CN105671137A - 运动心率反应的检测试剂盒和计算方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了人体运动心率反应的基因检测试剂盒，该试剂盒包括盒体及盒体内单独存放的试剂，试剂包括：（1）针对9个基因SNP多态位点的PCR反应引物组（2）PCR扩增试剂（3）琼脂糖凝胶电泳分析试剂。本发明通过PCR引物的设计使多个PCR扩增反应可在同一台PCR仪上同步进行，对受测者的相关基因进行检测，并实现检测的高效性、特异性，分析得到心率随健身运动周期变化的基因基础，从而为受测者获得一个合适的运动方案，评估相应运动强度，采取相应的策略避免对其无效甚至是有害的方法。同时可以辅助专业教练员对运动员的训练指导，评估运动员的训练强度。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测，具体涉及人体运动心率反应基因检测试剂盒。
背景技术
心率是心脏单位时间内的搏动次数。心率是衡量人体健康的重要指标。心率的变化反应了人体体征的变化。不规律和不稳定的心率波动预示这病患的发生。人体在安静时的心率成为安静心率，而在进行运动或较剧烈运动时的心率成为运动心率，较安静心率而言，运动时的心率会随人体对氧气、能量需求的上升而上升。对于进行常规健身运动和进行专业训练的群体来说，运动心率会随着锻炼周期的累计而呈现一定的下降，这表示锻炼个体的体能增加。健身教练和专业教练会根据运动心率的下降来衡量某个周期内运动强度的高低，锻炼效果的好坏。如果经过一段时间的训练，同样强度的运动下，运动心率没有较初始时期下降，则被认为运动强度不够。在这种情况下，教练会选择加大运动强度。这是十分普遍的做法。然而，根据科学研究发现，有相当比例的个体其运动心率并不会随运动周期的累积而下降，盲目的加大运动强度会给个体带来诸多运动损伤，甚至会导致高度的心脏负荷而发生猝死。如何避免类似状况的发生，改变现有非科学的经验模式是亟待解决的问题。心率在很大程度上是由基因决定的。从基因的角度来解决上述问题是非常可行和合理的。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种运动心率反应基因检测试剂盒，该试剂盒对受测者的相关基因进行检测，分析得到心率随健身运动周期变化的基因基础，从而为受测者获得一个合适的运动方案，评估相应运动强度，采取相应的策略避免对其无效甚至是有害的方法。同时可以辅助专业教练员对运动员的训练指导，评估运动员的训练强度。且PCR扩增反应在同一台PCR仪上同步进行并具备检测的高效性、特异性。
一种运动心率反应基因检测试剂盒，包括盒体及盒体内单独存放的试剂，存放的试剂包括：
（1）针对9个基因SNP多态位点的PCR反应引物组（以下引物序列方向均为5’端至3’端）：
针对SNPrs2979481的引物组：
1GCAACATACCAAGAGC
2CAGACAGGATTCCA
3CAGACCATGGTG
4CGGGATGAGTCA
针对SNPrs6432018的引物组：
1CCAAAAAGCAGTC
2GGTATCTCCTTTGT
3AATAGGTGCAATATT
4GGCTGAGGCAGCA
针对SNPrs2253206的引物组：
1GATAAGTTACAGTTAA
2CATTCGCCTACC
3CCCGGGACCACTCA
4CTCTCCATCTGT
针对SNPrs1560488的引物组：
1GATAGTGTAAAAAACA
2GTTTGTTCAGTCC
3CTTTGCATATTAG
4AGACTCACTAAAC
针对SNPrs10248479的引物组：
1GAACTGTGTGGAAACG
2CTTTAGTGTAGAA
3ATAAAGTTTAAATTC
4ACGAGGAATGAG
针对SNPrs857838的引物组：
1GGGACTGTCTATAA
2AACATCTAATGAGG
3ATGTTAGCCTAGC
4AGATTAGCAAAC
针对SNPrs909562的引物组：
1GCTTCACAAGCGGTTTC
2GGACCTTGTTTGGA
3GTCCTCAAAAGTAG
4AGGATTGGAAAATGCACT
针对SNPrs4759659的引物组：
1GGAGGGGGCGTAGCA
2CAGAACTTGTACTC
3CCTGTAATTCCAG
4CACATTTTAAAATGG
针对SNPrs2057368的引物组：
1AAACAAATTTTAAAAA
2GTTTCAAGCAGGGGCTC
3GTGGTAAAGTGGTGG
4ATGTAAAATCCATT
（2）PCR扩增试剂；
（3）琼脂糖凝胶电泳分析试剂。
本发明提供的运动心率反应基因检测试剂盒的有益效果是：通过PCR引物的设计使多个PCR扩增反应在同一台PCR仪上同步进行，对受测者的相关基因进行检测，并实现检测的高效性、特异性，分析得到心率随健身运动周期变化的基因基础，从而为受测者获得一个合适的运动方案，评估相应运动强度，采取相应的策略避免对其无效甚至是有害的方法。同时可以辅助专业教练员对运动员的训练指导，评估运动员的训练强度。
附图说明
图1是反应产物琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施方式
运动心率反应基因检测试剂盒，包括盒体及盒体内单独存放的试剂，存放的试剂包括：
（1）针对9个基因SNP多态位点的PCR反应引物组（以下引物序列方向均为5’端至3’端）：
针对SNPrs2979481的引物组：
1GCAACATACCAAGAGC
2CAGACAGGATTCCA
3CAGACCATGGTG
4CGGGATGAGTCA
针对SNPrs6432018的引物组：
1CCAAAAAGCAGTC
2GGTATCTCCTTTGT
3AATAGGTGCAATATT
4GGCTGAGGCAGCA
针对SNPrs2253206的引物组：
1GATAAGTTACAGTTAA
2CATTCGCCTACC
3CCCGGGACCACTCA
4CTCTCCATCTGT
针对SNPrs1560488的引物组：
1GATAGTGTAAAAAACA
2GTTTGTTCAGTCC
3CTTTGCATATTAG
4AGACTCACTAAAC
针对SNPrs10248479的引物组：
1GAACTGTGTGGAAACG
2CTTTAGTGTAGAA
3ATAAAGTTTAAATTC
4ACGAGGAATGAG
针对SNPrs857838的引物组：
1GGGACTGTCTATAA
2AACATCTAATGAGG
3ATGTTAGCCTAGC
4AGATTAGCAAAC
针对SNPrs909562的引物组：
1GCTTCACAAGCGGTTTC
2GGACCTTGTTTGGA
3GTCCTCAAAAGTAG
4AGGATTGGAAAATGCACT
针对SNPrs4759659的引物组：
1GGAGGGGGCGTAGCA
2CAGAACTTGTACTC
3CCTGTAATTCCAG
4CACATTTTAAAATGG
针对SNPrs2057368的引物组：
1AAACAAATTTTAAAAA
2GTTTCAAGCAGGGGCTC
3GTGGTAAAGTGGTGG
4ATGTAAAATCCATT
（2）PCR扩增试剂；
（3）琼脂糖凝胶电泳分析试剂。
下面将结合实施例对本发明提供的方法予以进一步的说明。
本实施例对测试者采用运动心率反应基因检测试剂盒同时检测9个基因的SNP多态位点，并根据基因分型结果，分析得到心率随健身运动周期变化的基因基础，从而为受测者获得一个合适的运动方案，评估相应运动强度，采取相应的策略避免对其无效甚至是有害的方法。同时可以辅助专业教练员对运动员的训练指导，评估运动员的训练强度。
使用到的运动心率反应基因检测试剂盒内试剂由以下组成：
（1）针对9个基因SNP多态位点的PCR反应引物组（以下引物序列方向均为5’端至3’端）：
针对SNPrs2979481的引物组：
1GCAACATACCAAGAGC
2CAGACAGGATTCCA
3CAGACCATGGTG
4CGGGATGAGTCA
针对SNPrs6432018的引物组：
1CCAAAAAGCAGTC
2GGTATCTCCTTTGT
3AATAGGTGCAATATT
4GGCTGAGGCAGCA
针对SNPrs2253206的引物组：
1GATAAGTTACAGTTAA
2CATTCGCCTACC
3CCCGGGACCACTCA
4CTCTCCATCTGT
针对SNPrs1560488的引物组：
1GATAGTGTAAAAAACA
2GTTTGTTCAGTCC
3CTTTGCATATTAG
4AGACTCACTAAAC
针对SNPrs10248479的引物组：
1GAACTGTGTGGAAACG
2CTTTAGTGTAGAA
3ATAAAGTTTAAATTC
4ACGAGGAATGAG
针对SNPrs857838的引物组：
1GGGACTGTCTATAA
2AACATCTAATGAGG
3ATGTTAGCCTAGC
4AGATTAGCAAAC
针对SNPrs909562的引物组：
1GCTTCACAAGCGGTTTC
2GGACCTTGTTTGGA
3GTCCTCAAAAGTAG
4AGGATTGGAAAATGCACT
针对SNPrs4759659的引物组：
1GGAGGGGGCGTAGCA
2CAGAACTTGTACTC
3CCTGTAATTCCAG
4CACATTTTAAAATGG
针对SNPrs2057368的引物组：
1AAACAAATTTTAAAAA
2GTTTCAAGCAGGGGCTC
3GTGGTAAAGTGGTGG
4ATGTAAAATCCATT
（2）PCR扩增试剂：10×PCR缓冲液，该PCR缓冲液为100mMTris-HClpH8.3，500mMKCl，15mMMgCl2；dNTPs混合物，该dNTPs混合物为三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸dGTP，三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸dATP，三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸dTTP，三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸dCTP四种核苷酸，各组分浓度为2.5mM；5U/μl热启动Taq酶。
（3）琼脂糖凝胶电泳分析试剂：琼脂糖、TAE缓冲液、DNA分子量标准、Goldview染色液和DNA上样缓冲液，该缓冲液以溴酚蓝为指示剂稀释至1X后使用。
使用上述运动心率反应基因检测试剂盒按如下步骤进行检测：
（1）提取样本基因组DNA。
采集该测试者唾液，向1-2ml唾液样品中加入500ul提取缓冲溶液，该DNA提取缓冲溶液溶剂为50mM的Tris-HClpH7.4、0.5mM的EDTA和50mM的NaCl，反复吹打混匀后，8000×g离心5分钟，弃去上清，此步骤重复一次；得到的沉淀中加入500ul裂解液，该裂解液溶剂为50mMTris-HClpH7.4，50mMTris-HClpH7.4，150mMNaCl，1mMEDTA，1％Tritonx-100，1％Sodiumdeoxycholate，0.1％SDS，蛋白酶K20mg/mL，彻底悬浮沉淀并充分混匀后，室温放置30分钟，期间来回颠倒离心管数次；得到的混合液中，加入浓度为10mg/mLRNA酶的水溶液10μL，37℃下静置10min；得到的上清液中，加入等体积苯酚-氯仿混合溶液，苯酚和氯仿体积比为1∶1，充分混匀，混合液4℃，12000×g离心5分钟，上清液移入干净离心管内；加入等体积苯氛-氯仿-异戊醇混合溶液，苯酚、氯仿和异戊醇体积比为25∶24∶1，充分混匀后，4℃，12000×g离心5分钟，上清液移入干净离心管内；加入等体积氯仿-异戊醇混合溶液，充分混匀后，4℃，12000×g离心5分钟，上清液移入干净离心管内；加入0.6倍体积的冰浴异丙醇溶液及0.1倍的3mol/L醋酸钠溶液，-20℃静置60分钟后，4℃，12000×g离心10分钟，弃上清液；得到的沉淀物中加入0.5mL70％乙醇清洗沉淀物，4℃，12000×g离心5分钟，弃上清液，此步骤重复一次；得到的沉淀物自然风干，加入20μL无菌超纯水回溶，电泳检测，-20℃保存。
（2）PCR扩增
本实施例同时检测rs2979481、rs6432018、rs2253206、rs1560488、rs10248479、rs857838、rs909562、rs4759659和rs2057368。每个SNP的检测需要一对上下游引物、两条多态引物共4条PCR引物，共需要36条引物。每个SNP的检测需要做两管PCR扩增，为防止出现假阳性之类的反应，衡量PCR是否成功，加设一管阴性对照组，共做19管PCR，所述阴性对照组基因组模板及反应体系是一样的，但没有引物存在。
根据不同的检测位点，用相应的引物按如下比例分别配制PCR反应体系：2.5μl10×PCR缓冲液，2μldNTPs，0.5μl引物组，热启动Taq酶0.15μl，基因组模板80mg，添加超纯水至总体积为25μl。
将装有反应溶液的Eppendorf试管放入ABI9700PCR仪中，设置反应条件如下：预变性95℃3min；热循环94℃30s，60℃30s，72℃30s，35个循环；延伸72℃3min。反应结束后，取出试管。
由于19管PCR扩增反应是在同一台PCR仪上同步进行的，为了实现检测的高效性、特异性，要求36条PCR引物的Tm值相近，为此需要先进行大量的DNA序列软件分析来设计PCR引物，并通过大量的实验来进行Tm值的优化并确定设计的合理性，本试剂盒各基因SNP多态性的检测是既相对独立又相互联系的，不可分割。
（3）琼脂糖凝胶电泳检测
将扩增后的产物进行琼脂糖电泳检测，过程如下：3g琼脂糖，加入100mL去离子水，微波炉加热1min，冷却到60℃时加入5μLGoldview染色液，制成3%的琼脂糖凝胶。PCR产物10μL与6×TBE缓冲液0.8μL混合上样，电压100V电泳15min。紫外灯下读取结果并拍照，所得琼脂糖电泳检测图如图1所示。
检测得到9个基因分型分析结果如下：
根据以上分型结果进行统计，纯和的CommonAllele记为2，纯和的MinorAllele记为0，而杂合型记为1，因此以上9个基因的分型结果总和等于：1+1+1+1+1+2+1+1+2=11。根据对以上9高基因的综合研究，如果总和小于等于9，则受测者的HR50不会随着个体锻炼周期的累计而发生改变，如果总和大于等于16，则受测者的HR50在经过一段时间的锻炼之后会下降大约20bpm。而在该测试者来看，其总和介于9和16之间，其HR50会随运动周期和强度而降低，但降幅不超过20bpm。因此，如果有专业的健身教练指导时，该受测者应向教练表明该测试结果。因为，对于教练来讲，传统经验认为人体在经过一定时间的锻炼之后，其心率应该有一定程度的下降。如果没有下降，教练会认为该锻炼强度不够，会刻意加大运动强度或延长运动时间。这样的做法是不科学的，而且刻意加大强度和时间会损害健身者的健康。该测试结果提醒教练该个体在经过锻炼后，心率会有下降，但HR50下降幅度不会超过20bpm。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
核苷酸序列表
<110>武汉白原科技有限公司
<120>运动心率反应的检测试剂盒和计算方法
<130>1
<160>36
<170>PatentInversion3.3
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<212>DNA
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<400>36
atgtaaaatccatt14
Claims (8)
1.心率反应基因检测试剂盒，包括盒体及盒体内单独存放的试剂，其特征在于：存放的试剂包括：
（1）针对9个基因SNP多态位点的PCR反应引物组（以下引物序列方向均为5’端至3’端）：
针对SNPrs2979481的引物组：
1GCAACATACCAAGAGC
2CAGACAGGATTCCA
3CAGACCATGGTG
4CGGGATGAGTCA
针对SNPrs6432018的引物组：
1CCAAAAAGCAGTC
2GGTATCTCCTTTGT
3AATAGGTGCAATATT
4GGCTGAGGCAGCA
针对SNPrs2253206的引物组：
1GATAAGTTACAGTTAA
2CATTCGCCTACC
3CCCGGGACCACTCA
4CTCTCCATCTGT
针对SNPrs1560488的引物组：
1GATAGTGTAAAAAACA
2GTTTGTTCAGTCC
3CTTTGCATATTAG
4AGACTCACTAAAC
针对SNPrs10248479的引物组：
1GAACTGTGTGGAAACG
2CTTTAGTGTAGAA
3ATAAAGTTTAAATTC
4ACGAGGAATGAG
针对SNPrs857838的引物组：
1GGGACTGTCTATAA
2AACATCTAATGAGG
3ATGTTAGCCTAGC
4AGATTAGCAAAC
针对SNPrs909562的引物组：
1GCTTCACAAGCGGTTTC
2GGACCTTGTTTGGA
3GTCCTCAAAAGTAG
4AGGATTGGAAAATGCACT
针对SNPrs4759659的引物组：
1GGAGGGGGCGTAGCA
2CAGAACTTGTACTC
3CCTGTAATTCCAG
4CACATTTTAAAATGG
针对SNPrs2057368的引物组：
1AAACAAATTTTAAAAA
2GTTTCAAGCAGGGGCTC
3GTGGTAAAGTGGTGG
4ATGTAAAATCCATT
（2）PCR扩增试剂；
（3）琼脂糖凝胶电泳分析试剂。
2.根据权利要求1所述的心率反应基因检测试剂盒，其特征在于：所述引物用量均为0.5-1.0μl。
3.根据权利要求1所述的心率反应基因检测试剂盒，其特征在于：所述PCR扩增试剂包括：10×PCR缓冲液，dNTPs，热启动Taq酶，基因组模板。
4.根据权利要求3所述的心率反应基因检测试剂盒，其特征在于：所述PCR缓冲液包含：100mMTris-HClpH8.3，500mMKCl，15mMMgCl2。
5.根据权利要求3所述的心率反应基因检测试剂盒，其特征在于：所述PCR扩增试剂用量为：10×PCR缓冲液2.5μl，dNTPs2μl，热启动Taq酶0.1-0.2μl，基因组模板50-100ng。
6.根据权利要求1所述的心率反应基因检测试剂盒，其特征在于：所述琼脂糖凝胶电泳分析试剂包括：琼脂糖、TAE缓冲液、DNA分子量标准、DNA无毒染料和DNA上样缓冲液。
7.根据权利要求6所述的心率反应基因检测试剂盒，其特征在于：所述DNA无毒染料优选BiotiumGelred无毒染料。
8.根据权利要求1所述的心率反应基因检测试剂盒，其特征在于：依据9个基因的分型结果分别赋值（纯和型commonallele=2，杂合型=1，纯和型minorallele=0），然后进行加成，依据所得总和值来分析受测者HR50随运动周期和强度的变化。
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| CN201410651966.1A Pending CN105671137A (zh) | 2014-11-17 | 2014-11-17 | 运动心率反应的检测试剂盒和计算方法 |
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|---|---|
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106086222A (zh) * | 2016-08-24 | 2016-11-09 | 厦门美因生物科技有限公司 | 基于qPCR分型技术的运动基因检测评估方法及系统 |
| CN112941194A (zh) * | 2019-12-11 | 2021-06-11 | 宁波海尔施基因科技有限公司 | 一种检测人类健身潜力基因型的试剂盒和方法 |
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| US20020025530A1 (en) * | 2000-07-31 | 2002-02-28 | Jason Affourtit | PCR-based multiplex assay for determining haplotype |
| CN101705306A (zh) * | 2009-12-01 | 2010-05-12 | 华中农业大学 | 应用as-pcr检测牛尿苷酸合酶缺乏症的方法 |
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| CN102428190A (zh) * | 2009-03-27 | 2012-04-25 | 生命技术公司 | 用于检测等位基因变体的方法、组合物和试剂盒 |
-
2014
- 2014-11-17 CN CN201410651966.1A patent/CN105671137A/zh active Pending
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