KR20030084184A - 유전자 조작 농산물과 이의 가공품의 정성 검정용프라이머와 정량 검정용 프라이머, 프로브 및 검정키트 - Google Patents

유전자 조작 농산물과 이의 가공품의 정성 검정용프라이머와 정량 검정용 프라이머, 프로브 및 검정키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 유전자 조작 농산물과 이의 가공품의 정성 검정용 프라이머와 정량 검정용 프라이머, 프로브 및 검정키트에 관한 것이다. 본 발명의 정성 및 정량 프라이머는 유전자 조작 농산물에 사용되는 CaMV 35s 프로모터, EPSPS 유전자, cry1A(b) 유전자 및 PAT 유전자를 PCR로 검출할 수 있으며, GMO 검사키트로 상업화하여 유통중인 유전자 조작 농산물 및 이의 가공품 판별에 이용될 수 있다.

Description

유전자 조작 농산물과 이의 가공품의 정성 검정용 프라이머와 정량 검정용 프라이머, 프로브 및 검정키트{DETECTION PRIMER FOR GENETICALLY MODIFIED ORGANISM AND MANUFACTURED GOODS, PRIMER AND PROBE FOR QUANTIFICATION OF GENETICALLY MODIFIED ORGANISM, AND DETECTION KIT USING SAME}
[발명이 속하는 기술분야]
본 발명은 유전자 조작 농산물과 이의 가공품의 정성 검정용 프라이머와 정량 검정용 프라이머, 프로브 및 검정키트에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 농산물의 유전자 조작여부 및 혼입율을 검사할 수 있는 정성 및 정량용 프라이머에 관한 것이다.
[종래기술]
유전자 조작 농산물(GMO : Genetically Modified Organism)이란 기존의 작물육종에 의한 품종 개발과는 달리, 동식물 또는 미생물의 유용 유전자를 인공적으로 분리, 결합시켜 생산성이 증가 되도록 한 생물체를 총칭하는 것이다. 일반적으로 유전자 조작 농산물의 생산성을 증가시키기 위하여 제초제 저항성, 내충성, 내병성, 내한성 등에 관련된 유전자를 농산물에 도입하고 있다.
현재, 세계적으로 가장 많이 상업화 되어 있는 유전자 조작 농산물로는 옥수수, 콩이 있으며, 그 밖에 다른 작물에도 넓게 적용되고 있는 실정이다. 하지만 유전자 조작 농산물의 안정성 및 잠재적 위험성에 대한 과학적 고찰이 이루어지지 않은 시점에서 일반 농산물과 구분되지 않은 채 우리 식탁에까지 오르고 있다.
이에 2001년 3월 1일부터 농수산물 품질 관리법에 의한 원물의 의무 표시 대상품목으로 콩, 콩나물 및 옥수수가 지정되었고, 2002년 3월 1일부터는 감자도 대상품목에 포함될 예정이다.
현재 유전자 조작 농산물에 도입된 외부 유전자로는 EPSPS(enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase), PAT(Phosphinothricin acetyl transferase) 및 BT(Bacillus thuringiensis)의 cry계열의 유전자 등이 가장 대표적이다. 상기 EPSPS 유전자는 글리포세이트(glyphosate)라는 제초능을 가지는 화학물질에 내성을 갖도록 하는 유전자이고, PAT 유전자는 글루포시네이트(gluphosinate)라는 제초능을 가지는 화학물질에 내성을 갖도록 하는 유전자이고, 상기 cry 계열의 유전자는 해충 저항성을 갖도록 하는 유전자이다.
상기한 유전자를 포함하는 시판되는 유전자 조작 농산물에는 글리포세이트 내성/해충 내성 옥수수(Agrobacterium sp.종 CP4 EPSPS + Ochrobactrum anthropi의 glyphosate oxidaoreductase, 몬산토사), 글리포세이트 내성 면실(Agrobactarium spp. CP4 EPSPS), 글리포세이트 내성 캐놀라(Agrobactarium spp. CP4 EPSPS), 글루포시네이트 내성 옥수수(Streptomyces hygroscopicus의 Phosphinothricin acetylhydrolase, Dekalb Genetics Corp.), 글루포시네이트 내성 캐놀라(Steptomyces virdochromogenes의 PAT, Agevo Inc.), 글루포시네이트 내성 옥수수 (Steptomyces virdochromogenes의 PAT), 해충 내성 옥수수(crylA(b), 몬산토사), 해충 내성 옥수수(crylA(b), 몬산토사), 해충 내성 감자(crylll A, 몬산토사), 해충 내성 옥수수(crylA(b), Northrup King), 해충 내성 옥수수(crylA(b), Ciba-Geigy Corp.) 등이 있다.
유전자 조작 농산물을 검사하기 위한 방법으로 유전자 검출방법이 이용되고 있다. 유전자 검출방법은 연쇄 중합 반응(PCR)에 의한 검정 기술로, 유전자 조작 농산물에 도입된 외부유전자의 발현을 조절하는 프로모터나 전사종결부에 대한 특이 프라이머로 PCR하여 검정하고 있다. 그러나, 유전자 조작 농산물에 따라 사용되어지고 있는 재조합 유전자의 종류, 발현방법, 염기서열변형정도가 다양하여 유전자 조작의 정확한 판단이 쉽지 않으며, 하나의 농산물에 대하여 다수의 재조합 유전자 프라이머로 동시에 PCR 할 수 있는 방법이 확립되어지지 않은 실정이다.
또한 현재 유전자 조작 농산물을 판정하는 기준이 농산물 내의 외부 유전자의 함유량에 의존되어 있지만, 이를 정확히 정량하기 어렵다. 유전자 조작 농산물을 PCR법으로 정량하기 위해서는 외래 유전자의 카피수를 비교할 수 있는 표준물질이 필요하다. 표준물질로는 각 계통별 유전자 조작 농산물을 일정량씩 함유한 천연 농산물의 종자 분쇄물 또는 그 게놈 DNA가 사용되고 있다. 그러나 하나의 유전자 조작 농산물 계통에는 다수의 품종이 혼입되어 있고, 천연 농산물도 다수의 품종이 혼입되어 있기 때문에 정확한 유전자 조작 농산물을 정량하기 어려운 실정이다.
따라서, 본 발명은 유전자 조작 농산물과 이의 가공품을 정성 분석할 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 유전자 조작 농산물 및 이의 가공품을 정성 분석할 수 있는 프라이머를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 유전자 조작 농산물을 정량 분석할 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 유전자 조작 농산물을 정량 분석하기 위하여 사용될 수 있는 프로브를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 유전자 조작 농산물을 정량 분석할 수 있는 프라이머를 제공하는 것을 목적으로 한다.
도 1은 Ga21에 도입된 mEPSPS 발현구조체를 나타낸 것이고,
도 2는 T14/T25에 도입된 PAT 발현구조체를 나타낸 것이고,
도 3은 Mon810에 도입된 Cry1A(b) 발현구조체를 나타낸 것이고,
도 4는 옥수수에 도입된 Cry1A(b) 발현구조체의 공통된 염기서열을 비교한 것이고,
도 5는 라운드업 레디에 도입된 EPSPS 발현구조체를 나타낸 것이고,
도 6은 옥수수에 공통으로 도입된 유전자 발현구조체를 나타낸 것이고,
도 7은 g88/g215 프라이머로 PCR한 전기영동사진이고,
도 8은 t9/t395 프라이머로 PCR한 전기영동사진이고,
도 9은 t66/t395 프라이머로 PCR한 전기영동사진이고,
도 10는 m39/m232 프라이머로 PCR한 전기영동사진이고,
도 11은 cb6/cb147 프라이머로 PCR한 전기영동사진이고,
도 12는 렉틴 유전자의 PCR 사이클 수에 대한 형광수치이고,
도 13은 렉틴 유전자의 카피수에 대한 교차점을 나타내는 정량곡선이고,
도 14는 rrs 유전자의 PCR 사이클 수에 대한 형광수치이고,
도 15는 rrs 유전자의 카피수에 대한 교차점을 나타내는 정량곡선이고,
도 16은 SSIIB 유전자의 PCR 사이클 수에 대한 형광수치이고,
도 17은 SSIIB 유전자의 카피수에 대한 교차점을 나타내는 정량곡선이고,
도 18은 35s 유전자의 PCR 사이클 수에 대한 형광수치이고,
도 19는 35s 유전자의 카피수에 대한 교차점을 나타내는 정량곡선이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 g88, 서열번호 2의 g215, 서열번호 3의 t9, 서열번호 4의 t66, 서열번호 5의 t395, 서열번호 6의 m39, 서열번호 7의 m232, 서열번호 10의 s223, 서열번호 11의 s363, 서열번호 12의 cb6 및 서열번호 13의 cb147로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 프라이머를 포함하는 유전자 조작 농산물 검정용 프라이머를 제공한다.
또한 본 발명은 상기의 유전자 조작 농산물 검출용 프라이머로 증폭된 외부유전자 PCR 산물 및 내재 유전자 검출용 프라이머로 증폭된 내재유전자 PCR 산물을포함하는 DNA 단편을 제공한다.
또한 본 발명은 상기의 DNA 단편을 포함하는 플라스미드를 제공한다.
또한 본 발명은 서열번호 14의 LTM, 서열번호 15의 EPTM, 서열번호 16의 SBTM 및 서열번호 17의 STM으로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자 조작 농산물 검출용 프로브를 제공한다.
또한 본 발명은 (a) 상기의 DNA 단편을 포함하는 표준물질을 유전자 조작 농산물 검출용 프로브를 반응시키고, 유전자조작 농산물 검출용 프라이머 및 농산물 내재 유전자 검출용 프라이머로 PCR하여 형광을 측정함으로써 형광량에 대한 유전자 카피수를 나타내는 표준곡선을 산출하는 단계, (b) 100% 유전자 조작 농산물 DNA를 (a) 단계의 방법으로 반응시킨 후 측정한 형광량을 표준곡선에 대입하여 유전자 카피수를 측정하는 단계, (c) 상기 (b) 단계에서 측정한 유전자 카피수를 계산식 1에 대입하여 보정계수를 산출하는 단계, (d) 측정대상인 농산물 또는 그의 가공품으로부터 추출한 DNA를 주형으로 상기 (a) 방법으로 반응시키고, 표준곡선에 대입하여 유전자 카피수를 측정하는 단계 및 (e) 상기 (d) 단계에서 측정한 유전자 카피수를 계산식 2에 대입하여 유전자 도입율을 측정하는 단계를 포함하는 유전자 조작 농산물 정량방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 농작물 또는 가공품에서 DNA를 분리한 다음 상기 DNA에 특이 프라이머로 PCR함으로써 유전자 조작 여부를 확인할 수 있도록 개발되었다.
더욱 바람직하게는 유전자 조작 농산물에 통상적으로 도입된 재조합 유전자또는 상기 유전자를 발현하기 위한 구조체(프로모터, 전사종결자 또는 인트론 등)를 PCR 할 수 있는 프라이머를 개발하였다.
상기 농산물은 식물에서 수득할 수 있는 모든 종류의 물질로, 바람직하기로는 뿌리, 줄기, 잎, 종자, 열매 및 꽃이다. 또한 상기 가공품은 식물을 이용하여 제조된 모든 종류의 물질로, 가장 바람직하게는 식품이다.
본 발명의 정성분석 및 정량분석용 프라이머는 서열번호 1의 g88, 서열번호 2의 g215, 서열번호 3의 t9, 서열번호 4의 t66, 서열번호 5의 t395, 서열번호 6의 m39, 서열번호 7의 m232, 서열번호 8의 ep78, 서열번호 9의 ep220, 서열번호 10의 s223, 서열번호 11의 s363, 서열번호 12의 cb6 및 서열번호 13의 cb147로 이루어진 군으로부터 1종이상 선택된 프라이머를 포함한다.
본 발명의 g88/g215 프라이머세트는 EPSPS 유전자 운반체(벼 액틴 1 프로모터-벼 액틴1 인트론-최적화된 목적 펩타이드-수정된 EPSPS-노팔린 합성효소 터미네이터)를 PCR로 증폭시키는데 사용되는 것으로, EPSPS 유전자 운반체를 포함하는 유전자 조작 농산물 및 상기 농작물로 제조된 가공품의 DNA를 증폭시킬 수 있다. 더욱 바람직하게는 몬산토사의 제초제 저항성 옥수수 Ga21에 도입된 EPSPS 유전자 운반체를 검정하는 것이다(도 1). g88 프라이머는 EPSPS 유전자에, g215 프라이머는 Tnos에 특이적으로 결합한다.
본 발명의 t9/t395 프라이머세트는 PAT 유전자 운반체(CaMV 35s 프로모터(P35s)-합성 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제(PAT)-CaMV 35s 터미네이터(T35s))를 검정하는 것으로, PAT 유전자 운반체를 포함하는 유전자 조작 농산물및 상기 농작물을 검정한다. 더욱 바람직하게는 아벤티스사의 제초제 저항성 옥수수인 리버티링크(libertylink(t14/t25))를 검정한다(도 2). t9 프라이머는 PAT 유전자에, t395 프라이머는 T35s에 특이적으로 결합한다.
또한 본 발명의 t66/t395 프라이머세트 역시 PAT 유전자 운반체(CaMV 35s 프로모터(P35s)-합성 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제(PAT)-CaMV 35s 터미네이터(T35s))를 검정하는 것으로, PAT 유전자 운반체를 포함하는 유전자 조작 농산물 및 상기 농작물을 검정한다. 바람직하게는 아베틴스사의 제초제 저항성 옥수수인 리버티링크를 검정한다. t66 프라이머는 PAT 유전자에 특이적으로 결합한다.
본 발명의 m39/m232 프라이머세트는 cryIA(b) 유전자 운반체(P35s-옥수수 열 충격 단백질70(Hsp70) 인트론#1-합성 cryIA(b)-Tnos)를 검정하는 것으로, cryIA(b) 유전자 운반체를 포함하는 유전자 조작 농산물 및 상기 농작물을 검정한다. 바람직하게는 몬산토사의 Mon810 옥수수를 검정하는 것으로(도 3), m39 프라이머는 Hsp70 인트론#1에 특이적이고, m232는 cryIA(b)에 특이적이다.
또한 cb6/cb147 프라이머세트는 유전자 조작 옥수수에 도입된 cryIa(b) 유전자 운반체를 검정한다. 특히 cb6/cb147 프라이머세트는 유전자 조작 농산물인 EVENT176, MONBT, BT1845, MON810, BT11 및 DEKALBBT의 공통된 염기서열(도 4)에 특이적으로 결합하여, 상기 유전자 조작 농산물들을 검출한다.
본 발명의 ep78 프라이머 및 ep220 프라이머는 EPSPS 유전자 운반체(CaMV 35S 프로모터(P35S)-엽록체 표적 펩타이드(CTP)-EPSPS-노팔린 합성효소(Nos) 전사종결자(Tnos))를 검출하는 것으로, EPSPS 유전자 운반체를 포함하는 유전자 조작 농산물 및 상기 농작물로 제조된 가공품을 검출한다. 더욱 바람직하게는 몬산토사의 제초제 저항성 콩인 라운드업 레디(Roundupready)를 특이적으로 검출한다.
본 발명의 s223/s363 프라이머세트는 유전자 조작 농산물에서 대부분 사용되고 있는 P35s를 특이적으로 검출하는 것이다(도 6).
본 발명의 유전자 조작 농산물 및 이의 가공품 정성분석 방법은 본 발명의 프라이머들로 PCR하여 외부 유전자의 존재여부를 확인하는 것이다. PCR 반응은 통상적인 PCR 방법 및 조건으로 실시되어지는 것이 바람직하며, 프라이머의 염기서열 특성에 따라 조절하여 하는 것이 좋다.
또한 본 발명의 상기 유전자 조작 농산물용 프라이머를 포함하는 검사키트를 제공한다. 상기 검사키트는 PCR 완충액, dNTP, Taq 중합효소 및 프라이머를 포함한다. 검사키트는 포함되는 프라이머는 검출하고자 하는 목적 농산물에 따라 달라질 수 있으며, 프라이머에 따라 PCR 반응조건이 달라질 수 있다. 상기 프라이머는 프라이머의 GC%, 및 Tm에 따라 PCR 반응조건을 조절하는 것이 바람직하며, 가장 최적의 반응조건에서 PCR될 수 있는 프라이머를 포함하는 것이 좋다. 바람직한 검사키트는 곡물 검사키트, 콩 원물 검사키트, 콩 가공품 검사키트 및 옥수수 검사키트이다.
또한 본 발명은 유전자 조작 농산물을 정량분석할 수 있는 방법을 제공한다. 본 발명의 정량분석방법은 유전자 조작 농산물이 필수적으로 포함하는 내재유전자에 대한 도입유전자의 비율을 측정하여 유전자 조작 농산물이 몇 % 존재하는지 상대적으로 측정하는 방법으로, 보다 상세하게는 주형 DNA에 특이적으로 결합하는 양쪽 프라이머의 사이에 상보적으로 결합하는 유전자 조작 농산물 검출용 프로브를 결합시킨 다음 PCR 증폭과정에서 발색되는 형광의 양을 측정하여 형광량이 특정 수치가 되는 PCR 사이클 수를 이용하여 내재 및 도입유전자의 양을 산출하는 것이다. 또한 PCR 과정에서 발생할 수 있는 오차를 보정할 수 있는 보정계수를 도입하여 정확한 유전자 조작 농산물 도입율을 측정할 수 있는 방법이다.
바람직한 정량분석방법은 (a) 표준물질을 유전자 조작 농산물 검출용 프로브를 반응시키고, 유전자조작 농산물 검출용 프라이머 및 농산물 내재 유전자 검출용 프라이머로 PCR하여 형광을 측정함으로써 형광량에 대한 유전자 카피수를 나타내는 표준곡선을 산출하는 단계, (b) 100% 유전자 조작 농산물을 (a) 단계의 방법으로 반응시킨 후 측정한 형광량을 표준곡선에 대입하여 유전자 카피수를 측정하는 단계, (c) 상기 (b) 단계에서 측정한 유전자 카피수를 계산식 1에 대입하여 보정계수를 산출하는 단계, (d) 유전자 조작 농산물 혼입율을 측정할 농산물 또는 그의 가공품으로부터 추출한 DNA를 주형으로 상기 (a) 방법으로 반응시키고, 표준곡선에 대입하여 유전자 카피수를 측정하는 단계, 및 (e) 상기 (d) 단계에서 측정한 유전자 카피수를 유전자 도입율 계산식 2에 대입하여 유전자 도입율을 측정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 표준물질은 유전자 조작 농산물 검출용 프라이머로 증폭된 외부유전자 PCR 산물 및 내재 유전자 검출용 프라이머로 증폭된 내재유전자 PCR 산물을 포함하는 플라스미드 DNA이다. 일예로, 콩 정량시 사용할 표준물질로 L554/L701프라이머 세트로 증폭된 PCR 산물 및 EP78/EP220 프라이머 세트로 증폭된 PCR 산물을 pUC19에 삽입하여 제조한 플라스미드를, 옥수수 정량시 사용할 표준물질로 SB1043/SB1142 프라이머 세트로 증폭된 PCR 산물 및 S223/S363 프라이머 세트로 증폭된 PCR 산물을 pUC19에 삽입하여 제조한 플라스미드를 제공한다.
본 발명의 유전자 조작 농산물 검출용 프로브는 유전자 조작 농산물 검출용 프라이머 한 쌍이 결합하는 부분 사이에 존재하는 DNA에 특이적으로 결합하며, 상기 프라이머에 의한 PCR 반응시 분해되고 이때 형광을 나타낸다. 일예로 제조한 프로브는 하기 표 1에 나타내었다. 프로브에 기재된 FAM은 형광을 나타내는 물질이며, "X"는 퀀처(quencher)로 FAM의 형광을 흡수하는 역할을 하며, "P"는 포스페이트이다. "P"는 프로브가 프라이머로 기능하지 못하도록 3'말단을 포스페이트기로 치환하였고, 퀀처를 두어 FAM의 형광발색을 흡수하도록 하였다. 그러나 유전자 조작 농산물 검출용 프라이머로 인하여 프로브가 결합된 DNA 부분이 증폭되면 DNA에 결합된 프로브는 분해되어 탈착되고 이때 FAM은 형광을 나타내게 된다.
검정대상 이름 염기서열 서열번호
렉틴 LTM 5'-6FAM-CCCGAGTGGGTGAGGATAGGGTXT p 14
EPSPS EPTM 5'-6FAM-AAGACGTGGCGGACCTGCGCGTXTC p 15
SSIIB SBTM 5'-6FAM-TGATGCAGTATGCTCGCTCTGTGCXTTGT p 16
35S STM 5'-6FAM-ATGGACCCCCACCCACGAGGAGCAXTC p 17
상기 (a) 단계에서 PCR 과정을 통하여 PCR 사이클수별 형광량을 측정하고, 이를 형광량에 대한 유전자 카피수로 변환하여 표준곡선을 작성한다.
이후 (b) 단계에서는 100% 유전자 조작 농산물 계통별로 대표적인 품종을 상기 (a)와 동일한 방법으로 PCR하여 형광량을 측정하고, 이를 표준곡선에 대입하여내재유전자 및 도입 유전자의 카피수를 각각 산출한다.
상기 (c) 단계에서는 (b) 단계에서 100% 유전자 조작 농산물 계통별로 측정한 내재유전자 카피수 및 도입 유전자 카피수를 하기 계산식 1에 대입하여 보정계수를 환산하다. 일반적으로 100% 유전자 조작 농산물내에는 내재유전자 카피수와 도입유전자 카피수가 동일하게 존재하지 않고, DNA 추출과정이나 PCR 과정중 오차가 발생할 수 있어 이를 보정하기 위하여 보정계수를 사용한다.
(계산식 1)
보정계수 = 도입유전자 카피수/내재유전자 카피수
상기에서 설명한 표준곡선과 보정계수를 이용하여 이후 유전자 조작 농산물의 혼입율을 측정한다.
상기 (d)단계에서는 유전자 조작 농산물 혼입율을 측정할 농산물 또는 그의 가공품으로부터 추출한 DNA를 주형으로 상기 (a) 방법으로 반응시키고, 형광량을 표준곡선에 대입하여 유전자 카피수를 측정한다.
(e) 단계에서는 측정한 유전자 카피수를 하기 계산식 2에 대입하여 유전자 도입율을 측정한다.
(계산식 2)
도입유전자 도입율(%) =
(도입유전자 카피수/내재유전자 카피수)/보정계수 X 100
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 정성분석
이하 "유전자 조작 농산물"을 "GMO"로 표기하고, "유전자 조작"을 "GM"으로, "천연형 농산물"을 "non-GM"으로 표기한다.
(1) 프라이머 제조
몬산토사의 제초제 저항성 옥수수 Ga21
Ga21에는 도 1에 도시한 바와 같은 EPSPS 유전자 운반체(Rice actin 1 promoter-Rice actin1 intron-optimized targeting peptide- modified EPSPS-nopaline synthase(Nos) terminator(Tnos))가 포함되어 있다. 이를 검정하 기 위한 프라이머로 서열번호 1의 g88와 서열번호 2의 g215를 제작하였다. g88은 EPSPS에 특이적이고, G215는 Tnos에 특이적이다.
아벤티스사의 제초제 저항성 옥수수 Libertylink(t14/t25)
Libertylink에 도입된 PAT 유전자 운반체(CaMV 35s promoter(P35s)-synthetic phosphinothricin acetyltransferase(PAT)-CaMV 35s terminator(T35s))는 도 2에 나타낸다. 이를 검정하기 위한 센스프라이머로 서열번호 3의 t9, 서열번호 4의 t66를 제작하였고, 공통적으로 사용가능한 안티센스 프라이머로 서열번호 5의 t395를 제작하였다. t395는 T35s에 특이적이다.
몬산토사의 Mon810 옥수수
도 3의 cryIA(b) 유전자 운반체(CaMV 35S promoter(P35s)-옥수수 heat shock protein 70(hsp70) intron#1-synthetic CryIA(b)-nopaline synthaseterminator(Tnos))를 가지는 Mon810을 검정하기 위하여 서열번호 6의 m39 및 서열번호 7의 m232를 제작하였다. m39는 Hsp70 인트론1에, m232는 cry1Ab에 특이적이다.
몬산토사의 제초제 저항성 콩(roundup readysoybean; rrs)
도 5의 EPSPS 유전자 운반체(CaMV 35S promoter(P35s)-chloroplast targeting peptide-EPSPS-nopaline synthase(Nos) terminator(Tnos))를 가지는 라운드업 레디를 검정하기 위하여 서열번호 8의 ep78 및 서열번호 9의 ep220을 각각 제작하였다. ep78 및 ep220은 EPSPS에 특이적이다.
p35s를 포함하는 GMO검정용 프라이머
현재 개발된 형질전환식물체중 Ga21을 제외한 모든 GMO가 p35s를 보유하고 있다(도 6). 이를 공통적으로 검정하기 위하여 P35s 특이적인 프라이머로, 서열번호 10의 s223 및 서열번호 11의 s363을 제작하였다.
옥수수에 도입된 cry1A(b) 검정용 프라이머
옥수수에 도입된 cry1A(b) 발현구조체의 공통된 염기서열을 하였다(도 4). 그 결과 공통적으로 삽입된 서열을 분석하였고, 이를 검정할 수 있는 프라이머 세트를 제작하였다. 프라이머 세트는 서열번호 12의 cb6 및 서열번호 13의 cb147이다.
(2) 정성분석
상기에서 제작한 프라이머에 대한 GMO 정성분석을 실시하였다.
1. 시료준비
곡물들은 65 ℃에서 건조시키고, 혼합기(blender)에서 미세하게 분쇄하였다. 분쇄물 100 mg은 DNeasy 식물 미니(DNeasy plant mini, Qiagen)키트로 매뉴얼에 따라 게놈 DNA를 분리하였다. 분리된 게놈 DNA는 자외선 흡광도 분석기(UV spectrophotometer)상에서 260 nm/280nm상에서 흡광도를 측정하여 정량하였다.
2. PCR 반응
- PCR 반응물
DNA - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 100 ng
프라이머 세트 - - - - - - - - - - - - - - - - 10 pmol/10 pmol
Taq중합효소(HotstarTaq DNA polymerase, Qiagen) - 1 unit
10X 완충액 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 2 ㎕
증류수 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - up to 20 ㎕
- PCR 반응조건
변성단계 : 95 ℃, 15 분
효소중합반응 단계(40회 반복): 표 1에 따라 실시함
중합반응 단계 : 72 ℃, 2분
종류 조건
g88/g215 95 ℃, 15초 -> 60 ℃, 20초 -> 72 ℃, 20초
t9/t395 95 ℃, 15초 -> 61 ℃, 30초 -> 72 ℃, 30초
t66/t395 95 ℃, 15초 -> 61 ℃, 30초 -> 72 ℃, 30초
m39/m232 95 ℃, 15초 -> 60 ℃, 30초 -> 72 ℃, 20초
cb6/cb147 95 ℃, 15초 -> 54 ℃, 30초 -> 72 ℃, 30초
3. 결과
PCR한 반응물은 EtBr을 포함하는 3 % 아가로즈 젤상에서 전기영동하였고, PCR된 DNA 단편이 있는 레인을 확인하였다.
g88/g215 프라이머
도 7은 g88/g215 프라이머 세트로 PCR 실시한 반응물을 전기영동한 사진이다. M은 100bp 래더(elpisbiotech)이고, "1"은 PCR 주형을 사용하지 않은 것이고, "2"는 non-GMO이고, "3"은 Bt11이고, "4"는 event176이고, "5"는 Mon810이고, "6"은 t14t25이고, "7"은 starlink이고, "8"은 Ga21이고, "9"는 콩, "10"은 벼, "11"은 밀이다.
도 7에서 Ga21이 128 bp로 특이적으로 PCR 되었음을 확인할 수 있었다.
t9/t395 프라이머
도 8은 t9/t395 프라이머 세트로 PCR 실시한 반응물을 전기영동한 사진이다. M은 100bp 래더(elpisbiotech)이고, "1"은 PCR 주형을 사용하지 않은 것이고, "2"는 non-GOM이고, "3"은 t14t25이고, "4"는 Mon810이고, "5"는 event176이고, "6"은 Bt11이고, "7"은 starlink이고, "8"은 Ga21이고, "9"는 콩, "10"은 벼, "11"은 밀이다.
도 8에서 t14t25가 580 bp로 특이적으로 PCR 되었음을 확인할 수 있었다.
t66/t395 프라이머
도 9는 t66/t395 프라이머 세트로 PCR 실시한 반응물을 전기영동한 사진이다. M은 100bp 래더(elpisbiotech)이고, "1"은 PCR 주형을 사용하지 않은 것이고, "2"는 non-GOM이고, "3"은 t14t25이고, "4"는 Mon810이고, "5"는 event176이고,"6"은 Bt11이고, "7"은 starlink이고, "8"은 Ga21이고, "9"는 콩, "10"은 벼, "11"은 밀이다.
도 9에서 t14t25가 155 bp로 특이적으로 PCR 되었음을 확인할 수 있었다.
m39/m232 프라이머
도 10은 m39/m232 프라이머 세트로 PCR 실시한 반응물을 전기영동한 사진이다. M은 100bp 래더(elpisbiotech)이고, "1"은 PCR 주형을 사용하지 않은 것이고, "2"는 non-GOM이고, "3"은 Mon810이고, "4"는 Event176이고, "5"는 Bt11이고, "6"은 t14t25이고, "7"은 Starlink이고, "8"은 Ga21이고, "9"는 콩, "10"은 벼, "11"은 밀이다.
도 10에서 Mon810이 193 bp로 특이적으로 PCR 되었음을 확인할 수 있었다.
cb6/cb147 프라이머
도 11은 cb6/cb147 프라이머 세트로 PCR 실시한 반응물을 전기영동한 사진이다. M은 100bp 래더(elpisbiotech)이고, "1"은 non-GOM이고, "2"는 Mon810이고, "3"은 event176이고, "4"는 Bt11이고, "5"는 t14t25이고, "6"은 Starlink이고, "7"은 Ga21이고, "8"는 콩, "9"은 벼, "10"은 밀이다.
도 11에서 cry1A(b)를 포함하는 Mon810, event176 및 Bt11이 각각 약 141 bp로 PCR 되었다.
실시예 2: 정량분석
(1) 표준물질
콩과 옥수수의 GMO를 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머와 콩 옥수수의 내재유전자 특이 프라이머를 이용하여 증폭된 각 PCR 산물(amplicon)을 하나의 플라스미드에 삽입하여 연결한 앰플리콘 플라스미드(amplicon plasmid)를 표준물질로 제조하였다.
콩 정량시 사용할 표준물질로 pUC19에 L554/L701 프라이머 세트로 증폭된 PCR 산물 및 EP78/EP220 프라이머 세트로 증폭된 PCR 산물을 삽입하여 콩 표준물질을 제조하였다. 또한 옥수수 정량시 사용할 표준물질로 pUC19에 SB1043/SB1142 프라이머 세트로 증폭된 PCR 산물 및 S223/S363 프라이머 세트로 증폭된 PCR 산물을 삽입하여 옥수수 표준물질을 제조하였다.
(2) 정량용 프라이머
렉틴 검정용 프라이머로 서열번호 18의 L554, 서열번호 19의 L701을, EPSPS 검정용 프라이머로 ep78, ep220을, SSIIB 검정용 프라이머로 서열번호 20의 sb1043, 서열번호 21의 sb1142를, 35S 검정용 프라이머로 s223, s363을 제작하였다(제조사 : (주)다까라코리아)
(3) 정량용 프로브
렉틴 정량용 프로브로 LTM, EPSPS 정량용 프로브로 EPTM, SSIIB 정량용 프로브로 SBTM 및 35S 정량용 프로브로 STM을 각각 제작하였다(제조사 : TIBMOLBIOL, 베를린, 독일).
(4) PCR 반응
하기 표 3의 조성으로 하기 표 4의 반응조건으로 PCR을 실시하였다.
조 성 물 부피(ul) 최종농도
Lightcycler-DNA Master Hybridization Probes 2 1x
MgCl2(25mM) 1.6 3mM
센스 프라이머(10uM) 1 0.5uM
안티센스 프라이머(10uM) 1 0.5uM
Taqman probe(2uM) 2 0.2uM
H2O 7.4
주형(표준물질 또는 시료) 5
합계 20
변성단계 95 ℃,10분
효소중합단계 사이클 수 45
type quantification
구획 1 구획 2
온도(℃) 95 62
시간(sec) 15 30
온도변환속도(℃/s) 20 20
acquisition mode none single
감온단계 40 ℃, 30초
lightcycler(Roche)를 이용하여 PCR 반응을 실시하며 각 사이클의 구획 2에서 형광량을 측정하였다.
(5) 결과
각 사이클의 구획 2에서 유전자의 PCR 사이클 수마다 측정한 형광량을 도 12(lectin), 도 14(EPSPS), 도 16(SSIIB) 및 도 18(35s)에 각각 그래프로 나타내었다. 또한 상기 그래프를 유전자의 카피수에 대한 PCR 사이클수로 나타내는 표준곡선인 도 13, 15, 17 및 19로 각각 나타내었다.
표준곡선의 그래프는 모두 이론적인 PCR 효율을 나타내는 기울기 -3.32에 매우 근접한 결과를 나타냈으며, 상관계수 또한 1 또는 1에 매우 근접한 수치를 나타내어 실험의 정확성을 나타내었다.
이후 100%의 GMO인 rrs 및 옥수수를 동일한 방법으로 PCR하고, 각 구획별 형광을 측정한 후 상기 표준곡선에 대입하여 유전자 수를 측정하였다. 측정한 유전자량수를 하기 식 1에 대입하여 보정계수를 구하였다.
(계산식 1)
보정계수=GM계통 F1 종자의 특이적 도입유전자 수/GM계통 F1 종자의 내재유전자 수
가. rrs 콩의 보정계수
상기 식을 이용하여 측정한 콩의 보정계수는 하기 표 5에 나타낸다.
실험회수 렉틴 유전자양 EPSPS유전자양 내표비
1 2783 3842 1.38
2 10710 11010 1.03
3 10440 10100 0.97
4 98100 80860 0.82
5 2496 3005 1.20
6 85600 76760 0.90
7 106700 67150 0.63
보정계수평균 0.99
절대편차 0.10
표준편차 0.14
표 5에 나타난 바와 같이, 7차례에 거쳐 실시한 결과 rrs 콩의 평균 보정계수는 0.99이다.
이후 GMO의 혼입율을 알고 있는 각각의 IRMM standard(CRM IRMM-410R) 시료로 하여 PCR하여 형광을 측정한 다음 표준곡선에 대입하여 렉틴과 EPSPS 유전자 양을 결정하였다. 이후 도입유전자 수를 내재유전자 수로 나누어 측정치를 구하고, 여기에 보정계수 0.99를 나눈 다음 100을 곱하여 환산치(gmo 유전자 도입율)를 산출하였다. 환산치는 IRMM 표준시료의 제조시 사용한 유전자 혼합치와 비교하여 오차를 계산하여 오차들의 표준편차와 절대 편차를 계산한 결과 각각 19.47과 14.74를 보여서 기존의 실험법에 허용치인 20 %를 만족함으로써 기존의 정량법을 대치할 수 있었다(표 6).
시료명(%) 렉틴 유전자 수 EPSPS유전자 수 측정치(%) 환산치(%) 오차(%)
0 2197 0 0.0 0.00 0.00
0 2091 0 0.00 0.00 0.00
0.1 2360 2.119 0.09 0.09 10.21
0.1 1364 1.555 0.11 0.11 -14.00
0.5 1903 10.34 0.54 0.54 -8.67
0.5 1217 4.989 0.41 0.41 18.01
1 3142 30.42 0.97 0.97 3.18
1 1786 19.71 1.10 1.10 -10.36
1 1946 23.6 1.21 1.21 -21.27
1 1267 11.05 0.87 0.87 12.79
2 3479 83.08 2.39 2.39 -19.40
2 1713 43.49 2.54 2.54 -26.94
2 4312 119.6 2.77 2.77 -38.68
2 1988 60.09 3.02 3.02 -51.13
2 1121 25.96 2.32 2.32 -15.79
3 1615 57.3 3.55 3.55 -18.27
3 1884 71.35 3.79 3.79 -26.24
3 1307 48.8 3.73 3.73 -24.46
3 600.6 28.86 4.81 4.81 -60.17
5 1996 137.3 6.88 6.88 -37.58
5 1673 96.82 5.79 5.79 -15.74
5 1420 75.22 5.30 5.30 -5.94
5 1181 62.84 5.32 5.32 -6.42
표준편차 19.47
절대편차 14.74
나. 옥수수의 보정계수 결정
번호 SSIIB 35s 내표비
1 1850 686.1 0.37
2 6038 1944 0.32
3 2742 757.6 0.28
4 3273 980.2 0.30
5 5918 2001 0.34
6 5804 2098 0.36
7 2961 933.7 0.32
8 1503 494.6 0.33
9 6317 1832 0.29
10 9395 2830 0.30
11 8897 3051 0.34
평균 0.32
절대편차 0.02
표준편차 0.03
표 7에서, 옥수수의 35s의 보정계수는 0.32이다.
이후 각각의 IRMM 표준시료(CRM IRMM-413)를 같은 방법으로 SSIIB와 35s유전자 양을 측정한 후에 이 측정치를 보정계수 0.32로 나누어서 환산치를 구하였으며 이를 원래 시료 제조시의 유전자 혼합치와 비교하여 오차를 계산하였다. 그 결과 오차들의 표준편차와 절대 편차는 각각 17.40과 11.94로 나타나 기존의의 실험법에 허용치인 20%를 만족하였다.
시료명(%) SSIIB 유전자 양 35s 유전자 양 측정치(%) 환산치(%) 오차(%)
1 5880 19.28 0.33 1.02 -2.47
1 5675 24.1 0.42 1.33 -32.71
2 7260 55.65 0.77 2.40 -19.77
2 7836 58.65 0.75 2.34 -16.95
2 6710 48.28 0.72 2.25 -12.43
5 7282 161.1 2.21 6.91 -38.27
5 7503 123.2 1.64 5.13 -2.63
5 7343 162.1 2.21 6.90 -37.97
절대편차 11.94
표준편차 17.40
이상에서 살펴 본 바와 같이, 본 발명의 유전자 조작 농산물 정성 또는 정량용 프라이머를 이용하여 유전자 조작여부를 쉽게 판단할 수 있을 뿐만 아니라 농산물에 혼입된 유전자 조작 농산물의 함량을 확인할 수 있다.

Claims (8)

  1. 서열번호 1의 g88, 서열번호 2의 g215, 서열번호 3의 t9, 서열번호 4의 t66, 서열번호 5의 t395, 서열번호 6의 m39, 서열번호 7의 m232, 서열번호 10의 s223, 서열번호 11의 s363, 서열번호 12의 cb6 및 서열번호 13의 cb147로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 프라이머를 포함하는 유전자 조작 농산물 검정용 프라이머.
  2. 제 1항의 유전자 조작 농산물 검출용 프라이머로 증폭된 외부유전자 PCR 산물 및 내재 유전자 검출용 프라이머로 증폭된 내재유전자 PCR 산물을 포함하는 DNA 단편.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 내재 유전자 검출용 프라이머는 서열번호 18의 L554 프라이머 또는 서열번호 19의 L701 프라이머인 DNA 단편.
  4. 제 2항에 있어서, 상기 내재 유전자 검출용 프라이머는 서열번호 20의 SB1043 프라이머 또는 서열번호 21의 SB1142 프라이머인 DNA 단편.
  5. 제 2항 내지 제 4항 중 어느 한항에 따른 DNA 단편을 포함하는 플라스미드.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 플라스미드는 pUC인 플라스미드.
  7. 서열번호 14의 LTM, 서열번호 15의 EPTM, 서열번호 16의 SBTM 및 서열번호 17의 STM으로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자 조작 농산물 검출용 프로브.
  8. (a) 제 2항의 DNA 단편을 포함하는 표준물질을 유전자 조작 농산물 검출용 프로브를 반응시키고, 유전자조작 농산물 검출용 프라이머 및 농산물 내재 유전자 검출용 프라이머로 PCR하여 형광을 측정함으로써 형광량에 대한 유전자 카피수를 나타내는 표준곡선을 산출하는 단계;
    (b) 100% 유전자 조작 농산물 DNA를 (a) 단계의 방법으로 반응시킨 후 측정한 형광량을 표준곡선에 대입하여 유전자 카피수를 측정하는 단계;
    (c) 상기 (b) 단계에서 측정한 유전자 카피수를 계산식 1에 대입하여 보정계수를 산출하는 단계;
    (d) 측정대상인 농산물 또는 그의 가공품으로부터 추출한 DNA를 주형으로 상기 (a) 방법으로 반응시키고, 표준곡선에 대입하여 유전자 카피수를 측정하는 단계; 및
    (e) 상기 (d) 단계에서 측정한 유전자 카피수를 계산식 2에 대입하여 유전자 도입율을 측정하는 단계;
    를 포함하는 유전자 조작 농산물 정량방법.
    (계산식 1)
    보정계수 = 도입유전자 카피수/내재유전자 카피수
    (계산식 2)
    도입유전자 도입율(%) =
    (도입유전자 카피수/내재유전자 카피수)/보정계수 X 100
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100723069B1 (ko) * 2004-06-16 2007-05-30 대한민국 유전자 변형 옥수수에 대한 특이 프라이머, 프로브 및 표준플라스미드와 이를 이용한 정량 및 정성 분석 방법
KR100794700B1 (ko) * 2002-08-02 2008-01-14 (주)바이오니아 유전자변형농산물에 대한 유전자변형농산물 혼입률(%)의정량분석방법
WO2011074897A3 (ko) * 2009-12-17 2011-11-10 한국표준과학연구원 식물배양세포주를 이용한 표준물질의 제조방법
WO2014185741A1 (ko) * 2013-05-16 2014-11-20 한국표준과학연구원 유전자 변형체의 검정을 위한 표준 플라스미드, 이를 이용한 분석 방법 및 검정용 키트

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH11266875A (ja) * 1998-03-24 1999-10-05 House Foods Corp 害虫抵抗性遺伝子組み換え作物の検出方法およびそれに用いるプライマー
WO2000047764A2 (de) * 1999-02-08 2000-08-17 Bioinside Gmbh Testkit und verfahren zum quantitativen nachweis von gentechnisch veränderter dns in lebensmitteln mittels fluoreszenzgekoppelter pcr
KR20010086586A (ko) * 2000-03-03 2001-09-13 오미야 히사시 이종 개체 존재비율의 측정 방법
KR20010100216A (ko) * 2000-03-16 2001-11-14 박한오 유전자 변형 농산물 검출방법 및 검출용 프라이머
KR20020092034A (ko) * 2001-06-01 2002-12-11 대한민국(관리부서:농촌진흥청) 유전자변형식물에 대한 ｐｃｒ 검정용 프라이머
KR20030018218A (ko) * 2001-08-27 2003-03-06 주식회사 지디바이오텍 유전자 조작 농산물과 이의 가공품 검정용 프라이머 및검정키트

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH11266875A (ja) * 1998-03-24 1999-10-05 House Foods Corp 害虫抵抗性遺伝子組み換え作物の検出方法およびそれに用いるプライマー
WO2000047764A2 (de) * 1999-02-08 2000-08-17 Bioinside Gmbh Testkit und verfahren zum quantitativen nachweis von gentechnisch veränderter dns in lebensmitteln mittels fluoreszenzgekoppelter pcr
KR20010086586A (ko) * 2000-03-03 2001-09-13 오미야 히사시 이종 개체 존재비율의 측정 방법
KR20010100216A (ko) * 2000-03-16 2001-11-14 박한오 유전자 변형 농산물 검출방법 및 검출용 프라이머
KR20020092034A (ko) * 2001-06-01 2002-12-11 대한민국(관리부서:농촌진흥청) 유전자변형식물에 대한 ｐｃｒ 검정용 프라이머
KR20030018218A (ko) * 2001-08-27 2003-03-06 주식회사 지디바이오텍 유전자 조작 농산물과 이의 가공품 검정용 프라이머 및검정키트

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100794700B1 (ko) * 2002-08-02 2008-01-14 (주)바이오니아 유전자변형농산물에 대한 유전자변형농산물 혼입률(%)의정량분석방법
KR100723069B1 (ko) * 2004-06-16 2007-05-30 대한민국 유전자 변형 옥수수에 대한 특이 프라이머, 프로브 및 표준플라스미드와 이를 이용한 정량 및 정성 분석 방법
WO2011074897A3 (ko) * 2009-12-17 2011-11-10 한국표준과학연구원 식물배양세포주를 이용한 표준물질의 제조방법
US20120282620A1 (en) * 2009-12-17 2012-11-08 Korea Research Institute Of Standards And Science Method of Manufacturing Reference Material Using Plant Cultured Cell Lines
JP2013511980A (ja) * 2009-12-17 2013-04-11 コリア リサーチ インスティテュート オブ スタンダーズ アンド サイエンス 植物培養細胞株を利用した標準物質の製造方法
US9512492B2 (en) * 2009-12-17 2016-12-06 Korea Research Institute Of Standards And Science Method of manufacturing reference material using plant cultured cell lines
WO2014185741A1 (ko) * 2013-05-16 2014-11-20 한국표준과학연구원 유전자 변형체의 검정을 위한 표준 플라스미드, 이를 이용한 분석 방법 및 검정용 키트
US9562267B2 (en) 2013-05-16 2017-02-07 Korea Research Institute Of Standards And Science Standard plasmid for assaying genetically modified organism, and analysis method and assay kit using same

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