CN105717295B - 一种快速检测转cp4-epsps基因植物及其衍生品的试纸条 - Google Patents

一种快速检测转cp4-epsps基因植物及其衍生品的试纸条 Download PDF

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Abstract

本发明公开了属于免疫学和食品安全检测领域的一种快速检测转CP4‑EPSPS基因植物及其衍生品的试纸条。所述试纸条包括：PVC底板、样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水滤纸。本发明采用的CP4‑EPSPS蛋白单克隆抗体C1108和C1130分别由杂交瘤细胞C1108和C1130分泌，其保藏编号分别为CGMCC No.11292与CGMCC No.11293。本发明的试纸条以胶体金标记的高亲和力的单克隆抗体为基础制备而成，检测的特异性强，灵敏度高，在5‑10分钟内即可判定检测结果；同时所述试纸条的适用范围广，可满足不同层次人员需要，具有广阔的市场前景和明显的经济、社会效益。

Description

一种快速检测转CP4-EPSPS基因植物及其衍生品的试纸条
技术领域
本发明属于免疫学和食品安全检测领域，具体涉及一种快速检测转CP4-EPSPS基因植物及其衍生品的试纸条。
背景技术
杂草危害是各类粮食作物减产的最主要原因之一。草甘膦是一种广谱灭生性、内吸传导型、易被微生物分解、土壤中无残毒的除草剂，是目前世界上用量最大的除草剂，利用基因工程将抗草甘膦CP4-EPSPs基因转入作物体内培育出抗草甘膦作物新品种，从而直接在田间使用草甘膦来控制杂草是解决问题的根本之道。
由于抗除草剂标记在商业化转基因植物应用广泛，而在转基因植物研制开发或对转基因产品进行筛选或安全性评价时，往往需要对转入的外源基因进行定性或半定量测定。
随着转CP4-EPSPs基因的农作物及相关产品的快速发展，配套的快速检测技术是转基因研发及生产和食品安全性评价的重要技术平台，其研究具有重要的意义。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供了一种快速检测转CP4-EPSPS基因植物及其衍生品的试纸条。
为了实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
一种快速检测转CP4-EPSPS基因植物及其衍生品的试纸条，所述试纸条包括：PVC底板、样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水滤纸；硝酸纤维素膜黏贴在PVC底板的中部，且硝酸纤维素膜上包被有相互分离的一条测试线和一条控制线；PVC底板一端黏贴样品垫和胶体金垫，另一端黏贴吸水滤纸；其中，胶体金垫位于硝酸纤维素膜靠近测试线的一端，压硝酸纤维素膜1-1.5mm，吸水滤纸位于硝酸纤维素膜靠近控制线的一端，压硝酸纤维素膜2-2.5mm；样品垫贴于胶体金垫的上方，露出胶体金垫2-3mm；所述的胶体金垫上包含胶体金标记的CP4-EPSPS蛋白单克隆抗体C1108。
所述的测试线为包被在硝酸纤维素膜上的CP4-EPSPS蛋白单克隆抗体C1130。
所述的控制线为包被在硝酸纤维素膜上的羊抗鼠IgG抗体。
所述的样品垫由1层吸水玻璃纤维和1层无纺布组成。
所述的CP4-EPSPS蛋白单克隆抗体C1108由保藏号为CGMCC No.11292的杂交瘤细胞株分泌。
所述的CP4-EPSPS蛋白单克隆抗体C1130由保藏号为CGMCC No.11293的杂交瘤细胞株分泌。
所述试纸条在检测转CP4-EPSPS基因植物中的应用。
所述试纸条在检测转CP4-EPSPS基因食品中的应用。
一种转基因检测试剂盒，所述转基因检测试剂盒包含上述的试纸条。
所述的转基因为转CP4-EPSPS基因。
本发明的有益效果为：所述纸条以胶体金标记高亲和力的单克隆抗体为基础制备而成，检测的特异性强，灵敏度高；使用所述试纸条检测时无需其他任何试剂和仪器，试纸条加入被测样品液后，在5-10分钟内即可判定检测结果；检测结果形象、直观，当硝酸纤维素膜上显示一条红色线控制线时，表示在被测样品中不含有被检物；显示两条红色的测试线和控制线时，表示在被检样品中含有被检物；同时所述试纸条的适用范围广，可满足不同层次人员需要，具有广阔的市场前景和明显的经济、社会效益。
生物材料保藏说明
杂交瘤细胞株C1108、C1130保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏中心登记入册编号分别为CGMCC No.11292与CGMCC No.11293，分类命名均为CP4-EPSPS单抗细胞株，保藏日期为：2015.10.23。中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101。
附图说明
图1为一种快速检测转CP4-EPSPS基因植物及其衍生品的纸条结构示意图。
图2为所述试纸条对阳性样品及阴性样品的检测结果示意图。
具体实施方式
实施例1：鼠抗CP4-EPSPS蛋白单克隆抗体C1108和C1130的制备。
用50μg纯化的CP4-EPSPS蛋白为免疫原，皮下多点注射BALB/C小白鼠，添加福氏完全佐剂；21天后进行第二次相同剂量的免疫，添加福氏不完全佐剂，腹腔注射；14天后进行第三次相同剂量的免疫，添加福氏不完全佐剂，腹腔注射；7天后进行ELISA效价检测，血清效价达1:243000；7天后进行细胞融合前加强免疫，用相同剂量的纯蛋白不加佐剂，脾脏注射；3天后取免疫后的BALB/C小白鼠的脾细胞进行融合。
将免疫后的BALB/C小白鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)按5∶1的比例，在无血清RPMI-1640培养基中混匀，1400rpm离心5min，去除培养基，相同方法洗涤细胞三次；用50％的PEG3350作为融合剂，在37℃下，1min内缓慢加入1ml，搅拌1.5min，用14ml无血清RPMI-1640培养基终止融合后，4min缓慢滴加完成；800rpm离心5min，沉淀用HAT培养基悬浮，分装到96孔含有饲养细胞与HAT培养基的细胞板中，于37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养。培养6天后，用HAT培养基全量换液一次，次日用常规间接ELISA方法筛选阳性孔，筛选得到的阳性孔用HT培养基全量换液一次，次日用常规间接ELISA方法进行复测，筛选阳性孔。
筛选出的特异性强的阳性孔用常规的有限稀释法克隆，共进行三次克隆，获得单抗杂交瘤细胞株C1108、C1130。两株杂交瘤细胞进一步扩大培养，用于制备单抗腹水和液氮冻存。
取体重22g左右BALB/C小鼠，腹腔注射0.5ml液体石蜡，7-10天后腹腔注入5×105个单抗杂交瘤细胞，注射后7-10天可见小鼠腹部明显膨大，采取腹水，10000rpm离心10min，收集上清液，即为单克隆抗体腹水。采用ProteinA亲和层析法纯化鼠抗CP4-EPSPS蛋白单克隆抗体C1108和C1130，-20℃保存。
实施例2：CP4-EPSPS蛋白单克隆抗体C1108和C1130的效价、亚型和亲和常数的鉴测。
1、CP4-EPSPS蛋白单克隆抗体C1108和C1130效价的测定。
(1)包被：将分离纯化的CP4-EPSPS蛋白用包被缓冲液进行稀释，加入酶标板中(100ul/孔)，CP4-EPSPS蛋白的包被浓度为1ug/ml；4℃孵育过夜，然后用洗涤缓冲液冲洗酶标板，共洗涤3次，拍干备用。
向1g非转基因玉米粉加入10ml包被缓冲液，漩涡震荡溶解，得到阴性对照液，将阴性对照加入酶标板中(100ul/孔)，即为阴性对照孔；4℃孵育过夜，然后用洗涤缓冲液冲洗酶标板，拍干备用。
(2)封闭：每孔加入130ul含5％脱脂奶粉的磷酸缓冲液，37℃孵育1h，然后用洗涤缓冲液冲洗酶标板。
(3)加样：每孔加入100ul单克隆抗体C1108或C1130，初始浓度为1mg/ml，37℃孵育0.5h，然后用洗涤缓冲液冲洗酶标板。
(4)加二抗：每孔加入100ul酶标二抗工作液，37℃孵育0.5h，然后用洗涤缓冲液冲洗酶标板。
(5)显色：每孔加入100ul底物溶液，室温避光孵育10min后，每空加入50ul终止液终止反应，用酶标仪测定450nm波长下的吸收值。
将吸收值为阴性对照孔两倍以上的孔判断为阳性孔，CP4-EPSPS蛋白单克隆抗体C1108和C1130的效价见表1。
2、CP4-EPSPS蛋白单克隆抗体C1108和C1130亚型的鉴定。
采用间接ELISA法鉴定抗体亚型，操作方法与效价检测相同，酶标二抗采用亚型鉴定抗体，CP4-EPSPS蛋白单克隆抗体C1108和C1130的亚型见表1。
3、CP4-EPSPS蛋白单克隆抗体C1108和C1130亲和常数的鉴定。
(1)包被：将分离纯化的CP4-EPSPS蛋白用包被缓冲液进行稀释，加入酶标板中，蛋白浓度分别为1000ng/ml、500ng/ml、250ng/ml、125ng/ml；每个浓度包被12个孔，100ul/孔，4℃过夜，然后用洗涤缓冲液冲洗酶标板。
(2)封闭：每孔加入130ul含5％脱脂奶粉的磷酸缓冲液，37℃孵育1h，然后用洗涤缓冲液冲洗酶标板。
(3)加样：将检测抗体用样品稀释液调节初始浓度至81ug/ml，横向倍比稀释1:1-1:59049，加至不同包被量的反应孔中，最后一孔做阴性对照，37℃孵育0.5h，然后用洗涤缓冲液冲洗酶标板。
(4)加二抗：每孔加入100ul酶标二抗工作液，37℃孵育0.5h，然后用洗涤缓冲液冲洗酶标板。
(5)显色：每孔加入100ul底物溶液，室温避光孵育10min后，每空加入50ul终止液终止反应，用酶标仪测定450nm波长下的吸收值。
结果分析：根据OD值做相应的曲线，横坐标为抗体浓度的对数，纵坐标为读取的OD值，在最大OD值一半的附近选取几个点做线，通过拟合方程求出不同抗原浓度下最大OD值一半时对应的抗体浓度，换算为mol/L，代入公式Ka＝(n-1)/2(nAb’-Ab)计算亲和常数(Ab’、Ab指的是当抗原浓度为Ag’、Ag时，产生最大吸光度一半时对应的抗体浓度，n＝Ag/Ag’，当n＝2时，可得3个Ka值，当n＝4时，可得2个Ka值，当n＝8时，可得1个Ka值，将6个Ka求平均数做为最后结果，CP4-EPSPS蛋白单克隆抗体C1108和C1130的亲和常数见表1。
表1：CP4-EPSPS蛋白单克隆抗体C1108和C1130的效价、亚型和亲和常数的鉴测结果。
编号 效价 亚型 Ka(×108M-1)
C1108 1：243000 IgG1 1.49
C1130 1：243000 IgG1 21
实施例3：胶体金垫的制备。
1、胶体金标记的CP4-EPSPS蛋白单克隆抗体C1108的制备。
取90ml实验室三级水于洁净的圆底烧瓶中，将圆底烧瓶置于电磁加热套中搅拌并加热；等待沸腾后，加入4ml 1％的氯化金溶液，继续搅拌1min后，迅速加入6ml 1％的柠檬酸三钠溶液，形成混合溶液，混合溶液的颜色由浅黄变成黑色，最后变成酒红色，然后继续加热5min得到胶体金溶液，取出冷却后于4℃避光保存。
取100ml胶体金溶液于洁净锥形瓶中，用0.2M K2CO3调至pH7.0-8.0，加入15μg/ml胶体金的C1108抗体于上述溶液中，加完摇匀反应30min，加入终浓度0.1％酪蛋白钠，0.1％聚乙二醇20000封闭20min，4℃低温离心，10000rpm，30min，弃上清，用胶体金工作液复溶至原体积的50％，制成胶体金标记的CP4-EPSPS蛋白单克隆抗体C1108。
2、胶体金垫的制备。
将胶体金标记的CP4-EPSPS蛋白单克隆抗体C1108按20ul/cm2铺在结合垫上，放入45℃干燥箱干燥2.5-3小时后制成胶体金垫，装入自封袋存放于干燥密封避光装置中保存，物料平衡率在5％以内。
实施例4：控制线与测试线的包被。
用0.01M pH7.2磷酸盐缓冲液(PBS)配制控制线和测试线包被液，其中控制线包被液为浓度为0.8mg/ml的羊抗鼠IgG，测试线包被液为浓度为1.5mg/ml的CP4-EPSPS蛋白单克隆抗体C1130。
将硝酸纤维素膜粘贴在PVC板上，吸水滤纸贴到PVC板上压住硝酸纤维素膜1-1.5mm。打开划膜仪，按清洗键清洗划膜仪，设置划膜仪的参数为：控制线为1.0μl/cm，测试线为1.0μl/cm；
将贴好的PVC板放在划膜仪上，用控制线和测试线包被液在硝酸纤维素膜上分别划控制线和测试线。划膜不合格的用红记号笔标出，将包被好的PVC板置干燥箱中45℃下，干燥1-1.5小时。包被完毕后，清洗划膜仪。物料平衡率在5％以内。
实施例5：试纸条的组装。
将吸水滤纸、包被的硝酸纤维素膜(包被有CP4-EPSPS蛋白单克隆抗体C1130和羊抗鼠IgG抗体)、胶体金垫(金标CP4-EPSPS单克隆抗体C1108)和样品垫从上到下依次固定于白色PVC板，将蓝色的MAX线胶带贴到金垫处，作为标示线。然后将其切成5mm宽的试纸条，室温干燥备用，即成测试条，如图1所示。将做好的测试条与干燥剂一起装入铝箔袋内密封贮存。
实施例6：试纸条对测试样品的检测。
检测前，样品需经充分研磨，并以蒸馏水抽提和稀释，为获得最佳检测效果，各不同样品应根据表2中的比例稀释，在完成研磨和稀释后，将样品混匀，静置，取上清液作为检测样品。样本制备后需在30分钟内使用。
表2：不同样品的稀释配制表
检测时，先将样品垫浸在已提取好的蛋白样品溶液中，样品溶液的浸没高度为标示线以下，样品溶液在毛细吸收作用下由样品垫沿硝酸纤维素膜向吸水滤纸流动。
若样品溶液中含有CP4-EPSPS基因表达的抗原则被胶体金-CP4-EPSPS蛋白单克隆抗体C1108捕获，并扩散到硝酸纤维素膜上，与硝酸纤维素膜上的CP4-EPSPS单克隆抗体C1130形成Ab-Ag-胶体金标记Ab复合物，当被捕获的胶体金复合物达到一定数量时，则形成一条肉眼可见的测试线，为阳性结果，控制线作为试剂的质控标准，阳性和阴性样品检测时均会出现。用肉眼直接观察在5-10分钟内测试线与控制线的出现情况，并判定检测结果。用该试纸条检测的阳性结果与阴性结果如图2所示。
根据上样的检测结果表明，确定胶体金的最佳标记pH值为7.4；最佳标记量为0.15mg CP4-EPSPS蛋白单克隆抗体C1108每100ml胶体金溶液；最佳的胶体金工作液为pH8.0的Tris-柠檬酸缓冲液，含0.2％的酪蛋白，5％蔗糖，0.2％的BSA，0.2％的吐温；最佳的CP4-EPSPS蛋白单克隆抗体C1130)包被浓度为1.5mg/ml；5-10分钟内判读结果。
实施例7：试纸条最低检测限试验。
将不同种类的样本按照表2进行1:3、1:5、1:10、1:16、1:32、1:64、1:80稀释检测，检测线出现红色的最大稀释比例，即为此试剂条的最低检测限。当稀释比例≤1:64时，出现明显的阳性红带；>1:64，没有检测线出现。因此本试纸条的检测最低限为1:64。
实施例8：试纸条的特异性检测试验。
分别以Cry3Bb、NPTII、Cry1Ab、PAT/bar、Cry1F、Cry9c、Cry34Ab1、Cry35Ab1、Cry3A055、Pmi、PAT/pat转基因样本为检测样品，同时检测CP4-EPSPS转基因样本、非转基因样本，检测方法同上，检测结果证明，制备的试纸条检测非转CP4-EPSPS基因植物无交叉反应，检测转其他基因作物无假阳性，对转CP4-EPSPS基因植物具有较强的特异性。
实施例9：试纸条的稳定性检测试验。
试纸条在不启封条件下，分别检测45℃存放12周、室温存放27个月后的试纸条的稳定性。结果显示，对样本稀释1:64的转基因成分检测无明显影响。

Claims (7)

1.一种快速检测转CP4-EPSPS基因植物及其衍生品的试纸条，其特征在于，所述试纸条包括：PVC底板、样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水滤纸；硝酸纤维素膜黏贴在PVC底板的中部，且硝酸纤维素膜上包被有相互分离的一条测试线和一条控制线；PVC底板一端黏贴样品垫和胶体金垫，另一端黏贴吸水滤纸；其中，胶体金垫位于硝酸纤维素膜靠近测试线的一端，压硝酸纤维素膜1-1.5mm，吸水滤纸位于硝酸纤维素膜靠近控制线的一端，压硝酸纤维素膜2-2.5mm；样品垫贴于胶体金垫的上方，露出胶体金垫2-3mm；
所述的测试线为包被在硝酸纤维素膜上的CP4-EPSPS蛋白单克隆抗体C1130；CP4-EPSPS蛋白单克隆抗体C1130的亲和常数为2.1×109M-1；CP4-EPSPS蛋白单克隆抗体C1130由保藏号为CGMCC No.11293的杂交瘤细胞株分泌；
所述的胶体金垫上包含用胶体金标记的CP4-EPSPS蛋白单克隆抗体C1108；CP4-EPSPS蛋白单克隆抗体C1108的亲和常数为1.49×108M-1；CP4-EPSPS蛋白单克隆抗体C1108由保藏号为CGMCC No.11292的杂交瘤细胞株分泌；
所述胶体金标记的CP4-EPSPS蛋白单克隆抗体C1108制备包括如下步骤：
取90ml实验室三级水于洁净的圆底烧瓶中，加热沸腾后，加入4ml 1％的氯化金溶液，继续搅拌1min后，迅速加入6ml 1％的柠檬酸三钠溶液，形成混合溶液，混合溶液的颜色由浅黄变成黑色，最后变成酒红色，然后继续加热5min得到胶体金溶液；
取100ml胶体金溶液，调节pH至7.0-8.0，加入15μg/ml C1108抗体，摇匀反应30min，加入终浓度0.1％酪蛋白钠，0.1％聚乙二醇20000封闭20min，4℃低温离心，10000rpm，30min，弃上清，用胶体金工作液复溶至原体积的50％，制成胶体金标记的CP4-EPSPS蛋白单克隆抗体C1108；
所述CP4-EPSPS蛋白单克隆抗体C1108和C1130的制备包括如下步骤：
用50μg纯化的CP4-EPSPS蛋白为免疫原，皮下多点注射BALB/C小白鼠，添加福氏完全佐剂；21天后进行第二次相同剂量的免疫，添加福氏不完全佐剂，腹腔注射；14天后进行第三次相同剂量的免疫，添加福氏不完全佐剂，腹腔注射；7天后进行ELISA效价检测，血清效价达1:243000；7天后进行细胞融合前加强免疫，用相同剂量的纯蛋白不加佐剂，脾脏注射；3天后取免疫后的BALB/C小白鼠的脾细胞进行融合；
将免疫后的BALB/C小白鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0按5∶1的比例，在无血清RPMI-1640培养基中混匀，1400rpm离心5min，去除培养基，相同方法洗涤细胞三次；用50％的PEG3350作为融合剂，在37℃下，1min内缓慢加入1ml，搅拌1.5min，用14ml无血清RPMI-1640培养基终止融合后，4min缓慢滴加完成；800rpm离心5min，沉淀用HAT培养基悬浮，分装到96孔含有饲养细胞与HAT培养基的细胞板中，于37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养；培养6天后，用HAT培养基全量换液一次，次日用常规间接ELISA方法筛选阳性孔，筛选得到的阳性孔用HT培养基全量换液一次，次日用常规间接ELISA方法进行复测，筛选阳性孔；
筛选出的特异性强的阳性孔用常规的有限稀释法克隆，共进行三次克隆，获得单抗杂交瘤细胞株C1108、C1130。
2.根据权利要求1所述的一种快速检测转CP4-EPSPS基因植物及其衍生品的试纸条，其特征在于，所述的控制线为包被在硝酸纤维素膜上的羊抗鼠IgG抗体。
3.根据权利要求1所述的一种快速检测转CP4-EPSPS基因植物及其衍生品的试纸条，其特征在于，所述的样品垫由1层吸水玻璃纤维和1层无纺布组成。
4.权利要求1-3任一项所述的快速检测转CP4-EPSPS基因植物及其衍生品的试纸条在检测转CP4-EPSPS基因植物中的应用。
5.权利要求1-3任一项所述的快速检测转CP4-EPSPS基因植物及其衍生品的试纸条在检测转CP4-EPSPS基因食品中的应用。
6.一种转基因检测试剂盒，其特征在于，所述转基因检测试剂盒包含权利要求1-3任一项所述的试纸条。
7.根据权利要求6所述的一种转基因检测试剂盒，其特征在于，所述的转基因为转CP4-EPSPS基因。
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