CN102911919A - 一种bar/PAT蛋白单克隆抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了针对植物中抗bar/PAT基因表达蛋白的单克隆抗体。所说的分泌单抗的细胞株4C2,其保藏编号为CGMCCNo.6341。本发明获得了抗体效价高、特异性强的杂交瘤细胞株，用该细胞株分泌的单克隆抗体在制备成检测植物中bar/PAT转基因成分的免疫胶体金试纸或Elisa试剂盒,可同时玉米、大豆、水稻、棉花及以其为原料的衍生产品,对转基因筛选和转基因安全评价，具有较为广泛的应用价值。

Description

一种bar/PAT蛋白单克隆抗体及其制备方法和应用

技术领域

　  本发明属生物技术领域，是一种单克隆抗体的制备和应用，涉及抗除草剂标记的转基因植物的检测技术。

背景技术

    bar/pat基因，为抗除草剂基因，编码蛋白—膦丝菌素乙酰转移酶（PAT）。该基因广泛应用于基因工程育种中，也是遗传转化中的标记基因，它使植物抵抗以L-phosphiothricin(PPT)为活性成分的除草剂。2001年全球种植的转基因作物面积达5260万hm²,抗除草剂作物占全球转基因作物的85%。从发展趋势上看，转基因的作物比例仍在不断增加。由于抗除草剂标记在商业化转基因植物应用广泛，随着转基因食品的快速发展，国外转bar或pat基因的作物和食品的大量进入我国，转bar基因的食品检测技术是转基因食品安全性评价的重要技术平台，其研究具有重要的意义。

开展转基因外源蛋白的检测，主要的方法有即Western杂交、酶联免疫吸附法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA)等，这些方法都依赖特异性高、纯度高、效价高的蛋白抗体。本发明针对bar/pat基因表达蛋白检测设计的抗PAT蛋白单克隆抗体，该单抗具有高特异性、与其他转基因材料或表达蛋白无交叉反应，效价高，达到10⁷以上。而单抗本身具有成本低，比多抗更敏感、精确、稳定，便于人为处理和质量控制，并可大量生产等优点，该单抗可用于快速检测植物、食品等农产品的转基因成分，及对公共卫生应急事件的检测，为抗除草剂转基因产品的检测提供技术支撑。 

发明内容

本发明的目的是提供一种bar/pat蛋白单克隆抗体及分泌改单克隆抗体的杂交瘤细胞株。 

本发明保护一种分泌bar/pat蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为4C2，已于2012年7月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏号为CGMCC No.6341 

本发明还保护所述杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。

所述单克隆抗体在辅助鉴定转bar基因植物及其产品中的应用也属于本发明的保护范围。 

所述单克隆抗体在辅助转基因植株培育中（玉米、大豆、水稻、棉花等）的筛选鉴定的应用也属于本发明的保护范围。所述植物体可为转基因初世代材料。 

本发明还保护所述单克隆抗体在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒功能为如下：（a）辅助鉴定抗除草剂转基因植物； 

（b）辅助鉴定待测转基因植株是否为抗甘膦草除草剂植株；

（c）辅助鉴定食品、饲料或其他加工产品原料中是否含有转bar/pat基因的转基因植物成分。

本发明还保护含有所述单克隆抗体的试剂盒；所述试剂盒功能如下 

（a）辅助鉴定抗除草剂转基因植物；

（b）辅助鉴定待测转基因植株是否为抗甘膦草除草剂植株；

（c）辅助鉴定食品、饲料或其他加工产品原料中是否含有转bar/pat基因的转基因植物成分。

所述植物具体可为水稻、大豆、玉米、烟草、苜蓿、棉花等。 

所述待测外源蛋白为bar或pat基因的表达蛋白。 

本发明提供的单克隆抗体用于植物中外源PAT蛋白检测，具有特异性好，效价高、广谱性等优点。本发明研制的抗PAT蛋白单克隆抗体，可用于研制转基因bar/pat的免疫学诊断试剂，如酶联免疫诊断试剂，胶体金免疫试纸条，抗体芯片等。 

本发明的积极效果在于：可用于快速检测植物、食品等农产品的转基因成分，及对公共卫生应急事件的检测，为抗除草剂转基因产品的检测提供技术支撑。 

本发明通过小鼠腹腔注射单抗细胞株，即可获得大量的单克隆抗体，可直接用于转基因植株的抗除草剂标记筛选，对今后转基因植物研发过程的阳性筛选和转基因食品安全评价具有很大的开发潜力。 

附图说明

图1 SDS电泳分析PAT蛋白表达  M为蛋白质分子量标准  1为 300nm洗脱峰 2为200nm洗脱峰 3为100nm洗脱峰 4为10nm洗脱峰，5为穿透峰。 

图2 纯化单抗的SDS-PAGE电泳图  1,2 为该细胞株表达的抗体蛋白，3为阴性细胞株；M为蛋白质分子量标准。 

图3 利用该单抗进行转bar基因棉花Western blot检测   1为阴性细胞株对照； 2为转bar基因棉花总蛋白；3为非转基因棉花总蛋白 4 为转EPSPS基因玉米种子总蛋白。 

图4 该单抗在Elisa检测特异性的结果。 

图5 该单克隆抗体在检测不同转Bar成分含量的检测灵敏度结果。 

图6 试纸条检测转基因植物中PAT蛋白 1为阴性水稻 2为转bar基因水稻。 

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下列实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂商店购买得的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复，结果取平均值。 

实施例中所用的植物材料样品均来自农业部转基因成分检测中心(长春)标准阳性样品库。配制方法参考农业部178号公告-8-2012《转基因植物及其产品成分检测：基体标准物质制备技术规范》每1升包被缓冲液按照如下方法配制：将碳酸钠1.59g、碳酸氢钠2.93g和叠氮化钠0.2g溶于去离子水，定容至1L；包被缓冲液的PH值为9.6。 

每1升洗涤缓冲液按照如下方法配制：将氯化钠8.0g、磷酸二氢钾0.2g、磷酸氢二钠1.15g、氯化钾0.2g、吐温200.5ml和叠氮化钠0.2g溶于去离子水中，定容至1L;洗涤缓冲液的PH值为7.4。 

每1升磷酸盐缓冲液（PBS）按照如下方法配制：将氯化钠8.0g、磷酸二氢钾0.2g、磷酸氢二钠1.15g、氯化钾0.2g和叠氮化钠0.2g溶于去离子水中，定容至1L;缓冲液的PH值为7.4。 

HEPES buffer蛋白抽提缓冲液：100mM HEPES，pH 7.5；5mM EDTA，5mM HEPES buffer EGTA；10mM Na3V04；l0mM NaF；5％Glycerol；2％2-ME。 

封闭液：溶于磷酸盐缓冲液中的1%BSA。 

底物缓冲液（磷酸盐-柠檬酸缓冲液）： NaHPO4 18.42g，柠檬酸5.10g，ddH2O定容至1L，PH 5.0。 

TMB储存液： 1gTMB 溶于100ml DMF。 

底物显色工作液： ELISA 底物缓冲液100ml + 100μl TMB储存液+5μl 预冷去离子水（用之前加）。 

一、抗原的表达和制备

1.原核表达的bar基因片段合成

根据Genebank公布的Bar基因序列，并使用“clustal”软件对Bar基因核苷酸序列（552bp），进行核苷酸和氨基酸序列(183aa)比对。在氨基酸序列不变的情况下，利用http://www.jcat.de/提供的信息进行密码子优化，获得更适合在大肠杆菌中表达的基因序列，核酸序列见说明书核苷酸和氨基酸序列表。

表达载体的构建

　　将上述优化核酸序列通过全基因合成，获得的567bp的bar基因片段克隆至pET-28a载体，构建重组质粒pET-Bar。质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）后，筛选阳性克隆。挑取含pET-Bar质粒的单克隆菌落，接种于100ml含有氨苄青霉素的 LB培养基(用LB(Amp⁺)表示)中，37℃震荡培养过夜。次日用LB(Amp⁺)稀释至1000ml，37℃培养至OD₆₀₀＝1左右，加IPTG至终浓度为1mM。37℃继续培养6小时。4℃，5,000rpm离心10分钟，收集沉淀并用PBS洗涤。

 3.原核表达PAT蛋白的分离

灌制10％分离胶60ml和5％浓缩胶15ml，灌胶。上样后进行SDS-PAGE凝胶电泳。电压100V，电泳6-7小时。终止电泳后，用冷0.1M KCl浸泡胶 2-3分钟，切下目的条带置透析袋内。将透析袋置于水平电泳洗脱装置内，60V 洗脱过夜。次日100V继续洗脱1小时。然后反转电极向相反方向洗脱3-5分钟。吸出透析带内液体，蔗糖包埋浓缩，PBS透析。 pGEX-1893在IPTG诱导6个小时后能稳定表达PAT融合蛋白。融合蛋白以包涵体形式存在，约占菌体总蛋白的10％。其分子量约为27kD。如图1所示。获得的纯化的PAT蛋白为本实验所用抗原。                    

二、杂交瘤细胞的获得

1.免疫小鼠

将纯化的PAT蛋白在其同体积的弗氏完全佐剂中乳化，乳化后，对8周龄balb/c雌性小鼠进行第一次免疫（腹腔注射，每只小鼠200ugPAT蛋白），2周后，进行第二次免疫，即将50mg PAT蛋白与不完全弗氏佐剂(IFA)等体积混匀，进行背部皮内多点注射（每只小鼠200ugPAT蛋白）。第二次免疫后的2周之后，进行第三次免疫，每次加强免疫后的第10天取小鼠尾血2ul，用酶联免疫吸附实验检测抗体效价。

第三次免疫1周后，进行第四次免疫，用酒精棉球消毒小白鼠尾部，把吸取的0.1ml溶于PBS的PAT蛋白，注射入小白鼠尾部静脉，注射完毕，有酒精棉消毒注射部位，以防感染。 

细胞融合、杂交瘤细胞的筛选和保藏

取免疫鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/O按细胞数量10:1 混合，（本实验脾细胞1.5×108 个，SP2/0细胞1.7×107个，融合后滴加到96孔细胞培养板上，使脾细胞数为3×105个/每孔）使两种细胞混合均匀，加入到l0mL的离心管内，DMEM基础培养液（购自ATCC，货号30-2002）补液至l0mL，混合均匀，1000r/min离心l0min，吸上清弃去；用手指轻击管底，使两种细胞充分混匀；将其置于37℃水浴中，吸取37℃预热的50% PEG3350 溶液0.6mL，沿转动的离心管壁在60s内缓慢滴入，然后37℃水浴中静止90s，立即在5min内加入10mL 37℃预热的1640 基础培养液使PEG稀释而失去促融作用。在第lmin加1mL，在第2min加4mL，随后3min 内加完剩余液体，混匀后，1000rpm离心10min，吸取上清弃去，加入DMEM 培养液，混匀，再洗一次，尽量除去剩余PEG，减少PEG 对细胞的毒性（朱立平等，2000）。然后将沉淀细胞轻悬于含20%胎牛血清的预温HAT选择培养液中，混合均匀，加入到已加有饲养细胞的96 孔细胞培养板中，每孔100μL，将培养板移至37℃，5% CO2饱和湿度温箱中培养。融合后10天进行换液培养。选择培养的第10天，10块96孔板中700孔有杂交瘤细胞生长，融合率达到70％。 

杂交瘤的筛选：融合后10 天换用HT培养液，第15天后用普通DMEM完全培养液。待杂交瘤细胞长满孔底1/4-1/3 时，于换液3-4 天后即可在无菌条件下取有克隆细胞生长孔的上清液100μL，不作稀释，利用间接ELISA 筛选方法对上清进行检测，同时用SP2/0 细胞培养上清液作阴性对照，并设阳性、阴性血清对照，测出的阳性孔及时进行克隆化和转移。 

克隆：采用液相有限稀释法进行细胞克隆：将阳性孔中的杂交瘤细胞集落吹起混匀，准确计数后进行系列稀释到lmL含10个细胞，将稀释好的细胞悬液每孔100μL加入到事先加有饲养细胞的96 孔细胞培养板中培养。适时补液或换液（如果液体蒸发不明显尽量不要补液或换液）并将克隆化剩余细胞进行转移扩大培养冻存。克隆后，选取单个细胞生长集落孔上清进行检测，从中选取1个阳性值最高的孔再进行克隆，方法同上，直至检测阳性率为100%，阳性克隆细胞及时冻存。 

获得了1株能稳定分泌抗PAT蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，将杂交瘤细胞株命名为4C2，于2012年7月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC,地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏号为CGMCC No.6341。 

三、单克隆抗体的鉴定

   1.单克隆抗体的纯化

　 取20-22克Balb/c雌性小鼠，每只腹腔注射0.5ml降殖烷(2，6，10，14- Tetramethylpen- tradecane，Janssen Chimica公司)。一周后，每只小鼠腹腔注射约2×10⁶个杂交瘤细胞。7-10天后小鼠腹部显著膨隆，收集腹水。12,000 rpm离心30秒，去除沉淀和上层油脂，收集中段液体。收集的液体用33％硫酸胺沉淀过夜。次日，10,000rpm离心4分钟，沉淀溶于去离子水，并用PBS透析。用结合缓冲液(0.1M碳酸钠缓冲液(pH 9.5)，3M NaC1或者0.05M硼酸钠缓冲液(pH9.5)，3M NaCl平衡Protein A Sepharose-4B层析柱(Pharmacia公司)。用结合缓冲液1稀释样品后通过层析柱。待流出液体的OD值为0.01时，用0.1M柠檬酸钠(pH 2.6)洗脱层析柱，收集洗脱液。用5M Tris(pH 8.8) 调节pH至7，PBS透析。纯化的抗体进行SDS-PAGE电泳，如图2所示，单克隆抗体的分子量约147kd，在还原剂的作用下，抗体分解为两个片段，其中重链50KD，轻链25KD。

单克隆抗体的效价测定

    1）包被

　  将分离纯化的PAT蛋白用包被缓冲液进行稀释，加入酶标板中（100ul/孔），PAT蛋白的包被浓度为10ug/ml；37℃孵育2h，然后用洗涤缓冲液冲洗酶标板。

将1g非转基因大豆叶片总蛋白加入10ml包被缓冲液中，在研钵中研磨，得到阴性对照液，将阴性对照加入酶标板中（100ul/孔），即为阴性对照孔；37℃孵育2h，然后用洗涤缓冲液冲洗酶标板。 

2）封闭 

   每孔加入100ul含5%脱脂奶粉的磷酸缓冲液，37℃孵育30min，然后用洗涤缓冲液冲洗酶标板。

3）每孔加入100ul上述纯化得到的单克隆抗体或其稀释液（用酶标抗体稀释缓冲液进行稀释），37℃孵育2h，然后用洗涤缓冲液冲洗酶标板。 

4）每孔加入100ul酶标二抗工作液，37℃孵育2h，然后用洗涤缓冲液冲洗酶标板。 

5）每孔加入100ul底物溶液，室温避光孵育60min后，用酶标仪测定450nm波长下的吸收值。 

将吸收值为阴性对照孔两倍以上的孔判断为阳性孔。 

杂交瘤细胞培养上清、小鼠腹水及纯化后抗体的效价见表1。 

　                     表1 单克隆抗体的效价

3. 抗体亚类的鉴定

ISO-1 Capture ELASA试剂盒购自Sigma公司。取待测杂交瘤细胞4C2上清液15ml，加等量饱和硫酸胺，混匀后4℃过夜。次日10,000rpm离心10分钟，沉淀溶于500ml去离子水。羊抗鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA和IgM 按1：1000稀释后包被96孔板，37℃作用1小时。PBS清洗，每孔加待测上清50ul，室温作用1小时。加HRP-羊抗鼠二抗，室温作用30分钟。OPD显色。CGMCC No.6341细胞株分泌的单克隆抗体为IgG1亚类。

实施例1 本发明的单抗应用之一，采用转印免疫印迹方法检测转基因植物表达PAT蛋白。

种子总蛋白的提取：转bar基因棉花、非转基因棉花、转EPSPS玉米种子各1g，采用HEPES buffer直接提取蛋白，具体方法为加入预冷的提取液1 mL，混悬后冰上静置3～4 h，4℃、12 000 r/min，离心20 min，上清液置于-80℃冰箱中备用。 

SDS-PAGE蛋白质电泳 

3. 转膜

4. 封闭及杂交

1）封闭：转膜结束后，小心取出凝胶和膜，可将凝胶再用考马斯亮蓝染色以判断转移情况。将膜放入TBST洗一次，再置于丽春红染色液中，在室温下染色5min，用双蒸水洗膜至水变清无色蛋白条带清晰。将膜放入盛有封闭液（5%的脱脂奶粉）的容器中，室温摇床封闭1h。

2）一抗孵育：根据抗体说明书以适当比例（1:1000）用5%的脱脂奶粉稀释一抗，每张膜约4ml。将封闭后的PVDF膜小心放入杂交袋内，然后加入配好的一抗溶液，，小心排除气泡，室温下摇床缓慢摇荡孵育1-3h。孵育后将膜取出，用TBST摇床洗膜3次，每次5min，以去除残留的一抗。 

3）二抗孵育：用5%的脱脂奶粉按二抗说明书比例稀释二抗（1:4000），将PVDF膜小心置于杂交袋中，每张膜加4ml二抗溶液，避免气泡产生，封好杂交带口，室温摇床孵育2h。孵育后将膜取出，用TBST摇床洗膜3次，每次5min。 

5. 曝光鉴定； 

在暗室中取出一张X光胶片，根据荧光强弱调整曝光时间，一般为1-5min。曝光后，打开暗盒取出X光胶片，显影、定影并冲洗胶片。

6. 将胶片进行扫描，用Quantity One图像分析软件分析目标条带的光密度值。图3为利用该单抗进行转bar基因的棉花Western blot检测，结果表明，该单克隆抗体能够特异识别植物中表达PAT蛋白。 

实施例2 本发明的单抗应用之二，利用该单克隆抗体，采用双抗夹心ELISA法，检测转基因材料。

实验材料的选择和蛋白提取

取不同转基因成分的转基因玉米品系， Bt176（转bar基因玉米）、Mon810（转Cry1Ab基因抗虫玉米）、GA21（转EPSPS基因玉米）、T25（转pat基因玉米）籽粒分别与非转基因玉米混合成样品材料。样品材料中转基因成分质量比分别为1%、10%、100%。分别取样品材料1g加入10ml样品预冷的抽提缓冲液1mL，并研磨。混悬后冰上静置3～4 h，4℃、12000r/min，离心20 min，上清液置于-80℃冰箱中备用。

单克隆抗体的特异性鉴定

1)兔PAT蛋白多抗制备方法如下：

选体重2.0kg 左右、雄性、健康的家兔3只，免疫前耳缘静脉采血分离血清作为阴性对照，-80℃保存备用。免疫程序如下：首免，抗原与等量弗氏完全佐剂充分乳化后，皮下多点注射，1mg/只。二免（第15日），用加弗氏不完全佐剂的抗原进行免疫，部位为双后脚掌，500μg/只。三免（第30日），剂量同上，免疫部位为肿大的腘淋巴结。加强免疫（第37 日），不加佐剂，剂量同上。加强免疫一周后心脏采血并分离血清，用间接ELISA检测抗体水平。效价为1:32000，心脏采血，分离血清，加入0.01%的叠氮钠，过滤除菌，-80℃保存备用。

辛酸－硫酸铵法提纯兔抗bar基因蛋白IgG 高免血清，将血清3000rpm 离心 30min，弃沉淀；按1:2 的比例将离心后的血清与醋酸盐缓冲液（0.06M，pH=5.0）混合，用0.1M HCl 调节pH值至4.5。4℃下边搅拌边加入辛酸（每mL 血清加入75μl辛酸），搅拌30min，4℃静止2h，12000rpm 离心 30min，弃沉淀；上清液用1M NaOH调pH值至7.4，边搅拌边加入4℃ 放置的饱和(NH₄)₂SO₄，使其浓度达45％，4℃静置1h 以上；4℃12000rpm离心30min 弃上清，沉淀用少量PBS(0.01M，pH=7.4)溶解，在0.01M，pH=7.4 PBS 溶液中4℃透析过夜，期间换液3-5 次，5％BaCl2 检测透析液中 SO42-存留情况；4℃ 12000rpm 离心30min，吸取上清于-20℃保存。将粗纯物进一步用亲和层析法进行纯化，步骤如下：平衡：加起始缓冲液平衡柱床至进入与洗出液pH 值相同；上样：样品经滤膜滤过，取5mL 上柱，轻轻振荡5min，竖直放置。待所有悬浮物沉淀后，吸出上清；洗脱：加起始缓冲液5mL，轻轻振荡5min，竖直放置。待所有悬浮物沉淀后，吸出上清。反复操作3次。加洗脱缓冲液3mL，轻轻振荡5min，竖直放置。待所有悬浮物沉淀后，吸出上清。反复操作2次。收集洗脱液，每毫升洗脱液加70μL中和缓冲液。 

提纯前和提纯后的兔抗bar基因蛋白 IgG 高免血清纯度鉴定采用普通的聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDS-PAGE），并用测定抗体浓度。 

2)兔抗PPV IgG 与McAb最佳工作浓度的确定 

用方阵试验确定兔抗bar基因蛋白多抗与McAb 最佳工作浓度。单抗双夹心ELISA 的一般流程：兔抗bar基因IgG 包被-洗板-封闭-洗板-加样-洗板-加McAb-洗板-加酶标二抗-洗板-显色-终止-判定结果。具体步骤如下：包被用包被液将兔抗bar基因 1gG 作1: 100、1: 200、 1: 400、 1: 800、1: 1600、 1: 3200、 1: 6400 稀释，100μL/孔，每个稀释度一行，37℃包被2h 后或4℃过夜；弃掉孔内液体，用洗涤液洗涤3 次，5min/次，拍干；封闭用3%BSA作封闭剂，100μL /孔，并去除各孔内可能产生的气泡，37℃封闭3h，同上洗涤三次，拍干；加样，100μL/孔，同时设PBS 空白对照，37℃作用40min，同上洗涤三次，拍干；加McAb 用稀释液将McAb 作1:25、1:50、1: 100、1: 200、 1: 400、 1: 800、 1: 1600 稀释，加入酶标板中，100μL/孔，每个稀释度作两列，同时设PBS 空白对照，37℃作用40min，同上洗涤三次，拍干；加酶标二抗加入1: 5000 稀释的HRP-羊抗鼠IgG，100μL /孔，37℃作用40min，同上洗涤三次，拍干；显色与终止，加入新配制的TMB 底物显色液100μL /孔，室温避光显色10-15min，加入终止液（2M H2SO4 溶液），50μL/孔，在酶标仪上读取OD450nm。以阳性孔OD 值接近1，P/N 值最大时，兔抗PPV IgG 和McAb 的最大稀释度为其最佳工作浓度。确定的兔抗PPV IgG包被浓度为1:3200；单抗稀释倍数为1:800。

双抗夹心Elisa检测该单抗对于转基因植株中PAT蛋白的特异性

分别将样本液Bt176、Mon810、GA21和T25（1%、10%、100%）作为待测样本液进行如下实验：提取的植物蛋白（包括叶片和种子的提取液）,每孔100μL加于微量反应板，4℃过夜包被，洗涤缓冲液洗涤后，以每孔100μL 加入3% BSA封闭液，37℃封闭3h，PBST 洗涤，杂交瘤细胞培养上清，每孔100μL 加于微量反应板，SP2/0 细胞培养上清液作为阴性对照。37℃作用60min，洗涤，加入酶标二抗，37℃作用60min，洗涤，加入新配制的TMB 底物显色液每100μL，室温避光显色10-15min，2mo1/L H₂SO₄；每孔50μL 终止反应，酶标检测仪测定OD450nm 各孔的吸收值。结果见图4。

上述结果说明，制备获得的单抗与非转bar基因植物不发生交叉反应，对转bar基因植物具有较强的特异性。该单抗仅对PAT蛋白有特异性反应，而与Bt蛋白、EPSP无特异性反应，说明用这单抗具有检测bar/PAT蛋白良好的特异性。 

单克隆抗体的灵敏度鉴定

样本制备：将Bt176（bar基因阳性材料），与其非转基因玉米亲本籽粒，按照质量比进行混合，制备转基因成分分别为100%、10%、5%、1%、0.1%、0.01%、0%的待测样品。选用Mon810（未含有bar基因的转基因玉米品系）为阴性对照，其与非转基因玉米的混合比例同上。

采用HEPES buffer直接提取蛋白，具体方法为加入预冷的提取液1 mL，混悬后冰上静置3～4 h，4℃、12 000 r/min，离心20 min，上清液置于-80℃冰箱中备用。 

分别将将含有10%，5%，1%，0.1%，0.01%，0.001%、0%的转bar基因成分的种子提取植物蛋白提取液,稀释浓度为10μg/mL，作物样本液，进行Elisa检测实验（步骤同特异性检测实验），结果见图5。该实验结果表明利用本发明获得的单克隆抗体可以检测限达到0.1%，完全能够实现目前国内外对转基因成分含量检测标准的要求。     

实施例3  本发明单抗的应用之三，采免疫层析法对植物源加工食品、饲料中的转基因成分半定量检测 。

1.胶体金标记bar基因蛋白单克隆抗体的制备 

采用改良的柠檬酸三钠还原法,其过程为:在搅拌条件下, 98 mL去离子水加热至65℃后,加入1.5 mL 1%的氯金酸,继续加热,待温度上升至95℃时,加入2mL 1%的柠檬酸三钠,当溶液呈酒红色时停止加热,冷却后, 4℃避光保存。

取胶体金溶液，pH7.2～7.5，金颗粒大小20～30nm。将bar基因蛋白单克隆抗体0. 5mg/mL1ul加入胶体200ul金溶液中，混合均匀，即得金标鼠抗蛋白单克隆抗体溶液。经纯化及浓缩，用稀释液稀释4倍后备用。 

2.试纸条的组装 

整个测试条由2 层吸水玻璃纤维，1 层硝酸纤维素膜，吸水滤纸及白色塑料垫板组成。将吸水纸、包被NC膜(包被有单克隆抗体和羊抗兔IgG) 、喷涂玻璃纤维(金标抗体)从上到下依次固定于白色塑料板上。

裁取40 mm ×5 mm 的吸水纸, 将吸水纸、包被NC 膜、喷涂玻璃纤维膜、样品垫从上到下依次固定在带有粘合剂的PVC背板上，切成5mm宽的试纸条，室温干燥备用, 即成测试条。将做好的测试条与干燥剂一起装入铝箔袋内, 密封贮存。 

 3.测试样品检测 

将样品磨碎并加水或提取液提取，溶解获取蛋白。检测时，先将样品垫浸在已提取好的蛋白样品溶液中，样品溶液在毛细吸收作用下由样品垫沿NC膜向吸收垫流动。样品溶液中的特定蛋白在流经结合垫时首先与其中胶体金标记的抗体发生抗原-抗体的特异性的结合作用，流经检测带时抗原-抗体复合物被固定在检测带上的捕获抗体结合，聚集形成肉眼可见的金标条带，显示检测结果为阳性。过量的金标抗体继续流动被固定在控制带上的第二抗体结合聚集形成条带，显示检测的结果有效。

图6为应用本发明的单抗，组装试纸条，并进行的转bar基因水稻和阴性水稻的检测结果。表明该单抗可用于免疫层析法检测转bar基因植物材料。 

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例子。显然，本发明不限于以上实施例子，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。  

    SEQUENCE LISTING

<110>  吉林省农业科学院，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司； 

<120>  一种bar/PAT蛋白单克隆抗体及其制备方法和应用

<130>  2012

<160>  1     

<170>  PatentIn version 3.5

<210>  1

<211>  567

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  1

cgcggatcca tgtctccgga acgtcgtccg gctgacatcc gtcgtgctac cgaagctgac       60

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ccgtggctgg ttgctgaagt tgacggtgaa gttgctggta tcgcttacgc tggtccgtgg      240

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     SEQUENCE LISTING

 

<110>  吉林省农业科学院，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；

<120>  一种bar/PAT蛋白单克隆抗体及其制备方法和应用

 

<130>  2012

 

<160>  1    

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  567

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

cgcggatcca tgtctccgga acgtcgtccg gctgacatcc gtcgtgctac cgaagctgac       60

 

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Claims (12)

1.一种分泌抗bar/PAT蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞，所述杂交瘤细胞保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心，保藏号为CGMCC No.6341。

2.由权利要求1所述的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体。

3.权利要求1所述的杂交瘤细胞分泌的抗bar/PAT蛋白单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：

基因序列的优化和基因合成

根据Genebank的Bar基因序列，对Bar基因核苷酸序列进行核苷酸和氨基酸序列比对；在氨基酸序列不变的情况下进行密码子优化，使得基因序列适合于大肠杆菌表达；

2）原核表达载体构建

将合成的基因片段连接入pET-28a载体，连接后的产物转化至DH5a感受态细胞中；筛选阳性克隆进行测序鉴定；连入外源片段的质粒并命名为pET-Bar；

3）PAT蛋白表达和分离纯化

将pET-Bar质粒转化到BL21（DE3）感受态细胞中；用终浓度为1mM的IPTG诱导已BL21（DE3）细胞中的Bar基因表达；确定目的蛋白的表达，并分离纯化；

4）单抗制备

用纯化bar/PAT蛋白腹腔注射BALB/C小白鼠，用福氏完全佐剂；经15天后进行二次相同剂量免疫，用福氏不完全佐剂；再15天后进行三次免疫，用加倍剂量的纯蛋白不加佐剂；3天后取脾细胞进行融合；

　  将免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)按比例在无血清的DMEM培养基中混匀，离心去除培养基，用50％PEG3350作为融合剂融合，用DMEM培养基终止融合后，离心，沉淀用HAT培养基悬浮，分装到96孔含有饲养细胞的细胞板中，37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养；细胞培养箱中培养5天后，用HAT培养基换液一次，第10天用HT培养基换液，等到融合细胞覆盖孔底10％-50％时，常规间接ELISA方法筛选阳性孔；

筛选出的特异性强阳性孔用常规的有限稀释法克隆，获得单抗细胞株DG-4C2；细胞株DG-4C2进一步扩大培养，用于制备单抗腹水和液氮冻存；

取8周龄左右BALB/C小鼠，腹腔注射0.3-0.5ml降植烷，7-10天后腹腔注入5-10×10⁵个杂交瘤细胞，小鼠腹部明显膨大时采取腹水，离心收集上清液，即为单克隆抗体腹水；辛酸-硫酸铵盐析法纯化单克隆抗体，-70℃保存；即为可专一识别PAT蛋白的抗体。

4.权利要求2所述单克隆抗体在抗除草剂转基因植物检测中的用途。

5.权利要求2所述单克隆抗体在抗以L-phosphiothricin为活性成分的除草剂的转基因植物检测中的用途。

6.权利要求2所述单克隆抗体在转基因食品检测中的用途。

7.权利要求2所述单克隆抗体在抗以L-phosphiothricin为活性成分的除草剂的转基因食品检测中的用途。

8.权利要求2所述单克隆抗体在检测转bar/PAT基因植物中的用途。

9.权利要求2所述单克隆抗体在检测转bar/PAT基因食品中的用途。

10.一种转基因检测试剂盒，其特征在于：包含权利要求2所述的单克隆抗体。

11.如权利要求10所述的检测试剂盒，所述转基因为转bar/PAT基因。

12.一种ELISA检测试剂盒，其特征在于：包含权利要求2所述的单克隆抗体。

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