CN115058386B - 去除血性羊水中母血细胞污染的羊水细胞培养方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及一种去除血性羊水中母血细胞污染的羊水细胞培养方法及应用。所述方法包括以下步骤：S1，将固液分离后的血性羊水中的上清去除后与羊水培养液混合，获得细胞悬液；将所述细胞悬液接种至培养皿中进行培养，获得第一培养物；S2，在所述第一培养物中添加所述羊水培养液继续进行培养，获得第二培养物；S3，去除第二培养物中的母血细胞和原有培养液，然后在其中添加所述羊水培养液，继续进行培养，获得第三培养物；S4，对所述第三培养物进行传代培养，获得传代培养物；S5，收集传代培养物中的胎儿细胞。该方法能够有效去除血性羊水中母血细胞，排除外来污染，保证后续检测结果的可靠性和准确性。
Description
技术领域
本申请涉及细胞分子遗传学检测的技术领域，尤其是涉及一种去除血性羊水中母血细胞的羊水细胞培养方法及应用。
背景技术
产前诊断又称“出生前诊断”或“宫内诊断”，是指在妊娠期的特定阶段，在胎儿出生之前，应用影像学、生物化学、细胞遗传学以及分子生物学等技术，了解胎儿宫内的发育状态，对先天性疾病和遗传性疾病(包括出生后发病的遗传性疾病)等的出生缺陷病作出诊断。
遗传病分为单基因病(包括常染色体显性遗传病、常染色体隐性遗传病、X连锁显性遗传病、X连锁隐性遗传病、Y连锁遗传病和线粒体病)、多基因病(包括冠状动脉病、原发性高血压病、原发性糖尿病、先天性巨结肠、尿道下裂、室间隔缺损、腭裂、脊柱裂等)、染色体病(包指染色体易位、缺失、倒位、等臂、重复等的结构异常和21-三体、18-三体、13-三体等的数目异常)、体细胞遗传病(包括体细胞中遗传物质改变所致的各种肿瘤和一些先天畸形等)。产前诊断是预防有严重遗传性疾病或先天性缺陷胎儿出生的有效而可靠的措施，是优生和提高人口素质的重要保障。
针对遗传病的产前诊断方法包括胎儿的羊水细胞染色体检查，以诊断各类染色体病。在羊水细胞染色体检查中，需抽取孕5个月左右孕妇的羊水进行检查。但是所抽取的羊水存在母血细胞污染的情况，称之为血性羊水。血性羊水中的母血细胞，会直接影响羊水检测结果，甚至会导致错误的检测结果，而目前并没有用于去除血性羊水中母血细胞污染的羊水细胞培养方法。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本申请提供一种去除血性羊水中母血细胞污染的羊水细胞培养方法，所述方法能够有效去除血性羊水中母血细胞，排除外来污染，保证后续检测结果的可靠性和准确性。
为此，本申请第一方面提供了一种去除血性羊水中母血细胞污染的羊水细胞培养方法，所述方法包括以下步骤：
S1，将固液分离后的血性羊水中的上清去除后与羊水培养液混合，获得细胞悬液；将所述细胞悬液接种至培养皿中进行培养，获得第一培养物；
S2，在所述第一培养物中添加所述羊水培养液继续进行培养，获得第二培养物；
S3，去除第二培养物中的母血细胞和原有培养液，然后在其中添加所述羊水培养液，继续进行培养，获得第三培养物；
S4，对所述第三培养物进行传代培养，获得传代培养物；
S5，收集传代培养物中的胎儿细胞。
本申请所述羊水细胞培养方法引入了去除母血细胞的操作，使得培养后所收集的细胞中不含有母血细胞而仅含有胎儿细胞，排除了外来污染，进而使得采用所述方法收集的细胞进行后续检测时，检测结果更为准确、可靠。
本申请所述方法能够有效去除血性羊水中的母血细胞是基于羊水培养液不适用于血细胞的生长，同时血细胞也无法贴壁生长的原理实现的。
本申请对所采用的羊水培养液没有明确限定，其可以为现有市售的羊水培养液中的任意一种。在一些具体实施方式中，所采用的羊水培养液为gibco生产的AmnioMAX-II羊水培养液，其生产批号为2277175，规格为100mL。
在一些实施方式中，步骤S1中，所述血清羊水与羊水培养液的体积比为(10～15):1；所述细胞悬液的接种量为0.5～1mL。
在一些具体实施方式中，步骤S1中，所述血性羊水的体积为10～15mL，所述血性羊水可通过离心的方式进行固液分离，所述离心的转速可以为2000rpm，时间可以为5min。去除血性羊水上清后获得的细胞沉淀可以与1mL的羊水培养液混合，混匀后获得细胞悬液。
在一些实施方式中，步骤S1中，所述培养的条件为：温度37±2℃，CO2的体积浓度4～5％，时间12～18h。
本申请中，在上述培养条件下有利于羊水中胎儿细胞的贴壁生长。步骤S1中，上述培养的时间应以获得的所述第一培养物中有零星细胞贴壁为准，一般静置培养12～18h(过夜培养)即可。
在一些实施方式中，步骤S2中，所述羊水培养液的添加量为1.5～2.5mL；所述培养的条件为：温度37±2℃，CO2的体积浓度4～5％，时间24～48h。
本申请中步骤S2中的培养时间应以所述第二培养物中有一个或多个细胞克隆出现为准，一般地培养24～48h(加液培养1～2天)即可。
本申请中，步骤S3中，去除第二培养物中的母血细胞和原有培养液的方式为：轻轻摇晃培养皿20～30次，使沉淀的母血细胞漂浮，用移液管吸出原有培养液，吸出时，用原有培养液沿玻片由上至下冲洗几次(动作要轻，不能把细胞冲下)，以使母血细胞去除干净。
在一些实施方式中，步骤S3中，所述羊水培养液的添加量为2～3mL；所述培养的条件为：温度37±2℃，CO2的体积浓度4～5％，时间3～5天。
本申请中步骤S3的培养时间应以所述第三培养物中有三到五个中等大小细胞克隆出现为准，一般地培养3～5天即可。
在一些实施方式中，步骤S4中，所述传代培养的方式为：弃去第三培养物中的培养液，加入胰酶进行消化，再加入羊水培养液终止消化，获得细胞悬液；将固液分离后的所述细胞悬液中的上清去除后与所述羊水培养液混合、重悬并接种至培养皿中进行培养，获得第四培养物；在所述第四培养物中添加羊水培养液继续培养，获得传代培养物。
本申请中，上述细胞悬液可以通过离心的方式进行固液分离，所述离心的转速可以为2000rpm，时间可以为5min。
在一些实施方式中，所述胰酶工作液的添加量为1.5～2.5mL；所述消化的时间为3～5min；终止消化时羊水培养液的添加量为0.5～1mL。
本申请中，胰酶工作液添加量按培养皿规格来确定，以覆盖整个培养皿底部细胞面为标准。终止消化时的羊水培养液添加量约为胰酶工作液的1/3，即可达到终止消化的作用，添加过少起不到终止消化的作用，添加过多则浪费试剂。
在一些具体实施方式中，所述胰酶工作液的添加量为1.5mL；所述消化的时间为5min；终止消化时羊水培养液的添加量为0.5mL。
本申请对所采用的胰酶没有明确限定，其可以为现有市售的胰酶中的任意一种。在一些具体实施方式中，所采用的胰酶的生产厂家为gibco，生产批号为2366086，规格为0.05％、100mL。
本申请中，对弃去所述细胞悬液中上清后获得的细胞沉淀的后续培养方式和条件基本同步骤S1和S2。具体地，将获得的细胞沉淀与1mL所述羊水培养液混合、重悬并接种至培养皿中进行培养，培养条件为温度37±2℃，CO2的体积浓度4～5％，时间12～18h，获得第四培养物(第四培养物中有零星细胞贴壁)；在所述第四培养物中添加1.5mL羊水培养液继续进行培养，培养的条件为温度37±2℃，CO2的体积浓度4～5％，获得传代培养物。
在一些实施方式中，步骤S5的具体操作方式为：待所述传代培养物中的细胞铺满培养皿70～80％时，弃去培养皿内的原有培养液，加入胰酶进行消化，再加入羊水培养液终止消化，获得细胞悬液；将固液分离后的所述细胞悬液中的上清去除后，收集获得胎儿细胞。
在一些实施方式中，所述胰酶的添加量为1.5～2.5mL；所述消化的时间为3～5min；终止消化时羊水培养液的添加量为0.5～1mL。
在一些具体实施方式中，所述胰酶的添加量为1.5mL；所述消化的时间为5min；终止消化时羊水培养液的添加量为0.5mL。
本申请中，所述方法收集的细胞均为胎儿细胞，所述胎儿细胞可直接用于后续的染色体检测。
本申请第二方面提供了一种如本申请第一方面所述方法在对血清羊水中胎儿染色体检测中的应用。
本申请所述羊水细胞培养方法能够有效去除血清羊水中母血细胞的污染，培养获得的细胞均为胎儿细胞，保证了后续检测结果的可靠性和准确性，因此能够较好地应用于针对血清羊水中胎儿染色体的检测中。
本申请的有益技术效果：本申请所述方法引入了去除母血细胞的操作，使得血性羊水经培养后所收集的细胞中不含有母血细胞而仅含有胎儿细胞，排除了外来污染，进而使得采用所述方法收集的细胞进行后续检测时，检测结果更为准确、可靠。
附图说明
图1为对实施例1所收集的胎儿细胞进行SNP-Array检测后的SNPQC指标结果图。
图2为对血性羊水直接进行SNP-Array检测后的SNPQC指标结果图。
图3为对实施例1所收集的胎儿细胞进行SNP探针等位基因分型检测的结果图。
图4为对血性羊水直接进行SNP探针等位基因分型检测的结果图。
图5为实施例1中SNP芯片检测实验流程图。
具体实施方式
为使本申请更加容易理解，下面将结合实施例来进一步详细说明本申请，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本申请的应用范围。本申请中所使用的原料或组分若无特殊说明均可以通过商业途径或常规方法制得。
实施例1
随机挑选一例血性羊水样本，分装为两份，一份血性羊水直接进入SNP-Array检测流程，另一份则经下述去除血性羊水中母血细胞污染的羊水细胞培养方法去除母血细胞污染后，收集胎儿细胞进行SNP-Array检测。
去除血性羊水中母血细胞污染的羊水细胞培养方法的具体操作如下：
接种：接收血性羊水15mL，离心5min 2000rpm，生物安全柜内去上清，加羊水培养液(AmnioMAX-II，gibco，2277175，100mL)1mL，混匀，分别取0.5mL细胞悬液接种在不同培养皿(35mm*10mL)中。(ps：1.羊水培养液不适用于血细胞培养；2.血细胞无法贴壁生长)；
培养：将上述培养皿于37℃、5％CO2培养箱中静置培养过夜(15小时左右)。第2天镜下观察细胞是否贴壁，选择加液时间(加液标准是：静置培养过夜并有零星细胞贴壁)；
加液：生物安全柜内，取1.5mL羊水培养液沿培养皿壁缓缓加入皿内，继续培养。加液后的第2天到第3天时镜下观察是否需要换液(换液标准是：有一个或多个细胞克隆出现，经镜下观察培养36h后需要换液)；
换液：轻轻摇晃培养皿20～30次，使沉淀的母血细胞漂浮，弃去原有培养液，吸出时，用原有培养液沿玻片由上至下冲洗几次(动作要轻，不能把细胞冲下)，再加入2mL新鲜羊水培养液，继续培养；注意观察羊水细胞生长情况；
传代：镜下观察细胞生长情况，选择生长较好的培养皿，确定最佳传代时机(传代标准：有三到五个中等大小细胞克隆，经镜下观察培养3天后需要换液)。弃去培养皿内原有培养液，加入1.5mL胰酶(gibco，0.05％，2366086，100mL)，消化5min，再加0.5mL羊水培养液终止消化，用10mL移液管均匀吹打10～20次，并将细胞悬液转移到15mL离心管中2000rpm5min离心，弃上清加1mL羊水培养液重悬接种到培养皿中进行培养，第二天加液(加液参数：静置培养过夜(15h左右)并有细胞贴壁加入1.5mL羊水培养液)继续进行培养；
收集：待细胞铺满培养皿80％左右即可消化，弃去培养皿内原有培养液，加入1.5mL胰酶消化5min，再加0.5mL羊水培养液终止消化，用10mL移液管均匀吹打10～20次，并将细胞悬液转移到15mL离心管中2000rpm 5min离心，弃上清收集细胞并待测。(ps：收集的细胞均为胎儿细胞)。
SNP-Array检测：
本实施例中的SNP-Array检测的方式根据SNP芯片检测实验标准作业程序(SOP)执行；所述SNP芯片检测实验流程图如图5所示，主要步骤包括：对待测样本的基因组DNA进行限制性内切酶的酶解消化、采用T4 DNA连接酶对酶解消化产物进行连接、对连接产物进行PCR扩增、对PCR扩增产物进行质量控制、对PCR产物进行纯化、对纯化后的PCR产物进行定量、对定量的纯化PCR产物进行片段化处理、对片段化产物进行质量控制、对片段化产物进行标记、对标记后的产物进行杂交、将杂交后的产物芯片上样后进行洗染和扫描。
扫描完成后，系统会自动将数据传送至数据分析的电脑，进行后续的分析。其中对所收集的胎儿细胞进行SNP-Array检测后的SNPQC指标结果图如图1所示，对血性羊水直接进行SNP-Array检测后的SNPQC指标结果图如图2所示，对所收集的胎儿细胞进行SNP探针等位基因分型检测的结果图如图3所示，对血性羊水直接进行SNP探针等位基因分型检测的结果图如图4所示。
从图1可知，经本申请所述方法去除血性羊水中的母血细胞污染后对培养收集的胎儿细胞进行SNP-Array检测后的SNPQC指标为16.579，QC指标大于15，表明质控合格。同时从图3可知，经本申请所述方法去除血性羊水中的母血细胞污染后对培养收集的胎儿细胞进行SNP-Array检测后的SNP探针等位基因分型呈现为三条散点图，显示正常。正常人二倍体SNP等位基因分型有三种，分别为AA、AB和BB，因此在全基因组视图上呈现为三条散点图。
从图2可知，将血性羊水直接进行SNP-Array检测后的SNPQC指标为5.379，QC指标小于7，表明质控不合格。同时从图4可知，将血性羊水直接进行SNP-Array检测后的SNP探针等位基因分型呈现为五条散点图，显示异常。原因是血性羊水样本由于混入母体细胞，因此产生了额外的SNP等位基因分型，分别为AAAA、AAAB、AABB、ABBB和BBBB，在全基因组视图上呈现为五条散点图，属于异常情况。
综上可知，采用本申请的去除血性羊水中母血细胞污染的羊水细胞培养方法所收集的胎儿细胞进行染色体检测的结果更为准确可靠。
应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本申请，并不构成对本申请的任何限制。通过参照典型实施例对本申请进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本申请权利要求的范围内对本申请作出修改，以及在不背离本申请的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本申请涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本申请限于其中公开的特定例，相反，本申请可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。
Claims (6)
1.一种去除血性羊水中母血细胞污染的羊水细胞培养方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
S1，将固液分离后的血性羊水中的上清去除后与羊水培养液混合，获得细胞悬液；将所述细胞悬液接种至培养皿中进行培养，获得第一培养物；
S2，在所述第一培养物中添加所述羊水培养液继续进行培养，获得第二培养物；
S3，去除第二培养物中的母血细胞和原有培养液，然后在其中添加所述羊水培养液，继续进行培养，获得第三培养物；
S4，对所述第三培养物进行传代培养，获得传代培养物；
S5，收集传代培养物中的胎儿细胞；
步骤S1中，所述血性羊水与羊水培养液的体积比为(10～15):1；所述细胞悬液的接种量为0.5～1mL；
步骤S1中，所述培养的条件为：温度37±2℃，CO2的体积浓度4～5％，时间12～18h；
步骤S2中，所述羊水培养液的添加量为1.5～2.5mL；所述培养的条件为：温度37±2℃，CO2的体积浓度4～5％，时间24～48h；
步骤S3中，去除第二培养物中的母血细胞和原有培养液的方式为：轻轻摇晃培养皿20～30次，使沉淀的母血细胞漂浮，用移液管吸出原有培养液，吸出时，用原有培养液沿玻片由上至下冲洗几次，以使母血细胞去除干净。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S3中，所述羊水培养液的添加量为2～3mL；所述培养的条件为：温度37±2℃，CO2的体积浓度4～5％，时间3～5天。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S4中，所述传代培养的方式为：弃去第三培养物中的培养液，加入胰酶进行消化，再加入羊水培养液终止消化，获得细胞悬液；将固液分离后的所述细胞悬液中的上清液去除后与所述羊水培养液混合、重悬并接种至培养皿中进行培养，获得第四培养物；在所述第四培养物中添加羊水培养液继续培养，获得传代培养物。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述胰酶的添加量为1.5～2.5mL；所述消化的时间为3～5min；终止消化时羊水培养液的添加量为0.5～1mL。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S5的具体操作方式为：待所述传代培养物中的细胞铺满培养皿70～80％时，弃去培养皿内的原有培养液，加入胰酶进行消化，再加入羊水培养液终止消化，获得细胞悬液；将固液分离后的所述细胞悬液中的上清去除后，收集获得胎儿细胞。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述胰酶的添加量为1.5～2.5mL；所述消化的时间为3～5min；终止消化时羊水培养液的添加量为0.5～1mL。
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| 妊娠中晚期羊水染色体在产前诊断中的应用研究;李付广等;中国优生与遗传杂志;第25卷(第1期);第62页1.2.1-1.2.3部分 * |
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