KR101218435B1 - 유전자 변형 식물의 스크리닝 방법 - Google Patents

유전자 변형 식물의 스크리닝 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 유전자 변형 식물의 스크리닝 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 경쟁적 PCR 및 질량 분석 방법을 이용하여 유전자 변형 식물을 검출하는 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 유전자 변형 식물 검출용 프라이머 세트 및 경쟁적 PCR 수행을 위한 경쟁적 서열, 및 상기 프라이머 세트 및 경쟁적 서열을 포함하는 유전자 변형 식물 검출용 키트를 제공한다.

Description

유전자 변형 식물의 스크리닝 방법{A method for analyzing GMO using competitive PCR}
본 발명은 경쟁적 PCR을 이용하여 유전자 변형 식물을 검출하는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 서열번호 7 내지 서열번호 24의 염기서열을 포함하는 유전자 변형 식물 검출용 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 서열번호 7 내지 서열번호 24로 표시된 염기서열을 갖는 프라이머 세트 및 경쟁적 서열(competitor gene) 서열을 포함하는 유전자 변형 식물 검출용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머 및 경쟁적 PCR을 이용하여 유전자 변형 식물의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
유전자 변형 식물(GMO : Genetically Modified Organism)이란 기존의 작물육종에 의한 품종 개발과는 달리, 동식물 또는 미생물의 유용 유전자를 인공적으로 분리, 결합시켜 생산성이 증가 되도록 한 생물체를 총칭한다. 일반적으로 유전자 변형 식물의 생산성을 증가시키기 위하여 제초제 저항성, 내충성, 내병성, 내한성 등에 관련된 유전자를 농산물에 도입하고 있다.
상기한 유전자 변형 식물을 검정하기 위하여 사용되는 기술로는 단백질 검출에 의한 방법과 유전자 검출에 의한 방법으로 크게 나누어 볼 수 있다.
첫 번째로, 단백질 검출에 의한 검정 기술은 EPSPS 유전자가 도입된 콩 및 CryIA(b), Cry9C, PAT 유전자가 도입된 옥수수에 대하여 EPSPS 또는 CryIA(b), Cry9C, PAT 유전자가 발현하는 EPSPS 또는 Bt 단백질을 항체로 이용하여 검출하는 스트립(strip) 키트가 있고, 효소면역학적 방법(Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA)에 의한 EPSPS과 CryIA(b) 유전자 단백질정량용 분석 키트가 최근 상품화되었다. 그러나 단백질의 발현양은 유전자변형농산물에 따라 다르고, 개발회사에서 사용한 유전자 발현 조절부위(프로모터)에 따라 종자에서 발현되지 않는 경우도 있으며, 보관상태 또는 가공식품의 경우에 가공과정에서 분해되는 경우도 있어 검정에 한계가 있다.
두 번째로, DNA 검출에 의한 검정기술 핵산중합효소 연쇄 반응법(polymerase chain reaction, PCR)에 의한 검정기술이다. 현재 유전자변형식물에 많이 사용되는 컬리플라워 모자이크 바이러스 프로모터(CaMV 35S promoter)에 대한 특이적인 PCR 프라이머로 유전자변형 여부를 확인할 수 있다. 특히 스위스, 독일 등 EU에서는 35S 프로모터 또는 Nos 터미네이터 특이적인 프라이머를 이용한 PCR 검정법이 유전자변형식품을 검정하는 공인기술로 이용되고 있다.(A. Jankiewicz 등, Eur. Food res. Technol. 209:77-82, 1999; Pietsch 등, DG JRC 보고서, 1999) 또한 현재 상품화되고 있는 PCR 검정킷트(kit)도 역시 35S 프로모터 또는Nos 터미네이터 특이 프라이머를 이용한 것이다. 그러나 이들의 35S 프로모터 또는 Nos 터미네이터 특이 프라이머를 이용한 PCR 결과에서 의사양성(false positive) 또는 의사음성(false negative)가 나타날 가능성이 있으며(Lipp 등, J.AOAC International 82:923-928, 1999), 유전자변형농산물의 종류에 따라 이들 조절부위 유전자를 이용하고 있지 않는 경우도 있다. 따라서 스위스 등 EU에서는 이들 조절부위 특이적인 프라이머를 이용한 PCR은 유전자변형농산물의 1차적인 스크리닝에 이용하고 있으며, 유전자변형농산물의 계통 특이적인 프라이머를 이용한 PCR 검정을 2차 검정으로 확인하고 있다.(Huber 등, Nat. Biotechnol. 17:1137-1138, 1999) 그러나 개발회사에 따라 유전자변형농산물에 도입시킨 유전자의 염기서열이 변경되어 있으며 도입유전자의 발현방법도 다를 뿐만 아니라 상기한 유전정보를 개발회사의 비밀정보 (confidential business information, CBI)로 하여 도입유전자에 대한 유전정보를 확보하기에 곤란한 점이 많다. 따라서 2차 검정에 이용하고 있는 프라이머의 정보도 공개하지 않고 있어 계통별 특이 프라이머 개발이 국내외적으로 시급한 실정이다.
이에 본 발명자들은 상기와 같은 한계점을 극복하고, GMO를 효과적으로 검출하기 위한 방법을 개발하고자 노력한 결과, 특정 프라이머들을 사용하여 경쟁적 PCR을 수행하고, 이를 질량 분석 방법으로 분석하는 경우 다수의 GMO를 한번에 검출할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 서열번호 7 내지 서열번호 24로 표시된 염기서열을 갖는 유전자 군을 포함하는 유전자 변형 식물 검출용 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 서열번호 7 내지 서열번호 24로 표시된 염기서열을 갖는 프라이머 세트 및 경쟁적 서열(competitor gene)을 포함하는 유전자 변형 식물 검출용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 내재 유전자 및 외래 도입 유전자에 대한 프라이머를 이용하여 경쟁적 PCR 및 질량 분석을 수행함으로써 유전자 변형 식물 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
따라서 본 발명은 서열번호 7 내지 서열번호 24로 표시된 염기서열을 갖는 유전자 군을 포함하는 유전자 변형 식물 검출용 프라이머 세트에 관한 것이다.
본 발명의 용어 ‘프라이머’란 짧은 자유 3’ 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로, 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(DNA 중합효소 또는 역전사효소) 및 상이한 4 가지 NTP(nucleoside triphospate)의 존재 하에 DNA 합성을 개시할 수 있다. 본 발명의 프라이머는 각 내재 유전자 및 외부 도임 유전자에 특이적인 프라이머로, 바람직하게 7 내지 50 개의 올리고 서열을 가진 센스 및 안티센스 핵산 서열로 구성될 수 있다. 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 또한, 본 발명의 프라이머 핵산 서열은 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지의 예로는, 효소(예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타아제), 방사성 동위원소(예를 들어, 32P), 형광성 분자, 화학그룹(예를 들어, 바이오틴) 등이 있다. 본 발명에서 프라이머 쌍은 표적 유전자 서열을 인지하는 정방향 및 역방향의 프라이머로 이루어진 모든 조합의 프라이머 쌍을 포함하나, 바람직하게는, 특이성 및 민감성을 가지는 분석 결과를 제공하는 프라이머 쌍이다. 프라이머의 핵산 서열이 시료 내에 존재하는 비-표적 서열과 불일치하는 서열이어서, 상보적인 프라이머 결합 부위를 함유하는 표적 유전자 서열만 증폭하고 비특이적 증폭을 유발하지 않는 프라이머일 때, 높은 특이성을 부여할 수 있다. 바람직하게 본 발명의 프라이머는 GMO 검출을 위한 PCR을 수행하는데 있어서 대상 식물의 목적 유전자(내재 유전자 및 외래 도입 유전자)에 특이적으로 결합하여 신장 반응을 일으킬 수 있는 프라이머이다. 본 발명자들은 GMO 예상 식물에 대해 real-competitive PCR(rcPCR)을 수행하기 위하여 해당 real-competitive PCR 과정에서 가장 적절하게 PCR 산물을 생산할 수 있다고 판단된 프라이머를 디자인하였으며, 이를 본 발명의 서열번호 7 내지 서열번호 24로 나타내었다. 또한 상기 프라이머들은 각각 내재 유전자 및 외래 도입 유전자에 대한 경쟁적 서열에 목적 유전자와 동일한 수준으로 증폭시킬 수 있다.
본 발명의 용어, 내재적 서열(endogenous sequence), 해당 작물이 고유하게 가지고 있는 서열로서 외래 도입 서열에 대한 비교 기준으로 사용되며, 내재적 참조 서열(endogenous reference sequence)이라고도 한다.
본 발명의 경쟁적 서열(competitor)이란, rcPCR에서 증폭시키고자 하는 목적 유전자 산물과 경쟁적으로 작용하는 임의의 올리고 서열을 의미한다. 이러한 경쟁적 서열은 목적 유전자의 서열과 최소의 차이를 갖게 하여, PCR 수행 시 프라이머들이 경쟁적으로 작용할 수 있기만 하면 그 서열에는 제한이 없다. 상기와 같은 조건을 반영하는 경우, 바람직하게 경쟁적 서열은 목적 유전자와 단 하나의 염기서열 차이를 보이는 임의의 올리고 서열이다.
본 발명의 외래 도입 서열 또는 외래 도입 유전자란, 해당 개체에 원래는 존재하지 않던 서열로서 GMO 식물은 병충해와 같은 식물 피해로부터 식물을 보호하고, 나아가 신품종 개발기간의 단축, 작물의 수량 또는/및 품질 개선, 의약품과 같은 고부가가치 물질의 생산등을 위하거나 또는 제초제에 대한 저항성을 부여하기 위해 본래의 유전자가 아닌 다른 유전자를 식물 개체에 도입한 서열을 의미한다.
본 발명의 프라이머를 이용하여 rcPCR을 수행하는 PCR 산물의 크기는 PCR 주기를 반영하여 상대적인 산물의 카피 수를 측정할 수 있는 크기이면 제한이 없다. 다만, 본 발명의 PCR은 다중 PCR(Multiplex PCR)이 수행되는 바, PCR의 크기가 100 내지 200 bp로 조절하는 것이 바람직하다.
본 발명의 “rcPCR(real-competitive PCR)”이란 PCR 과정에서 하나의 프라이머에 대해 경쟁적 올리고 서열이 목적 유전자와 경쟁하도록 조건을 설정하여 수행하는 PCR로서, 이미 농도와 카피 수를 알고 있는 경쟁적 서열(Competitor (internal DNA strand))와 카피 수를 알지 못하는 목적 유전자(또는 목적 DNA)를 동일한 프라이머로 함께 증폭하여 증폭된 DNA 양을 비교하여 DNA의 starting 농도를 결정할 수 있는 방법이다.
iPLEX Gold reaction은 단 하나의 염기서열의 차이를 분석하기 위한 방법으로써, 본 방법을 이용하는 경우 rcPCR로 생산된 목적 유전자 및 경쟁적 서열의 비율을 판단할 수 있게 된다. 본 발명에서는 상기 rcPCR 및 iPLEX Gold 반응 이후에 레진 첨가(resin addition) 및 물 첨가(pure-water addition) 등의 과정을 수행한 후, 생성된 산물을 첨가하여 MALDI-TOF 질량분석기에 넣어 생성된 염기서열을 확인하였다.
본 발명의 프라이머를 이용하여 검출 가능한 GMO는 프라이머에 반응하는 유전자를 가진 식물종이면 제한이 없으나, 바람직하게는 콩 또는/및 옥수수이고, 이들은 동시에, 별개로 또는 순차적으로 검출될 수 있다. 본 발명자들은 본 발명의 프라이머 및 rcPCR을 이용하여 유전자 재조합 콩 및 유전자 재조합 옥수수들에 대해 분석한 결과 높은 정확도와 민감성을 보임을 확인하였다. 바람직하게 본 발명에 의해 분석이 가능한 GMO 식물은 유전자 재조합 콩인 RRS, 유전자 재조합 옥수수인 (MON810, GA21 또는 Bt176일 수 있다.
다른 하나의 양태로서 본 발명은 서열번호 7 내지 서열번호 24로 표시된 염기서열을 갖는 프라이머 세트 및 경쟁적 서열(competitor)을 포함하는 유전자 변형 식물 검출용 키트에 관한 것이다.
본 발명의 프라이머 및 경쟁적 서열은 상기 기술한 바와 같으며, 본 발명의 프라이머 및 경쟁적 서열을 포함하여 GMO 검출용 키트를 제작할 수 있다. 본 발명의 키트는 상기 프라이머 및 경쟁적 서열 외에 통상적으로 서열 분석에 필요한 물질들을 더 포함시킬 수 있으며, 효과적인 분석을 위한 다양한 요소는 당업계에 공지되어 있다. 본 발명의 검출용 키트는 콩 유전자의 변형 검출 또는 옥수수 유전자의 변형 검출, 또는 콩 및 옥수수의 유전자 변화를 동시에 검출할 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서 본 발명은 내재 유전자 및 외래 도입 유전자에 대한 프라이머 세트 및 경쟁적 PCR을 이용한 유전자 변형 식물의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
본 발명의 스크리닝 방법은 (a) 내재 유전자 및 외래 도입 유전자의 프라이머 세트, 및 경쟁적 서열을 포함하는 키트에 시료를 투여하는 단계; (b) rcPCR(real-competitive PCR)을 수행하는 단계; (c) 질량 분석을 수행하는 단계; 및 (d) 대상 시료 내 유전자 변형 식물의 도입 유전자 카피 수를 확인하는 단계 포함하는 유전자 변형 식물의 스크리닝 방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 GMO 분석 방법은 rcPCR을 수행할 수 있는 키트에 GMO 개체임이 의심되는 시료를 투여하고, rcPCR 및 질량 분석을 수행한 이후 경쟁적 서열과 목적 서열간의 카피 수를 비교 분석 함으로써, GMO에 통상적으로 삽입되는 외래 도입 유전자가 존재하는지, 존재한다면 얼마나 존재하는지에 대한 정보를 제공합으로써 GMO 개체에 대한 여부를 판별할 수 있는 방법이다. GMO 개체를 구분하는 지표로 삼을 수 있는 내재 유전자 및 외래 도입 유전자에 대한 디자인을 수행하는 경우, 본 발명의 방법을 이용하여 다양한 식물로부터 GMO에 대한 스크리닝이 가능하다.
따라서 본 발명의 시료는 GMO가 의심되는 식물의 시료이면 제한 없이 분석 가능하나, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 GMO가 의심되는 콩 또는 옥수수의 시료를 사용하였다. 또한 본 발명의 시료는 상기 식물들의 유전적 서열을 확인할 수 있는 부위라면 어떤 부위라도 사용 가능하다.
GMO 의심 개체의 시료를 본 발명의 키트에 투여하고, rcPCR을 통해 경쟁적으로 증폭시킨 후, 질량 분석을 수행하는 경우, 시료 내 외래 도입 유전자의 유무에 따라 경쟁적 서열과의 증폭 비율에 차이를 나타내고, 이를 반영하여 분석하면 해당 시료를 가진 식물이 GMO 식물인지 여부를 확인할 수 있게 된다. 종래에는 GMO 개체를 판별하기 위하여 real-time PCR을 사용하는데 그쳤는데, 이러한 방법은 한 번에 하나의 유전자만을 분석할 수 있을 뿐이어서, 여러 개의 유전자에 대한 동시 분석을 수행하는데 한계가 존재하였다. 이에 비해 본 발명의 검출 방법을 이용하는 경우, 최대 24개의 유전자까지 동시에 분석할 수 있어, 분석 시간을 절감할 수 있다. 또한 본 발명자들은 본 발명의 방법이 기존의 real-time PCR을 대체할 수 있는지를 평가하기 위해, 특이성, 정확성, 정밀성 및 민감성을 검토하여 본 결과, 특이성, 정확성 및 민감성에 있어서는 기존 방법보다 우수함을 확인하였고, 정밀성과 반복성에 있어서도 기존의 방법과 큰 차이가 없음을 확인하기에 이르렀다.
질량 분석은 rcPCR에 의해 생산된 PCR 산물들을 서열 상 차이에 근거하여 분석할 수 있는 도구이면 제한 없이 사용가능하다. 바람직하게는 MALI-TOF를 통한 분석일 수 있고, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 Sequenom사의 제품을 이용하여 질량 분석을 수행하였다.
본 발명의 방법은 GMO에 대한 스크리닝 동정 뿐만 아니라, 정성 및 정량적 분석이 모두 가능하도록 디자인되었다. 특히 GMO 각각 제품에 해당하는 본 발명의 프라이머 세트는 다른 계통으로부터 해당 식물만을 특이적으로 검출할 수 있다. 또한 본 발명의 검출 방법은 콩 또는/및 옥수수에 특이적으로 삽입된 외래 도입 유전자 및 내재 유전자를 동시에 증폭시킬 수 있는 다중 PCR 조건과 프로토콜을 확립하기에 이르렀다.
도 1은 RRS, MON810, GA21 및 Bt176 각각에 대해, 외래 도입 유전자 선별을 위해 디자인된 스크리닝 타겟 유전자의 구조를 나타낸 모식도이다.
도 2는 MassARRAY QGE의 기본 원리를 나타낸 도이다.
도 3은 MassARRAY QGE 과정을 나타낸 흐름도이다.
도 4는 GM 옥수수 검출 플라스미드에 대한 real-time PCR로부터 얻은 표준 곡선 및 증폭 곡선이다; (A) P35S_Maize, (B) tNOS_Maize, (C) SSⅡb_Maize, (D) MON810, (E) GA21, (F) Bt176.
도 5는 GM 콩 검출 플라스미드에 대한 real-time PCR로부터 얻은 표준 곡선 및 증폭 곡선이다; (A) P35S_SOY, (B) tNOS_SOY, (C) Le1n, (D) RRS.
도 6은 real-time PCR를 사용하는 경우, 옥수수 및 콩의 실험값 및 실제값 간의 상관관계를 나타낸 그래프이다; (A) MON810, (B) GA21, (C) Bt176, (D) RRS.
도 7은 GM 콩 및 옥수수에 있어서 질량 분석 MALDI-TOF로부터 얻은 질량-스펙트럼 결과이다; (A)RRS, (B)MON810, (C)GA21, (D)Bt176;
*lec-UEP : Endogenous gene detection primer of GM soybean
*SSIIb-UEP : Endogenous gene detection primer of GM maize
*MON810-UEP : Event-specific gene(hsp70 - cry1Ab) detection primer of MON810
*GA21-UEP : Event-specific gene(OTP - mEPSPS) detection primer of GA21
*Bt176-UEP : Event-specific gene(cry1Ab - PEPC int#9) detection primer of Bt176
도 8은 질량분석 MALDI-TOF를 사용하는 경우, 옥수수 및 콩의 실험값 및 실제값 간의 상관관계를 나타낸 그래프이다; (A) MON810, (B) GA21, (C) Bt176, (D) RRS.
도 9는 옥수수 MON810의 서열로서 원 서열 상의 위치: 1132 - 1937는 hsp 70서열이며, 원 서열 상의 위치: 1938 - 4394는 cry1Ab 서열을 나타낸다. MON810-1st 및 MON810-2nd 부위는 도면에 굵게 밑줄로 표시하였고, MON810-UEP 부위는 굵게 이탤릭체로 표시하였다.
도 10은 옥수수 GA21의 서열로서 GA21-1st 및 GA21-2nd 부위는 굵게 밑줄로 표시하였고, GA21-UEP 부위는 굵게 이탤릭체로 표시하였다.
도 11은 옥수수 Bt176의 dry1A(b) 유전자 서열로서 Bt176-1st 및 Bt176-2nd 부위는 굵게 밑줄로, Bt176-UEP 부위는 굵게 이탤릭체로 표시하였다.
도 12는 콩 RRS의 서열로서 원 서열 상의 위치: 530-745는 CTP4를, 원 서열 상의 위치: 746-2114는 CP4EPSPS를 나타낸다. RRS-1st 및 RRS-2nd는 굵게 밑줄을 그어 표시하였고, RRS-UEP는 굵게 이탤릭체로 표시하였다.
도 13은 콩의 내재적 참조서열인 lec의 서열을 나타낸 도이다. lec-1st 및 lec-2nd는 굵게 밑줄을 그어 표시하였고, lec-UEP는 굵게 이탤릭체로 표시하였다.
도 14는 옥수수의 내재적 참조서열인 SSIIb의 서열을 나타낸 도이다. SSIIb-1st 및 SSIIb-2nd는 굵게 밑줄을 그어 표시하였고, SSIIb-UEP 굵게 이탤릭체로 표시하였다.
도 15는 프로모터 CaMV p35S 서열을 나타낸 도로서, Genbank Accession No. DQ191320.1로 등재되어 있다. p35S-1st 및 p35S-2nd는 굵게 밑줄을 그어 표시하였고, p35S-UEP 굵게 이탤릭체로 표시하였다.
도 16은 터미네이터 서열인 tNOs를 나타낸 도로서, Genbank Accession No. EU259513.1로 등재되어 있다. tNOS-1st 및 tNOS-2nd는 굵게 밑줄을 그어 표시하였고, tNOS-UEP 굵게 이탤릭체로 표시하였다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1. 시료준비 및 DNA 추출
실시예 1-1. 분석시료 (콩 및 옥수수 시료)
본 발명을 입증하기 위하여, 실험에 사용된 GMO 시료는 정량 및 정성검사가 모두 가능한 것으로 IRMM (Institute for Reference Materials and Measurements)에서 제조하여 Fluka사에서 ERM (European Reference Materials)으로 판매 중인 유전자재조합 콩인 RRS (ERM-BF410A, ERM-BF410E)와 유전자 재조합 옥수수들인 MON810 (ERM-BF413A, ERM-BF413F), GA21 (ERM-BF414A, ERM-BF414F), Bt176 (Event176; ERM-BF411A, ERM-BF411F)이다.
Figure 112010031406470-pat00001
실시예 1-2. Qiagen DNeasy kit 을 이용한 DNA 의 추출
본 발명에서는 DNeasy Plant Maxi kit(QIAGEN)을 사용하여 DNA를 분리하였다. 균질하게 분쇄된 시료 200mg을 50㎖ 폴리프로필렌 튜브에 넣고, 미리 65℃로 가온한 AP1완충액 5㎖와 RNase A(100㎎/㎖) 10㎕를 가하여 혼합기로 잘 혼합하여, 65℃에서 1시간 30분 동안 반응시키고, 이때 매 15분마다 10초간 혼합기를 사용하여 시료와 반응액이 충분히 혼합되도록 하였다. AP2 완충액 1.8㎖를 가하여 혼합하고 얼음 속에 15분간 정치한 후, 4500×g로 15분간 실온에서 원심 분리한 맑은 상층액(4.7㎖)을 QIA Shredder Spin Column에 옮겨 4,500×g에서 5분간 실온에서 원심분리하고 칼럼을 통과한 여액(4.4㎖)을 새로운 50㎖ 튜브에 옮긴 후에 에탄올을 첨가한 AP3용액을 1.5배량(6.6㎖) 넣어 10초간 잘 혼합한 후, DNeasy Maxi Spin Column에 옮기고 4500×g 에서 5분간 실온에서 원심분리하여 DNA를 칼럼에 부착시키고 칼럼을 통과한 여액은 버렸다. 칼럼에 AW 용액 12㎖를 가하고 4500×g에서 15분간 실온에서 원심분리하여 세척한 후, 칼럼을 새로운 50㎖ 튜브에 옮겨, 미리 65℃로 가온한 멸균증류수 1㎖를 가하고 실온에서 10분간 둔 후 4500×g에서 10분간 실온에서 원심 분리하여 DNA를 용출시켜 용출액을 2㎖ 튜브에 옮겨 동량의 이소프로필알콜을 가하고 상하로 10회 정도 뒤집어 준 후 실온에서 5분간 정치하고 12,000×g로 15분간 4℃에서 원심분리한 후 침전물에 닿지 않도록 주의하면서 마이크로피펫을 이용하여 상층액을 제거하였다. 70% 에탄올 500㎕를 가하여 튜브 벽에 붙은 침전물이 분리될 때까지 조심스럽게 씻어내고 12,000×g로 3분간 4℃에서 원심분리한 후 잔류하는 에탄올을 마이크로피펫을 사용하여 제거한 후 침전물을 건조 시킨 후 건조된 침전물에 50㎕의 멸균증류수 또는 TE 완충액(pH 8.0)을 가하고 4℃에서 12~24시간 정치하면서 완전히 녹여 이를 DNA 시료 원액으로 사용하였다.
실시예 1-3. 추출한 DNA 의 농도 및 순도 확인
DNA 시료 원액을 TE 완충액으로 적절히 희석한 후 분광광도계를 사용하여 260nm에서 흡광도(Absorbance, A)를 측정하고, 그 값이 1일 때 DNA 농도가 50ng/㎕ 인 것으로 하여 DNA 농도를 계산하였다. 추출된 DNA의 순도를 확인하기 위하여 230, 260, 280nm에서 흡광도를 각각 측정하고 A260/A280과 A260/A230이 1.7~2.0일 경우 PCR에 적합한 DNA로 판단하였다. 만일 A260/A280이 낮아 단백질 유래 불순물의 혼입이 우려되는 경우 단백질 분해효소(protease)로 처리한 후 DNA를 회수하며, A260/A230이 낮을 경우 전분 분해효소(amylase)로 처리한 후 DNA를 회수하여 PCR에 사용하였다. DNA 시료 원액에 대한 DNA 농도로부터 PCR에 필요한 DNA 농도가 되도록 TE 완충액 또는 멸균증류수로 희석하여 PCR용 DNA 시료로 하고, 남은 DNA는 -20℃이하에서 냉동 보관하였다.
실시예 2. RT - PCR ( Real time PCR ) 실시
RT-PCR은 주형 DNA에 특이적으로 결합하는 양방향 primer와 probe를 이용하여 PCR 증폭과정에서 발색되는 형광의 양을 측정하여 내재 및 도입유전자의 양을 산출하는 방법이다. RT-PCR을 이용하면 해당 농작물이 반드시 가지고 있는 내재유전자에 대한 외래도입유전자의 상대적인 비율을 통해 GM 농산물이 몇 % 함유되어있는지를 분석해 낼 수 있다.
본 발명에서는 RT-PCR을 수행하기 위해 일본 식품총합연구소(식총연)에서 개발한 primer와 probe sets를 사용하였다. 내재 유전자로 사용된 부위 중 콩은 lectin (Lec, Le1n), 옥수수는 SSIIb (Starch-synthase) 유전자를 이용하였고, 특이적으로 삽입된 도입유전자의 선별을 위해서는 Cauliflower mosaic virus로부터 유래한 35S 프로모터(promoter) (CaMV35S, p35S) 및 아그로박테이룸 투네파시온(Agrobacterium tumefaciens)로부터 유래한 NOS 터미네이터(terminater) (tNOS)를 이용하였으며, 도입된 구조유전자로 콩은 RRS, 옥수수의 경우 MON810, GA21, Bt176을 사용하였다. PCR은 Roche사의 Light Cycler 480 (Mannheim, Germany)을 이용하여 하나의 샘플 DNA에 대해서 3-well로 반복 분석을 수행하였다. 실험에 사용한 primer 및 probe와 반응액의 조성 및 PCR 반응단계는 하기 표 2, 3 및 4와 같다.
Figure 112010031406470-pat00002
Figure 112010031406470-pat00003
Figure 112010031406470-pat00004
실시예 3. MassARRAY Quantitative Gene Expression ( QGE )
실시예 3-1. GMO 유전정보 조사
국내 GMO 안전성 심사가 완료된 품목 중 RT-PCR을 통해 정량검사에 사용된 콩 1종 (RRS)과 옥수수 3종 (MON810, GA21, Bt176)에 삽입된 유전자 염기서열과 유전자의 특징과 관련된 정보를 관련 특허 및 GenBank의 유전자배열정보를 통해 수집하고, 이를 기초로 MassARRAY-multiplexing primer set 제작에 활용하였다.
p35S와 tNOS 같은 공통 조절 서열(common regulatory sequence), 각 GMO 품종에 따라 특이적으로 존재하는 특이 서열(event-specific sequence), 콩과 옥수수 등의 해당 작물이 고유하게 가지고 있는 내재적 참조 서열(endogenous reference sequence) (콩 ; lec, 옥수수 ; SSIIb)를 모두 확보하였다.
실시예 3-2. 프라이머 ( Primer ) 및 경쟁적 서열( Competitor ) 제작
MassARRAY-QGE Assay Designer 및 MySequenom software를 통해 가장최적의 Real-competitive PCR (rcPCR) 프라이머와 iPLEX 신장 프라이머를 제작하였고 사전 검증과정을 거쳤다. 모든 유전자를 한 번의 반응으로 동시에 증폭시키는 다중 PCR(Multiplex PCR)을 해야 하므로 PCR 산물의 크기가 가장 이상적인 100 ~ 200 bp가 되도록 조정하였다.
rcPCR을 위해서는 증폭시키고자 하는 PCR 산물과 경쟁적으로 작용하는 Competitor가 필요한데, 각각의 경쟁적 서열은 증폭시키고자하는 PCR 산물과 단 하나의 염기차이만 보이는 임의의 올리고이다. 또한 목적 DNA(target DNA)와 같은 프라이머로 증폭할 수 있어야 하며 이미 농도나 그 양을 알고 있는 것이어야 한다. 경쟁적 서열 역시 QGE Assay Designer와 MySequenom software을 통해 프라이머들과 함께 제작 되었다. 제작된 프라이머 정보는 도 1 및 표 5에 나타내었다.
Figure 112010031406470-pat00005
실시예 3-3. Real - competitive PCR
Real-competitive PCR을 수행한 후, 상기 PCR 과정 이후 남아있는 dNTP를 제거하기 위한 SAP addition 과정을 거친 후, 단 하나의 염기서열의 차이를 분석하기 위하여 iPLEX Gold reaction을 통해 하나의 염기만 생성되도록 반응시켰다. 그 후 resin addition, pure-water addition 등의 과정을 거쳤고, SpectroCHIP array에 iPLEX Gold assay를 통해 생성된 산물을 첨가하여 MALDI-TOF 질량분석기에 넣어 생성된 염기서열을 확인하였다.
MassARRAY는 Sequenom사 (San Diego, CA, USA)의 제품을 이용하여 3번 반복실험을 수행하였고, 실험에 사용한 반응액과 반응조건은 다음과 같다(표 6).
Figure 112010031406470-pat00006
Figure 112010031406470-pat00007
Figure 112010031406470-pat00008
실시예 4. Real - time PCR 결과
실시예 4-1. 표준플라스미드의 합성
표준플라스미드는 20, 125, 1.5k, 20k, 250k의 5단계 수준으로 NIPPON GENE사의 GM Maize Detection Plasmid set-ColE1/TE와 GM Soybean (RRS) Detection Plasmid set-ColE1/TE을 이용하였다. 5단계 농도의 표준플라스미드를 이용하여 Real-time PCR의 표준곡선을 그었다. 표 9 및 10에서 보듯이 RSD가 0.00~0.37, 도 4 및 도 5에서는 Efficiency 값이 1.860~1.958와 Error값이 0.00339~0.0865로 신뢰도 있는 값을 얻을 수 있었다.
실시예 4-2. 보정계수( Conversion factor , Cf )와 GMO 혼입율(%)의 결정
GM 혼입율을 알아보기 위하여 IRMM(Institute for Reference Materials and Measurements)에서 제조하여 Fluka사에서 ERM (European Reference Materials)으로 판매 중인 유전자 재조합 콩과 옥수수를 구입하고 무게 비율로 혼합하여 0.0, 0.1, 0.5 % 시료를 조제하여 Real-time PCR을 하였다. GM 작물들은 각기 다양한 카피(copy) 수의 도입유전자를 갖고 있기 때문에 내재유전자와의 관계에 있어 각 계통별로 보정이 필요하다. 보정계수(Conversion factor, Cf)는 하나의 GM계통에 있어서의 도입유전자와 내재유전자 사이의 DNA 카피 수의 비율을 나타낸다. 본 실험에서는 식품의약품안전청고시 제 2007-68호, '07.10.18의 유전자재조합 콩 및 옥수수의 정량 보정계수(LightCycler480)를 사용하였다(표 11). 보정계수를 이용한 GMO 양(%)은 아래 식을 이용하여 계산하였다.
Figure 112010031406470-pat00009

실시예 4-3. 정확성( Accuracy ), 정밀성( Precision ), 직선성 ( Linearity ) 확인
본 실험에서 정확성은 GMO(%)와 True value와의 bias(%)로, 정밀성은 표준편차(SD, standard deviation)로, 반복성은 상대표준편차(RSD, relative standard deviation)로 나타내었다 (표 12). 도 6에서 True value(%)와 GMO(%)의 상관관계를 보면 R2 값이 0.999 ~ 1.000로 거의 일치함을 보이면서 매우 높은 정확성을 보였고, 표 12에서 SD값이 0.005~0.161로 정밀성도 신뢰할 수 있다고 보여진다. MON810에서 0.0% 값이 정량된 것은 Fluka사에서 구입한 standard powder 0.0% 제품이 non-GM이 아니라 certified value(g/kg) 값이 MON810은 <0.2의 제품이기 때문으로 간주된다.
Figure 112010031406470-pat00010
Figure 112010031406470-pat00011
Figure 112010031406470-pat00012
Figure 112010031406470-pat00013
실시예 5. MassARRAY Quantitative Gene Expression 결과
실시예 5-1. 경쟁적 서열 적정( Competitor titration )
이미 카피 수를 알고 있는 경쟁적 서열로 미지의 GMO DNA 카피 수를 계산하기 위해서 경쟁적 서열 적정을 표 13과 같이 진행하였다.
Figure 112010031406470-pat00014
실시예 5-2. GMO 혼입율(%)의 결정
GM 혼입율을 알아보기 위하여 RT-PCR에서 사용한 것과 동일한 유전자 재조합 콩과 옥수수 시료를 구입하고 무게 비율로 혼합하여 0.0, 0.1, 0.5 % 시료를 조제하여 MassARRAY 분석을 진행하였다. 이미 카피 수와 농도를 알고 있는 경쟁적 서열을 통해 자동으로 계산되어져 나오는 LogEC50 값으로 각 GM 시료의 내재유전자와 도입유전자의 카피 수를 구하고 [DNA copy number = (LogEC50 value / 10E-18) X 3], 시료 별로 반복 실험된 카피 수의 평균값을 낸 후 다음 식에 따라 해당 GMO 혼입율(%)을 계산하였다.
Figure 112010031406470-pat00015

실시예 5-3. 개발된 다중 프라이머 세트( Multiplexing primer set )의 특이성 ( Specificity )
본 발명에서 개발된 질량분석용 다중 프라이머 세트는 콩 1종과 옥수수 3종의 lec, SSIIb, p35S, tNOS의 스크리닝 동정 뿐만 아니라 정성 및 정량분석이 모두 가능하도록 디자인되어졌으며, GMO 각각의 제품에 해당하는 프라이머 세트는 다른 계통으로부터 오직 해당 작물만을 특이적으로 검출할 수 있다. 도 7의 질량-스펙트럼(Mass-spectrum)을 보면 각 해당 작물만이 특이적으로 가지는 유전자만을 증폭시키는 프라이머만 소진되어 피크 강도(peak intensity)가 0을 보이고 나머지 유전자들에 대한 프라이머들은 그대로 남아있어 높은 피크 강도를 보이고 있다. 예를 들어 옥수수 MON810의 경우 옥수수의 내재유전자(SSIIb)를 증폭시키는 SSIIb-UEP와 MON810에 특이적으로 삽입된 유전자를 증폭시키는 MON810-UEP만이 모두 소진되어 peak intensity가 0이고, 콩의 내재유전자(lec)를 증폭시키는 lec-UEP 및 다른 GM 작물에 특이적으로 삽입된 유전자를 증폭시키는 프라이머들은 그대로 남아 높은 피크 강도를 보였다. 따라서 이는 개발된 질량분석용 다중 프라이머 세트는 각 GM 작물에 대한 높은 특이성을 가져 GMO 검정에 실제적으로 활용이 가능함을 보여주었다.
실시예 5-4. 정확성( Accuracy ), 정밀성( Precision ), 직선성 ( Lineality ) 확인
Real-time PCR과 마찬가지로 정확성은 GMO(%)와 True value와의 bias(%)로, 정밀성은 정밀성은 표준편차(SD, standard deviation)로, 반복성은 상대표준편차(RSD, relative standard deviation)로 나타내었다(표 14). 정확성은 Real-time PCR에 비해 높게 나왔으며 Real-time PCR에서 0.0%가 검출되지 못한 GA21, Bt176, RRS의 경우 MassARRAY QGE에서는 완벽하게 검출이 되면서 민감성도 더 우수하다는 것을 확인하였다. 도 8에서 True value(%)와 GMO(%)의 상관관계를 보면 R2 값이 0.999 ~ 1.000로 거의 일치함을 보이면서 매우 높은 정확성을 보였다. 하지만 SD값은 0.002 ~ 1.548로 0.005~0.161의 값을 보인 Real-time PCR보다는 정밀성이 떨어지는 결과를 보였다.
Figure 112010031406470-pat00016
서열목록 전자파일 첨부

Claims (7)

  1. 서열번호 7 내지 서열번호 24의 염기서열을 포함하는, 유전자 변형 콩 또는 유전자 변형 옥수수 검출용 프라이머 세트.
  2. 삭제
  3. 제1항의 프라이머 세트 및 경쟁적 서열(competitor)을 포함하는, 유전자 변형 콩 또는 유전자 변형 옥수수 검출용 키트.
  4. 삭제
  5. (a) 서열번호 7 내지 서열번호 24의 염기 서열의 프라이머 세트, 및 경쟁적 서열을 포함하는 키트에 시료를 투여하는 단계;
    (b) rcPCR(real-competitive PCR)을 수행하는 단계;
    (c) 질량 분석을 수행하는 단계; 및
    (d) 유전자 변형이 의심되는 콩 또는 유전자 변형이 의심되는 옥수수로부터 수득한 시료 내에서, 유전자 변형 콩 또는 유전자 변형 옥수수의 도입 유전자 카피 수를 확인하는 단계 포함하는, 유전자 변형 콩 또는 유전자 변형 옥수수의 스크리닝 방법.
  6. 삭제
  7. 삭제
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신규 유전자 재조합 식품 분석방법 개발. 주관연구기관: 경희대학교. 식품의약품안전청 과제 보고서. 2004.12.4. *
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