CN106566878A - 一种转基因玉米品系mir162的定量检测方法和试剂 - Google Patents

一种转基因玉米品系mir162的定量检测方法和试剂 Download PDF

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Abstract

本申请公开了一种转基因玉米品系MIR162的定量检测方法和试剂。本申请的定量检测方法，包括在PCR反应体系中加矿物油，混匀转移到微滴发生器产生微滴，然后进行PCR反应，结束后，读取每个微滴扩增信号，用QuantaSoft软件计算待测样品的靶标DNA分子数；PCR反应体系中包括MIR162品系和HMG基因特异引物和探针，两条探针分别采用FAM和HEX荧光标记。本申请的定量检测方法，设计配套使用的内源基因HMG和MIR162品系特异性引物探针，采用双通道法，分别定量出两者在玉米基因组中的分子数，计算出转基因玉米品系MIR162绝对含量，对转基因成分的研究和我国口岸转基因检测具有重要意义。

Description

一种转基因玉米品系MIR162的定量检测方法和试剂
技术领域
本申请涉及转基因玉米检测领域，特别是涉及一种转基因玉米品系MIR162的定量检测方法和试剂。
背景技术
转基因农作物自1996年商业化种植以来，全球转基因作物种植面积迅猛发展。截止2013年全球转基因作物种植面积已达到约1.75亿公顷，比2012年增长3％。按照种植面积统计，全球约81％的大豆、35％的玉米、30％的油菜和81％的棉花都是转基因产品。转基因作物种植面积排在前6位的国家是美国、巴西、阿根廷、加拿大、印度和中国。伴随转基因作物高速发展的同时，转基因作物的食品安全问题也一直是多年来讨论的热点，并直接影响到国际贸易和公众对转基因产品的接受程度。目前关注的焦点已从“是否是转基因”转移到“含有哪些转基因成分及各自的含量”，为满足公众知情权、管理水平和检测技术能力的需求，许多国家纷纷出台了转基因限量规定，如欧盟规定转基因作物的成分超过0.9％，必须进行标识；而日本的现行标准为5％。我国目前的标准最为严格，对转基因产品实行“零容忍”，只要在产品中检出转基因成分就需要进行标识。考虑到转基因低水平混杂等客观实际，目前这一“零容忍”政策在技术执法角度来讲过于苛刻，因此，从我国各口岸转基因检测水平的实际出发，为国家政策部门提出合理的转基因阈值迫在眉睫；首当其冲的便是开发转基因成分的精准定量检测方法。
转基因玉米品系MIR162是美国先正达(Syngenta)公司研发的转基因玉米品系，其转入了来源于苏云杆菌菌株AB88和AB424的Vip3a基因。该基因编码一个不同于传统苏云杆菌抗虫性内毒素(Cry)的新型抗虫蛋白。转基因玉米品系MIR162是我国2015年才获批进口的转基因玉米品系之一。虽然目前已经有关于转基因玉米品系MIR162的分子检测的研究和报道，但是，如前面提到的，随着转基因作物的高速发展，现有的检测方法已经不能很好的满足精准定量检测的需求。
发明内容
本申请的目的是提供一种转基因玉米品系MIR162的定量检测方法和试剂。
为了实现上述目的，本申请采用了以下技术方案：
本申请公开了一种转基因玉米品系MIR162的定量检测方法，包括在PCR反应体系中加入矿物油，混匀后，将其转移到微滴发生器上，自动产生微滴，然后将微滴全部转移到反应管中进行PCR反应，PCR反应结束后，读取每个微滴的扩增信号，并采用QuantaSoftV1.3.2软件计算待测样品的靶标DNA分子数；PCR反应体系为双重实时荧光PCR扩增体系，包括PCR反应液、MIR162品系特异引物组、MIR162品系特异探针、HMG基因特异引物组、HMG基因特异探针和待测样品的DNA；MIR162品系特异引物组的正向引物为Seq ID No.1所示序列，MIR162品系特异引物组的反向引物为Seq ID No.2所示序列，MIR162品系特异探针为SeqID No.3所示序列，HMG基因特异引物组的正向引物为Seq ID No.4所示序列，HMG基因特异引物组的反向引物为Seq ID No.5所示序列，HMG基因特异探针为Seq ID No.6所示序列；
Seq ID No.1：5’-TGCAAATAGGCTGGGAATAGTCTGTC-3’
Seq ID No.2：5’-AAACGGCTTGTCCCGCGTCAT-3’
Seq ID No.3：5’-GCGGGAAACGACAATCTGATCATGA-3’
Seq ID No.4：5’-TTGGACTAGAAATCTCGTGCTGA-3’
Seq ID No.5：5’-GCTACATAGGGAGCCTTGTCCT-3’
Seq ID No.6：5’-CAATCCACACAAACGCACGCGTA-3’
其中，Seq ID No.3所示序列的MIR162品系特异探针中，5’末端具有FAM荧光基团，3’末端具有BHQ-1淬灭基团；Seq ID No.6所示序列的HMG基因特异探针中，5’末端具有HEX荧光基团，3’末端具有BHQ-1淬灭基团。
需要说明的是，本申请的转基因玉米品系MIR162的定量检测方法，实际上就是微滴式数字PCR。其原理是，在一个PCR反应管中油水反应体系被微滴发生器制备成近20000个油包水小微滴，当待测DNA模板分子数低于一定的数目，微滴只含有一个分子的DNA模板和足够量的用于荧光PCR反应所需的所有其它组分如dNTP、Taq DNA聚合酶以及探针和引物等。待所有微滴实时荧光PCR反应结束后，逐一检查每个微滴，只要微滴有荧光信号检出，就被认为有实时荧光PCR反应发生，记有一个分子的待测模板被检出，统计所有阳性微滴数，就可得出样品中待测DNA模板的分子数。本申请采用双通道法，即分别对玉米品系MIR162特异性探针，以及玉米内源基因特异性探针，采用不同的荧光标记，在同一个PCR反应体系中同时测定内源基因和品系特异序列的分子数。其中，本申请检测的内源基因HMG在玉米基因组中仅一个拷贝，并且玉米品系MIR162特异性序列也仅有一个拷贝；因此，通过计算样品中品系特异性序列和HMG序列分子数的比值就可计算得出转基因玉米品系MIR162的绝对含量。
因此，本申请的定量检测方法中，还包括，采用QuantaSoft V1.3.2软件分别计算出转基因玉米品系MIR162的分子数和HMG基因分子数后，根据转基因玉米品系MIR162分子数和HMG基因分子数的比值，计算转基因玉米品系MIR162的绝对含量。
本申请的另一面公开了一种转基因玉米品系MIR162定量检测的试剂，该试剂包括第一引物探针组合和第二引物探针组合，所述第一引物探针组合用于MIR162品系特异性检测，所述第二引物探针组合用于HMG基因特异性检测；第一引物探针组合中，正向引物为SeqID No.1所示序列，反向引物为Seq ID No.2所示序列，探针为Seq ID No.3所示序列，并且探针的5’末端具有FAM荧光基团，3’末端具有BHQ-1淬灭基团；第二引物探针组合中，正向引物为Seq ID No.4所示序列，反向引物为Seq ID No.5所示序列，探针为Seq ID No.6所示序列，并且探针的5’末端具有HEX荧光基团，3’末端具有BHQ-1淬灭基团。
需要说明的是，本申请的试剂，实际上就是转基因玉米品系MIR162的定量检测方法中所采用的MIR162品系特异性检测引物探针，和HMG基因特异性检测引物和探针。可以理解，本申请的引物和探针是针对微滴式数字PCR而设计的，当然可以单独制备成相应的MIR162品系检测试剂使用。
本申请的另一面公开了本申请的试剂在制备转基因玉米检测试剂盒或检测设备中的应用。
本申请的再一面公开了一种转基因玉米检测试剂盒，该试剂盒中含有本申请的试剂。
优选的，本申请的试剂盒采用本申请的定量检测方法对转基因玉米品系MIR162进行定量检测。
由于采用以上技术方案，本申请的有益效果在于：
本申请的转基因玉米品系MIR162的定量检测方法，设计了配套使用的内源基因HMG特异性引物探针和MIR162品系特异性引物探针，两者配套使用，采用双通道法，分别定量出两者在玉米基因组中的分子数，最终计算出转基因玉米品系MIR162的绝对含量。本申请的定量检测方法，不同于常规的实时荧光PCR的相对定量，能够对待检样品中转基因玉米品系MIR162成分进行精准定量，对转基因成分的研究和我国口岸转基因检测具有重要意义。
附图说明
图1是本申请实施例中特异性检测FAM通道的输出结果图；
图2是本申请实施例中特异性检测FAM通道的输出结果图；
图3是本申请实施例中特异性检测HEX通道的输出结果图；
图4是本申请实施例中特异性检测HEX通道的输出结果图；
图5是本申请实施例中灵敏度检测FAM通道的输出结果图；
图6是本申请实施例中灵敏度检测HEX通道的输出结果图。
具体实施方式
转基因玉米品系检测的研究已经有很多报道，例如常规PCR、实时荧光PCR、PCR-DHPLC等方法，但是，现有的方法都无法对转基因玉米样品中转基因成分进行绝对定量。其中实时荧光PCR可以通过对梯度稀释的标准品进行检测，建立标准曲线，通过标准曲线进行相对定量。但是，随着转基因农作物越来越普遍，我国本着转基因“零容忍”的政策，现有的相对定量的检测方法已经不能满足我国口岸转基因检测的使用需求。因此，本申请利用先进的数字PCR检测技术，率先研究并提出了转基因玉米品系MIR162的定量检测方法。并且，在本申请的定量检测方法中，同时设计了内源基因和品系基因两套配套使用的引物探针，通过双重数字PCR扩增，用两个荧光通道分别统计分析内源基因HMG和MIR162品系特异性序列的分子数，根据转基因玉米品系MIR162分子数和HMG基因分子数的比值，计算转基因玉米品系MIR162的绝对含量。
下面通过具体实施例和附图对本申请作进一步详细说明。以下实施例和附图仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。
实施例
一、材料和方法
1.供试材料
本例分别采用了转基因玉米品系MIR162、MON89034、Bt176、Bt11、MON88017、MON810、MON863、T25、MIR604、ES3272、NK603、TC1507、MON87460、59122、GA21，转基因油菜RT73、RF1、T45，Topas19/2，转基因稻米KF6、LLRice62，转基因大豆GTS40-3-2，转基因棉花GHB614和转基因马铃薯EH92-527-1的DNA样品进行试验。以上DNA样品均由深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心提供和保藏。
2.引物和探针设计
本例分别根据玉米内源基因HMG，和转基因玉米品系MIR162特异性序列设计了特异性检测引物和探针，两条探针分别进行不同的荧光基团标记。引物和探针由生工生物工程(上海)股份有限公司合成与修饰。本例设计的引物和探针序列详见表1。
表1内源基因和MIR162品系特异性引物和探针
名称 序列(5’-3’) Seq ID No.
MIR162-F TGCAAATAGGCTGGGAATAGTCTGTC 1
MIR162-R AAACGGCTTGTCCCGCGTCAT 2
MIR162-P GCGGGAAACGACAATCTGATCATGA 3
HMG-F TTGGACTAGAAATCTCGTGCTGA 4
HMG-R GCTACATAGGGAGCCTTGTCCT 5
HMG-P CAATCCACACAAACGCACGCGTA 6
其中，MIR162-P探针5’末端进行FAM荧光基团，3’末端进行BHQ-1淬灭基团；HMG-P探针5’末端进行HEX荧光基团，3’末端进行BHQ-1淬灭基团。
3.双重数字PCR反应体系和条件
本例的PCR反应体系总计20μL，包括：2×ddPCR Super Mix 10μL、3.6μmol/L的玉米品系特异性探针MIR162-P 1μL、6μmol/L的玉米品系正向引物MIR162-F 1μL、6μmol/L的玉米品系反向引物MIR162-R 1μL、3.6μmol/L的内源基因探针HMG-P 1μL、6μmol/L内源基因正向引物HMG-F 1μL、6μmol/L内源基因反向引物HMG-R 1μL、DNA模板2μL，补充ddH2O至20μL。
配制好20μL的反应液后，将其与70μL的矿物油混匀，转移到微滴发生器上自动产生微滴；将产生的微滴仔细全部转移到96孔反应板PCR反应管中；再将96孔反应板在封膜仪上封膜，并置于普通PCR仪上进行PCR反应。
反应条件为：95℃预变性10min；然后进入40个循环：95℃变性15s、55.7℃退火1min；循环结束后98℃10min使酶热失活。扩增结束。
扩增结束后，将96孔板置入微滴读取仪中读取信号，并使用QuantaSoft V1.3.2软件分析实验数据。具体的，打开微滴荧光检测器应用软件，将PCR反应结束后的96孔反应板直接插入荧光检测仪中，设备自动检测每PCR反应管中所有微滴的荧光情况，即PCR反应情况，最后软件根据珀松分布定律直接给出待测DNA序列分子数。本例具体的，根据FAM荧光通道可以得到转基因玉米品系MIR162的分子数，根据HEX荧光通道可以得到内源基因HMG的分子数。
根据MIR162分子数与内源基因HMG分子数的比值可以计算出转基因玉米品系MIR162的绝对含量。
4.质量控制
每批(次)定量检测实验需设置对照，对照的设置应符合GB/T19495.2-2004中的规定。
每PCR反应管微滴数不少于12000个；加入玉米基因组的分子数不高于微滴数的5倍，每个玉米基因组DNA分子约2.5pg，因此，加入玉米基因组的量不高于12000×5×2.5＝150000pg，即150ng。
非转基因样品核酸提取对照、PCR空白对照和阴性对照理论检测结果应为零。但考虑到数字PCR的超灵敏性，特别是非转基因样品核酸提取对照的检查结果为零有时难以实现，因而允许有极少量阳性微滴数出现，但阳性微滴数应低于1/4000，基于经验，12000个微滴不能多于三个阳性微滴，有效阳性检测结果至少是对照阳性微滴数的三倍，即至少9个阳性微滴。
二次提取DNA样品的测试结果，其转基因成分含量的相对相差应小于或等于25％。
其中，a为第一次提取DNA样品的检测结果；b为第二次提取DNA样品的检测结果；m为a和b的平均数。
对同一批次提取的DNA样品，其三次重复PCR测试结果的偏差应小于或等于15％。
以上质控条件中有一项不符合者，试验结果应放弃，并应从制备测试样品开始重做实验。
5.特异性检测
本例以转基因玉米品系MIR162的DNA样品为阳性样品，以MON89034、Bt176、Bt11、MON88017、MON810、MON863、T25、MIR604、ES3272、NK603、TC1507、MON87460、59122、GA21，转基因油菜RT73、RF1、T45，Topas19/2，转基因稻米KF6、LLRice62，转基因大豆GTS40-3-2，转基因棉花GHB614，转基因马铃薯EH92-527-1等的DNA样品为阴性对照，并设置一个水空白对照，共计25个反应体系，进行特异性检测。
6.灵敏度检测
本例将转基因玉米品系MIR162的DNA样品用双蒸水稀释，分别稀释为5ng/μL、0.5ng/μL、0.05ng/μL、5pg/μL和0.5pg/μL共计5个浓度梯度，依序编号为M1～M5。按照本例的双重数字PCR反应体系和条件，以5个浓度梯度的DNA样品进行扩增检测，并设置一个不含转基因的玉米DNA阴性对照，以及一个水空白对照，检测灵敏度。每个浓度梯度的DNA样品设置5个重复。
二、结果及分析
1.特异性检测结果
特异性检测结果如图1-图4所示，其中，图1和图2为FAM通道检测到的荧光信号，即品系特异探针MIR162-P的扩增信号；图3和图4为HEX通道检测到的荧光信号，即内源基因特异探针HMG-P的扩增信号；图1和图3中，反应孔A02-H01依序为转基因玉米品系Bt11、MON89034、Bt11、MON88017、MON810、MON863、T25、MIR604、ES3272、NK603、TC1507、MON87460、59122、GA21的检测结果；图2和图4中，反应孔A03-E04依序为转基因玉米品系RT73、RF1、T45，Topas19/2、KF6、LLRice62、GTS40-3-2、GHB614、EH92-527-1的检测结果；四个图中，H04为转基因玉米品系MIR162的检测结果。
结果显示，FAM通道中14个转基因玉米品系和9个转基因油菜、大豆等品系均未检测到信号，而转基因玉米品系MIR162出现强烈的荧光信号。在HEX通道中，14个转基因玉米品系出现阳性信号，而9个转基因油菜、大豆等品系均未检测到信号。以上结果说明MIR162品系引物和探针特异性结果良好。
2.灵敏度检测结果
灵敏度试验的数据统计结果如表2所示，两个荧光通道的检测结果图如图5和图6所示。
表2检测结果统计的阳性微滴数
表2中，M1-FAM表示编号M1的样品的FAM通道检测结果，即5ng/μL样品的FAM通道结果；M1-HEX表示编号M1的样品的HEX通道检测结果，即5ng/μL样品的HEX通道结果；M2-FAM、M3-FAM、M4-FAM、M5-FAM、M2-HEX、M3-HEX、M4-HEX、M5-HEX以此类推；N-FAM为不含转基因的玉米DNA阴性对照的FAM通道检测结果，N-HEX为不含转基因的玉米DNA阴性对照的HEX通道检测结果；W-FAM为水空白对照的FAM通道检测结果，W-HEX为水空白对照的HEX通道检测结果；Concentration为5个重复样品的平均阳性微滴数单位为“个/μL”，TotalConfMax为5次重复中最多阳性微滴数单位为“个/μL”，TotalConfMin为5次重复中最少阳性微滴数单位为“个/μL”。
本例中，阳性信号判断标准为阴性玉米或者水对照阳性微滴数的3倍以上即为阳性微滴数。准确性的判断依5次重复误差不超过15％。表1中，N-HEX为不含转基因的玉米DNA阴性对照的HEX通道检测结果，因为HEX是内源基因探针标记，因此，对于玉米DNA有比较强的扩增信号。
图5为FAM通道检测到的荧光信号，即品系特异探针MIR162-P的扩增信号；图6为HEX通道检测到的荧光信号，即内源基因特异探针HMG-P的扩增信号。图5和图6中，反应孔A08-A12为5个重复M1样品的检测结果，B08-B12为5个重复M2样品的检测结果，C08-C12为5个重复M3样品的检测结果，D08-D12为5个重复M4样品的检测结果，E08-E12为5个重复M5样品的检测结果，F08为不含转基因的玉米DNA阴性对照的检测结果；F11水空白对照的检测结果。可见，MIR162品系基因检测探针引物在反应体系中含有10pg总基因组DNA时，即DNA样品稀释至5pg/μL，即拷贝数为1.2个，仍可出现稳定的阳性扩增，内源基因检测探针引物在反应体系中含有10pg总基因组DNA时，即DNA样品稀释至5pg/μL，即拷贝数为1.9个，也出现稳定阳性信号，故MIR162双通道的检测定量低限为10pg，即1.2个拷贝数，本例所建方法体系反应灵敏度极高。
此外，内源基因特异性探针和MIR162品系特异性探针，对M1-M3三个浓度样品检测结果显示，三浓度样品检测结果呈10倍梯度关系，误差在15％以内。M1、M2两个浓度样品5次重复检测结果误差在15％以内，特别是M1样品，5次重复检测结果误差更低。可见，本例所建方法体系在玉米基因组DNA为1ng以上时准确性高，10ng准确性更高。
以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本申请的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心
<120> 一种转基因玉米品系MIR162的定量检测方法和试剂
<130> 15I22163
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tgcaaatagg ctgggaatag tctgtc 26
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
aaacggcttg tcccgcgtca t 21
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gcgggaaacg acaatctgat catga 25
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ttggactaga aatctcgtgc tga 23
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gctacatagg gagccttgtc ct 22
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
caatccacac aaacgcacgc gta 23

Claims (6)

1.一种转基因玉米品系MIR162的定量检测方法，其特征在于：包括在PCR反应体系中加入矿物油，混匀后，将其转移到微滴发生器上，自动产生微滴，然后将微滴全部转移到反应管中进行PCR反应，PCR反应结束后，读取每个微滴的扩增信号，并采用QuantaSoft V1.3.2软件计算待测样品的靶标DNA分子数；
所述PCR反应体系为双重实时荧光PCR扩增体系，包括PCR反应液、MIR162品系特异引物组、MIR162品系特异探针、HMG基因特异引物组、HMG基因特异探针和待测样品的DNA；
所述MIR162品系特异引物组的正向引物为Seq ID No.1所示序列，MIR162品系特异引物组的反向引物为Seq ID No.2所示序列，所述MIR162品系特异探针为Seq ID No.3所示序列，所述HMG基因特异引物组的正向引物为Seq ID No.4所示序列，HMG基因特异引物组的反向引物为Seq ID No.5所示序列，所述HMG基因特异探针为Seq ID No.6所示序列；
Seq ID No.1：5’-TGCAAATAGGCTGGGAATAGTCTGTC-3’
Seq ID No.2：5’-AAACGGCTTGTCCCGCGTCAT-3’
Seq ID No.3：5’-GCGGGAAACGACAATCTGATCATGA-3’
Seq ID No.4：5’-TTGGACTAGAAATCTCGTGCTGA-3’
Seq ID No.5：5’-GCTACATAGGGAGCCTTGTCCT-3’
Seq ID No.6：5’-CAATCCACACAAACGCACGCGTA-3’
其中，Seq ID No.3所示序列的MIR162品系特异探针中，5’末端具有FAM荧光基团，3’末端具有BHQ-1淬灭基团；Seq ID No.6所示序列的HMG基因特异探针中，5’末端具有HEX荧光基团，3’末端具有BHQ-1淬灭基团。
2.根据权利要求1所述的定量检测方法，其特征在于：还包括，采用QuantaSoft V1.3.2软件分别计算出转基因玉米品系MIR162的分子数和HMG基因分子数后，根据转基因玉米品系MIR162分子数和HMG基因分子数的比值，计算转基因玉米品系MIR162的绝对含量。
3.一种转基因玉米品系MIR162定量检测的试剂，其特征在于：所述试剂包括第一引物探针组合和第二引物探针组合，所述第一引物探针组合用于MIR162品系特异性检测，所述第二引物探针组合用于HMG基因特异性检测；
所述第一引物探针组合中，正向引物为Seq ID No.1所示序列，反向引物为Seq IDNo.2所示序列，探针为Seq ID No.3所示序列，并且探针的5’末端具有FAM荧光基团，3’末端具有BHQ-1淬灭基团；
所述第二引物探针组合中，正向引物为Seq ID No.4所示序列，反向引物为Seq IDNo.5所示序列，探针为Seq ID No.6所示序列，并且探针的5’末端具有HEX荧光基团，3’末端具有BHQ-1淬灭基团。
4.根据权利要求3所述的试剂在制备转基因玉米检测试剂盒或检测设备中的应用。
5.一种转基因玉米检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中含有权利要求3所述的试剂。
6.根据权利要求5所述的转基因玉米检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒采用权利要求1或2所述的定量检测方法对转基因玉米品系MIR162进行定量检测。
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