CN107287338A - 多重荧光定量检测新生隐球菌和曲霉菌的试剂盒和方法 - Google Patents

多重荧光定量检测新生隐球菌和曲霉菌的试剂盒和方法 Download PDF

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王宏伟
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Abstract

本发明公开了多重荧光定量检测新生隐球菌和曲霉菌的试剂盒和方法。本发明提供了检测新生隐球菌和曲霉菌多重荧光定量试剂，包括检测新生隐球菌的引物1、检测新生隐球菌的引物2、检测新生隐球菌的探针1、检测曲霉菌的引物3、检测曲霉菌的引物4和检测曲霉菌的探针2。本发明的实验证明，本发明的试剂盒和检测方法基于多重的Taqman荧光定量检测技术，不仅可以快速明确含有的病原体，减少检测费用，提高仪器使用率，而且解决了临床呼吸道真菌含有病原体检测的通量问题，对临床的早期诊断和治疗具有重要的指导意义。

Description

多重荧光定量检测新生隐球菌和曲霉菌的试剂盒和方法
技术领域
本发明属于核酸检测技术领域，尤其涉及多重荧光定量检测新生隐球菌和曲霉菌的试剂盒和方法。
背景技术
侵袭性真菌含有主要的致病真菌有念珠菌属、曲霉属、隐球菌属等条件致病真菌，还有组织胞浆菌、皮炎芽生菌、孢子丝菌等地方流行性致病真菌。不同环境下，含有的真菌种类不同。侵袭性真菌含有早期没有特异性表现，所以很容易被掩盖，病死率很高。
新型隐球菌(Cryptococcus Neoformans，CN)是一种可引起人类严重含有的酵母样病原真菌，主要引起细胞免疫功能低下者，如器官移植、肺癌患者及艾滋病(AIDS)患者并发隐球菌病。
曲霉菌包括132个种和18个变种，临床上常见的有烟曲霉(A.fumigatus)，黄曲霉(A.flavus)，黑曲霉(A.niger)，杂色曲霉(A.versicolor)和构巢曲霉(A.nidulans)等。
其中烟曲霉存在于谷物、污染的食品、土壤和霉腐物中，是引起人和动物曲霉病的重要病原菌。含有肺部和其他器官，也能引起敏症。烟曲霉可寄生于肺内，发生肺结核样症状，是肺曲霉病的主要病原菌，还可产生烟曲霉毒素。黑曲霉能引起曲霉菌病，还能产生黑曲霉毒素。黄曲霉可引起肺、外耳道、皮肤脓皮病样曲霉病等，有些菌系可产生黄曲霉毒素，引起中毒或致癌。
目前市面上关于曲霉菌的实时荧光定量检测试剂盒寥寥无几，关于新生隐球菌和曲霉菌双重检测的试剂盒几乎没有。临床上，特别是肺癌患者免疫力低下的情况，经常伴随着新生隐球菌和曲霉菌双重真菌含有。所以研发多重荧光定量PCR同时检测新生隐球菌和曲霉菌的试剂盒及方法显便具有重要意义。
发明内容
本发明一个目的是提供检测新生隐球菌和曲霉菌多重荧光定量试剂。
本发明提供的试剂，包括检测新生隐球菌的引物1、检测新生隐球菌的引物2、检测新生隐球菌的探针1、检测曲霉菌的引物3、检测曲霉菌的引物4和检测曲霉菌的探针2；
所述引物1的核苷酸序列为序列2；
所述引物2的核苷酸序列为序列3；
所述探针1的核苷酸序列为序列4；
所述引物3的核苷酸序列为序列6；
所述引物4的核苷酸序列为序列7；
所述探针2的核苷酸序列为序列8。
上述试剂还包括内标荧光探针3，所述内标荧光探针3的核苷酸序列为序列10。
上述试剂中，所述各个探针的两端分别标记荧光基团和淬灭基团。
上述试剂中，所述引物1、所述引物2、所述探针1、所述引物3、所述引物4、所述探针2和所述探针3的摩尔比为2:2:1:2:2:1:1。
本发明的另一个目的是提供检测新生隐球菌和曲霉菌多重荧光定量PCR试剂。
本发明提供的PCR试剂，包括上述试剂；
所述各引物在所述PCR试剂中的浓度为0.4uM；
所述各探针在所述PCR试剂中的浓度为0.2uM。
含有上述试剂或所述PCR试剂的试剂盒也是本发明保护的范围。
试剂盒中还可以包括新生隐球菌IGS-1基因序列的标准品、曲霉菌ITS-1基因序列的标准品、内标、阳性对照品和阴性对照品。
新生隐球菌IGS-1基因序列的标准品为将序列1所示的新生隐球菌IGS-1基因特异序列与pGEM-T载体连接，得到新生隐球菌质粒，即为标准品。
曲霉菌IGS-1基因序列的标准品为将序列5所示的新生隐球菌IGS-1基因特异序列与pGEM-T载体连接，得到曲霉菌质粒，即为标准品。
内标：为将序列9所示的内标序列与pGEM-T载体(Promega，产品编号A362A)连接，得到内标质粒，即为标准品。
阳性对照品为灭活的新生隐球菌、烟曲霉菌、黑曲霉菌和黄曲霉的DNA提取物的混合物(按3：1：1：1质量比混合)。
阴性对照品为正常人的痰液提取液。
上述试剂或上述PCR试剂或上述的试剂盒在检测或定量检测新生隐球菌和/或曲霉菌中的应用也是本发明保护的范围；
或上述试剂或上述PCR试剂或上述的试剂盒在制备检测或定量检测新生隐球菌和/或曲霉菌产品中的应用也是本发明保护的范围；
或上述试剂或上述PCR试剂或上述的试剂盒在制备检测待测样本是否含有新生隐球菌和/或曲霉菌产品中的应用也是本发明保护的范围。
若要定量检测，可以通过检测5个浓度梯度定量参考品(标准品)的Ct值大小，并用该5个浓度梯度定量参考品(标准品)的Ct值大小和5个浓度梯度绘制的标准曲线，将待测样本的ct值带入该标准曲线中，得到待测样本的定量检测结果；
本发明第3个目的是提供一种检测待测样本是否含有新生隐球菌和/或曲霉菌的方法，包括如下步骤：用权利要求5所述PCR试剂对待测样本进行实时荧光定量PCR，
若所述待测样本的实时荧光定量PCR结果为如下条件1：在测定新生隐球菌的通道下扩增曲线呈S型或Ct值≤44且Ct值＞0，则所述待测样本含有或候选含有新生隐球菌；若所述待测样本的实时荧光定量PCR结果不为所述条件1，则所述待测样本不含有或候选不含有新生隐球菌；
和/或，
若所述待测样本的实时荧光定量PCR结果为如下条件2：在测定曲霉菌的通道下扩增曲线呈S型或Ct值≤44且Ct值＞0，则所述待测样本含有或候选含有曲霉菌；若所述待测样本的实时荧光定量PCR结果不为所述条件2，则所述待测样本不含有或候选不含有曲霉菌。
上述方法中，所述PCR扩增的模板为待测样本的DNA，
所述PCR扩增的方法还可以将待测样本的DNA和内标混合作为模板。
内标：为将序列9所示的内标序列与pGEM-T载体(Promega，产品编号A362A)连接，得到内标质粒，即为标准品。
本发明中可以设置的参照物包括：新生隐球菌工作标准品对照、曲霉菌工作标准品对照、阳性对照、阴性对照、内标。其中内标作为靶标核酸的竞争性内标，可以作为参照物，用于防止假阴性结果的发生，通过检测加入有内标的样本，可了解整个扩增反应体系是否受抑制，更好的提示假阴性。
本发明的实验证明，本发明的试剂盒和检测方法基于多重的Taqman荧光定量检测技术，不仅可以快速明确含有的病原体，减少检测费用，提高仪器使用率，而且解决了临床呼吸道真菌含有病原体检测的通量问题，对临床的早期诊断和治疗具有重要的指导意义。
附图说明
图1为本发明特异性实验结果图。
图2为本发明灵敏度试验结果图。
图3为本发明临床样品评估实验结果图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、新生隐球菌和曲霉菌多重实时荧光定量检测试剂盒及其专用引物
一、新生隐球菌和曲霉菌多重实时荧光定量检测专用引物的设计与合成
根据新生隐球菌IGS-1基因特异序列(序列1)设计引物序列如下：
新生隐球菌上游扩增引物序列为：5'-GTCTCTAACATGTTGGGTCTCG-3'(序列2)；
新生隐球菌下游扩增引物序列为5'-TCCTAGAGTCATCCACACTTCA-3'(序列3)；
新生隐球菌荧光探针序列为：5'-CCCTTACATCCAAGTCTCTAGAGGAAGCC-3'(序列4)，其5'端标记FAM荧光基团，3’端标记TAMRA淬灭基团。
根据曲霉菌ITS-1基因特异序列(序列5)设计引物序列如下：
曲霉菌上游扩增引物：5'-ACAATGGATCTCTTGGTTCCG-3'(序列6)；
曲霉菌下游扩增引物：5'-GCGCAATGTGCGTTCAAA-3'(序列7)；
曲霉菌荧光探针序列为：5'-CGATGAAGAACGCAGCGAAATGCG-3'(序列8)，其5'端标记HEX荧光基团，3’端标记TAMRA淬灭基团。
本发明设置的内标为一段除了探针结合序列与曲霉菌ITS-1基因序列不同外，其它碱基均相同的核苷酸序列，内标序列为序列9。
内标荧光探针序列为：5'-TACCTTTGGCCTGGAAACCTGGG-3'(序列10)，内标探针5'端标记CY5荧光基团，3’端标记Dabcyl淬灭基团。
内标上游扩增引物和下游扩增引物可使用序列6所示引物和序列7所示引物。
合成上述引物及探针。
二、新生隐球菌和曲霉菌的实时荧光定量PCR检测方法的建立
1、待测样本的基因组DNA的获得
取50μl待测样本于灭菌的离心管中，向待测样本中加入50μl Lysis Buffer(宝生物工程(大连)有限公司，Code No.9164)和10ul内标溶液(内标溶液为内标质粒溶于水中；内标质粒为将序列9所示的核苷酸插入pGEM-T载体(Promega，产品编号A362A)得到的质粒。)，混合均匀。
80℃热变性15分钟后，低速离心，取上清于新的灭菌的离心管中，得到DNA分子，用于后续实验或-20℃冻存。
2、实时荧光定量PCR检测
将待测样本的DNA分子加入如下反应体系中：
20ul PCR反应体系，其中PCR反应液15ul，待测样本的DNA分子5ul。
15ul PCR反应液：含有新生隐球菌上游扩增引物、新生隐球菌下游扩增引物、曲霉菌上游扩增引物、曲霉菌下游扩增引物各0.40uM、新生隐球菌荧光探针、曲霉菌荧光探针和内标荧光探针浓度均为0.20uM、耐热DNA聚合酶(碧云天生物技术公司，产品编号D7207)为5U/反应，MgCl2浓度为2.0mM，dNTPs浓度为0.2mM，50mM的N-二甘氨酸/N二羟乙基甘氨酸(AppliChem，产品编号A1024),硫酸铵的浓度为10mM，氯化钾的浓度为40mM，硫酸镁的浓度为2mM，质量百分含量为1‰含量的Tween 20，用水补足体积(以上浓度均未终浓度)。
将上述反应体系在如下反应程序下进行反应:
反应程序
60℃时分别检测FAM、HEX和CY5通道。其中FAM通道检测新生隐球菌，HEX通道检测曲霉菌，CY5检测内标。
反应结束后，仪器自动保存结果，可以利用仪器自带的软件进行自动分析，也可以手动调节基线的开始值、结束值以及阈值进行分析，然后记录样本Ct值和结果。扩增曲线与阈值线的交点，称为Ct值(即cycle threshold，指PCR反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数值)。
若待测样本为如下条件1：在测定新生隐球菌的通道(FAM通道)下扩增曲线呈S型或Ct值≤44且Ct值＞0，则待测样本含有或候选含有新生隐球菌；若待测样本不为所述条件1，则待测样本不含有或候选不含有新生隐球菌；
若待测样本为如下条件2：在测定曲霉菌的通道(HEX通道)下扩增曲线呈S型或Ct值≤44且Ct值＞0，则待测样本含有或候选含有曲霉菌；若待测样本不为所述条件2，则待测样本不含有或候选不含有曲霉菌。
对于测定显示无Ct值的样本，同时内标检测为阳性(Ct值≤44)，报告为阴性，此时待测样本扩增曲线平直；
对于测定Ct值>44的样本，同时内标检测为阳性(Ct值≤44)，报告为低于检测下限。
若内标Ct值>44或内标显示无Ct值，则该样本的检测结果无效，应查找并排除原因，并对此样本进行重复试验。
若要定量检测，可以通过检测5个浓度梯度定量参考品(标准品)的Ct值大小，并用该5个浓度梯度定量参考品(标准品)的Ct值大小和5个浓度梯度绘制的标准曲线，将待测样本的ct值带入该标准曲线中，得到待测样本的定量检测结果；
也可以仪器软件根据各样本Ct值大小，通过5个浓度梯度定量参考品绘制的标准曲线，可以自动求得各样本的定量检测结果。
三、新生隐球菌和曲霉菌的实时荧光定量PCR检测试剂盒建立
新生隐球菌和曲霉菌的实时荧光定量PCR检测试剂盒包括：新生隐球菌上游扩增引物、新生隐球菌下游扩增引物、新生隐球菌荧光探针、曲霉菌上游扩增引物、曲霉菌下游扩增引物、曲霉菌荧光探针、内标荧光探针；
或新生隐球菌和曲霉菌的实时荧光定量PCR检测试剂盒包括含有新生隐球菌上游扩增引物、新生隐球菌下游扩增引物、新生隐球菌荧光探针、曲霉菌上游扩增引物、曲霉菌下游扩增引物、曲霉菌荧光探针、内标荧光探针的PCR试剂；
其中试剂盒中也可以不含有内标荧光探针；
试剂盒中还可以包括新生隐球菌IGS-1基因序列的标准品、曲霉菌ITS-1基因序列的标准品、内标、阳性对照品和阴性对照品。
新生隐球菌IGS-1基因序列的标准品为将序列1所示的新生隐球菌IGS-1基因特异序列与pGEM-T载体连接，得到新生隐球菌质粒，即为标准品。
曲霉菌IGS-1基因序列的标准品为将序列5所示的新生隐球菌IGS-1基因特异序列与pGEM-T载体连接，得到曲霉菌质粒，即为标准品。
内标：为将序列9所示的内标序列与pGEM-T载体(Promega，产品编号A362A)连接，得到内标质粒，即为标准品。
阳性对照品为灭活的新生隐球菌、烟曲霉菌、黑曲霉菌和黄曲霉的DNA提取物的混合物(按3：1：1：1质量比混合)。
阴性对照品为正常人的痰液提取液(提取方法同前)。
实施例2、新生隐球菌和曲霉菌多重实时荧光定量检测试剂盒的应用
一、灵敏度检测
将浓度为105copies/ul新生隐球菌IGS-1基因序列的标准品和浓度为105copies/ul的曲霉菌IGS-1基因序列的标准品分别按105、104、103、102、10copies/ul梯度稀释，之后以之分别作为待测样本DNA，按照实施例1中的二的荧光定量方法检测。
结果如图2(图中曲线由左至右依次为105、104、103、102、10copies/ul)所示，上图为新生隐球菌、下图为曲霉菌，可以看出，该试剂盒及方法可以检测出10copies/ul的新生隐球菌DNA和10copies/ul的曲霉菌DNA拷贝，具有很高的灵敏度。
二、特异性测试
对常见其他肺部致病菌铜绿假单胞菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、嗜肺军团菌、肺炎支原体、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌(靶序列富集多重PCR在儿童肺炎细菌性病原诊断中的应用研究，邓继岿)等提取DNA作为待测样本DNA，按照实施例1中的二的荧光定量方法检测。
结果如图1所示，上图为新生隐球菌和其他肺部致病菌、下图为曲霉菌和其他肺部致病菌，试剂盒及方法可以专一检测新生隐球菌和曲霉菌，对于其它常见肺部致病菌如铜绿假单胞菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、嗜肺军团菌、肺炎支原体、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌等均无阳性检出。
三、新生隐球菌和曲霉菌多重实时荧光定量检测
1、核酸提取
收集北京儿童医院已鉴定30例含有新生隐球菌临床病例和27例含有曲霉菌临床病例的痰液，按照实施例1的二的方法提取DNA。
2、多重实时荧光定量检测
按照实施例1的二的方法检测上述各个样本的DNA。
对于测定FAM通道Ct值≤44(Ct值＞0)的样本，报告为新生隐球菌DNA阳性，此时待测样本的扩增曲线呈S型；
对于测定HEX通道Ct值≤44(Ct值＞0)的样本，报告为曲霉菌DNA阳性，此时待测样本的扩增曲线呈S型；
对于测定显示无Ct值的样本，同时内标检测为阳性(Ct值≤44)，报告为阴性，此时待测样本扩增曲线平直；
对于测定Ct值>44的样本，同时内标检测为阳性(Ct值≤44)，报告为低于检测下限。
若内标Ct值>44或内标显示无Ct值，则该样本的检测结果无效，应查找并排除原因，并对此样本进行重复试验。
结果如图3所示，上图为新生隐球菌、下图为曲霉菌，对30例新生隐球菌临床病例进行检测，其中25例为新生隐球菌阳性；对27例曲霉菌临床病例进行检测，其中24例为曲霉菌阳性，综合阳性检出率大于80％。
其中有两例样本(如图3所示1号和2号样品)混合新生隐球菌和曲霉菌感染。
对比例：
一、设计对照引物及对照探针：
根据新生隐球菌IGS-1基因其他靶区域设计的引物：
上游引物序列：5'-AGCCCTTGTTCTATAGATTTGTCTC-3'
下游引物序列：5'-GTTATGCGAATGCGTAAAGCC-3'
新生隐球菌荧光探针序列为：5'-CCCTTACATCCAAGTCTCTAGAGGAAGCC-3'(序列4)，其5'端标记FAM荧光基团，3’端标记TAMRA淬灭基团。
根据曲霉菌ITS-1基因其他靶区域设计的引物：
上游引物序列：5'-ACAATGGATCTCTTGGTTCCG-3'
下游引物序列：5'-CGATGAAGAACGCAGCGAAATGCG-3'
曲霉菌荧光探针序列为：5'-GCGCAATGTGCGTTCAAA-3'，其5'端标记HEX荧光基团，3’端标记TAMRA淬灭基团。
二、灵敏度检测
按照实施例2的一的方法进行检测，不同的是替换为本对比例中的引物对和探针，结果，对照引物及对照探针检测灵敏度为100copies/ul，低于本发明的实施例。
三、新生隐球菌和曲霉菌多重实时荧光定量检测
按照实施例2的三的方法进行检测，不同的是替换为本对比例中的引物对和探针，结果，30例新生隐球菌临床病例仅20例新生隐球菌阳性，27例曲霉菌临床病例仅18例曲霉菌阳性，表明对比例的阳性检出率远远低于本发明的实施例。
序列表
<110>北京福安华生物科技有限公司
<120> 多重荧光定量检测新生隐球菌和曲霉菌的试剂盒和方法
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 159
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 1
taagcccttg ttctatagat ttgtctctaa catgttgggt ctcggggggc ttcctctaga 60
gacttggatg taaggggctt tacgcattcg cataacttat gaagtgtgga tgactctagg 120
aggggtctga gaatgtgctg tgccagccag gctgataat 159
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 2
gtctctaaca tgttgggtct cg 22
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 3
tcctagagtc atccacactt ca 22
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
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cccttacatc caagtctcta gaggaagcc 29
<210> 5
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<212> DNA
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<220>
<223>
<400> 5
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taactaatgt gaattgcaga attcagtgaa tcatcgagtc tttgaacgca cattgcgccc 120
cctggtattc cggggggcat gcctgtccga gcgtcatt 158
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<211> 21
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<220>
<223>
<400> 6
acaatggatc tcttggttcc g 21
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 7
gcgcaatgtg cgttcaaa 18
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 8
cgatgaagaa cgcagcgaaa tgcg 24
<210> 9
<211> 152
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 9
taagcccttg ttctatagat ttgtctctaa catgttgggt ctcggggacc tttggcctgg 60
aaacctgggg ctttacgcat tcgcataact tatgaagtgt ggatgactct aggaggggtc 120
tgagaatgtg ctgtgccagc caggctgata at 152
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 10
tacctttggc ctggaaacct ggg 23

Claims (9)

1.检测新生隐球菌和曲霉菌多重荧光定量试剂，包括检测新生隐球菌的引物1、检测新生隐球菌的引物2、检测新生隐球菌的探针1、检测曲霉菌的引物3、检测曲霉菌的引物4和检测曲霉菌的探针2；
所述引物1的核苷酸序列为序列2；
所述引物2的核苷酸序列为序列3；
所述探针1的核苷酸序列为序列4；
所述引物3的核苷酸序列为序列6；
所述引物4的核苷酸序列为序列7；
所述探针2的核苷酸序列为序列8。
2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于：所述试剂还包括内标荧光探针3，所述内标荧光探针3的核苷酸序列为序列10。
3.根据权利要求1或2所述的试剂，其特征在于：所述各个探针的两端分别标记荧光基团和淬灭基团。
4.根据权利要求1-3中任一所述的试剂，其特征在于：
所述引物1、所述引物2、所述探针1、所述引物3、所述引物4、所述探针2和所述探针3的摩尔比为2:2:1:2:2:1:1。
5.检测新生隐球菌和曲霉菌多重荧光定量PCR试剂，包括权利要求1-4中任一所述试剂；
所述各引物在所述PCR试剂中的浓度为0.4uM；
所述各探针在所述PCR试剂中的浓度为0.2uM。
6.含有权利要求1-4中任一所述试剂或权利要求5所述PCR试剂的试剂盒。
7.权利要求1-4中任一所述试剂或权利要求5所述PCR试剂或权利要求6所述的试剂盒在检测或定量检测新生隐球菌和/或曲霉菌中的应用；
或权利要求1-4中任一所述试剂或权利要求5所述PCR试剂或权利要求6所述的试剂盒在制备检测或定量检测新生隐球菌和/或曲霉菌产品中的应用；
或权利要求1-4中任一所述试剂或权利要求5所述PCR试剂或权利要求6所述的试剂盒在制备检测待测样本是否含有新生隐球菌和/或曲霉菌产品中的应用。
8.一种检测待测样本是否含有新生隐球菌和/或曲霉菌的方法，包括如下步骤：用权利要求5所述PCR试剂对待测样本进行实时荧光定量PCR，
若所述待测样本的实时荧光定量PCR结果为如下条件1：在测定新生隐球菌的通道下扩增曲线呈S型或Ct值≤44且Ct值＞0，则所述待测样本含有或候选含有新生隐球菌；若所述待测样本的实时荧光定量PCR结果不为所述条件1，则所述待测样本不含有或候选不含有新生隐球菌；
和/或，
若所述待测样本的实时荧光定量PCR结果为如下条件2：在测定曲霉菌的通道下扩增曲线呈S型或Ct值≤44且Ct值＞0，则所述待测样本含有或候选含有曲霉菌；若所述待测样本的实时荧光定量PCR结果不为所述条件2，则所述待测样本不含有或候选不含有曲霉菌。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增的模板为待测样本的DNA。
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