CN104480195A - 肥胖基因检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了肥胖基因检测试剂盒，该试剂盒包括盒体及盒体内单独存放的试剂，试剂包括：(1)针对8个基因SNP多态位点的PCR反应引物组；(2)PCR扩增试剂；(3)琼脂糖凝胶电泳分析试剂。本发明通过PCR引物的设计使多个PCR扩增反应可在同一台PCR仪上同步进行，对受测者的相关基因进行检测，并实现检测的高效性、特异性，分析得到导致其肥胖的遗传因素，根据基因分型结果得到基因对体重BMI值的影响，计算目标体重区间，从而为受测者获得一个合适的减肥方案，采取相应的策略避免对其无效甚至是有害的方法。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测，具体涉及肥胖基因检测试剂盒。
背景技术
超重和肥胖是全球引起死亡的第五大风险，肥胖与许多疾病相关联，典型的如糖尿病，冠心病，动脉硬化等等。同时肥胖还带来了种种心理问题和社会歧视。全球有11亿超重人群，中国的肥胖人群也在不断激增，统计表明现今中国有至少3亿肥胖患者。人类肥胖是基因与环境共同作用的结果。缺乏运动和过度饮食是导致肥胖的主要外在因素。然而内在的基因因素也在很大程度上决定了一个人的肥胖程度，以及饮食和运动对肥胖的影响。
目前大部分减肥方案的制定未考虑并重视基因信息的作用，无法分析得到导致其肥胖的遗传因素，从而难以得到合适的减肥方案，可能对肥胖者无效甚至有害健康，目前对检测肥胖基因试剂盒的研究，由于引物设计的不足，难以达到检测的高效性、特异性。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种肥胖基因检测试剂盒，该试剂盒对受测者的相关基因进行检测，分析得到导致其肥胖的遗传因素，且PCR扩增反应在同一台PCR仪上同步进行并具备检测的高效性、特异性。
一种肥胖基因检测试剂盒，包括盒体及盒体内单独存放的试剂，存放的试剂包括：
(1)针对8个基因SNP多态位点的PCR反应引物组：
针对FAIM2基因SNP rs7138803的引物组：
5’-GAATTCCACAAGA-3’
5’-ACAGCAGGGTGAC-3’
5’-TGTGCGTGCACGC-3’
5’-CTGGGCAACAAG-3’
针对FTO基因SNP rs9939609的引物组：
5’-GCTGTGAATTTA-3’
5’-CAAGTGCATCACA-3’
5’-TGTTGGAATATGAG-3’
5’-ATAGTTTCGATC-3’
针对FTO基因SNP rs3751812的引物组：
5’-GTGAGCTGTCAAG-3’
5’-CTCCCTGCCAACTA-3’
5’-TCCTTAAAGATTC-3’
5’-ACATTGAAACAGC-3’
针对MC4R基因SNP rs10871777的引物组：
5’-GTGTTTTACACAA-3’
5’-CACACATGACAC-3’
5’-GTGTTTTACACA-3’
5’-TGTATATTGAAA-3’
针对GNPDA2基因SNP rs13130484的引物组：5’-CCCAGTCATGGCA-3’
5’-GCATTGCCTCTA-3’
5’-CCTCCGATTGCAG-3’
5’-AGATGGTTTCC-3’
针对SH2B1基因SNP rs4788102的引物组：
5’-GAGGACTTTTCAA-3’
5’-CCCAAGTAATC-3’
5’-GATTTATCCGTC-3’
5’-ATCTCAAAAAT-3’
针对MTCH2基因SNP rs10838738的引物组：
5’-CATTCCTAGGCACA-3’
5’-ACCTCATGCAGC-3’
5’-ATCTAGCCCCAAA-3’
5’-TCAGATTTCGG-3’
针对NEGR1基因SNP rs3101336的引物组：
5’-CAGACATCTATACA-3’
5’-ACTGAACTTAGC-3’
5’-CGAATTTAAGTCTC-3’
5’-TCTAGTACAAGC-3’；
(2)PCR扩增试剂；
(3)琼脂糖凝胶电泳分析试剂。
本发明提供的肥胖基因检测试剂盒的有益效果是：通过PCR引物的设计使多个PCR扩增反应在同一台PCR仪上同步进行，对受测者的相关基因进行检测，并实现检测的高效性、特异性，分析得到导致其肥胖的遗传因素，计算得到目标体重区间，从而为受测者获得一个合适的减肥方案，采取相应的策略避免对其无效甚至是有害的方法。
附图说明
图1是反应产物琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施方式
肥胖基因检测试剂盒，包括盒体及盒体内单独存放的试剂，存放的试剂包括：
(1)针对8个基因SNP多态位点的PCR反应引物组：
针对FAIM2基因SNP rs7138803的引物组：
5’-GAATTCCACAAGA-3’
5’-ACAGCAGGGTGAC-3’
5’-TGTGCGTGCACGC-3’
5’-CTGGGCAACAAG-3’
针对FTO基因SNP rs9939609的引物组：
5’-GCTGTGAATTTA-3’
5’-CAAGTGCATCACA-3’
5’-TGTTGGAATATGAG-3’
5’-ATAGTTTCGATC-3’
针对FTO基因SNP rs3751812的引物组：
5’-GTGAGCTGTCAAG-3’
5’-CTCCCTGCCAACTA-3’
5’-TCCTTAAAGATTC-3’
5’-ACATTGAAACAGC-3’
针对MC4R基因SNP rs10871777的引物组：
5’-GTGTTTTACACAA-3’
5’-CACACATGACAC-3’
5’-GTGTTTTACACA-3’
5’-TGTATATTGAAA-3’
针对GNPDA2基因SNP rs13130484的引物组：
5’-CCCAGTCATGGCA-3’
5’-GCATTGCCTCTA-3’
5’-CCTCCGATTGCAG-3’
5’-AGATGGTTTCC-3’
针对SH2B1基因SNP rs4788102的引物组：
5’-GAGGACTTTTCAA-3’
5’-CCCAAGTAATC-3’
5’-GATTTATCCGTC-3’
5’-ATCTCAAAAAT-3’
针对MTCH2基因SNP rs10838738的引物组：
5’-CATTCCTAGGCACA-3’
5’-ACCTCATGCAGC-3’
5’-ATCTAGCCCCAAA-3’
5’-TCAGATTTCGG-3’
针对NEGR1基因SNP rs3101336的引物组：
5’-CAGACATCTATACA-3’
5’-ACTGAACTTAGC-3’
5’-CGAATTTAAGTCTC-3’
5’-TCTAGTACAAGC-3’；
(2)PCR扩增试剂；
(3)琼脂糖凝胶电泳分析试剂。
下面将结合实施例对本发明提供的方法予以进一步的说明。
本实施例对肥胖者采用肥胖基因检测试剂盒同时检测8个基因的SNP多态位点，并根据基因分型结果得到基因对体重BMI值的影响，计算目标体重区间，从而更加科学合理的制定减肥目标，采取更加合适的减肥方案。
该肥胖者信息如下：性别男，身高180，体重97公斤，计算得BMI＝体重/身高2＝30，属于肥胖人群。
使用到的肥胖基因检测试剂盒内试剂由以下组成：
(1)针对8个基因SNP多态位点的PCR反应引物组：
针对FAIM2基因SNP rs7138803的引物组：
5’-GAATTCCACAAGA-3’
5’-ACAGCAGGGTGAC-3’
5’-TGTGCGTGCACGC-3’
5’-CTGGGCAACAAG-3’
针对FTO基因SNP rs9939609的引物组：
5’-GCTGTGAATTTA-3’
5’-CAAGTGCATCACA-3’
5’-TGTTGGAATATGAG-3’
5’-ATAGTTTCGATC-3’
针对FTO基因SNP rs3751812的引物组：
5’-GTGAGCTGTCAAG-3’
5’-CTCCCTGCCAACTA-3’
5’-TCCTTAAAGATTC-3’
5’-ACATTGAAACAGC-3’
针对MC4R基因SNP rs10871777的引物组：
5’-GTGTTTTACACAA-3’
5’-CACACATGACAC-3’
5’-GTGTTTTACACA-3’
5’-TGTATATTGAAA-3’
针对GNPDA2基因SNP rs13130484的引物组：
5’-CCCAGTCATGGCA-3’
5’-GCATTGCCTCTA-3’
5’-CCTCCGATTGCAG-3’
5’-AGATGGTTTCC-3’
针对SH2B1基因SNP rs4788102的引物组：
5’-GAGGACTTTTCAA-3’
5’-CCCAAGTAATC-3’
5’-GATTTATCCGTC-3’
5’-ATCTCAAAAAT-3’
针对MTCH2基因SNP rs10838738的引物组：
5’-CATTCCTAGGCACA-3’
5’-ACCTCATGCAGC-3’
5’-ATCTAGCCCCAAA-3’
5’-TCAGATTTCGG-3’
针对NEGR1基因SNP rs3101336的引物组：
5’-CAGACATCTATACA-3’
5’-ACTGAACTTAGC-3’
5’-CGAATTTAAGTCTC-3’
5’-TCTAGTACAAGC-3’。
(2)PCR扩增试剂：10×PCR缓冲液，该PCR缓冲液为100mM Tris-HClpH8.3，500mM KCl，15mM MgCl2；dNTPs混合物，该dNTPs混合物为三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸dGTP，三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸dATP，三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸dTTP，三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸dCTP四种核苷酸，各组分浓度为2.5mM；5U/μl热启动Taq酶。
(3)琼脂糖凝胶电泳分析试剂：琼脂糖、TAE缓冲液、DNA分子量标准、Goldview染色液和DNA上样缓冲液，该缓冲液以溴酚蓝为指示剂稀释至1X后使用。
使用上述肥胖基因检测试剂盒按如下步骤进行检测：
(1)提取样本基因组DNA。
采集该肥胖者唾液，向1-2ml唾液样品中加入500ul提取缓冲溶液，该DNA提取缓冲溶液溶剂为50mM的Tris-HCl pH7.4、0.5mM的EDTA和50mM的NaCl，反复吹打混匀后，8000×g离心5分钟，弃去上清，此步骤重复一次；得到的沉淀中加入500ul裂解液，该裂解液溶剂为50mM Tris-HClpH7.4，50mM Tris-HCl pH7.4，150mM NaCl，1mM EDTA，1％Triton x-100，1％Sodium deoxycholate，0.1％SDS，蛋白酶K20mg/mL，彻底悬浮沉淀并充分混匀后，室温放置30分钟，期间来回颠倒离心管数次；得到的混合液中，加入浓度为10mg/mLRNA酶的水溶液10μL，37℃下静置10min；得到的上清液中，加入等体积苯酚-氯仿混合溶液，苯酚和氯仿体积比为1∶1，充分混匀，混合液4℃，12000×g离心5分钟，上清液移入干净离心管内；加入等体积苯氛-氯仿-异戊醇混合溶液，苯酚、氯仿和异戊醇体积比为25∶24∶1，充分混匀后，4℃，12000×g离心5分钟，上清液移入干净离心管内；加入等体积氯仿-异戊醇混合溶液，充分混匀后，4℃，12000×g离心5分钟，上清液移入干净离心管内；加入0.6倍体积的冰浴异丙醇溶液及0.1倍的3mol/L醋酸钠溶液，-20℃静置60分钟后，4℃，12000×g离心10分钟，弃上清液；得到的沉淀物中加入0.5mL 70％乙醇清洗沉淀物，4℃，12000×g离心5分钟，弃上清液，此步骤重复一次；得到的沉淀物自然风干，加入20μL无菌超纯水回溶，电泳检测，-20℃保存。
(2)PCR扩增。
本实施例同时检测FAIM2基因SNPrs7138803、FTO基因SNP rs9939609、FTO基因SNP rs3751812、MC4R基因SNP rs10871777、GNPDA2基因SNPrs13130484、SH2B1基因SNP rs4788102、MTCH2基因SNP rs10838738、NEGR1基因SNP rs3101336，每个SNP的检测需要一对上下游引物、两条多态引物共4条PCR引物，共需要32条引物。每个SNP的检测需要做两管PCR扩增，为防止出现假阳性之类的反应，衡量PCR是否成功，加设一管阴性对照组，共做17管PCR，所述阴性对照组基因组模板及反应体系是一样的，但没有引物存在。
根据不同的检测位点，用相应的引物按如下比例分别配制PCR反应体系：2.5μ110×PCR缓冲液，2μl dNTPs，0.5μl引物组，热启动Taq酶0.15μl，基因组模板80mg，添加超纯水至总体积为25μl。
将装有反应溶液的Eppendorf试管放入ABI 9700 PCR仪中，设置反应条件如下：预变性95℃3min；热循环94℃30s，60℃30s，72℃30s，35个循环；延伸72℃3min。反应结束后，取出试管。
由于17管PCR扩增反应是在同一台PCR仪上同步进行的，为了实现检测的高效性、特异性，要求32条PCR引物的Tm值相近，为此需要先进行大量的DNA序列软件分析来设计PCR引物，并通过大量的实验来进行Tm值的优化并确定设计的合理性，本试剂盒各基因SNP多态性的检测是既相对独立又相互联系的，不可分割。
(3)琼脂糖凝胶电泳检测
将扩增后的产物进行琼脂糖电泳检测，过程如下3g琼脂糖，加入100mL去离子水，微波炉加热1min，冷却到60℃时加入5μL Goldview染色液，制成3％的琼脂糖凝胶。PCR产物10μL与6×TBE缓冲液0.8μL混合上样，电压100V电泳15min。紫外灯下读取结果并拍照，所得琼脂糖电泳检测图如图1所示。
检测得到8个基因分型分析结果如下：FAIM2基因SNP rs7138803分型结果为AA，FTO基因SNP rs9939609分型结果为AA，FTO基因SNPrs3751812分型结果为TT，MC4R基因SNP rs10871777分型结果为GG，GNPDA2基因SNP rs13130484分型结果为TT，SH2B1基因SNP rs4788102分型结果为AA，MTCH2基因SNP rs10838738分型结果为AG，NEGR1基因SNP rs3101336分型结果为CC。
根据基因分型测试结果，计算该男子目标体重区间，基因对体重BMI的影响因子如下表：
| 基因位点 | 影响因子 |
| FAIM2基因SNP rs7138803 | 0.41 |
| FTO基因SNP rs9939609 | 0.33 |
| FTO基因SNP rs3751812 | 0.33 |
| MC4R基因SNP rs10871777 | 0.2 |
| GNPDA2基因SNP rs13130484 | 0.19 |
| SH2B1基因SNP rs4788102 | 0.15 |
| MTCH2基因SNP rs10838738 | 0.07 |
| NEGR1基因SNP rs3101336 | 0.1 |
各肥胖基因对体重的贡献值分别为该基因系数与影响因子的乘积，根据8个肥胖基因分型结果，分析计算基因对该男子体重的影响，进一步计算基因对BMI总贡献值Y为2.68，目标体重区间为(BMI-22.6-Y)×H2～(BMI-18-Y)×H2＝15.2～30.2。中国人群正常体重范围是BMI18～22.6之间，通常情况下，该男子的减肥目标应该是减重23.9-38.9kg，然而，由于基因对其肥胖体重有所贡献，总贡献值为2.68，换算为体重为2.68×1.82kg，即8.7kg，并且由于基因的影响不同于环境因素的影响，可以被消减，因此应该将减重目标进行调整，根据基因结果将减重目标调整为15.2～30.2kg。这样可以避免该男过度减肥导致的运动过度或营养缺失等危害健康的状况发生，从而更加科学合理的制定减肥目标，采取更加合适的减肥方案。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.肥胖基因检测试剂盒，包括盒体及盒体内单独存放的试剂，其特征在于：存放的试剂包括：
(1)针对8个基因SNP多态位点的PCR反应引物组：
针对FAIM2基因SNP rs7138803的引物组：
5’-GAATTCCACAAGA-3’
5’-ACAGCAGGGTGAC-3’
5’-TGTGCGTGCACGC-3’
5’-CTGGGCAACAAG-3’
针对FTO基因SNP rs9939609的引物组：
5’-GCTGTGAATTTA-3’
5’-CAAGTGCATCACA-3’
5’-TGTTGGAATATGAG-3’
5’-ATAGTTTCGATC-3’
针对FTO基因SNP rs3751812的引物组：
5’-GTGAGCTGTCAAG-3’
5’-CTCCCTGCCAACTA-3’
5’-TCCTTAAAGATTC-3’
5’-ACATTGAAACAGC-3’
针对MC4R基因SNP rs10871777的引物组：
5’-GTGTTTTACACAA-3’
5’-CACACATGACAC-3’
5’-GTGTTTTACACA-3’
5’-TGTATATTGAAA-3’
针对GNPDA2基因SNP rs13130484的引物组：
5’-CCCAGTCATGGCA-3’
5’-GCATTGCCTCTA-3’
5’-CCTCCGATTGCAG-3’
5’-AGATGGTTTCC-3’
针对SH2B1基因SNP rs4788102的引物组：
5’-GAGGACTTTTCAA-3’
5’-CCCAAGTAATC-3’
5’-GATTTATCCGTC-3’
5’-ATCTCAAAAAT-3’
针对MTCH2基因SNP rs10838738的引物组：
5’-CATTCCTAGGCACA-3’
5’-ACCTCATGCAGC-3’
5’-ATCTAGCCCCAAA-3’
5’-TCAGATTTCGG-3’
针对NEGR1基因SNP rs3101336的引物组：
5’-CAGACATCTATACA-3’
5’-ACTGAACTTAGC-3’
5’-CGAATTTAAGTCTC-3’
5’-TCTAGTACAAGC-3’；
(2)PCR扩增试剂；
(3)琼脂糖凝胶电泳分析试剂。
2.根据权利要求1所述的肥胖基因检测试剂盒，其特征在于：所述引物用量均为0.5-1.0μl。
3.根据权利要求1所述的肥胖基因检测试剂盒，其特征在于：所述PCR扩增试剂包括：10×PCR缓冲液，dNTPs，热启动Taq酶，基因组模板。
4.根据权利要求3所述的肥胖基因检测试剂盒，其特征在于：所述PCR缓冲液包含：100mM Tris-HCl pH8.3，500mM KCl，15mM MgCl2。
5.根据权利要求3所述的肥胖基因检测试剂盒，其特征在于：所述PCR扩增试剂用量为：10×PCR缓冲液2.5μl，dNTPs2μl，热启动Taq酶0.1-0.2μl，基因组模板50-100ng。
6.根据权利要求1所述的肥胖基因检测试剂盒，其特征在于：所述琼脂糖凝胶电泳分析试剂包括：琼脂糖、TAE缓冲液、DNA分子量标准、DNA无毒染料和DNA上样缓冲液。
7.根据权利要求6所述的肥胖基因检测试剂盒，其特征在于：所述DNA无毒染料优选Biotium Gelred无毒染料。
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| CN105296619A (zh) * | 2015-10-16 | 2016-02-03 | 柳州市妇幼保健院 | 中国人群肥胖易感基因snp分型用试剂盒及其使用方法 |
| CN105936942A (zh) * | 2016-07-06 | 2016-09-14 | 上海市内分泌代谢病研究所 | 一种lgr4基因检测试剂盒 |
| CN108841966A (zh) * | 2018-06-12 | 2018-11-20 | 广州中安基因科技有限公司 | 一种瘦身基因检测试剂盒 |
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20150401 |
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |