包括如SEQNo.9-14所示的用于扩增VHL基因的三个外显子的扩增引物5-7：
扩增引物对5：VHL-1F5’-ggtggtctggatcgcgga-3’
VHL-1R5’-ggcttcagaccgtgctatcg-3’
扩增引物对6：VHL-2F5’-gtggctctttaacaacctttgc-3’
VHL-2R5’-cctgtacttaccacaacaaccttatc-3’
扩增引物对7：VHL-3F5’-gcaaagcctcttgttcgttc-3’
VHL-3R5’-caaaaatgccaccaccttct-3’。
其中，所述用于进行VHL基因大片段缺失检测的试剂包括用于进行大片段缺失检测的第一轮PCR反应体系和第二轮PCR反应体系的PCRmix和引物。
特别是，所述第一轮PCR反应体系为：
尤其是，所述第一轮PCR反应体系应用如SEQIDNO.15-22所示的扩增引物对8-11是：
扩增引物对8E1F:5’-tccgtcttagctgagtggcgtatacggccctgaagaagacg-3’
E1R:5’-aggcagaatcgactcaccgctatacctcggtagctgtggatg-3’
扩增引物对9E2F:5’-tccgtcttagctgagtggcgtaagacgaggtttcaccacgtt-3’
E2R:5’-aggcagaatcgactcaccgctagggcttaatttttcaagtggtc-3’
扩增引物对10E3F:5’-tccgtcttagctgagtggcgtatactgagaccctagtctgtcactg-3’
E3R:5’-aggcagaatcgactcaccgctactaaggaaggaaccagtcctgtat-3’
扩增引物对11BgF:5’-tccgtcttagctgagtggcgtacacaccctagggttggccaa-3’
BgR:5’-aggcagaatcgactcaccgctaacctgtcttgtaaccttgatac-3’；
特别是，所述第二轮PCR反应体系为：
PCRmix25μl
DNA模板第一轮PCR扩增产物
通用引物1μl
ddH2O至25μl
尤其是，所述第二轮PCR反应应用如SEQIDNO.23-24所示的通用引物对12是：
通用引物对12Univ-F:5’-tccgtcttagctgagtggcgta-3
Univ-R:5’-FAM-aggcagaatcgactcaccgcta-3’。
优选地，所述通用引物对12中的Univ-R的5’端标记有FAM荧光。
其中，所述用于对所述羊水中的胎儿细胞进行培养传代的试剂包括：70-79％的hyclonedmem/f12培养基、20-28％胎牛血清FBS和1-2％的青霉素和链霉素双抗PS。
优选的，所述用于对所述羊水中的胎儿细胞进行培养传代的试剂包括：74％的hyclonedmem/f12培养基、25％胎牛血清FBS和1％的青霉素和链霉素双抗PS
本发明的有益效果体现在以下方面：
1、本发明提供的检测方法可以快速准确的判断从羊水中提取的胎儿细胞DNA中是否存在母体遗传物质污染，从而保证VHL基因突变检测结果的准确性。
2、本发明提供了完备的VHL突变检测方法，可以检测VHL基因的点突变、小片段缺失或插入、剪切位点突变、大片段缺失等，检测方法完备，可检测胎儿细胞中是否存在上述的各种VHL基因突变。
3、本发明提供的检测方法可以在短时间内就检测出胎儿VHL基因突变，降低时间成本，最快一周就能得到检测结果。
4、本发明提供的检测方法实验操作简单，检测结果准确、可靠，实用性强，成本低。
5、本发明提供的试剂盒不但可以高效率、高准确率地检测胎儿VHL基因突变，而且成本低廉，适合推广。
附图说明
图1是本发明的实施例1中性别决定基因SRY的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图，其中，第一泳道为DNAMarker，大小为100-700，泳道2、3、4分别为胎儿、父亲和母亲SRY的PCR产物电泳图；
图2是本发明的实施例1中STR分析结果图，其中，图A为DXS6797的峰图，图B是DXS6807的峰图，图C是AR的峰图，图中从上至下分别为母亲、父亲和胎儿的峰图；
图3是本发明的实施例2中羊水中胎儿细胞DNA的VHL基因测序结果图；
图4是本发明的实施例3中VHL基因毛细血管电泳分析结果图，其中图A是羊水中胎儿细胞DNA的VHL基因毛细血管电泳分析结果图，图B是正常人外周血DNA的VHL基因毛细血管电泳分析结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。
本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
需要说明的是，在进行本实施例之前，先对胎儿母亲和父亲的外周血进行VHL基因突变的检测，其检测方法可以通过PCR测序检测技术检测点突变、小片段缺失或插入、剪切位点突变，也可以通过SouthernBlot、MLPA、RT-PCR及UPQFM-PCR进行VHL基因大片段缺失的检测，其检测方法不受限制，根据本发明的实施例，本发明方法提供的对胎儿母亲和父亲的外周血进行VHL基因突变的检测与胎儿的检测方法相同。
需要说明的是，本申请中提到的DNA的提取，包括胎儿DNA、胎儿母亲外周血DNA和胎儿父亲外周血DNA以及正常人外周血DNA，可以通过任意一个途径实现，根据本发明的一个实施例，本发明进行的DNA的提取都是采用Promega公司的A1120基因组DNA提取试剂盒进行提取，提取方法根据说明书的步骤进行。
实施例1胎儿细胞DNA中是否存在母体遗传物质污染的检测
1、样本的采集
用穿刺设备抽取妊娠14～22周的孕妇的羊水，获得羊水中的细胞。
需要说明的是，本发明提供的检测方法同样适用于使用穿刺设备抽取妊娠为11～14周的孕妇的绒毛样本。
需要说明的是，本申请使用的穿刺设备通过市售得到，没有特别的限定，可以是任意一种可以实现羊水穿刺的穿刺设备。
2、母体遗传物质污染与否的检测
2.1、引物的设计和合成
根据人类性别决定基因SRY、X染色体上的3个短串联重复序列DXS6797、DXS6807、AR的碱基序列，设计并合成SRY基因、DXS6797、DXS6807、AR序列的PCR扩增引物对：
扩增引物对1：SRY-F：5’-gagtgaagcgacccatgaac-3’
SRY-R：5’-tcttgagtgtgtggctttcg-3’
扩增引物对2：DXS6797-F：5’-ttccctctctccctctgtct-3’
DXS6797-R：5’-acacacacccaaaaccagat-3’
扩增引物对3：DXS6807-F：5’-gagcaatgatctcatttgca-3’
DXS6807-R：5’-aagtaaacatgtataggaaaaagct-3’
扩增引物对4：AR-F：5’-tccagaatctgttccagagcgtgc-3’
AR-R：5’-gctgtgaaggttgctgttctccat-3’
其中，扩增引物对DXS6797-F、DXS6807-F、AR-F的5’端标记FAM荧光。
2.2、扩增SRY基因及DXS6797、DXS6807、AR基因
提取羊水胎儿细胞的DNA、胎儿母亲外周血DNA和胎儿父亲外周血DNA，并以提取的羊水胎儿DNA和父母的DNA为模板分别建立总体积为25μl的PCR扩增反应体系：12.5μl的PCRmix溶液(所述PCRmix溶液选用天根生化科技有限公司生产的2xTaqPCRMasterMixKT201-02)、70ngDNA(其中，所述DNA的用量还可以是40-70ng范围内的任意用量，还可以是20-80ng范围内的任意用量，都可以实现本发明的目的)，上述引物对各0.5μl、引物浓度是10pmol/μl，余量ddH2O。上述反应的反应条件是：在95℃温度条件下预变性5min；95℃变性20s，SRY基因、DXS6797、DXS680755℃退火20s，AR58℃退火20s，72℃延伸20s，30个循环后72℃复性5min；4℃保存，得到SRY、DXS6797、DXS6807、AR基因的扩增产物。
2.3、分析判断基因扩增产物
将步骤2.2得到的SRY基因扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳(如图1所示)，判断胎儿性别，再对所述PCR扩增产物中的DXS6797、DXS6807和AR基因片段进行STR分析(如图2所示)，根据STR分析结果判断所述DNA溶液中是否存在母体遗传物质污染。
如图1的所示的琼脂糖凝胶电泳图，第一泳道为DNAMarker，大小为100-700bp，泳道2、3、4分别为胎儿、父亲和母亲SRY的PCR产物电泳图，根据本领域的公知常识可知性别决定基因SRY只存在于Y染色体上，如图1所示的SRY基因的扩增产物条带准确地出现在表示父亲的泳道上，并且条带清晰、无杂带，说明本发明设计的引物对SRY性别决定基因特异性强，可以准确扩增SRY基因；并且图中表示胎儿的泳道没有条带产生，说明胎儿不存在SRY基因，因此判断胎儿为女孩。
如图2所示的STR分析结果图，可知，本发明设计的引物得到的分析结果图清晰准确，得到的测序结果专一，说明引物的特异性好。其中，图A为DXS6797的峰图，图B是DXS6807的峰图，图C是AR的峰图，图中，从上至下分别为母亲、父亲和胎儿的峰图。图中A可以看出，胎儿的出现了只两个峰，分别出现在294.5与300处，与母亲的294.6处的峰相同，与父亲299.9处的峰相同，且没有出现母亲的另一个峰，说明胎儿具有分别来自父亲和母亲的两条X染色体，为女孩，且不存在母亲遗传物质的污染；图中B可以看出，母亲只出现另一个峰，且与父亲的峰为同一位置，胎儿也出现了同样的峰，说明母亲的两个峰发生了重叠，且与父亲位于同一位置，这是由于父亲和母亲的基因决定的；图中C可以看出，胎儿的只出现了两个峰，分别出现在294.5处，与母亲的294.7处的峰位置相同，300位置处的峰与父亲300.2处的峰相同，没有出现母亲的另一个峰，说明胎儿具有分别来自父亲和母亲的两条X染色体，为女孩，且不存在母亲遗传物质的污染，根据本试验结果表明，胎儿细胞中不存在母体遗传物质污染；如果胎儿DNA被污染，则会同时出现母亲的两个峰和父亲的一个峰。
实施例2羊水胎儿细胞VHL基因点突变、小片段缺失或插入以及剪切位点突变的检测
通过扩增待测DNA中VHL基因的三个外显子，经测序仪获得待测样本的外显子基因序列，与基因库中的VHL基因进行比对，分析序列是否发生了点突变、小片段缺失或插入以及剪切位点突变等突变。具体方法如下：
1、扩增引物的设计
设计PCR扩增VHL基因的三个外显子VHL-1、VHL-2、VHL-3的扩增引物对：
扩增引物对5：VHL-1F5’-ggtggtctggatcgcgga-3’
VHL-1R5’-ggcttcagaccgtgctatcg-3’
扩增引物对6：VHL-2F5’-gtggctctttaacaacctttgc-3’
VHL-2R5’-cctgtacttaccacaacaaccttatc-3’
扩增引物对7：VHL-3F5’-gcaaagcctcttgttcgttc-3’
VHL-3R5’-caaaaatgccaccaccttct-3’。
2、检测VHL基因点突变、小片段缺失或插入以及剪切位点突变
以实施例1中得到的羊水细胞的DNA为模板，以扩增引物对5-7为引物建立扩增反应体系，其中，反应体系的总体积为25μl，包括12.5μl的PCRmix(选用北京全式金生物技术有限公司生产的PCRSuperMixAS111)、100ng的DNA模板、浓度是5pmol/μl的引物各1μl，ddH2O余量。反应条件为：94℃预变性10min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环后，72℃复性5min，4℃保存。得到胎儿DNA的VHL基因的三个外显子的扩增产物，将扩增后的VHL基因的外显子产物送至北京诺塞基因组研究中心有限公司进行纯化处理，并使用ABI3730测序仪测序，得到测序结果，如图3所示，根据测序结果分析判断VHL基因是否发生了点突变、剪切位点突变、小片段缺失或插入等。
3、检测结果
如图3所示的测序结果图，每对碱基的峰图清晰可见，且无杂峰出现，表明本发明设计的引物特异性好，由图3可以看出，羊水中胎儿细胞的VHL基因出现了c.499C>Tp.Arg167Trp突变，即在VHL基因的第3外显子中的第499bp处存在由C至T的突变，导致VHL蛋白第167位氨基酸由精氨酸Arg变为色氨酸Trp。
根据实施例1得到的检测结果，发现羊水中胎儿细胞中不存在母体遗传物质的污染，因此本实施例的检测结果是准确的。
实施例3胎儿细胞VHL基因大片段缺失的检测
1待测样本及对照样本的采集
取实施例1中得到的羊水细胞的DNA为待测样本，同时抽取正常人的外周血，并提取DNA，以正常人的DNA溶液为对照样本。
2扩增引物的设计
设计并合成待测样本、对照样本的VHL基因的三个外显子E1、E2、E3和内参Bg的扩增引物：
扩增引物对8E1F:5’-tccgtcttagctgagtggcgtatacggccctgaagaagacg-3’
E1R:5’-aggcagaatcgactcaccgctatacctcggtagctgtggatg-3’
扩增引物对9E2F:5’-tccgtcttagctgagtggcgtaagacgaggtttcaccacgtt-3’
E2R:5’-aggcagaatcgactcaccgctagggcttaatttttcaagtggtc-3’
扩增引物对10E3F:5’-tccgtcttagctgagtggcgtatactgagaccctagtctgtcactg-3’
E3R:5’-aggcagaatcgactcaccgctactaaggaaggaaccagtcctgtat-3’
扩增引物对11BgF:5’-tccgtcttagctgagtggcgtacacaccctagggttggccaa-3’
BgR:5’-aggcagaatcgactcaccgctaacctgtcttgtaaccttgatac-3’。
3第一轮PCR扩增反应
以待测样本、对照样本的DNA溶液为模板，利用步骤2合成的扩增引物分别建立用于扩增的VHL基因的三个外显子E1、E2、E3和内参Bg的扩增反应体系：
其中，所述引物的浓度分别为：E1为5pmol/μl、E2为2pmol/μl、E3为1.5pmol/μl和内参Bg为2pmol/μl。
其反应体系的反应条件是：94℃预变性10min，94℃变性30s、58℃退火30s、72℃聚合30s、9个循环，72℃延长聚合5min，4℃保存。
分别得到待测样本、对照样本的三个外显子和内参的第一轮PCR扩增产物。
4第二轮PCR扩增反应
设计并人工合成第二轮PCR扩增反应的通用引物对12：
引物对12Univ-F:5’-tccgtcttagctgagtggcgta-3
Univ-R:5’-FAM-aggcagaatcgactcaccgcta-3’
所述通用引物对12中的Univ-R的5’端标记有FAM荧光。
以第一轮PCR扩增得到的待测样本、对照样本的三个外显子和内参产物为模板，分别建立总体积为25μl的第二轮PCR扩增反应体系：
其中，所述引物对12的浓度为4pmol/μl，其中，Univ-R引物5’端标记有FAM荧光。
其反应体系的反应条件是：94℃预变性10min、94℃变性30s、60℃退火30s、72℃聚合30s、循环数20、72℃延长聚合5min，4℃保存。
得到待测样本、对照样本的三个外显子和内参的第二轮PCR扩增产物。
分别取1μl的第二轮PCR扩增产物进行毛细管电泳分析，得到待测样本和对照样本的毛细血管电泳分析结果，将获得的待测样本的三个外显子峰面积分别与待测样本的内参峰面积进行比较，得到外显子与内参的峰面积比值；同时将对照样本的三个外显子峰面积分别与对照样本的内参峰面积进行比较，得到外显子与内参的峰面积比值。
5检测结果
5.1可信区间的建立
按照步骤1-4的方法检测20例正常人的VHL基因，得到VHLExon1,2,3与内参β-Globin峰面积之比的95％可信区间，其中Exon1基因的95％可信区间为1.100～1.912，Exon2基因的95％可信区间为0.287～0.611，Exon3基因的95％可信区间为0.912～1.328。
若待测样本的某一片段的峰面积比值减少超出95％可信区间并减少到接近50％时，即判断为大片段缺失。
5.2检测结果的判读
根据图4所示的毛细管电泳分析结果图，计算得到待测样本的VHLExon1,2,3与内参β-Globin峰面积之比分别为、1.578、0.479、1.123，均在可信区间内，正常人VHLExon1,2,3与内参β-Globin峰面积之比分别是1.635、0.589、1.211，也均在可信区间内，可见待测样本与正常人的VHL基因均未发生大片段缺失。
根据实施例1得到的检测结果，发现羊水中胎儿细胞中不存在母体遗传物质的污染，因此本实施例的检测结果是准确的。
实施例4羊水胎儿细胞的培养
将实施例1中穿刺得到的羊水培养在预先配制的培养液进行胎儿细胞培养传代。其中，培养液包含74％的hyclonedmem/f12培养基、25％胎牛血清FBS和1％的青霉素和链霉素双抗PS。培养温度为37℃，空气条件为5％的CO2。
需要说明的是，使用本发明中提供的胎儿细胞DNA是否存在母体遗传物质污染的方法得到的检测结果，影响胎儿VHL基因突变检测方法，具体是：
若检测结果是提取的胎儿DNA溶液中不存在母体遗传物质的污染，则选择实施例1或/和实施例2进行胎儿VHL基因突变检测，该方法检测周期为1-2周；
若检测结果是提取的胎儿DNA中存在母体遗传物质，则选择实施例4的方法先对胎儿细胞进行培养传代，当获得了纯净的胎儿细胞后再提取胎儿DNA进行实施例1或/和实施例2的VHL基因突变的检测，该方法检测周期为3-4周，该方法主要通过胎儿细胞培养液培养胎儿细胞，使胎儿细胞得以存活和传代，经过数次传代培养后，最终得到纯净的胎儿细胞，然后再进行胎儿细胞DNA的VHL基因突变的检测，以得到准确的检测结果。
需要说明的是，本发明的检测方法可以直接对羊水胎儿细胞进行点突变、小片段缺失或插入、剪切位点突变以及大片段缺失的检测，检测效率高且检测周期短。
需要说明的是，由于本发明提供的胎儿细胞VHL基因突变的检测方法通过准确的判断母体遗传物质污染与否来确定VHL基因突变的检测方案，可以减少盲目操作造成的人力、物力和时间的浪费。
需要说明的是，本发明提供的VHL基因突变检测方法全面，可以准确的检测胎儿VHL基因的各种突变，因此本发明提供的检测方法具有突出的实用性和高效性。
尽管上述对本发明做了详细说明，但不限于此，本技术领域的技术人员可以根据本发明的原理进行修改，因此，凡按照本发明的原理进行的各种修改都应当理解为落入本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种羊水胎儿细胞VHL基因突变检测方法，其特征在于，包括：
通过提取羊水中胎儿细胞的DNA，获得DNA溶液；
对所述的DNA溶液进行母体遗传物质污染与否的检测，判断DNA溶液中是否存在母体遗传物质污染；
若判断DNA溶液中不存在母体遗传物质污染，则直接对羊水胎儿细胞进行VHL基因突变检测；
若判断DNA溶液中存在母体遗传物质污染，则对羊水胎儿细胞进行培养传代后再提取DNA进行VHL基因突变检测；
所述VHL基因突变检测包括：
利用VHL基因的三个外显子E1、E2、E3和内参Bg的扩增引物和Univ通用引物对所述DNA溶液进行VHL基因大片段缺失的检测，获得所述DNA溶液中是否存在大片段缺失的检测结果。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述VHL基因突变检测还包括：
采用VHL基因的三个外显子VHL-1、VHL-2和VHL-3的扩增引物对所述DNA溶液进行VHL基因点突变、小片段缺失或插入、剪切位点突变的检测，获得所述DNA溶液中是否存在点突变、小片段缺失或插入、剪切位点突变的检测结果。
3.如权利要求1所述的基因突变检测方法，其特征在于，所述母体遗传物质污染检测包括：
人工合成人类性别决定基因SRY和X染色体上的3个短串联重复序列DXS6797、DXS6807、AR的扩增引物对1-4；
利用所述扩增引物对1-4和所述DNA溶液建立PCR扩增反应体系，进行PCR反应，得到PCR扩增产物；
对所述PCR扩增产物中的SRY基因扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，对所述PCR扩增产物中的DXS6797、DXS6807和AR基因的扩增产物进行STR分析，根据所述SRY基因扩增产物的电泳结果和STR分析结果判断所述DNA溶液中是否存在母体遗传物质污染。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述人类性别决定基因SRY和X染色体上的3个短串联重复序列DXS6797、DXS6807、AR的扩增引物对1-4如SEQIDNo.1-8所示，分别为：
扩增引物对1：SRY-F：5’-gagtgaagcgacccatgaac-3’
SRY-R：5’-tcttgagtgtgtggctttcg-3’
扩增引物对2：DXS6797-F：5’-ttccctctctccctctgtct-3’
DXS6797-R：5’-acacacacccaaaaccagat-3’
扩增引物对3：DXS6807-F：5’-gagcaatgatctcatttgca-3’
DXS6807-R：5’-aagtaaacatgtataggaaaaagct-3’
扩增引物对4：AR-F：5’-tccagaatctgttccagagcgtgc-3’
AR-R：5’-gctgtgaaggttgctgttctccat-3’
其中，所述引物对2中6797-F引物的5’端标记FAM荧光；
其中，所述引物对3中6807-F引物的5’端标记FAM荧光；
其中，所述引物对4中AR-F引物的5’端标记FAM荧光。
5.如权利要求1所述的基因突变检测方法，其特征在于，所述利用VHL基因的三个外显子E1、E2、E3、内参Bg的扩增引物和Univ通用引物对所述DNA溶液进行VHL基因大片段缺失的检测包括：
人工合成VHL基因的三个外显子E1、E2、E3和内参Bg的扩增引物对8-11：
利用所述引物对8-11和所述DNA溶液建立第一轮PCR扩增反应体系，进行第一轮PCR反应，获得VHL基因的三个外显子和内参的扩增产物；
人工合成VHL基因的三个外显子和内参在第二轮PCR中共用的Univ通用引物对12；
利用所述通用引物对12和所述第一轮PCR反应中VHL基因的三个外显子和内参的扩增产物建立第二轮PCR扩增反应体系并进行第二轮PCR扩增反应，得到带有荧光的第二轮PCR扩增产物；
将所述得到的带有荧光的第二轮PCR扩增产物进行毛细管电泳，根据毛细管电泳分析结果，判断所述DNA是否存在VHL基因的大片段缺失。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述VHL基因的三个外显子E1、E2、E3、内参Bg的扩增引物对8-11及Univ通用引物对12如SEQIDNo.15-24所示，分别为：
扩增引物对8E1F:5’-tccgtcttagctgagtggcgtatacggccctgaagaagacg-3’
E1R:5’-aggcagaatcgactcaccgctatacctcggtagctgtggatg-3’
扩增引物对9E2F:5’-tccgtcttagctgagtggcgtaagacgaggtttcaccacgtt-3’
E2R:5’-aggcagaatcgactcaccgctagggcttaatttttcaagtggtc-3’
扩增引物对10E3F:5’-tccgtcttagctgagtggcgtatactgagaccctagtctgtcactg-3’
E3R:5’-aggcagaatcgactcaccgctactaaggaaggaaccagtcctgtat-3’
扩增引物对11BgF:5’-tccgtcttagctgagtggcgtacacaccctagggttggccaa-3’
BgR:5’-aggcagaatcgactcaccgctaacctgtcttgtaaccttgatac-3’
通用引物对12Univ-F:5’-tccgtcttagctgagtggcgta-3
Univ-R:5’-FAM-aggcagaatcgactcaccgcta-3’；
其中，所述通用引物对12中的Univ-R引物的5’端标记有FAM荧光。
7.如权利要求2所述的基因突变检测方法，其特征在于，所述采用VHL基因的三个外显子VHL-1、VHL-2和VHL-3的扩增引物对所述DNA溶液进行VHL基因点突变、小片段缺失或插入、剪切位点突变的检测包括以下步骤：
人工合成VHL基因的三个外显子VHL-1、VHL-2和VHL-3的扩增引物对5-7；
利用所述引物对5-7和所述DNA溶液建立PCR扩增反应体系，进行PCR反应，获得PCR产物；
将得到的PCR产物进行纯化处理和测序分析，判断所述DNA是否发生了VHL基因点突变、小片段缺失或插入和剪切位点突变。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述扩增VHL基因的三个外显子VHL-1、VHL-2和VHL-3的扩增引物对5-7如SEQIDNo.9-14所示，分别为：
引物对5：VHL-1F5’-ggtggtctggatcgcgga-3’
VHL-1R5’-ggcttcagaccgtgctatcg-3’
引物对6：VHL-2F5’-gtggctctttaacaacctttgc-3’
VHL-2R5’-cctgtacttaccacaacaaccttatc-3’
引物对7：VHL-3F5’-gcaaagcctcttgttcgttc-3’
VHL-3R5’-caaaaatgccaccaccttct-3’。
9.一种用于检测VHL基因突变的试剂盒，其特征在于，包括：
用于提取羊水中细胞DNA的试剂；
包含如SEQIDNO.1-8所示的性别决定基因和X染色体短串联重复序列的扩增引物，用于检测所述羊水细胞DNA是否存在母体遗传物质的试剂；
包含如SEQIDNO.9-14所示的扩增引物，用于进行VHL基因点突变、小片段缺失或插入、剪切位点突变的检测以获得是否存在VHL基因点突变、小片段缺失或插入、剪切位点突变的检测结果的试剂；
包含如SEQIDNO.15-24所示的扩增引物，用于进行VHL基因大片段缺失的检测以获得是否存在大片段缺失的检测结果的试剂。
10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，还包括：
用于对所述羊水中的胎儿细胞进行培养传代的试剂。
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