CN113667019B - 一种可以进入肿瘤细胞内的ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种可以进入肿瘤细胞内的ACPP‑抗p21Ras单链抗体融合蛋白的序列、表达和纯化的制备方法及用途。本发明通过筛选不同的原核表达载体和菌株的组合，建立了最优的融合蛋白原核重组表达系统，并优化表达条件，使用发酵罐和AKTA层析系统建立了中试级别的表达及纯化工艺。本发明与现有技术相比，提高了融合蛋白的表达量和纯度，为规模化生产奠定了基础，同时该ACPP‑抗p21Ras单链抗体融合蛋白能够进入肿瘤细胞内，与p21Ras蛋白结合，从而阻断ras信号通路，达到抑制肿瘤细胞生长、诱导肿瘤细胞凋亡的目的。该ACPP‑抗p21Ras单链抗体融合蛋白在制备治疗ras相关肿瘤制剂方面具有广泛的应用前景。

Description

一种可以进入肿瘤细胞内的ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋 白及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，更具体的涉及一种可以进入肿瘤细胞内的ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白及其制备方法。

背景技术

ras基因是一种重要的细胞原癌基因，其命名来自大鼠肉瘤的英文rat asrcoma。ras基因家族包括三个主要成员：H-ras，K-ras及N-ras，其分别定位于第12，11以及1号染色体，编码由188-189个氨基酸组成的分子量约为21KD的蛋白质，三种Ras蛋白的氨基酸序列同源性为85％。

Ras蛋白作为极其重要的信号传导传递蛋白调节细胞的正常分化及增殖。Ras蛋白在合成后，其羧基端必须经过复杂的翻译后修饰，使其准确的定位于细胞膜的内侧面才能发挥其生物学功能。Ras蛋白在细胞外生长信号刺激下与GTP结合成为活性状态的Ras-GTP形式，从而激活Ras蛋白下游众多信号通道，促进细胞分裂，增生和恶性转化。

当ras基因发生突变或过表达时，与GTP结合成为活性状态，导致细胞恶性转化并促进恶性肿瘤细胞的浸润及转移。研究表明，大约30％的人类肿瘤中存在ras基因突变或ras基因的过表达。

利用基因工程技术构建的单链抗体是用柔性寡核苷酸片段连接完整抗体的可变区构建的线性片段，分子量只有完整抗体的1/6，渗透力强，在非靶向组织中滞留时间短、易从体内清除。而且由于没有全抗体的Fc片段，免疫源性低，用于人体几乎不会产生抗鼠抗体反应。这种抗体通过与细胞内特定蛋白的结合使其失活，阻断其与其他蛋白的相互作用，或干扰该蛋白的正常胞内定位，从而阻止其发挥正常生物学功能。

本发明利用小鼠抗体轻、重链混合引物，从经过Ras蛋白免疫后的Balb/c小鼠脾B淋巴细胞中扩增获得其轻、重链可变区基因片段。通过重叠延伸PCR技术，将柔性寡核苷酸和所述两片段连接，构建出抗p21Ras蛋白的单链抗体基因片段。为了制备可以特异进入肿瘤细胞的抗p21Ras单链抗体，本发明在前期基础上将ACPP穿膜肽和抗p21Ras单链抗体基因构建为融合表达基因，并对ACPP-抗p21Ras单链抗体融合基因的密码子进行优化，将优化后的ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白基因克隆至pET-32a原核表达载体，再将重组表达载体转入Origami(DE3)大肠杆菌表达菌中，构建出ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白重组表达系统。经过一系列表达及纯化条件的摸索，制备出能够穿透肿瘤细胞膜、抑制肿瘤生长的ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白。

发明内容

本发明的目的在于克服上述的不足，提供一种可以进入肿瘤细胞内的ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

该ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白是由ACPP穿膜肽、重链可变区、连接肽和轻链可变区组成的融合多肽；所述连接肽位于所述重链可变区与所述轻链可变区之间SEQ IDNO：2中第149-163位氨基酸序列。ACPP穿膜肽序列位于SEQ ID NO：2中第1-24位氨基酸序列。

本发明的目的还在于提供了一种ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白重组表达质粒，该重组表达质粒由ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白基因克隆至原核表达质粒pET-32a的Kpn I和Hind III酶切位点之间而成。所述ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白基因如SEQID NO：1所示。

本发明的目的还在于提供了一种ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白的原核表达系统，该原核表达系统由上述重组表达质粒转化到大肠杆菌表达菌Origami(DE3)而成。

本发明的目的还在于提供了一种ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白的发酵罐诱导表达条件，可以用于大规模发酵生产表达融合蛋白。

本发明的目的还在于提供了一种ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白的纯化方法，即先超声破碎重组表达菌，离心收集以包涵体形式存在的ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白，经过包涵体洗涤液洗涤后，使用含8M尿素的变性剂使其变性，利用镍离子亲和层析柱和AKTA系统纯化变性后的包涵体融合蛋白，最后采用尿素梯度透析复性的方法使变性的融合蛋白重新折叠，恢复其生物活性，达到纯化蛋白的目的。

本发明所述ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白能广谱拮抗H-Ras、K-Ras、N-Ras三种p21Ras蛋白；该融合蛋白能够穿透高表达MMP-2的肿瘤细胞的细胞膜从而进入肿瘤细胞内而无法穿透正常细胞的细胞膜进入正常细胞中，可用于ras基因相关肿瘤的诊断性研究、发病机制研究或治疗性研究。

本发明的上述目的通过如下方案实现：

本发明通过在抗p21Ras单链抗体的N端增加ACPP肽序列，使其具有能够特异性穿透肿瘤细胞膜，从而与肿瘤细胞内的p21Ras蛋白结合，阻断ras信号通路的能力。

本发明通过优化了ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白基因的密码子，改变了原有融合蛋白的DNA序列，使其密码子序列更适合在大肠杆菌中表达，提高了ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白在大肠杆菌中的表达量。

本发明通过实验确定了ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白的原核表达质粒和大肠杆菌表达菌株的最佳组合。

本发明通过实验确定了ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白的最佳诱导表达条件，并通过AKTA层析系统确定了镍离子亲和层析纯化ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白的最佳条件，进一步的提高了蛋白的表达量和蛋白纯度。

本发明所述的一种可以特异性进入肿瘤细胞内的ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白及其制备方法，所述融合蛋白的制备方法如下：

1.抗p21Ras单链抗体基因的构建

(1)利用小鼠抗体轻、重链混合引物，从经过p21Ras蛋白免疫后的Balb/c小鼠脾B淋巴细胞多重扩增获得其轻、重链可变区基因片段。通过重叠延伸PCR，将柔性寡核苷酸链(linker)和所述两片段连接，构建出单链抗体基因片段。

(2)在单链抗体的基因片段两端分别引入不同的酶切位点并与同步双酶切的噬菌粒表达载体pCANTAB-5E连接，获得重组噬菌粒。将鉴定连接正确的重组噬菌粒转化大肠杆菌粒转化大肠杆菌TG1，用辅助噬菌体M13K07进行挽救，通过噬菌体展示技术将目的单链抗体基因片段与表达载体中的gIII基因融合表达并展示在噬菌体尾部表面，获得融合表达的单链抗体，通过间接ELISA实验对融合表达的单链抗体进行检测，筛选出表达抗p21Ras单链抗体的阳性重组噬菌粒。

(3)将筛选获得的阳性重组噬菌粒转化大肠杆菌BL21(DE3)中进行可溶性表达，从而获得与E-tag标签融合表达的可溶性的抗p21Ras单链抗体，以该单链抗体为一抗，以E-tag抗体为二抗，采用间接ELISA实验和免疫细胞化学法检测目的单链抗体的特异性及亲和力，证实该单链抗体可特异性识别三种Ras蛋白。

2.ACPP-抗Ras单链抗体融合蛋白重组表达载体的构建

由于此前构建的抗p21Ras单链抗体不能直接穿透细胞膜，因此对抗p21Ras单链抗体的DNA序列进行改进，在抗p21Ras单链抗体DNA序列的5’端添加了ACPP穿膜肽的DNA序列，让ACPP穿膜肽与抗p21Ras单链抗体在原核表达系统中融合表达，使得ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白可以穿透高表达MMP-2的肿瘤细胞的细胞膜，结合肿瘤细胞内的p21Ras蛋白，但不进入正常细胞中。同时对ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白DNA序列的密码子进行优化，以提高蛋白在大肠杆菌中的表达量。最后将优化后的ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白的DNA片段克隆至pET-32a原核表达质粒中，构建出了ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白重组表达质粒。

3.ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白的表达及纯化工艺的建立

(1)ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白原核表达系统的构建：将上述ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白重组表达质粒转化到大肠杆菌Origami(DE3)内，通过含氨苄霉素的LB平板筛选出阳性克隆，PCR鉴定确定阳性克隆含有ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白基因。

(2)ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白原核表达工艺的建立：在1L的三角摇瓶中，通过单因素变量设置诱导温度梯度、诱导时间梯度和诱导方式等方面进行摇瓶表达条件的优化，确定了ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白的最佳诱导培养基及最适诱导表达条件。最后利用发酵罐在上述最适培养条件下发酵表达ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白，建立ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白的表达工艺。

(3)ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白纯化工艺的建立：收集诱导表达后的菌液，离心后超声破碎菌体，离心收集超声破碎后的沉淀包涵体蛋白；包涵体蛋白经过洗涤后，使用含尿素的变性剂使其变性；利用AKTA层析系统通过镍离子亲和层析柱纯化变性后的包涵体蛋白；采用尿素梯度，逐级透析复性使变性的包涵体蛋白重新折叠，恢复其生物学活性。

(4)ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白的鉴定：用SDS-PAGE鉴定ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白的纯度，通过分光光度计利用BCA法检测ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白的浓度，并通过WB和ELISA检测ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白的免疫学活性。

本发明所述的一种可以进入肿瘤细胞内的ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白，其对肿瘤细胞的抑制作用通过如下方法实现：

(1)通过免疫细胞化学及免疫荧光实验检测融合蛋白对高表达MMP-2的肿瘤细胞的穿膜能力。

(2)用ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白进行体外抑瘤实验。通过MTT法检测融合蛋白对肿瘤的杀伤作用，细胞划痕实验检测融合蛋白对肿瘤迁移能力的影响，平板克隆检测融合蛋白对肿瘤增殖能力的影响，TUNEL检测融合蛋白对肿瘤细胞的诱导凋亡作用。

本发明的有益成果：本发明创造性的将前期构建的抗p21Ras单链抗体与ACPP穿膜肽融合，通过密码子优化使其能在大肠杆菌表达系统中大量表达，再经过一系列纯化得到了ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白，使抗p21Ras单链抗体具备了穿透肿瘤细胞细胞膜的能力，从而使抗p21Ras单链抗体能够与肿瘤细胞内的p21Ras蛋白结合，进而阻断ras信号通路，达到抑制肿瘤细胞生长，诱导肿瘤细胞凋亡的目的。将ACPP-抗p21Ras单链抗体融合基因进行密码子优化并分别克隆到pET-28a、pET-32a、pET-22b三个原核表达质粒中，再将三个重组表达质粒分别都转化到大肠杆菌BL21(DE3)、Origami(DE3)、OrigamiB(DE3)原核表达菌中，构建出9个ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白原核表达系统，并从中筛选出表达量最高的重组表达质粒和表达菌株组合。最后优化摇瓶及发酵罐的发酵条件，通过自诱导培养基在发酵罐中进一步提高了ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白的产量，使得最终表达的蛋白产量达到了摇瓶IPTG/LB培养基诱导的25倍。最后利用AKTA系统通过实验摸索并确定了镍离子亲和层析的纯化参数，最终得到了纯度为80％的ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白。本发明所确定的ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白表达及纯化条件均可以线性放大，可以直接用于ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白的工业化生产。ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白通过体外穿膜实验及体外抑制肿瘤细胞实验表明，ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白能够特异性穿透高表达MMP-2的肿瘤细胞的细胞膜，并在体外可以显著抑制肿瘤细胞的迁移、增殖，并对肿瘤有杀伤及诱导凋亡作用，为今后肿瘤的治疗提供了一种新的靶向药物。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明通过在前期获得的单链抗体基因的5’端添加ACPP穿膜肽基因序列，使得抗p21Ras单链抗体能够特异性穿透肿瘤细胞的细胞膜，并能够与肿瘤细胞内的p21Ras蛋白结合，发挥阻断ras信号通路的作用。

(2)本发明通过原核表达系统获得了ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白，本发明所制备的ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白比现有技术(腺病毒携带抗p21Ras单链抗体基因)更易制备，更易工业化生产。

(3)本发明通过对ACPP-抗p21Ras单链抗体融合基因的密码子进行优化，同时通过筛选不同的原核表达质粒和原核表达菌株的组合确定出了最佳的原核表达系统，并通过实验确定了诱导表达的最佳培养基及最适发酵条件，使ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白的表达量与现有技术相比提高了50倍。

附图说明

附图1为本发明PCR鉴定重组原核表达菌中ACPP-抗p21Ras单链抗体融合基因的电泳图；M:DL2000，泳道1:pET22b-ACPP-p21Ras scfv/BL21(DE3)，泳道2:pET22b-ACPP-p21Ras scfv/Origami(DE3)，泳道3:pET22b-ACPP-p21Ras scfv/OrigamiB(DE3)，泳道4:pET28a-ACPP-p21Ras scfv/BL21(DE3)，泳道5:pET28a-ACPP-p21Ras scfv/Origami(DE3)，泳道6:pET28a-ACPP-p21Ras scfv/OrigamiB(DE3)，泳道7:pET32a-ACPP-p21Ras scfv/BL21(DE3)，泳道8:pET32a-ACPP-p21Ras scfv/Origami(DE3)，泳道9:pET32a-ACPP-p21Rasscfv/OrigamiB(DE3)；

附图2为本发明SDS-PAGE筛选高表达ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白的重组原核表达系统电泳图；M:蛋白Marker，泳道1:pET32a-ACPP-p21Ras scfv/BL21(DE3)，泳道2:pET32a-ACPP-p21Ras scfv/Origami(DE3)，泳道3:pET32a-ACPP-p21Ras scfv/OrigamiB(DE3)，泳道4:pET22b-ACPP-p21Ras scfv/BL21(DE3)，泳道5:pET22b-ACPP-p21Ras scfv/Origami(DE3)，泳道6:pET22b-ACPP-p21Ras scfv/OrigamiB(DE3)，泳道7:pET28a-ACPP-p21Ras scfv/Origami(DE3)，泳道8:pET28a-ACPP-p21Ras scfv/OrigamiB(DE3)；

附图3为本发明SDS-PAGE鉴定目的蛋白在不同诱导条件下融合蛋白表达量的电泳图；M:蛋白Marker，泳道1:未诱导时自诱导培养基pET32a-ACPP-p21Ras scfv/Origami(DE3)重组菌的菌体总蛋白，泳道2:自诱导条件下pET32a-ACPP-p21Ras scfv/Origami(DE3)重组菌的菌体总蛋白，泳道3:未加IPTG诱导剂时LB培养基中pET32a-ACPP-p21Rasscfv/Origami(DE3)重组菌的菌体总蛋白，泳道4:IPTG诱导下的pET32a-ACPP-p21Rasscfv/Origami(DE3)重组菌的菌体总蛋白；

附图4为本发明通过SDS-PAGE检测融合蛋白纯化结果的电泳图；M:蛋白Marker，泳道1:未经镍柱纯化的包涵体ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白，泳道2:纯化后的包涵体ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白；

附图5为本发明WB检测ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白的免疫反应性；M:蛋白Marker，1:H-p21Ras蛋白与ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白结合，2:K-p21Ras蛋白与ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白结合，3:N-p21Ras蛋白与ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白结合；附图6为本发明ELISA检测ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白的效价；

附图7为本发明免疫组化检测ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白体外的穿膜效果；竖排1显示单独的抗p21Ras单链抗体无法进入A549细胞，竖排2显示ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白进入A549细胞；

附图8为本发明免疫荧光检测ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白的穿膜效果；其中，红色信号为ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白，蓝色信号为细胞核，竖排1显示单独的抗p21Ras单链抗体无法进入A549细胞，竖排2显示ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白进入A549细胞；

附图9为本发明划痕实验检测ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白对肿瘤细胞迁移能力的影响；

附图10为本发明平板克隆集落实验检测ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白对肿瘤细胞增殖能力的影响；

附图11为本发明MTT实验检测ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白对肿瘤细胞的杀伤作用；

附图12为本发明TUNEL实验检测ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白对肿瘤细胞诱导凋亡作用的影响。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，本发明中所用方法如无特别说明均为常规方法。以下实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1：单链抗体基因片段的制备

1.1 p21Ras蛋白免疫Balb/c小鼠：取5只鼠龄在6-8周的Balb/c小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)，每只注射100μg的本实验室经过原核表达纯化后的p21Ras-K蛋白(p21ras-K蛋白的制备方法参照论文《重组p21ras蛋白的表达、鉴定与纯化及其多克隆抗体的制备》)，初次注射加等量的完全弗氏佐剂，皮下5点注射。两周后进行第二次注射，剂量同第一次，加等量不完全弗氏佐剂，皮下5点注射。两周后进行第三次注射，剂量同第一次，不加佐剂，腹腔注射。两周后进行第四次注射，剂量同第一次，不加佐剂，腹腔注射。3天后取其脾脏，用10ml灭菌的D-Hank’s液冲洗研碎的脾脏。用滴管吸取培养皿内细胞的悬液，移入50ml离心管中，1000g离心10分钟，弃上清，沉淀即为所需要的小鼠脾B淋巴细胞。

1.2小鼠脾B淋巴细胞总RNA的提取和逆转录合成cDNA：将已分离得到的小鼠脾B淋巴细胞，使用传统的Trizol法提取总RNA。提取的具体步骤参照分子克隆指南(第三版)。提取出的RNA进行1％琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为90伏，30分钟。结果显示提取的总RNA的28S、18S、5S亚基大小正确，条带清晰无明显杂带，可用于下游的反转录实验。反转录使用购自Fermentas公司的反转录试剂盒，具体步骤参见说明书操作。

1.3重叠延伸PCR合成单链抗体基因片段：扩增小鼠轻、重链可变区引物和重叠延伸PCR构建单链抗体的Linker引物等均使用购自GE healthcare公司的重组噬菌体抗体系统(Recombinant Phage Antibody System，RPAS)。首先在PCR管内加入下列试剂进行轻链可变区扩增：小鼠脾B淋巴细胞cDNA 4μl；10×PCR Buffer 5μl；dNTP(10mM)5μl；轻链引物混合液1μl；rTaq酶0.5μl；灭菌去离子水34.5μl。另一只PCR管内加入下列试剂进行重链可变区扩增：小鼠脾B淋巴细胞cDNA 4μl；10×PCR Buffer 5μl；dNTP(10mM)5μl；重链引物混合液1μl；rTaq酶0.5μl；灭菌去离子水34.5μl。将上述体系配制好后放入PCR仪经95℃，5分钟；(94℃ 30秒，55℃ 45秒，72℃ 1分钟，30个循环)；72℃ 10分钟，结束反应。将扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为90伏，30分钟。结果显示扩增的重链可变区大小约为350bp，轻链可变区大小约330bp，与预期一致。

将大小正确的条带进行切胶纯化，胶回收的步骤按天根离心柱型DNA纯化试剂盒说明书操作；将纯化后的条带再次取2μl进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为90伏，30分钟，确定胶回收后DNA的质量和大致浓度。

用Linker引物连接扩增的轻重链可变区并在连接产物两端引入Sfi I和Not I酶切位点：通过重叠延伸PCR法用Linker混合物将纯化后的相同摩尔量的轻重链可变区片段进行连接，连接产物在RS Primers(酶切位点引物)作用下在重链的5’末端加上Sfi I限制性位点和轻链的3’末端加上Not I酶切位点，可用于后续与有相同酶切位点的表达载体pCANTAB-5E(购自Pharmacia公司)进行连接。具体步骤参照GE healthcare公司的RPAS系统说明书。PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，可见单链抗体条带大小约780bp，与预期一致，条带集中，清晰无杂带。目的条带进行切胶纯化及纯化后的浓度测定。对所构建好的单链抗体命名为抗p21Ras-ScFv。

1.4单链抗体基因片段的克隆：将构建出的单链抗体片段抗p21Ras-ScFv连入pMD-18T载体(购自TAKARA公司)，构建出pMD-ScFv重组质粒。在200μl PCR管中配制如下连接体系：pMD-18T载体1μl；目的片段DNA 0.1pmol-0.3pmol；Solution I补足10μl。金属浴16℃反应4小时。将连接产物加入到100μl DH5α感受态中，冰浴30分钟。42℃热激90秒后立即冰浴90秒。加入900μl LB液体培养基，37℃，80rpm，振荡培养1小时。取200μl培养物涂布于含有X-Gal的LB/Amp平板上37℃倒置培养10小时。

1.5菌液PCR鉴定阳性重组子：挑取LB/Amp平板上的单菌落，溶于50μl的ddH₂O中，98℃热裂解10分钟后13000rpm离心1分钟，所得上清即为PCR的模板。在200微升PCR反应管内加入10×PCR Buffer 2.5μl；dNTP Mix(2.5mM each)2μl；M13F(10μM)0.5μl，M13R(10μM)0.5μl；菌液5μl；rTaq酶0.5μl；ddH₂O 14μl。设置PCR反应程序为预变性94℃4分钟。(94℃ 1分钟，57℃ 1分钟，72℃ 1分钟，30个循环)，72℃延伸10分钟，4℃保存。PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，可见在预期的930bp处出现条带，确定为阳性重组克隆。

实施例2：单链抗体库的建立及筛选鉴定

2.1重组噬菌粒的构建

2.1.1重组pMD-ScFv载体及表达载体的双酶切：将经PCR鉴定正确的阳性pMD-ScFv克隆提取质粒，提取步骤按天根质粒小提试剂盒说明书操作。将重组的pMD-ScFv质粒及表达载体质粒pCANTAB-5E(购自Pharmacia公司)分别先进行Sfi I酶切，在200μl PCR反应管内分别加入表达载体质粒/pMD-ScFv载体各30μl；Sfi I酶(10U/μl)4μl；10×Buffer M 5μl，ddH₂O 11μl，上述体系配置好后50℃反应4小时。将酶切产物经过胶回收纯化后，在新的200μlPCR反应管中加入纯化产物30μl，Not I酶(10U/μl)2μl，10×Buffer H 5μl，BSA 2μl，Trion X-1002μl，ddH₂O 9μl，上述体系配置好后37℃反应4小时。酶切产物全部加样进行1％琼脂糖凝胶电泳，重组的pMD-ScFv质粒双酶切后在780bp处出现目的条带，表达载体质粒双酶切后在3.5kb处出现目的条带。目的条带分别进行切胶纯化，步骤按天根离心柱型DNA纯化试剂盒说明书进行。

2.1.2重组表达载体的连接：将经过Sfi I和Not I同步双酶切后的表达载体pCANTAB-5E与ScFv目的片段按摩尔比1:5进行连接，从而构建出含有单链抗体基因的重组表达载体pCANTAB-ScFv。连接总体积为10μl，16℃反应4小时。将连接产物全部加入100μl的TG1感受态中，冰浴30分钟。42℃热激90秒后再冰浴90秒。加入900μl LB液体培养基，37℃，80rpm，振荡培养1小时。取200μl培养物涂布于LB/Amp平板上37℃倒置培养10小时。

2.1.3重组表达载体的鉴定：挑取LB/Amp平板上的单菌落，溶于50μl的ddH₂O中，98℃热裂解10分钟后13000rpm离心1分钟，所得上清即为PCR反应的模板。PCR鉴定插入片段使用表达载体pCANTAB-5E的通用引物，S1F:CAACGTGAAAAAATTATTATTCGC，S6R:GTAAATGAATTTTCTGTATGA-GG。在200微升PCR反应管内加入10×PCR Buffer 2.5μl；dNTPs(2.5mM each)2μl；S1F(10μM)0.5μl，S6R(10μM)0.5μl；菌液5μl；rTaq酶0.5μl；ddH₂O 14μl。设置PCR反应程序为预变性94℃ 4分钟。(94℃ 1分钟，58℃ 1分钟，72℃ 1分钟，30个循环)，72℃延伸10分钟，4℃保存。PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，可见在预期的950bp处出现条带。将重组表达载体pCANTAB-ScFv进行Sfi I和Not I分步双酶切，在3.5kb和780bp处有酶切条带，则确认为阳性重组克隆。

2.2噬菌体抗体库的富集和筛选

2.2.1噬菌体抗体库的富集：按细菌数量与辅助噬菌体数量1:20的比例加入辅助噬菌体M13K07(购自GE healthcare公司)于鉴定为阳性含有pCANTAB-ScFv的重组子菌液内，放恒温摇床内37℃，150rpm，培养2小时。当看到液体变浑浊时，放入离心机内，室温下1500g离心25分钟，弃上清。用2×YTAK液重悬沉淀，37℃，200rpm，过夜振荡培养。所得的液体即为经过富集后的噬菌体培养液。

2.2.2间接ELISA法筛选单链抗体的特异性：将所得培养液室温下低速离心25分钟，吸取上清，上清内加入1/5体积的10％脱脂奶粉封闭液，室温下放置10分钟。用PH9.6的0.05M碳酸盐缓冲液将p21ras-H、N、K蛋白分别稀释至5μg/ml，在每个酶标板孔内加入100μl稀释后蛋白液，4℃冰箱内过夜包被。第二天弃孔内液体，每孔加入0.15M PBS-Tweenz(磷酸盐-吐温)洗涤缓冲液300μl，置振荡摇床上振摇3分钟，弃孔内液体，重复洗涤3次。每孔加入1％BSA-PBS封闭液100μl，置37℃恒温培养箱内孵育1小时，洗板三次。每孔加入100μl适当稀释的融合表达的单链重组噬菌体克隆上清为一抗，置湿盒内37℃恒温孵育1小时后洗板三次，同时设置空白、阴性、阳性对照。每孔加入1:2000稀释的酶标二抗(HRP标记的抗M13g8p蛋白)100μl新鲜配制的TMB(四甲基联苯胺)底物液，避光作用5-10分钟，当阳性对照明显呈蓝色而空白、阴性对照呈无色时即可每孔加入2M H₂SO₄ 50μl终止反应。使用酶标仪读取OD₄₅₀值，凡待测孔值/阴性对照孔值≥2即为阳性。

2.3单链抗体的可溶性表达及鉴定

2.3.1单链抗体的可溶性表达：将经过ELISA筛选出的含有阳性重组噬菌体的菌液重新扩大培养至OD₆₀₀≈0.8。将培养好的菌液提取质粒，步骤按QIAGEN质粒小提试剂盒说明书进行。将3μl各个质粒分别转化至100μl BL21(DE3)感受态中。挑取阳性单克隆接于5ml的LB/Amp液体培养基中培养，取前一次的培养菌液按1/100比例加入到1L新的LB/Amp液体培养基中培养至OD₆₀₀≈0.8。收集培养后的菌体，用灭菌PBS缓冲液重悬菌体，加入100U/μl溶菌酶使溶菌酶终浓度达到1U/μl，室温放置15分钟，4℃，12000rpm，离心30分钟后收集上清。

2.3.2可溶性表达单链抗体的鉴定

2.3.2.1SDS-PAGE确定单链抗体的相对分子量：在上一步所得的上清中加入一定量的2×SDS上样缓冲液，使蛋白的终浓度为3-4mg/ml，混合液在沸水浴中加热10分钟，冷却后即可上样进行电泳。电泳完毕，取出分离胶放在盛有去离子水的容器中，加热沸腾后取出。加入快速染色液浸没分离胶即可，在脱色摇床上摇10分钟，当蛋白条带已可见时弃染色液。再次加入约50ml的水，加热沸腾2分钟，停止加热继续在脱色摇床上摇30分钟后观察结果。结果可见在30KDa处出现目的条带，与预期一致。

2.3.2.2免疫细胞化学法检测可溶性表达的单链抗体与肿瘤细胞株的结合特异性及敏感性：采用人肝癌细胞株HepG2，人肝癌细胞株QGY-7703，人胃癌细胞株BGC-853，人胃癌细胞株MKN-28，人结肠直肠癌细胞株HCT116，人卵巢癌细胞株SKOV3，人宫颈癌细胞株Hela，人乳腺癌细胞株MDA-MB-231，人乳腺癌细胞株MDA-MB-435，人乳腺癌细胞株MCF-7共10种肿瘤细胞株；将呈对数生长期的10种肿瘤细胞株收集于离心管内，离心弃上清，用生理盐水重悬细胞沉淀，离心弃上清，用95％乙醇重悬细胞沉淀，离心后让细胞沉淀在95％乙醇中固定3小时，小心取出肿瘤细胞沉淀块按常规组织脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、脱蜡、水化及高压抗原修复后，加入制备的可溶性单链抗体作为一抗，抗E-tag抗体作为二抗(购自Abcam公司)，通过SP法检测肿瘤细胞表达p21ras蛋白的情况。结果显示制备的可溶性单链抗体可与上述所有肿瘤细胞株呈不同程度的阳性反应，显示了良好的广泛的抗肿瘤细胞株谱系。

2.4将鉴定结果正确的单链抗体进行测序：将可溶性表达结果正确含有单链抗体基因重组pMD-ScFv载体的菌液送测序公司测序，DNA测序结果表明单链抗体的基因序列排列方式为V_H-Linker-V_L，与小鼠免疫球蛋白可变区序列数据库Kabat比对后发现序列符合小鼠轻重链可变区基因结构，具体序列见SEQ ID NO：5。

实施例3:ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白的制备

3.1ACPP-抗p21Ras单链抗体的重组原核表达质粒的设计及构建

将上一步得到的抗p21Ras单链抗体基因序列的5’端直接添加ACPP基因序列(序列见SEQ ID NO：6)，最终得到ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白的基因序列，具体序列见SEQID NO：7。将ACPP-抗p21Ras单链抗体融合基因序列通过在线网站(http://www.jcat.de/)按照大肠杆菌的密码子偏好进行密码子优化，优化后的序列(具体序列见SEQ ID NO：1)送昆明擎科生物科技有限公司进行化学合成，同时在一条序列的5’端添加Nde I，3’端添加Hind III酶切位点，另一条序列在5’端添加Kpn I，3’端添加Hind III酶切位点，合成两条末端带有不同酶切位点的ACPP-抗p21Ras单链抗体融合基因。并将两端含有Nde I和HindIII酶切位点的ACPP-抗p21Ras单链抗体融合基因分别克隆至pET-28a(+)和pET-22b原核表达质粒中，将两端含有Kpn I和Hind III酶切位点的ACPP-抗p21Ras单链抗体融合基因克隆至pET-32a原核表达质粒中，构建出3种含ACPP-抗p21Ras单链抗体融合基因的重组原核表达质粒，此部分由昆明擎科生物科技有限公司完成。重组原核表达质粒构建完成后经测序鉴定正确进行后续实验。

3.2重组原核表达菌的构建

3.2.1 BL21(DE3)重组表达菌的构建

将三种重组质粒分别转化BL21(DE3)感受态，操作步骤同大肠杆菌DH5α转化。分别向完成重组质粒转化的BL21(DE3)重组表达菌中加入500μl无抗性的LB液体培养基，37℃，180rpm摇床复苏培养60min。吸取200ul的pET-28a(+)重组质粒/BL21(DE3)复苏液均匀涂布到含有50μg/ml卡那抗性的LB固体培养平板上；分别吸取200ul的pET-32a重组质粒/BL21(DE3)和pET-22b重组质粒/BL21(DE3)复苏液分别均匀涂布到含有100μg/ml氨苄抗性的LB固体培养平板上。倒置于37℃恒温培养箱中过夜培养观察菌体生长情况。待有单克隆菌长出时，挑取BL21重组单克隆在LB液体培养基中进行扩增，随后行PCR鉴定阳性克隆。PCR反应体系为：重组菌液5μl，rTaq DNA聚合酶0.25ul，10×PCR buffer 2.5ul，dNTP Mixture2ul，正向引物F1 1ul，反向引物R1 1ul，ddH₂O 13.25ul，总体积25ul。反应条件如下：94℃，5min；(94℃，50s；55℃，1min；72℃，45s；共30个循环)；72℃，10min。测序鉴定序列无突变进行后续实验。PCR鉴定结果见说明书附图1。

3.2.2 Origami(DE3)重组表达菌的构建

将三种重组质粒分别转化Origami(DE3)感受态，操作步骤同大肠杆菌DH5α转化。分别向完成重组质粒转化的Origami(DE3)重组表达菌中加入500μl无抗性的LB液体培养基，37℃，180rpm摇床复苏培养60min。吸取200ul的pET-28a(+)重组质粒/Origami(DE3)复苏液均匀涂布到含有50μg/ml卡那抗性的LB固体培养平板上；分别吸取200ul的pET-32a重组质粒/Origami(DE3)和pET-22b重组质粒/Origami(DE3)复苏液分别均匀涂布到含有100μg/ml氨苄抗性的LB固体培养平板上。倒置于37℃恒温培养箱中过夜培养观察菌体生长情况。待有单克隆菌长出时，挑取Origami(DE3)重组单克隆，进行PCR及测序鉴定，步骤同上。PCR鉴定结果见说明书附图1。

3.2.3OrigamiB(DE3)重组表达菌的构建

将三种重组质粒分别转化OrigamiB(DE3)感受态，操作步骤同大肠杆菌DH5α转化。分别向完成重组质粒转化的OrigamiB(DE3)重组表达菌中加入500μl无抗性的LB液体培养基，37℃，180rpm摇床复苏培养60min。吸取200ul的pET-28a(+)重组质粒/OrigamiB(DE3)复苏液均匀涂布到含有50μg/ml卡那抗性的LB固体培养平板上；分别吸取200ul的pET-32a重组质粒/OrigamiB(DE3)和pET-22b重组质粒/OrigamiB(DE3)复苏液分别均匀涂布到含有100μg/ml氨苄抗性的LB固体培养平板上。倒置于37℃恒温培养箱中过夜培养观察菌体生长情况。待有单克隆菌长出时，挑取OrigamiB(DE3)重组单克隆，进行PCR及测序鉴定，步骤同上。PCR鉴定结果见说明书附图1。

3.3 ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白的诱导表达

3.3.1摇瓶确定诱导表达ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白的最佳组合及条件

3.3.1.1筛选ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白的最佳组合

分别将转化成功的重组表达菌，挑取单克隆菌至LB液体培养基中培养。按照1:100的比例，把菌液接种到1L的摇瓶中，37℃，200rpm摇床培养至OD600约0.6左右，加入过滤除菌的诱导剂IPTG至终浓度为1mM，在37℃，160rpm的条件下，诱导5h表达目的蛋白，最后SDS-PAGE鉴定目的蛋白的表达情况。结果表明：ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白的表达量在pET-32a/Origami(DE3)的组合中远高于其它组合(结果见说明书附图2)。因此选择该重组表达菌诱导表达目的蛋白。此外，分别比较了不同菌株可溶性上清和包涵体沉淀中目的蛋白的表达情况，发现无论在哪种组合的表达菌中，ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白大多以包涵体的形式存在，可溶性上清很少，因此后续实验均收集包涵体形式的目的蛋白。

3.3.1.2确定ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白在IPTG/LB培养基中的最适表达条件

挑取pET32a-ACPP-p21Ras scfv/Origami(DE3)单克隆菌至LB液体培养基中培养。按照1:100的比例，把菌液接种到1L的摇瓶中，37℃，200rpm摇床培养至OD600约0.6左右，加入过滤除菌的诱导剂IPTG至终浓度为0.8mM，分别在18℃、28℃、37℃，160rpm的条件下，设置诱导时间梯度分别为5h、7.5h、10h，诱导表达目的蛋白。最后SDS-PAGE鉴定目的蛋白的表达情况。结果显示当诱导温度为28℃、诱导时间在10h时目的蛋白条带最宽，表明目的蛋白表达量最高。

3.3.1.3自诱导培养基诱导表达ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白

按照表1配方配制自诱导培养基，按1:100的接种率接种pET32a-ACPP-p21Rasscfv/Origami(DE3)重组表达菌。37℃摇床培养，将菌液培养至OD≈0.6左右，然后降温至28℃，200rpm震荡培养18h，用来诱导表达目的蛋白，SDS-PAGE检测目的蛋白的表达情况。结果表明摇瓶自诱导表达的重组表达菌的菌体重量达到8.6g/L。与IPTG/LB培养基诱导的最佳条件相比，自诱导培养基诱表达的目的蛋白条带比IPTG/LB培养基诱导的目的蛋白宽很多，自诱导培养基诱导表达的目的蛋白表达量是IPTG/LB培养基的3.5倍左右。自诱导培养基和IPTG/LB培养基诱导表达目的蛋白的对比结果见说明书附图3。

表1自诱导培养基配方

3.3.2发酵诱导表达ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白

利用自诱导培养基，确定发酵罐放大诱导表达ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白的最佳条件。取pET32a-ACPP-p21Ras scfv/Origami(DE3)二级种子液按1:50的比例接种于60L自诱导培养基中，按前期摸索的培养和表达条件发酵。以37℃，200rpm培养8h完成菌体扩增，再以28℃，200rpm的条件下诱导表达18h，通过流加乳糖、蛋白胨和酵母粉进行补料，期间通过流加氢氧化钠和30％的磷酸将pH控制在7.4左右。发酵完成后离心收集菌体，SDS-PAGE检测目的蛋白的表达情况。结果显示通过发酵诱导表达的重组表达菌菌体的产量可以达到30g/L，是摇瓶自诱导表达菌体产量的2.5倍。表明中试发酵规模诱导条件成功建立，建立了稳定高效的pET32a-ACPP-p21Ras scfv/Origami(DE3)重组表达菌的发酵工艺。

3.4ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白的纯化

3.4.1包涵体蛋白的收集

离心收集的每克菌体中加入10ml洗菌液(20mM Tris-HCl,pH8.0)，4℃重悬洗菌10min后，以12000rpm离心15分钟。弃上清，收集菌体，每g菌体加入30ml超声缓冲液(50mmol/LTris-HCl，0.1mmol/L EDTA，5％甘油，0.1mmol/L DTT，0.1mol/L NaCl)重悬，冰上超声破碎，功率60％，超声5s,间隔5s，冰上超声30min。在上述超声裂解物加入纯的TritonX-100至1％(V/V)，以分解细胞膜和溶解膜蛋白。冰上孵育10min，然后12000rpm离心15min，收集的沉淀即为包涵体。包涵体沉淀用每克30ml超声裂解缓冲液重悬12000rpm离心除去TrintonX-100。得到的沉淀为洗涤后的包涵体。沉淀用约2倍体积的20mM，pH＝8，Tris-HCl重悬，12000g离心去上清，以去除EDTA。

3.4.2 ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白的亲和层析

每1g包涵体沉淀加入10ml平衡缓冲液(10mM咪唑/1X PBS)悬浮混匀，室温震荡，30min-60min，至包涵体沉淀完全溶解，4℃，12000g，离心20min，弃沉淀，收集上清液。

利用AKTA explorer 100蛋白纯化系统完成ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白的纯化。取Xk30/20层析柱，其内径为2cm，高为30cm。将25ml的Ni Sepharose 6FF/HP层析填料装入柱中。设流速为10ml/min，用3个柱体积的平衡缓冲液平衡镍柱后，将含有包涵体蛋白的平衡缓冲液向镍柱上样，保持压力低于0.4MPa。上样结束后用20倍柱体积的洗涤缓冲液(25mM咪唑/1X PBS)洗涤杂蛋白。当冲洗到流出液OD值小于0.01时，用5倍柱体积的洗脱缓冲液(250mM咪唑/1X PBS)洗脱目的蛋白并收集柱中的ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白，使用BCA蛋白试剂盒(碧云天，P0012)测定ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白的浓度为1.5mg/ml，最终从1L菌液中可纯化到37.5mg的ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白(结果见说明书附图4)。

3.4.3 ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白的透析复性

洗脱下来的目的蛋白，需通过尿素梯度复性，去除尿素洗脱物中的尿素，使其正确折叠。透析袋的预处理，根据透析袋说明书把透析袋剪成适当长度，在500ml含有2％NaHCO₃和1mmol/L的EDTA(pH＝8)中将透析袋煮沸10min，然后用蒸馏水彻底清洗透析袋。透析复性(蛋白液:透析液＝1:100体积比)，透析顺序从复性液1开始，每次透析6小时，使用磁力搅拌器在4℃下进行透析复性，待透析复性液Ⅳ时透析复性结束，透析复性缓冲液的配方见表2。将蛋白在0.01M PBS缓冲液继续透析6小时，回收蛋白，利用BCA法测定蛋白浓度，具体操作步骤参考说明书，过滤除菌后冻存在-20℃。

表2透析复性液

3.4.4 ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白的鉴定

3.4.4.1 SDS-PAGE鉴定ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白的纯度

参照BCA蛋白试剂盒(碧云天，P0012)说明书的步骤测定纯化后目的蛋白的浓度。然后根据目的蛋白的浓度，进行SDS-PAGE电泳，鉴定纯化后的目的蛋白的纯度。结果显示经过镍离子亲和层析柱纯化并透析复性后的ACPP-抗p21Ras-单链抗体融合蛋白分子量与理论值大小一致，与纯化前相比，重组蛋白经镍柱纯化后杂蛋白条带明显减少，纯度约达80％以上(结果见说明书附图4)。

3.4.4.2 WB检测ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白与p21Ras蛋白结合能力

先取目的蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳。按照1:4000的比例稀释小鼠抗His-tag抗体，一抗与PVDF膜在4℃过夜孵育。用TBST将HRP标记的羊抗鼠IgG二抗以1:4000的比例稀释，稀释后的二抗与PVDF膜在37℃下孵育1h，DAB显色。WB结果显示透析复性后ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白能够与p21Ras蛋白结合(结果见说明书附图5)。

3.4.4.3 ELISA检测ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白的效价

用pH为9.6的包被液将K-Ras抗原稀释至终浓度为5ug/ml，在96孔板中的每个孔中加入100ul已经稀释过的抗原，在4℃过夜铺板。第二天弃掉孔内缓冲液，使用吸水纸拍干，每孔再次加入300ul的ELISA洗涤液(0.5％吐温/0.1M PBS)洗板三次。96孔板的各孔中加入100ul的1％BSA-PBS封闭液进行封闭，置于37℃恒温培养箱内孵育约1小时。洗板后每孔中加入ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白。按照不同比例稀释(原液，1：100，1：200，1：400，1：800，1：1600，1：3200，1：6400，1：12800，1：25600)，37℃恒温培养箱孵育1h。洗涤后加100ul已经按照1:4000比例稀释的抗His标签抗体，之后置于37℃的恒温培养箱孵育1小时。洗板后每孔加入100ul已经按照1:2000比例稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG二抗，置于37℃恒温的培养箱内孵育40-60min。各孔加入100ul TMB试剂，将96孔板置于暗处(此步骤需要避光操作)反应15-20分钟，当阳性实验组孔内变为蓝色时，而空白及阴性对照组的孔内无明显的颜色变化时即终止反应。加入50ul的终止液终止显色反应，酶标仪在波长450nm下进行吸光值的检测。

ELISA结果显示当ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白稀释为0.5mg/ml时，ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白不能与K-Ras蛋白有效特异性结合，即ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白的效价为1:800(结果见说明书附图6)。说明经镍柱纯化，透析复性后的ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白具有免疫学活性。

实施例4:ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白的体外抗肿瘤活性研究

4.1 ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白对肿瘤细胞穿膜能力的检测

4.1.1免疫组化检测ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白穿膜能力

将ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白与A549细胞共孵育，离心收集制作细胞蜡块。切片机将细胞蜡块切4um切片，之后进行病理常规脱蜡、脱水、抗原修复，阻断内源性过氧化物酶，封闭非特异性结合位点后，分别与鼠抗His标签的一抗和山羊抗鼠HRP标记的二抗进行孵育，之后DAB复染，分化，蓝化后进行阅片，能够检测到ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白的存在，但未检测到单链抗体的存在，表明ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白能够穿透细胞膜，结果见说明书附图7。

4.1.2免疫荧光检测ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白穿膜能力

制作A549细胞爬片，Triton透化细胞，在爬片上加ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白37℃孵育1小时，后PBS清洗。在爬片上加鼠抗His标签的抗体37℃孵育1小时。清洗后爬片上加罗丹明标记的山羊抗鼠IgG抗体(购自中杉金桥公司)，在37℃的环境下处理40-60min。清洗后加入DAPI(购自Solarbio公司)对爬片上的细胞核染色，荧光显微镜下观察，可见ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白能够进入A549细胞内，定位于细胞胞浆，而单链抗体则没有进入细胞，表明ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白具有穿透肿瘤细胞膜的能力，结果见说明书附图8。

4.2细胞划痕检测ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白对肿瘤细胞迁移能力的影响

将ras基因驱动的10株肿瘤细胞(人肺癌细胞系A549、人肺癌细胞系H358、人肺癌细胞系H1299、人胰腺癌细胞系PANC-1、人胰腺癌细胞系MIA PaCa-2、人乳腺癌细胞系MDA-MB-231、人脑胶质瘤细胞系U251、人肝癌细胞系Huh 7、人结肠癌细胞系SW480、人胃癌细胞系AGS)分别按照每孔2ml培养基含有5×10⁵个细胞铺置在6孔板中，放入37℃，5％CO₂细胞培养箱中过夜培养。24h后当细胞融合率到达100％时，取出细胞在超净工作台中用200ul的枪头垂直划横，并每种细胞分为三个组，实验组中加入终浓度为0.07mg/ml的ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白，对照组分别加入终浓度为0.07mg/ml的ACPP-EGFP融合蛋白和等体积PBS。分别在0h、24h、48h显微镜下观察细胞划痕后的愈合情况并拍照。结果显示与对照组相比，ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白有效抑制了10种肿瘤细胞的迁移率，结果见说明书附图9。

4.3平板克隆检测ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白对肿瘤细胞增殖能力的影响

为了检测ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白是否能抑制ras驱动的肿瘤细胞的增殖，将ras驱动的上述10株肿瘤细胞按照每孔2ml培养基含100个细胞铺置在6孔板中，放入37℃，5％CO₂细胞培养箱中过夜培养。当细胞贴壁后，每种细胞分为三个组，实验组中加入终浓度为0.07mg/ml的ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白，对照组分别加入终浓度为0.07mg/ml的ACPP-EGFP融合蛋白和等体积PBS。培养2周后培养板中出现肉眼可见的克隆，这时终止培养，然后弃去6孔板种的培养液，用PBS(0.01mol/L，pH 7.4)清洗2次，之后加入3ml甲醇固定15min-30min。弃去固定液，加适量姬姆萨工作液染色30min，然后用PBS缓慢洗去染色液，空气干燥。在显微镜下计数大于50个细胞的克隆数。克隆形成率(％)＝(克隆数目/接种细胞数)×100％。

结果显示:对ras基因突变的10株肿瘤细胞ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白组的克隆形成数明显低于ACPP-EGFP融合蛋白组和PBS对照组，表明ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白能有效抑制肿瘤细胞的增殖，结果见说明书附图10。

4.4MTT检测ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白对肿瘤细胞的杀伤能力

将ras驱动的上述10株肿瘤细胞，用含10％胎牛血清的完全培养液制成单细胞悬液，按照每孔细胞数1000-10000接种到96孔板，体积100ul，放入37℃，5％CO₂细胞培养箱中过夜培养。当细胞贴壁长至50％左右时，实验组加入终浓度为0.07mg/ml的ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白，对照组是终浓度为0.07mg/ml的ACPP-EGFP融合蛋白和等体积PBS。连续培养三天，每组细胞每天取3个复孔在每孔中加MTT溶液20μl，37℃继续孵育4h。终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。每孔加150μl DMSO，振荡10min，使结晶物充分融解。室温下15-20min(紫红色溶液)后测量。在酶联免疫监测仪上490nm波长测定各孔光吸收值，记录结果绘制细胞生长曲线。

ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白与10株肿瘤细胞分别孵育后，10株细胞的活力均上升。相比于和ACPP-EGFP融合蛋白及PBS孵育后，上升趋势缓慢。结果表明ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白具有肿瘤细胞杀伤作用。结果见说明书附图11。

4.5 TUNEL检测ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白对肿瘤细胞凋亡的影响

分别将ras驱动的上述10株肿瘤细胞制作成细胞爬片，分别与终浓度为0.07mg/mlACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白、ACPP-EGFP融合蛋白及PBS共培养，然后检测重组蛋白诱导肿瘤细胞凋亡(roche，In situ cell death detection kit)的情况。结果表明与对照组相比，加入ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白的肿瘤细胞凋亡率均升高且有统计学意义(P＜0.05)。证明ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白具有促进这10株肿瘤细胞凋亡的能力，结果见说明书附图12。

综上所述，实施例4的结果表明ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白对ras驱动的上述10种肿瘤细胞有较好的体外抑瘤活性。

序列表

<110>

<120> 一种可以进入肿瘤细胞内的ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白及其制备方法

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 822

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gaagaagaag aagaagaaga agaaggtccg ctgggtctgg caggtcgtcg tcgtcgtcgc 60

cgtcgtcgtc gtatggcaca ggtgaaactg caggaaagcg gtgaaggtct ggttaaaccg 120

ggtggtagcc tgaaactgag ctgtgccgcc agtggtttta catttagcga ttattatatg 180

tattgggtgc gtcagacacc ggaaaaacgt ctggaatggg ttgcaattat tagcgatggt 240

ggtagctata cctattatcc ggatagtgtt aaaggtcgct ttaccatttc tcgtgataat 300

accaaaaaga atctgtatct gcagatgagc agcctgcgta gcgaagatac agcaatgtat 360

tattgtgcac gtgatcctca ttatagcggt agtagtcgtc tgtttgtgaa ttggggtcag 420

ggtacaaccg ttaccgtttc aagcggtggt ggtggtagtg gtggtggtgg ctccggtggt 480

ggtggttcag atattgaact gacgcagtca ccggcgagtc tggcggtgag tctgggtcag 540

cgtgcaacca ttagttatcg tgcgagtaaa agtgttagca cgagtggtta tagttatatg 600

cattggaacc agcagaaacc gggtcagcct ccgcgcctgc tgatttatct ggttagtaat 660

ctggaaagcg gtgtgccggc acgctttagc ggtagcggta gcggcaccga ttttacgctg 720

aatattcatc cggtggaaga agaagatgca gcaacctatt attgtcagca tattcgtgaa 780

ctgacacgta gtgaaggtgg tccgtcatgg cagattaaac gt 822

<210> 2

<211> 822

<212> PRT

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 2

Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Gly Pro Leu Gly Leu Ala Gly Arg

1 5 10 15

Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Met Ala Gln Val Lys Leu Gln Glu

20 25 30

Ser Gly Glu Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys

35 40 45

Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr Met Tyr Trp Val Arg

50 55 60

Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Ile Ile Ser Asp Gly

65 70 75 80

Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile

85 90 95

Ser Arg Asp Asn Thr Lys Lys Asn Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu

100 105 110

Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Pro His Tyr

115 120 125

Ser Gly Ser Ser Arg Leu Phe Val Asn Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val

130 135 140

Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

145 150 155 160

Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val

165 170 175

Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser Val

180 185 190

Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gln Gln Lys Pro Gly

195 200 205

Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly

210 215 220

Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu

225 230 235 240

Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln

245 250 255

His Ile Arg Glu Leu Thr Arg Ser Glu Gly Gly Pro Ser Trp Gln Ile

260 265 270

Lys Arg

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

caacgtgaaa aaattattat tcgc 24

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gtaaatgaat tttctgtatg a 21

<210> 5

<211> 750

<212> DNA

<213> Balb/c小鼠(Mus musculus)

<400> 5

atggcccagg tgaagctgca ggagtctggg gaaggcttag tgaagcctgg agggtccctg 60

aaactctcct gtgcagcctc tggattcact ttcagtgact attacatgta ttgggttcgc 120

cagactccgg aaaagaggct ggagtgggtc gcaatcatta gtgatggtgg tagttacacc 180

tactatccag acagtgtgaa ggggcgattc accatctcca gagacaatac caagaaaaac 240

ctgtacctgc aaatgagcag tctgaggtct gaggacacag ccatgtatta ctgtgcaaga 300

gatccccatt actccggtag tagccgcctg tttgttaact ggggccaagg caccacggtc 360

accgtctcct caggtggagg cggttcaggc ggaggtggct ctggcggtgg cggatcggac 420

atcgagctca ctcagtctcc agcttcctta gctgtatctc tggggcagag ggccaccatc 480

tcatacaggg ccagcaaaag tgtcagtaca tctggctata gttatatgca ctggaaccaa 540

cagaaaccag gacagccacc cagactcctc atctatcttg tatccaacct agaatctggg 600

gtccctgcca ggttcagtgg cagtgggtct gggacagact tcaccctcaa catccatcct 660

gtggaggagg aggatgctgc aacctattac tgtcagcaca ttagagagct tacacgttcg 720

gaggggggac caagctggca aatcaaacgg 750

<210> 6

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gaagaagaag aagaagaaga agaaggtccg ctgggtctgg ctggtcgtcg tcgtcgtcgt 60

cgtcgtcgtc gt 72

<210> 7

<211> 822

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gaagaagaag aagaagaaga agaaggtccg ctgggtctgg ctggtcgtcg tcgtcgtcgt 60

cgtcgtcgtc gtatggccca ggtgaagctg caggagtctg gggaaggctt agtgaagcct 120

ggagggtccc tgaaactctc ctgtgcagcc tctggattca ctttcagtga ctattacatg 180

tattgggttc gccagactcc ggaaaagagg ctggagtggg tcgcaatcat tagtgatggt 240

ggtagttaca cctactatcc agacagtgtg aaggggcgat tcaccatctc cagagacaat 300

accaagaaaa acctgtacct gcaaatgagc agtctgaggt ctgaggacac agccatgtat 360

tactgtgcaa gagatcccca ttactccggt agtagccgcc tgtttgttaa ctggggccaa 420

ggcaccacgg tcaccgtctc ctcaggtgga ggcggttcag gcggaggtgg ctctggcggt 480

ggcggatcgg acatcgagct cactcagtct ccagcttcct tagctgtatc tctggggcag 540

agggccacca tctcatacag ggccagcaaa agtgtcagta catctggcta tagttatatg 600

cactggaacc aacagaaacc aggacagcca cccagactcc tcatctatct tgtatccaac 660

ctagaatctg gggtccctgc caggttcagt ggcagtgggt ctgggacaga cttcaccctc 720

aacatccatc ctgtggagga ggaggatgct gcaacctatt actgtcagca cattagagag 780

cttacacgtt cggagggggg accaagctgg caaatcaaac gg 822

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gaagaagaag aagaagaaga ag 22

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

acgtttaatc tgccatgacg 20

Claims (4)

1.一种编码ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白的DNA分子或基因，其特征在于：编码ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种原核重组表达载体，其特征在于：含有权利要求1所述的DNA分子或基因，并将编码ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白的基因克隆至原核表达载体pET-32a的Kpn I和Hind III限制性内切酶识别位点之间。

3.一种原核重组表达菌株，其特征在于：它由权利要求2所述的原核重组表达载体经过化学转化或电转化至大肠杆菌Origami（DE3）感受态中而成，并能够表达ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白。

4.一种制备ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白的方法，其特征在于该方法包括如下步骤：a）将权利要求1所述ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白基因按照大肠杆菌宿主细胞的密码子偏好进行密码子优化后，克隆至原核表达载体pET-32a中，构建重组原核表达载体；b）将步骤a）所述重组原核表达载体转化宿主细胞Origami（DE3）感受态中；c）通过自诱导培养基在发酵罐中诱导重组原核表达菌株表达ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白，发酵条件为：取pET32a-ACPP-p21Ras scfv/Origami(DE3)二级种子液按1:50的比例接种于60L自诱导培养基中，以37℃、200rpm培养8h完成菌体扩增，再以28℃，pH7.4左右，200rpm的条件下诱导表达18h，期间通过流加乳糖、蛋白胨和酵母粉进行补料；d）离心收集菌体，使用超声缓冲液重悬菌体，冰上超声30min，在超声裂解物加入纯的TritonX-100至终浓度为1％（V/V），冰上孵育10min，然后离心收集包涵体沉淀，并洗涤包涵体去除杂质，最后用平衡缓冲液溶解包涵体沉淀，离心收集上清液；e）利用AKTA层析系统采用镍离子亲和层析从上一步的包涵体溶解上清中分离纯化ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白，纯化条件为：用Xk30/20层析柱，其内径为2cm，高为30cm，将25ml的Ni Sepharose 6 FF/HP 层析填料装入柱中，设流速为10ml/min，用3个柱体积的平衡缓冲液平衡镍柱后，将含有包涵体蛋白的平衡缓冲液向镍柱上样，保持压力低于0.4MPa，上样结束后用20倍柱体积的洗涤缓冲液洗涤杂蛋白，洗涤缓冲液配方为25mM咪唑/1X PBS，当冲洗到流出液OD值小于0.01时，用5倍柱体积的洗脱缓冲液洗脱目的蛋白并收集柱中的ACPP-抗p21Ras单链抗体融合蛋白，洗脱缓冲液配方为250mM咪唑/1X PBS，并通过梯度透析和复性使融合蛋白恢复免疫学活性。

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