CN105158475B - 用于检测转基因农作物的单克隆抗体对及双抗夹心酶联免疫检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一对杂交瘤细胞株。该对杂交瘤细胞株包括独立存放的第一杂交瘤细胞株和第二杂交瘤细胞株；所述第一杂交瘤细胞株的保藏编号为CGMCC NO.10498；所述第二杂交瘤细胞株的保藏编号为CGMCC NO.10496。本发明还提供了由这两株杂交瘤细胞分泌的配对单克隆抗体制成的双抗夹心酶联免疫检测试剂盒，其可以用于检测G2‑EPSPS蛋白及其转基因作物和产品。试验表明，本试剂盒可检测到线性范围为0‑1000ng/mL，并且对CP4‑EPSPS及27种非转基因作物和14种不同来源的非G2‑EPSPS转基因作物也都不呈现交叉反应，具有较高的特异性。

Description

用于检测转基因农作物的单克隆抗体对及双抗夹心酶联免疫检测试剂盒
技术领域
本发明涉及农业生物技术领域，具体地，涉及一种杂交瘤细胞对、一种单克隆抗体对和它们在检测转G2-EPSPS基因农作物中的用途以及一种双抗夹心酶联免疫检测试剂盒。
背景技术
草甘膦是农业应用最广泛的除草剂之一，主要作用于植物和微生物等的5-烯醇氏丙酮酰莽草酸-3-磷酸(EPSP)合酶，阻断莽草酸代谢途径，导致芳香族氨基酸及其衍生物合成受阻。由于自然界中绝大部分植物体内EPSP合酶均属于草甘膦敏感型，因此草甘膦除草剂具有十分优秀的广谱性。但是自然界微生物群体的多样性造就微生物中EPSP合酶的多样性，部分微生物体内EPSP合酶对草甘膦不敏感，利用基因工程技术将草甘膦不敏感EPSP合酶转入目标植物中以替代内源敏感型EPSP合酶，将使该植物获得草甘膦除草剂抗性。
抗草甘膦除草剂转基因大豆是世界上第一例商业化种植的转基因作物，随后孟山都公司利用该基因先后研发了多种转基因抗草甘膦作物(大豆、棉花、玉米、苜蓿、甘蔗等)。自1996年上市以来，在全世界转基因作物品种及种植面积迅猛增加，从171万公顷增加到2014年的1.815亿公顷。全球种植转CP4-EPSPS作物累计超过1亿公顷。
G2-EPSPS蛋白编码基因克隆自草甘膦污染土壤细菌基因组文库，具有很高的草甘膦耐受性。该基因编码的蛋白经分析属于Class I类型，酶活测定显示该蛋白具有高底物亲和能力和低草甘膦亲和力，因此能赋予宿主高草甘膦除草剂耐受力。在酶学水平上G2-EPSPS基因草甘膦耐受性高于孟山都公司的CP4-EPSPS基因。我国抗草甘膦作物一旦广泛应用，田间耕作方式将发生革命性的变革，意义重大。
ELISA抗原检测方法以其敏感、特异、易于操作而被广泛使用，适用于大量样品的快速检测。本专利应用由两株杂交瘤细胞分泌的配对单克隆抗体制成的双抗体夹心ELISA检测试剂盒可以用于检测G2-EPSPS蛋白及其转基因作物和产品。可检测到的线性范围为0-1000ng/mL，并且对CP4-EPSPS及27种非转基因作物和14种不同来源的非G2-EPSPS转基因作物也都不呈现交叉反应，具有较高的特异性。
发明内容
本发明的目的是提供一种灵敏特异的双抗体夹心ELISA试剂盒检测G2-EPSPS蛋白的方法。
为了实现上述目的，一方面，本发明提供了一种杂交瘤细胞对，其中，该杂交瘤细胞对包括独立存放的第一杂交瘤细胞株和第二杂交瘤细胞株；所述第一杂交瘤细胞株的保藏编号为CGMCC NO.10498；所述第二杂交瘤细胞株的保藏编号为CGMCC NO.10496。
再一方面，本发明还提供了一种单克隆抗体对，该单克隆抗体对包括独立存放的第一单克隆抗体和第二单克隆抗体；所述第一单克隆抗体由第一杂交瘤细胞株产生；所述第二单克隆抗体由第二杂交瘤细胞株产生；所述第一杂交瘤细胞株的保藏编号为CGMCC NO.10498；所述第二杂交瘤细胞株的保藏编号为CGMCC NO.10496。
再一方面，本发明还提供了如上所述的单克隆抗体对在检测G2-EPSPS蛋白中的用途。
再一方面，本发明还提供了一种双抗体夹心ELISA检测试剂盒，所述第一单克隆抗体作为包被抗体，HRP标记的第二单克隆抗体作为检测抗体。所述第一单克隆抗体和所述第二单克隆抗体构成单克隆抗体对，其中，所述单克隆抗体对为如上所述的单克隆抗体对。通过上述技术方案，本试剂盒可检测到线性范围为0-1000ng/mL，并且对CP4-EPSPS及27种非转基因作物和14种不同来源的非G2-EPSPS转基因作物也都不呈现交叉反应，具有较高的特异性。
本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
生物材料保藏
本发明的第一杂交瘤细胞株是本发明的发明人自行融合筛选得到的，其保藏编号为CGMCC NO.10498，保藏日期为2015年04月10日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为抗G2单克隆抗体杂交瘤细胞株。
本发明的第二杂交瘤细胞株是本发明的发明人自行融合筛选得到的，其保藏编号为CGMCC NO.10496，保藏日期为2015年04月10日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为抗G2单克隆抗体杂交瘤细胞株。
附图说明
附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1是实施例2中双抗体夹心ELISA检测试剂盒在检测G2-EPSPS蛋白的线性相关曲线图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
一方面，本发明提供了一种杂交瘤细胞对，其中，该杂交瘤细胞对包括独立存放的第一杂交瘤细胞株和第二杂交瘤细胞株；所述第一杂交瘤细胞株的保藏编号为CGMCC NO.10498；所述第二杂交瘤细胞株的保藏编号为CGMCC NO.10496。
再一方面，本发明还提供了一种单克隆抗体对，该单克隆抗体对包括独立存放的第一单克隆抗体和第二单克隆抗体；所述第一单克隆抗体由第一杂交瘤细胞株产生；所述第二单克隆抗体由第二杂交瘤细胞株产生；所述第一杂交瘤细胞株的保藏编号为CGMCC NO.10498；所述第二杂交瘤细胞株的保藏编号为CGMCC NO.10496。
再一方面，本发明还提供了如上所述的单克隆抗体和如上所述的单克隆抗体对在检测G2-EPSPS蛋白中的用途。
再一方面，本发明还提供了一种双抗夹心酶联免疫检测试剂盒，其中，该试剂盒包括：酶联板、包被缓冲液、第一单克隆抗体、封闭液、酶标记的第二单克隆抗体、显色底物和终止液；所述第一单克隆抗体由保藏编号为CGMCC NO.10498的杂交瘤细胞株分泌得到，所述第二单克隆抗体由保藏编号为CGMCC NO.10496的杂交瘤细胞株分泌得到。
其中，为了提高定量检测的准确性并提高试剂盒的易用性，优选地，该试剂盒还含有G2-EPSPS蛋白标准品。
其中，所述包被缓冲液可以为常规的ELISA包被缓冲液，例如为含有0.05-0.1体积％吐温-20的磷酸盐缓冲液。
其中，所述封闭液可以为常规的ELISA封闭液，例如为含有0.05-0.1体积％吐温-20和5-10重量％酪蛋白的磷酸盐缓冲液。
其中，对第二单克隆抗体的酶标记可以为本领域常规的酶标记方案，例如，可以按照Pierce HRP标记试剂盒(Cat No31488)的说明书中的方法进行酶标记。优选地，酶标记的第二单克隆抗体的标记酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶，当标记酶为辣根过氧化物酶时，所述显色底物包括显色底物A和显色底物B，所述显色底物A为过氧化氢或过氧化脲，所述显色底物B为邻苯二胺或四甲基联苯胺，所述终止液为1-2mol/L的硫酸或盐酸缓冲液；当标记酶为碱性磷酸酶时，所述显色底物为对硝基磷酸盐缓冲液，所述终止液为1-2mol/L氢氧化钠。
本发明的试剂盒的使用方法可以包括：将第一单克隆抗体用包被缓冲液稀释后包被于酶联板上，然后用包被缓冲液洗去多余的第一单克隆抗体；接着用封闭液封闭经包被的酶联板，然后用包被缓冲液洗板以洗去多余的封闭液；接着加入待检测样品，然后用包被缓冲液洗板以洗去多余的待检测样品；接着加入酶标记的第二单克隆抗体，然后用包被缓冲液洗板以洗去多余的酶标记的第二单克隆抗体；接着加显色底物显色，然后加终止液终止反应；测定OD450值；若待测样品中含有G2-EPSPS蛋白，则会有显色反应，若不含G2-EPSPS蛋白，则呈阴性。可以使用梯度稀释后的G2-EPSPS蛋白标准品替代被检测样品，以获得标准曲线，然后通过与标准曲线比对，定量检测G2-EPSPS蛋白。
本发明的试剂盒的可能原理包括：第一单克隆抗体首先结合至酶联板上，而后封闭液封闭酶联板上的空白位点，接着待检测样品若含有G2-EPSPS蛋白，则G2-EPSPS蛋白与第一单克隆抗体结合，然后酶标记的第二单克隆抗体与G2-EPSPS蛋白结合，形成第一单克隆抗体-G2-EPSPS蛋白-酶标记的第二单克隆抗体复合体，而后通过显色底物显示出复合体中酶的存在，从而显示出G2-EPSPS蛋白的存在，由此进行G2-EPSPS蛋白的定性和定量分析。
其中，用于构建本发明的试剂盒的第一单克隆抗体和第二单克隆抗体需要分别针对G2-EPSPS蛋白的不同抗原表位并且具有配对检测效果。
以下，通过实施例进一步详细说明本发明。以下实施例中，所用的试剂均为商购获得。
实施例1
对取自草甘膦污染土壤样品提取细菌总DNA，经电泳检测后来自2号样品(G2)的总DNA质量较好。对G2细菌总DNA进行部分酶切(Sau3AI)，回收3-20kb大小片段，同时对pACYC184质粒进行BamHI酶切，然后进行连接反应。将连接产物转化aroA基因缺失大肠杆菌ER2799，在M9培养基上筛选生长菌落。从生长菌落中提取质粒后进行测序鉴定，将含有EPSPS编码基因aroA的质粒命名为pACG2aroA。根据NCBI blast分析结果，找到一个长1332bp编码444个氨基酸的aroA基因，根据G2-aroA(即G2-EPSPS)序列设计引物，在上游引物5’端人工添加BamHI酶切序列，在下游引物5’端人工添加HindIII酶切序列。引物合成、测序均由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。具体所用引物序列如表1所示。
表1
按照表2和表3所列的条件进行PCR反应。
表2
成分 体积
模板：pACG2aroA质粒 1μL(30-50ng)
引物1：G2aroA(FB) 1μL(50pM)
引物2：G2aroA(RH) 1μL(50pM)
dNTPs 2μL(2.0mM)
10×Buffer 2μL
E×Taq 0.2μL(2.5U)
ddH2O 12.8μL
共计 20μL
表3
94℃预变性DNA 5min
94℃变性 30sec
59℃退火 30sec
72℃延伸 30sec
30个循环后
72℃补充延伸 10min
按照表4所列的条件进行PCR产物与pGEM-T载体连接，并将连接产物转化大肠杆菌。
表4
成分 体积
10×连接酶缓冲液 1μL
pGEM-T载体 1μL(50ng)
PCR产物 2μL(≈25ng)
T4DNA连接酶(3U/μL) 1μL
ddH2O 5μL
共计 10μL
其中，连接和转化的条件包括：4℃过夜连接，连接产物转化入大肠杆菌(E.coli)JM109的感受态细胞中，涂布在加有Amp(50mg/mL)，IPTG(200mg/mL)和X-gal(20mg/mL)的LB平板上进行重组转化的白色菌落筛选。质粒提取及酶切鉴定后送于诺赛生物公司测序鉴定。
按照表5和表6所列的条件，将测序检测正确插入目的片段基因序列的重组质粒利用BamHI和HindIII限制性内切酶消化，连接到相应内切酶消化的表达载体pET28a上，构建成重组表达载体。
表5
成分 体积
ddH2O 15μL
重组质粒 2μL(约100ng)
BamHI 0.5μL(2,000U)
HindIII 0.5μL(2,000U)
10×缓冲液 2μL
共计 20μL
表6
成分 体积
ddH2O 15μL
载体pET28a 2μL(约100ng)
BamHI 0.5μL(2,000U)
HindIII 0.5μL(2,000U)
10×缓冲液 2μL
共计 20μL
经过限制性内切酶消化的重组质粒和载体片段利用QXII DNA纯化回收试剂盒(QIAEXII DNA Gel Extraction Kit)经过凝胶电泳进行目的片段回收，回收方法包括：(1)将目的条带从0.5％的琼脂糖凝胶上切下，称量其重量；(2)加入3倍体积的QXI Buffer和2倍体积的灭菌的超纯水和5μl的QXII悬浮液；(3)50℃水浴10min，直至胶全部溶解；(4)以最大速度离心0.5min，弃上清；(5)沉淀重悬于500μL的QXI Buffer，以最大速度离心0.5min，弃上清；(6)沉淀重悬于500μL的PE Buffer，以最大速度离心0.5min，弃上清；(7)沉淀干燥后加入30μL的ddH2O；(8)50℃水浴10min；(9)以最大速度离心0.5min，上清转管(即为所得纯化的总DNA液体)；(10)电泳检测，贮存于-20℃。
利用T4DNA连接酶将回收后的BamHI和HindIII消化后的目的片段和载体pET28a片段连接，连接混合液中加入载体和外源片段的摩尔比约为1:3。连接体系如表7所示。
表7
成分 体积
10×Ligase buffer 1μL
pET28a Vector 1μL(50ng)
目的片段 1.5μL(≈25ng)
T4DNA Ligase(3U/μL) 1μL
ddH2O 5.5μL
Total 10μL
混匀，4℃过夜连接，连接产物转化入大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)的感受态细胞中，在含有50μg/mL的Km抗生素的平板上进行筛选并进行质粒的酶切鉴定。
将BL28G2AroA接入到50mL含50mg/L卡那霉素(Km)LB液体培养基中，37℃摇菌培养至OD600值为0.5～0.7时，加入IPTG(200mg/mL)诱导蛋白的表达，菌液转入30℃培养，0～8h每隔1h取样1.5mL菌液，SDS-PAGE电泳检测。将IPTG诱导合适时间的菌液离心并收集菌体，加入2mL E-Buffer(5mM Tris-HCl pH7.8，1mM EDTA pH8.0，1mM DTT)重悬菌体，于-86℃冻融一次，然后超声波破碎(200W，超声1.5Sec，间隔2.5Sec，10-20min)，4℃，12,000rpm离心去除细胞碎片，上清液为粗提物，取少量上清液进行SDS-PAGE电泳检测，其余上清液加入50％(w/v)甘油，混匀后于-20℃保存备用。
从上清液中提纯G2-aroA蛋白(即G2-EPSPS蛋白)。融合蛋白的N端含有6个His-Tag，因此采用Ni-NTA偶联的NTA树脂进行亲和层析纯化。首先将G2-aroA融合蛋白上清液逐步滴加到层析柱中，利用重力作用过滤溶液。而后层析柱用含不同咪唑梯度(10，50，100，150，200，250mM)的NTA洗脱液洗脱蛋白，分部收集洗脱液。当洗脱液中的咪唑浓度在200mM时，蛋白洗脱量最大。聚丙烯酰胺凝胶电泳检测收集到的蛋白纯度后用透析液(20mM Hepe、pH7.5、1mM DTT、200mM KCl和50％甘油)对纯化蛋白进行透析，将纯化的蛋白分装，-70℃保存。
实施例2
1.G2-EPSPS蛋白单克隆抗体的制备及鉴定
1.1 小鼠的免疫
(1)选用8W+的BALB/c雌小鼠按剂量分组免疫4次：(初次免疫前取眼血作为阴性对照)，免疫剂量分别为50、100、150、200μg/只(即实施例1得到的G2-EPSPS蛋白)。初次免疫时加等体积福氏完全佐剂皮下多点注射；以后隔两周进行一次免疫，以相同剂量重组抗原加等体积福氏不完全佐剂皮下多点注射，追加免疫两次。第三次免疫结束后10天左右用重组抗原包被ELISA板，用间接ELISA测定小鼠血清的抗体效价；
(2)融合前三天对抗体效价最高的(1:105以上)小鼠尾静脉注射加强免疫(50μg)。追加免疫72h后进行细胞融合。
1.2 细胞融合
1.2.1 饲养细胞制备
细胞融合前一天，按照以下方法制备饲养层细胞：
(1)将8W+健康雄性BALB/c小鼠，拉颈处死后，于75％乙醇浸泡2-3min；
(2)移至超净台内，以仰卧位固定在解剖板上，用眼科剪剪开胸腹部皮肤，用镊子纵向两侧剥离，暴露腹壁，并用75％乙醇消毒其腹膜；
(3)用止血钳轻轻拉起腹膜，将10mL预温的1640培养基用注射器注入腹腔，用棉球轻揉腹腔1-2min，吸出细胞悬液，放入离心管中；
(4)离心：1000rpm，5min，弃上清；
(5)用10mL含血清HAT培养基将细胞混匀，细胞计数，调整细胞密度于2×105/mL；
(6)将此细胞悬液加入96孔细胞培养板，100μL/孔，则细胞数为2×104/孔；
(7)置37℃，5％CO2孵箱培养，供次日融合实验用。
1.2.2 骨髓瘤细胞SP2/0的制备
(1)收获对数生长期SP2/0细胞，用1640培养基洗涤3次，离心1000rpm，5min，弃上清；
(2)用1640培养基重悬细胞。取100μL细胞悬液，以0.2％台盼蓝染色，进行细胞计数，要求细胞活力>95％，并调整细胞密度待用。
1.2.3 脾细胞悬液的制备
(1)将3天前经过冲击免疫的BABL/c小鼠摘除眼球放血，断颈处死，于75％乙醇浸泡2min；
(2)移至超净台内，剪开腹部皮肤向两侧剥离，暴露腹壁；换剪刀、镊子，剪开腹膜，取出脾脏，去掉脂肪和结缔组织，用1640培养基冲洗；
(3)将脾脏置于200目的筛网上，一边用注射器芯轻轻地研磨；一边以培养液冲洗，收集脾细胞悬液，离心1000rpm，5min，弃上清；
(4)用1640培养基重悬细胞，离心洗涤2次：1000rpm，5min，弃上清；
(5)用10mL不完全培养基重悬。取100μL细胞悬液，以0.2％台盼蓝染色，要求细胞活力>95％，并计数脾细胞。剩余细胞调整细胞密度待用。
1.2.4 细胞融合及培养
(1)将脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞以5:1比例放于50mL离心管中混匀，1000rpm离心5min，弃上清，用食指轻弹离心管底部，使细胞沉淀松散呈糊状；
(2)一边均匀转动离心管，一边用1mL吸管逐滴加入50℃预温的50％PEG 4000 1mL，于1min内完成；
(3)加1mL,37℃预热的1640培养基，在1min内完成；
(4)加10mL，37℃预热的1640培养基，在5min内完成；
(5)离心：800rpm，8min；细胞沉淀重悬于100mL HAT培养基中；
(6)按100μL/孔将细胞悬液转移到接种了饲养细胞的细胞培养板中，同时留2孔加未经融合的SP2/0细胞作对照，观察细胞对HAT的敏感性。培养板置于37℃、5％CO2孵箱中培养；
(7)融合7天后，采用半量换液的方式更换HAT培养液。以后每3-5天半量换液一次；
(8)3-4周后，换完全培养基维持培养。
1.3 ELISA筛选阳性杂交瘤细胞
(1)融合后的细胞培养约12-15天左右，生长到培养孔底面积的1/4时，取上清用间接ELISA法检测特异性反应和交叉反应，对杂交瘤细胞进行筛选。重组蛋白G2-EPSPS为包被抗原，包被浓度5μg/mL常规包被ELISA板。往包被ELISA板中加100μL/孔的细胞培养上清液，以免疫鼠血清为阳性对照(1:50稀释，稀释液为PBS)，SP2/0细胞孔培养上清为阴性对照。细胞上清与包被ELISA板孵育1h，充分洗涤后加入HRP标记的羊抗鼠IgG抗体(1:10000稀释)100μL/孔，37℃孵育30min，弃二抗。充分洗板后每孔加TMB 100μL显色15min，再加入1N H2SO450μL/孔终止反应。测定OD450值。
(2)ELISA筛选获得132株分泌G2-EPSPS单抗的细胞株；上述132株G2-EPSPS单抗的细胞株所分泌的单克隆抗体均对重组G2-EPSPS蛋白具有阳性反应。选择其中阳性反应最强的10株细胞进一步亚克隆培养，其余细胞株直接扩大培养，冻存和少量生产腹水。
1.4 有限稀释法进行克隆化培养
(1)克隆化的前一天按照上述方式制备饲养层细胞；用HT培养液按100μL/孔接种于96孔培养板中；
(2)用移液器将待克隆的细胞吹打混匀，用含20％血清的HT选择培养液稀释至1个细胞/孔的密度；
(3)按照1个细胞/孔加到已有饲养细胞的细胞板，置5％CO2、37℃的培养箱中进行培养；
(4)培养至第4天时，在倒置显微镜下观察并记录细胞单克隆生长孔；培养1周左右，当细胞培养液变黄时，做好标记，吸取100μL上清，用上述ELISA法检测细胞培养上清；
(5)隔3天左右待培养液变黄，再次对初检阳性孔做ELISA检测；
(6)将两次检测均为强阳性的孔内细胞进行2-3次亚克隆，直到最后一次所有仅一个细胞集落生长的培养孔上清ELISA检测结果均为阳性为止；
(7)将最后一次有限稀释后ELISA检测结果最好的杂交瘤细胞克隆转至24孔再扩大培养到6孔培养板，最后至100mL培养瓶收集细胞，冻存强阳性单克隆杂交瘤细胞。
1.5 单克隆抗体的制备
1.5.1 腹水的制备
(1)选取10周龄BALB/c小鼠，腹腔注射液体石蜡0.5mL/只；
(2)7天后，腹腔接种经PBS稀释的培养至对数期的阳性杂交瘤细胞，每只小鼠5×105/mL杂交瘤细胞；
(3)5天后观察，当小鼠腹部明显膨胀时，用12号注射针头收集腹水，每隔3天收集一次，直到小鼠死亡；
(4)将腹水以4000rpm，离心10min；留上清分装后-70℃冰箱保存。
1.5.2 单克隆抗体的纯化(protein A亲和层析)
(1)装柱：用Equilibration Buffer(50mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH8.6)湿润柱子，检查柱子是否堵塞，加5mLProtein A Agarose于柱中；
(2)加入10倍柱体积的Equilibration Buffer平衡柱子；
(3)使腹水缓慢流过凝胶床；如有必要，可将收集的流出液再次上柱；
(4)加入10倍柱体积的Equilibration Buffer，按4-5mL/管收集穿透液直至OD280<0.1；
(5)准备收集管，收集洗脱液的试管按500μL/管加入中和缓冲液(20mM磷酸盐缓冲液，pH 7.7)。
(6)用5倍柱体积的Elution Buffer(50mM glycine，0.5M NaCl，pH 2.3)洗脱，按1.5mL/管收集洗脱液直至OD280<0.1；
(7)用5倍柱体积的Equilibration Buffer洗柱及平衡柱子。
1.6 单克隆抗体识别表位的分析
将所获得的10株纯化单抗两两组合，采用相加指数法测定单克隆抗体的抗原识别表位。即用重组蛋白G2-EPSPS以5μg/mL浓度100μL/孔包被酶标板，封闭、洗涤后分别加入饱和稀释度的单克隆抗体，37℃作用60min，再洗涤后每孔分别两两组合加入另一株单克隆抗体，37℃作用60min，同样洗涤后加入工作浓度的HRP标记山羊抗小鼠二抗(Sigma公司产品)，37℃作用60min，最后再洗漆，底物显色测定OD450nm值。按如下公式计算两种单克隆抗体叠加后的AI值：AI＝(A1+2-A1)/A2χ100％(A1+2：表示2株单克隆抗体叠加后的OD值；A1表示第1株单克隆抗体自身叠加的OD值；A2表示第2株单克隆抗体自身叠加的OD值)。当两两抗体叠加之后的AI值大于40％，判为两株单克隆抗体识别不同位点。经过相加指数计算，并结合单克隆抗体腹水效价结果，实验最终得到第一单克隆抗体2GB12和第二单克隆抗体1BA7。两个抗体腹水效价均在1:105以上。
1.7 单克隆抗体亚类的鉴定
利用免疫球蛋白标准亚类鉴定试剂盒(Southern Biotech公司)对各株单抗进行亚类鉴定，具体试验方法如下：
(1)重组G2-EPSPS蛋白5μg/mL包被酶标板，每孔100μL，37℃过夜；
(2)次日，甩掉未结合的蛋白，PBST洗涤3次，每次5min；每孔加入100μL的0.5％BSA封闭，37℃放置1h；
(3)在封闭好的酶标板中分别加入1:1000倍稀释的纯化单克隆抗体，100μL/孔，37℃孵育1h；PBST洗涤3次，每次5min；
(4)向酶标板中依次加入用PBS 1:250稀释的HRP标记的羊抗鼠二抗(分别为抗鼠κ、λ、IgM、IgA、IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3)，100μL/孔，37℃放置1h，PBST洗涤3次，每次5min；
(5)37℃孵育30min，弃二抗。充分洗板后每孔加TMB 100μL显色15min，再加入1N H2SO450μL/孔终止反应。测定OD450值。
单克隆抗体亚类的鉴定结果
各单抗重链结果如表8所示；轻链均为Kappa链
表8
抗体 2GB12 1BA7
抗体亚类 IgG2b IgG2b
2.双抗体夹心ELISA抗原检测G2-EPSPS蛋白方法的建立
2.1 酶标单克隆抗体的制备和双抗体夹心配对抗体的选择
利用加强型活化过氧化物酶及标记试剂盒对纯化的单克隆抗体2GB12和1BA7进行HRP酶标记。2GB12和1BA7两株单克隆抗体经过酶标记后，记为2GB12E和1BA7E，利用双抗体夹心ELISA方法进行活性的鉴定。结果，它们的效价分别达到1:104和1:1.5×104。
将2GB12和1BA7单克隆抗体作为捕获抗体，2GB12E和1BA7E作为检测抗体，进行夹心配对性实验，以OD450nm值最高的配对为最佳的抗体组合，比较结果如表9。结果发现，2GB12作为包被抗体，1BA7E作为检测抗体效果最好。
表9
2.2 单克隆抗体包被浓度及酶标单克隆抗体工作浓度的确定
用包被液将2GB12单克隆抗体做梯度稀释，5μg/mL到1μg/mL中取五个浓度；用PBST将酶标单克隆抗体1BA7E进行稀释，1μg/mL到0.0625μg/mL中取五个浓度。选定P/N最大且阳性OD450nm值大于2.0的孔，其所对应的捕获抗体包被浓度和酶标检测抗体的浓度为最佳条件，最终确定单克隆抗体2GB12包被浓度为4μg/mL，酶标抗体1BA7E的作用浓度为1μg/mL。
2.3 配对抗体特异性评价
本实验筛选到的配对单克隆抗体：第一单克隆抗体2GB12和第二单克隆抗体1BA7，对27种非转基因作物和14种不同来源的各种非G2-EPSPS转基因作物(表10)做了特异性检测实验。以是否高于阴性样本的OD450值来判定阳性结果。检测结果如表10示。
配对单克隆抗体2GB12-1BA7对所有检测非转基因和非G2-EPSPS转基因作物没有交叉反应。对转CP4-EPSPS的大豆和玉米没有交叉反应。
表10
2.4 双抗夹心检测试剂盒的检测结果
用实施例1制备得到的G2-EPSPS蛋白作为标准品，以及第一单克隆抗体2GB12和酶标第二单克隆抗体1BA7进行双抗夹心酶联免疫检测，得到如图1所示的标准曲线和线性方程，继而对G2-rice和G2-corn进行定量分析(表10)，根据对应的OD450值和线性方程得到G2-rice和G2-corn的G2-EPSPS蛋白含量分别为3097ng/mg和3410ng/mg。
综上所述，配对单克隆抗体2GB12-1BA7制备的检测试纸条对大部分非转基因和非G2-EPSPS转基因作物没有交叉反应。对转CP4-EPSPS的大豆和玉米没有交叉反应。将产2GB12单克隆抗体的杂交瘤细胞株进行保藏，保藏编号为CGMCC NO.10498；将产1BA7单克隆抗体的杂交瘤细胞株进行保藏，保藏编号为CGMCC NO.10496。
根据实施例2可以看出，本发明筛选到了一对单克隆抗体，其配对单克隆抗体制成的双抗体夹心ELISA检测试剂盒可以用于定量检测G2-EPSPS蛋白，可检测到的线性范围为0-1000ng/ml。该检测试剂盒对CP4-EPSPS及27种非转基因作物和14种不同来源的非G2-EPSPS转基因作物也都不呈现交叉反应，具有较高的特异性。
以上结合附图详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (8)

1.一种杂交瘤细胞对，其特征在于，该杂交瘤细胞对包括独立存放的第一杂交瘤细胞株和第二杂交瘤细胞株；所述第一杂交瘤细胞株的保藏编号为CGMCC NO.10498；所述第二杂交瘤细胞株的保藏编号为CGMCCNO.10496。
2.一种单克隆抗体对，其特征在于，该单克隆抗体对包括独立存放的第一单克隆抗体和第二单克隆抗体；所述第一单克隆抗体由第一杂交瘤细胞株产生；所述第二单克隆抗体由第二杂交瘤细胞株产生；所述第一杂交瘤细胞株的保藏编号为CGMCC NO.10498；所述第二杂交瘤细胞株的保藏编号为CGMCC NO.10496。
3.权利要求2所述的单克隆抗体对在检测转G2-EPSPS基因农作物中的用途。
4.一种双抗夹心酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括：酶联板、包被缓冲液、第一单克隆抗体、封闭液、酶标记的第二单克隆抗体、显色底物和终止液；所述第一单克隆抗体由保藏编号为CGMCCNO.10498的杂交瘤细胞株分泌得到，所述第二单克隆抗体由保藏编号为CGMCC NO.10496的杂交瘤细胞株分泌得到。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其中，该试剂盒还含有G2-EPSPS蛋白标准品。
6.根据权利要求4所述的试剂盒，其中，所述包被缓冲液为含有0.05-0.1体积％吐温-20的磷酸盐缓冲液。
7.根据权利要求4所述的试剂盒，其中，所述封闭液为含有0.05-0.1体积％吐温-20和5-10重量％酪蛋白的磷酸盐缓冲液。
8.根据权利要求4所述的试剂盒，其中，酶标记的第二单克隆抗体的标记酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶，
当标记酶为辣根过氧化物酶时，所述显色底物包括显色底物A和显色底物B，所述显色底物A为过氧化氢或过氧化脲，所述显色底物B为邻苯二胺或四甲基联苯胺，所述终止液为1-2mol/L的硫酸或盐酸缓冲液；
当标记酶为碱性磷酸酶时，所述显色底物为对硝基磷酸盐缓冲液，所述终止液为1-2mol/L氢氧化钠。
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