CN109929034B - Cp4-epsps单克隆抗体及其制备方法 - Google Patents
Cp4-epsps单克隆抗体及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种CP4‑EPSPS单克隆抗体，属于生物工程技术领域。它解决了现有CP4‑EPSPS单克隆抗体制备成本高等问题，一种CP4‑EPSPS单克隆抗体，包括重链和轻链，重链核苷酸序列如序列表中(1)所示，其能编码序列表中(2)所示的重链氨基酸序列；轻链核苷酸序列如序列表中(3)所示，其能编码序列表中(4)所示的轻链氨基酸序列。本发明具有低成本等优点。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种CP4-EPSPS单克隆抗体以及该CP4-EPSPS单克隆抗体的制备方法。
背景技术
草甘膦(N-phosphonomethyl glycine)是一种广谱灭生性除草剂，对多种一年生和多年生的单子叶或双子叶杂草及草本植物都有很好的控制作用，同时由于其生物活性高、单位面积用量低，在土壤环境中极易被降解且对环境无危害等特性，草甘膦成为世界上使用量最大、推广面积最大的一种除草剂。草甘膦虽然是用作除草剂的最佳选择，但由于其是一种非选择性除草剂，对杂草产生药害的同时，也会对农作物造成伤害，影响农作物的生长和产量。为此，通过转基因技术，将筛选鉴定出的对草甘膦具有抗性的CP4-EPSPS酶基因导入至植物基因组，形成抗草甘膦转基因作物成为研究主流。
抗草甘膦的转基因作物生产在带来田间管理便利和巨大经济效益的同时，也引发公众对转基因食品安全问题和环境问题的关注，诸如外界媒介造成的基因漂移问题严重影响生态环境安全。因此建立一套高效、严谨而又简便的抗草甘膦作物检测技术，对于抗草甘膦转基因作物检测、基因漂移监测，以至促进中国转基因作物商业化进展，维护消费者在转基因作物食品安全上的知情权具有现实意义。
目前，基于免疫层析技术平台的抗草甘膦基因快速检测技术，因操作简便、结果易于判定，已成为主流方向。该方法主要是通过制备得到抗草甘膦基因蛋白CP4-EPSPS单克隆抗体实现抗草甘膦转基因蛋白的特异性检测。常规CP4-EPSPS单克隆抗体制备是将CP4-EPSPS单克隆细胞株制备Balb/c小鼠腹水，使用Protein A亲和层析法纯化单克隆抗体。但由于单只小鼠腹水产量较少且个体差异大，得到的抗草甘膦基因蛋白CP4-EPSPS单克隆抗体批间差异大，同时为了保证产量还需大量使用小鼠，且因抗体批次差异问题使得检测准确性较差。为解决上述问题，目前另一种方法是通过CHO细胞表达制备抗体，这样既避免大量使用小鼠，又可以保证不同批次抗体之间差异性小，但抗体需求量有限，而细胞表达是持续性的过程，人为控制细胞表达抗体所需成本高，严重限制了单克隆抗体的制备。
发明内容
本发明的第一目的是针对现有技术中存在的上述问题，提供一种CP4-EPSPS单克隆抗体，本发明的第二个目的在于提供上述CP4-EPSPS单克隆抗体的制备方法。
本发明的第一个目的是通过下面的技术方案得以实现的：
一种CP4-EPSPS单克隆抗体，包括重链和轻链，其特征在于，
所述重链核苷酸序列如序列表中(1)所示，其能编码序列表中(2)所示的重链氨基酸序列。
所述轻链核苷酸序列如序列表中(3)所示，其能编码序列表中(4)所示的轻链氨基酸序列。
在上述的一种CP4-EPSPS单克隆抗体中，所述的CP4-EPSPS单克隆抗体通过中国仓鼠卵巢细胞表达，所述的中国仓鼠卵巢细胞含有重组真核表达载体pCMV-SPORT6-GAVPO-GH和重组真核表达载体pCMV-SPORT6-GAVPO-GL。
本发明的第二个目的是通过下面的技术方案得以实现的：
一种上述CP4-EPSPS单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
a、总RNA提取：采用TRIzol试剂提取CP4-EPSPS单克隆细胞中的总RNA；
b、逆转录合成cDNA：根据步骤a中提取的总RNA逆转录合成cDNA；
c、PCR扩增：以步骤b中所合成的cDNA为模板，设计编码单克隆抗体的重链基因的上游引物和下游引物，以及编码单克隆抗体的轻链基因的上游引物和下游引物；分别进行重链基因和轻链基因的扩增，
重链基因的扩增：将扩增缓冲液、dNTP溶液、cDNA、重链基因的上游引物和下游引物、DNA聚合酶和无菌去离子水混合，放入PCR仪中进行重链DNA扩增，得到PCR产物后进行DNA测序；
轻链基因的扩增：将扩增缓冲液、dNTP溶液、cDNA、轻链基因的上游引物和下游引物、DNA聚合酶和无菌去离子水混合，放入PCR仪中进行轻链DNA扩增，得到PCR产物后进行DNA测序；
d、构建表达载体pCMV-SPORT6-GAVPO：化学合成蓝光光控启动系统GAVPO核苷酸序列，在真核表达载体pCMV-SPORT6的多克隆位点ApaI和XbaI之间定向插入GAVPO核苷酸序列，构建得到重组真核表达载体pCMV-SPORT6-GAVPO；
e、构建表达载体pCMV-SPORT6-GAVPO-GH和pCMV-SPORT6-GAVPO-GL：
化学合成GH核苷酸序列，在步骤d中的重组真核表达载体pCMV-SPORT6-GAVPO的多克隆位点NotI和SalI之间定向插入含GH核苷酸序列的片段，构建得到重组真核表达载体pCMV-SPORT6-GAVPO-GH；
化学合成GL核苷酸序列，在步骤d中的重组真核表达载体pCMV-SPORT6-GAVPO的多克隆位点NotI和SalI之间定向插入含GL核苷酸序列的片段，构建得到重组真核表达载体pCMV-SPORT6-GAVPO-GL；
f、构建表达CP4-EPSPS单克隆抗体的细胞株：将步骤e中的重组真核表达载体pCMV-SPORT6-GAVPO-GH和重组真核表达载体pCMV-SPORT6-GAVPO-GL转入到中国仓鼠卵巢细胞中，筛选得到表达CP4-EPSPS单克隆抗体的细胞株；
g、CP4-EPSPS单克隆抗体表达及纯化：将步骤f中的表达CP4-EPSPS单克隆抗体的细胞株进行培养，培养后亲和层析纯化得到CP4-EPSPS单克隆抗体。
在上述一种制备方法中，步骤c中，
编码单克隆抗体的重链基因的上游引物为CAGGTTCAGCTGCAGCAATCTGGAC；
编码单克隆抗体的重链基因的下游引物为TCATTTACCAGGAGAGTGGGAGA；
编码单克隆抗体的轻链基因的上游引物为GACTACAAAGATGTTGTGATG；
编码单克隆抗体的轻链基因的下游引物为CTAACACTCATTCCTGTTGAAG。
在上述一种制备方法中，步骤e中，所述的GH核苷酸序列包括Gal(UASG)序列和编码单克隆抗体的重链基因；所述的GL核苷酸序列包括Gal(UASG)序列和编码单克隆抗体的轻链基因。
在上述一种制备方法中，步骤e中，所述的GH核苷酸序列如序列表中(5)所示，所述的GL核苷酸序列如序列表中(6)所示。
在上述一种制备方法中，步骤f中，
所述重组真核表达载体pCMV-SPORT6-GAVPO-GH和重组真核表达载体pCMV-SPORT6-GAVPO-GL等量混匀，通过电穿孔方法转入到中国仓鼠卵巢细胞中。
在上述一种制备方法中，步骤g中，通过蓝光控制所述表达CP4-EPSPS单克隆抗体的细胞株分泌产生CP4-EPSPS单克隆抗体。
一种采用上述CP4-EPSPS单克隆抗体制备的试纸条，所述的试纸条采用如下方法制备：
S01：取胶体金溶液加入碳酸钾溶液中，混匀后加入CP4-EPSPS单克隆抗体，添加牛血清白蛋白，封闭处理后，离心并弃去上清，沉淀用复溶液溶解并喷涂于玻璃纤维，再将喷涂后的玻璃纤维置于恒温培养箱中静置。
S02：将CP4-EPSPS抗原用包被液稀释后，将稀释后的溶液包被于硝酸纤维素膜，此为T线。将羊抗鼠包被于硝酸纤维素膜，此为C线。划膜包被结束后，将硝酸纤维素膜置于恒温培养箱中静置。
将样品垫、玻璃纤维、硝酸纤维素膜、滤纸在PVC垫板上依次组装后切成长条，装上试剂卡条壳并压紧。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1.本发明的CP4-EPSPS单克隆抗体是通过向中国仓鼠卵巢细胞中导入重组真核表达载体pCMV-SPORT6-GAVPO-GH和重组真核表达载体pCMV-SPORT6-GAVPO-GL来表达并制得，抛弃了传统小鼠腹水制备抗体的方法，避免使用实验小鼠，降低了抗体批间差异，保证检测指标统一性；
2.本发明加入蓝光控制基因表达系统，合成了蓝光光控启动系统GAVPO核苷酸序列，重组得到真核表达载体pCMV-SPORT6-GAVPO-GH和真核表达载体pCMV-SPORT6-GAVPO-GL，将其导入中国仓鼠卵巢细胞后，可以通过蓝光来控制抗体表达的时间，加强了抗体生产过程可控性，保证抗体质量，节约成本；
3.本发明选用蓝光作为诱导剂，无毒且容易获得，避免了小分子诱导剂不可控因素，精确基因表达时间；
4、本发明的CP4-EPSPS单克隆抗体制备的试纸条能对草甘膦转基因蛋白进行特异性检测，且试纸条检测不需要使用大型仪器，操作简便、结果易于判定。
5.本发明通过蓝光控制CHO细胞表达CP4-EPSPS单克隆抗体，可避免现有技术的不足，达到抗体批间差异小，检测准确性高，生产可控，成本低等目的。
附图说明
图1是CP4-EPSPS抗体重链基因PCR扩增产物检测的电泳图，
其中，A:CP4-EPSPS抗体重链基因目的片段，
M:DL2000 DNA Marker；
图2是CP4-EPSPS抗体轻链基因PCR扩增产物检测的电泳图，
其中，B:CP4-EPSPS抗体轻链基因目的片段，
M:DL2000 DNA Marker。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
实施例1 CP4-EPSPS单克隆抗体的制备
a、总RNA提取
CP4-EPSPS单克隆细胞：来源于杭州贤至生物科技有限公司。
制备方法：取2mL细胞悬液，离心去上清，收集处于对数生长期的CP4-EPSPS单克隆细胞，往细胞沉淀中加入TRIzol试剂1mL，静置5min。加入氯仿200μL，剧烈摇晃15s，室温静置3min后，再12000r/min离心15min。移取上层水样层至新的离心管，加入0.5mL异丙醇，室温静置10min。再12000r/min离心10min。弃上清，加入1mL75％乙醇，再7500r/min离心5min，干燥沉淀，加入50μL RNase-free ddH2O。用紫外分光光度计测定其纯度并定量，OD260/OD280为1.86，纯度较高，浓度为400ng/ul，保存于－70℃备用。
TRIzol试剂是一种新型总RNA抽提试剂，可以直接从细胞或组织中提取总RNA。其含有苯酚、异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶。TRIzol的主要成分是苯酚。TRIzol在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性，因此对纯化RNA及标准化RNA的生产十分有用。
b、逆转录合成cDNA
逆转录合成cDNA反应体系为：步骤a中提取出来的总RNA 500纳克、oligo(dT)Primer 1μL、dNTP Mixture 1μL，用RNase-free ddH2O补足体积至10μL，65℃保温5min后，冰上急冷。然后在上述10μL反应液中加入5×Prime Script Buffer 4μL、Prime Script RTEnzyme Mix I 1μL，用无RNase d H2O(无RNA酶的水)补足体积至20μL，缓慢混匀，42℃反应60min后置于95℃反应3min，冰上冷却，最后得到cDNA。(5×Prime Script Buffer表示五倍于工作浓度的母液)
(oligo(dT)Primer、Prime Script RT Enzyme Mix、Prime Script Buffer均为TAKARA公司的产品)
c、PCR扩增：设计编码CP4-EPSPS单克隆抗体的重链基因的上游引物和下游引物，以及编码单克隆抗体的轻链基因的上游引物和下游引物，以步骤b中所合成的cDNA为模板，进行PCR扩增，反应体系如下:
重链扩增：10×Ex Taq Buffer 5μL、dNTP 4μL、cDNA 1μL、重链基因的上游引物和下游引物各1μL、TaKaRa Ex Taq DNA聚合酶0.5μL，用无菌去离子水补足体积至50μL。瞬时离心混匀，放入PCR仪，按以下反应条件进行PCR反应:94℃预变性5min，94℃解链45s，63℃退火45s，72℃延伸1min，30个循环后，再72℃延伸10min。反应完毕后，取10ul PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定(图见说明书附图1)。10ulPCR产物送至南京金斯瑞生物科技有限公司进行DNA测序。
轻链扩增：10×Ex Taq Buffer 5μL、dNTP 4μL、cDNA 1μL、轻链基因的上游引物和下游引物各1μL、TaKaRa Ex Taq DNA聚合酶0.5μL，用无菌去离子水补足体积至50μL。瞬时离心混匀，放入PCR仪，按以下反应条件进行PCR反应:94℃预变性5min，94℃解链45s，63℃退火45s，72℃延伸1min，30个循环后，再72℃延伸10min。反应完毕后，取10ul PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定(图见说明书附图2)。10ulPCR产物送至南京金斯瑞生物科技有限公司进行DNA测序。(10×Ex Taq Buffer表示10倍于工作浓度的母液)
(10×Ex Taq Buffer、dNTP、TaKaRa Ex Taq均购自TaKaRa公司)
经设计的：
编码单克隆抗体的重链基因的上游引物为CAGGTTCAGCTGCAGCAATCTGGAC；
编码单克隆抗体的重链基因的下游引物为TCATTTACCAGGAGAGTGGGAGA；
编码单克隆抗体的轻链基因的上游引物为GACTACAAAGATGTTGTGATG；
编码单克隆抗体的轻链基因的下游引物为CTAACACTCATTCCTGTTGAAG。
d、构建表达载体pCMV-SPORT6-GAVPO：化学合成蓝光光控启动系统GAVPO核苷酸序列，在真核表达载体pCMV-SPORT6的多克隆位点ApaI和XbaI之间定向插入GAVPO核苷酸序列，构建得到重组真核表达载体pCMV-SPORT6-GAVPO；
Gal4(65)为DNA识别元件，可以与Gal(UASG)结合，VVD是最小的光-氧-电压(LOV)域蛋白质，在蓝光活化下，Gal4(65)-VVD融合蛋白形成快速交换二聚体结构。在Gal4(65)-VVD的C端连接反式作用因子得到蓝光光控启动系统GAVPO核苷酸片段。
化学合成蓝光光控启动系统GAVPO核苷酸序列片段，用ApaI和XbaI酶切后连接至载体pCMV-SPORT6上，得到重组真核表达载体pCMV-SPORT6-GAVPO。
e、构建表达载体pCMV-SPORT6-GAVPO-GH和pCMV-SPORT6-GAVPO-GL：
化学合成GH核苷酸序列，GH核苷酸序列包括Gal(UASG)序列和编码单克隆抗体的重链基因，在步骤d中的重组真核表达载体pCMV-SPORT6-GAVPO的多克隆位点NotI和SalI之间定向插入GH核苷酸序列片段，构建得到重组真核表达载体pCMV-SPORT6-GAVPO-GH；
化学合成GL核苷酸序列，GL核苷酸序列包括Gal(UASG)序列和编码单克隆抗体的轻链基因，在步骤d中的重组真核表达载体pCMV-SPORT6-GAVPO的多克隆位点NotI和SalI之间定向插入含GL核苷酸序列的片段，构建得到重组真核表达载体pCMV-SPORT6-GAVPO-GL；
f、构建表达CP4-EPSPS单克隆抗体的细胞株：取处于对数生长期中国仓鼠卵巢细胞培养液2ml，其中细胞密度为5*106个/ml,1000rpm离心3分钟，去上清，细胞沉淀用电解液200ul重悬，向重悬液加入重组真核表达载体pCMV-SPORT6-GAVPO-GH和pCMV-SPORT6-GAVPO-GL各10ug，混匀并转移至电击管，放入celetrix电转仪(台州赛瑞崔克生物技术有限公司)，设置参数0.1s单脉冲，500V电击，将电击得到的样品与25ml CD Forti CHO培养基(购自Gibco公司)混合，放置在37℃，5％CO2无菌培养箱中培养。
g、CP4-EPSPS单克隆抗体表达及纯化：细胞扩大培养5天，给予15W蓝光照射24h，大量培养，将培养液在12000rpm的转速下离心5min，收集培养后的上清，并将上清用0.45um的微孔滤膜过滤，上样至琼脂糖亲和介质Protein A层析柱(南京金斯瑞生物科技有限公司)后，用50ml平衡缓冲液PBS(pH＝7.4)洗涤至吸光度为0，接着用0.1M甘氨酸-盐酸缓冲液(pH＝3.0)洗脱，收集流出液并加入500mM Tris-HCl(pH＝8.5)缓冲液中和至pH＝7.0左右，得到的即为单克隆抗体。
实施例2：胶体金免疫层析试纸条的制备
S01：取10ml 0.01％胶体金溶液加入0.2mol/L碳酸钾溶液20uL，充分混匀后加入100ug CP4-EPSPS单克隆抗体，室温反应2h后添加10％牛血清白蛋白(BSA)1ml，封闭处理2h后，离心(7500rpm/min、20分钟)，弃去上清后沉淀用1ml复溶液充分溶解，采用喷金划膜仪(上海金标生物科技有限公司)按照10ul/cm将其均匀喷涂于玻璃纤维(宽度6mm)，再置于电热恒温培养箱中(上海一恒科学仪器有限公司)37℃静置30分钟。
相关溶液配方如下:
0.01％胶体金溶液：1％氯金酸溶液1ml，1％柠檬酸溶液1.4ml，加超纯水加热溶解反应并定容至100ml。
1％氯金酸溶液：1gAuCL3.HCl.4H2O粉末加超纯水溶解并定容至100ml。
1％柠檬酸溶液：1g柠檬酸晶体加超纯水溶解并定容至100ml。
复溶液：Tris碱6.057g溶解于800ml双蒸水，用适量HCL调节pH至8.0，加双蒸水定容到1000ml。
S02：CP4-EPSPS抗原经包被液稀释后(终浓度为1mg/ml)，通过喷金划膜仪(上海金标生物科技有限公司)按照1ul/cm将其均匀包被于硝酸纤维素膜(Sartorius)，此为T线。通过喷金划膜仪(上海金标生物科技有限公司)将羊抗鼠(终浓度为1mg/ml)按照1ul/cm均匀包被于硝酸纤维素膜，此为C线。划膜包被结束后，将硝酸纤维素膜置于电热恒温培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)37℃静置30分钟。
按照常规工艺将样品垫、玻璃纤维、硝酸纤维素膜、滤纸在PVC垫板上依次组装后切成宽4mm长条，装上试剂卡条壳并压紧。相关溶液配方如下：
包被液：Na2HPO4·7H2O 43.42g,NaH2PO4·H2O 5.244g,加双蒸水定容至1000mL(pH7.4)。
序列表
<110>杭州贤至生物科技有限公司
<120>CP4-EPSPS单克隆抗体及其制备方法
<160> 6
<210> 1
<211>1326
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>CP4-EPSPS单克隆抗体的重链基因核苷酸序列
<400> 1
caggttcagctgcagcaatctggacctgacctggtgaagcctggggcttcagtgaagata60
ccctgcaaggcttctggttactcattcactggctactacatgcactgggtgaagcagagc120
catggaaagagccttgagtggattggacgtgttattcctaacaatggtggtactagttat180
catcagaagttcaagggcaaggccatattaactgtagacaagtcatccagcacagcctac240
atggaactccgcagcctgacatctgaggactctgcggtctgttactgtgcaagagatgat300
tacgcctggtttgcttactggggccaagggactctagtcaccgtctcctcggctaaaacg360
acacccccatctgtctatccactggcccctggatctgctgcccaaactaactccatggtg420
accctgggatgcctggtcaagggctatttccctgagccagtgacagtgacctggaactct480
ggatccctgtccagcggtgtgcacaccttcccagctgtcctgcagtctgacctctacact540
ctgagcagctcagtgactgtcccctccagcacctggcccagcgagaccgtcacctgcaac600
gttgcccacccggccagcagcaccaaggtggacaagaaaattgtgcccagggattgtggt660
tgtaagccttgcatatgtacagtcccagaagtatcatctgtcttcatcttccccccaaag720
cccaaggatgtgctcaccattactctgactcctaaggtcacgtgtgttgtggtagacatc780
agcaaggatgatcccgaggtccagttcagctggtttgtagatgatgtggaggtgcacaca840
gctcagacgcaaccccgggaggagcagttcaacagcactttccgctcagtcagtgaactt900
cccatcatgcaccaggactggctcaatggcaaggagttcaaatgcagggtcaacagtgca960
gctttccctgcccccatcgagaaaaccatctccaaaaccaaaggcagaccgaaggctccg1020
caggtgtacaccattccacctcccaaggagcagatggccaaggataaagtcagtctgacc1080
tgcatgataacagacttcttccctgaagacattactgtggagtggcagtggaatgggcag1140
ccagcggagaactacaagaacactcagcccatcatggacacagatggctcttacttcgtc1200
tacagcaagctcaatgtgcagaagagcaactgggaggcaggaaatactttcacctgctct1260
gtgttacatgagggcctgcacaaccaccatactgagaagagcctctcccactctcctggt1320
aaatga 1326
<210>2
<211>441
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>CP4-EPSPS单克隆抗体的重链基因氨基酸序列
<400>2
Gln Val GlnLeuGlnGlnSerGly Pro Asp Leu Val Lys Pro Gly
5 10 15
Ala Ser Val Lys Ile Pro Cys Lys AlaSerGly Tyr SerPheThr
20 25 30
Gly Tyr TyrMet His Trp Val Lys GlnSer His Gly Lys SerLeu
35 40 45
GluTrp Ile GlyArg Val Ile Pro AsnAsnGlyGlyThrSer Tyr
50 55 60
His Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Ile LeuThr Val Asp Lys Ser
65 70 75
SerSerThrAla Tyr MetGluLeuArgSerLeuThr Ser Glu Asp
80 85 90
SerAla Val Cys Tyr CysAlaArg Asp Asp Tyr AlaTrpPheAla
95 100 105
Tyr TrpGlyGlnGlyThrLeu Val Thr Val SerSerAla Lys Thr
110 115 120
Thr Pro ProSer Val Tyr Pro LeuAla Pro GlySerAlaAlaGln
125 130 135
ThrAsnSerMet Val ThrLeuGlyCysLeu Val Lys Gly Tyr Phe
140 145 150
Pro Glu Pro Val Thr Val ThrTrpAsnSerGlySerLeuSerSer
155 160 165
Gly Val His ThrPhe Pro Ala Val LeuGlnSer Asp Leu Tyr Thr
170 175 180
LeuSerSerSer Val Thr Val Pro SerSerThrTrp Pro Ser Glu
185 190 195
Thr Val ThrCysAsn Val Ala His Pro AlaSerSerThr Lys Val
200 205 210
Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp CysGlyCys Lys Pro Cys Ile
215 220 225
CysThr Val Pro Glu Val SerSer Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys
230 235 240
Pro Lys Asp Val LeuThr Ile ThrLeuThr Pro Lys Val ThrCys
245 250 255
Val ValVal Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val GlnPheSer
260 265 270
TrpPhe Val Asp Asp Val Glu Val His ThrAlaGlnThrGln Pro
275 280 285
ArgGluGluGlnPheAsnSerThrPheArgSer Val Ser Glu Leu
290 295 300
Pro Ile Met His Gln Asp TrpLeuAsnGly Lys GluPhe Lys Cys
305 310 315
Arg Val AsnSerAlaAlaPhe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
320 325 330
Ser Lys Thr Lys GlyArg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile
335 340 345
Pro ProPro Lys GluGlnMetAla Lys Asp Lys Val SerLeuThr
350 355 360
CysMet Ile Thr Asp PhePhe Pro Glu Asp Ile Thr Val GluTrp
365 370 375
GlnTrpAsnGlyGln Pro AlaGluAsn Tyr Lys AsnThrGln Pro
380 385 390
Ile Met Asp Thr Asp GlySer Tyr Phe Val Tyr Ser Lys LeuAsn
395 400 405
Val Gln Lys SerAsnTrpGluAlaGlyAsnThrPheThrCysSer
410 415 420
Val Leu His GluGlyLeu His Asn His HisThrGlu Lys Ser Leu
425 430 435
Ser His Ser Pro Gly Lys ***
440
<210>3
<211>669
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>CP4-EPSPS单克隆抗体的轻链基因核苷酸序列
<400>3
gactacaaagatgttgtgatgacccaacctccactctccctgcctgtcagtcttggagat 60
caagcctccatctcttgcagatctagtcagagcattgtacatagtaatggaaacacctat 120
ttagaatggtacctgcagaaaccaggccagtctccaagactcctgatctacaaagtttcc 180
aaccgattttctggggtcccagacaggttcagtggcagtggatcagggacagatttcaca 240
ctcaagatcagcagagtggaggctgaggatctgggagtttattactgctttcaaggttca 300
cttgttcctcccacgttcggtgctgggaccaagctggaaatcaaacgtgcagatgctgca 360
ccaactgtatccatcttcccaccatccagtgagcagttaacatctggaggtgcctcagtc 420
gtgtgcttcttgaacaacttctaccccaaagacatcaatgtcaagtggaagattgatggc 480
agtgaacgacaaaatggcgtcctgaacagttggactgatcaggacagcaaagacagcacc 540
tacagcatgagcagcaccctcacgttgaccaaggacgagtatgaacgacataacagctat 600
acctgtgaggccactcacaagacatcaacttcacccattgtcaagagcttcaacaggaat 660
gagtgttag 669
<210>4
<211>222
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>CP4-EPSPS单克隆抗体的轻链基因氨基酸序列
<400>4
Asp Tyr Lys Asp Val Val MetThrGln Pro ProLeuSerLeu Pro
5 10 15
Val SerLeuGly Asp GlnAlaSer Ile SerCysArgSerSerGln
20 25 30
Ser Ile Val His SerAsnGlyAsnThr Tyr LeuGluTrp Tyr Leu
35 40 45
Gln Lys Pro GlyGlnSer Pro ArgLeuLeu Ile Tyr Lys Val Ser
50 55 60
AsnArgPheSerGly Val Pro Asp ArgPheSerGlySerGlySer
65 70 75
GlyThr Asp PheThrLeu Lys Ile SerArg Val GluAla Glu Asp
80 85 90
LeuGly Val Tyr TyrCysPheGlnGly Ser Leu Val Pro ProThr
95 100 105
PheGlyAlaGlyThr Lys LeuGlu Ile Lys ArgAla Asp AlaAla
110 115 120
Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro ProSerSerGluGlnLeuThrSer
125 130 135
GlyGlyAlaSer Val ValCysPheLeuAsnAsnPhe Tyr Pro Lys
140 145 150
Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp GlySerGluArgGlnAsn
155 160 165
Gly Val LeuAsnSerTrpThr Asp Gln Asp Ser Lys Asp SerThr
170 175 180
Tyr Ser Met SerSerThrLeuThrLeuThr Lys Asp Glu Tyr Glu
185 190 195
Arg His AsnSer Tyr ThrCysGluAlaThr His Lys ThrSerThr
200 205 210
Ser Pro Ile Val Lys SerPheAsnArgAsnGluCys ***
215 220
<210>5
<211>1446
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>包含与DNA识别元件快速结合并激活转录的Gal（UASG）序列和CP4-EPSPS抗体重链基因序列
<400>5
gagtttctagacggagtactgtcctccgagcggagtactgtcctccgactcgagcggagt 60
actgtcctccgatcggagtactgtcctccgcgaattccggagtactgtcctccgaagacg 120
caggttcagctgcagcaatctggacctgacctggtgaagcctggggcttcagtgaagata 180
ccctgcaaggcttctggttactcattcactggctactacatgcactgggtgaagcagagc 240
catggaaagagccttgagtggattggacgtgttattcctaacaatggtggtactagttat 300
catcagaagttcaagggcaaggccatattaactgtagacaagtcatccagcacagcctac 360
atggaactccgcagcctgacatctgaggactctgcggtctgttactgtgcaagagatgat 420
tacgcctggtttgcttactggggccaagggactctagtcaccgtctcctcggctaaaacg 480
acacccccatctgtctatccactggcccctggatctgctgcccaaactaactccatggtg 540
accctgggatgcctggtcaagggctatttccctgagccagtgacagtgacctggaactct 600
ggatccctgtccagcggtgtgcacaccttcccagctgtcctgcagtctgacctctacact 660
ctgagcagctcagtgactgtcccctccagcacctggcccagcgagaccgtcacctgcaac 720
gttgcccacccggccagcagcaccaaggtggacaagaaaattgtgcccagggattgtggt 780
tgtaagccttgcatatgtacagtcccagaagtatcatctgtcttcatcttccccccaaag 840
cccaaggatgtgctcaccattactctgactcctaaggtcacgtgtgttgtggtagacatc 900
agcaaggatgatcccgaggtccagttcagctggtttgtagatgatgtggaggtgcacaca 960
gctcagacgcaaccccgggaggagcagttcaacagcactttccgctcagtcagtgaactt 1020
cccatcatgcaccaggactggctcaatggcaaggagttcaaatgcagggtcaacagtgca 1080
gctttccctgcccccatcgagaaaaccatctccaaaaccaaaggcagaccgaaggctccg 1140
caggtgtacaccattccacctcccaaggagcagatggccaaggataaagtcagtctgacc 1200
tgcatgataacagacttcttccctgaagacattactgtggagtggcagtggaatgggcag 1260
ccagcggagaactacaagaacactcagcccatcatggacacagatggctcttacttcgtc 1320
tacagcaagctcaatgtgcagaagagcaactgggaggcaggaaatactttcacctgctct 1380
gtgttacatgagggcctgcacaaccaccatactgagaagagcctctcccactctcctggt 1440
aaatga 1446
<210>6
<211>789
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>包含与DNA识别元件快速结合并激活转录的Gal（UASG）序列和CP4-EPSPS抗体轻链基因序列
<400>6
gagtttctagacggagtactgtcctccgagcggagtactgtcctccgactcgagcggagt 60
actgtcctccgatcggagtactgtcctccgcgaattccggagtactgtcctccgaagacg 120
gactacaaagatgttgtgatgacccaacctccactctccctgcctgtcagtcttggagat 180
caagcctccatctcttgcagatctagtcagagcattgtacatagtaatggaaacacctat 240
ttagaatggtacctgcagaaaccaggccagtctccaagactcctgatctacaaagtttcc 300
aaccgattttctggggtcccagacaggttcagtggcagtggatcagggacagatttcaca 360
ctcaagatcagcagagtggaggctgaggatctgggagtttattactgctttcaaggttca 420
cttgttcctcccacgttcggtgctgggaccaagctggaaatcaaacgtgcagatgctgca 480
ccaactgtatccatcttcccaccatccagtgagcagttaacatctggaggtgcctcagtc 540
gtgtgcttcttgaacaacttctaccccaaagacatcaatgtcaagtggaagattgatggc 600
agtgaacgacaaaatggcgtcctgaacagttggactgatcaggacagcaaagacagcacc 660
tacagcatgagcagcaccctcacgttgaccaaggacgagtatgaacgacataacagctat 720
acctgtgaggccactcacaagacatcaacttcacccattgtcaagagcttcaacaggaat 780
gagtgttag 789
Claims (2)
1.一种CP4-EPSPS单克隆抗体，包括重链和轻链，其特征在于，
所述重链核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其能编码的重链氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述轻链核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，其能编码的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
2.根据权利要求1所述的一种CP4-EPSPS单克隆抗体，其特征在于，所述的CP4-EPSPS单克隆抗体通过中国仓鼠卵巢细胞表达，所述的中国仓鼠卵巢细胞含有重组真核表达载体pCMV-SPORT6-GAVPO-GH和重组真核表达载体pCMV-SPORT6-GAVPO-GL。
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|---|---|---|---|
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| CN105717295B (zh) * | 2016-01-15 | 2018-05-29 | 北京市农林科学院 | 一种快速检测转cp4-epsps基因植物及其衍生品的试纸条 |
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-
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