KR20010086586A

KR20010086586A - 이종 개체 존재비율의 측정 방법

Info

Publication number: KR20010086586A
Application number: KR1020000016786A
Authority: KR
Inventors: 히로시게 야마시따; 이꾸노신 가또
Original assignee: 오미야 히사시; 다까라 슈조 가부시키가이샤
Priority date: 2000-03-03
Filing date: 2000-03-31
Publication date: 2001-09-13
Also published as: JP2001238700A; US20020100082A1

Abstract

본 발명은 이종 개체 존재비율의 정량적이고 또한 정확한 측정 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 생물 집단 중의 이종 개체 존재비율의 정량적 측정 방법은 생물 집단 또는 생물 집단의 가공물로부터 2개 이상의 시료를 얻고; DNA를 추출하고; DNA, 표적 유전자 특이적 프라이머, 및 콘트롤 유전자 특이적 프라이머를 함유하는 반응액을 조제하고; 이것을 정량적 PCR에 이용하여 각 증폭 산물의 양을 측정하고; 양 증폭 산물의 양에 따라서 생물 집단 중의 이종 개체의 존재비율을 결정하고; 존재비율의 신뢰도를 통계 처리에 의해서 결정하는 공정들을 포함한다.

Description

이종 개체 존재비율의 측정 방법{Method for determining content of heterologous individual}

본 발명은 유전자의 검출 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 본 발명은 생물 집단 중의 이종 개체 존재비율의 정량적이고 또한 정확한 측정 방법에 관한 것이다.

작물의 생산성 또는 품질을 향상 및(또는) 변화시키도록 변형된 유전자를 갖는 유전자 변형 작물(Genetically Modified Organism (GMO))이 개발되어 있다. 예를 들어, 유전자를 변형시켜 해충 저항성, 제초제 내성을 부여한 작물이 이미 시판되고 있다(Wolfram Hemmer著, Foods Derived from Genetically Modified Organisms and Detection Methods, February 1997, Agency BATS).

GMO의 안전성에 대한 불안감으로 인해(예를 들어, Losey, J.E. et al., Nature, 399:214 (1999)참조), GMO와 비유전자 변형 작물(non-GMO)의 분별 및(또는) GMO 사용의 표시가 요망되고 있다. 이에 대응하여 GMO와 non-GMO와의 혼합을 방지하기 위한 IP(Identity Preserved)수송시스템이 실시되고 있다. 또한, 일본국 농림수산성은 일본농림규격(JAS)법의 GMO에 관한 품질표시의 기준안을 1999년 11월29일에 공표하였다.

그러나, 예를 들어 IP 수송이 채용되지 않은 경우에, 또는 IP 수송이 채용되고 있더라도 고의 또는 과실에 의해서, GMO와 non-GMO가 혼합될 가능성이 있다. 따라서, GMO와 non-GMO의 분별을 보증하기 위한, 또는 그들의 존재비율을 측정하기 위한 정량적인 검사기술의 개발이 요망되고 있다.

작물 검체에 있어서, 특정 유전자형이 다른 작물(예를 들어, GMO)의 존재비율을 측정하기 위해서 사용될 수 있는 방법의 예로서는, 특이적으로 핵산 서열을 증폭하는 폴리머라아제 연쇄반응(PCR), 및 유전자에게 코드되는 단백질을 면역학적으로 검출하는 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)를 들 수 있다. 그러나 하기와 같이, 이들의 방법을 사용하여 작물 검체 중의 GMO의 존재비율을 정확히 측정하는 것은 곤란하다.

ELISA는 목적 단백질과 효소 표지시킨 목적 단백질에 대한 항체와의 결합을 정량적으로 측정하는 방법이다. ELISA를 작물 검체의 검사에 적용하기 위해서는, 시험하고자 하는 검체로부터 단백질을 함유하는 시료를 조제할 필요가 있다. 그러나, 검체로부터 모든 단백질을 규정된 효율로 조제하는 것은 곤란하다. 그러므로, ELISA를 이용한 측정 방법은 큰 오차를 수반하여 원래 수치보다 낮은 수치를 부여할 수 있다고 생각된다. 더욱이, 검체가 가공 식품인 경우에는 검체 중의 단백질이 가열처리 등에 의해서 변성될 수 있기 때문에, 측정이 더욱 곤란해질 수 있다.

핵산의 증폭방법인 PCR은 많은 목적을 위하여 사용되고 있다. 특히, PCR은 핵산을 특이적으로 다량으로 증폭시킬 수 있기 때문에, 고감도인 핵산 검출방법으로서 유용하다. 예를 들어, PCR은 옥수수 중의 변형 CryIA 유전자의 검출에 사용되고 있다(일본국 특허공개 평11-266875). 일반적으로 PCR은 정성적인 검출에 사용되지만, PCR을 사용한 시료 중의 목적 핵산의 정량적 측정도 시도되고 있다. 예를 들어, 목적 핵산 서열과 동일하게 증폭되어 또한 목적핵산 서열과는 다른 크기의 밴드를 발생시키는 규정량의 경합주형을 첨가하여 PCR을 실시하는 경합적 PCR이 기재되어 있다(예를 들어, Wang, A.M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 86, 9717-9721 (1989)). 그러나, 이 방법은 조작이 번잡하고, 이 방법을 이용하여 정확한 측정치를 얻는 것은 곤란하다. 이와 같이, 검체 중의 GMO의 존재비율을 측정하기 위해서 적용할 수 있는 정량적이고 또한 정확한 PCR을 이용한 측정 방법은 알려져 있지 않다.

본 발명은 생물 집단 중의 이종 개체의 존재비율을 정량적이고 또한 정확히 측정하는 방법을 제공한다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명자들은 예의 연구한 결과, 생물 집단 또는 생물 집단의 가공물로부터 얻은 복수의 시료로부터 추출된 DNA를 주형으로 하여, 표적 유전자 및 콘트롤 (control, 대조군이라고도 함) 유전자의 양쪽에 대해서 정량적 PCR을 실시하여 각각의 유전자의 증폭 산물의 양에 따라서 생물 집단 중의 이종 개체의 존재비율을 산출하고, 복수의 시료에 대한 독립된 측정결과를 통계 처리에 의해 상기 산출된 수치의 신뢰도를 결정함으로써, 정량적이고 또한 정확하게생물 집단 중의 이종 개체의 존재비율을 측정할 수 있는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명은

a) 생물 집단 또는 생물 집단의 가공물로부터 2개 이상의 시료를 얻는 공정;

b) 시료로부터 DNA를 추출하는 공정;

c) 추출한 DNA, 표적 유전자 특이적 프라이머, 및 콘트롤 유전자 특이적 프라이머를 함유하는 반응액을 조제하는 공정;

d) 반응액을 정량적 PCR에 이용하여 표적 유전자 특이적 증폭 산물의 양 및 콘트롤 유전자 특이적 증폭 산물의 양을 측정하는 공정;

e) 표적 유전자 특이적 증폭 산물의 양 및 콘트롤 유전자 특이적 증폭 산물의 양에 따라서 생물 집단 중의 이종 개체의 존재비율을 결정하는 공정; 및

f) 결정된 존재비율의 신뢰도를 통계 처리에 의해서 결정하는 공정을 포함하는 생물 집단 중의 이종 개체 존재비율의 정량적 측정 방법을 제공한다.

본 명세서에서 사용된 "이종 개체"라는 용어는, 생물 집단 중에 존재하는 특정 유전자형이 다른 생물을 말한다. 다른 특정 유전자형으로서는, 특정 품종에 특이적으로 존재하는 유전자에 의한 것, 인위적으로 도입된 유전자에 의한 것, 내인성의 유전자를 인위적으로 변형시킨 유전자에 의한 것 등을 들 수 있다.

상기 인위적으로 도입된 유전자로서는, 외래 단백질을 코드하는 유전자 또는 내인성 유전자의 발현을 제어하기 위한 프로모터, 인핸서(enhancer)나 안티센스 핵산을 코드하는 유전자 등을 들 수 있다.

이종 개체의 예로서는, 예를 들어 복수의 품종이 혼재하는 검체 중의 특정품종, 바이러스 등의 병원체에 감염된 개체, 천연 이외의 유전자를 도입한 또는 내인성의 유전자를 변형시킨 유전자 변형 작물(GMO) 등을 들 수 있다.

이하, 본 발명을 주로 작물 검체 중의 GMO의 존재비율의 측정에 대해서 설명하지만, 본 발명은 진핵 생물 및 원핵 생물을 포함하는 모든 생물에 적용 가능하다. 본 발명의 방법을 사용하여 복수의 품종이 혼재하는 검체 중의 특정 품종의 존재비율을 측정할 수 있다. 예를 들어, 「코시히카리」의 브랜드명으로 고가로 시판되고 있는 쌀 제품의 어느 정도에는, 품종「코시히카리」이외의 저렴한 쌀 품종이 혼합되어 있다. 이러한 쌀 제품 중의 품종「코시히카리」의 존재비율을 측정하는 것은 작물의 표시에 중요한 의미를 갖는다.

본 발명에 사용되는 생물 집단은, 그 생물 집단 자체 및 그 가공물을 포함한다. 생물 집단이 작물인 경우에는 미가공 작물, 그 작물을 원료로 하여 얻어지는 가공 식품을 본 발명에 사용할 수 있다. 미가공 작물은 유전자 조작이 가능한 어느 하나의 작물로서, 한정하는 것은 아니지만, 콩, 옥수수, 벼, 밀, 보리, 토마토, 호박, 감자, 고구마, 목화, 유채의 씨, 사탕무를 포함한다. 가공 식품은, 상기의 미가공 작물로부터 가공되는 어느 하나의 식품으로서, 한정하는 것은 아니지만, 두부, 두부관련 식품(유부, 동두부, 두유, 두부껍질 등), 탈지콩, 콩가루, 미정제 콩단백질, 콘 그리츠(corn grits), 콘 플라워(corn flour), 콘 스타치, 팝콘, 스낵과자를 포함한다. 작물의 건조품 역시 가공 식품에 포함된다. 또한, 가공 식품에 있어서 이종 개체의 존재비율이란, 그 가공 식품의 원료중에 포함되는 이종 개체의비율을 말한다.

가열처리, 효소처리, 정제, 발효 등의 공정을 거친 가공 식품 중의 DNA는 그 함량이 저하되고, 및(또는) 분해되어 있을 가능성이 있다. 이러한 가공 식품 중의 GMO의 존재비율을 본 발명의 방법에 의해서 측정 가능한지의 여부는 하기의 콘트롤 유전자의 증폭 결과에 따라서 판단된다.

본 발명의 유전자 변형 작물(GMO)이란, 외래 유전자의 도입, 내인성 유전자의 변형 등에 의해서 변형된 작물을 말한다. GMO는, 한정하는 것은 아니지만, 예를 들어 변형 5-에놀-피루보일시키메이트-3-포스페이트 신타아제(5-enolpyruvoyl- shikimate-3-phosphate synthase(EPSPS)) 단백질 유전자를 혼입시켜 제초제 글리포세이트(glyphosate)(상품명「라운드업(Roundup)」)에 대한 내성을 부여한 작물, 스트렙토마이세스·비리도크리모제네스(Streptomyces viridochrimogenes) 유래의 포스피노쓰리신 아세틸트랜스퍼라제(phosphinothricin acetyltransferase(pat)) 유전자를 혼입시켜 제초제 글루포시네이트 (상품명「바스타(Basta)」)에 대한 내성을 부여한 작물, 스트렙토마이세스·하이그로스코피커스(Streptomyces hygroscopicus) 유래의 pat 상동유전자인 bar 유전자를 혼입하고, 제초제 글루포시네이트(상품명「바스타」)에 대한 내성을 부여한 작물, 바실러스·튜린겐시스(Bacillus thuringiensis) 유래의 CryIA 유전자, CryIIIA 유전자를 혼입하여 해충 저항성을 부여한 작물을 포함한다.

또한, 내인성 유전자의 변형에 의한 GMO로서는, 특정한 내인성의 구조유전자로 치환, 결실, 삽입, 부가 등의 변이를 도입하여 그 유전자 산물의 활성을 개량한것, 특정한 내인성의 콘트롤 유전자(프로모터, 인핸서 등)로 치환, 결실, 삽입, 부가 등의 변이를 도입하여 그 콘트롤 유전자의 제어하에 있는 유전자의 발현을 개량한 것 등을 들 수 있다.

본 발명의 시료는, 이종 개체를 포함할 가능성이 있는 생물 집단, 그 생물 집단을 원료로 하는 가공물, 및 그 생물 집단, 그 가공물을 처리하여 얻어진 조제물로부터 얻어진다. 예를 들어, 생물 집단이 옥수수, 콩 등의 작물인 경우, 이들의 작물을 파쇄하여(예를 들어, 0.01의 검출 한계를 달성하기 위해서 약 10,000 알에 상당하는 약 2㎏을 파쇄한다), 균질하게 한 조제물로부터 시료를 얻는다. 측정 대상이 균질한 가공 식품인 경우에는 이러한 처리는 필요하지 않다.

본 발명의 방법에 있어서, 1 검체당 2개 이상의 시료를 얻는다. 일반적으로, 시료의 수가 많으면 많을수록, 보다 정확한 측정치가 얻어진다. 한편, 조작을 간편하게 하기 위해서는 시료의 수를 감소시키는 것이 바람직하다. 예를 들어, 1 검체당 2∼30개, 바람직하게는 3∼20개, 보다 바람직하게는 5∼10개, 가장 바람직하게는 4∼8개의 시료를 얻는다. 시료의 양은, DNA를 추출하기 위해서 적절하도록 결정된다. 예를 들어, 콩 또는 옥수수 분말, 또는 건조 두부 분말의 경우, 0.5∼1g의 시료를 채취한다.

DNA의 추출방법은, 사용하는 시료에 적절하도록 선택된다. 예를 들어, 옥수수 분말 및 콩 분말로부터의 게놈 DNA의 추출은 공지의 DNA 추출 방법에 의해서 실시할 수 있다. 또한, 예를 들어 다수의 시료를 취급하는 경우에는, DNA 추출 로봇 BIOROBOT 9604(키아겐社 제품) 및 이 로봇용의 DNA 추출 키트를 이용하여, 또는 자동기기 GENEEXTRACTOR TA100(타카라주조社 제품) 및 추출시약 키트 GENEEXTRACTIN BC 키트(타카라주조社 제품)를 사용하여 행할 수 있다. 또한, 공지의 방법에 의해서 추출된 RNA보다, 공지의 방법으로 합성된 DNA도 본 발명에 사용할 수 있다.

본 발명의 방법에 사용되는 표적 유전자란, 이종 개체 이외의 생물(예를 들어, 비유전자 변형 작물(non-GMO))중에는 존재하지 않고, 이종 개체(예를 들어, GMO) 중에 존재하는, 또는 이종 개체 중의 서열과 그 이외의 생물 중의 서열이 다른, 검출하고자 하는 유전자를 말한다. 예를 들어, 상기의 유전자 변형 작물에 혼입된 외래 유전자나, 변형된 내인성 유전자가 표적 유전자로서 들 수 있다. 바람직하게는, 표적 유전자의 뉴클레오티드는 공지된 것이 좋다. 표적 유전자의 뉴클레오티드 서열이 미지인 경우는 해당 분야에서 주지의 재조합 DNA 기술(예를 들어, PCR, 클로닝, 서열결정을 포함한다)을 사용함으로써, 그와 같은 유전자의 뉴클레오티드 서열을 결정할 수 있다. 표적 유전자는 한정하는 것이 아니지만, 예를 들어 pat 유전자, 변형 EPSPS 단백질 유전자, CryIA 유전자, bar 유전자, CryIIIA 유전자를 포함한다.

본 발명의 방법에 사용되는 콘트롤 유전자란, 이종 개체(예를 들어, GMO) 및 이종 개체 이외의 생물(예를 들어, non-GMO)의 양쪽에 존재하는 어느 하나의 유전자를 말한다. 바람직하게는, 콘트롤 유전자의 뉴클레오티드 서열은 공지된 것이 좋다. 콘트롤 유전자는, 한정하는 것이 아니지만, 예를 들어 제인(zein) 유전자, 액틴단백질 유전자, 렉틴 유전자를 포함한다.

본 발명의 방법에 있어서의 정량적 PCR은, 표적 유전자 및 콘트롤 유전자의증폭 산물의 양에 따라서, 생물 집단 중의 이종 개체의 존재비율을 정량적으로 측정하는 것을 가능케 하는 PCR이다. 예를 들어, 정량적인 측정을 가능케 하는 것과 같은 반응조건 하에 PCR을 행하여 증폭 산물을 전기영동에 걸고, 증폭 산물에 대응하는 밴드의 강도에 따라서 정량적 측정을 달성할 수 있다. 보다 간편하고 또한 정확하게 정량적 측정을 실시하기 위해서는, 증폭 산물의 경시적 정량적인 측정을 가능케 하는 PCR용 장치(리얼 타임(Real Time) PCR 장치)를 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 PCR 장치로서, Light Cycler(로슈社 제품), ABI Sequence Detector PRISM 7700(파킨엘머 바이오시스템즈社 제품) 등이 시판되고 있다. 리얼 타임 PCR을 행하는 방법으로서는, TaqMan법(특허 제2825976호), 하이브리다이제이션법 또는 사이버그린 I 등의 인터칼레이터를 이용하는 방법 등을 들 수 있다. 어떠한 방법도 본 발명의 목적에 부합되게 사용할 수 있다.

정량적 PCR에 이용되는 반응액은, 시료로부터 추출한 DNA, 표적 유전자 특이적 프라이머, 및 콘트롤 유전자 특이적 프라이머를 함유한다. 프라이머의 설계 및 제작 방법은 해당 분야에서 공지되어 있다. 더욱이, 반응액은 내열성 DNA 폴리머라아제, dNTP, 완충액, 그 밖의 첨가물을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 사용하는 PCR용 장치, 키트 등에 의존하여 적절히 선택된다. 반응액은 증폭 산물을 검출하기 위한 표지 프로브를 함유할 수 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 생물 집단 중의 이종 개체의 존재비율은 표적 유전자 특이적 증폭 산물의 양 및 콘트롤 유전자 특이적 증폭 산물의 양에 따라서 결정한다. 1개의 실시태양에 있어서, 1개의 시료중에 포함되는 표준유전자 및 콘트롤유전자 양쪽의 초기 주형 DNA의 양을 각각의 증폭 산물의 양으로부터 검량선를 이용하여 산출한다. 시료의 측정에는, 검량선의 작성과 동일한 조건(증폭용 프라이머/검출용 프로브의 조합을 포함한다)을 사용한다.

우선, GMO와 같은 이종 개체 만을 함유하는 양성 생물 집단 유래의 시료로부터 DNA를 추출하고, 이 DNA를 단계 희석하여 희석액을 조제하고, 이 희석액을 주형으로서 표적 유전자, 콘트롤 유전자의 각각에 대해서 PCR를 행하고, 그 결과에 따라서 초기 주형 DNA량 대 증폭 산물량의 검량선을 작성한다. 이어서, 측정하고자 하는 시료에 대해서 동일하게 DNA의 추출 및 PCR을 실시하여 증폭 산물량을 측정하고, 상기한 바와 같이 하여 작성한 검량선에 따라서, 각각의 유전자의 초기 주형 DNA 량을 결정한다. 이어서, 콘트롤 유전자의 초기 주형 DNA 량에 대한 표적 유전자의 초기 주형 DNA 량의 비율(백분율)을 산출하여 생물 집단 중의 이종 개체(GMO)의 존재비율을 결정한다. 시료에 대해서 결정되는 초기 주형 DNA 량은 상대적인 수치이고, 검량선 작성용 주형 DNA와는 다른 DNA의 추출 효율 또는 추출 DNA 중에 포함될 수 있는 PCR 반응의 인히비터의 존재 또는 양 등의 인자에 의한 변동을 받을 수 있다. 그러나, 이들의 인자는 콘트롤 유전자 및 표적 유전자의 양쪽에 동일하게 기여하기 때문에, 2개의 주형 DNA 량의 비를 산출하여 생물 집단 중의 이종 개체의 존재비율을 결정하는 경우, 그와 같은 변동은 최종적으로 결정되는 존재비율에 영향을 주지 않는다.

작물 검체를 파쇄하여 얻은 미분말을 시료로 하는 경우, 분말을 균질하게 되도록 충분히 혼합하여도 측정치에는 샘플링에 의한 오차가 포함될 수 있다. 측정대상이 일견 균질한 가공 식품인 경우도 동일하다. 더욱이, 추출공정, PCR 공정에서도 오차가 발생될 수 있다. 본 발명의 방법에 있어서, 복수의 시료에 대해서 독립적인 측정을 실시하고 얻어진 결과에 대하여 통계 처리를 행함으로써, 이러한 오차를 포함하는 측정치의 신뢰도가 보증된다. 본 발명에 적용 가능한 통계 처리는 해당 분야에서 공지되어 있다. 예를 들어, 구간추정을 사용하여 측정치의 소정(예를 들어, 99)의 신뢰도를 보증하는 상한치 및 하한치로 규정된 범위를 결정할 수 있다. 본 발명 이전에는, 이러한 통계 처리는 생물 집단 중의 이종 개체 존재비율의 정량적 측정 방법에 적용되지 않았다.

<실시예>

이하, 본 발명을 실시예에 의해 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 범위는 이들의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 유전자 변형 옥수수의 존재 비율의 측정

양성 옥수수로서, GMO의 하나인 T14/25 계통 옥수수(상품명 VARIETY 8539, Garst Seed Company社 제품)(이하, T14/25로 기재한다)를 이용하였다. T14/25에는 스트렙토마이세스·비리도크리모제네스(Streptomyces viridochrimogenes) 유래의 포스피노쓰리신 아세틸트랜스퍼라제(pat) 유전자(상품명 Liberty Link, Hoechst/AgrEvo社 제품)가 도입되어 있고, 이 유전자의 게놈 중에서의 카피(copy)수는 1 인 것이 알려져 있다. 또한, 서열 및 카피수는 아그레보(AgrEvo)社가 일본국 후생성에 제출한 서류 중에 기재되어 있고, 그 서류의 정보는 (재) 일본식품위생협회에서 입수할 수 있다. 옥수수에는 제인(zein) 단백질이 보편적으로 존재하고, 이 단백질을 코드하는 유전자의 뉴클레오티드 서열은 이미 알려져 있다(Kirihara J.A. et al., Mol. Gen. Genet, 211:477-484 (1988)). pat 유전자를 표적 유전자로 하고, 제인 유전자를 콘트롤 유전자로 하여 양 유전자량의 비를 측정함으로써, 옥수수 검체에 있어서의 T14/25의 존재비율을 측정하였다.

음성 옥수수로서, GMO를 함유하지 않은 옥수수(이하, GMO Free로 기재한다)를 사용하였다. T14/25를 GMO Free 옥수수에 대하여 2또는 6의 중량비로 함유하는 옥수수 검체(각각 A, B로 칭한다)를 조제하였다. 옥수수 검체 A, B는 표 1에 나타내는 바와 같이 조제하였다.

옥수수 검체	A B
T14/25GMO Free총중량T14/25의 존재비율	40g 120g1960g 1880g2000g 2000g2 6

혼합한 옥수수 검체를 컷터 믹서 5.5(데이트사마社, 프랑스)를 사용하여 미분말상으로 파쇄하였다. 이 파쇄한 옥수수 검체 A, B에서 1g 씩, 각각 8점에서 분말시료를 얻고, 그 각각으로부터 독립적으로 게놈 DNA를 추출하였다. 게놈 DNA의 추출에는 DNA 추출 로봇 BIOROBOT 9604(키아겐社 제품) 및 이 로봇용의 DNA 추출 키트를 사용하였다. 이 키트에 첨부된 AE Buffer에 용해된 DNA 용액 100㎕를 얻었다.

T14/25만을 함유하는 검체를 파쇄하여 얻은 분말을 양성시료로 하고, 이 시료로부터 상기한 바와 동일하게 게놈 DNA를 추출하였다. 이 DNA를 멸균증류수로 10배씩 5단계 희석하여 희석액을 조제하였다(원액, 10배 희석, 100배 희석, 1,000배 희석, 10,000배 희석).

이들의 희석액을 주형으로 하여 pat 유전자, 제인 유전자의 각각을 증폭하는 PCR을 행하고, 그 결과에 따라서 양 유전자에 관한 검량선을 작성하였다. pat 유전자의 증폭에는 pat 유전자 증폭용 프라이머 대 pat FP 및 pat RP(서열번호 1 및 서열번호 2) 및 형광표지 프로브(서열번호 3)를 사용하였다. 제인 유전자의 증폭에는 제인 유전자 증폭용 프라이머 대 Zein FP 및 Zein RP(서열번호 4 및 서열번호 5) 및 형광표지 프로브(서열번호 6)를 사용하였다. 상기의 2종의 형광표지 프로브의 5’말단에 FAM을, 3’말단에 TAMRA(모두 그레인리서치社 제품)를 부가하였다. 표 2에 이 증폭반응의 반응액 조성을 나타낸다.

주형 DNA프라이머 1(10pmol/㎕)프라이머 2(10pmol/㎕)형광표지 프로브(2pmol/㎕)TaqMan 2xPCR Master Premix멸균증류수	5 ㎕1.5㎕1.5㎕5 ㎕25 ㎕12 ㎕
반응액량	50 ㎕

상기의 각 희석액의 각각에 대해서 PCR을 2회 연속 실시하였다. 반응은 96 웰 플레이트 중에서 ABI Sequence Detector PRISM 7700(파킨엘머 바이오시스템즈社 제품)을 이용하고, TaqMan PCR 법에 의해 실시하였다. 표적 유전자(pat 유전자) 및 콘트롤 유전자(제인 유전자)의 증폭을 경시적으로 기록하여 양 유전자에 관한 검량선을 작성하였다.

다음에, 옥수수 검체 A, B에서 얻은 각각 8개의 시료로부터 추출한 게놈 DNA를 주형으로 하여 동일하게 PCR을 실시하고, 검량선에 따라서 각 시료 중의 표적 유전자(pat 유전자) 및 콘트롤 유전자(제인 유전자)의 상대적인 초기 주형 DNA 량(표 3 및 표 4 중의 각각 a 및 b)을 산출하였다. 각각의 시료에 대해서 콘트롤 유전자(제인 유전자)에 대한 표적 유전자(pat 유전자)의 백분율(a/b×100)을 산출하였다. 또한, 옥수수 검체 A, B의 각각에 대해서, 8개의 시료로부터 얻어진 상대 백분율로부터 구간 추정법에 의해 99신뢰도의 하한치 및 상한치를 구하였다. 결과를 표 3 및 표 4에 나타낸다.

옥수수검체 A(T 14/25 2함유)
시료번호	표적 유전자량(a) 콘트롤 유전자량(b)	a/b×100()
12345678	4.78 2065.04 1477.10 3216.92 2105.22 3246.27 2785.97 2606.42 278	2.333.442.213.301.612.262.302.31
	평균치()표준편차()변동계수()	2.470.604224.5
99신뢰도의 구간	하한치()상한치()	1.53.5

옥수수검체 B(T 14/25 6함유)
시료번호	표적 유전자량(a) 콘트롤 유전자량(b)	a/b×100()
12345678	19.1 28121.9 32014.7 25215.4 25622.0 33318.5 25919.9 26919.4 278	6.796.835.826.026.617.137.386.97
	평균치()표준편차()변동계수()	6.690.53328.0
99신뢰도의 구간	하한치()상한치()	5.87.6

옥수수 검체 A, B의 양쪽에 대해서, 첨가한 T14/25의 존재비율(각각 2, 6)은 측정치에 근거한 구간추정에 의해서 결정한 하한치와 상한치와의 사이의 범위내이었다.

실시예 2 : 유전자 변형 콩의 존재비율의 측정

양성 콩으로서, GMO를 함유하지 않은 콩에 GMO의 하나인 라운드업 레디(Roundup Ready, 몬산토社 제품)를 0, 0.1, 0.5, 및 2의 농도로 포함하는 Soya Bean Powder SB-Set(Fluka社 제품, Individual sample number 1673, Lot and filling code 92683/1)를 이용하였다. 본 샘플은 Institute for Reference Materials and Measurements(IRMM)에 의해서 승인을 받은 표준 콩가루이다.

또한, 본 샘플에 포함되는 라운드업 레디에는, 아그로박테리움·튜메파시엔스 CP4 주(Agrobacterium tumefaciens CP4 strain) 유래의 변형(CP4) EPSPS 단백질 유전자가 도입되어 있고, 본 유전자의 게놈 중에서의 카피수는 1 인 것을 알고 있다. 또한, 콩에는 액틴 단백질이 보편적으로 존재하고, 그 단백질을 코드하는 유전자의 염기서열은 이미 알려져 있다(Shah, D.M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 79, 1022-1026 (1982)). 그래서, 변형(CP4) EPSPS 단백질 유전자를 표적 유전자로 하고, 액틴 유전자를 콘트롤 유전자로서 양 유전자량의 비를 측정하는 것으로 Soya Bean Powder SB-Set에 있어서의 라운드업 레디의 존재비율을 측정하였다.

4종의 Soya Bean Powder SB-Set의 0.5g 씩부터 각각 4점의 샘플링을 행하고, 그 각각으로부터 독립적으로 게놈 DNA를 추출하였다. 게놈 DNA의 추출은 DNA 추출 로봇 BIOROBOT 9604(키아겐社 제품) 및 이 로봇용의 DNA 추출 키트를 사용하였다. 이 키트에 첨부된 AE Buffer에 용해시킨 DNA 용액 100㎕를 얻었다.

추출한 DNA의 상태를 아가로스겔 전기영동에 의해서 확인한 바, 래더 상의 영동 패턴을 나타내었다. 이는 콩의 DNA가 보존 또는 콩가루 조제시 아포톱시스에 의해서 효소적으로 분해되었음을 나타낸다. 이러한 DNA를 주형으로 하여 PCR을 행하는 경우, 같은 프라이머를 사용하여도 시료에 의해서 증폭효율이 변동하고, 따라서 정확한 정량이 곤란해 질 가능성이 있다.

라운드업 레디만을 함유하는 검체를 파쇄하여 얻은 분말을 양성 시료로 하고, 이 시료로부터 상기와 같이 게놈 DNA를 추출하였다. 이 DNA를 멸균 증류수로 10배씩 5단계 희석하여 희석액을 조제하였다(원액, 10배 희석, 100배 희석, 1,000배 희석, 10,000배 희석).

이들의 희석액을 주형으로 하여 변형 EPSPS 단백질 유전자, 액틴 유전자의각각을 증폭하는 PCR을 행하고, 그 결과에 따라서 양 유전자에 관한 검량선을 작성하였다. 변형 EPSPS 단백질 유전자의 증폭에는 변형 EPSPS 단백질 유전자 증폭용 프라이머 대 CP4 FP 및 CP4 RP(서열번호 7 및 서열번호 8) 및 형광표지 프로브(서열번호 9)를 사용하였다. 액틴 유전자의 증폭에는 액틴 유전자 증폭용 프라이머 대 actin FP 및 actin RP(서열번호 10 및 서열번호 11) 및 형광표지 프로브(서열번호 12)를 사용하였다. 상기의 2종의 형광표지 프로브의 5’말단에 FAM을, 3’말단에 TAMRA를 부가하였다. 표 5에 이 증폭반응의 반응액 조성을 나타낸다.

주형 DNA프라이머 1(10pmol/㎕)프라이머 2(10pmol/㎕)형광표지 프로브(2pmol/㎕)TaqMan 2xPCR Master Premix멸균증류수	5 ㎕1.5 ㎕1.5 ㎕5 ㎕25 ㎕12 ㎕
반응액량	50 ㎕

상기의 각 희석액의 각각에 대해서 PCR을 2회 연속으로 실시하였다. 반응은 96 웰 플레이트 중에서 ABI Sequence Detector PRISM 7700(파킨엘머 바이오시스템즈社 제품)을 이용하고, TaqMan PCR 법에 의해 실시하였다. 표적 유전자(변형 EPSPS 단백질 유전자) 및 콘트롤 유전자(액틴 유전자)의 증폭을 경시적으로 기록하여 양 유전자에 관한 검량선을 작성하였다.

다음에, 4종의 Soya Bean Powder SB-Set에서 얻은 각각 4개의 시료로부터 추출한 게놈 DNA를 주형으로 하여 동일하게 PCR을 실시하고, 검량선에 따라서 각 시료 중의 표적 유전자(변형 EPSPS 단백질 유전자) 및 콘트롤 유전자(액틴 유전자)의상대적 초기 주형 DNA 량을 산출하였다(표 6 중의 각각 a 및 b). 각각의 시료에 대해서 콘트롤 유전자(액틴 유전자)에 대한 표적 유전자(변형 EPSPS 단백질 유전자)의 백분율(a/b×100)을 산출하였다. 더욱이, 4종의 Soya Bean Powder SB-Set의 각각에 대해서 구간 추정법에 의해 99신뢰도의 하한치 및 상한치를 구하였다. 결과를 표 6에 나타낸다.

IRMM 샘플	표적 콘트롤 (a)/(b)유전 유전자 ()자량 량(a) (b)	평균 표준 변동치 편차 계수	99신뢰도의 구간하한 상한치 치
표기농도	표적 콘트롤 (a)/(b)유전 유전자 ()자량 량(a) (b)	평균 표준 변동치 편차 계수	99신뢰도의 구간하한 상한치 치	시료번호
0	1234	0.007 217 0.00N.D. 109 N.D.N.D. 114 N.D.N.D. 88.9 N.D.	- - -	- -
0.10	1234	0.441 299 0.150.191 337 0.060.261 295 0.090.279 251 0.11	0.100.0004 0.3788	0 0.2
0.50	1234	0.754 204 0.370.826 349 0.241.41 241 0.590.811 440 0.18	0.340.0018 0.5196	0 0.8
2	1234	4.41 281 1.574.19 191 2.194.13 330 1.253.11 629 0.49	1.380.0071 0.5132	0 3

N.D. : 검출한계 이하.

4종의 Soya Bean Powder SB-Set에 있어서의 각각의 라운드업 레디의 존재비율(각각 0, 0.1, 0.5, 2)은 측정치에 근거한 구간 추정에 의해서 결정한 하한치와 상한치와의 사이의 범위내 이었다.

실시예 3 : 두부 검체 중의 유전자 변형 콩의 존재비율

주원료가 콩인 두부에 대해서, GMO 콩의 존재비율의 측정이 가능한지의 여부를 검토하였다. 실시예 2와 동일한 순서에 의해 양성 콩으로 하여 라운드업 레디(Roundup Ready, 몬산토社 제품)를 사용하고, GMO의 존재비율이 4인 원료콩 표준품을 제작하였다. 실시예 2와 동일하게 이 원료콩 표준품을 파쇄하여 멸균수에 밤새 침윤시킨 후, 상청을 가열(약 80℃)하고, 시판 응고제(간수)를 가하였다. 이 혼합물이 두부상으로 굳어질 때까지 온화하게 교반하고, 두부상 고형물을 가제를 통해서 여과시켜 수분을 제거하여 GMO 존재비율의 이미 알고 있는 두부 검체를 얻었다.

두부 검체를 동결 건조시켜 수분을 완전히 제거하여 건조두부 분말을 얻었다. 4점에서 얻은 약 0.5g의 분말 시료로부터 게놈 DNA를 추출하였다.

원심관에 0.5g의 분말 시료를 넣고, 여기에 20㎎/㎖의 프로테이나아제 K를 포함하는 추출 버퍼 [10mM 트리스염산(pH 8.0), 150mM NaCl, 2mM EDTA, 1SDS] 3.5㎖ 및 5M 구아니딘 400㎕를 가하여 현탁한 후, 58℃로 1시간 가열하였다. 3000rpm에서 5분간 원심분리하고, 얻어진 상청 300㎕를 회수하였다. 여기에 100㎍/㎕의 RNaseA를 포함하는 세포현탁액 [10mM EDTA, 50mM 트리스염산(pH 7.5)] 100㎕을 가하여 현탁하였다. 다음에, 여기에 200㎕의 0.2SDS 용액을 첨가하여 진탕조작에 의해 5분간 혼화하였다. 더욱이, 핵산흡착체 현탁액[50㎎/㎖ 실리카겔 입자(입경 5㎛, 후지실리시아화학社 제품), 7M 염산 구아니딘, 2mM EDTA, 10mM 트리스염산(pH 7.5)] 63용량과 에탄올 37용량의 혼합액 1㎖를 첨가하여 5분간 더 진탕시켰다.

상기의 혼합액을 원심분리한 후, 상청을 제거하고 침전을 300㎕의 세정액[50에탄올(v/v), 100mM NaCl, 2.5mM EDTA, 10mM 트리스염산(pH 7.5)]에 현탁하여 SUPREC-01(타카라주조社 제품)에 옮겨, 12000rpm에서 5분간 원심분리함으로써 세정하였다. 동일한 세정조작을 다시 한번 반복한 후(단, 세정액의 액량은 200㎕로 하였다), 침전을 70℃로 가온한 100㎕의 TE 버퍼에 현탁하여 원심분리를 행한 후, 상청을 회수하였다. 이 상청을 DNA 용액으로서 이하의 공정에 사용하였다.

추출한 DNA의 상태를 아가로스겔 전기영동에 의해서 확인한 바, 고분자 DNA가 스미어(smear)로 되어 있었다. 이는 두부에 포함되는 DNA가 가열 등에 의해 물리적으로 분해되어 있었음을 나타낸다. 이러한 DNA를 주형으로 하여 PCR을 행하는 경우, 같은 프라이머를 사용하여도 시료에 의해서 증폭 효율이 변동하고, 따라서 정확한 정량이 곤란해 질 가능성이 있다.

표적 유전자로서는, 변형 EPSPS 단백질 유전자를 이용하고, 그 유전자의 증폭 및 검출에는 실시예 2에 기재된 프라이머 대 CP4 FP 및 CP4 RP(서열번호 7 및 서열번호 8) 및 형광표지 프로브(서열번호 9)를 사용하였다.

컨트롤 유전자로서는, 콩 액틴 유전자를 이용하고, 액틴 유전자의 증폭 및 검출에는 실시예 2에 기재된 프라이머 대 actin FP 및 actin RP(서열번호 10 및 서열번호 11) 및 형광표지 프로브(서열번호 12)를 사용하였다. 상기 2종의 형광표지 프로브의 5’말단에 FAM을, 3’말단에 TAMRA를 부가하였다.

PCR를 실시예 1과 동일하게 실시하였다. 표적 유전자 및 콘트롤 유전자의 상대적 초기 주형 DNA 량은 라운드업 레디만을 함유하는 검체를 이용하여 작성하였다. 결과를 표 7에 나타낸다.

두부검체 (라운드업 레디 4함유)
시료번호	표적 유전자량(a) 콘트롤 유전자량(b)	a/b×100()
1234	4.25 91.24.29 84.64.18 90.94.22 104	4.665.074.604.06
	평균치()표준편차()변동계수()	4.600.41489.0
99신뢰도의 구간	하한치()상한치()	3.65.6

표 7에 나타내는 바와 같이, DNA가 분해되어 있는 두부와 같은 가공 식품에 대해서, 주원료인 콩 중의 GMO(라운드업 레디 콩)의 존재 비율을 측정할 수 있었다. 이 결과는 유부, 동두부, 두유, 탈지콩과 같은 두부와 동일하게 DNA가 분해, 손상되어 있는 가공 식품 검체 중의 GMO의 존재 비율을 본 발명의 방법에 의해서 측정할 수 있음을 시사한다.

본 발명에 의해서, 생물 집단 중의 이종 개체 존재비율의 정량적이고 또한 정확한 측정 방법이 제공된다.

서열 목록의 설명

SEQ ID NO:1: pat FP로 명명된 pat 유전자의 부분을 증폭하기 위해 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머.

SEQ ID NO:2: pat RP로 명명된 pat 유전자의 부분을 증폭하기 위해 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머.

SEQ ID NO:3: pat 유전자 서열을 검출하기 위해 디자인된 올리고뉴클레오티드 프로브.

SEQ ID NO:4: zein FP로 명명된 zein 유전자의 부분을 증폭하기 위해 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머

SEQ ID NO:5: Zein RP로 명명된 zein 유전자의 부분을 증폭하기 위해 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머

SEQ ID NO:6: zein 유전자 서열을 검출하기 위해 디자인된 올리고뉴클레오티드 프로브.

SEQ ID NO:7: CP4 FP 로 명명된 EPSPS 단백질 유전자의 부분을 증폭하기 위해 디자인된 올리고뉴클레오티드.

SEQ ID NO:8: CP4 RP로 명명된 EPSPS 단백질 유전자의 부분을 증폭하기 위해 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머.

SEQ ID NO:9: EPSPS 단백질 유전자 서열을 검출하기 위해 디자인된 올리고뉴클레오티드 프로브.

SEQ ID NO:10: 액틴 FP로 명명된 액틴 유전자를 증폭하기 위해 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머.

SEQ ID NO:11: 액틴 RP로 명명된 액틴 유전자를 증폭하기 위해 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머.

SEQ ID NO:12: 액틴 유전자 서열을 검출하기 위해 디자인된 올리고뉴클레오티드 프로브.

SEQ ID NO:13: 35-1로 명명된 양배추 모자이크 바이러스 35S 프로모터에 특이적인 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머

SEQ ID NO:14: NOS-3로 명명된 노팔린 신타아제 유전자 터미네이터에 특이적인 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머

Claims

a) 생물 집단 또는 생물 집단의 가공물로부터 2개 이상의 시료를 얻는 공정;

b) 그 시료로부터 DNA를 추출하는 공정;

c) 추출한 그 DNA, 표적 유전자 특이적 프라이머, 및 콘트롤 유전자 특이적 프라이머를 함유하는 반응액을 조제하는 공정;

d) 그 반응액을 정량적 PCR에 이용하여 표적 유전자 특이적 증폭 산물의 양 및 콘트롤 유전자 특이적 증폭 산물의 양을 측정하는 공정;

e) 그 표적 유전자 특이적 증폭 산물의 양 및 그 콘트롤 유전자 특이적 증폭 산물의 양에 따라서 그 생물 집단 중의 이종 개체의 존재비율을 결정하는 공정; 및

f) 결정된 존재비율의 신뢰도를 통계 처리에 의해서 결정하는 공정을 포함하는 생물 집단 중의 이종 개체 존재비율의 정량적 측정 방법.
제 1 항에 있어서, 생물 집단이 미가공 작물인 방법.
제 2 항에 있어서, 미가공 작물이 옥수수, 콩, 벼, 밀, 보리, 토마토, 호박, 감자, 고구마, 목화, 유채의 씨, 사탕무인 방법.
제 1 항에 있어서, 생물 집단의 가공물이 작물을 원료로 한 가공 식품인 방법.
제 4 항에 있어서, 가공 식품이 두부, 두부관련 식품, 탈지콩, 콩가루, 미정제 콩단백질, 콘 그리츠, 콘 플라워, 콘 스타치, 팝콘, 스낵과자인 방법.
제 1 항 내지 제 5 항 중의 어느 한 항에 있어서, 특이적 유전자가 외래 유전자인 방법.
제 6 항에 있어서, 외래 유전자가 pat 유전자, 변형 EPSPS 유전자, CryIA 유전자, CryIIIA 유전자 또는 bar 유전자인 방법.
제 1 항 내지 제 7 항 중의 어느 한 항에 있어서, 콘트롤 유전자가 생물 집단에 공통으로 존재하는 유전자인 방법.
제 8 항에 있어서, 콘트롤 유전자가 제인 유전자, 액틴 유전자 또는 렉틴 유전자인 방법.
제 1 항 내지 제 9 항 중의 어느 한 항에 있어서, 공정 a)에서 4∼8 개의 시료를 얻고, 공정 f)에서 구간추정을 이용하는 통계 처리에 의해서 99신뢰도의 범위를 결정하는 방법.