JP5681763B2 - トランスジェニック植物イベントの検出 - Google Patents
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Description
(1)試料中に、以下のものを含む又はからなる核酸が存在するか又は不在であるかを検出する工程:
a) 「Zm」:トウモロコシ(Zea mays)分類群(taxon), 好ましくは Zea mays ssp. mays由来及び特異的な核酸
b) 「Bn」:セイヨウアブラナ(Brassica napus)分類群由来及び特異的な核酸,
c) 「Gm」:ダイズ(Glycine max)分類群由来及び特異的な核酸, 及び
下記から選ばれる核酸の1種、1種超、若しくはすべて
d) 「p35S」:カリフラワーモザイクウィルスの35S プロモーター由来の核酸
e) 「tNOS」:アグロバクテリウム=ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)ノパリン(nopaline)シンテターゼ遺伝子の3’ターミネーター由来の核酸
f)「Cry1Ab」:Bacillus thuringiensis の結晶タンパク遺伝子Cry1Ab由来の核酸
g)「PAT/bar」:Streptomyces hygroscopicus のホスフィノトリシン(phosphinothricin)アセチルトランスフェラーゼ(PAT)遺伝子bar 由来の核酸
h)「PAT/pat」:Streptomyces viridochromogenes のホスフィノトリシン(phosphinothricin)アセチルトランスフェラーゼ (PAT)遺伝子pat 由来の核酸
i) 「CP4-EPSPS」:Agrobacterium sp. CP4a からの5−エノイルピルビニルシキミ酸−3−リン酸合成酵素EPSPS 遺伝子由来の核酸;並びに
(2)イベントBt176,Bt11,Bt10,MON810,MON863,TC1507,NK603,T25,GA21,DAS-59122、その交差物、及びその関連イベント;イベントTopas 19/2,MS1,RF1,RF2,RF3,MS8,GT73,T45,Liberator pHoe6/Ac,GS40/90pHoe6/Ac、その交差物(MS1/RF1,MS1/RF2,MS8/RF3を含む)、及びその関連イベント;イベントMON 40-3-2,MON89788,A2704-12,A5547-127,その交差物、及びその関連イベントを含む又はからなる群から選ばれるイベントのような1種以上のトランスジェニック植物イベントに由来する材料が、試料中に存在するか不在かを結論づける工程。
(1)上記で定義されたa)で挙げられた核酸、及び上記で定義されたd)−i)で挙げられた核酸から選ばれる1種、1種超若しくはすべてからなる、又は含む核酸が、試料中に存在するか又は不在であるかを検出する工程;並びに
(2)イベントBt176,Bt11,Bt10,MON810,MON863,TC1507,NK603,T25,GA21, DAS-59122、その交差物、及びその関連イベントからなる群又は含む群から選ばれるイベント等の、トウモロコシの1つ以上のトランスジェニック植物イベントに由来する材料が、試料中に存在するか又は不在であるか結論づける工程;
を含む。
(1) 上記で定義するようなb)で挙げられた核酸、及び上記で定義するようなd) - i)で挙げられた核酸から選択される1種、1種超、若しくはすべてを含む、又はからなる核酸が試料中に存在するか又は不在であるかを検出する工程;並びに
(2) イベントTopas 19/2,MS1,RF1,RF2,RF3,MS8,GT73,T45,Liberator pHoe6/Ac, GS40/90pHoe6/Ac、その交差物(MS1/RF1,MS1/RF2,MS8/RF3を含む)、及びその関連イベントを含む、又はからなる群から選択されるイベント等の、アブラナの1以上のトランスジェニック植物イベントに由来する材料が、試料中に存在するか又は不在であるかを結論づける
工程を含む。
(1) 上記で定義されたc) で挙げられた核酸及び上記で定義されたd) - i)で挙げられた核酸から選ばれる核酸の1種、1種超若しくはすべての核酸を含む、又はからなる核酸が、試料中に存在するか又は不在であるかを検出する工程;並びに
(2) イベントMON 40-3-2, MON89788,A2704-12,A5547-127、その交差物、及びその関連イベントを含む、又はからなる群から選択されるイベント等の、1以上の大豆トランスジェニック植物イベントに由来する材料が、試料中に存在するか又は不在であるかを結論づける工程
を含む。
(1)上記で定義されたa)およびb)で挙げられた核酸、上記で定義されたd) - i)で挙げられた核酸から選ばれる1種、1種超若しくはすべての核酸を含む、又はからなる核酸が、試料中に存在するか又は不在であるかを検出する工程;並びに
(2)イベントBt176,Bt11,Bt10,MON810,MON863,TC1507,NK603,T25,GA21, DAS-59122,その交差物、及びその関連イベント;イベントTopas 19/2,MS1,RF1,RF2,RF3,MS8,GT73,T45,Liberator pHoe6/Ac,GS40/90pHoe6/Ac、その交差物(MS1/RF1, MS1/RF2,MS8/RF3を含む)、及びその関連イベントを含む、又はからなる群から選ばれるイベントのような、トウモロコシトランスジェニック植物及び/またはアブラナの1以上のトランスジェニック植物イベントに由来する材料が、試料中に存在するか又は不在であるかを結論づける工程
を含む。
(1) 上記で定義されたa)およびc)で挙げられた核酸、及び上記で定義されたd)−i)で挙げられた核酸から選ばれる1種、1種超若しくはすべての核酸を含む、又はからなる核酸が、試料中に存在するか又は不在であるかを検出する工程;並びに
(2) イベントBt176,Bt11,Bt10,MON810,MON863,TC1507,NK603,T25,GA21,DAS-59122、その交差物、及びその関連イベント;及びMON 40-3-2,MON89788,A2704-12,A5547-127、その交差物、及びその関連イベントを含む又はからなる群から選ばれるイベントのような、トウモロコシトランスジェニック植物及び/又は大豆の1以上のトランスジェニック植物イベントに由来する材料が、試料中に存在するか又は不在であるかを結論づける工程
を含む。
(1) 上記で定義されたb)およびc)で挙げられた核酸、及び上記で定義されたd)−i)で挙げられた核酸から選ばれる1種、1種超、若しくはすべての核酸を含む、又はからなる核酸が、試料中に存在するか又は不在であるかを検出する工程;並びに
(2) イベントTopas 19/2,MS1,RF1,RF2,RF3,MS8,GT73,T45,Liberator pHoe6/Ac,GS40/90pHoe6/Ac、その交差物(MS1/RF1,MS1/RF2,MS8/RF3を含む)、及びその関連イベント;及びイベントMON 40-3-2,MON89788,A2704-12,A5547-127,その交差物、及びその関連イベントを含む、又はからなる群から選ばれるイベントのような、アブラナ及び/又は大豆の1以上のトランスジェニック植物イベントに由来する材料が、試料中に存在するか又は不在であるかを結論づける工程
を含む。
(1) 上記で定義されたa), b) 及び c)で挙げられた核酸から選択される1種、1種超、若しくはすべての核酸、及び上記で定義されたd)−i)で挙げられた核酸から選ばれる核酸の1種、1種超、若しくはすべての核酸を含む又はからなる核酸が、試料中に存在するか又は不在であるかを検出する工程;並びに
(2) イベントBt176,Bt11,Bt10,MON810,MON863,TC1507,NK603,T25,GA21, DAS-59122,その交差物、及びその関連イベント;イベントTopas 19/2,MS1,RF1,RF2, RF3,MS8,GT73,T45,Liberator pHoe6/Ac,GS40/90pHoe6/Ac、その交差物(MS1/RF1,MS1/RF2,MS8/RF3を含む)、及びその関連イベント;及びイベントMON 40-3-2, MON89788,A2704-12,A5547-127,その交差物、及びその関連イベントを含む又はからなる群から選ばれるイベントのような、1以上のトランスジェニック植物イベントに由来する材料が、試料中に存在するか又は不在であるかを結論づける工程
を含む。
(1) 上記で定義されたa), b) 及びc)で挙げられた核酸から選ばれる1種、1種超、若しくはすべて;上記で定義されたd)−i)で挙げられた核酸から選ばれる1種、1種超、若しくはすべて;及び所望により、上記で定義されたj)−n)で挙げられた核酸から選ばれる1種、1種超、若しくはすべてを含む、又はからなる核酸が、試料中に存在するか又は不在であるかを検出する工程;並びに
(2) イベントBt176,Bt11,Bt10,MON810,MON863,TC1507,NK603,T25,GA21,DAS-59122,MIR604,LY038及びMON88017、その交差物;イベントTopas 19/2,MS1,RF1,RF2,RF3,MS8,GT73,T45,Liberator pHoe6/Ac,GS40/90pHoe6/Ac,OXY235、その交差物(MS1/RF1,MS1/RF2,MS8/RF3を含む)、及びその関連イベント;及びイベントMON 40-3-2,MON89788,A2704-12,A5547-127、その交差物、及びその関連イベントを含む又はからなる群から選ばれるイベントのような、1以上のトランスジェニック植物イベントが、試料中に存在するか又は不在であるかを結論づける工程
を含む。
(1) 上記で定義されたa), b), c), o), p) q) 及びt)で挙げられた核酸から選ばれる核酸の1種、1種超若しくはすべて、上記で定義されたd)−i)で挙げられた核酸から選ばれる核酸の1種、1種超若しくはすべて、および所望により、上記で定義されたj)−n), r) s) 及び u)で挙げられた核酸から選ばれる核酸の1種、1種超若しくはすべてを含む又はからなる核酸が、試料中に存在するか又は不在であるかを検出する工程;並びに
(2) イベントBt176,Bt11,Bt10,MON810,MON863,TC1507,NK603,T25,GA21,DAS-59122,MIR604,LY038,MON88017、その交差物、及びその関連イベント;イベントTopas 19/2,MS1,RF1,RF2,RF3,MS8,GT73,T45,Liberator pHoe6/Ac,GS40/90pHoe6/Ac,OXY235、その交差物(MS1/RF1,MS1/RF2,MS8/RF3を含む)、及びその関連イベント;イベントMON 40-3-2,MON89788,A2704-12,A5547-127、その交差物、及びその関連イベント;イベントLL62,LL06及びLL601、その交差物、及びその関連イベント;イベントT120-7、H7-1 及びA5-15、その交差物、及びその関連イベント;イベントLL cotton 25,MON 1445,MON 531,MON15985、その交差物、及びその関連イベント;イベントEH92-527-1及び関連イベントを含む又はからなる群から選ばれるイベント等の、1以上のトランスジェニック植物イベントに由来する材料が、試料中に存在するか又は不在であるかを結論づける工程
を含む。
(1) 上記で定義されたでa), b), c), o), p) q) 及び t) で挙げられた核酸から選ばれる核酸の1種、1種超若しくはすべて、上記で定義されたd) - i)で挙げられた核酸から選ばれる核酸の1種、1種超若しくはすべてを含む又はからなる核酸が、試料中に存在するか又は不在であるかを検出する工程;並びに
(2) イベントBt176,Bt11,Bt10,MON810,MON863,TC1507,NK603,T25,GA21,DAS-59122,所望によりMIR604,LY038及びMON88017、その交差物、及びその関連イベント;イベントTopas 19/2,MS1,RF1,RF2,RF3,MS8,GT73,T45,Liberator pHoe6/Ac,GS40/90pHoe6/Ac、所望によりOXY235,その交差物(MS1/RF1,MS1/RF2,MS8/RF3を含む);イベントMON 40-3-2,MON89788,A2704-12,A5547-127、その交差物、及びその関連イベント;イベントLL62,LL06及びLL601、その交差物、及びその関連イベント;イベントT120-7,H7-1及びA5-15、その交差物、及びその関連イベント;及びイベントLL cotton 25,MON 1445,MON 531,MON15985、その交差物、及びその関連イベント;及びイベントEH92-527-1及びその関連イベントを含む又はからなる群から選択されるイベント等の、1以上のトランスジェニック植物イベントが、試料中に存在するか又は不在であるかを結論づける工程
を含む。
(1) 上記で定義されたa), b), c), o), p) q)および t)で挙げられる核酸から選ばれる1種、1種超若しくはすべて、上記で定義されたd) - i)で挙げられた核酸から選ばれる1種若しくは1種超若しくはすべてを含む、又はからなる核酸が、試料中に存在するか又は不在であるかを検出する工程;並びに
(2) イベントBt176,Bt11,Bt10,MON810,MON863,TC1507,NK603,T25,GA21,DAS-59122、所望により、MIR604,LY038 及び MON88017、その交差物、及びその関連イベント;イベントTopas 19/2,MS1,RF1,RF2,RF3,MS8,GT73,T45,Liberator pHoe6/Ac,GS40/90pHoe6/Ac、所望によりOXY235、その交差物(MS1/RF1,MS1/RF2,MS8/RF3を含む)、及びその関連イベント;イベントMON 40-3-2,MON89788,A2704-12,A5547-127、その交差物、及びその関連イベント;イベントLL62,LL06 及びLL601、その交差物、及び関連イベント;イベントT120-7,H7-1及び A5-15、その交差物、及びその関連イベント;イベントLL cotton 25,MON 1445,MON 531,MON15985、その交差物、及びその関連イベント;イベントEH92-527-1及びその関連イベントを含む、又はからなる群から選ばれるイベント等の、1以上のトランスジェニック植物イベントに由来する材料が、試料中に存在するか又は不在であるかを結論づける工程を含み、
工程(1)における、試料中の核酸の存在または不在の検出は、表1に示されるそれぞれのプライマー及びプライマー対、またはバリアントまたはその誘導物を用いたPCR増幅を用いて行われる。
−もし GXがGSAMと等しいならば(GX=GSAM)、トランスジェニック植物イベントX、またはその交差物、またはその関連イベント由来物質由が試料中に存在している可能性がある;
−もし、GX がGSAM の適当なサブセットであれば(GX ⊂GSAM)、トランスジェニック植物イベントX、またはその交差物、またはその関連イベントが、試料中に存在している可能性がある;
−もし、GX がGSAM と等しくなく、且つ GX がGSAMの適当なサブセットでないならば
トランスジェニック植物イベントX、またはその交差物、またはその関連イベントが、試料中に不在である。
好ましい態様では、これらの論理演算は、コンピュータ装置によって、有効に実行されることができる。
工程(1):課題を解決する手段の欄のa) - u)で挙げられた核酸の1種、1種超若しくはすべてを含む又はからなる核酸が、試料中に存在するか又は不在であるかを検出(特に与えられたアッセイの目的に依存する特定の選択)する工程、
工程(2):課題を解決する手段の欄で詳述した核酸のいくつかまたはすべてを含むまたはからなる群から選ばれる、1以上のトランスジェニック植物イベントに由来する材料が、試料中に存在するか又は不在であるかを結論づける工程
を含む。
表2:トランスジェニック植物イベントの同定
配列要素/遺伝子 GenBank アクセッションナンバー
CMV p35Sプロモーター V00140 (CAMV ゲノム全体)
NOS ターミネータ V00087.1
Cry1Ab ORF AF465640
bar遺伝子ORF AY346130.1
pat遺伝子ORF DQ156557.1
EPSPS 遺伝子ORF AY125353.1
修飾されたCry3A遺伝子ORF AR836206.1
Glb1プロモーター CS155614.1
Cry3Bb1 遺伝子ORF CS410008.1
Bxn 遺伝子ORF E01313.1
Cry1Ac遺伝子ORF EF094884.1
Cry2Ab2遺伝子ORF DQ361266.1
Gbss遺伝子ORF X58453.1
Zea mays葉緑素のrbcL遺伝子 Z11973.1
・もし、GX がGSAM と等しいならば(GX= GSAM)、トランスジェニック植物イベントX、又はその交差物、又はその関連イベントに由来する材料が、試料中に存在する可能性あり;
・もし、GX が適当なサブセットGSAM であるならば(GX⊂GSAM)、トランスジェニック植物イベントX、その交差物、またはその関連イベントに由来する材料が、試料中に存在する可能性あり;
・もし、GX が GSAM と等しくなく、且つGX がGSAM,の適当なサブセットでないならば
トランスジェニック植物イベントX、その交差物、又はその関連イベントに由来する材料は、試料中に存在しない。
ここで、
- VGBt176 = VZm × Vp35S × VCry1Ab × VPAT/bar,
- VGBt11 =VZm × Vp35S × VtNOS × VCry1Ab × VPAT/pat,
- VGBt10 = VZm × Vp35S × VtNOS × VCry1Ab × VPAT/pat,
- VGMON810 = VZm × Vp35S × VtNOS × VCry1Ab,
- VGMON863 = VZm × Vp35S × VtNOS,
- VGTC1507 = VZm × Vp35S × VPAT/pat,
- VGNK603 = VZm × Vp35S × VtNOS × VCP4-EPSPS,
- VGT25 = VZm × Vp35S × VPAT/pat,
- VGGA21 = VZm × VtNOS,
- VGDAS-59122 = VZm × Vp35S × VPAT/bar,
- VGMIR604 = VZm × VtNOS × VmCry3A,
- VGLY038 = VZm × Vp35S × VtNOS × VcordapA × VGlb1,
- VGMON88017 = VZm × Vp35S × VtNOS × VCP4-EPSPS × VCry3Bb1,
- VGTopas 19/2 = VBn × Vp35S × VPAT/pat,
- VGMS1 = VBn × VtNOS × VPAT/bar,
- VGRF1 = VBn × VtNOS × VPAT/bar,
- VGRF2 = VBn × VtNOS × VPAT/bar,
- VGMS8 = VBn × VtNOS × VPAT/bar,
- VGRF3 = VBn × VtNOS × VPAT/bar,
- VGMS1/RF1 = VBn × VtNOS × VPAT/bar,
- VGMS1/RF2 = VBn × VtNOS × VPAT/bar,
- VGMS8/RF3 = VBn × VtNOS × VPAT/bar,
- VGGT73 = VBn × VCP4-EPSPS,
- VGT45 = VBn × Vp35S × VPAT/pat,
- VGLiberator pHoe6/Ac = VBn × Vp35S × VPAT/pat,
- VGGS40/90pHoe6/Ac = VBn × Vp35S × VPAT/pat,
- VGOXY235 = VBn × Vp35S × VBxn,
- VGMON40-3-2 = VGm × Vp35S × VtNOS × VCP4-EPSPS,
- VGMON89788 = VGm × VCP4-EPSPS,
- VGA2704-12 = VGm × Vp35S × VPAT/pat,
- VGA5547-127 = VGm × Vp35S × VPAT/pat,
- VGLL62 = VOr × Vp35S × VPAT/bar,
- VGLL06 = VOr × Vp35S × VPAT/bar,
- VGLL601 = VOr × Vp35S × VtNOS × VPAT/bar,
- VGT120-7 = VBv × Vp35S × VPAT/pat,
- VGH7-1 = VBv × Vp35S × VCP4-EPSPS,
- VGA5-15 = VBv × Vp35S × VtNOS × VCP4-EPSPS,
- VGLL cotton 25 = VGs × Vp35S × VtNOS × VPAT/bar,
- VGMON1445 = VGs × Vp35S × VtNOS × VCP4-EPSPS,
- VGMON531 = VGs × Vp35S × VtNOS × VCry1Ac,
- VGMON15985 = VGs × Vp35S × VtNOS × VCry1Ac × VCry1Ac,
- 又はVGEH92-527-1 = VSt × VtNOS × VGbss
である。
・もし、 VGSAM / VGX が1に等しいならば、トランスジェニック植物イベントX またはその交差物、またはその関連イベントに由来する材料が、試料中に存在する可能性あり;
・もし、VGSAM / VGX が、値VZm,VBn,VGm ,Vp35S,VtNOS,VCry1Ab,VPAT/bar,VPAT/pat,VCP4-EPSPS,VmCry3A ,Vcordap A, VGlb1, VCry3Bb1 ,VBxn ,VOr, VBv,VGs, VCry1Ac ,VCry2ab2 ,VSt 及び VGbssを含む群又はからなる群から選ばれる1つの値、または2つ以上の値の倍数と等しいならば、トランスジェニック植物イベントX又はその交差物、又はその関連イベントに由来する材料が、試料中に存在する可能性がある;
・もし、VGSAM / VGX が 1と等しくないならば、且つ値VZm,VBn,VGm ,Vp35S,VtNOS,VCry1Ab, VPAT/bar,VPAT/pat,VCP4-EPSPS,VmCry3A ,Vcordap A, VGlb1, VCry3Bb1 ,VBxn ,VOr, VBv,VGs, VCry1Ac ,VCry2ab2 ,VSt 及び VGbssを含む、又はからなる群から選ばれる1つの値、または2つ以上の値の倍数とも等しくないならば、トランスジェニック植物 イベントX、その交差物、又はその関連イベントに由来する材料は試料中に存在しない。
・もし、VGSAM / VGX が1に等しいならば、トランスジェニック植物イベントXまたはその交差物、又はその関連イベントに由来する材料が、試料中に存在する可能性がある;
・もし、VGSAM / VGX が1より大きい整数ならば、トランスジェニック植物イベントX 又はその交差物、又はその関連イベントに由来する材料が、試料中に存在する可能性がある;
・もし、VGSAM / VGX が整数でないならば、トランスジェニック植物イベントX 、その交差物又はその関連イベントに由来する材料は、試料中に存在しない。
・Brassica acc遺伝子のためのプライマー対SEQ ID NO: 3 及び4(OSR wt上で増幅される適例なインサート配列を図1のSEQ ID NO: 44に示す);
・CP4-EPSPプライマー対SEQ ID NO: 18及び19、及びSEQ ID NO: 50及び19(図1にSEQ ID NO: 45及び46で示される、それぞれの適例なインサート配列を得るために、イベント 40-3-2及びイベント NK603それぞれについて増幅される適例なインサート)(プライマー SEQ ID NO: 17も、プライマーSEQ ID NO: 19と組み合わせて用いてもよい;しかしながら、プライマーSEQ ID NO: 17は、SEQ ID NO: 50と比べて、ヌクレオチド20でミスマッチ配列を含むので、後者(プライマーSEQ ID NO:50)の方がより好ましい)
・トウモロコシadh-1遺伝子のためのプライマー対SEQ ID NO: 1及び2 (野生型トウモロコシについて増幅される、図1の適例なインサート配列SEQ ID NO: 32);
・大豆レクチン遺伝子のためのプライマー対SEQ ID NO: 5及び49(野生型大豆について増幅した適例なインサート配列 図1のSEQ ID NO: 33);
・Zea mays adh-1 遺伝子内のより短いアンプリコン のためのプライマー対SEQ ID NO: 56及び57 (適例なインサート配列 図1のSEQ ID NO: 70);
・Glycin maxレクチンアンプリコンのためのプライマー対SEQ ID NO:58及び59 (SLTM) (適例なインサート配列 図1のSEQ ID NO: 71);
・p35S要素内でのより短いアンプリコンのためのプライマー対SEQ ID NO: 60及び61 (適例なインサート配列 図1のSEQ ID NO: 72);
・Beta vulgaris GluA3 遺伝子内のアンプリコンのためのプライマー対SEQ ID NO: 64及び65 (適例なインサート配列 図1のSEQ ID NO: 76);
・Gossypium sah-7遺伝子内のアンプリコンのためのプライマー対SEQ ID NO: 66及び67(適例なインサート配列 図1のSEQ ID NO: 77);
・ポテトUGPase遺伝子内のアンプリコン のためのプライマー対SEQ ID NO: 68及び69 (適例なインサート配列 図1のSEQ ID NO: 78);
・Cry1Ab 特性内での アンプリコンのためのプライマー対SEQ ID NO: 11及び12 (MON 810物質について増幅された適例なインサート配列 図1のSEQ ID NO: 73);
・CP4-EPSPS特性内でのアンプリコンのためのプライマー対SEQ ID NO: 22及び62 (RRS)または22及び63 (GT 73) (GT73について増幅された適例なインサート配列 図1のSEQ ID NO: 74、及びRRS について増幅された適例なインサート配列 図1のSEQ ID NO: 75)。
ここで教示された種々の核酸の増幅のためのプライマー及びプライマー対は、ある者が検出したいとするトランスジェニックイベントに関する採択に従って、種々にデザインされたキットに含まれていてもよい。
サイバーグリーンを用いた検出リアルタイムPCRを、表1及び4に挙げられたそれぞれのプライマー対を用いて、核酸「p35S」、「tNOS」、「Cry1Ab」、「PAT/Bar」、「PAT/pat」及び「CP4-EPSPS」からのアンプリコンの増幅のために最適化した。
RBCL:プライマーSEQ ID NO: 26 及びSEQ ID NO: 27;Tm = 76.5℃;サイズ = 95 bp; LOD = ± 0.039 ng標的DNA
トウモロコシADH (長い方のアンプリコン):プライマーSEQ ID NO: 1 及びSEQ ID NO: 2;Tm = 79.5℃;サイズ= 138bp;LOD = ± 0.016 ng 標的DNA (± 6 ハプロイド ゲノム)
トウモロコシADH (短い方のアンプリコン):プライマーSEQ ID NO: 56及びSEQ ID NO: 57;Tm = 75.5℃;サイズ= 83 bp;LOD = ± 0.016 ng標的DNA (± 6 ハプロイド ゲノム)
アブラナACC;プライマーSEQ ID NO: 79 及びSEQ ID NO: 3;Tm = 79℃;サイズ= 103 bp;LOD = ± 0.05 ng標的DNA (± 20 ハプロイド ゲノム)
アブラナクルシフェリン:プライマーSEQ ID NO: 24及びSEQ ID NO: 25;Tm = 80℃;サイズ= 85 bp;LOD = ± 0.015 ng 標的DNA (± 12 ハプロイド ゲノム)
大豆レクチン(長い方のアンプリコン):プライマーSEQ ID NO: 5及びSEQ ID NO: 49;Tm = 81.5℃;サイズ= 178 bp;LOD = ± 0.016 ng標的DNA (± 13 ハプロイド ゲノム)
大豆(レクチン):プライマーSEQ ID NO: 58及びSEQ ID NO: 59 (SLTM);Tm = 79.5℃;サイズ= 81 bp;LOD = ± 0.063 ng標的DNA (± 50 ハプロイド ゲノム)
ライスPLD:プライマーSEQ ID NO: 20及びSEQ ID NO: 21;Tm = 76.5℃;サイズ= 80 bp;LOD = ± 0.01 ng 標的DNA (± 20 ハプロイド ゲノム)
テンサイGluA3:プライマーSEQ ID NO: 64及びSEQ ID NO: 65;Tm = 77℃;サイズ= 118 bp;LOD = ± 0.01 ng 標的DNA (± 13 ハプロイド ゲノム)
コットンSAH7:プライマー SEQ ID NO: 66及びSEQ ID NO: 67;Tm = 75.5℃;サイズ= 115 bp;LOD = ± 0.02 ng 標的DNA (± 9 ハプロイド ゲノム)
ポテトUGPase:プライマーSEQ ID NO: 68及びSEQ ID NO: 69;Tm = 81℃;サイズ= 87 bp;LOD = ± 0.0002 ng標的DNA
p35S (長い方のアンプリコン):プライマーSEQ ID NO: 7及びSEQ ID NO: 8;Tm = 80.5℃;サイズ= 147 bp;LOD = ± 0.016 ng 標的DNA (± 6 ハプロイド ゲノム)
p35S (短い方のアンプリコン):プライマーSEQ ID NO: 60及びSEQ ID NO: 61;Tm = 76℃;サイズ = 75 bp;LOD:RRS 100% ± 0.032 ng 標的DNA (± 25 ハプロイド ゲノム);NK603 5% ± 6,25 ng 標的DNA (± 62.5 ハプロイド ゲノム)
tNOS-L:プライマーSEQ ID NO: 28及びSEQ ID NO: 29;Tm = 72℃;サイズ= 172 bp;LOD = ± 0.03 ng標的DNA (± 25 ハプロイド ゲノム)
tNOS-D:プライマーSEQ ID NO: 9及びSEQ ID NO: 10;Tm = 72℃;サイズ= 69 bp;LOD = ± 0.03 ng標的DNA (± 25 ハプロイド ゲノム)
Cry1Ab:プライマーSEQ ID NO: 11及びSEQ ID NO: 12;Tm = 78.5℃;サイズ= 73 bp;LOD = ± 0.06 ng (±12 ハプロイド ゲノム)
PAT/Bar:プライマーSEQ ID NO: 13 及びSEQ ID NO: 14;Tm = 80℃;サイズ= 69bp;LOD = ± 0.125ng (±50 ハプロイド ゲノム)
PAT/pat:プライマーSEQ ID NO: 15及びSEQ ID NO: 16;Tm = 77℃;サイズ= 109 bp;LOD = ± 0.03ng (±12 ハプロイド ゲノム)
CP4-EPSP:プライマーSEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 62及びSEQ ID NO: 63;Tm = 80.5または84.5℃;サイズ= 108 bp;LOD:NK603 5% ±3,125 ng (±31 ハプロイド ゲノム)、RRS 100% ±0.032 ng (±25 ハプロイド ゲノム)、GT73 100% ±0.016 ng (±12 ハプロイド ゲノム)
CP4-EPSP:プライマーSEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18及びSEQ ID NO: 19;Tm = 85℃;サイズ= 94 bp 又は124 bp;LOD = ±0.03 ng (±25 ハプロイド ゲノム)
無関係なDNAキャリアにBt176 DNAを添加することによって、仮想試料を作製した。この試料は、実施例1のリアルタイムPCR法を用いて、「p35S」,「tNOS」,「Cry1Ab」,「PAT/Bar」,「PAT/pat」及び 「CP4-EPSPS」の有無検出のためにスクリーニングされた。
なので、イベントBt11に由来する材料は、試料中に存在しない。同様に、
なので、イベントNK603からの材料は、試料中に存在しない。
スクリーニングされる核酸:表1で定義されたプライマー対を用いて、上記で定義されたような遺伝子「Zm」、「Bn」、「Gm」、「p35S」、「tNOS」、「CP4-EPSPS」、「Cry1Ab」、「PAT/bar」、「PAT/pat」、並びに、プライマー対SEQ ID NO: 26及び27 (表4)を用いて増幅される植物属の遺伝子。
・試薬:HS Taq-ポリメラーゼを含むサイバーグリーンPCRマスターMix;プライマー20 μM;ヌクレアーゼフリー水
・装置:ABI PRISMO 7700配列検出システム、7300 リアルタイムPCRシステム、層流(Laminar Flow)、ピペット 20, 200及び1000 ml、滅菌(Sterile)、エアロゾル耐性ピペットチップ、Optical 96ウェル反応プレート、光学カップ
・プロトコル:PCR は、ABI PRISMO 7700 配列検出システム又は 7300リアルタイムPCRシステムにおいて、製造者の指示に従って行う。 ある一般的なPCRプログラムを用いる。
PCR Mix調製:PCR Mixには、鋳型DNA以外のPCR反応のすべての要素が含まれる。この操作は、層流(Laminar Flow)に従って実行される。層流は、この種の操作にだけ用いられる。
表6: Q-PCRスクリーニングの反応混合物
DNA調製:鋳型DNAは、標準CTAB DNA抽出法を用いて抽出され、DNA濃度は、ピコグリーン蛍光決定によって測定される。
PCRセットアップ:PCRセットアップは、層流に従って実行される。鋳型DNAとPCRミックスは、異なる場所で組み合わされる。
PCRラン:PCRは、ユーザーマニュアルで説明されたように、製造者の指示に従って行われるだろう。
あらゆる一般的な食品/飼料マーカー、ライスマーカー(認可されていないライスイベントの検出) 及び CAMV リバーストランスクリプターゼマーカー(CaMV コントロールの不在)を. 含むセットアップについて、下記に説明する。
96プレートセットアップ
本実施例は、p35S 及び tNOS アンプリコンのマルチプレックスPCR増幅の例を示す。ここで、検出は、サイバーグリーンによってなされ、増幅産物は、その融点(Tm)の差異に基づいて、区別される。
p35S: SEQ ID NO: 60 及び 61
tNOS: SEQ ID NO: 9 及び10
鋳型 (50 ng):Roundup Ready Soybean (RRS) 100% (ダブルポジティブコントロール)
PCR プログラム: 95℃ 10’, (95℃ 15''、60℃ 1’) x 40 cycles
融解プログラム: 20’で50℃〜95℃
実施例4の実験と類似の実験により、さらに、以下の複合的組み合わせが実行可能であることが示された:
1. トウモロコシadh-1 (SEQ ID NO: 56 及び 57)と大豆SLTM (SEQ ID NO: 58及び 59)
2. トウモロコシadh-1 (SEQ ID NO: 56及び57)とアブラナクルシフェリン(SEQ ID NO: 24及び25)
3. 大豆SLTM (SEQ ID NO: 58 及び59) とコットンsah-7 (SEQ ID NO: 66 及び 67)
4. コットンsah-7 (SEQ ID NO: 66及び67)とアブラナクルシフェリン(SEQ ID NO: 24及び 25)
Claims (5)
- 試料中に、2種以上のイベント又はイベント材料が存在するか不在であるかを決定する方法であって、
各イベントが1以上の特性(trait)によって特徴づけられていて、
(1)前記試料中に、前記1以上の特性が存在するか不在であるかを検出する工程;及び
(2)前記1以上のイベントが、前記試料中に存在するか不在であるかを結論づける工程で、
(a)各特性に固有の素数値を割り当て、
(b)前記イベントの特性に割り当てられた素数値の積で、各イベントを表し、
(c)前記試料中に存在するとして検出された特性に割り当てられた素数値の積で、前記試料を表し、
(d)(c)において定義される試料を表す積を、(b)で定義されるイベントを表す積で割り算し、
・前記割り算により得られる値が1であるならば、前記イベント又はイベントの材料が前記試料中に存在する可能性があり、
・前記割り算により得られる値が1よりも大きい整数ならば、前記イベント又はイベント材料が前記試料中に存在する可能性があり、
・前記割り算により得られる値が整数でないときは、前記イベント又はイベントの材料は前記サンプルに存在しない
とする工程を含む方法。 - 前記イベントは、トランスジェニック植物イベントである請求項1に記載の方法。
- 前記工程(2)は、コンピュータ装置によって実行される請求項1又は2に記載の方法。
- 請求項1〜3のいずれかに記載の方法において、前記工程(2)を実行するようにプログラムされたコンピュータ装置。
- 請求項1〜3のいずれかに記載の方法において、前記工程(2)を実行するようにプログラム可能なコンピュータ装置への指示を含む記録媒体。
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