CN107586337B - 一种小鼠抗人kiaa0100蛋白单克隆抗体的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种采用淋巴细胞杂交瘤技术制备小鼠抗人KIAA0100蛋白单克隆抗体的方法，这个抗体为今后检测人KIAA0100蛋白的表达，研究人KIAA0100蛋白的结构和功能奠定了基础。我们使用本发明中所制备的抗体，采用western blot分析方法检测了U937细胞中人KIAA0100蛋白的表达；采用免疫细胞化学分析方法在世界上首次明确了人KIAA0100蛋白在U937细胞中的亚细胞定位。结果显示：人KIAA0100基因在U937细胞中有两个分子量分别为254kDa和＜250kDa的蛋白产物；在一些U937细胞中,人KIAA0100蛋白主要定位在细胞膜上，在另一些U937细胞中,人KIAA0100蛋白定位在细胞膜和细胞质。综上所述，本发明制备的小鼠抗人KIAA0100蛋白单克隆抗体能够高效、特异地识别人KIAA0100蛋白。

Description

一种小鼠抗人KIAA0100蛋白单克隆抗体的制备方法

技术领域

本发明涉及一种小鼠抗人KIAA0100蛋白单克隆抗体的制备方法。

背景技术

使用淋巴细胞杂交瘤技术来制备单克隆抗体技术是由Milstein和Kohler在1975年首先创立的，目前采用该技术制备的单克隆抗体已经被广泛地应用于生物学和疾病的诊断和治疗等领域。单克隆抗体可以用来检测抗原蛋白的表达，分析抗原蛋白的结构、检测抗原抗体之间的结构关系等。

淋巴细胞杂交瘤技术的基本原理是将骨髓瘤细胞和经抗原诱导产生的能分泌特定抗体的B细胞利用聚乙二醇等细胞融合剂(或者电融合、激光融合)在体外进行细胞融合，筛选并建立能稳定分泌特定单克隆抗体的杂交瘤细胞株。这样制备出的杂交瘤细胞同时具有两种亲本细胞的特性，即肿瘤细胞的无限增殖能力及淋巴细胞分泌特异性抗体的能力。与多克隆抗体相比，单克隆抗体具有纯度高、效价高、均质性好、重复性好、便于大量生产和进行质量控制等明显优势。

人KIAA0100基因是KIAA基因家族的一员，KIAA基因家族是由Kazusa基因研究中心主要从急性髓系白血病细胞系KG-1cDNA文库中获得的一大类编码大蛋白的基因。目前，人KIAA0100基因的功能尚未明确。因为缺乏高效、特异的抗体，无法进行人KIAA0100蛋白表达的研究，无法明确人KIAA0100蛋白的亚细胞定位，也阻碍了其生物学功能的研究。

发明内容

针对上述存在的问题，本发明提供了一种采用淋巴细胞杂交瘤技术制备高效、特异的小鼠抗人KIAA0100蛋白单克隆抗体的方法,为检测KIAA0100蛋白的表达，研究KIAA0100蛋白的结构和功能奠定基础。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种小鼠抗人KIAA0100蛋白单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：

步骤(1)：使用生物信息学软件Optimum^TMCodon(http://www.genscript.com/codon_opt.html)对人KIAA0100蛋白的蛋白片段(1557-2234)进行分析，将其对应的核苷酸序列中的大肠杆菌稀有密码子进行优化，在优化后的核苷酸序列的3′端加上6×组氨酸(histidine，His)标签，人工合成核苷酸序列，克隆入pET30a载体中，构建pET30a-KIAA0100(1557-2234)质粒表达载体；

步骤(2)：pET30a-KIAA0100(1557-2234)质粒在大肠杆菌中经诱导表达，获得重组人KIAA0100蛋白片段(1557-2234)后,使用Ni²⁺-IDA亲和层析柱纯化；

步骤(3)：使用经浓缩和复性后的重组人KIAA0100蛋白片段(1557-2234)作为免疫原免疫5只健康BALB/c小鼠(雌性，6-8周龄)，取成功免疫后的小鼠脾细胞，与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合，制备杂交瘤细胞株，以未免疫的、健康BALB/c小鼠(雌性，6-8周龄)的血清做为阴性对照，使用间接酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbentassay，ELISA)筛选杂交瘤细胞株，使用有限稀释法对筛选出的阳性杂交瘤细胞株进行2轮亚克隆，将ELISA检测阳性的杂交瘤细胞进行扩大培养，最终得到一个稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株；

步骤(4)：使用SBA小鼠单克隆抗体分析试剂盒(SouthernBiotech，伯明翰,美国)检测小鼠抗人KIAA0100蛋白单克隆抗体的亚型，使用western blot分析和免疫细胞化学分析对小鼠抗人KIAA0100蛋白单克隆抗体进行鉴定；

步骤(5)：选择3只健康BALB/c雌性小鼠(6-8周龄)，每只小鼠腹腔注射0.5ml的姥鲛烷，14天后，腹腔注射杂交瘤细胞，在注射前1天使用新鲜培养基对处于对数生长期的杂交瘤细胞进行换液，注射当天，混匀杂交瘤细胞制成细胞悬液，计数后，将细胞悬液加入15ml离心管中，室温200×g离心5分钟，弃上清后用磷酸盐缓冲液(phosphate buffersaline，PBS)(NaCl 137mM，KCl 2.7mM，Na₂HPO₄10mM，KH₂PO₄ 2mM，PH 7.2-7.4)悬浮细胞，使细胞浓度为5×10⁶个/ml，每只小鼠注射1ml；观察小鼠的健康状况及腹水产生情况，10天－14天后收集腹水，收集的腹水使用蛋白A亲和层析柱纯化。

优选的是，重组蛋白抗原的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。

上述任一方案优选的是，密码子优化后的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。

上述任一方案优选的是，人KIAA0100蛋白的蛋白片段为1557位氨基酸-2234位氨基酸蛋白片段，pET30a-KIAA0100表达载体为pET30a-KIAA0100(1557-2234)表达载体。

上述任一方案优选的是，pET30a-KIAA0100(1557-2234)表达载体在大肠杆菌BL21(DE3)中经异丙基硫代-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(sopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG)诱导表达，使用Ni²⁺-IDA亲和层析柱对获得的重组人KIAA0100蛋白片段(1557-2234)进行纯化。

上述任一方案优选的是，pET30a-KIAA0100(1557-2234)重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，使用含卡那霉素的LB固体培养基筛选阳性克隆，并进行PCR验证，提取阳性克隆质粒后进行酶切和测序鉴定。

上述任一方案优选的是，步骤(2)中具体纯化方法为：取1支15ml离心管，将表达正常的菌种以0.1％比例接种于含100μg/ml卡那霉素的4mlLB培养液中，37℃、190rpm恒温震荡培养16小时至18小时后，按1％比例接种至400ml含100μg/ml卡那霉素的TB培养液中，37℃、190rpm恒温震荡培养至OD_600nm＝1.2时，加入终浓度为0.5mM IPTG,15℃、190rpm恒温震荡培养16小时后，用500ml离心杯收集菌体，8,000rpm，离心5分钟后，弃上清，加入120ml缓冲液A(50mM Tris-Hcl,300mM Nacl,5％甘油,PH8.0)重悬后，加入终浓度为0.1mg/ml的溶菌酶、0.1ng/ml的核酸酶和2mM的二硫苏糖醇,置于冰水容器中，超声破菌30分钟(超声：3秒，间隔：6秒，功率：600w)后，4℃，13，000rpm离心30分钟后收集上清和沉淀，将得到的上清经Ni²⁺-IDA亲和层析柱纯化，将纯化后的产物进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分析；将得到的沉淀用洗涤缓冲液(100mMTris-Hcl,300mM Nacl,10mM乙二胺四乙酸,2％聚乙二醇辛基苯基醚,2mM二硫苏糖醇,PH8.0)洗涤后，用含8M尿素的洗脱缓冲液(8M尿素，5mM Tris-Hcl,300mM Nacl,PH8.0)溶解包涵体，经Ni²⁺-IDA亲和层析柱纯化，将纯化后的产物进行SDS-PAGE分析和western blot分析。

上述任一方案优选的是，步骤(3)中重组人KIAA0100蛋白片段经浓缩和复性的方法为：将经洗脱缓冲液(8M尿素，5mM Tris-Hcl,150mM Nacl,500mM咪唑,PH8.0)洗脱的蛋白产物用10kDa超滤管浓缩后，产物经6,000rpm离心20分钟，收集上清，在上清中加入0.5％月桂酰肌氨酸,用3.5kDa透析袋透析到1L透析缓冲液(1×PBS,0.5％月桂酰肌氨酸,PH7.4)中，4℃透析3小时，然后将重组蛋白再换到1L新的透析缓冲液中，4℃继续透析3小时，收集蛋白，用0.22μm过滤器过滤蛋白。

上述任一方案优选的是，步骤(4)中使用western blot分析对获得的小鼠抗人KIAA0100蛋白单克隆抗体进行鉴定的方法为：将U937细胞总蛋白经SDS-PAGE分离后转移至硝酸纤维素膜上，以小鼠抗人KIAA0100蛋白单克隆抗体(1μg/ml)一抗，以辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase，HRP)标记的山羊抗小鼠IgG(Genscript，南京,中国)为二抗(稀释度：1:5000)，使用western blot方法检测。

上述任一方案优选的是，步骤(4)中免疫细胞化学分析对获得的小鼠抗人KIAA0100蛋白单克隆抗体进行鉴定方法为：收集对数生长期U937细胞，使用PBS洗涤2次，再用PBS重悬，用移液器将细胞悬液滴加在硅化载玻片上，用丙酮固定U937细胞，以小鼠抗人KIAA0100蛋白单克隆抗体(1μg/ml)为一抗，使用小鼠IgG两步法免疫组化检测试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司，武汉，中国)进行免疫细胞化学分析。

本发明的有益效果是：本发明提供了一种小鼠抗人KIAA0100蛋白单克隆抗体的制备方法，采用淋巴细胞杂交瘤技术制备高效、特异的小鼠抗人KIAA0100蛋白单克隆抗体,为检测KIAA0100蛋白的表达，研究KIAA0100蛋白的结构和功能奠定了基础。本发明采用western blot技术检测人U937细胞中人KIAA0100蛋白的表达，证实了人KIAA0100蛋白的分子量为254kDa(与生物信息学预测值相符合)，同时在U937细胞中检测出另外一个＜250kDa的蛋白条带，证实了人KIAA0100基因在U937细胞中有两个分子量分别为254kDa和＜250kDa蛋白产物。另外，我们采用免疫细胞化学方法在世界上首次明确了人KIAA0100蛋白在U937细胞中的亚细胞定位，实验结果显示：在一些U937细胞中,人KIAA0100蛋白主要定位在细胞膜上，在另一些U937细胞中,人KIAA0100蛋白定位在细胞膜和细胞质。本发明填补了抗人KIAA0100蛋白单克隆抗体制备技术的空白。为大规模生产小鼠抗人KIAA0100蛋白单克隆抗体，研究KIAA0100蛋白的结构和功能奠定了基础。

附图说明

图1：pET30a-KIAA0100(1557-2234)重组质粒的鉴定结果：(A)重组质粒的PCR验证结果，其中M:DNAmarker；Lane1-Lane8:随机挑取的单克隆菌落中的重组质粒PCR产物，1,2,3,4,6泳道的单克隆菌落重组质粒PCR产物在2109bp附近出现明显条带；(B)为重组质粒的酶切鉴定结果，M:DNAmarker；Lane1:未酶切的重组质粒；Lane2:重组质粒经MluI+HindⅢ酶切:酶切产物的大小为2895bp和4419bp。

图2：重组蛋白的表达及使用Ni²⁺-IDA亲和层析柱纯化的SDS-PAGE分析结果；M：marker；1：包涵体洗液洗涤后的沉淀；2：包涵体洗液洗涤后的上清；3：尿素溶解后的沉淀；4：尿素溶解后的上清；5：流出液；6：尿素+20mM咪唑洗脱；7：尿素+50mM咪唑洗脱；8：尿素+500mM咪唑洗脱；9洗脱后的镍树脂。

图3：重组蛋白纯度和浓度测定，(A)SDS-PAGE方法测定重组蛋白纯度的结果：M,蛋白分子量marker；lane 1，5μg牛血清白蛋白；lane 2,5.8 μg重组蛋白。(B)聚氰基丙烯酸正丁酯(bicinchonininc acid，BCA)法检测重组蛋白浓度的标准曲线。

图4：Western blot方法鉴定重组蛋白分子量；M：蛋白marker；1：重组蛋白。

图5：间接ELISA法检测第3次免疫后5只小鼠的抗血清效价。

图6：间接ELISA法测定小鼠抗人KIAA0100蛋白单克隆抗体效价。

图7：小鼠抗人KIAA0100蛋白单克隆抗体检测能力的western blot方法鉴定，1：U937总蛋白。

图8：小鼠抗人KIAA0100蛋白单克隆抗体检测能力的免疫细胞化学方法鉴定，(A)在一些U937细胞中,人KIAA0100蛋白定位在细胞膜上，在另一些U937细胞中,人KIAA0100蛋白定位在细胞膜和细胞质中；(B)在一些较大的U937细胞中，人KIAA0100蛋白定位在细胞膜和毗连细胞膜的细胞质中；(C)阴性对照。

具体实施方式

实施例一：

1.实验方法：

1.1重组蛋白抗原的表达：

1.1.1原核表达密码子优化：

使用生物信息学软件Optimum^TMCodon(http://www.genscript.com/codon_opt.html)对人KIAA0100蛋白片段(1557-2234)进行原核表达密码子优化。

重组蛋白抗原的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。

1.1.2pET30a-KIAA0100(1557-2234)重组质粒的构建和鉴定：

表达重组蛋白抗原的核苷酸序列交南京金斯瑞生物科技有限公司进行序列合成后，克隆入pET30a载体的NdeI和HindⅢ酶切位点中，构建pET30a-KIAA0100(1557-2234)重组质粒。将该重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，使用含100μg/ml卡那霉素的LB固体培养基筛选阳性克隆，并进行PCR验证。PCR引物序列：上游引物：AACTTTAAGAAGGAGATATACATATGTCAGATCAGCTATGTGGGATTGCTGCATGCCAA；下游引物：GGTGCTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTTCATTAGTGGTGATGGTGATGATGACGACGACCG，提取阳性克隆质粒后进行酶切和测序鉴定。

1.1.3重组蛋白的表达及纯化：

取1支15ml离心管，将表达正常的菌种以0.1％比例接种于含100μg/ml卡那霉素的4mlLB培养液中，37℃、190rpm恒温震荡过夜培养16小时至18小时后，按1％比例将经过夜培养的菌液接种至400ml含100μg/ml卡那霉素的TB培养液中，37℃、190rpm恒温震荡培养至OD_600nm＝1.2时，加入终浓度为0.5mM的IPTG,15℃、190rpm恒温震荡培养16小时后，用500ml离心杯收集菌体，8,000rpm，离心5分钟后，弃上清，加入120ml缓冲液A(50mM Tris-Hcl,300mM Nacl,5％甘油,PH:8.0)重悬后，加入终浓度为0.1mg/ml的溶菌酶、0.1ng/ml的核酸酶和2mM的二硫苏糖醇,置于冰水容器中，超声破菌30分钟(超声：3秒，间隔：6秒，功率：600w)后，4℃，13，000rpm离心30分钟后收集上清和沉淀，将得到的上清经Ni²⁺-IDA亲和层析柱纯化，将纯化后的产物进行SDS-PAGE分析；将得到的沉淀用洗涤缓冲液(100mMTris-Hcl,300mM Nacl,10mM乙二胺四乙酸,2％聚乙二醇辛基苯基醚,2mM二硫苏糖醇,PH8.0)洗涤后，用含8M尿素的洗脱缓冲液(8M尿素，5mM Tris-Hcl,300mM Nacl,PH8.0)溶解包涵体，经Ni²⁺-IDA亲和层析柱纯化，将纯化后的产物进行SDS-PAGE分析和western blot分析。

1.1.4重组蛋白的浓缩及复性

将经洗脱缓冲液(8M尿素，5mM Tris-Hcl,150mM Nacl,500mM咪唑,PH8.0)洗脱的蛋白产物用10kDa超滤管浓缩后，产物经6,000rpm离心20分钟，收集上清，在上清中加入0.5％月桂酰肌氨酸,用3.5kDa透析袋透析到1L透析缓冲液(1×PBS,0.5％月桂酰肌氨酸,PH7.4)中，4℃透析3小时，然后将重组蛋白再换到1L新的透析缓冲液中，4℃继续透析3小时，收集蛋白，用0.22μm过滤器过滤蛋白。

1.1.5BCA法检测重组蛋白浓度：

将浓度为2mg/ml的标准蛋白牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)用超纯水分别稀释为0.125mg/ml、0.25mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、1.5mg/ml，取1支15ml离心管，按50:1的比例分别加入A液和B液配工作液混匀，将待测蛋白使用超纯水稀释10倍，各取25μl不同浓度的标准蛋白BSA及待测蛋白加入到96孔板中，以等体积超纯水做空白对照，每孔中加200μl工作液，在震荡仪上震荡30秒后放入37℃恒温箱中反应30分钟后取出放置室温，使用酶标仪测OD_560nm值。

1.1.6SDS-PAGE法检测重组蛋白纯度：

将复性后重组蛋白样品加入5×样品缓冲液中，100℃加热10分钟，立即插在冰上，4℃、7，000rpm离心5分钟，收集上清，取上清10μl进行SDS-PAGE分析，电泳结束后将凝胶放在eStain^TM2.0蛋白快速染色仪内，染色7分钟，使用Bandscan软件分析重组人KIAA0100蛋白片段(1557-2234)纯度，计算公式：目标蛋白纯度＝目标蛋白条带灰度值/目标蛋白所在泳道各个蛋白条带灰度值之和。

1.1.7westernblot方法鉴定复性后的重组蛋白：

将复性后的重组蛋白样品加入5×样品缓冲液中，100℃加热10分钟，立即插在冰上，4℃、7，000rpm离心5分钟，收集上清，取上清10μl经10％SDS-PAGE分离后转移至硝酸纤维素膜，使用小鼠抗His单克隆抗体(Genscript，南京,中国)为一抗(稀释度：1:2500)，以HRP标记的山羊抗小鼠IgG(Genscript，南京,中国)作为二抗(稀释度：1:5000)，进行western blot检测。

1.2单克隆抗体的制备：

1.2.1使用重组蛋白免疫动物：

选取5只健康6-8周龄雌性BALB/c小鼠，首次免疫是取重组蛋白溶于生理盐水中与等体积的弗氏完全佐剂混合，充分乳化后，小鼠背部分4点皮下注射，每只小鼠注射40ug重组蛋白抗原。第14天：加强免疫，取重组蛋白溶于生理盐水中与等体积的弗氏不完全佐剂混合，充分乳化后，小鼠背部分4点皮下注射，每只小鼠注射40ug重组蛋白抗原；第21天：小鼠内眦静脉采血，分离血清，间接ELISA法检测抗血清效价，第28天：加强免疫，取重组蛋白溶于生理盐水中与等体积的弗氏不完全佐剂混合，充分乳化后，小鼠背部分4点皮下注射，每只小鼠注射40ug重组蛋白抗原；第35天，小鼠内眦静脉采血，分离血清，间接ELISA法检测抗血清效价，第42天时，选取抗血清效价最高的小鼠腹腔注射100μg重组蛋白抗原；第45天：在超净台上收获脾细胞准备融合。

1.2.2获得杂交瘤细胞株：

选择抗血清抗体效价高的小鼠，最后1次加强免疫，3天后取其脾细胞，与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合，制备杂交瘤细胞株。采用间接ELISA方法筛选出阳性杂交瘤细胞株，并使用westernblot方法进行鉴定，对阳性杂交瘤细胞株用有限稀释法进行亚克隆，间接ELISA法检测抗血清效价，将检测阳性的细胞进行扩大培养，最终得到最佳的一个稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

1.2.3大量制备单克隆抗体：

选取3只健康BALB/c小鼠(雌性，6-8周龄)，每只小鼠腹腔注射0.5ml的姥鲛烷，14天后，腹腔注射杂交瘤细胞，在注射前1天使用新鲜培养基对处于对数生长期的杂交瘤细胞进行换液，注射当天，混匀杂交瘤细胞制成细胞悬液，计数后，将细胞悬液加入15ml离心管中，室温200×g离心5分钟，弃上清后用PBS悬浮细胞，使细胞浓度为5×10⁶个/ml，每只小鼠注射1ml；观察小鼠的健康状况及腹水产生情况，10天－14天后收集腹水并测定效价。收集的腹水经1500×g离心10分钟后，取上清用蛋白A亲和层析柱纯化。

1.2.4IG类及亚型鉴定：

使用SBA小鼠单克隆抗体分型试剂盒(SouthernBiotech，伯明翰,美国)，按照说明书中的操作步骤检测获得的小鼠抗人KIAA0100蛋白单克隆抗体的亚型。

1.3单克隆抗体检测能力的鉴定：

1.3.1小鼠抗人KIAA0100蛋白单克隆抗体检测能力的western blot方法鉴定：

将60ugU937细胞总蛋白经6％SDS-PAGE分离后转移至硝酸纤维素膜上(200毫安，4小时，冰浴中湿转)，硝酸纤维素膜经含10％的脱脂奶粉的TBST(Tris-base:50mM,Nacl:150mM,Tween20:0.05％，PH7.6)溶液室温封闭2小时后，将硝酸纤维素膜浸在含1μg/ml小鼠抗人KIAA0100蛋白单克隆抗体的TBST溶液(含5％的脱脂奶粉)中4℃过夜，次日取出硝酸纤维素膜，经TBST溶液振荡洗涤3次(240rpm，每次10分钟)后,将硝酸纤维素膜浸在含HRP标记的山羊抗小鼠IgG(稀释度：1:5000)的TBST溶液(含5％的脱脂奶粉)中，27℃水浴1小时45分钟后，经TBST溶液振荡洗涤3次(240rpm，每次15分钟)，TBS溶液振荡洗涤1次(240rpm，5分钟),使用增强的化学发光检测试剂盒(Thermo Fisher Scientific，沃尔瑟姆,美国)在化学发光成像系统(Syngene,剑桥，英国)中观察蛋白条带。

1.3.2小鼠抗人KIAA0100蛋白单克隆抗体检测能力的免疫细胞化学方法鉴定：

收集对数生长期U937细胞，37℃的PBS洗2次，用PBS重悬后滴在硅化载玻片上，丙酮固定20分钟，以小鼠抗人KIAA0100蛋白单克隆抗体(1μg/ml)为一抗，使用小鼠IgG两步法免疫组化检测试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司，武汉，中国)进行免疫细胞化学分析。

2结果：

2.1密码子优化后的表达重组蛋白的核苷酸序列，密码子优化后的表达重组蛋白的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。

2.1pET30a-KIAA0100(1557-2234)重组质粒的鉴定：

将pET30a-KIAA0100重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，使用含100μg/ml卡那霉素的LB固体培养基37℃培养箱培养中1小时，再将培养皿倒置过来，培养过夜，次日挑取8个单克隆菌落分别接种入2mlLB液体培养基中，37℃，250rpm振荡过夜培养，次日，收集细菌，提取质粒，进行PCR验证，结果见图1A:1,2,3,4,6泳道的单克隆菌落的PCR产物在2109bp附近出现明显条带(图1A)，与预期结果一致。进一步将从阳性单克隆菌落中提取的pET30a-KIAA0100(1557-2234)重组质粒经MluI和HindⅢ双酶切和消化后，经琼脂糖凝胶电泳，酶切产物在4419bp和2895bp处出现明显条带，大片段为经双酶切的质粒，小片段为目的片段(图1B)，与预期结果一致。取该质粒50uL送南京金斯瑞公司测序，测序结果为：序列完全正确。

2.2重组蛋白的表达及纯化：

pET30a-KIAA0100(1557-2234)重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导大量表达后，超声裂解菌体，取裂解液上清及尿素溶解后沉淀分别经Ni²⁺-IDA亲和层析柱纯化。并将纯化产物进行SDS-PAGE分析(图2)。由图2可以看出：在细菌裂解液沉淀蛋白泳道上，79kDa的位置出现一明显蛋白条带，而细菌裂解液上清泳道上，79kDa的位置的蛋白条带很弱，这说明重组人KIAA0100蛋白片段(1557-2234)主要以包涵体形式表达。

2.3重组蛋白浓度和纯度测定：

复性后的重组蛋白经10％SDS-PAGE分离后，放入eStain^TM2.0蛋白快速染色仪内染色7分钟后，检测重组人KIAA0100蛋白片段(1557R-2234M)的纯度为85％，如图3A所示。使用BCA法将浓缩和复性后的重组人KIAA0100蛋白片段(1557-2234)进行定量，重组人KIAA0100蛋白片段(1557-2234)的浓度为0.7mg/ml,标准曲线如图3B。

2.4western blot方法鉴定重组蛋白分子量：

使用小鼠抗His单克隆抗体(Genscript，南京,中国)为一抗(稀释度：1:2500)，以HRP标记的山羊抗小鼠IgG(Genscript，南京,中国)作为二抗(稀释度：1:5000)，采用western blot方法检测重组蛋白，结果显示：79kDa附近出现单一条带，与重组蛋白理论分子量相符合，如图4所示。

2.5间接ELISA法检测第3次免疫后小鼠抗血清效价：

通过小鼠内眦静脉采血，获得血清。将重组人KIAA0100蛋白稀释至4μg/ml包被板，使用PBST(含0.05％Tween20的PBS)配制5％BSA作为抗体稀释液，空白对照组用抗体稀释液代替一抗，以未免疫、健康6-8周龄雌性BALB/c小鼠的血清做为阴性对照。使用酶标仪测OD_450nm，以稀释孔OD/阴性对照OD大于等于2.1的最大稀释度为抗体效价，将抗血清效价最高的小鼠进行第4次免疫。

2.6间接ELISA法测定小鼠抗人KIAA0100蛋白单克隆抗体的效价和亚型测定：

将重组人KIAA0100蛋白稀释至4μg/ml包被板，使用PBST配制5％BSA作为抗体稀释液，空白对照组用抗体稀释液代替一抗，以未免疫、健康6-8周龄雌性BALB/c小鼠的血清做为阴性对照。使用酶标仪测OD_450nm，以稀释孔OD/阴性对照OD大于等于2.1的最大稀释度为抗体效价，如图6所示。根据所得结果，小鼠抗人KIAA0100蛋白单克隆抗体效价为1:5120000，采用SBA小鼠单克隆抗体分型试剂盒测定小鼠抗人KIAA0100蛋白单克隆抗体的亚型为IgG2a。

2.7小鼠抗人KIAA0100蛋白单克隆抗体检测能力的western blot方法鉴定：

Western blot结果显示:在254kDa(与人KIAA0100蛋白理论分子量相符合)和＜250kDa附近各出现一明显条带。说明我们制备的小鼠抗人KIAA0100蛋白单克隆抗体可以识别KIAA0100蛋白的线性抗原表位，人KIAA0100基因在U937细胞中存在两个蛋白产物，如图7所示。

2.8小鼠抗人KIAA0100蛋白单克隆抗体检测能力的免疫细胞化学方法鉴定：

免疫细胞化学结果结果显示：此抗体可以识别人KIAA0100蛋白的空间构象性抗原表位，在一些U937细胞中，人KIAA0100蛋白主要定位在细胞膜上；在另外一些U937细胞中，人KIAA0100蛋白定位在细胞膜和细胞质，如图8A所示。特别是在一些较大的U937细胞中，人KIAA0100蛋白定位在细胞膜和毗连细胞膜的细胞质中，如图8B所示。

以上对本发明实施例所提供的技术方案进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明实施例的原理以及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只适用于帮助理解本发明实施例的原理；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例，在具体实施方式以及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

重组蛋白抗原的氨基酸序列：

密码子优化后的表达重组蛋白的核苷酸序列

SEQUENCE LISTING

<110> 西安交通大学第二附属医院

<120> 一种小鼠抗人KIAA0100蛋白单克隆抗体的制备方法

<130> 1

<140> 1

<141> 2016-02-18

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 685

<212> PRT

<213> 重组蛋白抗原的氨基酸序列

<400> 1

Met Ser Asp Gln Leu Cys Gly Ile Ala Ala Cys Gln Thr Asp Asp Ile

1 5 10 15

Tyr Asn Arg Asn Cys Leu Ile Glu Leu Val Asn Cys Gln Met Val Leu

20 25 30

Arg Gly Ala Glu Thr Glu Gly Cys Val Ile Val Ser Ala Ala Lys Ala

35 40 45

Gln Leu Leu Gln Cys Gln His His Pro Ala Trp Tyr Gly Asp Thr Leu

50 55 60

Lys Gln Lys Thr Ser Trp Thr Cys Leu Leu Asp Gly Met Gln Tyr Phe

65 70 75 80

Ala Thr Thr Glu Ser Ser Pro Thr Glu Gln Asp Gly Arg Gln Leu Trp

85 90 95

Leu Glu Val Lys Asn Ile Glu Glu His Arg Gln Arg Ser Leu Asp Ser

100 105 110

Val Gln Glu Leu Met Glu Ser Gly Gln Ala Val Gly Gly Met Val Thr

115 120 125

Thr Thr Thr Asp Trp Asn Gln Pro Ala Glu Ala Gln Gln Ala Gln Gln

130 135 140

Val Gln Arg Ile Ile Ser Arg Cys Asn Cys Arg Met Tyr Tyr Ile Ser

145 150 155 160

Tyr Ser His Asp Ile Asp Pro Glu Leu Ala Thr Gln Ile Lys Pro Pro

165 170 175

Glu Val Leu Glu Asn Gln Glu Lys Glu Asp Leu Leu Lys Lys Gln Glu

180 185 190

Gly Ala Val Asp Thr Phe Thr Leu Ile His His Glu Leu Glu Ile Ser

195 200 205

Thr Asn Pro Ala Gln Tyr Ala Met Ile Leu Asp Ile Val Asn Asn Leu

210 215 220

Leu Leu His Val Glu Pro Lys Arg Lys Glu His Ser Glu Lys Lys Gln

225 230 235 240

Arg Val Arg Phe Gln Leu Glu Ile Ser Ser Asn Pro Glu Glu Gln Arg

245 250 255

Ser Ser Ile Leu His Leu Gln Glu Ala Val Arg Gln His Val Ala Gln

260 265 270

Ile Arg Gln Leu Glu Lys Gln Met Tyr Ser Ile Met Lys Ser Leu Gln

275 280 285

Asp Asp Ser Lys Asn Glu Asn Leu Leu Asp Leu Asn Gln Lys Leu Gln

290 295 300

Leu Gln Leu Asn Gln Glu Lys Ala Asn Leu Gln Leu Glu Ser Glu Glu

305 310 315 320

Leu Asn Ile Leu Ile Arg Cys Phe Lys Asp Phe Gln Leu Gln Arg Ala

325 330 335

Asn Lys Met Glu Leu Arg Lys Gln Gln Glu Asp Val Ser Val Val Arg

340 345 350

Arg Thr Glu Phe Tyr Phe Ala Gln Ala Arg Trp Arg Leu Thr Glu Glu

355 360 365

Asp Gly Gln Leu Gly Ile Ala Glu Leu Glu Leu Gln Arg Phe Leu Tyr

370 375 380

Ser Lys Val Asn Lys Ser Asp Asp Thr Ala Glu His Leu Leu Glu Leu

385 390 395 400

Gly Trp Phe Thr Met Asn Asn Leu Leu Pro Asn Ala Val Tyr Lys Val

405 410 415

Val Leu Arg Pro Gln Ser Ser Cys Gln Ser Gly Arg Gln Leu Ala Leu

420 425 430

Arg Leu Phe Ser Lys Val Arg Pro Pro Val Gly Gly Ile Ser Val Lys

435 440 445

Glu His Phe Glu Val Asn Val Val Pro Leu Thr Ile Gln Leu Thr His

450 455 460

Gln Phe Phe His Arg Met Met Gly Phe Phe Phe Pro Gly Arg Ser Val

465 470 475 480

Glu Asp Asp Glu Val Gly Asp Glu Glu Asp Lys Ser Lys Leu Val Thr

485 490 495

Thr Gly Ile Pro Val Val Lys Pro Arg Gln Leu Ile Ala Thr Asp Asp

500 505 510

Ala Val Pro Leu Gly Pro Gly Lys Gly Val Ala Gln Gly Leu Thr Arg

515 520 525

Ser Ser Gly Val Arg Arg Ser Phe Arg Lys Ser Pro Glu His Pro Val

530 535 540

Asp Asp Ile Asp Lys Met Lys Glu Arg Ala Ala Met Asn Asn Ser Phe

545 550 555 560

Ile Tyr Ile Lys Ile Pro Gln Val Pro Leu Cys Val Ser Tyr Lys Gly

565 570 575

Glu Lys Asn Ser Val Asp Trp Gly Asp Leu Asn Leu Val Leu Pro Cys

580 585 590

Leu Glu Tyr His Asn Asn Thr Trp Thr Trp Leu Asp Phe Ala Met Ala

595 600 605

Val Lys Arg Asp Ser Arg Lys Ala Leu Val Ala Gln Val Ile Lys Glu

610 615 620

Lys Leu Arg Leu Lys Ser Ala Thr Gly Ser Glu Val Arg Gly Lys Leu

625 630 635 640

Glu Thr Lys Ser Asp Leu Asn Met Gln Gln Gln Glu Glu Glu Glu Lys

645 650 655

Ala Arg Leu Leu Ile Gly Leu Ser Val Gly Asp Lys Asn Pro Gly Lys

660 665 670

Lys Ser Ile Phe Gly Arg Arg His His His His His His

675 680 685

<210> 2

<211> 2070

<212> DNA

<213> 密码子优化后的表达重组蛋白的核苷酸序列

<400> 2

atgtcag atcagctatg tgggattgct gcatgccaaa cagatgacat atacaaccgt 60

aactgcctga ttgaactggt gaactgccaa atggtgctgc gtggcgcgga gaccgaaggt 120

tgcgtgattg ttagcgcggc gaaagcgcag ctgctgcaat gccagcacca tccggcgtgg 180

tacggcgaca ccctgaagca aaaaaccagc tggacctgcc tgctggatgg tatgcagtat 240

tttgcgacca ccgagagcag cccgaccgaa caagacggcc gtcagctgtg gctggaagtg 300

aagaacatcg aggaacaccg tcagcgcagc ctggatagcg ttcaagagct gatggaaagc 360

ggtcaggcgg tgggtggcat ggttaccacc accaccgact ggaaccaacc ggcggaagcg 420

cagcaagcgc agcaagtgca gcgtatcatt agccgctgca attgccgtat gtactatatt 480

agctacagcc acgacatcga tccggagctg gcgacccaaa tcaagccgcc ggaagtgctg 540

gaaaaccaag agaaggaaga cctgctgaag aaacaggaag gtgcggttga tacctttacc 600

ctgattcacc atgagctgga aatcagcacc aacccggcgc agtatgcgat gattctggat 660

atcgtgaaca atctgctgct gcacgttgag ccgaagcgta aagagcatag cgaaaagaaa 720

cagcgtgttc gcttccaact ggaaattagc agcaacccgg aggaacagcg tagcagcatc 780

ctgcacctgc aggaagcggt gcgccaacat gttgcgcaaa ttcgtcagct ggaaaagcaa 840

atgtacagca tcatgaaaag cctgcaggac gatagcaaga acgagaatct gctggacctg 900

aaccagaaac tgcaactgca gctgaaccag gagaaggcga atctgcaact ggaaagcgag 960

gaactgaaca tcctgattcg ttgctttaaa gacttccaac tgcagcgcgc gaataagatg 1020

gagctgcgta aacagcaaga agatgtgagc gtggttcgtc gcaccgaatt ttacttcgcg 1080

caggcgcgtt ggcgcctgac cgaggaagat ggccaactgg gtatcgcgga gctggaactg 1140

cagcgttttc tgtatagcaa ggtgaacaaa agcgacgata ccgcggagca cctgctggaa 1200

ctgggctggt tcaccatgaa caatctgctg ccgaatgcgg tttataaggt ggttctgcgc 1260

ccgcaaagca gctgccagag cggtcgccaa ctggcgctgc gtctgtttag caaagtgcgt 1320

ccgccggttg gtggcattag cgtgaaggag catttcgaag ttaacgtggt tccgctgacc 1380

atccagctga cccaccaatt ctttcatcgc atgatgggct tctttttccc gggtcgtagc 1440

gtggaggacg atgaagttgg cgacgaggaa gataagagca aactggttac caccggtatt 1500

ccggtggtta aaccgcgtca actgatcgcg accgacgatg cggtgccgct gggtccgggt 1560

aagggtgttg cgcagggtct gacccgtagc agcggtgtgc gtcgcagctt tcgtaaaagc 1620

ccggagcacc cggttgacga tattgacaag atgaaagaac gtgcggcgat gaacaatagc 1680

ttcatctaca ttaagatccc gcaggtgccg ctgtgcgtta gctataaggg cgagaaaaac 1740

agcgtggact ggggtgatct gaatctggtt ctgccgtgcc tggaatacca taacaatacc 1800

tggacctggc tggacttcgc gatggcggtg aagcgtgata gccgcaaggc gctggttgcg 1860

caggttatca aggagaaact gcgcctgaaa agcgcgaccg gcagcgaggt tcgtggtaag 1920

ctggaaacca aaagcgacct gaacatgcag caacaggaag aggaagagaa ggcgcgtctg 1980

ctgattggcc tgagcgttgg cgataaaaat ccgggtaaaa agagcatctt cggtcgtcgt 2040

catcatcacc atcaccacta atga 2070

Claims (5)

1.一种小鼠抗人KIAA0100蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤(1)：使用生物信息学软件Optimum^TMCodon对人KIAA0100蛋白的蛋白片段1557-2234进行分析，将其对应的核苷酸序列中的大肠杆菌稀有密码子进行优化，在优化后的核苷酸序列的3 ′端加上6×组氨酸标签，人工合成核苷酸序列，克隆入pET30a载体中，构建pET30a-KIAA0100 1557-2234质粒表达载体；

步骤(2)：pET30a-KIAA0100 1557-2234质粒在大肠杆菌中经诱导表达，获得重组人KIAA0100蛋白片段1557-2234后,使用镍离子-亚氨基二乙酸亲和层析柱纯化；

步骤(3)：使用经浓缩和复性后的重组人KIAA0100蛋白片段1557-2234作为免疫原免疫5只健康BALB/c小鼠，取成功免疫后的小鼠脾细胞，与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合，制备杂交瘤细胞株，以未免疫的、健康BALB/c小鼠的血清作为阴性对照，使用间接酶联免疫吸附法筛选杂交瘤细胞株，使用有限稀释法对筛选出的阳性杂交瘤细胞株进行2轮亚克隆，将ELISA检测阳性的杂交瘤细胞进行扩大培养，最终得到一个稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株；

步骤(4)：使用SBA小鼠单克隆抗体分析试剂盒检测获得的小鼠抗人KIAA0100蛋白单克隆抗体的亚型，使用western blot分析和免疫细胞化学分析对获得的小鼠抗人KIAA0100蛋白单克隆抗体进行鉴定；

步骤(5)：选择3只健康BALB/c雌性小鼠，每只小鼠腹腔注射0 .5ml的姥鲛烷，14天后，腹腔注射杂交瘤细胞，在注射前1天使用新鲜培养基对处于对数生长期的杂交瘤细胞进行换液，注射当天，混匀杂交瘤细胞制成细胞悬液，计数后，将细胞悬液加入15ml离心管中，室温200×g离心5分钟，弃上清后用磷酸盐缓冲液悬浮细胞，使细胞浓度为5×10⁶个/ml，每只小鼠注射1ml；观察小鼠的健康状况及腹水产生情况，10天－14天后收集腹水，收集的腹水使用蛋白A亲和层析柱纯化；

重组人KIAA0100蛋白片段1557-2234抗原的氨基酸序列为SEQ ID NO:1；

密码子优化后的编码该重组蛋白片段的核苷酸序列为SEQ ID NO:2；

pET30a-KIAA0100 1557-2234 表达载体在大肠杆菌BL21中经异丙基硫代-β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导表达，使用Ni²⁺-IDA亲和层析柱对获得的重组人KIAA0100蛋白片段1557-2234进行纯化；

所述步骤(4)中使用western blot分析对获得的小鼠抗人KIAA0100蛋白单克隆抗体进行鉴定的方法为：将U937细胞总蛋白经SDS-PAGE分离后转移至硝酸纤维素膜上，以小鼠抗人KIAA0100蛋白单克隆抗体一抗，以辣根过氧化物酶标记的山羊抗小IgG为二抗，使用westernblot方法检测。

2.根据权利要求1所述的一种小鼠抗人KIAA0100蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于：pET30a-KIAA0100 1557-2234 重组质粒转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中，使用含卡那霉素的LB固体培养基筛选阳性克隆，并进行PCR验证，提取阳性克隆质粒后进行酶切和测序鉴定。

3.根据权利要求1所述的一种小鼠抗人KIAA0100蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于：步骤(2)中具体纯化方法为：取1支15ml离心管，将表达正常的菌种以0 .1％比例接种于含100μg/ml卡那霉素的4mlLB培养液中，37℃、190rpm恒温震荡培养16小时至18小时后，按1％比例接种至400ml含100μg/ml卡那霉素的TB培养液中，37℃、190rpm恒温震荡培养至OD600nm＝1.2时，加入终浓度为0 .5mM IPTG ,15℃、190rpm恒温震荡培养16小时后，用500ml离心杯收集菌体，8,000rpm，离心5分钟后，弃上清，加入120ml缓冲液A重悬后，加入终浓度为0.1mg/ml的溶菌酶、0.1ng/ml的核酸酶和2mM的二硫苏糖醇,置于冰水容器中，超声破菌30分钟后，4℃，13，000rpm离心30分钟后收集上清和沉淀，将得到的上清经Ni²⁺-IDA亲和层析柱纯化，将纯化后的产物进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析；将得到的沉淀用洗涤缓冲液洗涤后，用含8M尿素的洗脱缓冲液溶解包涵体，经Ni²⁺-IDA亲和层析柱纯化，将纯化后的产物进行SDS-PAGE分析和westernblot分析；其中，缓冲液A 为 50mM Tris-Hcl ,300mMNacl ,5％甘油,PH8.0；洗涤缓冲液为100mMTris-Hcl ,300mM Nacl ,10mM乙二胺四乙酸,2％聚乙二醇辛基苯基醚,2mM二硫苏糖醇,pH8.0 ；洗脱缓冲液为 8M尿素，5mMTris-Hcl ,300mM Nacl, pH8.0 。

4.根据权利要求1所述的一种小鼠抗人KIAA0100蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于：步骤(3)中重组人KIAA0100蛋白片段经浓缩和复性的方法为：将经洗脱缓冲液洗脱的蛋白产物用10kDa超滤管浓缩后，产物经6 ,000rpm离心20分钟，收集上清，在上清中加入0.5％月桂酰肌氨酸,用3.5kDa透析袋透析到1L透析缓冲液中，4℃透析3小时，然后将重组蛋白再换到1L新的透析缓冲液中，4℃继续透析3小时，收集蛋白，用0.22μm过滤器过滤蛋白；其中，洗脱缓冲液为8M尿素，5mM Tris-Hcl,150mM Nacl,500mM咪唑,pH8.0；透析缓冲液为1×PBS ,0.5％月桂酰肌氨酸,PH7.4。

5.根据权利要求1所述的一种小鼠抗人KIAA0100蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于：步骤(4)中免疫细胞化学分析对获得的小鼠抗人KIAA0100蛋白单克隆抗体进行鉴定方法为：收集对数生长期U937细胞，使用PBS洗涤2次，再用PBS重悬，用移液器将细胞悬液滴加在硅化载玻片上，用丙酮固定U937细胞，以小鼠抗人KIAA0100蛋白单克隆抗体为一抗，使用小鼠IgG两步法免疫组化检测试剂盒进行免疫细胞化学分析。

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