CN105671131A - 评估人体vo2 max（最大耗氧量）的检测试剂盒和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了人体VO2MAX基因检测试剂盒，该试剂盒包括盒体及盒体内单独存放的试剂，试剂包括：（1）针对4个基因SNP多态位点的PCR反应引物组（2）PCR扩增试剂（3）琼脂糖凝胶电泳分析试剂。本发明通过PCR引物的设计使多个PCR扩增反应可在同一台PCR仪上同步进行，对受测者的相关基因进行检测，并实现检测的高效性、特异性，分析得到其最大耗氧量的遗传因素，从而为受测者获得一个合适的健身运动方案，采取相应的策略避免对其无效甚至是有害的方法。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测，具体涉及最大耗氧量相关基因检测试剂盒。
背景技术
VO2MAX是人每公斤体重每分钟可以使用氧量的毫升数。该指数通常用于衡量人体有氧运动能力的高低以及评估专业的耐力运动员的训练效果。体能越强的人，VO2MAX越高，可以达到的运动强度越大。最大耗氧量的生理局限，取决于:1肌肉细胞组织利用氧气分解燃料的化学能力。2心血管和肺系统为肌肉组织输送氧气的综合能力。
人体最大摄氧量的测试有几种方法，主要包括了：直接测试法、间接测试法、Bruce方法和12分钟跑等。这些方法都需要借助相应的仪器和专业人员才能完成。而VO2MAX受到环境、年龄、性别、训练和遗传等因素的影响。自1971年起，多国科学家发现VO2MAX的遗传度可以高达93.4%，VO2MAX与遗传的关系十分密切，可训练性即训练使VO2MAX提高的可能性较小，一般为20%一25%。
而目前的方法都无法评估个最大摄氧量的水平，这也就导致了个体对自身有氧运动能力的认识不清，进而会采取错误的健身方案。而对于我国的专业体育运动员来讲，如果在青少年选材和后续的训练培养阶段没有考虑VO2MAX的高遗传度，将会导致漏选极有潜力的人才，造成我国体育事业无法估量的损失。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种人体最大摄氧量的基因检测试剂盒，该试剂盒对受测者的相关基因进行检测，分析得到其VO2MAX的遗传因素，且PCR扩增反应在同一台PCR仪上同步进行并具备检测的高效性、特异性。
一种VO2MAX基因检测试剂盒，包括盒体及盒体内单独存放的试剂，存放的试剂包括：
（1）针对4个基因SNP多态位点的PCR反应引物组：
针对SNPrs1042713的引物组：
1CCTTCTTGCTGGCACCCAATA
2GTCCGGCGCATGGCTTCC
3GCTGAGTGTGCAGGAC
4CCAGTGAAGTGATGAAG
针对SNPrs1205的引物组：
1GTTTGGCTTCTGTCCTCAC
2CACATGGAGAGAGAGACTA
3GCTTTATTGGCTTATAG
4TCCCTATCTGGAGGATAG
针对SNPrs8192678的引物组：
1GACGACGAAGCAGACAAGACCA
2CTGTCCCTCAGTTCACC
3GAGAGACTTTGGAG
4AAGAACAAGAAGGAGAC
针对SNPrs2010963的引物组：
1GTGCGAGCAGCGAAAGC
2GCACTTTGCCCCTGTCC
3AGCGGACTCACCGGCCAG
4GGGCTCACGCCGCGCTC
（2）PCR扩增试剂；
（3）琼脂糖凝胶电泳分析试剂。
本发明提供的最大摄氧量基因检测试剂盒的有益效果是：通过PCR引物的设计使多个PCR扩增反应在同一台PCR仪上同步进行，对受测者的相关基因进行检测，并实现检测的高效性、特异性，分析得到其最大摄氧量的遗传因素，从而为受测者获得一个合适的健身运动方案，为专业体育运动机构提供科学的选材依据，制定合理的训练培养计划。
附图说明
图1是反应产物琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施方式
最大摄氧量基因检测试剂盒，包括盒体及盒体内单独存放的试剂，存放的试剂包括：
（1）针对4个基因SNP多态位点的PCR反应引物组：
针对SNPrs1042713的引物组：
1CCTTCTTGCTGGCACCCAATA
2GTCCGGCGCATGGCTTCC
3GCTGAGTGTGCAGGAC
4CCAGTGAAGTGATGAAG
针对SNPrs1205的引物组：
1GTTTGGCTTCTGTCCTCAC
2CACATGGAGAGAGAGACTA
3GCTTTATTGGCTTATAG
4TCCCTATCTGGAGGATAG
针对SNPrs8192678的引物组：
1GACGACGAAGCAGACAAGACCA
2CTGTCCCTCAGTTCACC
3GAGAGACTTTGGAG
4AAGAACAAGAAGGAGAC
针对SNPrs2010963的引物组：
1GTGCGAGCAGCGAAAGC
2GCACTTTGCCCCTGTCC
3AGCGGACTCACCGGCCAG
4GGGCTCACGCCGCGCTC
（2）PCR扩增试剂；
（3）琼脂糖凝胶电泳分析试剂。
下面将结合实施例对本发明提供的方法予以进一步的说明。
本实施例对测试个体采用最大摄氧量基因检测试剂盒同时检测4个基因的SNP多态位点，并根据基因分型结果，评估其最大摄氧量水平，从而更加科学合理的制定健身运动方案。
使用到的最大摄氧量检测试剂盒内试剂由以下组成：
（1）针对8个基因SNP多态位点的PCR反应引物组：
针对SNPrs1042713的引物组：
1CCTTCTTGCTGGCACCCAATA
2GTCCGGCGCATGGCTTCC
3GCTGAGTGTGCAGGAC
4CCAGTGAAGTGATGAAG
针对SNPrs1205的引物组：
1GTTTGGCTTCTGTCCTCAC
2CACATGGAGAGAGAGACTA
3GCTTTATTGGCTTATAG
4TCCCTATCTGGAGGATAG
针对SNPrs8192678的引物组：
1GACGACGAAGCAGACAAGACCA
2CTGTCCCTCAGTTCACC
3GAGAGACTTTGGAG
4AAGAACAAGAAGGAGAC
针对SNPrs2010963的引物组：
1GTGCGAGCAGCGAAAGC
2GCACTTTGCCCCTGTCC
3AGCGGACTCACCGGCCAG
4GGGCTCACGCCGCGCTC
（2）PCR扩增试剂：10×PCR缓冲液，该PCR缓冲液为100mMTris-HClpH8.3，500mMKCl，15mMMgCl2；dNTPs混合物，该dNTPs混合物为三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸dGTP，三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸dATP，三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸dTTP，三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸dCTP四种核苷酸，各组分浓度为2.5mM；5U/μl热启动Taq酶。
（3）琼脂糖凝胶电泳分析试剂：琼脂糖、TAE缓冲液、DNA分子量标准、Goldview染色液和DNA上样缓冲液，该缓冲液以溴酚蓝为指示剂稀释至1X后使用。
使用上述最大摄氧量基因检测试剂盒按如下步骤进行检测：
（1）提取样本基因组DNA。
采集该测试者唾液，向1-2ml唾液样品中加入500ul提取缓冲溶液，该DNA提取缓冲溶液溶剂为50mM的Tris-HClpH7.4、0.5mM的EDTA和50mM的NaCl，反复吹打混匀后，8000×g离心5分钟，弃去上清，此步骤重复一次；得到的沉淀中加入500ul裂解液，该裂解液溶剂为50mMTris-HClpH7.4，50mMTris-HClpH7.4，150mMNaCl，1mMEDTA，1％Tritonx-100，1％Sodiumdeoxycholate，0.1％SDS，蛋白酶K20mg/mL，彻底悬浮沉淀并充分混匀后，室温放置30分钟，期间来回颠倒离心管数次；得到的混合液中，加入浓度为10mg/mLRNA酶的水溶液10μL，37℃下静置10min；得到的上清液中，加入等体积苯酚-氯仿混合溶液，苯酚和氯仿体积比为1∶1，充分混匀，混合液4℃，12000×g离心5分钟，上清液移入干净离心管内；加入等体积苯氛-氯仿-异戊醇混合溶液，苯酚、氯仿和异戊醇体积比为25∶24∶1，充分混匀后，4℃，12000×g离心5分钟，上清液移入干净离心管内；加入等体积氯仿-异戊醇混合溶液，充分混匀后，4℃，12000×g离心5分钟，上清液移入干净离心管内；加入0.6倍体积的冰浴异丙醇溶液及0.1倍的3mol/L醋酸钠溶液，-20℃静置60分钟后，4℃，12000×g离心10分钟，弃上清液；得到的沉淀物中加入0.5mL70％乙醇清洗沉淀物，4℃，12000×g离心5分钟，弃上清液，此步骤重复一次；得到的沉淀物自然风干，加入20μL无菌超纯水回溶，电泳检测，-20℃保存。
（2）PCR扩增。
本实施例同时检测rs1042713、rs1205、rs8192678和rs2010963，每个SNP的检测需要一对上下游引物、两条多态引物共4条PCR引物，共需要16条引物。每个SNP的检测需要做两管PCR扩增，为防止出现假阳性之类的反应，衡量PCR是否成功，加设一管阴性对照组，共做9管PCR，所述阴性对照组基因组模板及反应体系是一样的，但没有引物存在。
根据不同的检测位点，用相应的引物按如下比例分别配制PCR反应体系：2.5μl10×PCR缓冲液，2μldNTPs，0.5μl引物组，热启动Taq酶0.15μl，基因组模板80mg，添加超纯水至总体积为25μl。
将装有反应溶液的Eppendorf试管放入ABI9700PCR仪中，设置反应条件如下：预变性95℃3min；热循环94℃30s，60℃30s，72℃30s，35个循环；延伸72℃3min。反应结束后，取出试管。
由于9管PCR扩增反应是在同一台PCR仪上同步进行的，为了实现检测的高效性、特异性，要求16条PCR引物的Tm值相近，为此需要先进行大量的DNA序列软件分析来设计PCR引物，并通过大量的实验来进行Tm值的优化并确定设计的合理性，本试剂盒各基因SNP多态性的检测是既相对独立又相互联系的，不可分割。
（3）琼脂糖凝胶电泳检测
将扩增后的产物进行琼脂糖电泳检测，过程如下：3g琼脂糖，加入100mL去离子水，微波炉加热1min，冷却到60℃时加入5μLGoldview染色液，制成3%的琼脂糖凝胶。PCR产物10μL与6×TBE缓冲液0.8μL混合上样，电压100V电泳15min。紫外灯下读取结果并拍照，所得琼脂糖电泳检测图如图1所示。
检测得到4个基因分型分析结果如下：
根据以上分型结果，该测试者具有很好的最大摄氧量，这意味着该人适合耐力相关运动。如果是专业运动员，则有较大可能在耐力项目，如中长跑中取得好的比赛成绩。如果是普通健身爱好者，则在日常锻炼中应适当加大有氧运动强度，可以有效起到减肥的效果。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
核苷酸序列表
<110>武汉白原科技有限公司
<120>评估人体VO2MAX（最大耗氧量）的检测试剂盒和方法
<130>1
<160>16
<170>PatentInversion3.3
<210>1
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<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
ccttcttgctggcacccaata21
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gctgagtgtgcaggac16
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ccagtgaagtgatgaag17
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<400>16
gggctcacgccgcgctc17
Claims (8)
1.最大摄氧量检测试剂盒，包括盒体及盒体内单独存放的试剂，其特征在于：存放的试剂包括：
（1）针对4个基因SNP多态位点的PCR反应引物组：
针对SNPrs1042713的引物组：
1CCTTCTTGCTGGCACCCAATA
2GTCCGGCGCATGGCTTCC
3GCTGAGTGTGCAGGAC
4CCAGTGAAGTGATGAAG
针对SNPrs1205的引物组：
1GTTTGGCTTCTGTCCTCAC
2CACATGGAGAGAGAGACTA
3GCTTTATTGGCTTATAG
4TCCCTATCTGGAGGATAG
针对SNPrs8192678的引物组：
1GACGACGAAGCAGACAAGACCA
2CTGTCCCTCAGTTCACC
3GAGAGACTTTGGAG
4AAGAACAAGAAGGAGAC
针对SNPrs2010963的引物组：
1GTGCGAGCAGCGAAAGC
2GCACTTTGCCCCTGTCC
3AGCGGACTCACCGGCCAG
4GGGCTCACGCCGCGCTC
（2）PCR扩增试剂；
（3）琼脂糖凝胶电泳分析试剂。
2.根据权利要求1所述的最大摄氧量检测试剂盒，其特征在于：所述引物用量均为0.5-1.0μl。
3.根据权利要求1所述的最大摄氧量检测试剂盒，其特征在于：所述PCR扩增试剂包括：10×PCR缓冲液，dNTPs，热启动Taq酶，基因组模板。
4.根据权利要求3所述的最大摄氧量检测试剂盒，其特征在于：所述PCR缓冲液包含：100mMTris-HClpH8.3，500mMKCl，15mMMgCl2。
5.根据权利要求3所述的最大摄氧量检测试剂盒，其特征在于：所述PCR扩增试剂用量为：10×PCR缓冲液2.5μl，dNTPs2μl，热启动Taq酶0.1-0.2μl，基因组模板50-100ng。
6.根据权利要求1所述的最大摄氧量检测试剂盒，其特征在于：所述琼脂糖凝胶电泳分析试剂包括：琼脂糖、TAE缓冲液、DNA分子量标准、DNA无毒染料和DNA上样缓冲液。
7.根据权利要求6所述的最大摄氧量检测试剂盒，其特征在于：所述DNA无毒染料优选BiotiumGelred无毒染料。
8.根据权利要求1所述的最大摄氧量检测试剂盒，其特征在于：根据测试结果，为受测者提供最大摄氧量的基因分析，使其了解自身最大摄氧量的潜力，合理运用在日常训练或锻炼当中。
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