CN105296619A - 中国人群肥胖易感基因snp分型用试剂盒及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种中国人群肥胖易感基因SNP分型用试剂盒及其使用方法，具体公开了一种针对中国人群10个肥胖易感基因12个SNP位点的同时定性分型试剂盒及其使用方法，以<i>FTO</i>基因的2个位点，<i>MC4R</i>？基因的1个位点、<i>ADRB3</i>？基因的1个位点、<i>PPAR</i><i>γ</i><i>2</i>基因的1个位点、<i>LEPR</i>？基因的1个位点、<i>APOE？</i>基因的2个位点，<i>UCP2？</i>基因的1个位点，<i>GNPDA2</i>？基因的1个位点，<i>KCTD15</i>基因的1个位点和<i>NEGR1？</i>基因的1个位点为检测对象，针对每个SNP位点的突变分别设计出扩增引物和延伸引物，并进行多重PCR扩增和标记延伸，通过毛细管电泳分析，同时获得12个SNP位点的基因型。本发明使用方便，操作简单，成本低，通量高，检测结果直接可靠，适用于中国人群肥胖易感基因SNP分型的大规模筛查。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域中SNP分型检测领域，具体涉及一种中国人群肥胖易感基因SNP分型试剂盒及其使用方法。
背景技术
肥胖是一种常见的营养代谢性疾病。2002年WHO将肥胖列为造成人类疾病负担的全球一级风险因素之一，预防肥胖症的流行也是21世纪前50年世界各国面临的最大公共卫生挑战之一。家系分析和双生子研究表明遗传因素在肥胖发生中起着非常重要的作用，有研究显示父母双方有一方肥胖者，其子女发生肥胖的概率为41-50%，而父母双方均肥胖者，其子女发生肥胖的概率增为66-80%。过去有关候选基因的大量研究已经表明，大多数基因与人类脂肪组织中肥胖的发生相关。与人体体质量相关的40%以上的基因变异可以产生遗传差异。随着分子遗传学的进展，人们发现肥胖是多基因遗传病，许多国家都在开展肥胖候选基因研究，到目前为止已经发现600余种基因位点与肥胖症的发生有关，得到广泛证实的与体重调节密切相关的基因主要包括体脂量和肥胖症相关（FTO）基因、瘦素受体（LEPR）基因、载脂蛋白E（APOE）基因、黑皮质素-4受体（MC4R）基因、解偶联蛋白（UCP2）基因、β3-肾上腺素能受体（ADRB3）基因、过氧化物酶增殖活化受体γ（PPARγ2）基因、GNPDA2基因、KCTD15基因、NEGR1基因等。
目前国内常规用于肥胖症基因变异的主要检测方法是限制性片段长度多态性法（RestrictionFragmentLengthPolymorphism,RFLP），其原理是当变异影响到某一限制性内切酶的酶切位点时，简单地通过酶切处理患者的PCR产物继而电泳检测是否有变异的方法。但是这种方法存在耗时长，操作繁琐，准确度不高等缺点。也有利用PCR结合DNA测序方法进行基因多态性位点的检测，但是这种方法在大规模人群筛查或检测多个基因多个位点的应用受到一定限制。因此有必要建立一种高通量、高效能、低成本的肥胖易感基因SNP分型方法，以实现临床快速检测或规模化人群筛查。
SNaPshot技术是一种基于单碱基延伸原理的SNP分型新方法，包括三个基本步骤：扩增、引物延伸和分析。
用单一PCR或多重PCR扩增包括SNP位点在内的区域，然后向最初反应管或板孔中直接加入核酸外切酶（Exonuclease，Exo）消化单链引物，以及虾-碱性磷酸酶（ShrimpAlkalinePhosphatase，SAP）消化未结合的dNTP底物。去除引物和dNTP，可有效避免其在随后引物反应中的干扰。在ExoSAP酶处理后的PCR产物中加入SNP延伸产物、四种荧光标记的ddNTP混合物以及聚合酶共同完成引物延伸，最后用GeneMapper软件进行等位基因自动化分析。电泳检测的峰高受延伸引物的浓度影响，延伸引物的片段长度决定峰的位置，延伸位点碱基的类型决定电泳峰的颜色。SNPs作为第三代遗传标记应用于疾病基因的定位、克隆和鉴定，具有快速、简便、高通量的特点。
发明内容
本发明的目的是针对目前中国人群肥胖易感基因SNP位点的特点，选择有密切相关性的12个SNP位点作为筛查目标，弥补目前现有SNP分型筛查方法的不足，提供一种简单、高通量、高效能、低成本的适合中国人群的肥胖易感基因SNP位点分型试剂盒及其使用方法。
解决上述技术问题的技术方案是：一种中国人群肥胖易感基因SNP分型用试剂盒，该试剂盒包括以下内容：
（1）PCR反应试剂：包括10×PCR缓冲液、Mg2+离子、底物dNTP、FastTaq酶，SNaPshot混合液；
（2）按一定比例混合的针对10个肥胖易感基因11个区段进行多重PCR扩增的正向引物和反向引物；
（3）按一定比例混合的针对10个肥胖易感基因12个SNP位点的PCR延伸引物；
（4）PCR产物纯化试剂：包括核酸外切酶、虾-碱性磷酸酶及其配套的缓冲液；
（5）对照标本：包括单个SNP位点纯合、杂合突变的阳性对照标本、阴性对照标本；
所述试剂盒以FTO基因rs9939609位点和rs8050136位点、LEPR基因rs1137100位点、APOE基因rs429358位点和rs7412位点、MC4R基因rs17782313位点、UCP2基因rs660339位点、ADRB3基因rs4994位点、PPARγ2基因rs1801282位点、GNPDA2基因rs10938397位点、KCTD15基因rs29941位点、NEGR1基因rs3101336位点共12个位点为检测对象，针对每个SNP位点的突变分别设计出扩增引物和延伸引物，针对各个SNP位点进行多重PCR扩增和标记延伸，通过毛细管电泳分析，同时获得12个SNP位点的基因型；
所述FTO基因rs9939609位点扩增的正向引物和反向引物是5’-CTGGCTCTTGAATGAAATAGGA-3’和5’-GTCACACTCAGCCTCTCTACCA-3’；
所述FTO基因rs8050136位点扩增的正向引物和反向引物是5’-TGTGACAGTGCCAGCTTCAT-3’和5’-CACCAAGATGGTCATGTCTGAT-3’；
所述LEPR基因rs1137100位点扩增的正向引物和反向引物是5’-TTGCCTGCTGGACTCTCAA-3’和5’-AGAGATATTCCTTGCCTGAAGA-3’；
所述APOE基因rs429358位点扩增的正向引物和反向引物与所述APOE基因rs7412位点扩增的正向引物和反向引物相同，均是5’-CTGATGGACGAGACCATGAAG-3’和5’-TCGGCGTTCAGTGATTGTC-3’；
所述MC4R基因rs17782313位点扩增的正向引物和反向引物是5’-AGGCTCTGCTCTGTGTCTCTT-3’和5’-CTTCTGGAGGCAGGTTCTGT-3’；
所述UCP2基因rs660339位点扩增的正向引物和反向引物是5’-CATCGCAGATCTCATCACCT-3’和5’-TGCTCCATACTCACGCTCAG-3’；
所述ADRB3基因rs4994位点扩增的正向引物和反向引物是5’-CTCTCATGCCTTGCTGTC-3’和5’-GGTTGGTCACAGCCAGGTA-3’；
所述PPARγ2基因rs1801282位点扩增的正向引物和反向引物是5’-GACAGTGCCAGCCAATTCA-3’和5’-TGAACGCGATAGCAACGAG-3’；
所述GNPDA2基因rs10938397位点扩增的正向引物和反向引物是5’-TCTGTGCAGAGATGGCTGAT-3’和5’-GTGGTGATTCCACTGGCATA-3’；
所述KCTD15基因rs29941位点扩增的正向引物和反向引物是5’-TCATGCCTGGATGCACAAC-3’和5’-GATCTCACAACCAGCGAGTTC-3’；
所述NEGR1基因rs3101336位点扩增的正向引物和反向引物是5’-CCACGTAAAAGCCTGTCAGA-3’和5’-TGACCAGGGATGGAGCTATG-3’；
所述FTO基因rs9939609位点的延伸引物是(T)13AGAGACTATCCAAGTGCATCAC；
所述FTO基因rs8050136位点的延伸引物是(T)22TTGCCCACTGTGGCAAT；
所述LEPR基因rs1137100位点的延伸引物是(T)23TGCAGACAACATTGAAGGAA；
所述APOE基因rs429358位点的延伸引物是(T)30CGGACATGGAGGACGTG；
所述APOE基因rs7412位点的延伸引物序列是(T)34CCGATGACCTGCAGAAG；
所述MC4R基因rs17782313位点的延伸引物是(T)33TAAAGCAGGAGAGATTGTATCC；
所述UCP2基因rs660339位点的延伸引物是(T)43CCAGTGCGCGCTACAG；
所述ADRB3基因rs4994位点的延伸引物是(T)44GTCTGGAGTCTCGGAGTCC；
所述PPARγ2基因rs1801282位点的延伸引物是(T)46CTGGGAGATTCTCCTATTGAC；
所述GNPDA2基因rs10938397位点的延伸引物是(T)49TGCTAAGAACATTCTTGAAAAC；
所述KCTD15基因rs29941位点的延伸引物是(T)55TGACCTCTGCAGACCTAGGA；
所述NEGR1基因rs3101336位点的延伸引物是(T)56AAGAAAGCAATGACTGAACTTAG。
本发明的进一步技术方案是：所述针对10个肥胖易感基因11个区段进行多重PCR扩增的正向引物和反向引物的终浓度为0.1μM。
所述针对10个肥胖易感基因12个SNP位点的PCR延伸引物的终浓度分别为：FTO基因rs9939609位点为0.20μM；FTO基因rs8050136位点为0.10μM；LEPR基因rs1137100位点为0.20μM；APOE基因rs429358位点为0.10μM；APOE基因rs7412位点为0.15μM；MC4R基因rs17782313位点为0.25μM；UCP2基因rs660339位点为0.15μM；ADRB3基因rs4994位点为0.25μM；PPARγ2基因rs1801282位点为0.20μM；GNPDA2基因rs10938397位点为0.30μM；KCTD15基因rs29941位点为0.20μM；NEGR1基因rs3101336位点为0.25μM。
本发明的另一技术方案是：上述中国人群肥胖易感基因SNP分型用试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
（1）10个肥胖易感基因12个SNP位点进行单对引物PCR扩增；
（2）10个肥胖易感基因12个SNP位点分为3组进行多重PCR扩增；
（3）多重PCR扩增产物纯化；
（4）分为2组进行SNaPshot延伸反应优化；
（5）延伸产物纯化；
（6）分为2组在ABI3730测序仪上进行扫板分析和GeneMapperID-XVersion1.4软件数据分析。
本发明使用PrimerPremier5引物设计程序（加拿大PREMIER生物软件公司提供软件）协助设计引物，通过多重PCR扩增，使被检测样本的12个SNP位点得到扩增富集。PCR扩增引物设计时选择目的区域上下游100~200bp的距离引物设计的起始位点，引物与序列匹配的特异性更好，引物间退火温度要尽量一致，且保持在55℃左右，使在一个多重PCR反应中的各个扩增效率相当。11个扩增片段包含所要检测的12个SNP位点，分为三组：A组包括FTO基因rs9939609位点、FTO基因rs8050136位点、LEPR基因rs1137100位点、UCP2基因rs660339位点、PPARγ2基因rs1801282位点、GNPDA2基因rs10938397位点、KCTD15基因rs29941位点和NEGR1基因rs3101336位点，其扩增片段长度依次为330bp、226bp、599bp、432bp、436bp、558bp、319bp和395bp；B组包括APOE基因rs429358位点和rs7412位点，共同扩增片段长度为720bp；C组包括MC4R基因rs17782313位点和ADRB3基因rs4994位点，其扩增片段长度分别为604bp和516bp。三组多重PCR扩增结束后可通过1.5%琼脂糖凝胶电泳进行扩增片段检测，发现11条扩增条带。
接着进行PCR扩增产物的酶反应纯化，去除多余的dNTP及引物等杂质，再对11个富集的片段进行寡核苷酸引物的PCR扩增，又进一步针对经过扩增的12个SNP位点进行延伸引物设计，引物设计的指导思想是：仅在SNP位点的上下游设计正向或反向的延伸引物，引物设计长度较扩增片段长度少1个碱基，延伸的单个碱基为带有相应颜色荧光标记的双脱氧核苷酸ddNTP。各个引物扩增片段长度需要有一定的差异，均匀分布在18-80bp之间，以便于毛细管电泳检测。分为两组进行延伸反应，理论上，第1组的FTO基因rs9939609位点、FTO基因rs8050136位点、LEPR基因rs1137100位点、MC4R基因rs17782313位点、UCP2基因rs660339位点、ADRB3基因rs4994位点、PPARγ2基因rs1801282位点、GNPDA2基因rs10938397位点、KCTD15基因rs29941位点、NEGR1基因rs3101336位点的延伸引物片段在经过毛细管电泳后的长度依次为35bp、39bp、43bp、55bp、59bp、63bp、67bp、71bp、75bp、79bp；第2组的APOE基因rs429358和APOE基因rs7412位点的延伸引物片段在经过毛细管电泳后的长度分别为47bp和51bp。
如表1所示，实际电泳过程可能存在漂移现象，尤其是发生了变异位点的峰漂移更多，即与分子量marker所测片段大小有差距，但不会影响整体结果判读。
表110个肥胖易感基因12个SNP位点延伸片段理论长度
这样，经过对变异位点的单个碱基进行荧光标记PCR延伸扩增后，再进行一次扩增产物的酶反应纯化，带有不同荧光的不同长度的片段经遗传分析毛细管电泳后就能够分析出相应片段所携带的碱基类型，延伸引物的片段长度决定峰的位置，延伸位点碱基的类型决定电泳峰的颜色，延伸引物的浓度影响电泳检测的峰高。A碱基的峰颜色为绿色，G碱基为蓝色，T碱基为红色，C碱基为黑色。根据峰的颜色可以清楚方便的判断为野生型（正常）还是突变型，如表2所示：
表212个SNP位点野生型与突变型颜色标记
所示设计为反向测序反应，因此在毛细管电泳结果中野生型与突变型均要按反向测序去判断。FTO基因rs9939609位点正向测序突变类型为C→A，反向测序则为A→T；ADRB3基因rs4994位点正向测序突变类型为T→C，反向测序则为A→G；GNPDA2基因rs10938397位点正向测序突变类型为G→A，反向测序为C→T；KCTD15基因rs29941位点正向测序突变类型为T→C，反向测序为A→G；NEGR1基因rs3101336位点正向测序突变类型为G→A，反向测序为C→T。
本发明将上述12个SNP位点在两个反应中检测，大大节省了检测的时间、试剂、人力和物力，提高了诊断效率。
PCR扩增引物序列和扩增长度见表3所示：
表310个肥胖易感基因12个SNP位点PCR扩增引物
PCR延伸引物见表4所示：
表410个肥胖易感基因12个SNP位点的PCR延伸引物
为了使检测准确可靠、简单易行，本试剂盒含有PCR扩增反应试剂，包括10×PCR缓冲液、Mg2+离子、dNTP、FastTaq酶、引物混合液、延伸引物混合液、SNaPshot混合液，纯化用SAP酶、ExoI酶及其配套的缓冲液；阳性对照标本、阴性对照标本以及说明书。其主要功能在于，将所需的试剂集成在一个小盒内，进行片段扩增，纯化可以在试剂盒提供试剂的基础上顺序而简便地完成。
在过去的十几年中，虽然已有多种SNP分型检测的技术得到发展，但总的来说，尚缺乏一种适用于肥胖易感基因SNP位点分型的技术方法，本发明是一种准确、简便、高通量又经济的基因分型检测的方法。
下面，结合附图和实施例对本发明之中国人群肥胖易感基因SNP分型用试剂盒及其使用方法的技术特征作进一步的说明。
附图说明
图1：中国人群肥胖易感基因SNP位点基因分型原理图。
图2：本发明检测样品一第1组9个肥胖症易感基因10个多态性位点的基因分型图。
图3：本发明检测样品二第1组9个肥胖症易感基因10个多态性位点的基因分型图。
图4：本发明检测样品三第1组9个肥胖症易感基因10个多态性位点的基因分型图。
图5：本发明检测样品四第1组9个肥胖症易感基因10个多态性位点的基因分型图。
图6：本发明检测样品五第1组9个肥胖症易感基因10个多态性位点的基因分型图。
图7：本发明检测样品六第1组9个肥胖症易感基因10个多态性位点的基因分型图。
图8：本发明检测样品七第1组9个肥胖症易感基因10个多态性位点的基因分型图。
图9：本发明检测样品一第2组1个肥胖症易感基因2个多态性位点的基因分型图。
图10：本发明检测样品二第2组1个肥胖症易感基因2个多态性位点的基因分型图。
图11：本发明检测样品三第2组1个肥胖症易感基因2个多态性位点的基因分型图。
图12：本发明检测样品四第2组1个肥胖症易感基因2个多态性位点的基因分型图。
图13：本发明检测样品五第2组1个肥胖症易感基因2个多态性位点的基因分型图。
图14：本发明检测样品六第2组1个肥胖症易感基因2个多态性位点的基因分型图。
图15：本发明检测样品七第2组1个肥胖症易感基因2个多态性位点的基因分型图。
一个样品分两组进行扫板，其中图2～图8中有10个多态性位点的基因分型，图9～图15中有2个多态性位点的基因分型。
具体实施方式
本发明的的分型原理为：通过在引物的5’末端连接不同数目的核苷酸尾巴，同时进行多引物（复合）分析，这样各引物可因核苷酸尾巴数目的不同而区分。在电泳平台上应用5种荧光染料检测，第5种染料标记内标，内标用以纠正电泳时泳道间产生的迁移误差。四种核苷酸各标记不同的染料颜色：A（green，绿色）、G（blue，蓝色）、C（yellow，黑色）和T（red，红色）。因此，在电泳中一个蓝色峰形的出现，表明一个G（ddGTP）通过聚合酶结合在SNP位点上。在检测时，峰的颜色显示所选择的SNP位点核苷酸信息，而峰的位置与SNP遗传标记5’加尾的长度有关，显示相互区别的不同位点。纯合的等位基因以单峰形式出现，杂合的等位基因则以毗邻的两个峰显示。
实施例1：如附图所示，肥胖患者易感基因SNP分型监测：
样本选择：样本来源于柳州市妇幼保健院儿童保健科、柳州市红十字会医院、柳州市广西科技大学第一附属医院肥胖患者DNA文库。均是柳州市为主的柳北地区患者，其中男50例，女50例，库中所有患者样本收集前均签署了知情同意书，并承诺配合后续的诊疗和随访。
1、10个肥胖易感基因11个区段进行单对引物PCR扩增
PCR反应体系为20μL,包括10×PCR缓冲液（Mg2+free）2μL，0.8μLMgCl2（50mM），dNTP混合物0.5μL（10mM），0.2μLPlatinumTaqDNA聚合酶（5U），正向引物0.5μL，反向引物0.5μL，1μLDNA模板（20mg/L），14.5μLddH2O。PCR反应条件为：95℃变性2min，95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，33个循环，最后72℃延伸5min，结束后4℃保存。PCR反应在美国ABI公司9700热循环仪中进行。PCR扩增后，取PCR反应产物5μL在1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，电泳条带清晰，大小正确，即表明实验成功。
2、10个肥胖易感基因11个区段分为三组进行多重PCR扩增反应
11个区段分为三组进行多重PCR扩增反应，A组包括FTO基因rs9939609位点、FTO基因rs8050136位点、LEPR基因rs1137100位点、UCP2基因rs660339位点、PPARγ2基因rs1801282位点、GNPDA2基因rs10938397位点、KCTD15基因rs29941位点、NEGR1基因rs3101336位点；B组包括APOE基因rs429358位点和rs7412位点，C组包括MC4R基因rs17782313位点、ADRB3基因rs4994位点。每组PCR反应体系为20μL,包括10×PCR缓冲液（Mg2+free）2μL，dNTP混合物0.5μL（10mM），0.8μLMgCl2（50mM），PlatinumTaqDNA聚合酶0.2μL（5U），扩增引物混合液0.5μL，1μLDNA模板（20mg/L），14.2μLddH2O。PCR反应条件为：95℃变性2min，94℃变性20s，56℃退火30s，72℃延伸40s，33个循环，最后72℃延伸5min，结束后4℃保存。PCR反应在9700热循环仪（美国ABI公司）中进行。PCR扩增后，取PCR反应产物2μL做琼脂糖凝胶电泳检测有片段的表明实验成功。扩增引物序列见表3。
3、多重PCR扩增产物纯化
用虾碱酶方法进行PCR产物的纯化，总体积为10μL，在2μLPCR产物中加入0.3μLSAP（1U/μL）、0.2μLExoI（20U/μL）和7.5μLddH2O，震荡混匀，37℃保温1h40min，然后75℃保温15min以灭活SAP和ExoI酶，纯化好的模板可以在4℃保存24h或-20℃长期保存。
4、SNaPshot延伸反应的优化
分为2组进行延伸反应：第1组包括FTO基因rs9939609位点、FTO基因rs8050136位点、LEPR基因rs1137100位点、UCP2基因rs660339位点、PPARγ2基因rs1801282位点、GNPDA2基因rs10938397位点、KCTD15基因rs29941位点、NEGR1基因rs3101336位点、APOE基因rs429358位点和rs7412位点；第2组包括MC4R基因rs17782313位点、ADRB3基因rs4994位点。SNaPshot延伸反应体系：总体积为5μL，其中SnaPshot反应混合液2.5μL，上述纯化的多重PCR扩增产物1.5μL，SNaPshot延伸引物混合液0.7μL，GCbuffer0.3μL。SNaPshot延伸反应程序：96℃变性10s,51℃退火5s，60℃延伸30s，25个循环，结束后4℃保存。延伸引物序列见表4。
5、延伸产物纯化
用虾碱酶方法进行延伸产物的纯化，总体积为8μL，在5μL延伸产物中加入0.5μLSAP（1U/μL）和2.5μLddH2O，震荡混匀，37℃保温1h，然后75℃保温15min以灭活SAP，纯化好的模板可以在4℃保存24h或-20℃长期保存。
6、ABI3730测序仪扫板分析
分为2组进行扫板分析（分组与第二步多重PCR扩增反应一致）。96孔板中加入1μL上述纯化延伸产物，与GenescanTM-120LIZSizeStandard0.5μL和去离子甲酰胺8.5μL混合均匀后，95℃变性5min，在美国ABI3730测序仪上直接进行扫板。运行GeneMapperID-XVersion1.4软件行数据分析。根据电泳峰型颜色和位置不同进行结果判读。
以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种中国人群肥胖易感基因SNP分型用试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括以下内容：
（1）PCR反应试剂：包括10×PCR缓冲液、Mg2+离子、底物dNTP、FastTaq酶，SNaPshot混合液；
（2）按一定比例混合的针对10个肥胖易感基因11个区段进行多重PCR扩增的正向引物和反向引物；
（3）按一定比例混合的针对10个肥胖易感基因12个SNP位点的PCR延伸引物；
（4）PCR产物纯化试剂：包括核酸外切酶、虾-碱性磷酸酶及其配套的缓冲液；
（5）对照标本：包括单个SNP位点纯合、杂合突变的阳性对照标本、阴性对照标本；
所述试剂盒以FTO基因rs9939609位点和rs8050136位点、LEPR基因rs1137100位点、APOE基因rs429358位点和rs7412位点、MC4R基因rs17782313位点、UCP2基因rs660339位点、ADRB3基因rs4994位点、PPARγ2基因rs1801282位点、GNPDA2基因rs10938397位点、KCTD15基因rs29941位点、NEGR1基因rs3101336位点共12个位点为检测对象，针对每个SNP位点的突变分别设计出扩增引物和延伸引物，针对各个SNP位点进行多重PCR扩增和标记延伸，通过毛细管电泳分析，同时获得12个SNP位点的基因型；
所述FTO基因rs9939609位点扩增的正向引物和反向引物是5’-CTGGCTCTTGAATGAAATAGGA-3’和5’-GTCACACTCAGCCTCTCTACCA-3’；
所述FTO基因rs8050136位点扩增的正向引物和反向引物是5’-TGTGACAGTGCCAGCTTCAT-3’和5’-CACCAAGATGGTCATGTCTGAT-3’；
所述LEPR基因rs1137100位点扩增的正向引物和反向引物是5’-TTGCCTGCTGGACTCTCAA-3’和5’-AGAGATATTCCTTGCCTGAAGA-3’；
所述APOE基因rs429358位点扩增的正向引物和反向引物与所述APOE基因rs7412位点扩增的正向引物和反向引物相同，均是5’-CTGATGGACGAGACCATGAAG-3’和5’-TCGGCGTTCAGTGATTGTC-3’；
所述MC4R基因rs17782313位点扩增的正向引物和反向引物是5’-AGGCTCTGCTCTGTGTCTCTT-3’和5’-CTTCTGGAGGCAGGTTCTGT-3’；
所述UCP2基因rs660339位点扩增的正向引物和反向引物是5’-CATCGCAGATCTCATCACCT-3’和5’-TGCTCCATACTCACGCTCAG-3’；
所述ADRB3基因rs4994位点扩增的正向引物和反向引物是5’-CTCTCATGCCTTGCTGTC-3’和5’-GGTTGGTCACAGCCAGGTA-3’；
所述PPARγ2基因rs1801282位点扩增的正向引物和反向引物是5’-GACAGTGCCAGCCAATTCA-3’和5’-TGAACGCGATAGCAACGAG-3’；
所述GNPDA2基因rs10938397位点扩增的正向引物和反向引物是5’-TCTGTGCAGAGATGGCTGAT-3’和5’-GTGGTGATTCCACTGGCATA-3’；
所述KCTD15基因rs29941位点扩增的正向引物和反向引物是5’-TCATGCCTGGATGCACAAC-3’和5’-GATCTCACAACCAGCGAGTTC-3’；
所述NEGR1基因rs3101336位点扩增的正向引物和反向引物是5’-CCACGTAAAAGCCTGTCAGA-3’和5’-TGACCAGGGATGGAGCTATG-3’；
所述FTO基因rs9939609位点的延伸引物是(T)13AGAGACTATCCAAGTGCATCAC；
所述FTO基因rs8050136位点的延伸引物是(T)22TTGCCCACTGTGGCAAT；
所述LEPR基因rs1137100位点的延伸引物是(T)23TGCAGACAACATTGAAGGAA；
所述APOE基因rs429358位点的延伸引物是(T)30CGGACATGGAGGACGTG；
所述APOE基因rs7412位点的延伸引物序列是(T)34CCGATGACCTGCAGAAG；
所述MC4R基因rs17782313位点的延伸引物是(T)33TAAAGCAGGAGAGATTGTATCC；
所述UCP2基因rs660339位点的延伸引物是(T)43CCAGTGCGCGCTACAG；
所述ADRB3基因rs4994位点的延伸引物是(T)44GTCTGGAGTCTCGGAGTCC；
所述PPARγ2基因rs1801282位点的延伸引物是(T)46CTGGGAGATTCTCCTATTGAC；
所述GNPDA2基因rs10938397位点的延伸引物是(T)49TGCTAAGAACATTCTTGAAAAC；
所述KCTD15基因rs29941位点的延伸引物是(T)55TGACCTCTGCAGACCTAGGA；
所述NEGR1基因rs3101336位点的延伸引物是(T)56AAGAAAGCAATGACTGAACTTAG。
2.根据权利要求1所述的中国人群肥胖易感基因SNP分型用试剂盒，其特征在于：所述针对10个肥胖易感基因11个区段进行多重PCR扩增的正向引物和反向引物的终浓度为0.1μM。
3.根据权利要求1所述的中国人群肥胖易感基因SNP分型用试剂盒，其特征在于：所述针对10个肥胖易感基因12个SNP位点的PCR延伸引物的终浓度分别为：FTO基因rs9939609位点为0.20μM；FTO基因rs8050136位点为0.10μM；LEPR基因rs1137100位点为0.20μM；APOE基因rs429358位点为0.10μM；APOE基因rs7412位点为0.15μM；MC4R基因rs17782313位点为0.25μM；UCP2基因rs660339位点为0.15μM；ADRB3基因rs4994位点为0.25μM；PPARγ2基因rs1801282位点为0.20μM；GNPDA2基因rs10938397位点为0.30μM；KCTD15基因rs29941位点为0.20μM；NEGR1基因rs3101336位点为0.25μM。
4.一种如权利要求1-3任一项所述的中国人群肥胖易感基因SNP分型用试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）10个肥胖易感基因12个SNP位点进行单对引物PCR扩增；
（2）10个肥胖易感基因12个SNP位点分为3组进行多重PCR扩增；
（3）多重PCR扩增产物纯化；
（4）分为2组进行SNaPshot延伸反应优化；
（5）延伸产物纯化；
（6）分为2组在ABI3730测序仪上进行扫板分析和GeneMapperID-XVersion1.4软件数据分析。
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