CN115992284A - 一种基于RPA-CRISPR-Cas12a系统快速检测转基因产品的试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于RPA‑CRISPR‑Cas12a系统快速检测转基因产品的试剂盒及方法，所述试剂盒包含Cry1Ab/Ac基因或CP4‑EPSPS基因的RPA引物及crRNA引导序列；检测时通过先对转基因的待测样品进行RPA扩增，再在CrRNA序列介导下，引导CRISPR‑Cas12a检测体系对RPA扩增产物进行的超灵敏识别目标dsDNA，形成三元复合物，进而激活附属切割功能，任意切割体系中的标记荧光探针的ssDNA，最后通过裂解产物中的荧光显色检测进行判断。本发明通过RPA扩增及CrRNA识别可超灵敏识别转基因产品中的Cry1Ab/Ac基因和CP4‑EPSPS基因，检测方法特异性强，且在灵敏度上可低至45拷贝/μL，可以实现现场的快速和高通量的检测。
Description
技术领域
本发明涉及转基因产品的分子检测技术领域，具体涉及一种基于RPA-CRISPR-Cas12a体系检测转基因产品的试剂盒及方法。
背景技术
转基因作物的大规模种植，引起了公众对其安全性的广泛关注。全球五大种植国的转基因作物应用率已经接近饱和，大豆、玉米和油菜的平均应用率统计显示，美国为95％、巴西(94％)、阿根廷(约100％)、加拿大(90％)和印度(94％)。
目前，抗虫和抗除草剂性状的产品是最广泛的转基因作物，其中抗草甘膦除草剂作物是将CP4-5-烯醇丙酮酸酯-3-磷酸合酶基因(CP4-5-enol acetate-3-phosphatesynthase gene CP4-EPSPS)转入转基因作物的基因组中，表达的CP4-EPSPS蛋白表现出对草甘膦的耐受性。
抗虫类转基因作物是将一种或多种杀虫晶体蛋白(Cry蛋白，内毒素)基因插入作物的基因组中而表现出抗虫的性状，其中Cry蛋白中的最常见的表达基因为Cry1Ab/Ac。通过调查发现，耐除草剂转基因作物的种植面积占比达到了43％，抗虫性状的转基因作物种植达12％，而具有抗除草剂和其他性状的复合性状比则为45％，首次超过了耐除草剂的性状占比。
转基因作物的广泛种植引起了公众对环境风险的极大关注，研究转入CP4-EPSPS、Cry1Ab/Ac基因的转基因农作物对于食品安全检测与环境、监测具有深远的意义。
在2020年12月份欧盟RASFF对华食品通报中，非法转基因问题占了第一位是我国食品出口贸易的主要原因。尽管许多国家已经实施了严格的转基因标签规定，但未经授权和不受控制的转基因作物种植依然被报道。因此，对转基因作物种植的检测技术在农产品安全监管中至关重要。迫切需要建立一种快速、灵敏、便携、低成本和易操作的检测方法来进行转基因作物的检测。
目前国内外已经建立和发展了很多转基因产品检测的方法和标准，如常规PCR、qPCR，逆转录PCR和等温扩增等技术，这已成为转基因产品检测评估的基准方法，并已被广泛用于各个领域的核酸检测，但这些检测方法大多是基于实验室平台的检测，现场速测的方法相对较少。
RPA恒温扩增技术在检测过程中因其不需特殊仪器和循环温度且高效特异扩增而被广泛应用于转基因检测中，而CRISPR-Cas12a检测技术因其精准检测的能力成为核酸检测的热点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于RPA-CRISPR-Cas12a系统快速检测转基因产品的试剂盒及方法，通过RPA扩增及CrRNA识别可超灵敏识别转基因产品中的Cry1Ab/Ac基因或CP4-EPSPS基因，检测方法特异性强，且在灵敏度上可低至45拷贝/μL，可以实现现场的快速和高通量的检测。
为了达到上述目的，本发明提供以下技术方案：
一种基于RPA-CRISPR-Cas12a系统快速检测转基因产品的试剂盒，包括：CP4-EPSPS基因的RPA引物及CrRNA序列或Cry1Ab/Ac基因的RPA引物及CrRNA序列、Cas12a酶和ssDNA荧光探针；
其中，所述CP4-EPSPS基因的特异性RPA引物序列为：
RPA-CP4-F4:5’-CAATCACCTACAGGGTACCTATGGCTTCCGCTC-3’；
RPA-CP4-R4:5’-ATCAGTCTCAACGGTAAGGTTAGCACCAAAA-3’；
所述CP4-EPSPS基因的特异性CrRNA引导序列为：CP4-CrRNA-1:5’-AAUUUCUACUGUUGUAGAUGGUGCUAACCUUACCGUUGAGACU-3’；
所述Cry1Ab/Ac基因的特异性RPA引物序列为：
RPA-Cry-F4:5’-CAGCGTGGTCGGTGTAGTTTCCAATCAGCCT-3’；
RPA-Cry-R4:5’-CCACAGCTATCCCATTGTTCGCAGTCCAGA-3’；
Cry1Ab/Ac基因的特异性CrRNA引导序列为：
CRY-CrRNA-2:5’-AAUUUCUACUGUUGUAGAUCCCAAACACGCUAACGUCUCGAAG-3’。
优选地，所述ssDNA荧光探针中的碱基数为8NT-14NT。
又，所述ssDNA荧光探针中的碱基数为12NT，所述ssDNA荧光探针结构为FT-HEX-12NT-BHQ1，具体序列为：5’-HEX-TTTTTTTTTTTT-BHQ1-3’。
又，所述ssDNA荧光探针为试纸条LFD探针LFD-FITC-8NT-Biotin，具体序列为：5’-FITC-TTTTTTTT-Biotin-3’。
进一步，所述试剂盒还包含相应的CP4-EPSPS基因或Cry1Ab/Ac基因片段的质粒标准品。
一种利用所述试剂盒快速检测转基因产品的RPA检测方法，包括以下步骤：
1)将RPA扩增体系预混物均匀分配到反应管中充分混合，所述反应管中含有RPA扩增用酶的试剂盒冻干颗粒；所述RPA扩增体系预混物包括：26.5-32.5μL的RPA缓冲液、终浓度为0.24-1μM的上游引物、终浓度为0.24-1μM的下游引物、ddH2O和靶标DNA；
2)将终浓度为500-900mM MgOAc转移到试管盖上；
3)反应混合管倒置数次混合均匀，于35-42℃恒温反应12-15min，获得RPA扩增产物；
4)对RPA扩增产物进行CRISPR-Cas12a附属切割并进行荧光检测或试纸条检测。
进一步，步骤4)中，进行CRISPR-Cas12a附属切割及荧光检测过程为：将步骤3)中的RPA扩增产物加入由LDEPC水、缓冲液、Cas12a酶、CrRNA、RNA酶抑制剂和ssDNA荧光探针组成的Cas12a酶解反应体系中，置于35-42℃均可的恒温扩增仪中酶切15-45min，反应结束时测定荧光值；
其中，CRISPR-Cas12a附属切割体系中包括：1-3μL RPA扩增产物、11-13μL LDEPC水、1-3μL缓冲液、0.5-1.5pmol的Cas12a酶、0.1-0.5μM CrRNA、15U-40U的RNA酶抑制剂和0.1-0.5μM ssDNA，使用的ssDNA荧光探针为FT-HEX-12NT-BHQ1，具体序列为：5’-HEX-TTTTTTTTTTTT-BHQ1-3’。
优选地，步骤1)中，所述RPA扩增体系预混物包括：29.5μLRPA缓冲液、终浓度为0.48μM的上游引物、终浓度为0.48μM的下游引物、11.2μL ddH2O和检测靶标DNA；步骤4)中，CRISPR-Cas12a附属切割体系总体积为20μL，包括：2μL RPA扩增产物、12.5μL LDEPC水、2μL缓冲液、1μL Cas12a酶、0.2μM CrRNA、20U RNA酶抑制剂和0.2μM ssDNA。
又，步骤4)中，CRISPR-Cas12a附属切割及试纸条检测过程为：将步骤3)中的RPA扩增产物加入由DEPC水、缓冲液、Cas12a酶、CrRNA、RNA酶抑制剂和ssDNA荧光探针组成的Cas12a附属切割反应体系中，置于35-42℃均可的恒温扩增仪中酶切15-45min；酶切完成后向离心管中加入酶切产物和缓冲液，将试纸条结合垫端插入离心管，液面不应超过高端绑定垫，孵化2-5min后，观察检测线(T)和控制线(C)的条带情况；检测结果的确定方法如下：如果T线和C线都出现条带则为阳性，则只有C线为阴性；如果C线和T线未着色，则检测结果无效；
其中，CRISPR-Cas12a附属切割体系的总体积为20μL，包括：2μL RPA扩增产物、12.5μL LDEPC水、2μL缓冲液、1μL Cas12a酶、1μL CrRNA、0.5μL RNA酶抑制剂和1μL ssDNA，所述ssDNA为试纸条LFD探针LFD-FITC-8NT-Biotin，具体序列为：5’-FITC-TTTTTTTT-Biotin-3’。
本发明对转基因产品中的CP4-EPSPS基因和Cry1Ab/Ac基因的序列保守区域，设计了特异性的RPA扩增引物及对应的CrRNA识别序列，和cas12a结合后，灵敏度至少提高了一个数量级；先通过对转基因基因待测样本进行RPA扩增，再在CrRNA的引导下，精准识别RPA扩增产物，将CRISPR/Cas12a和扩增片段dsDNA，结合在一起形成三元复合物，从而启动附属切割功能，任意切割体系中的ssDNA，发出荧光信号，进行荧光显示结果或试纸条检测，检测系统中是否存在目标序列。
本发明在靶DNA存在下，实现了对靶标的两次的信号放大，能检测到明显高于阴性对照的荧光信号，因此，可以检测系统中靶标的存在。此外，免疫层析条带检测方法以核酸检测为基础，在单链DNA的5’端用FITC荧光素标记，在3’端用生物素标记，用免疫层析法测定荧光强度，使检测结果更直观、更简单。
本发明中，所述ssDNA荧光探针为5’端HEX标记、3’端BHQ1标记的单链核苷酸序列，所述试纸条ssDNA的探针为5’端FITC标记、3’端Biotin标记的单链核苷酸序列；HEX和BHQ1修饰的ssDNA荧光探针可用于手持荧光检测仪检测目标体系中是否存在转基因成分，FITC和Biotin修饰的ssDNA荧光探针用于胶体金试纸条检测目标体系中是否存在转基因成分。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提出了一种简单、快速、灵敏、便携的重组酶聚合酶扩增结合CRISPR-Cas12a荧光或侧向流动试纸条检测转基因成分的检测技术即RPA-CRISPR-Cas12a，建立的RPA扩增反应和CRISPR-Cas12a检测系统稳定性好、实用性强、扩增效率高，该检测技术能特异性地区分CP4-EPSPS和Cry1Ab/Ac序列，且无交叉反应，荧光检测与试纸条的检测符合率为100％。
本发明中RPA-CRISPR-Cas12a系统的荧光检测方法中检测靶标DNA的相对荧光强度，并进行结果判定，适用于大规模田间检测和数据分析的方法。
本发明中的RPA-CRISPR-Cas12a荧光法和试纸条法都是检测CP4-EPSPS和Cry1Ab/Ac的灵敏、特异、快速和直观的方法，且不需要辅助设备，该方法为现场快速大规模筛选提供了技术手段。
附图说明
图1为本发明基于RPA-CRISPR-Cas12a体系可视化转基因产品检测的流程图。
图2-7为本发明实施例中RPA-CRISPR-Cas12a的特异性检测结果，其中，1-8分别为转基因大豆MON88913、转基因玉米BT-11、转基因玉米TC1507、转基因油菜MS、转基因油菜RF、非转基因大豆、非转基因玉米、DNA混合样品(MON88913:BT11:TC1507＝1:1:1)；M:DL2000Marker。NTC：体系中未加入模板。注：****有显著差异(P<0.0001)；
图2和图3分别为CP4-EPSPS和Cry1Ab/Ac基因RPA扩增后的特异性检测结果；图4和图5分别为CP4-EPSPS和Cry1Ab/Ac基因的荧光检测结果；图6和图7分别为CP4-EPSPS和Cry1Ab/Ac基因的试纸条检测结果。
图8-13为本发明实施例中RPA-CRISPR-Cas12a的灵敏度检测结果，其中，G1:4.5×108、G2:4.5×107拷贝、G3:4.5×106拷贝、G4:4.5×105拷贝、G5:4.5×104拷贝、G6:4.5×103拷贝、G7:4.5×102拷贝、G8:4.5×101拷贝、G9:4.5×100拷贝，NTC：体系中未加入模板，M：DL2000 Marker，注：****有显著差异(P<0.0001)。
图8和图9分别为CP4-EPSPS和Cry1Ab/Ac基因的RPA扩增后灵敏度检测结果；图10和图11分别为CP4-EPSPS和Cry1Ab/Ac基因的灵敏度荧光检测结果；图12和图13分别为CP4-EPSPS和Cry1Ab/Ac基因的试纸条灵敏度检测结果。
图14-19为本发明实施例中转基因产品的检测结果，图14、16和18是CP4-EPSPS转基因产品的检测结果，1-8分别为转基因油菜GT73、转基因大豆MON89788、转基因苜蓿J163、转基因玉米NK603、转基因甜菜H7-1、转基因大豆MON88913、转基因棉花MON1445、转基因苜蓿J101；图15、17和19是Cry1Ab/Ac转基因产品的检测结果；其中，1-5：转基因玉米MON810、转基因水稻KF、KMD、转基因玉米MON87701、BT11，M：DL2000 Marker，NTC：体系中未加入模板；注：****有显著差异(P<0.0001)。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明做进一步说明。
除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂，材料均为市购，合成的引物探针等均在生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
实施例中涉及的含有CP4-EPSPS基因和Cry1Ab/Ac基因片段均为RPA扩增后克隆至puc57质粒载体中。
实施例
本实施例主要是针对CP4-EPSPS基因和Cry1Ab/Ac基因进行的说明。检测流程图如图1所示。
通过先对待测的样本进行RPA的恒温扩增，得到扩增产物后，将产物加入CRISPR-Cas12a体系中，CrRNA和扩增产物dsDNA在cas12a酶的作用下，进行超灵敏的特异性识别，进而启动附属切割功能，切割ssDNA，从而实现荧光显示结果或者试纸条的检测结果，具体过程如下：
首先，针对CP4-EPSPS基因和Cry1Ab/Ac基因的靶标序列设计PRA引物，合成后进行引物的条带特异性和灵敏度的筛选检测后，最终得到如下最合适的引物：
RPA-CP4-F4：5’-CAATCACCTACAGGGTACCTATGGCTTCCGCTC-3’；
RPA-CP4-R4：5’-ATCAGTCTCAACGGTAAGGTTAGCACCAAAA-3’；
RPA-Cry-F4：5’-CAGCGTGGTCGGTGTAGTTTCCAATCAGCCT-3’；
RPA-Cry-R4：5’-CCACAGCTATCCCATTGTTCGCAGTCCAGA-3’。
CP4-EPSPS基因(AF464188.1)的扩增片段长度为167bp，Cry1Ab/Ac基因(AF023672.1)的扩增片段长度为198bp；
而后进行RPA体系的系列优化，并对引物浓度、扩增温度和扩增时间进行探索优化，最终获得的最优RPA扩增体系中含有29.5μL RPA缓冲液、2.4μL引物(终浓度为0.48μM的上游引物、终浓度为0.48μM的下游引物)、11.2μL的ddH2O和2μL靶标DNA(100-106拷贝)。
将47.5mol/L的预混料均匀分配到每个含有TwistAmp Basic试剂盒冻干颗粒的反应管中，充分混合，然后，将2.5μL(700mM)的醋酸镁转移到试管盖上，每个反应管最终体积均为50μL。反应混合管倒置10次，混合均匀，置于35-42℃均可的恒温反应器上反应，12-15min后获得RPA扩增产物；其中，所述RPA扩增体系预混物包括：29.5μL的RPA缓冲液、终浓度为0.48μM的上游引物、终浓度为0.48μM的下游引物、ddH2O和靶标DNA。
其次，进行RPA-CRISPR-Cas12a系统的体系优化筛选：在167bp的CP4-EPSPS基因的片段和198bp Cry1Ab/Ac基因的片段上，进行CrRNA的设计和筛选，分别设计了4组，最终优化得到如下2组识别效率最高的CrRNA引导序列：
CP4-EPSPS基因的CrRNA引导序列为CP4-CrRNA-1：
5’-AAUUUCUACUGUUGUAGAUGGUGCUAACCUUACCGUUGAGACU-3’；
Cry1Ab/Ac基因的CrRNA引导序列为CRY-CrRNA-2：
5’-AAUUUCUACUGUUGUAGAUCCCAAACACGCUAACGUCUCGAAG-3’；
其中CrRNA的识别长度均为24bp。
CRISPR-Cas12a附属切割反应体系及过程为：将2μL RPA扩增产物加入由12.5μLLDEPC水、2μL缓冲液、1μL Cas12a酶、1μL CrRNA、0.5μL RNA酶抑制剂、1μL ssDNA组成的Cas12a酶解反应体系中，置于35-42℃均可的恒温扩增仪中酶切30min，反应结束时测定荧光值和进行试纸条检测。
最后进行结果判断：
荧光检测方法是进行荧光值的测定，和NTC相比，大于1.4倍的NTC值，则为阳性，反之为阴性。
试纸条检测方法是在酶切完成后向1.5mL离心管中加入5μL的酶切产物和95μL的缓冲液，将试纸条结合垫端插入离心管。液面不应超过高端绑定垫，孵化2-5min后，观察检测线(T)和控制线(C)的条带情况。检测结果的确定方法如下：如果T线和C线都出现条带则为阳性，则只有C线为阴性；如果C线和T线未着色，则检测结果无效。
以转基因大豆、玉米等农作物及其产品为研究对象，对抗除草剂基因(CP4-EPSPS)和抗虫基因(Cry1Ab/Ac)在恒温条件下的现场速测，利用RPA技术实现转基因靶标基因序列的指数扩增，设计基于CRISPR-Cas12a系统的转基因特异性精准识别靶向的引导CrRNA和标记荧光或识别元件的ssDNA，通过荧光显示实现高通量检测或结合侧向流动试纸条检测技术使结果可视化，整个反应在35-39℃区间内皆可完成检测流程，且在45min内完成。
特异性实验中选取NK603、RRS、MON89788、MON1445 MON88913、GT73、J101、H7-1、Bt11、MON87701、M0N531、KMD、KF转基因材料，提取DNA后进行RPA扩增，再进行CRISPR-Cas12a系统切割，荧光或试纸条结果检测。
结果参见图2-7，只有含有CP4-EPSPS和Cry1Ab/Ac基因的产品产生了显著的荧光信号，而对照和非转基因产品产生较弱的荧光信号。针对CP4-EPSPS设计的CrRNA中，只有CrRNA-1检测结果呈阳性，即检测线与质控线都出现，且检测线条带明显。阴性对照的质控线条带较明显，检测线条带极弱。而Cry1Ab/Ac中的三条CrRNA检测结果都呈阳性，且差异不明显，与RPA-CRISPR-Cas12a荧光检测结果相同。
灵敏度检测实验中，测定了RPA-CRISPR-Cas12a系统对CP4-EPSPS和Cry1Ab/Ac的灵敏度。结果参见图8-13，含有CP4-EPSPS的108-103拷贝的荧光值没有差异，而含有Cry1Ab/Ac基因108-100拷贝的8个质粒的荧光值也没有差异。荧光强度显著高于4.5个拷贝的荧光强度。试纸条检测结果显示，在4.5×101的极限下，CP4-EPSPS与Cry1Ab/Ac试纸条T线的信号依然明显。当模板浓度低于4.5×101拷贝时，只观察到明显的C线的信号，即所检测的检测限为45拷贝。
该实例中对转基因材料进行了实际样本的检测，结果参见图14-19，由图14-19可见，所有含有目的基因的转基因产品都检测到了特异性片段，条带均一明亮，只有含CP4-EPSPS和Cry1Ab/Ac的转基因产品有较大的荧光值。所有通过CRISPR荧光确认的转基因阳性样品也均通过CRISPR试纸条系统确认，即所有转基因阳性品系都有T线和C线的出现，而阴性样品只出现C线，说明该系统能够快速检测出转基因产品，稳定性好，准确度高。
本发明的RPA-CRISPR-Cas12a体系可视化转基因产品检测在35-39℃区间内皆可完成检测流程，且在45min内完成，特异性良好(图2-7)，检测最低灵敏度达到45拷贝(图8-13)；反应体系体积降低至20μL仍可稳定检出45拷贝的靶标分子；该系统在不同转基因材料上进行了应用(图14-19)，均可检出，特异性和灵敏度较好。
本发明建立的RPA-CRISPR-Cas12a检测方法高效特异，且无需复杂的设备，仅需室温下利用手持荧光分析仪即可完成整个检测流程。
Claims (9)
1.一种基于RPA-CRISPR-Cas12a系统快速检测转基因产品的试剂盒，包括：CP4-EPSPS基因的RPA引物及CrRNA序列或Cry1Ab/Ac基因的RPA引物及CrRNA序列、Cas12a酶和ssDNA荧光探针；
其中，所述CP4-EPSPS基因的RPA引物序列为：
RPA-CP4-F4:5’-CAATCACCTACAGGGTACCTATGGCTTCCGCTC-3’；
RPA-CP4-R4:5’-ATCAGTCTCAACGGTAAGGTTAGCACCAAAA-3’；
所述CP4-EPSPS基因的CrRNA引导序列为：
CP4-CrRNA-1:5’-AAUUUCUACUGUUGUAGAUGGUGCUAACCUUACCGUUGAGACU-3’；
所述Cry1Ab/Ac基因的RPA引物序列为：
RPA-Cry-F4:5’-CAGCGTGGTCGGTGTAGTTTCCAATCAGCCT-3’；
RPA-Cry-R4:5’-CCACAGCTATCCCATTGTTCGCAGTCCAGA-3’；
Cry1Ab/Ac基因的CrRNA引导序列为：
CRY-CrRNA-2:5’-AAUUUCUACUGUUGUAGAUCCCAAACACGCUAACGUCUCGAAG-3’。
2.根据权利要求1所述基于RPA-CRISPR-Cas12a系统快速检测转基因产品的试剂盒，其特征在于，所述ssDNA荧光探针中的碱基数为8NT-14NT。
3.根据权利要求2所述基于RPA-CRISPR-Cas12a系统快速检测转基因产品的试剂盒，其特征在于，所述ssDNA荧光探针中的12NT，所述ssDNA荧光探针结构为FT-HEX-12NT-BHQ1，具体序列为：5’-HEX-TTTTTTTTTTTT-BHQ1-3’。
4.根据权利要求1所述基于RPA-CRISPR-Cas12a系统快速检测转基因产品的试剂盒，其特征在于，所述ssDNA荧光探针为试纸条LFD探针LFD-FITC-8NT-Biotin，具体序列为：5’-FITC-TTTTTTTT-Biotin-3’。
5.根据权利要求1所述基于RPA-CRISPR-Cas12a系统快速检测转基因产品的试剂盒，其特征在于，还包含相应的CP4-EPSPS基因或Cry1Ab/Ac基因片段的质粒标准品。
6.一种利用如权利要求1所述试剂盒快速检测转基因产品的RPA检测方法，包括以下步骤：
1)将RPA扩增体系预混物均匀分配到反应管中充分混合，所述反应管中含有RPA扩增用酶的试剂盒冻干颗粒；所述RPA扩增体系预混物包括：26.5-32.5μL的RPA缓冲液、终浓度为0.24-1μM的上游引物、终浓度为0.24-1μM的下游引物、ddH2O和靶标DNA；
2)将终浓度为500-900mM醋酸镁转移到试管盖上；
3)反应混合管倒置数次混合均匀，于35-42℃恒温反应12-15min，获得RPA扩增产物；
4)对RPA扩增产物进行CRISPR-Cas12a附属切割并进行荧光检测或试纸条检测。
7.根据权利要求6所述的RPA检测方法，其特征在于，步骤4)中，进行CRISPR-Cas12a附属切割及荧光检测过程为：将步骤3)中的RPA扩增产物加入由LDEPC水、缓冲液、Cas12a酶、CrRNA、RNA酶抑制剂和ssDNA荧光探针组成的Cas12a附属切割反应体系中，置于35-42℃均可的恒温扩增仪中酶切15-45min，反应结束时测定荧光值；
其中，CRISPR-Cas12a附属切割体系中包括：1-3μL RPA扩增产物、11-13μL LDEPC水、1-3μL缓冲液、0.5-1.5pmol的Cas12a酶、0.1-0.5μM CrRNA、15U-40U的RNA酶抑制剂和0.1-0.5μM ssDNA，使用的ssDNA荧光探针为FT-HEX-12NT-BHQ1，具体序列为：5’-HEX-TTTTTTTTTTTT-BHQ1-3’。
8.根据权利要求7所述的RPA检测方法，其特征在于，步骤1)中，所述RPA扩增体系预混物包括：29.5μLRPA缓冲液、终浓度为0.48μM的上游引物、终浓度为0.48μM的下游引物、11.2μL ddH2O和检测靶标DNA；步骤4)中，CRISPR-Cas12a附属切割体系总体积为20μL，包括：2μLRPA扩增产物、12.5μL LDEPC水、2μL缓冲液、1μL Cas12a酶、0.2μM CrRNA、20U RNA酶抑制剂和0.2μM ssDNA。
9.根据权利要求6所述的RPA检测方法，其特征在于，步骤4)中，CRISPR-Cas12a附属切割及试纸条检测过程为：
将步骤3)中的RPA扩增产物加入由LDEPC水、缓冲液、Cas12a酶、CrRNA、RNA酶抑制剂和ssDNA荧光探针组成的Cas12a附属切割反应体系中，置于35-42℃均可的恒温扩增仪中酶切15-45min；酶切完成后向离心管中加入酶切产物和缓冲液，将试纸条结合垫端插入离心管，液面不应超过高端绑定垫，孵化2-5min后，观察检测线(T)和控制线(C)的条带情况；检测结果的确定方法如下：如果T线和C线都出现条带则为阳性，则只有C线为阴性；如果C线和T线未着色，则检测结果无效；
其中，CRISPR-Cas12a附属切割体系的总体积为20μL，包括：2μL RPA扩增产物、12.5μLLDEPC水、2μL缓冲液、1μL Cas12a酶、1μL CrRNA、0.5μL RNA酶抑制剂和1μL ssDNA，所述ssDNA为试纸条LFD探针LFD-FITC-8NT-Biotin，具体序列为：5’-FITC-TTTTTTTT-Biotin-3’。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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