EA031180B1 - Способ и устройство для исследования образца на наличие или отсутствие двух или более независимых трансформантов растений или материала, полученного от них - Google Patents

Abstract

Данное изобретение относится к способам определения наличия или отсутствия двух или более независимых трансформантов растений, где указанные трансформанты характеризуются определенными генетическими признаками. Изобретение также относится к вычислительному устройству, запрограммированному для осуществления способа, и к носителю данных, который содержит инструкции, предназначенные для указанного вычислительного устройства.

Description

Данное изобретение относится к способам определения наличия или отсутствия двух или более независимых трансформантов растений, где указанные трансформанты характеризуются определенными генетическими признаками. Изобретение также относится к вычислительному устройству, запрограммированному для осуществления способа, и к носителю данных, который содержит инструкции, предназначенные для указанного вычислительного устройства.

Область техники, к которой относится изобретение

Данное изобретение относится к способам детектирования наличия или отсутствия в образце двух или более независимых трансформантов (events) или материала, происходящего от них; вычислительному устройству, для проведения этого способа и носителю данных, содержащему инструкции, предназначенные для программируемого вычислительного устройства для проведения данного способа. В частности, это изобретение обеспечивает способы, реагенты, наборы и ссылочные материалы для детектирования присутствия или отсутствия в образце генетического материала, происходящего от или могущего быть отнесенным к избранным независимым трансформантам растений (transgenic plant events).

Сведения о предшествующем уровне техники

Генетически модифицированные организмы (ГМО), в частности генетически модифицированные растения, приобретают важность в сельском хозяйстве, а также в получении и маркетинге пищевых и кормовых продуктов.

Однако, вследствие обеспокоенности в отношении действия ГМО на окружающую среду и здоровье потребителей, введение новых ГМО требует обычно регламентирующего санкционирования и, во многих странах, в том числе Европейском Союзе, пищевые и кормовые продукты, содержащие ГМО, подвергаются сами получению разрешения и обязательному маркированию (см., например, Regulation (EC) по. 1829/2003. Off J. Eur Communities: Legis. 2003, L268: 1-23; Regulation (EC) no. 1830/2003. Off J. Eur Communities: Legis. 2003, L268: 24-28).

Таким образом, отслеживание ГМО в среде и на протяжении процесса культивирования и производственной цепи пищевых и кормовых продуктов является фундаментальным для оценки опасности для окружающей среды, а также необходимым для сохранения доверия потребителей и для удовлетворения или подтверждения соблюдения обязательных предписаний, в том числе маркировки продуктов ГМО.

Это требует наличия способов, которые могут определять присутствие, идентичность и/или количество ГМО или материалов, происходящих или полученных из них, например, в пищевых и кормовых источниках, ингредиентах и/или обработанных потребительских товарах. В этом отношении очень применимы способы на основе ДНК, не в последнюю очередь потому, что ДНК часто выдерживает физические и химические технологические обработки лучше, чем другие молекулы, такие как белки. Например, полимеразная цепная реакция в реальном времени (ПЦР) оказалась специфическим и чувствительным способом для количественного определения нуклеиновых кислот, являющихся показателями присутствия ДНК, происходящей из ГМО.

Доступны анализы для недвусмысленного заключения о присутствии или отсутствии генетического материала, происходящего от независимого трансформанта растения, в образце. Обычно такие анализы могут детектировать присутствие уникальной, специфической для данной трансформации, нуклеотидной последовательности, обнаруживаемой в представляющем интерес независимом трансформанте растения, но отсутствующей в других независимых трансформантах. Например, такие отличительные нуклеотидные последовательности могут присутствовать в местах соединений между эндогенной геномной последовательностью ГМО и последовательностью трансформирующей конструкции гена в геномном сайте инсерции последнего; детектирование может, например, включать в себя ПЦР-амплификацию сквозь указанное место соединения с использованием специфических праймеров, фланкирующих это место соединения (см., например, Hernandez et al. 2003. Transgenic Res 12: 179-189; Hernandez et al. 2004. J. Cereal Sci 39: 99-107; Berdal et al. 2001. Eur Food Res Technol 213: 432-438; Nielsen et al. 2004. Eur Food Res Technol 219: 421-427; или Ronning et al. 2003. Eur Food Res Technol 216: 347-354).

Однако эти специфические для трансформантов анализы часто осуществляются с использованием дорогостоящих наборов, позволяющих лишь ограниченное количество тестов, которые ограничены детектированием материала от одного независимого трансформанта, и часто используют очень конкретные условия реакций. Однако, количество создаваемых, разрешенных и продаваемых на рынке ГМО продолжает увеличиваться. Таким образом, недвусмысленное определение состава ГМО образца может, в принципе, требовать применения неуклонно растущей совокупности отдельных специфических для этих независимых трансформантов анализов детектирования на каждом образце, что является как трудоемким, так и дорогостоящим.

Таким образом, хотя все еще является желательным использование специфических для трансформации анализов вследствие недвусмысленного характера их результата, существует потребность в использовании этих анализов более эффективным и нацеленным образом, для улучшения детектирования ГМО, например, в отношении затраты времени, стоимости и трудоемкости.

Сущность изобретения

Данное изобретение обеспечивает способы, реагенты, наборы, вычислительные устройства и ссылочные материалы, которые направлены на одну или несколько из обсуждаемых выше потребностей в данной области.

Таким образом, первым объектом (объект 1) настоящего изобретения является способ установления наличия или отсутствия двух или более независимых трансформантов, или материала, происходящего от них, в образце, где каждый независимый трансформант характеризуется одним или несколькими признаками, включающий стадии:

- 1 031180 (1) детектирование присутствия или отсутствия в этом образце одного или нескольких указанных признаков;

(2) заключение о присутствии или отсутствии в образце материала, происходящего от одного или нескольких независимых трансформантов, включающее:

(a) присваивание каждому признаку уникального значения, выбранного из простых чисел;

(b) представление каждого независимого трансформанта в виде произведения простых чисел присвоенных признакам, характеризующим данный независимый трансформант, (c) представление каждого образца в виде произведения простых чисел присвоенных признакам, которые присутствуют в данном образце, и (d) деление определенного на стадии (с) произведения, представляющего образец, на определенное на стадии (b) произведение, представляющее независимый трансформант, где если полученное при делении число будет равно 1, тогда данный независимый трансформант или материал, полученный из него, потенциально присутствует в образце;

если полученное при делении число будет целым числом больше 1, тогда данный независимый трансформант или материал, полученный из него, потенциально присутствует в образце;

если полученное при делении число будет дробным числом, тогда данный независимый трансформант или материал, полученный из него, отсутствует в образце.

В частности, данный способ может применяться для определения независимых трансформантов или материала, происходящего от них, где независимые трансформанты представляют собой независимые трансформанты растений.

В предпочтительном воплощении стадия 2 данного способа осуществляется с помощью вычислительного устройства.

Соответственно, следующим объектом настоящего изобретения (объект 2) является вычислительное устройство, запрограммированное так, чтобы осуществлять стадию (2) способа по изобретению, или ее предпочтительное воплощение.

Другим объектом настоящего изобретения (объект 3) является носитель данных, содержащий инструкции, предназначенные для программируемого вычислительного устройства для проведения стадии (2) способа по изобретению, или ее предпочтительного воплощения. В общем это изобретение обеспечивает улучшенные способы, реагенты, наборы и ссылочные материалы для детектирования материала, происходящего из ГМО, и предпочтительно из генетически модифицированных растений, в образцах.

Более конкретно, авторы изобретения выяснили, что посредством тщательного выбора признаков определенных последовательностей, которые должны быть анализированы в этом образце - где эти указанные признаки последовательности не должны быть обязательно специфическими для конкретного независимого трансформанта, и могут быть фактически общими между двумя или более независимыми трансформантами - можно сделать вывод, содержит ли этот образец потенциально материал, происходящий от одного или нескольких независимых трансформантов, или, напротив, что этот образец не содержит материала, происходящего от одного или нескольких таких независимых трансформантов. Анализы этого изобретения могут, следовательно, обеспечивать важное указание на потенциальное содержание ГМО в образце и посредством этого уменьшать количество последующих тестов (таких как специфические для трансформантов анализы), необходимых для подтверждения присутствия материала, происходящего от одного или нескольких конкретных независимых трансформантов, в этом образце; это может, в свою очередь, улучшать эффективность способов детектирования ГМО путем уменьшения стоимости, затрат времени и труда. Например, анализы этого изобретения могут позволить уменьшение количества специфических для независимых трансформантов анализов, необходимых для характеристики состава ГМО этого образца.

Авторы этого изобретения оценили скрупулезно известные, коммерчески значимые и/или разрешенные независимые трансформанты для выбора признаков, подлежащих анализу в образце, для уменьшения количества индивидуальных тест-реакций, требуемых на один образец, но все еще гарантирования достаточной информативности анализа профиля ГМО в соответствии с этим исследованием.

Таким образом, в одном особенно предпочтительном аспекте (здесь аспекте А1) это изобретение относится к способу для испытания образца на присутствие или отсутствие материала, происходящего от одного или нескольких независимых трансформантов растений, предусматривающему стадии:

(1) детектирование присутствия или отсутствия в этом образце нуклеиновых кислот, содержащих или состоящих из:

a) Zm: нуклеиновой кислоты, происходящей из таксона и специфической для таксона Zea mays, предпочтительно Zea mays ssp. mays;

b) Bn: нуклеиновой кислоты, происходящей из таксона и специфической для таксона Brassica napus;

c) Gm: нуклеиновой кислоты, происходящей из таксона и специфической для таксона Glycine max, и одной, более чем одной или всех нуклеиновых кислот, выбранных из:

d) p35S: нуклеиновой кислоты, происходящей из промотора 35S вируса мозаичной болезни цветной капусты,

- 2 031180

e) tNOS: нуклеиновой кислоты, происходящей из З'-терминатора гена нопалинсинтетазы Agrobacterium tumefaciens,

f) Cry1Ab: нуклеиновой кислоты, происходящей из гена Cry1Ab кристаллического белка Bacillus thuringiensis,

g) PAT/bar: нуклеиновой кислоты, происходящей из гена bar фосфинотрицинацетилтрансферазы (PAT) Streptomyces hygroscopicus,

h) PAT/pat: нуклеиновой кислоты, происходящей из гена pat фосфинотрицинацетилтрансферазы (PAT) Streptomyces viridochromogenes, и

i) CP4-EPSPS: нуклеиновой кислоты, происходящей из гена EPSPS 5-енолпирувилшикимат-3фосфатсинтазы из Agrobacterium sp. CP4; и (2) заключение о присутствии или отсутствии в этом образце материала, происходящего от одного или более независимых трансформантов растений, таких как независимые трансформанты, выбранные из группы, включающей или состоящей из независимых трансформантов, выбранных из независимых трансформантов Bt176, Bt11, Bt10, MON810, MON863, ТС1507, NK603, Т25, GA21, DAS-59122, их гибридов, и родственных им независимых трансформантов; независимых трансформантов Topas 19/2, MS1, RF1, RF2, RF3, MS8, GT73, Т45, Liberator pHoe6M.g GS40/90pHoe6/Ac, их гибридов, включающих в себя MS1/RF1, MS1/RF2, MS8/RF3, и родственных им независимых трансформантов; независимых трансформантов MON 40-3-2, MON89788, А2704-12, А5547-127, их гибридов, и родственных им независимых трансформантов.

Аспект А1 позволяет исследовать потенциальное присутствие или отсутствие в образце материала от многочисленных независимых трансформантов растений, принадлежащих к нескольким отдельным таксонам растений, с проведением относительно ограниченного количества стадий детектирования. Предпочтительно независимые трансформанты растений, детектируемые по способу аспекта А1, включают в себя большую часть, или даже по существу наибольшее количество, независимых трансформантов растений, разрешенных и/или коммерциализованных в настоящее время, например, в Европе, т.е. независимые трансформанты растений, которые должны встречаться, особенно вероятно, например, в окружающей среде или коммерческих образцах. Таким образом, в этом аспекте это изобретение обеспечивает не предъявляющий особенно больших требований анализ для испытания значительного спектра релевантных независимых трансформантов растений.

Предпочтительно стадия (1) аспекта А1 может включать в себя детектирование присутствия или отсутствия в образце нуклеиновых кислот, содержащих все из нуклеиновых кислот или состоящих из всех нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами а)4), определенными выше. Это выгодным образом улучшает информацию, получаемую тестированием этого образца, и позволяет сделать вывод о потенциальном присутствии или отсутствии материала, происходящего по существу от большого числа независимых трансформантов растений.

Поскольку на стадии (2) аспекта А1 предусматривается детектирование специально для конкретно существующих независимых трансформантов растений, должно быть понятно, что другие независимые трансформанты, в том числе любые будущие независимые трансформанты, которые будут генерироваться, могут также детектироваться в той степени, в какой они принадлежат к таксонам, определенным под пунктами а)-с), и содержат одну или несколько из нуклеиновых кислот, определенных под пунктами d)i). Это наблюдение относится mutatis mutandis к детектированию независимых трансформантов в любых аспектах этого изобретения, как описано в дальнейшем.

Хотя способ аспекта А1 позволяет одновременно испытывать присутствие или отсутствие в образце независимых трансформантов растений, принадлежащих, по меньшей мере, к трем различным таксонам, авторы изобретения рассматривают также адаптирование этого способа к индивидуальным таксонам. Это может выгодным образом уменьшать количество стадий детектирования нуклеиновых кислот, если требуется информация только для конкретного таксона.

Таким образом, в следующем аспекте (А2) это изобретение обеспечивает способ испытания образца на присутствие или отсутствие материала, происходящего от одного или нескольких независимых трансформантов растений кукурузы, предусматривающий стадии:

(1) детектирование присутствия или отсутствия в этом образце нуклеиновых кислот, содержащих нуклеиновые кислоты или состоящих из нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктом а), определенным выше, и одной, более чем одной или всех нуклеиновых кислот, выбранных из нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами d)-i), определенными выше; и (2) заключение о присутствии или отсутствии в этом образце материала, происходящего от одного или нескольких независимых трансформантов растений кукурузы, таких как независимые трансформанты, выбранные из группы, включающей или состоящей из Bt176, Bt11, Bt10, MON810, MON863, ТС1507, NK603, Т25, GA21, DAS-59122, их гибридов, и родственных им независимых трансформантов.

Предпочтительно стадия (1) аспекта А2 может включать в себя детектирование присутствия или отсутствия в образце нуклеиновых кислот, содержащих все из нуклеиновых кислот или состоящих из всех нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами а)4), определенными выше. Это увеличивает информацию, получаемую тестированием этого образца, и позволяет сделать вывод о потенциальном присут

- 3 031180 ствии или отсутствии материала, происходящего из сравнительно большего числа независимых трансформантов растений кукурузы.

В следующем аспекте (A3) это изобретение предоставляет способ испытания образца на присутствие или отсутствие материала, происходящего от одного или нескольких независимых трансформантов растений масличного рапса, предусматривающий стадии:

(1) детектирование присутствия или отсутствия в этом образце нуклеиновых кислот, содержащих нуклеиновые кислоты или состоящих из нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктом b), определенным выше, и одной более чем одной или всех нуклеиновых кислот, выбранных из нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами d)-i), определенными выше; и (2) заключение о присутствии или отсутствии в этом образце материала, происходящего от одного или нескольких независимых трансформантов растений масличного рапса, таких как независимые трансформанты, выбранные из группы, включающей или состоящей из независимых трансформантов Topas 19/2, MS1, RF1, RF2, RF3, MS8, GT73, Т45, Liberator рНоеб/Ас, GS40/90pHoe6/Ac, их гибридов, включающих в себя MS1/RF1, MS1/RF2, MS8/RF3, и родственных им независимых трансформантов.

Предпочтительно стадия (1) аспекта A3 может включать в себя детектирование присутствия или отсутствия в образце нуклеиновых кислот, содержащих все из нуклеиновых кислот или состоящих из всех нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами b) и d)-i), определенными выше. Это увеличивает информацию, получаемую тестированием этого образца, и позволяет сделать вывод о потенциальном присутствии или отсутствии материала, происходящего из сравнительно большего числа независимых трансформантов растений масличного рапса.

В другом предпочтительном варианте осуществления стадия (1) аспекта A3 включает в себя детектирование присутствия или отсутствия в образце нуклеиновых кислот, содержащих нуклеиновые кислоты или состоящих из нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами b) и d), e), и g)-i), определенными выше. Отмечается, что многие независимые трансформанты масличного рапса, например, независимые трансформанты, особо указанные в стадии (2) аспекта 3, могут не включать в себя нуклеиновую кислоту, указанную под пунктом f), определенным выше. Таким образом, исключение указанной нуклеиновой кислоты, указанной в перечне под пунктом f) из стадии (1) аспекта A3, может уменьшать число тестов без потери информации.

В следующем аспекте (А4) это изобретение предоставляет способ испытания образца на присутствие или отсутствие материала, происходящего от одного или нескольких независимых трансформантов растений сои, предусматривающий стадии:

(1) детектирование присутствия или отсутствия в этом образце нуклеиновых кислот, включающих нуклеиновые кислоты или состоящих из нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктом с), определенном выше, и одну, более чем одну или все нуклеиновые кислоты, выбранные из нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами d)-i), определенными выше; и (2) заключение о присутствии или отсутствии в этом образце материала, происходящего от одного или нескольких независимых трансформантов растений сои, таких как независимые трансформанты, выбранные из группы, состоящей из MON 40-3-2, MON89788, А2704-12, А5547-127, их гибридов, и родственных им независимых трансформантов.

Предпочтительно стадия (1) аспекта А4 может включать в себя детектирование присутствия или отсутствия в образце нуклеиновых кислот, включающих из нуклеиновых кислот или состоящих из всех нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами с) и d) -i), определенными выше. Это увеличивает информацию, получаемую тестированием этого образца, и позволяет сделать вывод о потенциальном присутствии или отсутствии материала, происходящего из сравнительно большего числа независимых трансформантов растений сои.

В другом предпочтительном варианте осуществления, стадия (1) аспекта А4 включает в себя детектирование присутствия или отсутствия в образце нуклеиновых кислот, содержащих нуклеиновые кислоты или состоящих из нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами с) и d), e), h) и i), определенными выше. Отмечается, что многие независимые трансформанты сои, например, независимые трансформанты, особо указанные в стадии (2) аспекта 4, могут не включать в себя нуклеиновых кислот, указанных под пунктами f) и g), определенными выше. Таким образом, исключение указанных нуклеиновых кислот, указанной в перечне под пунктами f) и g), из стадии (1) аспекта А4, может уменьшать число тестов без потери информации.

Должно быть также понятно, что дополнительные аспекты могут описывать комбинации любых двух из приведенных выше аспектов А2-А4. Например, это может выгодным образом уменьшать количество проведений тестирования в случаях, когда предполагается детектирование независимых трансформантов из выбранных таксонов.

Таким образом, в следующем аспекте (А5) это изобретение предоставляет способ для испытания образца на присутствие или отсутствие материала, происходящего от одного или нескольких независимых трансформантов растений кукурузы и/или масличного рапса, предусматривающий стадии:

(1) детектирование присутствия или отсутствия в этом образце нуклеиновых кислот, включающих нуклеиновые кислоты или состоящих из нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами а) и b), оп

- 4 031180 ределенными выше, и одной, более чем одной или всех из нуклеиновых кислот, выбранных из нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами d)-i), определенными выше; и (2) заключение о присутствии или отсутствии в этом образце материала, происходящего от одного или нескольких независимых трансформантов растений кукурузы и/или масличного рапса, таких как независимые трансформанты, выбранные из группы, включающей независимые трансформанты или состоящей из независимых трансформантов, выбранных из Bt176, Bt11, Bt10, MON810, MON863, ТС1507, NK603, Т25, GA21, DAS-59122, их гибридов, и родственных им независимых трансформантов; и независимых трансформантов Topas 19/2, MS1, RF1, RF2, RF3, MS8, GT73, Т45, Liberator pHoe6^^ GS40/90pHoe6/Ac, их гибридов, включающих в себя MS1/RF1, MS1/RF2, MS8/RF3, и родственных им независимых трансформантов.

По разъясненным выше причинам, стадия (1) аспекта А5 может предпочтительно включать в себя детектирование присутствия или отсутствия в этом образце нуклеиновых кислот, включающих все нуклеиновые кислоты или состоящих из всех нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами а), b) и d)i), определенными выше.

Еще в одном аспекте (А6) это изобретение предоставляет способ для испытания образца на присутствие или отсутствие материала, происходящего от одного или нескольких независимых трансформантов растений кукурузы и/или сои, предусматривающий стадии:

(1) детектирование присутствия или отсутствия в этом образце нуклеиновых кислот, включающих нуклеиновые кислоты или состоящих из нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами а) и с), определенными выше, и одной, более чем одной или всех из нуклеиновых кислот, выбранных из нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами d)-i), определенными выше; и (2) заключение о присутствии или отсутствии в этом образце материала, происходящего от одного или нескольких независимых трансформантов растений кукурузы и/или сои, таких как независимые трансформанты, выбранные из группы, включающей независимые трансформанты или состоящей из независимых трансформантов Bt176, Bt11, Bt10, MON810, MON863, ТС1507, NK603, Т25, GA21, их гибридов, и родственных им независимых трансформантов и независимых трансформантов MON 40-3-2, MON89788, А2704-12, А5547-127, их гибридов, и родственных им независимых трансформантов.

По разъясненным выше причинам, стадия (1) аспекта А6 может предпочтительно включать в себя детектирование присутствия или отсутствия в этом образце нуклеиновых кислот, включающих все нуклеиновые кислоты или состоящих из всех нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами а), с) и d)i), определенными выше.

Еще в одном аспекте (А7) это изобретение предоставляет способ для испытания образца на присутствие или отсутствие материала, происходящего от одного или нескольких независимых трансформантов масличного рапса и/или сои, предусматривающий стадии:

(1) детектирование присутствия или отсутствия в этом образце нуклеиновых кислот, включающих нуклеиновые кислоты или состоящих из нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами а) и b), определенными выше, и одной, более чем одной или всех из нуклеиновых кислот, выбранных из нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами d)-i), определенными выше; и (2) заключение о присутствии или отсутствии в этом образце материала, происходящего от одного или нескольких независимых трансформантов растений масличного рапса и/или сои, таких как независимые трансформанты, выбранные из группы, включающей независимые трансформанты или состоящей из независимых трансформантов Topas 19/2, MS1, RF1, RF2, RF3, MS8, GT73, T45, Liberator pHoe6/Ac, GS40/90pHoe6/Ac, их гибридов, включающих в себя MS1/RF1, MS1/RF2, MS8/RF3, и родственных им независимых трансформантов; и независимых трансформантов MON 40-3-2, MON89788, А2704-12, А5547-127, их гибридов, и родственных им независимых трансформантов.

По разъясненным выше причинам, стадия (1) аспекта А7 может предпочтительно включать в себя детектирование присутствия или отсутствия в этом образце нуклеиновых кислот, включающих все нуклеиновые кислоты или состоящих из всех нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами b), с) и d)i), определенными выше.

В другом предпочтительном варианте осуществления, стадия (1) аспекта А7 включает в себя детектирование присутствия или отсутствия в образце нуклеиновых кислот, включающих все нуклеиновые кислоты или состоящей из всех нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами b), с) и d), e) и g)-i), определенными выше, т. е. без детектирования нуклеиновой кислоты, указанной в перечне под пунктом f).

Таким образом, в одном аспекте (А8) это изобретение предоставляет способ испытания образца на присутствие или отсутствие материала, происходящего от одного или нескольких независимых трансформантов растений кукурузы и/или масличного рапса и/или сои, предусматривающий стадии:

(1) детектирование присутствия или отсутствия в этом образце нуклеиновых кислот, включающих нуклеиновые кислоты или состоящих из таких нуклеиновых кислот, как одна, более чем одна или все из нуклеиновых кислот, выбранных из нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами а), b) и с), определенными выше; и одна, более чем одна или все из нуклеиновых кислот, выбранных из нуклеиновых кислот, перечис

- 5 031180 ленных под пунктами d)-i), определенными выше; и (2) заключение о присутствии или отсутствии в этом образце материала, происходящего от одного или нескольких независимых трансформантов растений, таких как независимые трансформанты, выбранные из группы, включающей независимые трансформанты или состоящей из независимых трансформантов Bt176, Bt11, Bt10, MON810, MON863, ТС1507, NK603, Т25, GA21, DAS-59122, их гибридов, и родственных им независимых трансформантов; независимых трансформантов Topas 19/2, MS1, RF1, RF2, RF3, MS8, GT73, Т45, Liberator pHoe6Mc, GS40/90pHoe6/Ac, их гибридов, включающих в себя MS1/RF1, MS1/RF2, MS8/RF3, и родственных им независимых трансформантов; и независимых трансформантов MON 40-3-2, MON89788, А2704-12, А5547-127, их гибридов, и родственных им независимых трансформантов.

По разъясненным выше причинам, стадия (1) аспекта А8 может предпочтительно включать в себя детектирование присутствия или отсутствия в этом образце нуклеиновых кислот, включающих все нуклеиновые кислоты или состоящих из всех нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами d)-i), определенными выше.

Как объяснялось, способы описанных выше аспектов А1-А8 хорошо подходят для детектирования потенциального присутствия или отсутствия в образце материала, происходящего из независимых трансформантов растений, таких как независимые трансформанты, которые были разрешены и/или обычно использовались. Однако должно быть понятно, что указанные способы являются также выгодно гибкими и, в вариантах осуществления, позволяют лучшим образом оценивать присутствие или отсутствие материала, происходящего из дополнительных независимых трансформантов, таких как независимые трансформанты, не описанные особо в стадии 2 описанных выше аспектов А1-А9. Таким образом, это позволяет собирать даже больше информации в отношении состава этого образца.

Таким образом, в вариантах, стадия (1) любого из аспектов А1, А2, А5, А6 или А8 может дополнительно содержать детектирование присутствия или отсутствия в образце нуклеиновой кислоты j) mCry3A: нуклеиновой кислоты, происходящей из модифицированного гена Cry3A кристаллического белка Bacillus thuringiensis; и группа независимых трансформантов, определенная на стадии (23) любого из соответствующих аспектов, дополнительно содержит независимый трансформант кукурузы MIR604, его гибриды с другими независимыми трансформантами кукурузы и независимые трансформанты, родственными MIR604.

В дополнительных вариантах осуществления стадия (1) любого из вышеописанных аспектов А1, А2, А5, А6 или А8 может дополнительно включать в себя детектирование присутствия или отсутствия в образце одной или обеих нуклеиновых кислот k) cordapA: нуклеиновой кислоты, происходящей из гена cordapA не чувствительной к лизину дигидродипиколинатсинтазы (cDHDPS) Corynebacterium glutamicum, и/или 1) Glb1: нуклеиновой кислоты, происходящей из промотора Glb1 кукурузы; и группа независимых трансформантов, определенных в стадии (2) любого из соответствующих аспектов, дополнительно содержит независимый трансформант кукурузы LY038, его гибриды с другими независимыми трансформантами кукурузы, и независимые трансформанты, родственные LY038.

В дополнительных вариантах осуществления стадия (1) любого из вышеописанных аспектов А1, А2, А5, А6 или А8 может дополнительно включать в себя детектирование присутствия или отсутствия в образце нуклеиновой кислоты m) Cry3Bb1: нуклеиновой кислоты, происходящей из гена Cry3Bb1 кристаллического белка Bacillus thuringiensis; и группа независимых трансформантов, определенная в стадии (2) любого из соответствующих аспектов, дополнительно содержит независимый трансформант кукурузы MON88017, его гибриды с другими независимыми трансформантами кукурузы, и независимые трансформанты, родственные MON88017.

Соответственно, стадия (1) любого из вышеописанных аспектов А1, А2, А5, А6 или А8 может дополнительно включать в себя детектирование присутствия или отсутствия в образце одной, более чем одной или всех нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами j)-m), определенными выше; и группа независимых трансформантов, определенных в стадии (2) любого из соответствующих аспектов, может дополнительно содержать одно, более чем одно или все из независимых трансформантов кукурузы MIR604, LY038 и MON88017, их гибриды с другими независимыми трансформантами кукурузы, и независимые трансформанты, родственные им. Однако, поскольку детектирование соответствующих нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами j)-m), определенными выше, может обеспечивать улучшенное детектирование присутствия материала из независимых трансформантов кукурузы MIR604, LY038 и/или MON88017 в этом образце, детектирование нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами d)-i), определенными выше, позволяет уже сделать выводы относительно потенциального присутствия материала из указанных независимых трансформантов MIR604, LY038 и/или MON88017 в образце (см. также табл. 3).

В вариантах осуществления, стадия (1) любого из вышеописанных аспектов А1, А2, А5, А6 или А8 может дополнительно включать в себя детектирование присутствия или отсутствия в образце нуклеиновой кислоты n) Bxn: нуклеиновой кислоты, происходящей из гена Bxn нитрилазы Klebsiella pneumoniae ssp. ozaenae; и группа независимых трансформантов, определенных в стадии (2) любого из соответствующих аспектов, дополнительно содержит независимый трансформант масличного рапса OXY235, его

- 6 031180 гибриды с другими независимыми трансформантами в масличном рапсе, и независимые трансформанты, родственные OXY235. Однако, поскольку детектирование нуклеиновой кислоты, указанной под пунктом (n), определенным выше, может обеспечивать улучшенное детектирование присутствия материала из независимых трансформантов масличного рапса OXY235 в этом образце, детектирование нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами d)-i), определенными выше, позволяет уже сделать выводы относительно потенциального присутствия материала из указанного независимого трансформанта OXY235 в образце (см. табл. 3).

Таким образом, в одном аспекте (А9) это изобретение предоставляет способ испытания образца на присутствие или отсутствие материала, происходящего от одного или нескольких независимых трансформантов растений кукурузы и/или масличного рапса и/или сои, предусматривающий стадии:

(1) детектирование присутствия или отсутствия в этом образце нуклеиновых кислот, включающих нуклеиновые кислоты или состоящих из таких нуклеиновых кислот, как одна, более чем одна или все из нуклеиновых кислот, выбранных из нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами а), b) и с), определенными выше; и одна, более чем одна или все из нуклеиновых кислот, выбранных из нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами d)-i), определенными выше; и необязательно, одна, более чем одна или все из нуклеиновых кислот, выбранных из нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами j)-n), определенными выше; и (2) заключение о присутствии или отсутствии в этом образце материала, происходящего от одного или нескольких независимых трансформантов растений, таких как независимые трансформанты, выбранные из группы, включающей независимые трансформанты или состоящей из независимых трансформантов Bt176, Bt11, Bt10, MON810, MON863, ТС1507, NK603, Т25, GA21, DAS-59122, MIR604, LY038 и MON88017, их гибридов, и родственных им независимых трансформантов; независимых трансформантов Topas 19/2, MS1, RF1, RF2, RF3, MS8, GT73, Т45, Liberator pHoe6/Ac, GS40/90pHoe6/Ac, OXY235, их гибридов, включающих в себя MS1/RF1, MS1/RF2, MS8/RF3, и родственных им независимых трансформантов; и независимых трансформантов MON 40-3-2, MON89788, А2704-12, А5547-127, их гибридов, и родственных им независимых трансформантов.

По разъясненным выше причинам, стадия (1) аспекта А9 может предпочтительно включать в себя детектирование присутствия или отсутствия в этом образце нуклеиновых кислот, включающих все нуклеиновые кислоты или состоящих из всех нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами d)-i), определенными выше.

Таким образом, в следующих предпочтительных вариантах осуществления, способы вышеописанных аспектов А1-А8 могут дополнительно оценивать также потенциальное присутствие или отсутствие в образцах материала, происходящего из независимых трансформантов, которые относятся к другим таксонам.

Таким образом, в вариантах осуществления, стадия (1) любого из вышеописанных аспектов А1-А8 (или вышеописанных вариантов осуществления указанных аспектов) может дополнительно включать в себя детектирование присутствия или отсутствия в образце нуклеиновой кислоты о) Or: нуклеиновой кислоты, происходящей из таксона и специфической для таксона Oryza sativa; и группа независимых трансформантов, определенная в стадии (2) любого из соответствующих аспектов, дополнительно включает один, более одного или всех независимых трансформантов риса LL62, LL06 и LL601, их гибридов, и родственных им независимых трансформантов.

В дополнительных вариантах осуществления стадия (1) любого из вышеописанных аспектов А1-А8 (или вышеописанных вариантах осуществления указанных аспектов) дополнительно включает в себя детектирование присутствия или отсутствия в образце нуклеиновой кислоты р) Bv: нуклеиновой кислоты, происходящей из таксона и специфической для таксона Beta vulgaris; и группа независимых трансформантов, определенная в стадии (2) любого из соответствующих аспектов, дополнительно включает один, более одного или все независимые трансформанты в сахарной свекле Т120-7, Н7-1 и А5-15, их гибриды, и родственные им независимые трансформанты.

В дополнительных вариантах осуществления, стадия (1) любого из вышеописанных аспектов А1-А8 (или вышеописанных вариантов осуществления указанных аспектов) может дополнительно включать в себя детектирование присутствия или отсутствия в образце нуклеиновой кислоты q) Gs: нуклеиновой кислоты, происходящей из таксона и специфической для таксона Gossypium; и группа независимых трансформантов, определенная в стадии (2) любого из соответствующих аспектов, дополнительно включает один, более одного или все независимые трансформанты хлопчатника LL cotton 25, MON 1445, MON 531, MON15985, их гибриды, и родственные им независимые трансформанты.

В дополнительном развитии, стадия (1) любого из вариантов осуществления предыдущего абзаца может дополнительно включать в себя детектирование присутствия или отсутствия в образце одной или обеих из нуклеиновых кислот r) Cry1Ac: нуклеиновой кислоты, происходящей из гена Cry1Ac кристаллического белка Bacillus thuringiensis, и/или s) Cry2Ab2: нуклеиновой кислоты, происходящей из гена Cry2Ab2 кристаллического белка Bacillus thuringiensis; и группа независимых трансформантов, определенная в стадии (2), может особенно хорошо детектировать одно или оба из независимых трансформан

- 7 031180 тов в хлопчатнике MON 531, MON15985, их гибриды с другими независимыми трансформантами в хлопчатнике, и родственные им независимые трансформанты.

В других дополнительных вариантах осуществления, стадия (1) любого из вышеописанных аспектов А1-А8 (или вышеописанных вариантов осуществления указанных аспектов) может дополнительно включать в себя детектирование присутствия или отсутствия в образце нуклеиновой кислоты t) St: нуклеиновой кислоты, происходящей из таксона и специфической для таксона Solarium tuberosum; и группа независимых трансформантов, определенная в стадии (2) любого из соответствующих аспектов, дополнительно включает независимую трансформацию в картофеле ЕН92-527-1 и родственные ему независимые трансформанты.

В дополнительном развитии стадия (1) любого из вариантов осуществления предыдущего абзаца может дополнительно включать в себя детектирование присутствия или отсутствия в образце нуклеиновой кислоты u) GBSS: нуклеиновой кислоты, происходящей из гена Gbss связанной с гранулами крахмалсинтазы Solarium tuberosum, что дополнительно улучшает достоверность детектирования материала из указанного независимого трансформанта ЕН92-527-1.

Должно быть понятно, что предыдущие способы могут выполняться в различных подходящих комбинациях, позволяющих детектировать желаемые независимые трансформанты растений и уменьшающих прилагаемые усилия.

Таким образом, в одном аспекте (А10) это изобретение предоставляет способ испытания образца на присутствие или отсутствие материала, происходящего от одного или нескольких независимых трансформантов растений кукурузы и/или масличного рапса и/или сои и/или риса и/или сахарной свеклы и/или хлопчатника и/или картофеля, предусматривающий стадии:

(1) детектирования присутствия или отсутствия в этом образце нуклеиновых кислот, включающих нуклеиновые кислоты или состоящих из таких нуклеиновых кислот, как одна, более чем одна или все из нуклеиновых кислот, выбранных из нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами а), b), с), о), р), q) и t), определенными выше; и одна, более чем одна или все из нуклеиновых кислот, выбранных из нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами d)-i), определенными выше; и необязательно, одна, более чем одна или все из нуклеиновых кислот, выбранных из нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами j)-n), r), s) и u) определенными выше; и (2) заключения о присутствии или отсутствии в этом образце материала, происходящего от одного или нескольких независимых трансформантов растений, таких как независимые трансформанты, выбранные из группы, включающей независимые трансформанты или состоящей из независимых трансформантов Bt176, Bt11, Bt10, MON810, MON863, ТС1507, NK603, Т25, GA21, DAS-59122, MIR604, LY038 и MON88017, их гибридов, и родственных им независимых трансформантов; независимых трансформантов Topas 19/2, MS1, RF1, RF2, RF3, MS8, GT73, T45, Liberator pHoe6/Ac, GS40/90pHoe6/Ac, OXY235, их гибридов, включающих в себя MS1/RF1, MS1/RF2, MS8/RF3, и родственных им независимых трансформантов; и независимых трансформантов MON 40-3-2, MON89788, А2704-12, А5547-127, их гибридов, и родственных им независимых трансформантов; независимых трансформантов LL62, LL06 и LL601, их гибридов, и родственных им независимых трансформантов; независимых трансформантов Т120-7, Н7-1 и А5-15, их гибридов, и родственных им независимых трансформантов; независимых трансформантов LL cotton 25, MON 1445, MON 531, MON15985, их гибридов, и родственных им независимых трансформантов.

По разъясненным выше причинам, стадия (1) аспекта А10 может предпочтительно включать в себя детектирование присутствия или отсутствия в этом образце нуклеиновых кислот, включающих все нуклеиновые кислоты или состоящих из всех нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами d)-i), определенными выше.

В одном родственном предпочтительном аспекте (A11) это изобретение предоставляет способ испытания образца на присутствие или отсутствие материала, происходящего от одного или нескольких независимых трансформантов растений кукурузы и/или масличного рапса и/или сои и/или риса и/или сахарной свеклы и/или хлопчатника и/или картофеля, предусматривающий стадии:

(1) детектирование присутствия или отсутствия в этом образце нуклеиновых кислот, содержащих нуклеиновые кислоты или состоящих из таких нуклеиновых кислот, как одна, более чем одна или все из нуклеиновых кислот, выбранных из нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами а), b), с), о), р), q) и t), определенными выше; и одна, более чем одна или все из нуклеиновых кислот, выбранных из нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами d)-i), определенными выше; определенными выше; и (2) заключение о присутствии или отсутствии в этом образце материала, происходящего от одного или нескольких независимых трансформантов растений, таких как независимые трансформанты, выбранные из группы, включающей независимые трансформанты или состоящей из независимых трансформантов Bt176, Bt11, Bt10, MON810, MON863, ТС1507, NK603, Т25, GA21, DAS-59122, необязательно MIR604, LY038 и MON88017, их гибридов, и родственных им независимых трансформантов; независимых трансформантов Topas 19/2, MS1, RF1, RF2, RF3, MS8, GT73, Т45, Liberator pHoe6M^,

- 8 031180

GS40/90pHoe6/Ac, необязательно OXY235, их гибридов, включающих в себя MS1/RF1, MS1/RF2, MS8/RF3, и родственных им независимых трансформантов; независимых трансформантов MON 40-3-2, MON89788, А2704-12, А5547-127, их гибридов, и родственных им независимых трансформантов; независимых трансформантов LL62, LL06 и LL601, их гибридов, и родственных им независимых трансформантов; независимых трансформантов Т120-7, Н7-1 и А5-15, их гибридов, и родственных им независимых трансформантов; независимых трансформантов LL cotton 25, MON 1445, MON 531, MON15985, их гибридов, и родственных им независимых трансформантов.

По разъясненным выше причинам, стадия (1) аспекта А11 может предпочтительно включать в себя детектирование присутствия или отсутствия в этом образце нуклеиновых кислот, включающих все нуклеиновые кислоты или состоящих из всех нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами d)-i).

Предпочтительно в любом из вышеописанных аспектов А1 - A11 или любом варианте осуществления указанных аспектов присутствие или отсутствие нуклеиновых кислот в образце детектируют с использованием амплификации ампликонов, содержащихся в соответствующих нуклеиновых кислотах, например, предпочтительно с использованием ПЦР и, более предпочтительно, с использованием ПЦР в реальном времени.

Для возможности эффективного применения ПЦР-амплификации в вышеописанных способах авторы данного изобретения проводили скрупулезный поиск на праймеры и пары праймеров и тестировали праймеры и пары праймеров таким образом, чтобы выбрать праймеры, особенно предпочтительные в указанных способах.

Идентифицированные предпочтительные пары праймеров приведены в списке в табл. 1. Они влекут за собой inter alia следующие существенные преимущества. Эти праймеры проявляют по существу одну и ту же или достаточно сходную температуру отжига, позволяя посредством этого выполнять ПЦРамплификацию на различных нуклеиновых кислотах при одних и тех же температурных условиях циклов и, следовательно, в одном и том же устройстве. Это в значительной степени облегчает достижение высокой производительности этих способов и уменьшает количество прилагаемого труда, расходных материалов и устройств. Эти пары праймеров продуцируют ампликоны приблизительно 100 п. н. и посредством этого позволяют амплифицировать нуклеиновые кислоты-мишени даже из образцов, в которых генетический материал в значительной степени фрагментирован, как это может иметь место в случае обработанных пищевых или кормовых продуктов. Эти праймеры и пары праймеров обнаруживают достаточную специфичность амплификации, а также чувствительность, подходящую для амплификации в реальном времени. Кроме того, для гарантии чувствительности и однородности способов и наборов, обеспечиваемых этим изобретением, эти праймеры и пары праймеров были сконструированы таким образом, что они генерируют, при 40 циклах и с использованием 10000 копий матрицы, флуоресценцию, по меньшей мере, 2500 относительных единиц флуоресценции (RFU), причем генерированные таким образом величины флуоресценции для различных наборов праймеров лежат приблизительно в 3-кратном пределе. Кроме того, каждая пара праймеров была сконструирована таким образом, что она выполняет амплификацию на соответствующих нуклеиновых кислотах по существу из всех представляющих интерес независимых трансформантов, несмотря на существование потенциальных несоответствий последовательности (например, вследствие оптимизированной частоты использования кодонов) в указанных нуклеиновых кислотах между такими независимые трансформантами.

- 9 031180

Таблица 1 Предпочтительные пары праймеров для детектирования нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами a)-i), о), р), q) и t), определенными выше, при помощи ПЦР

Нуклеиновая кислотамишень	Праймеры
Zm	Прямой: 5' TCTCTTCCTCCTTTAGAGCTACCACTA 3' (SEQ ID NO: 56) Обратный: 5' AATCGATCCAAAGCGAGATGA 3' (SEQ ID NO: 57)
Bn	Прямой: 5' CAGCTCAACAGTTTCCAAACGA 3' (SEQ ID NO: 24) Обратный: 5' CGACCAGCCTCAGCCTTAAG 3' (SEQ ID NO: 25)
Gm	Прямой: 5' AACCGGTAGCGTTGCCAG 3' (SEQ ID NO: 58) Rev': 5' AGCCCATCTGCAAGCCTTT 3' (SEQ ID NO: 59)
p35S	Прямой: 5' AAAGCAAGTGGATTGATGTGATA 3' (SEQ ID NO: 60) Обратный: 5' GGGTCTTGCGAAGGATAGTG 3' (SEQ ID NO: 61)
tNOS	Прямой: 5'-GATTAGAGTCCCGCAATTATACATTTAA-3' (SEQ ID NO: 9) Обратный: 5'-TTATCCTAGKTTGCGCGCTATATTT-3' (SEQ ID NO: 10)
CrylAb	Прямой: 5'-ACCGGTTACACTCCCATCGA-3' (SEQ ID NO: 11) Обратный: 5'-CAGCACCTGGCACGAACTC-3' (SEQ ID NO: 12)
PAT/bar	Прямой: 5'-CGTCAACCACTACATCGAGACAA-3' (SEQ ID NO: 13) Обратный: 5'-GTCCACTCCTGCGGTTCCT-3' (SEQ ID NO: 14)
PAT/pat	Прямой: 5'-CCGCGGTTTGTGATATCGTT-3' (SEQ ID NO: 15) Обратный: 5'-TCTTGCAACCTCTCTAGATCATCAA-3' (SEQ ID NO: 16)
CP4-EPSPS	Прямой: 5’ GCATGCTTCACGGTGCAA 3’ (SEQ ID NO: 22) Обратный: 5' GGACCTGTGGGAGATAGACTTGTC 3' (SEQ ID NO: 23) Rev 1: 5' TGAAGGACCGGTGGGAGAT 3' (SEQ ID NO: 62) Rev 2: 5' TGAAGGACCTGTGGGAGAT 3' (SEQ ID NO: 63)
Or	Fwd': 5' GCTTAGGGAACAGGGAAGTAAAGT 3' (SEQ ID NO: 51) Обратный: 5' CTTAGCATAGTCTGTGCCATCCA 3' (SEQ ID NO: 21)
Bv	Прямой: 5' GACCTCCATATTACTGAAAGGAAG 3' (SEQ ID NO: 64) Обратный: 5' GAGTAATTGCTCCATCCTGTTCA 3' (SEQ ID NO: 65)
Gs	Прямой: 5' AGTTTGTAGGTTTTGATGTTACATTGAG 3' (SEQ ID NO: 66) Обратный: 5' GCATCTTTGAACCGCCTACTG 3' (SEQ ID NO: 67)
St	Прямой: 5' GGACATGTGAAGAGACGGAGC 3' (SEQ ID NO: 68) Обратный: 5' CCTACCTCTACCCCTCCGC 3' (SEQ ID NO: 69)

Таким образом, это изобретение обеспечивает способы, определенные в любом из вышеописанных аспектов А1-А11 или в любом варианте осуществления указанных аспектов, в которых присутствие или отсутствие нуклеиновых кислот из нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами а)4), о), р), q) и t), определенными выше, в образце детектируют при помощи ПЦР-амплификации с использованием соответствующих пар праймеров, показанных в табл. 1.

Когда табл. 1 приводит более чем один прямой и/или обратный праймер для амплификации на определенной нуклеиновой кислоте (например, для CP4-EPSPS), любой один или любая комбинация указанных прямых праймеров могут быть использованы с любым одним или с любой комбинацией указанных обратных праймеров для получения амплификации.

Следует понимать, что, хотя последовательности праймеров, перечисленных в табл. 1, были усовершенствованы для обеспечения оптимальной амплификации, данные способы могут работать адекватно при использовании вариантных праймеров, которые проявляют определенную ограниченную степень вариации последовательности относительно праймеров в табл. 1.

Таким образом, вышеописанные аспекты и варианты осуществления включают в себя также способы, в которых представляющие интерес нуклеиновые кислоты детектируют ПЦР-амплификацией с использованием вариантных праймеров, которые включают в себя одну или несколько вариаций последовательности относительно соответствующих праймеров, перечисленных в табл. 1, такие как, например, одна или несколько делеций, инсерций и/или замен, пока такие вариантные праймеры/пары праймеров все еще могут приводить к адекватной амплификации их соответствующих ампликонов. Предпочтительно такие вариантные праймеры могут обнаруживать по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, даже более предпочтительно по меньшей мере 95% и даже еще более предпочтительно по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность последовательности с праймерами, перечисленными в табл. 1. Сопоставления последовательностей и определение идентичности последовательностей может выполняться, например, с использованием Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) первоначально описанного Altschul et al. 1990 (J. Mol. Biol. 215: 403-10), например, алгоритма Blast 2 sequences, описанного Tatusova and Madden 1999 (FEMS Microbiol Lett 174: 247-250).

Кроме того, должно быть понятно, что праймеры, перечисленные в табл. 1, или их варианты могут быть выгодным образом дериватизованы. Например, указанные праймеры или их варианты могут быть помечены для возможности детектирования амплифицированных продуктов, например, в применениях ПЦР в реальном времени. Таким образом, подобная дериватизация может, например, приводить к введению одной или нескольких меченых частей и одной или нескольких вспомогательных частей молекулы (например, гасящую часть, часть FRET и т.д.), и необязательно, если требуется, модификации последовательности праймера для создания возможности введения и/или правильной работы указанной части или

- 10 031180 частей молекулы. Квалифицированный в данной области специалист обычно знаком со способами модификации праймеров и пар праймеров для целей мечения. Применение дериватизованных таким образом праймеров и пар праймеров может быть особенно полезным в ПЦР в реальном времени и, в частности, когда в мультиплексных реакциях амплификации должны прослеживаться два или более меченых продукта амплификации.

Таким образом, вышеописанные аспекты и варианты осуществления включают в себя также способы, в которых представляющие интерес нуклеиновые кислоты детектируют при помощи ПЦРамплификации с использованием производных праймеров и пар праймеров, перечисленных в табл. 1, или их вариантов.

В качестве примера, в одном предпочтительном аспекте (А12), это изобретение предоставляет способ испытания образца на присутствие или отсутствие материала, происходящего от одного или нескольких независимых трансформантов растений (в частности, одного или нескольких независимых трансформантов растений кукурузы и/или масличного рапса и/или сои и/или риса и/или сахарной свеклы и/или хлопчатника и/или картофеля), предусматривающий стадии:

(1) детектирование присутствия или отсутствия в этом образце нуклеиновых кислот, включающих нуклеиновые кислоты или состоящих из таких нуклеиновых кислот, как одна, более чем одна или все из нуклеиновых кислот, выбранных из нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами а), b), с), о), р), q) и t), определенными выше; и одна, более чем одна или все из нуклеиновых кислот, выбранных из нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами d)-i), определенными выше; и (2) заключение о присутствии или отсутствии в этом образце материала, происходящего от одного или нескольких независимых трансформантов растений, таких как независимые трансформанты, выбранные из группы, включающей независимые трансформанты или состоящей из независимых трансформантов Bt176, Bt11, Bt10, MON810, MON863, ТС1507, NK603, Т25, GA21, DAS-59122, необязательно MIR604, LY038 и MON88017, их гибридов, и родственных им независимых трансформантов; независимых трансформантов Topas 19/2, MS1, RF1, RF2, RF3, MS8, GT73, T45, Liberator pHoe6^^ GS40/90pHoe6/Ac, необязательно OXY235, их гибридов, включающих в себя MS1/RF1, MS1/RF2, MS8/RP3, и родственных им независимых трансформантов; независимых трансформантов MON 40-3-2, MON89788, А2704-12, А5547-127, их гибридов, и родственных им независимых трансформантов; независимых трансформантов LL62, LL06 и LL601, их гибридов, и родственных им независимых трансформантов; независимых трансформантов Т120-7, Н7-1 и А5-15, их гибридов, и родственных им независимых трансформантов; независимых трансформантов LL cotton 25, MON 1445, MON 531, MON15985, их гибридов, и родственных им независимых трансформантов, где на стадии (1) присутствие или отсутствие нуклеиновых кислот в образце детектируют при помощи ПЦР-амплификации с использованием соответствующих праймеров и пар праймеров, показанных в табл. 1, или их вариантов или производных.

По разъясненным выше причинам, стадия (1) аспекта А12 может предпочтительно включать в себя детектирование присутствия или отсутствия в этом образце нуклеиновых кислот, включающих все нуклеиновые кислоты или состоящих из всех нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами d)-i), определенными выше. В одном предпочтительном варианте осуществления стадия (1) аспекта А12 может предпочтительно включать в себя детектирование присутствия или отсутствия в этом образце нуклеиновых кислот, включающих все нуклеиновые кислоты или состоящих из всех нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами а)4), определенными выше.

В одном аспекте это изобретение дополнительно обеспечивает праймеры и пары праймеров и их варианты или производные, подходящие для амплификации ампликонов из нуклеиновых кислот, включающих нуклеиновые кислоты или состоящих из нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами а)u), определенными выше. В частности, ввиду значительных усилий, вложенных авторами этого изобретения в идентификацию пар праймеров, перечисленных в табл. 1, это изобретение обеспечивает праймеры и пары праймеров, перечисленные в табл. 1, а также их варианты и производные, необязательно в любой подходящей комбинации указанных праймеров и/или пар праймеров или их вариантов или производных.

Кроме того, это изобретение обеспечивает также продукты амплификации, получаемые с использованием предпочтительных праймеров и пар праймеров, векторы и плазмиды, содержащие указанные продукты амплификации, и рекомбинантые микроорганизмы, трансформированные указанными векторами и плазмидами и несущие указанные векторы и плазмиды.

Таким образом, в предпочтительных вариантах осуществления это изобретение относится также к рекомбинантной Е. coli, депонированной согласно Будапештскому договору Belgian Coordinated Collections of Microorganisms (BCCM), Laboratorium voor Moleculaire Biologie - Plasmidencollectie (BCCM/LMBP) (Universiteit Gent, Technologiepark 927, B-9052 Gent-Zwijnaarde, Belgium) 10 января 2007 года под номерами доступа LMBP: LMBP 5452, LMBP 5453, LMBP 5454, LMBP 5455, LMBP 5456, LMBP 5457, LMBP 5458, LMBP 5459 и LMBP 5460, 6 марта 2007 года под номером доступа 5451 и 19 апреля 2007 года под номерами доступа LMBP: LMBP 5587, LMBP 5588, LMBP 5589 и LMBP 5590, a также к

- 11 031180 выделенным рекомбинантным плазмидам, получаемым из указанной рекомбинантной Е. coli, а также к выделенным вставкам из указанных плазмид, предпочтительно выделенным вставкам EcoRI-EcoRI.

Такие плазмиды или векторы или их вставки и их комбинации особенно применимы в качестве положительных контролей, эталонов и/или калибраторов для соответствующих ампликонов в реакциях амплификации вышеописанных способов.

Кроме того, это изобретение относится также к наборам, содержащим один или несколько реагентов, применимых в способах одного или нескольких вышеописанных аспектов и вариантов. Например, такие наборы могут содержать один или несколько из вышеописанных праймеров и/или пар праймеров, в частности, перечисленных в табл. 1, или вариантов или производных указанных праймеров, и/или один или несколько вышеописанных продуктов амплификации, векторов или плазмид, содержащих их, или вставки из указанных векторов или плазмид и/или носитель данных, содержащий инструкции для программируемого устройства для проведения стадии (2) способов этого изобретения (см. ниже). Такие наборы могут предпочтительно дополнительно содержать инструкции для пользователя в отношении выполнения способов этого изобретения и для интерпретации получаемых таким образом данных.

Это изобретение описывает также несложный и прямой способ выполнения стадии (2) вышеописанных аспектов и вариантов, т. е. для заключения о потенциальном присутствии или отсутствии в образце материала, происходящего из различных представляющих интерес независимых трансформантов растений. В частности, результаты, получаемые для образца в стадии (1) вышеописанных аспектов и вариантов, представлены в виде набора G_sam, состоящего из нуклеиновых кислот, т.е. представляющего коллекцию нуклеиновых кислот, выбранных из нуклеиновых кислот, включающих нуклеиновые кислоты или состоящих из нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами а)-и) выше, которые были детектированы в указанной стадии (1) как присутствующие в этом образце (стадии i)).

Кроме того, любой представляющее интерес независимый трансформант растения может быть представлено в виде набора G_x (где X обозначает представляющее интерес независимую трансформацию), состоящего из нуклеиновых кислот, т.е. представляющего коллекцию нуклеиновых кислот, выбранных из нуклеиновых кислот, содержащих нуклеиновые кислоты или состоящих из нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами а)-и) выше, которые были обнаружены в указанном независимом трансформанте, следовательно, могут быть детектированы в стадии (1), если этот образец содержал материал, происходящий из указанного независимого трансформанта, или гибрид, включающий в себя такой или родственный независимый трансформант (стадии (ii)).

В конкретном примерном варианте осуществления, набор G_x может предпочтительно быть выбран из наборов, представляющих независимые трансформанты, конкретно описанные выше, например, содержащих наборы: наборы независимых трансформантов в кукурузе G_Bt176 е {Zm; p35S; CrylAb; PAT/bar}, GBt11, е {Zm; p35S; tNOS; Cry1Ab; PAT/pat}, Gbuo е {Zm; p35S; tNOS; Cry1Ab; PAT/pat}, G_moN810 е {Zm; p35S; tNOS; Cry1Ab}, GMON₈₆₃ е {Zm; p35S; tNOS}, G_TC1507 е {Zm; p35S; PAT/pat}, Gnk603 е {Zm; p35S; tNOS; CP4-EPSPS}, Gt25 е {Zm; p35S; PAT/pat}, Gga21 е {Zm; tNOS}, Gdas_-59122 е {Zm; p35S; PAT/bar}, G_MIR604 е {Zm; tNOS; mCry3A}, G_LY038 е {Zm; p35S; tNOS; cordapA; Glb1} и G_MoN88017 е {Zm; p35S; tNOS; CP4-EPSPS; Cry3Bb1}, наборы независимых трансформантов в масличном рапсе G_{Topas 19/2} е {Bn; p35S; PAT/pat}, G_MS1 е {Bn; tNOS; PAT/bar}, G_RF1 е {Bn; tNOS; PAT/bar}, G_RF2 е {Bn; tNOS; PAT/bar}, G_mS1/RF1 е {Bn; tNOS; PAT/bar}, G_mS1/RF2 е {Bn; tNOS; PAT/bar}, G_MS8 е {Bn; tNOS; PAT/bar}, G_RF3 е {Bn; tNOS; PAT/bar}, G_MS8/RF3 е {Bn; tNOS; PAT/bar}, G_GT73 е {Bn; CP4-EPSPS}, G_T45 е ^{Bn; p^35S; ^T/pitt}, ^GLiberator pHoe6/AC ^{е {Bn; p35S; PAT/pat}, G}GS4090PHoe6/Ac ^{е {Bn; p35S; PAT/pat}, G}OXY235 е {Bn; p35S; Bxn}; наборы независимых трансформантов в сое G_MoN40-3-2 е {Gm; p35S; tNOS; CP4EPSPS}, Gmon89788 е {Gm; CP4-EPSPS}, Ga2704_-12 е {Gm; p35S; PAT/pat} и Ga5547_-127 е {p35S; PART/pat}, наборы независимых трансформантов в рисе G_LL62 е {Or; p35S; PAT/bar}, G_LL06 е {Or; p35S; PAT/bar} и G_LL601 е {Or; p35S; tNOS; PAT/bar}, наборы независимых трансформантов в сахарной свекле G_T120-7 е {Bv; p35S; PAT/pat}, Gh7-1 е {Bv; p35S; CP4-EPSPS} и Ga5-15 е {Bv; p35S; tNOS; CP4-EPSPS}, наборы независимых трансформантов в хлопчатнике G_ll cotton 25 е {Gs; p35S; tNOS; PAT/bar}, G_moN1445 е {Gs; p35S; tNOS; CP4-EPSPS}, G_moN531 е {Gs; p35S; tNOS; cry1Ac} и G_moN15985 е {Gs; p35S; tNOS; cry1Ac; cry2Ab2} и набор независимых трансформантов в картофеле G_EH92-527-1 е {St; tNOS; Gbss}; где обозначения между скобками {} относятся к нуклеиновым кислотам, перечисленным под пунктами а)-и) выше, которые обнаружены в таких независимых трансформантах и могут быть, следовательно, детектированы в материалах, происходящих из них. Должно быть понятно, что, если стадия детектирования (1) включает в себя дополнительные нуклеиновые кислоты, другие, чем нуклеиновые кислоты, перечисленные под пунктами а)-и) выше, такие нуклеиновые кислоты могут быть предпочтительно включены в вышеописанные наборы.

Должно быть понятно, что, когда вышеописанные способы не тестируют присутствие всех нуклеиновых кислот под пунктами а)-и) выше, этот набор образцов, а также наборы независимых трансформантов могут быть определены на основе нуклеиновых кислот, присутствие которых эффективно тестируется. В качестве примера, но не ограничения, если присутствие нуклеиновых кислот, перечисленных под

- 12 031180 пунктами j)-n), r) s) и u), определенными выше, которые соответствуют специфическим признакам, наряду с нуклеиновыми кислотами, определенными под пунктами d)-i), не тестируется, то наборы, соответствующие нескольким независимым трансформантам, могут быть определены в более узких рамках, в частности, наборы независимых трансформантов в кукурузе G_miR604 е {Zm; tNOS}, G_Lyo3s е {Zm; p35S; tNOS}, G_mON88017 е {Zm; p35S; tNOS; CP4-EPSPS}; наборы независимых трансформантов в масличном рапсе G_OXY235={Bn; p35S}; наборы независимых трансформантов в хлопчатнике G_mON531 е {Gs; p35S; tNOS}, G_mON15985={Gs; p35S; tNOS}; и наборы независимых трансформантов в картофеле G_EH92-527-1 е {St; tNOS}.

Таким образом, присутствие материала, происходящего из представляющего интерес независимого трансформанта X в этом образце, может быть затем определено проведением логических операций для соответствующего представляющего интерес набора G_x следующим образом (стадии iii):

если G_x равен G_sam (G_x=G_sam), то материал, происходящий из независимого трансформанта X или из его гибрида, или из родственного ему независимого трансформанта, потенциально присутствует в этом образце;

если G_x является истинным подмножеством G_sam (G_x с G_sam), то материал, происходящий из независимого трансформанта X, или из его гибрида, или из родственного ему независимого трансформанта, потенциально присутствует в этом образце;

если G_x не равен G_sam и G_x не является истинным подмножеством G_sam, (G_x Ψ G_sam и G_x q G_sam), то материал, происходящий из независимого трансформанта X, или из его гибрида, или из родственного ему независимого трансформанта, отсутствует в этом образце.

В предпочтительных вариантах осуществления, эти логические операции могут предпочтительно проводиться вычислительным устройством.

Должно быть понятно, что поскольку вышеописанный алгоритм для применения на стадии (2) этих способов, объяснен здесь в связи с заключением о присутствии материала из определенных независимых трансформантов с использованием детектирования конкретных нуклеиновых кислот, указанный алгоритм в принципе легко применим к способам, которые нацелены на заключение о присутствии любых независимых трансформантов, таких как независимые трансформанты, иные, чем независимые трансформанты, конкретно упомянутые выше, или дополнительные к независимым трансформантам, конкретно упомянутым выше, с использованием детектирования любых нуклеиновых кислот, таких как нуклеиновые кислоты, другие, чем нуклеиновые кислоты, перечисленные под пунктами а)-и), или дополнительные к нуклеиновым кислотам, перечисленным под пунктами а)-и) выше.

Эти и дополнительные аспекты, и предпочтительные варианты осуществления этого изобретения описаны в следующих разделах и в прилагаемой формуле изобретения.

Краткое описание фигур

Фиг. 1 (A-F) иллюстрирует выбранные последовательности ампликонов, амплифицированных с использованием праймеров, перечисленных в табл. 4, и присутствующих в клонирующих векторах, в частности, в pUC18, таких как плазмиды, перечисленные в табл. 5. Как можно видеть, эти последовательности могут включать в себя частичные последовательности из множественных сайтов клонирования, фланкирующих инсертированные ампликоны.

Фиг. 2 (А) показывает результаты мультиплексного ПЦР-теста на p35S/tNOS, (В) кривая диссоциации p35S/tNOS-специфического мультиплексного теста.

Фиг. 3 обеспечивает графическое представление данных с использованием ±8300 копий матриц, перечисленных в табл. 8.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

В данном контексте, единственные формы включают в себя как единственные, так и множественные понятия, если контекст не диктует явно другого понимания.

Термины содержащий, содержит и состоит из являются в данном контексте синонимами терминов включающий в себя, включает в себя или содержащий в себе, содержит в себе, и являются включающими в себя или не окончательными и не исключают дополнительных, не указанных здесь членов, элементов или стадий способов.

Предполагается, что термин приблизительно, когда он относится к измеряемой величине, такой как параметр, количество, продолжительность времени и т.п., включает в себя вариации ±20% или менее, предпочтительно ±10% или менее, более предпочтительно ±5% или менее, даже более предпочтительно ±1% или менее и еще более предпочтительно ±0,1% или менее указанной величины, пока такие вариации являются пригодными для выполнения в описанном изобретении. Должно быть понятно, что величина, к которой относится определение приблизительно, сама, также раскрывается конкретно и предпочтительно.

Перечисления числовых диапазонов посредством конечных точек включает в себя все числа и части, находящиеся в пределах такого диапазона, а также указанные конечные точки.

Все документы, цитируемые в данном описании, включены в настоящее описание посредством отсылки в их полном виде. В частности, описания всех документов, на которые даются ссылки здесь,

- 13 031180 включены посредством отсылки.

Таким образом, в некоторых аспектах, более конкретно, аспектах А1-А12, как описано в разделе Выводы, это изобретение относится к способам для испытания образца на присутствие или отсутствие материала, происходящего от одного или нескольких независимых трансформантов растений, предусматривающим стадии (1) детектирования присутствия или отсутствия в образце нуклеиновых кислот, включающих одну, более чем одну или все (причем конкретный выбор зависит от цели конкретного анализа) из нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами а)-и), в разделе Выводы, и (2) заключения о присутствии или отсутствии в образце материала, происходящего от одного или нескольких независимых трансформантов растений, выбранных из группы, включающей один или несколько независимых трансформантов растений или состоящей из одного или нескольких независимых трансформантов растений, выбранных из группы, включающей некоторые или все из независимых трансформантов или состоящей из некоторых или всех независимых трансформантов, подробно описанных в разделе Выводы.

Независимая трансформация растения происходит путем независимой трансформации клеток растений гетерологичной нуклеиновой кислотой, обычно конструкцией нуклеиновой кислоты, содержащей один или более представляющих интерес трансгенов; регенерацией популяции растений, полученных в результате инсерции этой конструкции или ее части, включающей в себя указанный (указанные) представляющий интерес (представляющие интерес) трансген (трансгены), в геном этих растений; и отбором конкретного растения, характеризующегося указанной инсерцией, в одном или нескольких, предпочтительно одном конкретном местоположение генома. Таким образом, термин независимый трансформант растения включает в себя исходное отобранное таким образом растение-трансформант, а также его любого последующего потомка, содержащего инсертированную нуклеиновую кислоту, включающую в себя представляющий интерес трансген (представляющие интерес трансгены); например, указанный потомок может быть гемизиготным или гомозиготным в отношении указанной инсерции; указанный потомок может быть получен, например, вегетативным размножением или половым скрещиванием.

Термин растение включает в себя в данном контексте клетки растений; протопласты растений; культуру клеток или ткани растений, из которых может быть регенерирован растительный организм; каллусы или скопления растения; растительные организмы и их части, например, без ограничения, цветки, листочки околоцветника, лепестки, чашелистики, пыльники, пыльцу, семена, плоды, околоплодник (перикарпий), коробочки, листья, черешки, стебли, корни, корневища (ризомы), столоны, клубни, побеги и т.п. Этот термин обычно включает в себя в этом контексте растения любых таксонов, классифицированных в этой области в пределах царства растений (Plantae). Кроме того, в данном контексте растение может предпочтительно принадлежать к наземным растениям (эмбриофитам), в том числе, без ограничения, бессосудистым растениям (бриофитам) и сосудистым растениям (трахеофитам); более предпочтительно к сосудистым растениям (трахеофитам), включающим в себя, без ограничения, lycopodiophyta (плауны), equisetophyta, pteridophyta (папоротникообразные), psilotophyta, ophioglossophyta, и семенные растения (spermatophyta); даже более предпочтительно к семенным растениям (spermatophyta), включающим в себя, без ограничения, семеноносные растения (голосемянные растения), такие как, например, pinophyta, cycadophyta, ginkgophyta и gnetophyta и цветущие растения (покрытосемянные растения), такие как magnoliophyta, в том числе однодольные (liliopsida) и двудольные (Magnoliopsida). Предпочтительными растениями могут быть растения, обычно применяемые в земледелии и садоводстве. В качестве примера, но не ограничения, предпочтительные сельскохозяйственные культуры могут включать в себя кукурузу, пшеницу, рис, ячмень, сорго, табак, томат, картофель, масличный рапс, сою, сахарную свеклу, горох, подсолнечник, хлопчатник, арахис, цветочные растения (например, гвоздику) и т.д.

Термин материал относится обычно к физическому веществу. Термин материал, происходящий от независимого трансформанта растения, включает в себя независимый трансформант растения как таковой, в том числе, в качестве примера, но не ограничения, организм независимого трансформанта растения; любые части организма независимого трансформанта растения, такие как, например, цветки, листочки околоцветника, лепестки, чашелистики, пыльники, пыльцу, семена, плоды, околоплодник (перикарпий), коробочки, листья, черешки, стебли, корни, корневища (ризомы), столоны, клубни или побеги, или их части; клетки, протопласты, ткани, каллусы или скопления независимых трансформантов растения; или материал, полученный подверганием любых из вышеописанных частей одной или нескольким дальнейшим стадиям обработки. Эти дальнейшие стадии обработки могут включать в себя любые действия, используемые для обработки конкретных растительных материалов в сельском хозяйстве, садоводстве или в любых последующих отраслях промышленности, например, в пищевой промышленности, включающей в себя производство напитков, комбикормовую промышленность, в текстильной промышленности (например, хлопчатника, льна, бамбука и т.д.), топливной промышленности (например, масличного рапса), производстве смазочных веществ (например, касторового масла), производстве красок (например, льняного масла, тунгового масла), косметической и фармацевтической промышленности и т.д.

В качестве примера, но не ограничения, такая дальнейшая обработка может включать в себя сбор; удаление нежелательных наружных слоев, например, очистку от кожуры или кожицы, обдирание и т.д.; сушку, например атмосферную сушку, воздушно-солнечную сушку, распылительную сушку, лиофили- 14 031180 зацию, концентрирование сока и т.д.; измельчение, например, дробление, размалывание, рубку, нарезание и т. д.; разжижение, например, сбор сока; консервирование, например, вакуумный розлив в бутылки, консервирование в жестяных банках, баночное консервирование в герметичной таре, пастеризацию, добавление консервантов и т.д.; прессование, например, сбор масла; гидрогенизацию, например, сатурацию растительного масла; мацерацию; эмульгирование; тепловую обработку, например, варку, варку под давлением, обработку паром, обработку в печи, копчение, обжаривание, обработку на гриле и т.д.; ферментацию, например, с использованием дрожжей, бактерий и/или грибов; замораживание и т.п.

Термин образец относится в данном контексте в широком смысле к репрезентативной части или фракции большего материала, представленного в целом для инспекции, например, для контроля качества. Предпочтительно, в образце, подлежащем испытанию при помощи способов этого изобретения, может предполагаться потенциальное содержание материала, происходящего от одного или нескольких представляющих интерес независимых трансформантов растений. В качестве примера, такое подозрение может существовать в отношении любого образца, являющегося репрезентативным образцом материала, о котором известно, что он содержит, или предполагается, что он, возможно или вероятно, содержит, растения или их части или материал, происходящий из них, причем указанные растения или их части принадлежат к тому же самому таксону, что и представляющий интерес независимый трансформант, присутствие которого в этом образце подлежит испытанию. Например, образец может быть репрезентативным образцом растений или их частей, например, собранных или убранных растений или их частей (таких как, без ограничения, плодов, семян, коробочек, цветков и т. д.) или репрезентативным образцом промежуточного или конечного материала, полученного с применением к нему одной или нескольких дальнейших стадий обработки, или продуктов, содержащих такой материал, например, обработанных пищевых или кормовых продуктов.

Таким образом, в одном варианте осуществления этот образец содержит растения или их части, включающие в себя цветки, листочки околоцветника, лепестки, чашелистики, пыльники, пыльцу, семена, плоды, околоплодник (перикарпий), коробочки, листья, черешки, стебли, корни, корневища (ризомы), столоны, клубни или побеги, или их части; клетки растений, протопласты растений и/или ткани растений, и/или полученный из растений материал, предпочтительно пищевой или кормовой материал, в том числе обработанный пищевой или кормовой материал.

Способы этого изобретения детектируют присутствие или отсутствие в образце нуклеиновых кислот, т.е. генетического материала и предпочтительно геномной ДНК, происходящих или произведенных из представляющих интерес независимых трансформантов растений. Присутствие или отсутствие таких нуклеиновых кислот является показателем, соответственно, присутствия или отсутствия в этом образце этого и потенциально дополнительного материала, происходящего от соответствующих независимых трансформантов растений; такого как, например, материалы, соочищающиеся или совместно выделяющиеся с указанными нуклеиновыми кислотами во время различных стадий обработки, примененной к этим независимым трансформантам растений.

Известно, что нуклеиновые кислоты и, в частности, геномная ДНК, являются сравнительно стойкими и могут выдерживать различные стадии обработки, применяемые к растительным материалам в сельском хозяйстве и промышленности, например, в пищевой и кормовой промышленности, так что молекулы ДНК с длиной, которая позволяет последовательность-специфическое определение их, могут быть обнаружены после таких стадий и даже в конечных продуктах.

Таким образом, предпочтительный образец этого изобретения содержит нуклеиновые кислоты, более предпочтительно геномную ДНК, даже более предпочтительно геномную ДНК, имеющую по меньшей мере размеры, которые позволяют их последовательность-специфическое детектирование, такие как, в среднем, по меньшей мере приблизительно 20 п.н., например, по меньшей мере приблизительно 30 п.н., предпочтительно по меньшей мере приблизительно 50 п.н., по меньшей мере приблизительно 75 п.н., более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 100 п.н., например, приблизительно 150 п.н., или даже более предпочтительно приблизительно 200 п.н., или по меньшей мере приблизительно 300 п.н., или по меньшей мере приблизительно 500 п.н., или по меньшей мере приблизительно 1 т.п.н., или более.

Хотя можно предположить, что большинство стадий обработки, которым независимый трансформант растения может быть подвергнут на практике, могло бы сохранять детектируемые нуклеиновые кислоты в конечном продукте, и, следовательно, в его подлежащем испытанию образце, авторы этого изобретения предполагают выполнение положительного контроля, нацеленного на проверку, содержит ли указанный образец детектируемые происходящие из растения нуклеиновые кислоты.

В частности, способ данного изобретения может дополнительно предусматривать детектирование присутствия или отсутствия в этом образце характерной для растений нуклеиновой кислоты. В предпочтительном варианте осуществления, такая характерная для растений нуклеиновая кислота происходит из гена, присутствующего в различных таксонах растений и предпочтительно высоко консервативного (например, с > 80%, предпочтительно > 90%, более предпочтительно > 95%, даже более предпочтительно > 96%, > 97%, > 98% или > 99% идентичностью последовательности) между различными таксонами растений; предпочтительно по меньшей мере в пределах семенных растений; или по меньшей мере в пределах

- 15 031180 покрытосемянных растений, например, между однодольными и двудольными растениями и/или в пределах однодольных и двудольных растений; или предпочтительно, по меньшей мере, между таксонами растений, обычно используемыми в сельском хозяйстве и промышленности, например, без ограничения, между кукурузой, пшеницей, рисом, ячменем, сорго, табаком, томатом, масличным рапсом, соей, сахарной свеклой, горохом, подсолнечником, хлопчатником, арахисом и цветковыми растениями (например, гвоздикой); или предпочтительно, по меньшей мере, между таксонами растений, содержащими независимые трансформанты получения трансгенных растений или состоящими из независимых трансформантов растений, испытуемых в этом образце.

В предпочтительных вариантах осуществления указанная характерная для растений нуклеиновая кислота получена из хлоропластного гена малой субъединицы Rubisco (рибулозобисфосфаткарбоксилазы) или из гена CHL-tRNA-синтетазы.

Как упоминалось, способы этого изобретения включают в себя в стадии (1) детектирование присутствия или отсутствия в образце нуклеиновых кислот, включающих одну, более чем одну или все из нуклеиновых кислот или состоящих из одной, более чем одной или всех нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами а)-и) в разделе Выводы. Термин детектирование или детекция включает в себя в данном контексте любой способ определения присутствия или отсутствия указанной нуклеиновой кислоты в этом образце.

Предпочтительно, присутствие конкретной молекулы нуклеиновой кислоты в образце может быть детектировано с использованием одного или нескольких реагентов, специфически гибридизующихся с соответствующей нуклеотидной последовательностью (соответствующими нуклеотидными последовательностями), содержащимися в указанной молекуле нуклеиновой кислоты.

Термины гибридизация и гибридизоваться относятся к процессу, посредством которого одна цепь нуклеиновой кислоты отжигается (гибридизуется) с комплементарной или по существу комплементарной последовательностью (последовательностями), содержащимися в одной и той же или другой полинуклеотидной цепи спариванием оснований, предпочтительно спариванием оснований Уотсона-Крика.

Термины комплементарное и комплементарность относятся к нормальному связыванию полинуклеотидов при пермиссивных солевых (ионной силе) и температурных условиях спариванием оснований, предпочтительно спариванием оснований Уотсона-Крика. В качестве примера, комплементарное спаривание оснований Уотсона-Крика происходит между основаниями А и Т, А или G и С. Например, последовательность A-G-Т (т.е. 5'-A-G-T-3') является, следовательно, комплементарной последовательности А-С-Т (т.е. 5'-А-С-Т-3').

Степень комплементарности цепи (А) нуклеиновой кислоты цепи (В) нуклеиновой кислоты может быть выражена в виде доли (процента) нуклеотидов цепи (А), которая, как ожидается, будет соответствовать, т.е. образовывать спаривание Уотсона-Крика, с нуклеотидами цепи (В) нуклеиновой кислоты, при отжиге указанных цепей (А) и (В) нуклеиновых кислот, предпочтительно в условиях высокой строгости.

Таким образом, комплементарные обозначает в данном контексте полную комплементарность, так что все соответствующие нуклеотиды этих цепей нуклеиновых кислот могут связываться при отжиге этих цепей. В качестве примера, относительно более короткая цепь может обнаруживать полную комплементарность относительно более длинной цепи нуклеиновой кислоты, если эта последняя цепь содержала последовательность, полностью комплементарную последовательности первой цепи. Термин по существу комплементарная относится к комплементарной в значительной степени, но не полностью комплементарной, в частности, по меньшей мере комплементарной на 85%, например, комплементарной по меньшей мере на 90%, предпочтительно комплементарной по меньшей мере на 96, 97, 98% или по меньшей мере на 99% нуклеиновой кислоте.

Термины специфически гибридизоваться и специфическая гибридизация отражают ситуацию, когда реагент гибридизуется с конкретной последовательностью более легко, чем он гибридизовался бы со случайной, неродственной последовательностью. Например, реагент специфически гибридизующийся с конкретной нуклеотидной последовательностью (А), предпочтительно обнаруживает малую гибридизацию или отсутствие гибридизации с другими полинуклеотидами, и предпочтительно с гомологами или ортологами последовательности нуклеиновой кислоты (А), в условиях, в которых он мог бы специфически гибридизоваться с указанным полинуклеотидом (А).

Предпочтительно, реагентами, которые могут специфически гибридизоваться с соответствующей нуклеотидной последовательностью (соответствующими нуклеотидными последовательностями), содержащимися в молекулах нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами а)-и) выше, могут быть зонды или праймеры.

Зонд является выделенной нуклеиновой кислотой, к которой предпочтительно присоединена детектируемая метка или репортерная часть молекулы, например, радиоактивный изотоп (например, ³²Р, ³³Р), лиганд, хемилюминесцентный агент, флуорофор (например, флуоресцеин, тетрахлорфлуоресцеин, TAMRA, ROX, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Texas Red и т.д.), витамин (например, биотин), стероид (например, дигоксин), фермент (например, HRP, АР и т.д.) и т.д. Такой зонд является комплементарным или по существу комплементарным последовательности, содержащейся в цепи нуклеиновой кислоты-мишени, в

- 16 031180 случае данного изобретения, нуклеиновой кислоты, предпочтительно геномной ДНК, находящейся в списке под пунктами а)-и) выше. Зондами в соответствии с данным изобретением могут быть дезоксирибонуклеиновые кислоты, рибонуклеиновые кислоты или нуклеиновые кислоты, содержащие как дезоксирибо-, так и рибонуклеотиды; они могут содержать стандартные пуриновые и/или пиримидиновые основания (A, G, Т, С, U и/или I), но также другие природные, химически или биохимически модифицированные (например, метилированные), неприродные или дериватизованные нуклеотидные основания; могут включать в себя скелет макромолекулы, содержащий сахара и фосфатные группы, которые могут обычно обнаруживаться в РНК или ДНК, а также один или несколько раз модифицированные или замещенные (например, 2'-О-алкилированные, например, 2'-О-метилированные или 2'-О-этилированные; или 2'-О,4'-С-алкинилированные, например, 2'-О,4'-С-этилированные) сахара или один или несколько раз модифицированные или замещенные фосфатные группы - например, скелетные аналоги в нуклеиновых кислотах могут включать в себя фосфородиэфирные, фосфоротиоатные, фосфородитиоатные, метилфосфонатные, фосфороамидатные, алкилфосфотриэфирные, сульфаматные, З'-тиоацетатные, метиленовые (метиламино), З'-Ы-карбаматные, морфолинокарбаматные и пептиднуклеиновые кислоты (ПНА).

Зонды могут иметь длину по меньшей мере 10 нуклеотидов, например, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13 или по меньшей мере 14 нуклеотидов, предпочтительно по меньшей мере 15 нуклеотидов, например, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18 или по меньшей мере 19 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 20 нуклеотидов, например, по меньшей мере 21 нуклеотид, по меньшей мере 22 нуклеотида, по меньшей мере 2З или по меньшей мере 24 нуклеотида, даже более предпочтительно по меньшей мере 25 нуклеотидов, например, по меньшей мере З0, по меньшей мере З5, по меньшей мере 40, по меньшей мере 45, по меньшей мере 50, по меньшей мере, по меньшей мере 100 или по меньшей мере 200 нуклеотидов.

Праймеры являются выделенными нуклеиновыми кислотами, предпочтительно дезоксирибонуклеиновыми кислотами, или в других предпочтительных примерах, рибонуклеиновыми кислотами или ПНА, комплементарными или по существу комплементарными последовательности, содержащейся в нуклеиновой кислоте-мишени (в случае данного изобретения, последовательности, содержащейся в нуклеиновой кислоте, предпочтительно геномной ДНК, включающей нуклеиновые кислоты или состоящей из нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами а)-и) выше), которые могут быть подвергнуты отжигу с указанной нуклеиновой кислотой-мишенью и могут действовать в качестве точки инициации синтеза продукта удлинения праймера в присутствии нуклеотидов и агента для полимеризации нуклеиновых кислот, такого как ДНК-зависимая или РНК-зависимая полимераза.

Праймер должен быть достаточно длинным для праймирования синтеза продуктов удлинения в присутствии агента для полимеризации. Таким образом, типичный праймер имеет длину по меньшей мере 10 нуклеотидов, например, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 1З или по меньшей мере 14 нуклеотидов, предпочтительно по меньшей мере 15 нуклеотидов, например, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18 или по меньшей мере 19 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 20 нуклеотидов. Дополнительные предпочтительные праймеры имеют длину между приблизительно 10 и приблизительно 40 нуклеотидами, более предпочтительно между приблизительно 15 и приблизительно 30 нуклеотидами, наиболее предпочтительно между приблизительно 20 и приблизительно 25 нуклеотидами.

Парами праймеров называют комбинации праймеров, которые пригодны для амплификации ампликонов из внутренней части нуклеиновых кислот-мишеней (в случае данного изобретения, из внутренней части нуклеиновых кислот, предпочтительно геномной ДНК, включающей нуклеиновые кислоты или состоящей из нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами а)-и) выше), при помощи подходящих способов амплификации нуклеиновых кислот. Таким образом, способность амплификации ампликона из внутренней части конкретной нуклеиновой кислоты-мишени с использованием пары праймеров, сконструированных для специфической гибридизации внутри указанной нуклеиновой кислоты-мишени указывает на присутствие (и необязательно количество) указанной нуклеиновой кислоты-мишени в этом образце. Примерные, но не ограничивающие способы приготовления и применения зондов и праймеров описаны, например, в Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, ed. Sambrook el al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989 (Sambrook et al. 1989); Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel et al., Greene Publishing and Wiley-lnterscience, New York, 1992 (с периодическими обновлениями) (Ausubel et al. 1992); и I lnnis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press: San Diego, 1990. Пары праймеров ПЦР могут быть произведены из известной последовательности, например, с использованием компьютерных программ, предназначенных для этой цели, таких как Primer3 (Rozen and Skaletsky. 2000. Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. In: Krawetz S, Misener S (eds) Bioinformatics Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology. Humana Press, Totowa, NJ, pp 365-386) или пакета программ GCG™v. 11.1.2 от Accelrys.

Специфическая гибридизация этих зондов, праймеров или пар праймеров этого изобретения с их соответствующими комплементарными последовательностями внутри нуклеиновых кислот-мишеней, например, нуклеиновых кислот, содержащих нуклеиновые кислоты или состоящих из нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами а)-и) выше), может быть предпочтительно достигнута в условиях вы

- 17 031180 сокой строгости.

Условия высокой строгости включают в себя условия, эквивалентные следующим примерным условиям для связывания или гибридизации при 65°С в растворе, состоящем из 5xSSPE (43,8 г/л NaCl, 6,9 г/л NaH₂PO₄.H₂O и 1,85 г/л ЭДТА, с рН, доведенным до 7,4 при помощи NaOH), 0,1% ДСН, 5x реагента Денхардта (50х раствор Денхардта содержит на 500 мл: 5 г Фиколла (Type 400, Pharmacia), 5 г БСА (Фракции V; Sigma) и 100 мкл/мл денатурированной ДНК спермы лосося), с последующим промыванием в растворе, содержащем 5xSSPE, 0,1% ДСН, при 65°С при использовании зонда с длиной приблизительно 500 нуклеотидов. Другие примерные условия для гибридизации при высокой строгости для последовательностей нуклеиновых кислот с длиной более приблизительно 20-100 нуклеотидов, предпочтительно с длиной приблизительно 30-100 нуклеотидов, например, с длиной между 30 и 50 нуклеотидами, включают в себя условия, эквивалентные гибридизации в 6xSSC при 45°С, с последующими одной или несколькими промывками в 0,2xSSC, 0,1% ДСН или даже 0,1xSSC, 0,1% ДСН при 65°С. Многочисленные эквивалентные условия могут быть использованы для варьирования условий строгости; рассматриваются такие факторы, как длина и природа (ДНК, РНК, состав оснований) зонда и природа мишени (ДНК, РНК, состав оснований, присутствующие в растворе или иммобилизованные и т.д.), и концентрация солей и других компонентов (например, присутствие или отсутствие формамида, декстран-сульфата, полиэтиленгликоля), и раствор для гибридизации может варьироваться для генерирования условий гибридизации низкой или высокой строгости, отличающейся от перечисленных выше условий, но эквивалентных им. Кроме того, в данной области известны условия, которые стимулируют гибридизацию при условиях высокой строгости (например, увеличение температуры гибридизации и/или стадий промывок, применение формамида в гибридизационном растворе и т.д.). Руководство для выполнения реакций гибридизации может быть найдено, например, в Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons,

N. Y., 6.3.1-6.3.6, 1989, и более недавних обновленных изданиях, все из которых включены в качестве ссылки.

Что касается амплификации ампликонов из внутренней части нуклеиновых кислот-мишеней с использованием пар праймеров, строгие условия или условия высокой строгости являются условиями, которые позволяют паре праймеров гибридизоваться только с ее соответствующей последовательностью нуклеиновой кислоты-мишени и получать уникальный продукт амплификации, т.е. ампликон, по существу без получения непредусмотренных, т.е. неспецифических продуктов амплификации. Например, предпочтительно менее 20%, более предпочтительно менее 10%, даже более предпочтительно менее 5%, например, менее 4%, менее 3% или менее 2%, еще более предпочтительно менее 1%, например, менее

O, 1% или менее 0,01% общего количества (например, массы) продукта амплификации в одной реакции амплификации могли бы быть неспецифическими при проведении такой реакции при строгих условиях (например, при анализе с использованием количественного гель-электрофореза или посредством определения T_m, или т.п.).

Любые общепринятые способы могут быть использованы для детектирования гибридизации зонда с нуклеиновой кислотой-мишенью в этом образце. Например, нуклеиновые кислоты, предпочтительно ДНК, из образца могут быть иммобилизованы и денатурированы на твердом носителе и таким образом гибридизованы с соответствующими зондами (например, блоттингом по Саузерну, слот-блоттингом, дотблоттингом и т.д.). Если зонд и, следовательно, его детектируемая метка удерживаются на этом твердом носителе, это свидетельствует о том, что нуклеиновая кислота-мишень, в отношении которой является специфическим этот зонд, присутствует в данном образце.

Подобным образом, любой существующий способ амплификации нуклеиновых кислот может быть использован для амплификации ампликонов из внутренней части представляющих интерес последовательностей-мишеней, указывая на присутствие соответствующих последовательностей-мишеней в этом образце: в том числе, но не только полимеразная цепная реакция (ПЦР) (US 4683202; US 4965188), амплификация с вытеснением цепи (SDA) (US 5455166; ЕР 0684315), LCR, TAS, 3SR, NASBA (US 5409818; ЕР 0329822), RCA и Q-бета-амплификация.

В одном особенно предпочтительном варианте осуществления, способы этого изобретения используют полимеразную цепную реакцию (ПЦР) для амплификации ампликонов из внутренней части нуклеиновых кислот-мишеней, выбранных из нуклеиновых кислот, включающих нуклеиновые кислоты или состоящих из нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами а)-и) выше. Термины полимеразная цепная реакция и ПЦР в широком смысле включают в себя любой способ, называемый так в данной области, и, в частности, способы для амплификации последовательностей нуклеиновых кислот-мишеней, особенно ДНК-последовательностей-мишеней, с использованием термостабильных ДНК-полимераз и двух праймеров, в частности, олигонуклеотидных праймеров, одного, комплементарного (+)-цепи на одном конце амплифицируемой последовательности, и другого, комплементарного (-)-цепи на другом конце. Этот термин включает в себя модификации прототипных ПЦР, таких как, например, ПЦР высокой точности, ПЦР с горячим стартом, touch-down PCR, гнездовая ПЦР, мультиплексная ПЦР, количественная ПЦР, количественная ПЦР в реальном времени, ПЦР длинных фрагментов, ОТ-ПЦР и т.д. (см., например, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, eds. Innis et al., Academic Press, San Diego,

- 18 031180

1990).

Продукты амплификации, полученные с использованием вышеописанных способов амплификации, и, в частности, с использованием ПЦР, могут оцениваться, например, на их присутствие или отсутствие, на их специфичность и/или количество, любым из способов, обычных в данной области. Например, размер (как показатель специфичности амплификации) и/или количество продукта амплификации могут оцениваться с использованием гель-электрофореза, такого как, например, электрофорез в агарозном или полиакриламидном геле, где продукты амплификации визуализируют при помощи подходящих ДНКсвязывающих красителей, таких как, например, бромид этидия.

Альтернативно, продукты амплификации могут оцениваться способами, которые используют зонды, гибридизующиеся со специфическими последовательностями внутри продуктов амплификации. Например, продукт амплификации может быть иммобилизован и денатурирован на твердом носителе и затем гибридизован с меченым зондом.

В другом случае, продукт амплификации может быть сам меченым, например, включением детектируемой метки (например, флуорофора) в один или оба праймера и/или посредством субстратных нуклеотидов, включенных в продукт амплификации во время амплификации, и полученный таким образом продукт ПЦР может быть затем денатурирован и гибридизирован со специфическими (олигонуклеотидными) зондами, прикрепленными к твердому носителю. Таким образом, присутствие и количество детектируемой метки в выбранных положениях на твердом носителе показывает специфичность и количество, соответственно, продукта амплификации. Например, такая схема пригодна для использования с массивами зондов, например, микрочипами.

В дополнительных примерных способах, продукты амплификации могут оцениваться с использованием клонирования и секвенирования; прямого секвенирования; опосредованного олигонуклеотидом пиросеквенирования (Ahmadian et al. 2000. Anal Biochem 280: 103-110); хроматографии, например, DHPLC, анализов дотирования олигонуклеотидов (Landegren et al. 1988. Science 241: 1077; Eggerding et al. 1995. Hum Mutat 5: 153-165; Nickerson et al. 1990. PNAS 87: 8923-8927); RNAse Protection Assay; и т.д.

Особенно предпочтительным способом оценки продукта амплификации является амплификация в реальном времени, особенно ПЦР в реальном времени. Термин амплификация в реальном времени обозначает любой способ амплификации, предпочтительно ПЦР (ПЦР в реальном времени), который позволяет проводить мониторинг развития протекающей реакции амплификации (см., например, RealTime PCR: An Essential Guide, eds. Edwards et al., Horizon Scientific Press, 2004; Marras SAE et al. 2006. Real-time assays with molecular beacons and other fluorescent nucleic acid hybrisization probes. Clin Chim Acta 363: 48-60; в отношении обсуждения см. различные платформы ПЦР в реальном времени).

В качестве примера, но не ограничения, амплификация в реальном времени, в частности, ПЦР в реальном времени, включает в себя в данном контексте полностью стандартные системы, такие как, например, система TaqMan™, разработанная Applied Biosystems, которая основана на высвобождении и детектировании флуоресцентного зонда во время каждого раунда амплификации ДНК (Holland et al. 1991. Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5'-3' exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase. PNAS 88: 7276-80). Этот способ использует 5'-экзонуклеазную активность полимеразы Taq во время удлинения праймера для расщепления дважды меченого, флуорогенного зонда, гибридизованного с ДНК-мишенью, между праймерами ПЦР. Перед расщеплением, репортерный флуорофор, такой как 6-карбоксифлуоресцеин (6-FAM), на 5-конце этого зонда тушат 6карбокситетраметилроданином с использованием резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET). После расщепления высвобождается FAM. Полученная флуоресценция, измеренная в реальном времени при приблизительно 518 нм, во время лог-фазы накопления продукта, пропорциональна количеству копий последовательности-мишени.

Дополнительные системы детектирования амплификации в реальном времени, в частности, ПЦР в реальном времени, могут также использовать FRET, например, системы на основе молекулярных маяков. Молекулярные маяки являются одноцепочечными полинуклеотидными зондами, которые имеют структуру шпильки со стеблем и петлей. Петля является последовательностью зонда, комплементарной последовательности внутри подлежащего оценке ампликона, а стебель образован короткими комплементарными последовательностями, расположенными на противоположных концах этого молекулярного маяка. Молекулярный маяк метят флуорофором (например, 6-FAM) на одном конце и гасителем (например, TAMRA) на другом конце. Будучи свободным в растворе, этот стебель сохраняет флуорофор и тушитель в тесной близости, вызывая тушение флуоресценции этого флуорофора посредством FRET. Однако, при связывании с его комплементарной мишенью этот гибрид зонд-мишень заставляет стебель разворачиваться, отделяя флуорофор от тушителя и восстанавливая флуоресценцию. Таким образом, при увеличении количества ампликона во время амплификации это увеличение может быть подвергнуто мониторингу в виде увеличения флуоресценции соответствующего маяка (см., например, Manganelli et al. 2001. Real-time PCR using molecular beacons. Methods Mol Med 54: 295-310; Marras SAE. 2006. Selection of fluorophore and quencher pairs for fluorescent nucleic acid hybridization probes. Methods Mol Biol 335: 3-16; Marras SAE et al. 2006. Real-time assays with molecular beacons and other fluorescent nucleic acid hybridization probes. Clin Chim Acta 363: 48-60 в отношении дополнительного обсуждения детектирования моле

- 19 031180 кулярных маяков).

Особенно предпочтительной системой ПЦР-амплификации в реальном времени и детектирования для применения в данном изобретении является система Light Upon Extension (LUX™), продаваемая Invitrogen (Carlsbad, CA) и описанная подробно в Nazarenko et al. 2002 (Nucleic Acids Research 30: e37) и Nazarenko et al. 2002 (Nucleic Acids Research 30: 2089-2095). Эта система использует пары праймеров, в которых обычно один из этих праймеров указанной пары праймеров помечен флуорофором (таким как, например, FAM или JOE или Alexa Fluor 546). Эта конкретная структура этого свободного праймера гасит сигнал связанного с ним флуорофора, в то время как интенсивность сигнала флуорофора увеличивается, когда этот праймер принимает удлиненную конформацию после включения в амплифицированный продукт. Последовательность этих праймеров данного изобретения, таких как особенно предпочтительные праймеры, перечисленные в табл. 1 и 4, может быть специально приспособлена для выполнения способа LUX™ в соответствии с инструкциями приведенных выше публикаций Nazarenko et al. 2002 или с использованием инструментов программ, обеспеченных Invitrogen на www.invitrogen.com/lux. Этот способ LUX™ особенно пригоден для достижения мультиплексности (множественности) (т.е. выполнения в единой реакции) двух или более амплификации с использованием различных наборов праймеров, так как каждый из этих наборов праймеров может быть маркирован с использованием отличающегося флуорофора.

В отношении описания дополнительных путей для детектирования и оценки продуктов амплификации (например, с использованием смежных зондов; 5'-нуклеазных зондов, таких как зонды Taqman™; Light-up; праймеров Duplex scorpion; праймеров Amplifluor; и других альтернативных флуоресцентных форматов гибридизационных зондов, см., например, Marras SAE et al. 2006. Real-time assays with molecular beacons and other fluorescent nucleic acid hybridization probes. Clin Chim Acta 363: 48-60, в частности, раздел 6 и ссылки в нем).

В предпочтительных вариантах осуществления, амплификация в реальном времени, предпочтительно ПЦР в реальном времени, данного изобретения использует (в основном) не специфические в отношении последовательности реагенты для детектирования и оценки накапливания продуктов амплификации. Эти системы обычно используют флуорохромы (флуоресцентные красители), которые связываются с ДНК (т.е. являются ДНК-связывающими), предпочтительно с двухцепочечной ДНК, по существу не специфическим в отношении последовательности образом, и после такого связывания достигается или усиливается их флуоресценция. Таким образом, наблюдаемое увеличение флуоресценции указывает на появление и количество накопленного (двухцепочечного) продукта амплификации. Если указанные флуорохромы связываются преимущественно или исключительно с двухцепочечной ДНК и/или если их флуоресценция усиливается преимущественно или исключительно при связывании с двухцепочечной ДНК, то специфичность этого продукта амплификации может быть определена получением его кривой плавления, т. е. графика зависимости флуоресценции от температуры, и определением Tm этого продукта, т.е. температуры, при которой 50% этого продукта расплавлены и, следовательно, потеряли его усиленную флуоресценцию. Наблюдение единственной ожидаемой Tm для продукта амплификации (или множественных ожидаемых Tm во множественной амплификации) подтверждает специфичность амплификации.

Примерные флуорохромы для применения в вышеописанных способах не специфического в отношении последовательности детектирования включают в себя, без ограничения, связывающиеся с большой бороздкой агенты, связывающиеся с малой бороздкой агенты, интеркалирующиеся красители или т.п.; такие как, например, SYBR Green I (2-[Ы-(3-диметиламинопропил)-Н-пропиламино]-4-[2,3-дигидро3-метил-(бензо-1,3-тиазол-2-ил)метилиден]-1-фенилхинолиний; Zipper et al. 2004. Nucleic Acid Res 32: e103), бромид этидия, Hoechst 33258, PicoGreen™ (Molecular Probes), предпочтительно SYBR Green I или PicoGreen™.

В дополнительном предпочтительном варианте осуществления, реакции амплификации в реальном времени в данных способах могут быть множественными, т. е. два или более разных ампликонов могут быть амплифицированы с использованием двух или более соответствующих пар праймеров на одном и том же образце (образцах) в одной и той же реакции. Праймеры, предполагаемые авторами данного изобретения, в частности, праймеры, перечисленные в любой из табл. 1 или 4, или их варианты или производные, могут быть особенно пригодными для мультиплексирования применений, inter alia потому, что они работают адекватно по существу при одних и тех же или сходных условиях реакции (например, условиях состава реакционной смеси и температурных циклов), а также потому, что они продуцируют продукты сходного размера.

Хорошо понятно, что мультиплексность обычно требует, чтобы различные продукты амплификации, возникающие в этой реакции, могли быть различены. В данном контексте, при использовании не специфических в отношении последовательности способов (например, с использованием SYBR Green или другого ДНК-связывающего красителя) для детектирования продуктов амплификации, мультиплексность, в частности, может ожидаться, когда продукты амплификации имеют достаточно разные Tm, для различения построением кривой плавления (например, когда Tm различаются на приблизительно 5°С

- 20 031180 или более). Однако, при использовании ампликон-специфических способов детектирования (например, различно меченых праймеров или различно меченых зондов для различных ампликонов), в принципе возможным является далеко идущая мультиплексность этих тестов.

Таким образом, мишенью для вышеописанного детектирования с применением зондов и/или матрицы для амплификации с использованием пар праймеров, должна быть нуклеиновая кислота, происходящая из соответствующих независимых трансформантов растений, содержащаяся в этом образце. Предпочтительно, эта мишень и/или нуклеиновая кислота-матрица должны быть геномной ДНК, происходящей из указанных трансгенных независимых трансформантов, которая, как ожидается, вследствие ее более высокой стабильности является лучше сохраняемой в этом образце, чем другие типы нуклеиновых кислот, такие как, например, гетерогенная ядерная РНК (гяРНК) или мРНК. Тем не менее, это изобретение рассматривает также детектирование мРНК или кДНК (например, при помощи соответствующих ОТ-ПЦР-анализов), или происходящей из плазмид ДНК, в подходящих случаях.

Таким образом, данный способ предпочтительно использует амплификацию с применением пар праймеров, сконструированных для специфической гибридизации внутри и амплификации соответствующих ампликонов из внутренней части нуклеиновых кислот, присутствие или отсутствие которых в этом образце должно быть детектировано, таких как, предпочтительно, нуклеиновые кислоты, включающие нуклеиновые кислоты или состоящие из нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами а)u) выше, в качестве средства детектирования присутствия или отсутствия указанных нуклеиновых кислот в этом образце.

В этом отношении, авторы данного изобретения выяснили, что, если материал независимого трансформанта растения был подвергнут одной или нескольким дальнейшим стадиям обработки, например, как описано выше, нуклеиновые кислоты, такие как их геномная ДНК, могут быть фрагментированы. Таким образом, для увеличения шансов репрезентативной амплификации соответствующих ампликонов из фрагментированной таким образом ДНК это изобретение описывает также выгодное уменьшение размера этих ампликонов.

Таким образом, в предпочтительных вариантах осуществления, эти ампликоны меньше приблизительно 300 п.н., меньше приблизительно 280 п.н., меньше приблизительно 260 п.н., меньше приблизительно 240 п.н. или меньше приблизительно 220 п.н., более предпочтительно меньше приблизительно 200 п.н., например, меньше приблизительно 190 п.н., меньше приблизительно 180 п.н., меньше приблизительно 170 п.н. или меньше приблизительно 160 п.н., даже более предпочтительно менее приблизительно 150 п.н., меньше приблизительно 140 п.н., меньше приблизительно 130 п.н., меньше приблизительно 120 п.н. или меньше приблизительно 110 п.н., еще более предпочтительно меньше приблизительно 100 п.н. и еще более предпочтительно меньше приблизительно 90 п.н., например, приблизительно 85 п.н., приблизительно 80 п.н., приблизительно 75 п.н., приблизительно 70 п.н., приблизительно 65 п.н., приблизительно 60 п.н., приблизительно 55 п.н. или приблизительно 50 п.н..

В следующих предпочтительных вариантах осуществления, эти ампликоны находятся в диапазонах приблизительно 50 п.н. - приблизительно 150 п.н., приблизительно 50 п.н. - приблизительно 100 п.н., предпочтительно в диапазонах приблизительно 50 п.н. - приблизительно 90 п.н., более предпочтительно в диапазонах приблизительно 60 п.н. - приблизительно 80 п.н. и еще более предпочтительно в диапазоне приблизительно 65 п. н. - приблизительно 75 п. н.

Как объяснялось, приведенные выше способы детектируют конкретные нуклеиновые кислоты, предпочтительно геномную ДНК, в образце. Может быть понятно, что некоторые надежные протоколы детектирования, например, некоторые протоколы ПЦР, могут выполняться на образцах без предварительной очистки или обогащения составляющих их нуклеиновых кислот. С другой стороны, детектирования по этому изобретению могут выполняться более надежно, если нуклеиновые кислоты, такие как, предпочтительно, геномная кислота, сначала обогащают или выделяют из этого образца. Способы выделения нуклеиновых кислот, например, геномной ДНК, из образцов, в частности, из образцов, содержащих растительный материал, являются давно установленными в данной области и включают в себя способы, основанные, например, без ограничения, на экстракции органическим растворителем (например, экстракции смесью фенол-хлороформ) и осаждении этанолом или изопропиловым спиртом; связывании с ионообменными смолами; разделении в градиенте плотности хлорида цезия; хроматографии на колонке при центрифугировании, магнитном разделении и т.д. (см., например, Milligan 1992. Plant DNA isolation, pp 59-88 in Hoelzel, ed. Molecular genetic analysis of populations: a practical approach. IRL Press, Oxford, UK).

Качество выделенной таким образом ДНК может оцениваться, например, гель-электрофорезом и/или измерением отношения оптической плотности A260/A280. Предпочтительно, это отношение A260/A280 для нуклеиновых кислот, используемых в способах детектирования этого изобретения, может находиться между 1,6 и 2,3, более предпочтительно между 1,6 и 2,0, даже более предпочтительно между 1,7 и 1,9, еще более предпочтительно между 1,75 и 1,85 и наиболее предпочтительно равно приблизительно 1,8. Количество выделенной таким образом ДНК может оцениваться, например, измерением оптической плотности A₂₆₀ (Sambrook 1989) или предпочтительно с использованием флуорохромов PicoGreen™ или SYBR Green I (Ahn et al. 1996. Nucleic Acids Res 24: 2623-5; Schneeberger et al. 1995. PCR Methods Appl 4:

- 21 031180

234-8).

В предпочтительном варианте осуществления, получение материала нуклеиновых кислот, в частности, геномной ДНК, для применения в способах этого изобретения может также вызывать фрагментацию с получением более низких средних размеров фрагментов нуклеиновых кислот, например, с использованием ферментативного расщепления или обработки ультразвуком, известных в данной области. Предпочтительная средняя длина фрагментированных таким образом нуклеиновых кислот может находиться между 200 и 2000 п.н., более предпочтительно между 300 и 1500 п.н., даже более предпочтительно между 500 и 1000 п.н., например, приблизительно 500, приблизительно 600, приблизительно 700, приблизительно 800, приблизительно 900 или приблизительно 1000 п.н.

Таким образом, вышеописанные способы детектируют присутствие или отсутствие выбранных нуклеиновых кислот в образце, предпочтительно с использованием систем и протоколов детектирования, описанных здесь ранее. В данном контексте, заключение о присутствии конкретной нуклеиновой кислоты в образце делают, когда величина интенсивности сигнала (количество сигнала), полученная для этой нуклеиновой кислоты при помощи подходящего способа анализа (например, флуоресцентного сигнала, хемилюминесцентного сигнала, сигнала ферментной реакции и т.д.) в образце является большей, предпочтительно статистически значимо большей, чем величина этого сигнала в отрицательном контроле.

Отрицательный контроль не содержит анализируемой нуклеиновой кислоты, но может быть предпочтительно сравнимым с этим образцом в других отношениях, предпочтительно в большинстве других отношений, например, в типе и количестве содержащегося в нем растительного материала, в дальнейших стадиях обработки, которым был подвергнут этот материал и т.д.

Предпочтительно, способы детектирования этого изобретения могут выполняться на нуклеиновых кислотах, более предпочтительно на геномной ДНК, выделенных из этого образца (см. выше). В таком случае, отрицательный контроль может состоять в основном из выделенных нуклеиновых кислот, не содержащих детектируемых нуклеиновых кислот. Предпочтительно, этот способ детектирования мог бы тогда использовать одно и то же или приблизительно одно и то же количество выделенных нуклеиновых кислот как из этого образца, так и, для ссылки, отрицательного контроля. Предпочтительно также, чистота и/или количество нуклеиновых кислот, выделенных из этого образца и из отрицательного контроля, может быть также одинаковым или приблизительно одинаковым; предпочтительно также, чтобы мог быть использован один и тот же способ выделения для выделения нуклеиновых кислот как из образца, так и из отрицательного контроля.

В вышеописанных ситуациях, заключение о присутствии конкретной нуклеиновой кислоты в образце может быть предпочтительно сделано, когда величина интенсивности сигнала (количество сигнала), полученного для этой нуклеиновой кислоты в образце, является по меньшей мере в 2 раза большей, чем величина интенсивности сигнала в отрицательном контроле, например, по меньшей мере в 3 раза или по меньшей мере в 4 раза большей, более предпочтительно по меньшей мере в 5 раз большей, например, по меньшей мере в 6 раз, по меньшей мере в 7 раз большей, по меньшей мере в 8 раз или по меньшей мере в 9 раз большей, даже более предпочтительно по меньшей мере в 10 раз большей, например, по меньшей мере в 15 раз большей, еще более предпочтительно по меньшей мере в 20 раз большей, например, по меньшей мере в 30 раз большей или по меньшей мере в 40 раз большей, еще более предпочтительно по меньшей мере в 50 раз большей, например, по меньшей мере в 100 раз большей по меньшей мере в 200 раз большей, по меньшей мере в 300 раз большей, по меньшей мере в 400 раз большей, по меньшей мере в 500 раз большей, по меньшей мере в 1000 раз или даже в большее число раз большей, чем сигнал в отрицательном контроле.

Таким образом, когда величина сигнала (количество сигнала), полученного для анализируемой нуклеиновой кислоты в образце, является не большей (например, одинаковой, приблизительно одинаковой или меньшей), чем величина сигнала, полученного для анализируемой нуклеиновой кислоты в отрицательном контроле, или предпочтительно не большей в указанное предпочтительное число раз, обычно можно сделать заключение об отсутствии указанной нуклеиновой кислоты в этом образце.

В предпочтительных вариантах осуществления, присутствие или отсутствие в этом образце представляющей интерес нуклеиновой кислоты оценивают амплификацией в реальном времени, предпочтительно ПЦР в реальном времени. В этих системах, общей мерой, используемой для выражения количества матрицы для конкретной нуклеиновой кислоты в образце, является величина Ct. Вкратце, величина Ct обозначает количество циклов, при котором флуоресценция, приписываемая накапливающемуся продукту амплификации (AR_n), переходит через условную (произвольно выбранную) величину флуоресценции, установленную выше фоновой флуоресценции, но в пределах экспоненциальной фазы амплификации (т.е. в пределах части, которая казалась бы линейной на log 2-графике зависимости флуоресценции от числа циклов).

Таким образом, в амплификации в реальном времени обычно можно сделать заключение о присутствии конкретной нуклеиновой кислоты в образце, когда Ct этого образца (SAM C_t) является более низким, чем C_t отрицательного контроля (NC Ct); и можно сделать предпочтительно, когда SAM C_t <

- 22 031180 (NC Ct - 1), например, SAM Ct < (NC Cf - 2), SAM Cf < (NC Ct - 3) или SAM Ct < (NC Ct - 4), более предпочтительно, когда SAM C_t < (NC C_f - 5), например, SAM C_t < (NC C_t - 6), SAM C_t < (NC C_t - 7), SAM C_t < (NC C_t - 8) или SAM C_t < (NC C_t - 9), даже более предпочтительно, когда SAM C_t < (NC C_t - 10), например, SAM Ct < (NC Ct - 11), SAM Ct < (NC Ct - 12), SAM Ct < (NC Ct - 13), SAM Ct < (NC Ct - 13) or SAM C_t < (NC Ct - 14), но более предпочтительно, когда SAM C_t < (NC Ct - 15), например, SAM C_t < (NC C_t 16), SAM C_t < (NC C_t - 17), SAM Ct < (NC C_t - 18) или SAM Ct < (NC Ct - 19), еще более предпочтительно, когда SAM Ct < (NC Ct - 20), например, SAM Ct < (NC Ct - 25), SAM Ct < (NC Ct - 30) или SAM Ct < (NC Ct - 35).

Таким образом, в амплификации в реальном времени, когда SAM C_t является не меньшей (например, одинаковой, почти одинаковой или большей), чем NC Ct, или предпочтительно является не меньшей на предпочтительные перепады, указанные выше, обычно может быть сделано заключение об отсутствии указанной нуклеиновой кислоты в этом образце.

Как отмечалось выше, в системах амплификации в реальном времени, которые не используют последовательно-специфические зонды (например, когда продукт амплификации детектируют с использованием не специфических в отношении последовательности красителей ДНК, таких как, например, SYBR Green I), специфичность продукта амплификации может быть подтверждена выполнением анализа кривой плавления и определением Tm. О присутствии специфического продукта амплификации можно заключить, когда наблюдаемая Tm является идентичной или по существу идентичной (предпочтительно в интервале ±3°С, более предпочтительно ±2°С, еще более предпочтительно ±1°С, даже более предпочтительно ±0,5°С и еще более предпочтительно ±0,2 или ±0,1°С) рассчитанной и/или экспериментально определенной температуре плавления ожидаемого ампликона.

Кроме того, заключение о специфической амплификации может быть предпочтительно сделано, когда анализ кривой плавления обнаруживает единственную Tm. Альтернативно или дополнительно, заключение о специфической амплификации может быть предпочтительно сделано, когда продукт амплификации обнаруживает единственный, ожидаемый размер после гель-электрофореза. Однако, появление продукта (продуктов) неспецифической амплификации может быть до некоторой степени переносимым на практике, предпочтительно, если такой продукт (такие продукты) неспецифической амплификации составляют менее 50%, более предпочтительно менее 40%, даже более предпочтительно менее 30%, еще более предпочтительно менее 20%, даже еще более предпочтительно менее 10%, более предпочтительно менее 5%, даже более предпочтительно менее 2% и наиболее предпочтительно менее 1%, например, менее 0,5% или менее 0,1%, общего количества (масса/масса) продукта амплификации. Такие продукт (продукты) неспецифической амплификации могут наблюдаться, например, в виде одного или нескольких дополнительных размеров продуктов после гель-электрофореза.

В дополнительном развитии этого изобретения отмечается, что ампликоны, амплифицированные с использованием одного и того же набора праймеров на нуклеиновых кислотах, происходящих из различных независимых трансформантов, могут обнаруживать различающиеся величины Tm, предположительно вследствие некоторых различий в последовательности между этими ампликонами. В качестве примера, но не ограничения, ампликоны, амплифицированные с использованием набора праймеров SEQ ID NO: 11 и 12 (табл. 4) на Bt11 и Bt176, обнаруживают такое различие в их Tm. Таким образом, наблюдаемая величина Tm может служить в качестве дополнительной отличающей информации для использования в способе этого изобретения, так что получают даже более детальное указание на присутствие или отсутствие нуклеиновых кислот из таких конкретных независимых трансформантов.

Альтернативно или дополнительно, в следующей вариации, конкретная нуклеиновая кислота может быть амплифицирована с использованием конкретного набора праймеров для одного или более независимых трансформантов, хотя тот же самый праймер не мог бы амплифицировать соответствующую нуклеиновую кислоту в одном или нескольких других независимые трансформантных, предположительно вследствие некоторых различий последовательности в сайтах связывания праймера. Хотя такая ситуация может делать необходимым применение двух или более наборов праймеров для амплификации соответствующей нуклеиновой кислоты из различных независимых трансформантов (и может в этом отношении быть менее выгодной, чем выбор набора праймеров, который амплифицирует эту нуклеиновую кислоту из всех представляющих интерес независимых трансформантов в растении), это может давать преимущество обеспечения дополнительной информации о присутствии или отсутствии нуклеиновых кислот из конкретных независимых трансформантов в данном образце. Например, нуклеиновая кислота Cry1Ab может быть преимущественно детектирована из MON810 с использованием набора праймеров SEQ ID NO: 30 и 31 и из Bt11 и Bt176 с использованием набора праймеров SEQ ID NO: 11 и 12 (табл. 4).

Квалифицированному в данной области специалисту будет понятно, что реакции амплификации, например, ПЦР, могут вызывать появление неспецифического, побочного продукта - димера праймера. Такие продукты, димеры праймера, могут обычно быть легко отличимыми от продукта (продуктов) специфической амплификации по их отличающемуся, наиболее часто меньшему размеру и/или Tm. Таким образом, квалифицированный в данной области специалист был бы способен распознать и минимизировать влияние таких артефактов на анализ реакции амплификации. Предпочтительные праймеры это

- 23 031180 го изобретения, такие как перечисленные в табл. 1 и 4, были сконструированы для минимизации действия димера праймера.

Следующим предметом обсуждения является чувствительность способов детектирования, используемых в данном изобретении, которая может быть выражена как их предел детектирования (LOD), обозначающий здесь самое низкое количество или самую низкую концентрацию аналита (здесь конкретной подлежащей детектированию нуклеиновой кислоты) в образце, которые могут быть достоверно детестированы, хотя и необязательно в количественном выражении. Выражение достоверно детектированы, обозначает здесь, что образцы, содержащие количество или концентрацию LOD анализируемого вещества, будут давать положительный результат в > 50% повторных детектирований, предпочтительно в > 60%, более предпочтительно в > 70%, даже более предпочтительно в > 80%, еще более предпочтительно в > 90% и наиболее предпочтительно в > 95% или даже в > 99% повторных детектирований.

Предпочтительно, LOD способов детектирования, подходящих для применения в этом изобретении, выражаемый в виде копийности LOD конкретной представляющей интерес нуклеиновой кислоты в образце, подвергаемой детектированию, может быть равен 10000 или менее, например, 9000 или менее, 8000 или менее, 7000 или менее или 6000 или менее, более предпочтительно 1000 или менее, например, 900 или менее, 800 или менее, 700 или менее или 600 или менее, еще более предпочтительно 500 или менее, например, 400 или менее, 300 или менее или 200 или менее, еще более предпочтительно 100 или менее, например, 90 или менее, 80 или менее, 70 или менее или 60 или менее, и наиболее предпочтительно 50 или менее, с примерными предпочтительными вариантами, включающими в себя 40 или менее, 30 или менее, 20 или менее или даже 10 или менее, например, 1, 2, 3,4, 5, 6, 7, 8 или 9. Предпочтительные праймеры этого изобретения, такие как праймеры, перечисленные в табл. 1 и 4, были сконструированы для достижения особенно высокой чувствительности (низкого LOD).

В данном контексте, термин кукуруза относится к Zea mays, предпочтительно Zea mays ssp. mays, и включает в себя все сорта растения, которые были выведены с кукурузой, в том числе дикие виды кукурузы; термины рапс, масличный рапс или канола относятся взаимозаменяемо к Brassica napus и включают в себя все сорта, которые были выведены с рапсом, в том числе дикие виды рапса; термины соя (soy, soya bean или soybean) относятся взаимозаменяемо к Glycine max и включают в себя все сорта растения, которые могут быть выведены с соей, в том числе дикие виды сои; термин рис относится к Oryza sativa, в том числе, без ограничения, ssp. indica и japonica, и включает в себя все сорта растения, которые могут быть выведены с рисом, в том числе дикие виды риса; термин сахарная свекла относится к Beta vulgaris и включает в себя все сорта растения, которые могут быть выведены с сахарной свеклой, в том числе дикие виды сахарной свеклы; термин хлопчатник относится к Gossypium species, предпочтительно Gossypium hirsutum, и включает в себя все сорта растения, которые могут быть выведены с хлопчатником, в том числе дикие виды хлопчатника; термин картофель относится к Solarium tuberosum и включает в себя все сорта растения, которые могут быть выведены с картофелем, в том числе дикие виды картофеля.

Независимые трансформанты растений называются здесь их обозначениями, обычно используемыми в данной области и известными квалифицированному в данной области специалисту. Тем не менее, в качестве дополнительной помощи, табл. 2 ниже суммирует дополнительную информацию, достаточную для специфической идентификации указанных независимых трансформантов.

Таблица 2

Незавимимый трансформант	Компания	Таксон хозяина	Уникальный идентификатор (UI)
Btl76	Syngenta	Zea mays	SYN-EV176-9
Bill	Syngenta	Zea mays	SYN-BT011-1
MON810	Monsanto	Zea mays	MON-00810-6
MON863	Monsanto	Zea mays	MON-00863-5
TCI 507	Pioneer Hi-Bred / Dow AgroScience	Zea mays	DAS-01507-1
NK603	Monsanto	Zea mays	MON-00603-6
Т25	Bayer CropScience	Zea mays	ACS-ZM003-2
GA21	Monsanto	Zea mays	MON-00021-9
DAS-59122	Dow AgroSciences / Pioneer Hi-Bred	Zea mays	DAS-DAS-59122-7
MIR604	Syngenta Seeds	Zea mays	SYN-IR604-5
LY038	Renessen LLC / Monsanto	Zea mays	REN-00038-3
ΜΘΝ88017	Monsanto	Zea mays	MON88017-3
Topas 19/2	Bayer CropScience	Brassica napus	ACS-BN007-1
MS1	Bayer CropScience	Brassica napus	ACS-BN004-7
RF1	Bayer CropScience	Brassica napus	ACS-BN001-4

- 24 031180

RF2	Bayer CropScience	Brassica napus	ACS-BN002-5
RF3	Bayer CropScience	Brassica napus	ACS-BN003-6
MS8	Bayer CropScience	Brassica napus	ACS-BN005-8
GT73	Monsanto	Brassica napus	MON-00073-7
Т45	Bayer CropScience	Brassica napus	ACS-BN008-2
Liberator рНоеб/Ас	Bayer CropScience	Brassica napus	ACS-BN010-4
GS40/90pHoe6/Ac	Bayer CropScience	Brassica napus	ACS-BN010-4
MS1/RF1	Bayer CropScience	Brassica napus	ACS-BN004-7 x ACS-BN001-4
MS1/RF2	Bayer CropScience	Brassica napus	ACS-BN004-7 x ACS-BN002-5
MS8/RF3	Bayer CropScience	Brassica napus	ACS-BN005-8 x ACS-BN003-6
OXY235	Bayer CropScience	Brassica napus	ACS-BN011-5
MON 40-3-2	Monsanto	Glycine max	MON-04032-6
MON89788	Monsanto	Glycine max	MON-89788-1
А2704-12	Bayer CropScience	Glycine max	ACS-GM005-3
А5547-127	Bayer CropScience	Glycine max	ACS-GM006-4
LL62	Bayer CropScience	Oryza sativa	ACS-OS002-5
LL06	Bayer CropScience	Oryza sativa	ACS-OS001-4
Т120-7	Bayer CropScience	Beta vulgaris	ACS-BV001-3
Н7-1	KWS SAATAG/ Monsanto	Beta vulgaris	KM-000H71-4
А5-15	DANISCO Seed; DLF Trifolium A/S; Monsanto	Beta vulgaris	DLF-0A515-7
LL cotton 25	Bayer CropScience	Gossypium hirsutum	ACS-GH001-3
MON 1445	Monsanto	Gossypium hirsutum	MON-01445-2
MON 531	Monsanto	Gossypium hirsutum	MON-00531-6
MON 15985	Monsanto	Gossypium hirsutum	MON-15985-7
EH-92-527-1	Amylogen HB (BASF Plant Science	Solanum tuberosum	BPS-25271-9

Перечисленные выше уникальные идентификаторы (UI) представляют систему уникальной классификации независимых трансформантов растений, установленную вместо прежней классификации Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD) и описанную в ее публикациях ENV/JM/MONO(2002)7: OECD Guidance for the Designation of a Unique Identifier for Transgenic Plants, of October 20, 2004, и ENV/JM/MONO(2002)7/REV1 of November 7, 2006. Эти указанные уникальные идентификаторы используются, признаются и приписываются в международном масштабе, в том числе в Европе (см., например, Commission Regulation (EC) No 65/2004 of January 14, 2004, где устанавливается система для развития и приписывания уникальных идентификаторов генетически модифицированным организмам).

Подробная информация в отношении вышеописанных и последующих представляющих интерес независимых трансформантов растений, такая как, например, информация о таксонах хозяев, трансформирующих конструкциях, инсертированных последовательностях и т.д., может быть доступна через публично доступные порталы различных регламентирующих органов власти, в том числе, например, OECD BioTrack Product Database (http://www2.oecd.org/biotech/default.aspx), US FDA (http://www.cfsan.fda.gov/), European Community Register of GM Food and Feed (http://ec.europa.eu/food/dyna/gm_register/index_en.cfm), Agbios database (www.agbios.com), или the EC ГМО Compass database (http://www.gmo-compass.org/), а также в научной литературе и т.д. Квалифицированный в данной области специалист хорошо знает об этом и может использовать такие источники баз данных.

Кроме того, специфические в отношении независимых трансформантов способы детектирования и специфические в отношении конструкций способы детектирования (например, см. Codex Alimentarium) являются доступными и позволяют недвусмысленно различать приведенные выше и последующие независимые трансформанты. Например, European Community Reference Laboratory (CRL) (http://gmocrl.jrc.it/; http://gmo-crl.jrc.it/statusofdoss.htm) предоставляет список надежных способов для специфического в отношении независимых трансформантов детектирования, обеспечиваемых изготовителями, описанных в научной литературе или разработанных самой CRL.

Как отмечалось выше, это изобретение позволяет делать вывод о присутствии или отсутствии в образце материала, происходящего из выбранных независимых трансформантов, их гибридов, или родст

- 25 031180 венных им независимых трансформантов.

Термин их гибриды в этом контексте относится к потомству, полученному одним или несколькими скрещиваниями двух или более совместимых независимых трансформантов (т. е. независимых трансформантов, способных скрещиваться, в частности, независимых трансформантов, принадлежащих к одному и тому же таксону), так что указанное полученное потомство содержит трансгенные вставки из двух или более родительских скрещиваемых независимых трансформантов.

Термин родственные им независимые трансформанты в этом контексте относится к независимым трансформантам, которые были получены введением в одни и те же таксоны тех же самых трансформирующих конструкций, что и в соответствующих указанных независимых трансформантов, но, несмотря на это отличаются от указанных независимых трансформантов, например, могут обычно отличаться в количестве и/или сайте геномных интеграции этой трансформирующей конструкции. Часто, такие независимые трансформанты могут сами быть предметом для получения разрешения. В других случаях, такие родственные независимые трансформанты могут присутствовать в виде нежелательных примесей. Таким образом, посредством детектирования генетических элементов из внутренней части трансформирующих конструкций, способ данного изобретения позволит выгодным образом детектировать такие независимые трансформанты.

Как отмечалось выше, способы этого изобретения включают в себя детектирование присутствия или отсутствия в образцах одной или нескольких нуклеиновых кислот, включающих нуклеиновых кислоты или состоящих из нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами а)-и). определенными выше.

В этом отношении, выражение нуклеиновая кислота, происходящая из конкретного таксона или специфическая для конкретного таксона, такая как нуклеиновые кислоты, перечисленные под пунктом a) Zm, b) Bn, с) Gm, о) Or, р) Bv, q) Gs и t) St, означает, что указанная нуклеиновая кислота в этом образце происходит из генетического материала, предпочтительно геномной ДНК, указанного конкретного таксона и не присутствует - и, следовательно, не могла бы быть детектирована с использованием выбранного способа детектирования - в генетическом материале, происходящем из других таксонов, таких как остальные таксоны, перечисленные выше. В качестве примера, но не для ограничения, указанная нуклеиновая кислота, происходящая из этого конкретного таксона, может либо не иметь гомологов в других таксонах, либо ее гомологи в других таксонах могут иметь достаточно отличающиеся последовательности, так что они не могли бы быть детектированы выбранным способом детектирования. Например, в одном сайте детектирования, например, в сайте детектировании, с котором мог бы гибридизоваться зонд или один или несколько праймеров амплификации, внутри этой конкретной нуклеиновой кислоты, такие гомологи могут обнаруживать меньшую чем 100% идентичность последовательности, предпочтительно меньшую чем 95%, даже более предпочтительно меньшую чем 90%, еще более предпочтительно меньшую чем 85%, еще более предпочтительно меньшую чем 80% и наиболее предпочтительно меньшую чем 75%, в предпочтительных примерных вариантах меньшую чем 70%, меньшую чем 65%, меньшую чем 60%, меньшую чем 55% или меньшую чем 50% идентичность последовательности с рассматриваемой нуклеиновой кислотой.

Кроме того, термин нуклеиновая кислота, происходящая из, используемый, в частности, в а)-и), означает, что указанные нуклеиновые кислоты происходят из их соответствующих таксонов, генетических элементов, генов, открытой рамки считывания и т.д., хотя они - как обнаружено в этом образце могут структурно отчасти отличаться от них.

Например, последующая обработка растительного материала может вызывать изменения в структуре нуклеиновой кислоты (например, ДНК), и, возможно, что наиболее важно, может вызывать ее фрагментацию. Кроме того, иногда функциональные фрагменты или варианты полноразмерных элементов могут быть использованы в трансгенных растениях. Таким образом, нуклеиновые кислоты, происходящие из нуклеиновых кислот, указанных под пунктами а)-и) выше, могут быть, например, их фрагментами, пока такие фрагменты позволяют их специфическое отнесение к исходным нуклеиновым кислотам. Например, такие фрагменты могут включать в себя по меньшей мере 15 непрерывных п.н. последовательности, из которой они произведены, предпочтительно по меньшей мере 20 непрерывных п.н., например по меньшей мере 30 или по меньшей мере 40 непрерывных п.н., более предпочтительно по меньшей мере 50 непрерывных п.н., например, по меньшей мере 60 или по меньшей мере 70 непрерывных п.н., даже более предпочтительно по меньшей мере 80 непрерывных п.н., например, по меньшей мере 90 непрерывных п.н., еще более предпочтительно по меньшей мере 200 непрерывных п. н., например, по меньшей мере 300 непрерывных п.н., по меньшей мере 400 непрерывных п.н. или по меньшей мере 500 непрерывных п. н. или более, и могут даже включать в себя полноразмерные элементы.

Другие модификации нуклеиновых кислот, ожидаемые из последующей обработки растительного материала, например, частичное дезаминирование и т.д., также обсуждаются под термином происходящие из.

В предпочтительном варианте осуществления нуклеиновая кислота a) Zm происходит из эндогенного гена (adh-1) алкогольдегидрогеназы Zea mays. Примерная, но не ограничивающая последовательность гена adh-1 Zea mays найдена под номером доступа AF123535.1 в базе данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).

- 26 031180

В следующем предпочтительном варианте осуществления, нуклеиновая кислота b) Bn происходит из эндогенного гена (acc) ацетил-СоА-карбоксилазы или эндогенного гена круциферина Brassica napus. Примерная, но не ограничивающая последовательность гена acc Brassica napus найдена под номером доступа Х77576.1 в базе данных GenBank; примерная последовательность гена круциферина найдена под номером доступа X14555.1 в базе данных GenBank.

В следующем предпочтительном варианте осуществления нуклеиновая кислота с) Gm происходит из эндогенного гена (lec) лектина Glycine max. Примерная, но не ограничивающая последовательность гена lec Glycine max найдена под номером доступа K00821.1 в базе данных GenBank.

В следующем предпочтительном варианте осуществления нуклеиновая кислота о) Or происходит из эндогенного гена (pld) фосфолипазы D Oryza sativa. Примерная, но не ограничивающая последовательность гена pld Oryza sativa найдена под номером доступа АВ001919.

В предпочтительном варианте осуществления нуклеиновая кислота р) Bv происходит из эндогенного гена глутаминсинтазы (GluA3) Beta vulgaris. Примерная, но не ограничивающая последовательность гена GluA3 Beta vulgaris найдена под номером доступа AY026353.1 в базе данных GenBank.

В предпочтительном варианте осуществления нуклеиновая кислота q) Gs происходит из эндогенного гена (sah-7) гомолога 7 sinopsis arabidopsis Gossypium. Примерная, но не ограничивающая последовательность гена sah-7 Gossypium найдена под номером доступа AY117067 (авторы: Senchina et al. 2003. Mol Biol Evol 20 (4): 633-643) в базе данных GenBank.

В предпочтительном варианте осуществления, нуклеиновая кислота t) St происходит из эндогенного гена УДФ-глюкозофосфорилазы (UGPase) Solarium tuberosum. Примерная, но не ограничивающая последовательность гена UGPase Solarium tuberosum найдена под номером доступа U20345 в базе данных GenBank.

В следующем предпочтительном варианте осуществления, характерная для растений нуклеиновая кислота происходит из эндогенного хлоропластного гена RBCL (rbcl) Zea mays. Примерная, но не ограничивающая последовательность гена rbcl Zea mays найдена под номером доступа Z11973.1 в базе данных GenBank.

Квалифицированный в данной области специалист способен конструировать и подтверждать специфические зонды или пары праймеров из вышеописанных последовательностей для использования в стадиях детектирования данного способа.

Ссылки на элементы последовательностей и гены, упоминаемые в этом описании для нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами d)-n), r), s) и u), известны квалифицированному специалисту в области генетической модификации растений. Таким образом, квалифицированный специалист понимает, к каким последовательностям относятся эти обозначения, и может вполне понять уровень изменений в отношении этих последовательностей, который является общим в генерировании трансгенных растений.

В одном варианте осуществления, нуклеиновая кислота, присутствующая в независимом трансформанте, может включать в себя открытую рамку считывания или ее функциональную часть (т.е. часть, успешно выполняющую желаемое действие в трансгенном растении) упоминаемых здесь генов, в частности, генов, перечисленных под пунктами f)-n), r), s) и u), выше.

Тем не менее, посредством дополнительного объяснения, но не ограничения, авторы данного изобретения приводят здесь список примерных последовательностей для конкретных генов и элементов, упоминаемых под пунктами d)-n), r), s) и u), и примерную происходящую из исходного растения нуклеиновую кислоту:

Элемент последовательности/ген промотор CMV p35S терминатор NOS ORF CrylAb ORF гена bar

Номер доступа GenBank

V00140 (весь геном CAMV)

V00087.1

AF465640

AY346130.1

ORF гена pat

ORF гена EPSPS

DQ156557.1

AY125353.1

ORF модифицированного гена СгуЗА промотор Glbl

ORF гена СгуЗВЫ

ORF гена Вхп

AR836206.1

CS155614.1

CS410008.1

Е01313.1

ORF гена Cry 1 Ас

ORF гена Сгу2АЬ2

ORF гена Gbss

EF094884.1

DQ361266.1

ORF Х58453.1 хлоропластный ген rbcL Zea mays

Z11973.1

Должно быть понятно, что нуклеиновые кислоты, фактически присутствующие в независимых трансформантах растений, могут содержать последовательности, которые могут отличаться до некоторой степени от приведенных выше примерных последовательностей. Например, такие различия могут вклю- 27 031180 чать в себя делеции, добавления и/или замены оснований, укорочения (например, включение функциональных фрагментов), слияния с другими элементами (например, слияние с сигналами мембранного транспорта или сортинга органелл) и т.д.

Фактические последовательности приведенных выше и других элементов, обнаруживаемые в независимых трансформантах, были во многих случаях определены и доступны через GenBank и другие базы данных последовательностей. Таким образом, должны выполняться сопоставления последовательностей для идентификации районов в вышеуказанных нуклеиновых кислотах, наиболее подходящих для получения из них зондов или ампликонов.

Таким образом, может быть выгодным образом произведен зонд или ампликон (и соответствующий набор праймеров) из частей каждой из вышеупомянутых нуклеиновых кислот, который обнаруживается в большинстве независимых трансформантов и/или который обнаруживает наивысшую идентичность между различными независимыми трансформантами. Такие зонды или пара праймеров будут увеличивать шанс детектирования этой конкретной нуклеиновой кислоты из различных независимых трансформантов. Квалифицированный специалист может следовать этой инструкции для выполнения необходимых сопоставлений последовательностей.

Как указано в разделе Выводы, это изобретение обеспечивает также предпочтительный способ заключения в отношении потенциального присутствия или отсутствия материала от одного или нескольких представляющих интерес независимых трансформантов растений для использования в стадии (2) вышеописанных способов. В частности, результаты, полученные для образца в стадии (1) представлены в виде набора G_sam, символизирующего коллекцию нуклеиновых кислот, выбранных из нуклеиновых кислот, содержащих нуклеиновые кислоты или состоящих из нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами а)-и) выше, которые были детектированы как присутствующие в этом образце; и сравнении указанного набора GSAM с одним или несколькими наборами представляющих интерес GX, представляющих подлежащие оценке индивидуальные независимые трансформанты. Эти наборы представляющих интерес G_X состоят из нуклеиновых кислот, т.е. представляют коллекцию нуклеиновых кислот, выбранных из нуклеиновых кислот, включающих нуклеиновой кислоты или состоящих из нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами а)-и) выше, которые обнаруживаются в соответствующих независимых трансформантах и, следовательно, могут быть детектированы в стадии (1) (в той степени, до которой указанная стадия (1) детектирует присутствие указанных нуклеиновых кислот), если этот образец содержал материал, происходящий из соответствующих независимых трансформантов, или гибрида, включающего в себя этот материал, или родственного независимого трансформанта.

Следующая табл. 3 перечисляет, какие нуклеиновые кислоты из нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами а)-и) выше, присутствуют в конкретных представляющих интерес независимых трансформантах.

- 28 031180

Таблица 3

Признаки независимых . трансформантов.....

Незавимимый трансформант

a

b

c

d

e

f

g

h

i

j

k

1

m

n

0

P

q

r

s

t

u

Btl76

+

-

-

+

-

+

+

Bill

+

-

-

+

+

+

-

+

BtlO

+

-

-

+

+

+

-

+

MON810

+

-

-

+

+

+

MON863

+

-

-

+

+

TCI 507

+

+

+

NK603

+

-

-

+

+

+

T25

+

+

+

GA21

+

+

DAS-59122

+

+

+

MIR604

+

+

+

LY038

+

-

-

+

+

+

+

MON88017

+

-

-

+

+

+

+

Topas 19/2

+

+

+

MS1

+

+

+

RF1

+

+

-4-

RF2

+

+

+

RF3

+

+

+

MS8

+

+

+

GT73

+

+

T45

+

+

+

Liberator pHoe6/Ac

+

+

+

GS40/90pHoe6/Ac

+

+

MS1/RF1

+

+

+

MS1/RF2

+

+

+

MS8/RF3

+

+

+

OXY235

+

+

+

MON 40-3-2

+

+

+

+

MON89788

+

+

A2704-12

+

+

+

A5547-127

+

+

+

LL62

+

+

+

LL06

+

+

+

LL601

-

+

+

-

+

+

T120-7

+

+

+

H7-1

+

+

+

A5-15

-

+

+

+

+

LL cotton 25

-

+

+

-

+

+

MON 1445

-

+

+

+

+

MON 531

-

+

+

+

+

-

-

-

MON 15985

-

+

+

+

+

+

-

-

EH-92-527-1

+

+

+

Как уже объяснялось:

если G_x равен G_sam (G_x=G_sam), то материал, происходящий из независимого трансформанта растения X, или его гибрида, или родственного ему независимого трансформанта, потенциально присутствует в этом образце;

если G_x является истинным подмножеством G_sam (G_x с G_sam), то материал, происходящий из независимого трансформанта растения X, или его гибрида, или родственного ему независимого трансформанта, потенциально присутствует в этом образце;

если G_x не равен G_sam и G_x не является истинным подмножеством G_sam, (G_x Ψ G_sam и G_x q G_sam), то материал, происходящий из независимого трансформанта растения X, или его гибрида, или родственного ему независимого трансформанта, отсутствует в этом образце.

В следующем предпочтительном варианте осуществления, если G_x равен G_sam и если ни один набор или ни одна сумма двух или нескольких наборов, представляющих независимые трансформанты (в частности, наборов, представляющих независимые трансформанты, выбранные из группы, содержащей или состоящей из θ^Βι176> θ^Βι11’ Gbuo, , то материал, произве денный из независимого трансформанта растения X или из его гибрида, или из родственного им независимого трансформанта, присутствует в этом образце.

В дополнительном развитии этого способа оценки, нуклеиновым кислотам, включающим нуклеиновые кислоты или состоящим из нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами а)-и) выше, приписываются соответствующие уникальные значения. Таким образом, набору G_sam приписано в этом случае значение VG_sam, являющееся множеством уникальных значений, приписанных нуклеиновым кислотам, детектированным на стадии (1) в качестве присутствующих в этом образце; и набору представляющих интерес G_x приписано значение VG_x, являющееся множеством уникальных значений, приписанных нуклеиновым кислотам, выбранным из нуклеиновых кислот, включающих нуклеиновые кислоты или состоящих их нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами а)-и) выше, которые обнаруживаются в указанной событии и, следовательно, могут быть детектированы на стадии (1).

Таким образом, в предпочтительном примере, нуклеиновым кислотам

GmON810, GmON863, GtC1507, GnK603, Gt25, GgA21, GdAS-59122, GmIR604, Gl Y038, GmON88017, GTopas 19/2, Gmsi, Grfi, Grt2, Gmsi/rfi, Gmsi/rf2, Gmss, Grf3 и Geh92-527-i), дру_гие, _чем G_x, _не р_авны G_X

- 29 031180 “Zm”, “Bn”, “Gm”, “p35S’, “tNOS”, “CrylAb”, “PAT/bar”, “PAT/pat”, “CP4-EPSPS”, “шСгуЗА”, “cordap A”, “Glbl”, “Cry3Bbl)”, “Bxn”, “Or”, “Bv”, “Gs”, “Cry 1 Ac”, “Cry2ab2”, “St” и “Gbss” приписаны соответствующие уникальные значения

Vzm, W, Vg,h, Vpjjs, VtNOS,

VCrylAb, VPAT/bar, VPAT/pat, VCP4-EPSPS, V_mCry3A, Vcordap a, VGlbl, Vcry3Bbl, VBxn,

Vor, Vbv, Vgs, VCrylAc, VCry2ab₂, Vst И Veto;

и каждому набору представляющих интерес G_X приписано соответствующее значение VG_X, выбранное из значений из группы, содержащей значения или состоящей из значений

VGbh76, VGbh/, VGbgo, VGmws/o, VGjwcwmj, VGrc/507, VGaooj,

VGr25, VGgW, VGdAS-59122, VGm1R604, VGilW, VGmON880!7, VGTopas 19/2, VGmsi, VGrfi, VGbf2, VGmsi/rfi, VGmsi/rfz, VGmss, VGbfj, VGmss/rf3, VGgT73 , VGt4s, VGLiberator рНоеб/Ас, VGGS40/90pHoe6/Ac, VGoXY235, VGmON40-3-2,

VGmON89788 , VGa2704-12, VGa5547-127, VG/w, VGlIOi, VGlL601, VGt120-7, NGh7-1, VGaS-Is, VGll cotton 25, VGMON1445, VGmvW, VGm0N1598s ИЛИ VGeH92-527-i, в которых

VGBtl76 = Vz_ra ^x Vp35S ^x VCrylAb ^x VPAT/bar,

VGetll = VZm ^x Vp35S ^x VtNOS ^x V CrylAb ^x VPAT/pat, VGBtlO = Vzm ^x Vp35S ^x VtNOS ^x VCrylAb ^x VPAT/pat, VGmONSIO = Vzm ^x VP35S ^x VtNOS ^x V CrylAb,

V GMON863 = Vzm X V_p35S ^x VtNOS, VGtC1507 = Vzm ^x V_p33S ^x VPAT/pat,

VGnK603 = Vzm ^x Vp35S ^x VtNOS ^x VcP4-EPSPS,

VGt25 = Vzm ^x Vp35S ^x VpAT/pat,

VGgA21 ⁼ Vzm^x VtNOS,

VGdAS-59122 = Vzm ^x Vp35S ^x VPAT/bar, VGm1R604 = VZm^x VtNOS ^x VтСгуЗА, VGlY038 - Vzm ^x VP35S ^x VtNOS ^x VcordapA ^x VgIM, VGmON88017 = Vz/n ^x Vp35S ^x VtNOS ^x VCP4-EPSP ^x Vcry3Bbl, VG Topas 19/2 = VBn ^x V_P35S ^x VPAT/pat, VGmSI = VBn ^x VtNOS ^x VPAT/bar, VGrfi = Vb« X VtNOS X VPAT/bar, VGrF2 = 'Увп^х VtNOS X VPAT/bar, NGmS8 - VBn X VtNOS X VPAT/bar,

VGrf3 - VBn x Vinos ^x Vpat/Ьог,

VGmSI/RFI = Увп^х VtNOS X VPAT/bar, VGmS1/RF2 ~ Ven X VtNOS X V PAT/bar, VGMS8/RF3 = Ven X VtNOS X V PAT/bar, VGGT73 = Ven X V CP4-EPSPS, VGt45 = Vb„ X V_p35S X VPAT/pat, VGLiberatorрНоеб/Ас ⁼ VBn^x Vp35S ^x VPAT/pat,

V GcS40/90pHoe6/Ac = V Bn ^x Vp35S ^x VPAT/pat,

- 30 031180

VGoXY235 = VBn ^x VpJJS X V Bxn,

VGMON40-3-2 = VGm^x V_p35S ^x VtNOS ^x VCP4-EPSPS,

VGmON’89788 ⁼ VGm^x VCP4-EPSPS,

VGa2704-12 = VGm^x V_P35S ^x VPAT/pat,

VGA5547-I27 = VGm^x V_P35S ^x VPAT/pat,

VGlL62 = VOr ^x V_P35S ^x V PAT/bar,

VGlL06 = Vor^x V_P35S ^x V PAT/bar,

VGlL601 = Vor^x V_P35S ^x VtNOS ^x VPAT/bar,

VGt 120-7 ~Vbv^x V_p35S ^x VPAT/pat,

VGh7-1 = Vbv^x V_p35S ^x V CP4-EPSPS,

VGas-is = Vsv ^x V_P35S ^x Vinos ^x Vcp4-epsps,

VGee cotton 25 = V_GS^X V_p35S ^x VtNOS ^x vPAT/bar,

VGMON1445 = Vgs^x Vp35S ^x VtNOS ^x VCP4-EPSPS,

VGMON531 -Vgs ^x Vp35S ^x VtNOS ^x vCry 1 Ac,

VGMON15985 = VGs ^x V_p35S ^x VtNOS ^x V CrylAc ^x VCrylAc,

ИЛИ VGEH92-527-1 = VSt ^x VtNOS ^x VGbss.

Обратите внимание на то, что поскольку эти способы не тестируют присутствие всех нуклеиновых кислот под пунктами а)-и), приведенные выше значения будут определены в терминах нуклеиновых кислот, присутствие которых эффективно тестируется. В качестве примера, но не ограничения, когда присутствие нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами j)-n), r) s) и u), определенными выше, которые соответствуют специфическим признакам, наряду с нуклеиновыми кислотами, определенными под пунктами d)-i), не тестируется, то значения, соответствующие нескольким независимым трансформантам, могут быть определены более узким образом: в частности, значения независимых трансформантов кукуру^зы ^VGMIR604=^VZm ^{Х V}tNOS^{, VG}LY038=^VZm ^{Х V}p35S ^{Х V}tNOS^{, VG}MON88017=^VZm ^{Х V}p35S ^{Х V}tNOS ^{Х V}CP4-EPSP^, значение независимых трансформантов масличного рапса VGoxy235=Vbh х Vp35S; значения независимых трансформантов хлопчатника VGmon531=Vgs х Vp35S Х VtNOS, VGmon15985=Vgs х Vp35S Х VtNOS; и значение независимых трансформантов картофеля VG_EH92-527-i=V_St х V_tNOS.

Таким образом, стадия (iii) этого варианта осуществления могла бы включать в себя выполнение для каждого набора представляющих интерес G_X логических операций:

если VG_sam/VG_x равно 1, то материал, происходящий от независимого трансформанта растения X, или из его гибрида, или от родственного ему независимого трансформанта, потенциально присутствует в этом образце;

если VGSAM/VGX равно одному значению или кратному двух или более значений, выбранных из группы, состоящей из значений

Vzm, V_Bn, VGm, Vp35S, VftNOS, VcrylAB, VpAR/bar,

VpAR/pat, VcP-EPSPS, V_mCry3A, Vcordap A, Vdbl, Vcry3Bbl, VBxn, Vor, VBxn, Vgs, VcrylAc, Vcry2ab2, Vst И VGbss, то материал, происходящий от независимого трансформанта растения X, из его гибрида, или от родственного ему независимого трансформанта, потенциально присутствует в этом образце;

если VGSAM/VGX не равно 1 и не равно одному значению или кратному из двух или более значений, выбранных из группы, состоящей из значений

Vzm, V_Bn, VGm, V_P35S,

VftNOS, VcrYlAB, VpAR/bar, VpAR/pat, VcP-EPSPS, V_mCry3A, Vcordap A, Vdbl, Vcry3Bbl, VBxn, Vor, Vbxo,

Vgs, VcrylAc, Vcry2ab2, Vst И VGbss, то материал, происходящий от независимого трансформанта растения X, из его гибрида, или от родственного ему независимого трансформанта, отсутствует в этом образце.

В следующем предпочтительном варианте осуществления, если VGSAM/VGX равно 1 и если ни одно значение или кратное двух или более значений наборов, представляющих независимые трансформанты (в частности, значений, выбранных из группы, состоящей из или содержащей

VGetl76, VGbiII, VGetlO, VGmON810, VGmON863, VGtC1507, VGnK603, VGt25,

VGgA21, VGdAS-59122, VGmIR604, VGlY038, VGmON88017, VGTopas 19/2, VGmSI, VGrfI, VGrF2, VGmSI/RFI, VGmS1/RF2, VGmS8, VGrF3, VGmS8/RF3, VGgT73, VGt45, VG Liberator pHoe6/Ac, VGGS40/90pHoe6/Ac, VGOXY235, VGmON40-3-2, VGmON89788, VGa2704-12, VGa5547-127, VGlL62, VGlL06, VGLL601, VGT120-7, VGH7-1, VGaS-15, VGlL cotton 25, VGmON1445, VGmON531, VGmON15985 and VGeH92527-1) другие, чем VGX, не равны VGX, то материал, происходящий от независимого трансформанта рас

- 31 031180 тения X, или из его гибрида, или из родственного ему независимого трансформанта, присутствует в данном образце.

В следующем предпочтительном варианте осуществления, уникальные значения, приписанные нуклеиновым кислотам, включающим нуклеиновые кислоты или состоящим из нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами а)-и), т.е. значения, выбранные из группы, состоящей из

Vzm, V_Bn, VGm, Vp35S, VftNOS, VcrylAB, VpAR/bar, VpAR/pat, VcP-EPSPS,

V_mCry3A, Vcordap A, VgIM, Vcry3Bbl, VBxn, Vor, VBxn, Vgs, VcrylAc, Vcry2ab2, Vst И VGbss,

Являются уникальными простыми числами, и эта стадия (iii) включает в себя выполнение для каждого набора представляющих интерес GX логических операций:

если VG_sam/VG_x равно 1, то материал, происходящий от независимого трансформанта растения X, или из его гибрида, или из родственного ему независимого трансформанта, потенциально присутствует в этом образце;

если VG_sam/VG_x является целым числом, большим чем 1, то материал, происходящий от независимого трансформанта растения X, или из его гибрида, или из родственного ему независимого трансформанта, потенциально присутствует в этом образце;

если VG_sam/VG_x не является целым числом, то материал, происходящий от независимого трансформанта растения X, или из его гибрида, или из родственного ему независимого трансформанта, отсутствует в этом образце.

Авторы этого изобретения выявили, что применение простых чисел для представления индивидуальных анализируемых признаков (нуклеиновых кислот), как описано в предыдущем абзаце, является особенно простым и упорядочивает и облегчает анализ этих данных.

Ввиду этого, авторы данного изобретения обсуждают также общую применимость описанного здесь анализа данных с использованием простых чисел в других применениях, например, в области молекулярной биологии или молекулярной медицины и т.д. Таким образом, в одном применении, этот способ может быть обычно использован для определения состава образца, где указанный образец может содержать два или более различных независимых трансформантов (слово независимый трансформант в этом абзаце имеет общее значение, не ограниченное независимыми трансформантами растений) или их материалов, где каждое независимый трансформант характеризуется одним или несколькими признаками или характерными чертами (слова признаки и характерные черты в контексте этого абзаца несут общее значение, не ограничиваемое нуклеиновыми кислотами, хотя и включающими в себя предпочтительно нуклеиновые кислоты). Таким образом, этот образец, а также каждый независимый трансформант могут быть представлены в виде произведения (т.е. операции х) уникальных простых чисел, приписанных каждому из тестируемых признаков или каждой из тестируемых характерных черт, и (потенциальное) присутствие или отсутствие в указанном образце может быть тестировано делением (т.е. операцией / величины, полученной для этого образца, на величину, рассчитанную и приписанную каждому индивидуальному событию, и рассмотрением результата указанного деления, как описано выше, mutatis mutandis.

В предпочтительном варианте осуществления, вышеуказанные стадии вычисления стадии (2) этого способа проводят при помощи вычислительного устройства, например, калькулятора или компьютера; и в дополнительных аспектах это изобретение обсуждает также вычислительное устройство, выполняющее вышеуказанные вычисления, носитель данных (например, дискету, CD-ROM и т.д.), содержащий инструкции для программируемого вычислительного устройства для проведения стадии (2) способа этого изобретения, в том числе вышеуказанных вычислений, набор, содержащий такой носитель данных, вместе с одним или несколькими реагентами, также применимыми в способах этого изобретения. Данное изобретение рассматривает также прикладную программу на основе web, позволяющую выполнять алгоритм стадии (2), где, необязательно, информация о независимые трансформанты, потенциально присутствующих в образце, может непосредственно оцениваться в подсоединенной базе данных посредством встроенной (загруженной) текстовой гиперссылки.

Должно быть понятно, что идентификаторы G_sam, G_x, VG_sam, VG_x и т.д., используемые в предыдущем описании, были выбраны здесь произвольно для обозначения лежащих в основе концепций inter alia наборов и значений, соответственно, и что другие идентификаторы (например, другие буквы, слова или выражения) могут использоваться для представления указанных наборов и значений.

Как упоминалось, способ данного изобретения может предпочтительно оценивать присутствие или отсутствие представляющих интерес нуклеиновых кислот, в частности, нуклеиновых кислот, выбранных из группы, включающей нуклеиновые кислоты или состоящей из нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами а)-и) выше, с использованием амплификации и, в частности, ПЦР-амплификации ампликонов из них.

Понятно, что квалифицированный специалист обычно может быть способен конструировать наборы индивидуальных праймеров для специфической амплификации из известных последовательностей нуклеиновых кислот.

Тем не менее, как уже описывалось, табл. 1 дает список особенно предпочтительных пар праймеров, которые были скрупулезно сконструированы авторами изобретения для обеспечения многочислен- 32 031180 ных преимуществ при использовании в данной методологии. Кроме того, табл. 4 перечисляет праймеры табл. 1 и дополнительно включает в себя дополнительные праймеры и пары праймеров, которые также работают очень удовлетворительно в данном способе, хотя праймеры табл. 1 остаются предпочтительным выбором авторов этого изобретения. Эти наборы праймеров могут выгодным образом достигать амплификации из соответствующих нуклеиновых кислот, присутствующих в релевантных независимых трансформантах растений, и из различно обработанного растительного материала и влечет за собой различные преимущества, описанные в другом месте в этом описании.

Таблица 4

Последовательности праймеров

Нуклеиновая кислота	Праймеры
Zm (adh-1)	Прямой: 5' CgTCgTTTCCCATCTCTTCCTCC 3’ (SEQ ID NO: 1) Обратный: 5' CCACTCCgAgACCCTCAgTC 3' (SEQ ID NO: 2)
Zm (adh-1)	Прямой: 5' TCTCTTCCTCCTTTAGAGCTACCACTA 3' (SEQ ID NO: 56) Обратный: 5' AATCGATCCAAAGCGAGATGA 3' (SEQ ID NO: 57)
Bn (ACC)	Прямой1: 5' GAGAATGAGGAGGACCAAGCTC 3' (SEQ ID NO: 4) Прямой2: 5’GGTGAGCTGTATAATCGAGCGA 3’ (SEQ ID NO: 79) Обратный: 5' GGCGCAGCATCGGCT 3' (SEQ ID NO: 3)
Bn (круциферин)	Прямой: 5' CAGCTCAACAGTTTCCAAACGA 3' (SEQ ID NO: 24) Обратный: 5' CGACCAGCCTCAGCCTTAAG 3’ (SEQ ID NO: 25)
Gm (лектин)	Прямой: 5' CATTACCTATgATgCCTCCACC 3' (SEQ ID NO: 5 ) Обратный: 5' AAgCACgTCATgCgATTC 3' (SEQ ID NO: 6) Обратный’: 5' AAgCACgTCATgCgATTCC 3' (SEQ ID NO: 49)
Gm (лектин) (SLTM)	Прямой: 5' AACCGGTAGCGTTGCCAG 3' (SEQ ID NO: 58) Обратный': 5’ AGCCCATCTGCAAGCCTTT 3’ (SEQ ID NO: 59)
p35S (более длинный)	Прямой: 5'-GACAGTGGTCCCAAAGATGG-3' (SEQ ID NO: 7) Обратный: 5'-GTCTTGCGAAGGATAGTGGG-3' (SEQ ID NO: 8)
“p35S” (более короткий)	Прямой: 5’ AAAGCAAGTGGATTGATGTGATA 3’ (SEQ ID NO: 60) Обратный: 5’ GGGTCTTGCGAAGGATAGTG 3’ (SEQ ID NO: 61)
tNOS (TNOS-D)	Прямой: 5'-GATTAGAGTCCCGCAATTATACATTTAA-3' (SEQ ID NO: 9) Обратный: 5'-TTATCCTAGKTTGCGCGCTATATTT-3' (SEQ ID NO: 10)
tNOS (TNOS-L)	Прямой: 5' CGTTCAAACATTTGGCAATAAAG 3' (SEQ ID NO: 28) Обратный: 5' AAATGTATAATTGCGGGACTCTAATC 3' (SEQ ID NO: 29)
CrylAb	Прямой: 5'-ACCGGTTACACTCCCATCGA-3' (SEQ ID NO: 11) Обратный: 5'-CAGCACCTGGCACGAACTC-3' (SEQ ID NO: 12)
CrylAb	Прямой: 5' GACATCATCTGGGGYATCTT 3' (SEQ ID NO: 30) Обратный: 5’ GCGCTGTTCATGTCGTTGAA 3' (SEQ ID NO: 31)
CrylAb	Прямой: 5' ACGCCTTCCTGGTGCAAA 3' (SEQ ID NO: 47) Обратный: 5' CCTGGTTCCTGGCGAACTC 3' (SEQ ID NO: 48)
PAT/bar	Прямой: 5'-CGTCAACCACTACATCGAGACAA-3' (SEQ ID NO: 13) Обратный: 5'-GTCCACTCCTGCGGTTCCT-3' (SEQ ID NO: 14)
PAT/pat	Прямой: 5'-CCGCGGTTTGTGATATCGTT-3' (SEQ ID NO: 15) Обратный: 5'-TCTTGCAACCTCTCTAGATCATCAA-3' (SEQ ID NO: 16)
CP4-EPSPS	Прямой!: 5'-GGCTCTGAGCTTCGTCCTCCTAAGG-3' (SEQ ID NO: 17) ПрямойГ: 5'-GGCTCTGAGCTTCGTCCTCTTAAGG-3' (SEQ ID NO: 50) Прямой2: 5'-ATCAGTGGCTACAGCCTGCAT-3' (SEQ ID NO: 18) Обратный: 5'-GAATGCGGACGGTTCCGGAAAG-3' (SEQ ID NO: 19)
CP4-EPSPS	Прямой: 5’ GCATGCTTCACGGTGCAA 3’ (SEQ ID NO: 22) Обратный: 5' GGACCTGTGGGAGATAGACTTGTC 3' (SEQ ID NO: 23) Обратный1: 5' TGAAGGACCGGTGGGAGAT 3' (SEQ ID NO: 62) Обратный2: 5' TGAAGGACCTGTGGGAGAT 3' (SEQ ID NO: 63)
Or	Прямой: 5' GCTTAGGGAACAGGGAAGTAAAGTT 3' (SEQ ID NO: 20) Прямой': 5' GCTTAGGGAACAGGGAAGTAAAGT 3' (SEQ ID N0:51) Обратный: 5' CTTAGCATAGTCTGTGCCATCCA 3' (SEQ ID NO: 21)
Bv (GluA3)	Прямой: 5' GACCTCCATATTACTGAAAGGAAG 3' (SEQ ID NO: 64) Обратный: 5' GAGTAATTGCTCCATCCTGTTCA 3' (SEQ ID NO: 65)
Gs	Прямой: 5' AGTTTGTAGGTTTTGATGTTACATTGAG 3' (SEQ ID NO: 66) Обратный: 5' GCATCTTTGAACCGCCTACTG 3' (SEQ ID NO: 67)
St (UGPase)	Прямой: 5' GGACATGTGAAGAGACGGAGC 3' (SEQ ID NO: 68) Обратный: 5' CCTACCTCTACCCCTCCGC 3' (SEQ ID NO: 69)
Общий праймер растений (Rbcl)	Прямой: 5' AGGTCTAADGGRTAAGCTAC 3' (SEQ ID NO: 26) Обратный: 5' AGYCTTGATCGTTACAAAGG 3' (SEQ ID NO: 27)

В случаях, где табл. 4 включает в себя более одной строки, причем эти строки относятся к амплификации определенной нуклеиновой кислоты (такие как, например, несколько строк для Cry1Ab и CP4-EPSPS) различными наборами отличающихся праймеров, любые один или несколько из указанных наборов праймеров указанных различных строк табл. 4 могут быть использованы для амплификации. Когда табл. 4 перечисляет, в пределах единственной строки, более одного прямого и/или обратного праймеров для амплификации определенной нуклеиновой кислоты (например, для Bn (АСС), Gm (лектин) или СР4- EPSPS), любой один или любая комбинация указанного прямого праймера (прямых праймеров) могут быть использованы вместе с любым одним или с любой комбинацией указанного обратного праймера (обратных праймеров) для получения амплификации.

Кроме того, это изобретение обеспечивает также вариантные праймеры, которые включают в себя одну или несколько вариаций последовательности относительно праймеров, перечисленных в табл. 4,

- 33 031180 таких как, например, делеция, инсерция и/или замена, пока такие праймеры/пары праймеров могут все еще достигать адекватной амплификации их соответствующих ампликонов. Предпочтительно, такие вариантные праймеры будут обнаруживать по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, даже более предпочтительно по меньшей мере 95% и еще более предпочтительно по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность последовательности относительно праймеров, перечисленных в табл. 4. Выравнивание последовательностей и определение идентичности последовательности может выполняться, например, с использованием Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) первоначально описанного Altschul et al. 1990 (J Mol Biol 215: 40310), например, алгоритма Blast 2 sequences, описанного Tatusova and Madden 1999 (FEMS Microbiol Lett 174: 247-250).

Кроме того, это изобретение рассматривает также вмонтированные праймеры и пары праймеров, подходящие для амплификации ампликонов из внутренней части ампликонов, амплифицированных из соответствующих нуклеиновых кислот с использованием пар праймеров, перечисленных в любой из табл. 1 или 4.

Это изобретение обсуждает также производные, описанные в другом месте в этом описании, праймеров и пар праймеров, перечисленных в любой из табл. 1 или 4.

Таким образом, это изобретение обеспечивает праймеры и пары праймеров, перечисленные в любой из табл. 1 или 4, а также их варианты и производные, необязательно в любой подходящей комбинации указанных праймеров и/или пар праймеров или их вариантов или производных.

В следующем аспекте, это изобретение обеспечивает продукты амплификации, получаемые из соответствующих нуклеиновых кислот с использованием вышеописанных праймеров и пар праймеров, и в частности, с использованием пар праймеров, представленных в любой из табл. 1 или 4, или их вариантов или производных. Указанные продукты амплификации могут быть дополнительно обработаны, например, выделены, клонированы в подходящие векторы или плазмиды, трансформированы в рекомбинантных хозяев, например, подходящих бактериальных хозяев, таких как Е. coli, размножены ими и выделены из них, секвенированы и т.д.

Предпочтительно указанные продукты амплификации, предпочтительно клонированные и повторно изолированные, и, возможно, содержащиеся в подходящих плазмидах или векторах, могут быть использованы в качестве положительных контролей для подтверждения работы стадий детектирования способов этого изобретения, направленных на детектирование соответствующей нуклеиновой кислоты в образце. Альтернативно или в дополнение, такие продукты амплификации (клонированные или изолированные) могут быть использованы в качестве калибрующих агентов для определения количества конкретных матриц в образце, например, ПЦР в реальном времени.

Таким образом, в следующем аспекте, это изобретение обеспечивает рекомбинантную Е. coli, депонированную согласно Будапештскому договору Belgian Coordinated Collections of Microorganisms (BCCM), 10 января 2007 г. под номерами доступа LMBP: LMBP 5452, LMBP 5453, LMBP 5454, LMBP 5455, LMBP 5456, LMBP 5457, LMBP 5458, LMBP 5459 и LMBP 5460, 6 марта 2007 г. под номером доступа 5451 и 19 апреля 2007 г. под номерами доступа LMBP: LMBP 5587, LMBP 5588, LMBP 5589 и LMBP 5590.

Указанные рекомбинантные Е. coli содержат продукты амплификации, полученные на матрицахнезависимых трансформантах с использованием наборов праймеров, перечисленных в табл. 5, клонированные в сайтах EcoRI клонирующего вектора pUC18 MCS.

- 34 031180

Таблица 5

№ доступа LMBP	Пара праймеров	Амплифицированные при событии	Секвенированная вставка (фиг. 1)
LMBP 5460	SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 8	BT11	SEQ ID NO: 34
LMBP 5456	SEQ ID NO: 9 SEQ ID NO: 10	40-3-2	SEQ ID NO: 35
LMBP 5452	SEQ ID NO: 47 SEQ ID NO: 48	MON810	SEQ ID NO: 36
LMBP 5453	SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO: 12	Btl76	SEQ ID NO: 37
LMBP 5454	SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO: 12	Btll	SEQ ID NO: 38
LMBP 5457	SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 14	ВТ 176	SEQ ID NO: 39
LMBP 5455	SEQ ID NO: 15 SEQ ID NO: 16	BT11	SEQ ID NO: 40
LMBP 5458	SEQ ID NO: 26 SEQ ID NO: 27	Btl 1 кукурузы	SEQ ID N0:41
LMBP 5459	SEQ ID NO: 26	OSR (масляничный	SEQ ID N0:42
SEQ ID NO: 27	рапс) дикого типа
LMBP 5451	SEQ ID NO: 28 SEQ ID NO: 29	Btll	SEQ ID N0:43
LMBP 5587	SEQ ID NO: 22 SEQ ID NO: 23	RRS сои	SEQ ID NO: 53
LMBP 5588	SEQ ID NO: 22 SEQ ID NO: 23	GT 73	SEQ ID NO: 54
LMBP 5589	SEQ ID NO: 24 SEQ ID NO: 25	GT 73	SEQ ID NO: 55
LMBP 5590	SEQ ID NO: 51 SEQ ID NO: 21	Рис дикого типа	SEQ ID NO: 52

Кроме депонированных плазмид и Е. coli, перечисленных в табл. 5, это изобретение обеспечивает также дополнительные примерные плазмиды, такие как, например, pUC18, содержащие вставки, амплифицированные с использованием, например:

пары праймеров SEQ ID NO: 3 и 4 для гена acc Brassica (примерной последовательности вставки SEQ ID NO: 44 на фиг. 1, амплифицированной на OSR дикого типа);

пар праймеров CP4-EPSP SEQ ID NO: 18 и 19 и SEQ ID NO: 50 and 19 (примерных вставок, амплифицированных, соответственно, на событии 40-3-2 и событии NK603, для получения соответствующих примерных последовательностей вставок, показанных в виде SEQ ID NO: 45 и 46 на фиг. 1) (праймер SEQ ID NO: 17 может быть также использован вместе с праймером SEQ ID NO: 19; однако, праймер SEQ ID NO: 17 содержит несоответствие последовательности при нуклеотиде 20 в сравнении с последовательностью 50, которая, следовательно, является более предпочтительной);

пары праймеров SEQ ID NO: 1 и 2 для гена adh-1 кукурузы (примерной последовательности вставки SEQ ID NO: 32 на фиг. 1, амплифицированной на кукурузе дикого типа);

пары праймеров SEQ ID NO: 5 и 49 для гена лектина сои (примерной последовательности вставки SEQ ID NO: 33 на фиг. 1, амплифицированной на сое дикого типа);

пары праймеров SEQ ID NO: 56 и 57 для более короткого ампликона внутри гена adh-1 Zea mays (примерной последовательности вставки SEQ ID NO: 70 на фиг. 1);

пары праймеров SEQ ID NO: 58 и 59 (SLTM) для ампликона лектина Glycine max (примерной последовательности вставки SEQ ID NO: 71 на фиг. 1);

пары праймеров SEQ ID NO: 60 и 61 для более короткого ампликона внутри элемента p35S (примерной последовательности вставки SEQ ID NO: 72 на фиг. 1);

пары праймеров SEQ ID NO: 64 и 65 для ампликона внутри гена GluA3 Beta vulgaris (примерной последовательности вставки SEQ ID NO: 76 на фиг. 1);

пары праймеров SEQ ID NO: 66 и 67 для ампликона внутри гена sah-7 Gossypium (примерной последовательности вставки SEQ ID NO: 77 на фиг. 1);

пары праймеров SEQ ID NO: 68 и 69 для ампликона внутри гена UGP-азы картофеля (примерной последовательности вставки SEQ ID NO: 78 на фиг. 1);

пары праймеров SEQ ID NO: 11 и 12 для ампликона внутри признака Cry1Ab (примерной последовательности вставки SEQ ID NO: 73 на фиг. 1, амплифицированной на материале MON 810);

пары праймеров SEQ ID NO: 22 и 62 (RRS) или 22 и 63 (GT 73) для ампликона внутри признака CP4-EPSPS (примерной последовательности вставки на фиг. 1: SEQ ID NO: 74, амплифицированной на GT73, и SEQ ID NO: 75, амплифицированной на RRS).

Отмечается, что вследствие более короткого размера соответствующего ампликона, пара праймеров SEQ ID NO: 22 и 23 или SEQ ID NO: 22 вместе с любыми одним или обоими праймерами SEQ ID NO: 62 и 63, может быть предпочтительно использована для амплификации CP4-EPSPS как из необработанного растительного материала (например, ткани или семян растения), так и из обработанного материала (например, кормового или пищевого продукта), тогда как пара праймеров SEQ ID NO: 18 и 19 или 50 и 19,

- 35 031180 которая определяет более длинный ампликон, может быть предпочтительно использована на необработанном материале. Таким образом, пара праймеров SEQ ID NO: 22 и 23 или SEQ ID NO: 22 вместе с любыми одним или обоими праймерами SEQ ID NO: 62 и 63, может быть более предпочтительной в данных способах и наборах.

Кроме того, это изобретение обеспечивает выделенные рекомбинантные плазмиды, получаемые из рекомбинантных бактерий Е. coli, перечисленных в табл. 5, а также их выделенные вставки, предпочтительно вставки EcoRI. Это изобретение обеспечивает также любой другой рекомбинантный микроорганизм, трансформированный выделенными таким образом плазмидами.

Квалифицированному специалисту может быть также понятно, что это изобретение может обеспечивать комбинации указанных плазмид или вставок, причем указанные комбинации являются репрезентативными для тех нуклеиновых кислот, которые подлежат детектированию в образце.

Кроме того, это изобретение обеспечивает использование рекомбинантных плазмид и вставок, обнаруженных в бактериях табл. 5 и получаемых из бактерий табл. 5, или других, объясненных выше, для использования в качестве положительных контролей и/или калибраторов в способах данного изобретения. Например, такие плазмиды или их вставки могут быть включены в способах и наборах этого изобретения в подходящих количествах для облегчения также принятия решения, присутствует ли нуклеиновая кислота одного или нескольких независимых трансформантов в количестве, которое оправдывает дополнительное количественное определение, или присутствует в количестве ниже приемлемого порога.

В дальнейшем развитии этого изобретения, обсуждается также, что любой из праймеров этого изобретения, в частности, такой как праймеры, перечисленные в любой из табл. 1 или 4, или их варианты или производные, может быть использован в стратегии прогулки по геному для идентификации последовательностей, смежных с указанным праймером в геномной ДНК независимого трансформанта. Подобным образом, обсуждается, что любой праймер, сконструированный на основе последовательности любого ампликона данного изобретения, в частности, такой как, любой праймер, расположенный внутри или перекрывающийся с любой из последовательностей ампликонов SEQ ID NO: 34 - SEQ ID NO: 78, или вариант или производное такого праймера, может быть использован в стратегии прогулки по геному для идентификации последовательностей, смежных с указанным ампликоном в геномной ДНК независимого трансформанта.

Этот аспект может быть, в частности, применим, когда данные способы амплификации продуцируют ампликон, имеющий характеристики (например, длину, Tm или последовательность), которые не могут быть недвусмысленно отнесены к конкретному независимому трансформанту. В такой ситуации, прогулка по геному вне этого рассматриваемого ампликона может обеспечить дополнительную информацию о последовательности этого независимого трансформанта и посредством этого способствовать идентификации указанного независимого трансформанта. В особенно предпочтительных вариантах осуществления, этот специфический праймер может быть получен из ампликонов р35 или tNOS.

В общем, стратегии прогулки по геному хорошо известны в данной области. Примеры включают в себя inter alia способ векторетты Riley et al. 1990 (Nucleic Acids Res 18: 2887-90), доступный коммерчески в виде Universal Vectorette™ System (Sigma), a также более поздних упрощений этой системы (см., например, Kilstrup & Kristiansen 2000. Nucleic Acids Res 28: e55).

В одном конкретном варианте осуществления, авторы этого изобретения обсуждают двухстадийный способ прогулки по геному. В первой стадии амплификации меченый LUX™ (или другим образом) праймер этого изобретения используют вместе со смесью произвольных (случайным образом выбранных) праймеров (обычно с длиной приблизительно 8-15 п.н.) и предпочтительно используют условия градиентной ПЦР увеличивающейся строгости. Метка на этом праймере позволяет следить, имеет ли место амплификация, использующая меченый праймер. Во второй стадии амплификации, выполняют гнездовую ПЦР с использованием другого вложенного праймера из этого ампликона, предпочтительно также меченого LUX™ или другим образом, вместе с указанными случайным образом выбранными праймерами, и предпочтительно при условиях ПЦР высокой строгости. Метка на этом праймере позволяет следить, имеет ли место амплификация, использующая меченый праймер. В конечном счете, полученный таким образом продукт секвенируют, идентифицируя посредством этого последовательности, смежные с этим ампликоном.

В следующих аспектах это изобретение обеспечивает наборы компонентов для выполнения способов данного изобретения, т.е. для испытания образца на потенциальное присутствие или отсутствие материала, происходящего от одного или нескольких независимых трансформантов растений.

В одном варианте осуществления набор согласно этому изобретению может содержать зонды, подходящие для детектирования одной или нескольких или всех нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами а)-и) выше.

В одном варианте осуществления, набор согласно этому изобретению может содержать праймеры, предпочтительно пары праймеров, подходящие для амплификации ампликонов из внутренней части одной или нескольких или всех нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами а)-и), определенными выше.

- 36 031180

В другом варианте осуществления этот набор может содержать праймеры, предпочтительно пары праймеров, подходящие для амплификации одной, более чем одной и предпочтительно всех нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами а)-1) выше.

В другом варианте осуществления этот набор может содержать праймеры, предпочтительно пары праймеров, подходящие для амплификации одной, более чем одной и предпочтительно всех нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами а)-1). о), р), q) и t) выше.

В другом варианте осуществления этот набор может содержать праймеры, предпочтительно пары праймеров, подходящие для амплификации одной, более чем одной и предпочтительно всех нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами а)-с) выше, и одной, более чем одной или предпочтительно всех нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами d)-i) выше.

В другом варианте осуществления этот набор может содержать праймеры, предпочтительно пары праймеров, подходящие для амплификации одной, более чем одной или всех нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами а)-с), о), р), q), t) выше, и одной, более чем одной или предпочтительно всех нуклеиновых кислот, перечисленных под пунктами d)-i) выше.

Кроме того, этот набор может также содержать праймеры или пары праймеров для амплификации характерной для растений последовательности, как описано в другом месте в этом описании.

Должно быть понятно, что праймеры и пары праймеров для амплификации различных нуклеиновых кислот, описанных здесь, могут быть включены в различным образом спроектированные наборы, в соответствии с предпочтением в отношении того, какие независимые трансформанты желательно детектировать.

В одном предпочтительном варианте осуществления, с учетом различных выборов нуклеиновых кислот, подлежащих амплификации, как было определено в предыдущих абзацах, этот набор может содержать один или несколько праймеров или все праймеры, предпочтительно одну, более чем одну или все пары праймеров, определенные в любой из табл. 1 или 4, или их варианты или производные.

В одном особенно предпочтительном варианте осуществления, один или оба из пары любых праймеров, включенных в этот набор, могут быть мечеными.

В другом особенно предпочтительном варианте осуществления, любая пара праймеров, включенная в этот набор, может содержать по меньшей мере один, и обычно один, праймер, меченый подходящим флуорофором и сконструированный для возможности детектирования в реальном времени с использованием вышеописанной системы детектирования LUX™.

В одном дополнительном варианте осуществления, этот набор содержит также продукты амплификации, например, клонированные и повторно выделенные и, возможно, содержащиеся в подходящих плазмидах и векторах, которые могут быть использованы в качестве положительных контролей и/или калибраторов в способах этого изобретения, как объяснено выше. Например, для таких целей могут быть обеспечены точно измеренные количества или разведения таких продуктов амплификации, например, клонированных и повторно выделенных и, возможно, содержащихся в подходящих плазмидах или векторах. Как объяснялось выше, могут также ожидаться различные комбинации таких реагентов.

В одном конкретном варианте осуществления, этот набор может содержать один, более одного или все организмы Е. coli, перечисленные в табл. 5, и/или плазмиды, получаемые из них, и/или выделенные вставки, предпочтительно вставки EcoRI, указанных плазмид, или их комбинации.

В одном дополнительном варианте осуществления, как уже объяснялось, этот набор может также содержать носитель данных, содержащий инструкции для программируемого вычислительного устройства для выполнения действий стадии (2) способов этого изобретения.

Понятно, что такие наборы могут содержать дополнительные компоненты, такие как компоненты, применимые для гибридизации, ПЦР, детектирования и т.д. Квалифицированному специалисту будет понятно потенциальное применение таких компонентов.

В предпочтительном варианте осуществления этот набор может содержать один или несколько реакционных компартментов, например, реакционных компартментов, обеспеченных многолуночной полоской или планшетом (многолуночного формата), причем каждый компартмент содержит композицию всех компонентов, необходимых для реакции ПЦР-амплификации (например, нуклеотидов, солей, термостабильной полимеразы и т.д.) и включает в себя желаемые одну или несколько (в случае множества независимых трансформантов) пар праймеров, определенных выше, но не содержит ДНК-матрицы. Таким образом, реакция ПЦР может начинаться, как только пользователь вводит ДНК анализируемого образца в указанную композицию. Необязательно, для гарантии стабильности, полимераза Taq или другая термостабильная полимераза может быть также исключена из этой композиции (но может быть отдельно включена в этот набор), и может быть необходимо добавление ее пользователем. Обычно, эта композиция может быть жидкой, хотя, в частности, для транспортировки и хранения, она может быть заморожена. Однако предусматриваются также лиофилизированные композиции.

- 37 031180

Примеры

Пример 1. Условия амплификации для выбранных пар праймеров, перечисленных в табл. 1 и 4.

ПЦР-детектирование в реальном времени с применением SYBR Green оптимизировали для амплификации ампликонов из нуклеиновых кислот p35S, tNOS, Ciy1Ab, PAT/Bar, PAT/pat и CP4EPSPS с использованием соответствующих пар праймеров, перечисленных в табл. 1 и 4.

ДНК выделяли из независимых трансформантов, содержащих (положительный контроль) или не содержащих (отрицательный контроль) эти нуклеиновые кислоты, в том числе из независимых трансформантов Bt11 , Bt176, MON810, MON40-3-2, ТС1507, NK603, MS8/RF3 (см. табл. 5), с использованием СТАВ-выделения из материала тканей листьев.

ПЦР-реакции содержали SYBR Green PCR Master Mix (Diagenode, ref: GMO-GS2X-A300) 1x, прямой праймер 250 нМ, обратный праймер 250 нМ, матричную ДНК 50 нг в общем объеме 20 мкл. Схема циклов ПЦР включала в себя стадию 1: 1х [50°С, 120 с]; стадию 2: 1х [95°С, 600 с] и стадию 3: 40x [95°С, 15 с, 60°C, 60 с] с получением флуоресценции. Использовали Applied Biosystems Prism 7700. Анализ с использованием кривой плавления выполняли при градиенте от 50 до 95°С на протяжении 1200 с.

Для всех пар праймеров, получали специфические продукты амплификации, как показано единственной специфической Tm и единственной полосой при электрофорезе на агарозном геле. Эти анализы имели низкие LOD:

RBCL: праймеры SEQ ID NO: 26 и SEQ ID NO: 27; Tm=76,5°C; размер=95 п.н.; LOD=±0,039 нг ДНК-мишени;

ADH Zea mays (более длинный ампликон): праймеры SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2; Tm=79,5°C; размер=138 п.н.; LOD=±0,016 нг ДНК-мишени (±6 гаплоидных геномов);

ADH Zea mays (более короткий ампликон): праймеры SEQ ID NO: 56 и SEQ ID NO: 57; Tm=75,5°C; размер=83 п.н.; LOD=±0,016 нг ДНК-мишени (±6 гаплоидных геномов);

ACC масличного рапса: праймеры SEQ ID NO: 79 и SEQ ID NO: 3; Tm=79°C; размер=103 п.н.; LOD=±0,05 нг ДНК-мишени (±20 гаплоидных геномов);

Круциферин масличного рапса: праймеры SEQ ID NO: 24 и SEQ ID NO: 25; Tm=80°C; размер=85 п.н.; LOD=±0,015 нг ДНК-мишени (±12 гаплоидных геномов);

Лектин сои (более длинный ампликон): праймеры SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 49; Tm=81,5°C; размер=178 п.н.; LOD=±0,016 нг ДНК-мишени (±13 гаплоидных геномов);

Соя (лектин): праймеры SEQ ID NO: 58 и SEQ ID NO: 59; Tm=79,5°C; размер=81 п.н.; LOD=±0,063 нг ДНК-мишени (±50 гаплоидных геномов);

PLD риса: праймеры SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 21; Tm=76,5°C; размер=80 п.н.; LOD=±0,01 нг ДНК-мишени (±20 гаплоидных геномов);

GluA3 сахарной свеклы: праймеры SEQ ID NO: 64 и SEQ ID NO: 65; Tm=77°C; размер=118 п.н.; LOD=±0,01 нг ДНК-мишени (±13 гаплоидных геномов);

SAH7 хлопчатника: праймеры SEQ ID NO: 66 и SEQ ID NO: 67; Tm=75,5°C; размер=115 п.н.; LOD=±0,02 нг ДНК-мишени (±9 гаплоидных геномов);

UGP-аза картофеля: праймеры SEQ ID NO: 68 и SEQ ID NO: 69; Tm=81°C; размер=87 п.н.; LOD=±0,0002 нг ДНК-мишени p35S (более длинный ампликон): праймеры SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8; Tm=80,5°C; размер=147 п.н.; LOD=±0,016 нг ДНК-мишени (±6 гаплоидных геномов);

p35S (более короткий ампликон): праймеры SEQ ID NO: 60 и SEQ ID NO: 61; Tm=76°C; размер=75 п.н.; LOD=RRS 100% ±0,032 нг ДНК-мишени (±25 гаплоидных геномов); NK603 5% ±6,25 ДНК-мишени (±62,5 гаплоидных генома);

tNOS-L: праймеры SEQ ID NO: 28 и SEQ ID NO: 29; Tm=72°C; размер=172 п.н.; LOD=±0,03 нг ДНК-мишени (±25 гаплоидных геномов);

tNOS-D: праймеры SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10; Tm=72°C; размер=69 п.н.; LOD=±0,03 нг ДНКмишени (±20 гаплоидных геномов);

Cry1Ab: праймеры SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 12; Tm=78,5°C; размер=73 п.н.; LOD=±0,06 нг ДНК-мишени (±12 гаплоидных геномов);

PAT/Bar: праймеры SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 14; Tm=80°C; размер=69 п.н.; LOD=±0,125 нг ДНК-мишени (±50 гаплоидных геномов);

PAT/pat: праймеры SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 16; Tm=77°C; размер=109 п.н.; LOD=±0,03 нг ДНК-мишени (±12 гаплоидных геномов);

CP4-EPSP: праймеры SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 62 и SEQ ID NO: 63; Tm=80,5 или 84,5°С; размер=108 п.н.; LOD=NK603 5% ±3,12505 нг (±31 гаплоидный геном), RRS 100% ±0,032 нг (±25 гаплоидных геномов), GT73 100% ±0,016 нг (±12 гаплоидных геномов);

CP4-EPSP: праймеры SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 19; Tm=85°C; размеры=94 п.н. или 124 п.н.; LOD=±0,03 нг (±25 гаплоидных геномов).

Пример 2. Примерный упрощенный способ в соответствии с этим изобретением.

Гипотетический образец готовили добавлением ДНК Bt176 к неродственному ДНК-носителю. Этот

- 38 031180 образец подвергали скринингу на присутствие или отсутствие p35S'', tNOS, Cry1Ab, PAT/Bar, PAT/pat и CP4-EPSPS с использованием ПЦР-способов в реальном времени примера 1.

Этот упрощенный способ предназначен для заключения о потенциальном присутствии или отсутствии в этом образце материала, происходящего из Bt176, Bt11 и NK603.

После тестирования, этот образец является положительным в отношении p35S, Cry1Ab и Pat/Bar, но не в отношении других тестированных нуклеиновых кислот. Таким образом, этот образец может быть представлен как набор G_SAM е {p35S; Cry1Ab; Pat/bar}. В этом примерном анализе (где не испытывали присутствие нуклеиновых кислот Zea mays), независимый трансформант Bt176 представлен набором G_B1176 е {p35S; Cry1Ab; Pat/bar}, независимый трансформант Bt11- набором G_B11 е {p35S; tNOS; Cry1Ab; Pat/pat} и независимый трансформант NK603 - набором G_NK603 е {p35S; tNOS; CP4-EPSP}.

Таким образом, поскольку G_Bt176=G_SAM, материал из независимого трансформанта Bt176 может присутствовать в этом образце. С другой стороны, поскольку G_B11 Ф G_SAM и G_B11 £ G_SAM, материал из независимого трансформанта Bt11 не присутствует в этом образце. Подобным образом, поскольку G_NK603 Ф G_sam и G_NK603 £ G_SAM, материал из независимого трансформанта NK603 не присутствует в этом образце.

В альтернативном представлении, p35S, tNOS, Cry1Ab, PAT/Bar, PAT/pat и CP4-EPSPS имеют приписанные им соответствующие простые числа V_p35s=3, V_tNOS==5, V_Cry1Ab=7, V_PAT/$_ar=11, ^VPAT/pat=^{13 и V}CP4-EPSPS=¹⁷.

Таким образом, набору Gsam приписана величина VG_SAM, являющаяся множеством соответствующих величин, приписанных нуклеиновым кислотам, детектируемым в нем, т.е. VG_SAM=V_P35s х V_Cry1Ab X V_PAT/$_ar=231. Кроме того, набору G_Bt176 приписана величина VG_Bt176, являющаяся кратным величин, приписанных тем из тестированных нуклеиновых кислот, которые обнаруживаются в событии Bt176, т.е. VG_Bt176=V_tp35s х V_Cry1Ab х PAT/Bar=231. Аналогично, набору G_Bt11 приписана величина VG_Bt11 х V_P35s х VtNOs х VCry1Ab х VPAT/pat=1365; и набору Gnk603 приписана величина VGNK603=Vp₃5s х VtNOs х Vcp4EPSP=255.

Таким образом, поскольку VG_SAM / VG_Bt176=1, материал из независимого трансформанта Bt176 может присутствовать в этом образце. С другой стороны, поскольку VG_SAM / VG_B11=0,169, т.е. не является единицей и не является целым числом, большим чем 1, материал из независимого трансформанта Bt11 не присутствует в этом образце. Подобным образом, поскольку VG_SAM / VG_NK603=0,906, т.е. не является 1 и не является целым числом, большим чем 1, материал из независимого трансформанта NK603 не присутствует в этом образце.

Пример 3. Примерное описание набора по этому изобретению (формат 96-луночного планшета).

Подлежащие скринингу нуклеиновые кислоты: Zm, Bn, Gm, p35S, tNOS, CP4-EpSpS, Cry1Ab, PAT/bar, PAT/pat, определенные выше с использованием пар праймеров, определенных в табл. 1 выше, а также общий ген растений амплифицировали с использованием пары праймеров SEQ ID NO: 26 и 27 (табл. 4). Необязательно, например, по запросу, этот набор может также включать в себя маркеры таксона для риса (Or), хлопчатника (Gs), сахарной свеклы (Bv) и/или картофеля (St), с использованием пар праймеров, определенных в табл. 1.

Рабочие условия для способов количественного ПЦР с использованием SYBR Green

Реагенты: смесь SYBR Green PCR Master Mix, включающая в себя Taq-polymerase HS; праймеры 20 мкМ; не содержащую нуклеаз воду.

Оборудование: система детектирования последовательности ABI PRISM® 7700, Система ПЦР в реальном времени 7300, ламинарный бокс, пипетки 20, 200 и 1000 мкл, стерильные, устойчивые к аэрозолю наконечники, оптические 96-луночные реакционные планшеты, оптические крышки.

Протокол: ПЦР проводят в системе детектирования последовательностей ABI PRISM® 7700 или в системе ПЦР в реальном времени 7300 в соответствии с инструкциями изготовителя. Используют одну общую программу.

Приготовление ПЦР-смеси: эта ПЦР-смесь содержит все компоненты реакции ПЦР, за исключением ДНК-матрицы. Эту операцию проводят в ламинарном боксе, который используется только для операций этого типа.

Таблица 6

Реакционная смесь для Q-PCR-скрининга

Компонент	Конечная концентрация	мкл на одну реакцию	X(число) реакций
SYBRGreen PCR Master Mix (2X)	Гх '	12,5 мкл
Прямой праймер (20 мкМ)	250 нМ	0,312 мкл
Обратный праймер (20 мкМ)	250 нМ	0,312 мкл
Не содержащая нуклеаз вода		6,876 мкл
Общий объем:	20 мкл

Получение ДНК: матричную ДНК экстрагируют с использованием стандартного способа экстракции ДНК СТАВ, и концентрацию ДНК измеряют по определению флуоресценции PicoGreen.

Подготовка к проведению ПЦР: подготовку к проведению ПЦР проводят в ламинарном боксе. ДНК-матрицы и смесь для ПЦР объединяют в других помещениях.

- 39 031180

Проведение ПЦР: ПЦР должна проводиться в соответствии с инструкциями изготовителя, как описано в Руководстве пользователя.

Условия термоциклера перечислены ниже в табл. 7.

Таблица 7

Условия работы термоциклера .

Стадия	Ступень	Т°С	Время (сек)	Обнаружение	Циклы
1	УНГ	50°С	120”	нет	1х
2	Активация Taq	95°С	600”	нет	1х
3	Амплификация Денатурация Отжиг и удлинение	95°С 60°С	15” 60”	нет измерение	40х
4	Плавление	50°С to 95°С	1200”	измерение	1х

Затем выполняли анализ кривой плавления с использованием стандартной программы (например, постепенного плавления от 50 до 95°С и мониторинга уменьшения флуоресценции).

Схема ГМО-скрининга на 96-луночном планшете для пищевых/кормовых продуктов.

Ниже описана схема, включающая в себя все обычные пищевые/кормовые маркеры, маркер риса (детектирование несанкционированных независимых трансформантов риса) и маркер обратной транскриптазы CAMV (отсутствие контроля CaMV).

Схема 96-луночного планшета:__

Растение	Gm	Zm	Вп	Ог	p35S	tNos	СР4	CrylAb	PAT/pat	PAT/bar	CRT
+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
NTC	NTC	NTC	NTC	NTC	NTC	NTC	NTC	NTC	NTC	NTC	NTC
Образец 1 А	Образец 1 А	Образец 1 А	Образец 1 А	Образец 1 А	Образец 1 А	Образец 1 А	Образец 1 А	Образец 1 А	Образец 1 А	Образец 1 А	Образец 1 А
Образец 1 В	Образец 1 В	Образец 1 В	Образец 1 В	Образец 1 В	Образец 1 В	Образец 1В	Образец 1 В	Образец 1 В	Образец 1 В	Образец 1 В	Образец 1 В
Образец 2А	Образец 2А	Образец 2А	Образец 2 А	Образец 2 А	Образец 2 А	Образец 2А	Образец 2А	Образец 2А	Образец 2 А	Образец 2 А	Образец 2 А
Образец 2В	Образец 2В	Образец 2В	Образец 2В	Образец 2В	Образец 2В	Образец 2В	Образец 2В	Образец 2В	Образец 2В	Образец 2В	Образец 2В

Положительными контролями (+) могли бы быть соответствующие ампликоны (плазмиды и вставки), описанные здесь, в частности, в табл. 5, ампликоны при определенном числе копий (например, 100 копий на одну лунку).

Технически должно быть предусмотрено, что лунки с образцами могут открываться последовательно (например, сначала положительные контроли, затем образцы и в последнюю очередь NTC и отрицательные контроли).

Ct-величины и Tm-величины для каждой лунки регистрируют и используют в анализе принятия решения для определения GM-набора, присутствующего в соответствующих образцах.

Обратите внимание на то, что, в принципе, каждый ряд мог бы быть получен по отдельности в альтернативной схеме (посредством чего достигается увеличенная эксплуатационная гибкость для потребителя).

Пример 4. Мультиплексная ПЦР p35S, tNOS.

Данный пример показывает примерную мультиплексную (множественную) ПЦР-амплификацию ампликонов p35S и tNOS, в которой детектирование выполняют при помощи SYBR Green и продукты амплификации различают на основе различий в их температурах плавления (Tm).

Использованные праймеры (20 мкМ):

p35S: SEQ ID NO: 60 и 61;

tNOS: SEQ ID NO: 9 и 10.

Матрица (50 нг): устойчивая к Раундап соя (Roundup Ready Soybean (RRS)) 100% (двойной положительный контроль).

Программа ПЦР: 95°С 10', (95°С 15, 60°С 1') х 40 циклов.

Программа плавления: 50-95°С в течение 20'.

Мультиплексность ПЦР-способов в отношении p35S и tNOS в SYBR Green возможна, так как оба ампликона являются различаемыми благодаря разной Tm в этом способе (см. фиг. 2). Таким образом, можно получить информацию с использованием одной ПЦР о присутствии двух различных мишеней, которыми являются p35S и tNOS.

Пример 5. Дополнительные возможности мультиплексности при использовании SYBR Green.

Эксперименты, аналогичные экспериментам примера 4, дополнительно определяли возможность следующих мультиплексных комбинаций.

1. Adh-1 кукурузы (SEQ ID NO: 56 и 57) с SLTM сои (SEQ ID NO: 58 и 59).

2. Adh-1 кукурузы (SEQ ID NO: 56 и 57) с круциферином масличного рапса (SEQ ID NO: 24 и 25).

3. SLTM сои (SEQ ID NO: 58 и 59) с sah-7 хлопчатника (SEQ ID NO: 66 и 67).

4. Sah-7 хлопчатника (SEQ ID NO: 66 и 67) с круциферином масличного рапса (SEQ ID NO: 24 и

- 40 031180

25).

Пример 6. Параметры ПЦР в реальном времени с использованием праймеров этого изобретения.

Реакции, использующие условия и праймеры, определенные в примере 1, выполняли на определенной копийности ссылочных плазмид, содержащих соответствующие вставки ампликонов, и определяли относительную флуоресценцию (RFU) после 40 циклов (т.е. приближающуюся к плато или достигшую плато). Результаты в табл. 8 (результаты, использующие ±8300 копий матрицы, изображены также графически на фиг. 3) показывают, что данные способы и праймеры способны генерировать величины RFU при плато, по меньшей мере, 2500, которые лежат в рамках 3-кратного предела.

Таблица 8

	Мишень ПЦР (использованные праймеры: SEQ ID NO: прямой + обратный)	Плазменная матрица	Средняя RFU 40 циклов с 1000 копий плазмид в качестве матрицы	Средняя RFU после 40 циклов с +/- 8300 копий плазмид в качестве матрицы	Размер ампликона
1	RbcL	RbcL OSR Wt	2581,58	4369,51	95
	(26 + 27)
2	ADH более длинный (1+2)	ADH длинный	4248,58	5447,4	135
3	ADH более короткий (56 + 57)	ADH alt	2434,16	4210,28	84
4	Лектин более длинный (5 + 49)	Lec Long	3854,97	5969,65	178
5	Lectin SLTM (58 + 59)	SLTM	5943,98	6713,95	74
6	Cru770 (24 + 25)	Cru770	4614,59	6768,95	85
7	p35S более длинный (7 + 8)	p35S long	3490,22	4792,49	147
8	p35S более короткий (60 + 61)	p35S short	3963,27	6173,37	75
9	tNOS-D (9 + 10)	tNOS-D	2339,11	3731,95	69
10	CrylAb (11 + 12)	CrylAb Btll	4299,47	6973,77	73
11	CrylAb (11 + 12)	CrylAb MON810	3957,05	6759,2	73
12	CrylAb (11 + 12)	CrylAbBtll и CrylAb MON810	4028,97	6641,04	73
13	CP4 (22 + 62 + 63)	CP4-RRS	3235,24	5098,82	108
14	CP4 (22 + 62 + 63)	CP4-GT73	2641,86	4968,28	108
15	CP4 (22 + 62 + 63)	CP4-RRS и CP4GT73	3157,24	5034,91	108
16	Pat-Pat (15 + 16)	Pat-Pat	2299,71	4875,61	109
17	Pat-Bar (13 + 14)	Pat-Bar	4839,79	7370,7	69
		Среднее:	3642,93	5641,17
		Стандартное отклонение:	1011,93	1106,76
		Медиана:	3854,97	5447,40
		Минимум:	2299,71	3731,95
		Максимум:	5943,98	7370,7

- 41 031180

Перечень последовательностей <110> scientific institute of Public Health (iph) <120> СПОСОБ И УСТРОЙСТВО ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ ОБРАЗЦА НА НАЛИЧИЕ ИЛИ ОТСУСТВИЕ ДВУХ ИЛИ БОЛЕЕ НЕЗАВИСИМЫХ ТРАНСФОРМАНТОВ РАСТЕНИЙ ИЛИ МАТЕРИАЛА, ПОЛУЧЕННОГО ОТ НИХ <130> iPH-001-рст <140> РСТ/ЕР2ОО8/О51О59 <141> 2008-01-29 <150> ЕР 07447008.9 <151> 2007-01-29 <150> ЕР 07108343.0 <151> 2007-05-16 <160> 79 <170> Patentin version 3.3 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> искусственная последовательность <22О>

<223> праймер: Zea Mays (adh-1) <400> 1 cgtcgtttcc catctcttcc tcc 23 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> искусственная последовательность <220>

<223> праймер: Zea Mays (adh-1) <400>

<400>2 ccactccgag accctcagtc <210>3 <211>15 <212> DNA <213> искусственная последовательность <220>

<223> праймер: Brassica napus (ACC) <400>3 ggcgcagcat cggct15 <210>4 <211> 22 <212> DNA <213> искусственная последовательность <220>

<223> праймер: Brassica napus (ACC) <400>

- 42 031180 gagaatgagg aggaccaagc tc 22 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> искусственная последовательность <220>

<223> праймер: Glycine max (лектин) <400> 5 cattacctat gatgcctcca cc 22 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> искусственная последовательность <220>

<223> праймер: Glycine max (лектин) <400>6 aagcacgtca tgcgattc18 <210>7 <211> 20 <212> DNA <213> искусственная последовательность <220>

<223> праймер: 35Б-промотор вируса мозаики цветной капусты <400> 7 gacagtggtc ccaaagatgg 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> искусственная последовательность <220>

<223> праймер: 355-промотор вируса мозаики цветной капусты <400>8 gtcttgcgaa ggatagtggg20 <210>9 <211> 28 <212> DNA <213> искусственная последовательность <220>

<223> праймер: 3' терминатор гена нопалинсинтазы Agrobacterium tumefaciens (TNOS-D) <400> 9 gattagagtc ccgcaattat acatttaa 28 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> искусственная последовательность

- 43 031180 <220>

<223> праймер: 3' терминатор гена нопалинсинтазы Agrobacterium tumefaciens <400> 10 ttatcctagk ttgcgcgcta tattt 25 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <Z13> искусственная последовательность <220>

<223> праймер: CrylAb Bacillus thuringiensis <400>11 accggttaca ctcccatcga20 <210> 12 <211>19 <212> DNA <213> искусственная последовательность <220>

<223> праймер: CrylAb Bacillus thuringiensis <400>12 cagcacctgg cacgaactc19 <210>13 <211>23 <212> DNA <213> искусственная последовательность <220>

<223> праймер: фосфинотрицинацетилтрансфераза (pat) ген bar hygroscopicus	streptomyces
<400>	13
cgtcaaccac tacatcgaga caa			23
<210>	14
<211>	19
<212>	DNA
<213>	искусственная последовательность
<22O> <223>	праймер: фосфинотрицинацетилтрансфераза	(PAT)	ген bar	Streptomyces

hygroscopicus

<400>	14
gtccactcct gcggttcct	19
<210>	15
<211>	20
<212>	DNA
<213>	искусственная последовательность
<220>
<223>	праймер: фосфинотрицинацетилтрансфераза (РАТ) ген pat

- 44 031180 <400> 15 ccgcggtttg tgatatcgtt <210>

<211>

<212>

<213>

DNA искусственная последовательность <220>

<223>

праймер: фосфинотрицинаиетилтрансфераза (pat) ген pat St reptomyces vi ridoch romogenes <400> tcttgcaacc tctctagatc atcaa

<210>	17
<211>	25
<212>	DNA
<213>	искусственная	последовательность
<220> <223>	праймер: гена Agrobacterium	EPSPS 5-енолпирувилшикимат-З-фосфатсинтазы sp. CP4
<400>	17

ggctctgagc ttcgtcctcc taagg

<210>	18
<211>	21
<212>	DNA
<213>	искусственная	последовательность
<220> <223>	праймер: гена Agrobacterium	EPSPS 5-енолпирувилшикимат-З-фосфатсинтазы sp. CP4
<400>	18

atcagtggct acagcctgca t

<210>	19
<211>	22
<212>	DNA
<213>	искусственная	последовательность
<220> <223>	праймер: гена Agrobacterium	EPSPS 5-енолпирувилшикимат-З-фосфатсинтазы sp. CP4
<400>	19

gaatgcggac ggttccggaa ag <210>

<211>

<212>

<213>

DNA искусственная последовательность <220>

<223>

праймер: Oryza sativa <400> gcttagggaa cagggaagta aagtt

- 45 031180 <210> 21 <211> 23 <212> DNA <213> искусственная последовательность <220>

<223> праймер: Oryza sativa <400> 21 cttagcatag tctgtgccat cca 23 <210> 22 <211> 18 <212> DNA <213> искусственная последовательность <220>

<223> праймер: гена epsps 5-енолпирувилшикимат-З-фосфатсинтазы Agrobacterium sp. CP4 <400>22 gcatgcttca cggtgcaa18 <210>23 <211>24 <212> DNA <213> искусственная последовательность <220>

<223> праймер: гена EPSPS 5-енолпирувилшикимат-З-фосфатсинтазы Agrobacterium sp. CP4 <400>23 ggacctgtgg gagatagact tgtc24 <210>24 <211> 22 <212> DNA <213> искусственная последовательность <220>

<223> праймер: Brassica napus (круциферин) <400>24 cagctcaaca gtttccaaac ga22 <210>25 <211> 20 <212> DNA <213> искусственная последовательность <220>

<223> праймер: Brassica napus (круциферин) <400> 25 cgaccagcct cagccttaag 20

<210> <211> <212> <213>

26 20 DNA искусственная последовательность

- 46 031180

<220> <223>	праймер: родовое растение (Rbcl)
<400>	26
aggtctaadg grtaagctac	20
<210>	27
<211>	20
<212>	DNA
<213>	искусственная последовательность
<220>
<223>	праймер: родовое растение (Rbcl)
<400>	27
agycttgatc gttacaaagg	20
<210>	28
<211>	23
<212>	DNA
<213>	искусственная последовательность
<220>
<223>	праймер: 3' терминатор гена нопалинсинтазы synthetase gene (tnos-L) 28	Agrobacterium tumefaciens
<400>

cgttcaaaca tttggcaata aag 23 <210> 29 <211> 26 <212> DNA <213> искусственная последовательность <220>

<223> праймер: 3' терминатор гена нопалинсинтазы Agrobacterium tumefaciens synthetase gene (tnos-l) <400>29 aaatgtataa ttgcgggact ctaatc26 <210>30 <211> 20 <212> DNA <213> искусственная последовательность <220>

<223> праймер: CrylAb Bacillus thuringiensis <400>30 gacatcatct ggggyatctt20 <210>31 <211> 20 <212> DNA <213> искусственная последовательность <220>

<223> праймер: CrylAb Bacillus thuringiensis <400> 31 gcgctgttca tgtcgttgaa 20

- 47 031180 <210>

<211>

<212>

<213>

166

DNA искусственная последовательность <220>

<223>

ампликон дикого типа Zea Mays <400> gaattcgagc tcggtacccg gggtatccgt cgtttcccat ctcttcctcc tttagtagct accactatat aaatcagggc tcattttctc gctcctcaca ggctcatctc gctttggatc

120 gattggtttc gtaactggtg agggactgag ggtctcggag tgggtc

166 <210>

<211>

<212>

<213>

216

DNA искусственная последовательность <220>

<223>

ампликон дикого типа Glycine max <400> gaattgcgcc cttcattacc tatgatgcct ccaccaacct cttgtgttgc ttctttggtt catccttcgc agagaagcag ctatatcctc tccggatgtg gtcgatttga agacttctct

120 tcccgagttg gggggttgag gataggggtt ctcgtgcgtg ccacgtggga ctcgacatag

180 cctggggaat cgcatgacgt gcttaagggc gaattc

216 <210> 34 <211> 179 <212> DNA <213> искусственная последовательность <220>

<223> ампликон ВТ 11 zea Mays, амплифицированный с использованием праймеров из 35s promoter of Cauliflower Mosaic virus <400>34 gctcgaattc gcccttgaca gtggtcccaa agatggaccc ccacccacga ggaacatcgt60 ggaagaagaa gacgttccaa ccacgtcttc aaagcaagtg gattgatgtg atatctccac120 tgacgtaagg gatgacgcac aatcccacta tccttcgcaa gacaagggcg aattcgtaa179 <210>35 <211> 100 <212> DNA <213> искусственная последовательность <220>

<223> ампликон 40-3-2 Glycine max, амплифицированный с использованием праймеров из 3' terminator of the Agrobacterium tumefaciens nopaline synthetase gene <400> 35 gctcgaattc gccctttatc ctaggttgcg cgctatattt tgttttctat cgcgtattaa 60

- 48 031180 atgtataatt gcgggactct aatcaagggc gaattcgtaa

100

<210> <211> <212> <213>	36 98 DNA искусственная последовательность
<220> <223> из	ампликон MON 810 zea Mays, амплифицированный с использованием праймеров CrylAb Bacillus thuringiensis

<400>36 gctcgaattc gcccttacgc cttcctggtg caaatcgagc agctcatcaa ccagaggatc 60 gaggagttcg ccaggaacca ggaagggcga attcgtaa98

<210> <211> <212> <213>	37 105 DNA искусственная последовательность
<220> <223> CrylAb	ампликон Btl76 Zea Mays, амплифицированный с использованием праймеров из Bacillus thuringiensis

<400>37 gctcgaattc gcccttaccg gttacactcc catcgacatc tccctctccc tcacgcagtt 60 cctgctcagc gagttcgtgc caggtgctga agggcgaatt cgtaa105

<210> <211> <212> <213>	38 105 DNA искусственная последовательность
<22O> <223> CrylAb	ампликон Btll Zea Mays, амплифицированный с использованием праймеров из Bacillus thuringiensis

<400>38 gctcgaattc gcccttcagc acctggcacg aactcgctga gcagaaactg tgtcaaggac 60 aaggagatgt cgatgggagt gtaaccggta agggcgaatt cgtaa105

<210> <211> <212> <213>	39 101 DNA искусственная последовательность
<22O> <223>	ампликон BT176 Zea Mays, амплифицированной с использованием праймеров из фосфинотрицинацетилтрансфераза (РАТ) гена bar Streptomyces hygroscopicus

<400>39 gctcgaattc gcccttcgtc aaccactaca tcgagacaag cacggtcaac ttccgtaccg 60 agccgcagga accgcaggag tggacaaggg cgaattcgta a101

<210> <211>

40 140

- 49 031180 <212> DNA <213> искусственная последовательность <220>

<223> ампликон BT11 zea Mays, амплифицированной с использованием праймеров из фосфинотрицинацетилтрансфераза (pat) ген pat streptomyces vi ridochromogenes <400> 40 gctcgaattc gcccttccgc ggtttgtgat atcgttaacc attacattga gacgtctaca 60 gtgaacttta ggacagagcc acaaacacca caagagtgga ttgatgatct agagaggttg 120 caagaagggc gaattcgtaa140 <210>41 <211>127 <212> DNA <213> искусственная последовательность <220>

<223> ампликон_ BT11 Zea Mays, амплифицированный с использованием праймеров из родового растения (Rbcl) <400>41 gctcgaattc gcccttaggt ctaaggggta agctacataa cagatatatt gatctgggtc60 cccaggaacg ggctcgatgt gatagcatcg tcctttgtaa cgatcaaggc taagggcgaa120 ttcgtaa127

<210> <211> <212> <213>	42 127 DNA искусственная последовательность
<220> <223>	ампликон OSR дикого типа, амплифицированный с использованием праймеров из

родового растения (Rbcl) <400>42 gctcgaattc gcccttaggt ctaaggggta agctacatac gcaataaatt gagtttcttc60 tcctggaacg ggctcgatgt ggtagcatcg tcctttgtaa cgatcaaggc taagggcgaa120 ttcgtaa127

<210> <211> <212> <213>

43 205 DNA искусственная последовательность

<22O>

<223> 3'

ампликон BT11 Zea Mays, амплифицированный с использованием праймеров из terminator of the Agrobacterium tumefaciens nopaline synthetase gene

<400> 43 gctcgaattc gcccgttaaa tgtataattg cgggactcta atcataaaaa cccatctcat60 aaataacgtc atgcattaca tgttaattat tacatgctta acgtaattca acagaaatta120

- 50 031180 tatgataatc atcgcaagac cggcaacagg attcaatctt aagaaacttt attgccaaat 180 gtttgaacga agggcgaatt cgtaa 205 <210> 44 <211> 228 <212> DNA <213> искусственная последовательность <220>

<223> ампликон_ Brassica napus <400>44 gctcgaattc gcccttggcg cagcatcggc tcttctgcat agtaccgttt ctccatcgac60 caatggaacg aatgtctaat aggtgttcgt ccttcatctc gctcgattat acagctcacc120 acacccacac ctgcggaaca caggctcgaa ctaacttctt cctctttgag aattttctcc180 actctttctt gagcttggtc ctcctcattc tcaagggcga attcgtaa228 <210>45 <211>123 <212> DNA <213> искусственная последовательность <220>

<223> ампликон 40-3-2 Zea Mays, амплифицированный с использованием праймеров из

CP4-EPSP <400>45 ctcgaattcg cccttgaatg cggacggttc cggaaaggcc agaggatttg cgggcggttg60 cgggccggct gcttgcaccg tgaagcatgc aggctgtagc cactgataag ggcgaattcg120 taa123 <210>46 <211>156 <212> DNA <213> искусственная последовательность <220>

<223> ампликон NK603 Zea Mays, амплифицированной с использованием праймеров из CP4-EPSP <400> 46 gctcgaattc gcccttggct ctgagcttcg tcctcctaag gtcatgtctt ctgtttccac60 ggcgtgcatg cttcacggtg caagcagccg gcccgcaacc gcccgcaaat cctctggcct120 ttccggaacc gtccgcattc aagggcgaat tcgtaa156 <210> 47 <211> 18 <212> DNA <213> искусственная последовательность <220>

<223> праймер: CrylAb Bacillus thuringiensis <400> 47 acgccttcct ggtgcaaa 18

- 51 031180 <210> 48 <211> 19 <212> DNA <213> искусственная последовательность <220>

<223> праймер: CrylAb Bacillus thuringiensis <400> 48 cctggttcct ggcgaactc19 <210>49 <211>19 <212> DNA <213> искусственная последовательность <220>

<223> праймер: Glycine max (лектин) <400> 49 aagcacgtca tgcgattcc19 <210>50 <211>25 <212> DNA <213> искусственная последовательность <220>

<223> праймер: ген EPSPS 5-енолпирувилшикимат-З-фосфатсинтазы из Agrobacterium sp CP4

<400>	50
ggctctgagc ttcgtcctct taagg	25
<210>	51
<211>	24
<212>	DNA
<213>	искусственная последовательность
<220> <223>	праймер: Oryza sativa
<400>	51
gcttagggaa cagggaagta aagt	24
<210>	52
<211>	112
<212>	DNA
<213>	искусственная последовательность
<220> <223>	ампликон дикого риса, амплифицированный гена фосфолипазы D	с использованием праймеров из
<400>	52

gctcgaattc gcccttgctt agggaacagg gaagtaaagt tgaatggtga gtatgaacct 60 gcaggtcgcc ctttggatgg cacagactat gctaagaagg gcgaattcgt aa 112 <210> 53 <211> 136

- 52 031180 <212> DNA <213> искусственная последовательность <220>

<223> ампликон готовой сои, амплифицированный с использованием праймеров из CP4-EPSP <400>53 gctcgaattc gcccttggac ctgtgggaga tagacttgtc gccgggaatg cggacggttc 60 cggaaaggcc agaggatttg cgggcggttg cgggccggct gcttgcaccg tgaagcatgc 120 aagggcgaat tcgtaa136 <210>54 <211> 136 <212> DNA <213> искусственная последовательность <220>

<223> ампликон_ GT73 Brassica napus, амплифицирован с использованием праймеров из

CP4-EPSP <400>54 gctcgaattc gcccttggac ctgtgggaga tagacttgtc acctggaata cggacggttc 60 cagaaagacc agaggactta cgagcagttg ctggacggct gcttgcaccg tgaagcatgc 120 aagggcgaat tcgtaa136 <210>55 <211>117 <212> DNA <213> искусственная последовательность <220>

<223> ампликон. GT73 Brassica napus, амплифицирован с использованием праймеров из круциферин <400>55 gctcgaattc gcccttcagc tcaacagttt ccaaacgagt gccaactaga ccagctcaat60 gcgctggagc cgtcacacgt acttaaggct gaggctggtc gaagggcgaa ttcgtaa117 <210>56 <211>27 <212> DNA <213> искусственная последовательность <220>

<223> праймер: Zea Mays (adh-l) <400>56 tctcttcctc ctttagagct accacta27 <210>57 <211> 21 <212> DNA <213> искусственная последовательность <220>

<223> праймер: Zea Mays (adh-l)

- 53 031180 <400>57 aatcgatcca aagcgagatg a21 <210>58 <211> 18 <212> DNA <213> искусственная последовательность <220>

<223> праймер: Glycine max (лектин) <400>58 aaccggtagc gttgccag18 <210>59 <211>19 <212> DNA <213> искусственная последовательность <220>

<223> праймер: Glycine max (лектин) <400>59 agcccatctg caagccttt19 <210> 60 <211>23 <212> DNA <213> искусственная последовательность <220>

<223> праймер: 35Б-промотор вируса мозаики цветной капусты <400> 60 aaagcaagtg gattgatgtg ata 23 <210> 61 <211> 20 <212> DNA <213> искусственная последовательность <220>

<223> праймер: 35Б-промотор вируса мозаики цветной капусты <400>61 gggtcttgcg aaggatagtg20 <210> 62 <211>19 <212> DNA <213> искусственная последовательность <220>

<223> праймер: ген EPSPS 5-енолпирувилшикимат-З-фосфатсинтазы Agrobacterium sp. СР4 <400>62 tgaaggaccg gtgggagat19 <210>63 <211> 19

- 54 031180 <212> DNA <213> искусственная последовательность <22О>

<223> праймер: ген EPSPS 5-енолпирувилшикимат-З-фосфатсинтазы Agrobacterium sp. СР4 <400>63 tgaaggacct gtgggagat19 <210>64 <211>24 <212> DNA <213> искусственная последовательность <22О>

<223> праймер: Beta vulgaris (GluA3) <400>64 gacctccata ttactgaaag gaag24 <210> 65 <211>23 <212> DNA <213> искусственная последовательность <22О>

<223> праймер: Beta vulgaris (G1UA3) <400> 65 gagtaattgc tccatcctgt tea 23 <210> 66 <211> 28 <212> DNA <213> искусственная последовательность <220>

<223> праймер: Gossypium <400> 66 agtttgtagg ttttgatgtt acattgag <210> 67 <211> 21 <212> DNA <213> искусственная последовательность <220>

<223> праймер: Gossypium <400> 67 gcatctttga accgcctact g 21 <210> 68 <211> 21 <212> DNA <213> искусственная последовательность <220>

<223> праймер: Solanum tuberosum (UGPase) <400>

- 55 031180 ggacatgtga agagacggag c21 <210>69 <211>19 <212> DNA <213> искусственная последовательность <22О>

<223> праймер: Solanum tuberosum (UGPase) <400> 69 cctacctcta cccctccgc 19 <210> 70 <211> 108 <212> DNA <213> искусственная последовательность <220>

<223> ампликон дикого типа zea Mays <400> 70 gaattcgccc ttaatcgatc caaagcgaga tgagcctgtg aggagcgaga aaatgagccc 60 tgatttatat agtggtagct ctaaaggagg aagagaaagg gcgaattc108 <210>71 <211>105 <212> DNA <213> искусственная последовательность <22О>

<223> ампликон дикого типа риса <400>71 gaattcgccc ttaaccggta gcgttgccag cttcgccgct tccttcaact tcaccttcta 60 tgcccctgac acaaaaaggc ttgcagatgg gctaagggcg aattc105 <210>72 <211>99 <212> DNA <213> искусственная последовательность <220>

<223> ампликон, амплифицированный с использованием праймеров из 35S промотор вируса цветной капусты <400>72 gaattcgccc ttgggtcttg cgaaggatag tgggattgtg cgtcatccct tacgtcagtg 60 gagatatcac atcaatccac ttgctttaag ggcgaattc99 <210>73 <211>97 <212> DNA <213> искусственная последовательность <220>

<223> ампликон MON810 Zea Mays, амплифицированной с использованием праймеров из CrylAb

Bacillus thuringiensis

- 56 031180 <400> 73 gaattcgccc ttcagcacct ggcacgaact cgctgagcag gaactgcgtg agggagaggg 60 agatgtcgat gggagtgtaa ccggtaaggg cgaattc97 <210>74 <211>132 <212> DNA <213> искусственная последовательность <22О>

<223> ампликон GT73 Zea Mays, амплифицированный с использованием праймеров из CP4-EPSP <400>74 gaattcgccc tttgaaggac ctgtgggaga tagacttgtc acctggaata cggacggttc 60 cagaaagacc agaggactta cgagcagttg ctggacggct gcttgcaccg tgaagcatgc 120 aagggcgaat tc132

<210>	75
<211>	132
<212>	DNA
<213>	искусственная последовательность
<220>
<223>	ампликон готовой сои, амплифицированный с использованием праймеров из
	CP4-EPSP
<400>	75
gaattcgccc tttgaaggac cggtgggaga tcgacttgtc gccgggaatg cggacggttc	60
cggaaaggcc agaggatttg cgggcggttg cgggccggct gcttgcaccg tgaagcatgc	120
aagggcgaat tc	132
<210>	76
<211>	142
<212>	DNA
<213>	искусственная последовательность
<22O>
<223> G1UA3	ампликон Beta vulgaris, амплифицированный с использованием праймеров из
<400>	76
gaattcgccc ttgacctcca tattactgaa aggaagccaa aagggatcaa ttaagtgctc	60
tacgaagttt aaagtatgtg ccgctctcaa gactgaacat ggcactgtga acaggatgga	120
gcaattactc aagggcgaat tc	142
<210>	77
<211>	139
<212>	DNA
<213>	искусственная последовательность
<220>
<223>	ампликон Gossypiuma, амплифицированный с использованием праймеров из
Sah-7
<400>	77
gaattcgccc ttagtttgta ggttttgatg ttacattgag tgacagtgaa tgaaagggtg	60
tgtaaacata aaataatggg aacaaccatg acatgttgga ctggatcagt aggcggttca	120
aagatgcaag ggcgaattc	139
<210>	78
<211>	111
<212>	DNA
<213>	искусственная последовательность
<22O>
<223>	ампликон Solanum Tuberosum, амплифицированный с использованием праймеров
из	UGPase
<400>	78

gaattcgccc ttggacatgt gaagagacgg agcgcagatt ccccagtaag gaggtgtgag 60 gggctagttg tagagggtac gcggaggggt agaggtagga agggcgaatt c 111 <210>79 <211> 22 <212> DNA <213> искусственная последовательность <220>

<223> праймер: Brassica napus (ACC) <400> 79 ggtgagctgt ataatcgagc ga 22

- 57 031180

Claims (1)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Способ установления наличия или отсутствия двух или более независимых трансформантов растений или материала, полученного от них, по анализу образца, содержащего растения или их части, клетки растений, протопласты растений и/или ткани растений, и/или полученный из растений материал, где каждый независимый трансформант характеризуется (i) нуклеиновой кислотой, выбранной из группы, включающей нуклеиновую кислоту, происходящую из таксона и специфичную для таксона Zea mays (Zm), нуклеиновую кислоту, происходящую из таксона и специфичную для таксона Brassica napus (Bn), нуклеиновую кислоту, происходящую из таксона и специфичную для таксона Glycine max (Gm), нуклеиновую кислоту, происходящую из таксона и специфичную для таксона Oryza sativa (Or), нуклеиновую кислоту, происходящую из таксона и специфичную для таксона Beta vulgaris (Bv), нуклеиновую кислоту, происходящую из таксона и специфичную для таксона Gossypium (Gs), или нуклеиновую кислоту, происходящую из таксона и специфичную для таксона Solarium tuberosum (St), и (ii) одной или несколькими нуклеиновыми кислотами, выбранными из нуклеиновой кислоты, происходящей из промотора 35S вируса мозаики цветной капусты (p35S), нуклеиновой кислоты, происходящей из 3' терминатора гена нопалинсинтазы Agrobacterium tumefaciens (tNOS), нуклеиновой кислоты, происходящей из гена кристаллического белка Cry1Ab Bacillus thuringiensis (Cry1Ab), нуклеиновой кислоты, происходящей из гена bar фосфинотрицинацетилтрансферазы (PAT) Streptomyces hygroscopicus (PAT/bar), нуклеиновой кислоты, происходящей из гена pat фосфинотрицинацетилтрансферазы (PAT) Streptomyces viridochromogenes (PAT/pat), нуклеиновой кислоты, происходящей из гена EPSPS 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазы Agrobacterium sp. CP4 (CP4-EPSPS), включающий следующие стадии:

   (1) анализ указанного образца для детектирования присутствия или отсутствия в этом образце указанных выше нуклеиновых кислот, которые характеризуют два или более независимых трансформантов растений;

   (2) заключение о присутствии или отсутствии в образце материала, происходящего от двух или нескольких независимых трансформантов растений, выбранных из группы, включающей независимые трансформанты Bt176, Bt11, Bt10, MON810, MON863, ТС1507, NK603, Т25, GA21, DAS-59122, MIR604, LY038, MON88017, их гибриды и родственные им независимые трансформанты; независимые трансформанты Topas 19/2, MS1, RF1, RF2, RF3, MS8, GT73, Т45, Liberator pHoe6/Ac, GS40/90pHoe6/Ac, OXY235, их гибриды, включая MS1/RF1, MS1/RF2, MS8/RF3, и родственные им независимые трансформанты; независимые трансформанты MON 40-3-2, MON89788, А2704-12, А5547-127, их гибриды и родственные им независимые трансформанты, независимые трансформанты LL62, LL06 и LL601, их гибриды и родственные им независимые трансформанты; независимые трансформанты Т120-7, Н7-1 и А5-15, их гибриды и родственные им независимые трансформанты, независимые трансформанты LL cotton 25, MON 1445, MON 531, MON15985, их гибриды и родственные им независимые трансформанты и независимый трансформант ЕН92-527-1 и родственные ему независимые трансформанты, где указанные родственные независимые трансформанты представляют собой растения того же таксона, что и независимые трансформанты, и которые трансформированы теми же конструкциями, как соответствующие независимые трансформанты, которым они родственны, где стадию (2) осуществляют с помощью вычислительного устройства и она включает:

   (a) присваивание каждой нуклеиновой кислоте уникального значения, выбранного из простых чисел;

   (b) представление каждого независимого трансформанта в виде произведения простых чисел, присвоенных нуклеиновым кислотам, характеризующим данный независимый трансформант;

   (c) представление каждого образца в виде произведения простых чисел, присвоенных нуклеиновым кислотам, которые присутствуют в данном образце; и (d) для каждого независимого трансформанта деление определенного на стадии (с) произведения, представляющего образец, на определенное на стадии (b) произведение, представляющее независимый трансформант, где если полученное при делении число будет равно 1, тогда данный независимый трансформант или материал, полученный из него, потенциально присутствует в образце;

   если полученное при делении число будет целым числом больше 1, тогда данный независимый трансформант или материал, полученный из него, потенциально присутствует в образце;

   если полученное при делении число будет дробным числом, тогда данный независимый трансформант или материал, полученный из него, отсутствует в образце.

   2. Вычислительное устройство, запрограммированное для осуществления стадии (2) способа по п.1.

   3. Применение вычислительного устройства по п.2 для осуществления стадии (2) способа по п.1.

   4. Носитель данных, содержащий инструкции для вычислительного устройства, запрограммированного для осуществления стадии (2) способа по п.1.

   - 58 031180

   ADH (Zea Mays)

   GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGTATCCGTCGTTTCCCATCTCTTCCTCCTTTAGTAGCT ACCACTATATAAATCAGGGCTCATTTTCTCGCTCCTCACAGGCTCATCTCGCTTTGGATC GATTGGTTTCGTAACTGGTGAGGGACTGAGGGTCTCGGAGTGGGTC (SEQ ID NO: 32)

   ADH (Zea mays)

   GAATTCGCCCTTAATCGATCCAAAGCGAGATGAGCCTGTGAGGAGCGAGAAAATGAGCC CTGATTTATATAGTGGTAGCTCTAAAGGAGGAAGAGAAAGGGCGAATTC (SEQ ID NO: 70)

   Lectin (Glycine max)

   GAATTGCGCCCTTCATTACCTATGATGCCTCCACCAACCTCTTGTGTTGCTTCTTTGGTT CATCCTTCGCAGAGAAGCAGCTATATCCTCTCCGGATGTGGTCGATTTGAAGACTTCTCT TCCCGAGTTGGGGGGTTGAGGATAGGGGTTCTCGTGCGTGCCACGTGGGACTCGACAT AGCCTGGGGAATCGCATGACGTGCTTAAGGGCGAATTC (SEQ ID NO: 33)

   SLTM (Glycine max)

   GAATTCGCCCTTAACCGGTAGCGTTGCCAGCTTCGCCGCTTCCTTCAACTTCACCTTCTA TGCCCCTGACACAAAAAGGCTTGCAGATGGGCTAAGGGCGAATTC (SEQ ID NO: 71) p35S (более длинный)

   GCTCGAATTCGCCCTTGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAACATC GTGGAAGAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATATCTC CACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACAAGGGCGAATTCG TAA (SEQ ID NO: 34)

   Фиг. 1А p35S (короткий)

   GAATTCGCCCTTGGGTCTTGCGAAGGATAGTGGGATTGTGCGTCATCCCTTACGTCAGT GGAGATATCACATCAATCCACTTGCTTTAAGGGCGAATTC (SEQ ID NO: 72) tNOS (TNOS-D)

   GCTCGAATTCGCCCTTTATCCTAGGTTGCGCGCTATATTTTGTTTTCTATCGCGTATTAAA TGTATAATTGCGGGACTCTAATCAAGGGCGAATTCGTAA (SEQ ID NO: 35)

   CRYIAb

   GCTCGAATTCGCCCTTACGCCTTCCTGGTGCAAATCGAGCAGCTCATCAACCAGAGGAT CGAGGAGTTCGCCAGGAACCAGGAAGGGCGAATTCGTAA (SEQ ID NO: 36)

   CRY 1Ab

   GCTCGAATTCGCCCTTACCGGTTACACTCCCATCGACATCTCCCTCTCCCTCACGCAGTT CCTGCTCAGCGAGTTCGTGCCAGGTGCTGAAGGGCGAATTCGTAA (SEQ ID NO: 37)

   CRY 1Ab (Bt11)

   GCTCGAATTCGCCCTTCAGCACCTGGCACGAACTCGCTGAGCAGAAACTGTGTCAAGGA CAAGGAGATGTCGATGGGAGTGTAACCGGTAAGGGCGAATTTCGTAA (SEQ ID NO: 38)

   CRYIAb (MON 810)

   GAATTCGCCCTTCAGCACCTGGCACGAACTCGCTGAGCAGGAACTGCGTGAGGGAGAG

   GGAGATGTCGATGGGAGTGTAACCGGTAAGGGCGAATTC (SEQ ID NO: 73)

   Фиг. 1B

   - 59 031180

   PAT/bar

   GCTCGAATTCGCCCTTCGTCAACCACTACATCGAGACAAGCACGGTCAACTTCCGTACC GAGCCGCAGGAACCGCAGGAGTGGACAAGGGCGAATTCGTAA (SEQ ID NO: 39)

   PAT/pat

   GCTCGAATTCGCCCTTCCGCGGTTTGTGATATCGTTAACCATTACATTGAGACGTCTACA GTGAACTTTAGGACAGAGCCACAAACACCACAAGAGTGGATTGATGATCTAGAGAGGTT GCAAGAAGGGCGAATTCGTAA (SEQ ID NO: 40)

   Rbcl

   G CTCG AATTCGCCCTTAG GTCTAAG GGGTAAGCT AC ATAACAG AT AT ATT GATCT G G GTC CCCAGGAACGGGCTCGATGTGATAGCATCGTCCTTTGTAACGATCAAGGCTAAGGGCGA ATTCGTAA (SEQ ID NO: 41)

   Rbcl (OSR Wt)

   GCTCGAATTCGCCCTTAGGTCTAAGGGGTAAGCTACATACGCAATAAATTGAGTTTCTTC TCCTGGAACGGGCTCGATGTGGTAGCATCGTCCTTTGTAACGATCAAGGCTAAGGGCGA ATTCGTAA (SEQ ID NO: 42) tNOS (TNOS-L)

   GCTCGAATTCGCCCGTTAAATGTATAATTGCGGGACTCTAATCATAAAAACCCATCTCAT AAATAACGTCATGCATTACATGTTAATTATTACATGCTTAACGTAATTCAACAGAAATTATA TGATAATCATCGCAAGACCGGCAACAGGATTCAATCTTAAGAAACTTTATTGCCAAATGT TTGAACGAAGGGCGAATTCGTAA (SEQ ID NO: 43)

   Фиг. 1С

   ACC (Brassica napus)

   GCTCGAATTCGCCCTTGGCGCAGCATCGGCTCTTCTGCATAGTACCGTTTCTCCATCGA CCAATGGAACGAATGTCTAATAGGTGTTCGTCCTTCATCTCGCTCGATTATACAGCTCAC CACACCCACACCTGCGGAACACAGGCTCGAACTAACTTCTTCCTCTTTGAGAATTTTCTC CACTCTTTCTTGAGCTTGGTCCTCCTCATTCTCAAGGGCGAATTCGTAA (SEQ ID NO: 44)

   CP4-EPSPS

   CTCGAATTCGCCCTTGAATGCGGACGGTTCCGGAAAGGCCAGAGGATTTGCGGGCGGT TGCGGGCCGGCTGCTTGCACCGTGAAGCATGCAGGCTGTAGCCACTGATAAGGGCGAA TTCGTAA (SEQ ID NO: 45)

   CP4-EPSPS

   GCTCGAATTCGCCCTTGGCTCTGAGCTTCGTCCTCTTAAGGTCATGTCTTCTGTTTCCAC GGCGTGCATGCTTCACGGTGCAAGCAGCCGGCCCGCAACCGCCCGCAAATCCTCTGGC CTTTCCGGAACCGTCCGCATTCAAGGGCGAATTCGTAA (SEQ ID NO: 46)

   CP4-EPSPS (GT 73)

   GAATTCGCCCTTTGAAGGACCTGTGGGAGATAGACTTGTCACCTGGAATACGGACGGTT CCAGAAAGACCAGAGGACTTACGAGCAGTTGCTGGACGGCTGCTTGCACCGTGAAGCA TGCAAGGGCGAATTC (SEQ ID NO: 74)

   CP4-EPSPS RRS

   GAATTCGCCCTTTGAAGGACCGGTGGGAGATCGACTTGTCGCCGGGAATGCGGACGGT TCCGGAAAGGCCAGAGGATTTGCGGGCGGTTGCGGGCCGGCTGCTTGCACCGTGAAG CATGCAAGGGCGAATTC (SEQ ID NO: 75)

   Фиг. 1D

   - 60 031180

   Фосфолипаза D (Oryza sativa)

   GCTCGAATTCGCCCTTGCTTAGGGAACAGGGAAGTAAAGTTGAATGGTGAGTATGAACC TGCAGGTCGCCCTTTGGATGGCACAGACTATGCTAAGAAGGGCGAATTCGTAA (SEQ ID NO: 52)

   CP4-EPSP

   GCTCGAATTCGCCCTTGGACCTGTGGGAGATAGACTTGTCGCCGGGAATGCGGACGGT TCCGGAAAGGCCAGAGGATTTGCGGGCGGTTGCGGGCCGGCTGCTTGCACCGTGAAG CATGCAAGGGCGAATTCGTAA (SEQ ID NO: 53)

   CP4-EPSP

   GCTCGAATTCGCCCTTGGACCTGTGGGAGATAGACTTGTCACCTGGAATACGGACGGTT CCAGAAAGACCAGAGGACTTACGAGCAGTTGCTGGACGGCTGCTTGCACCGTGAAGCA TGCAAGGGCGAATTCGTAA (SEQ ID NO: 54)

   Kpyi4M0epMH(Brassica)

   GCTCGAATTCGCCCTTCAGCTCAACAGTTTCCAAACGAGTGCCAACTAGACCAGCTCAA TGCGCTGGAGCCGTCACACGTACTTAAGGCTGAGGCTGGTCGAAGGGCGAATTCGTAA (SEQ ID NO: 55)

   GluA3 (Сахарная свекла)

   GAATTCGCCCTTGACCTCCATATTACTGAAAGGAAGCCAAAAGGGATCAATTAAGTGCTC TACGAAGTTTAAAGTATGTGCCGCTCTCAAGACTGAACATGGCACTGTGAACAGGATGG AGCAATTACTCAAGGGCGAATTC (SEQ ID NO: 76)

   Фиг. 1E

   Sah-7 (Хлопчатник)

   GAATTCGCCCTTAGTTTGTAGGTTTTGATGTTACATTGAGTGACAGTGAATGAAAGGGTG TGTAAACATAAAATAATGGGAACAACCATGACATGTTGGACTGGATCAGTAGGCGGTTCA AAGATGCAAGGGCGAATTC (SEQ ID NO: 77)

   UGPase (Картофель)

   GAATTCGCCCTTGGACATGTGAAGAGACGGAGCGCAGATTCCCCAGTAAGGAGGTGTG AGGGGCTAGTTGTAGAGGGTACGCGGAGGGGTAGAGGTAGGAAGGGCGAATTC (SEQ ID NO: 78)

   Фиг. 1F

   - 61 031180 (А)

   RRS 100% Ct 22.51 22.09 22.13 p35S Короткий +· Tm 71.5 и 76 71.5 и 76 72 и 76.5 tNOS Среднее Ct 22.25 Станд. откл. 0.232 Ct 22.99 22.76 22.62 Tm 76.50 76.50 76.50 p35S Короткий Среднее Ct 22.79 Станд. откл. 0.186 Ct 23.03 22.83 22.76 Tm 72.00 72.00 72.00 --шоь Среднее Ct 22.88 Станд. откл. 0.142

   (В)

   RRS 100% 230107 мультиплекс

   Mel Рей: 191107 test rnuftiRiex p35S INOS .opd

   Температура

   Фиг. 2

   Фиг. 3