CN112661844B

CN112661844B - 一种靶向EGFRvIII的单链抗体及应用

Info

Publication number: CN112661844B
Application number: CN202011294512.5A
Authority: CN
Inventors: 刘亭; 张煜彬; 官志忠; 王永林; 李勇军
Original assignee: Guizhou Medical University
Current assignee: Guizhou Medical University
Priority date: 2020-11-18
Filing date: 2020-11-18
Publication date: 2022-05-03
Anticipated expiration: 2040-11-18
Also published as: CN112661844A

Abstract

本发明涉及基因工程抗体技术领域，具体涉及一种靶向EGFRvIII的单链抗体及应用。本发明利用基因工程制备并筛选的抗EGFRvIII单链抗体，所得的抗EGFRvIII单链抗体特异性较高，具有良好的生物活性，能够有效的与EGFRvIII蛋白进行结合；使用本发明的抗EGFRvIII单链抗体与抗肿瘤药物偶联之后的抗体偶联药物对多种表达EGFRvIII的癌细胞组织具有良好的靶向性，对有EGFRvIII表达的靶标细胞具有良好的杀伤效果，对于非靶标细胞的杀伤较低；并且相较于完整抗体，本发明的抗EGFRvIII单链抗体与药物偶联物能够降低完整抗体与药物偶联物在体内的清除速率，延长半衰期，从而提高药物的体内利用率，具有更好的体内药动学特性。

Description

一种靶向EGFRvIII的单链抗体及应用

技术领域

本发明涉及基因工程抗体技术领域，具体涉及一种靶向EGFRvIII的单链抗体及应用。

背景技术

EGFR是一种分子量约为170kDa的跨膜糖蛋白，也称为ErbB或HER受体，是表皮生长因子受体家族的一员。EGFR家族成员参与许多癌症进程中的血管生成、细胞分化、增殖、存活的重要信号通路，并且在正常细胞生长以及恶性转化，预防细胞凋亡，耐药性，肿瘤干细胞和多种癌症的转移中发挥重要作用。EGFR拥有很多的突变体，其中最常见的就是EGFRvIII。这种突变起源于其胞外区的外显子2-7框内缺失，导致841个编码碱基对的丢失，变为分子量只有145kDa的糖蛋白，由于缺乏胞外的L1和CR1(富含半胱氨酸)的亚结构域，因此没有被任何配体激活的能力。EGFRvIII作为组成型激活突变体，能够促进细胞内有丝分裂和生长支持信号传导，还能促进恶性肿瘤的发展，是肿瘤靶向治疗的理想靶点。目前已经在许多人类恶性肿瘤中检测到EGFRvIII的存在，包括肺癌、结肠直肠癌、多形性胶质母细胞瘤、胸腺癌和头颈癌。并且在包括正常乳腺组织在内的成人组织中，并没有发现可检测水平EGFRvIII的存在，可作为一个靶标治疗的理想靶点。

由于靶向EGFRvIII抗体常存在耐药的现象，导致目前针对EGFRvIII的靶标药物进入市场的数量非常少，主要都是抗其他类型EGFR的单链抗体及相关药物，如专利CN200910308102.9(抗EGFR单链抗体融合Gelonin重组免疫毒素及其制备方法与用途)、CN201010148069.0(一种高亲和力的抗EGFR单克隆抗体)，因此，寻找一特异性较高，用其制备的抗体偶联药物具有良好靶向性，相较于完整抗体具有更好的体内药动学特性的抗EGFRvIII单链抗体及其制备方法与应用是当务之急。

发明内容

为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供靶向EGFRvIII的单链抗体及应用，具体是通过以下技术方案得以实现的：

一种抗EGFRvIII的单链抗体，包括重链CDR1-3和轻链CDR1-3，所述重链CDR1-3的氨基酸序列分别为：

CDR1：GFTFSKFG；

CDR2：ISTGGYYT；

CDR3：RGYSSTKEWNDY；

所述轻链CDR1-3的氨基酸序列分别为：

CDR1：TDIDDD；

CDR2：EGNSFIP；

CDR3：QQLQSFNVPLT。

进一步的，所述重链可变区的氨基酸序列为：QVQLQESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSKFGMSWVRQTPDKRLEWVATISTGGYYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARGYSSTKEWMDYWGQGTMVTVSS；

所述轻链可变区的氨基酸序列为：SDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASTDIDDDMNWYQQKPGKTPKLLIYEGNSFIPGVPSRFSGSGSGTDFIFTISSLQPEDIATYYCQQLQSFNVPLTFGGGTKVEIK。

进一步的，所述重链CDR1-3的碱基序列分别为：

CDR1：GGCTTTACCTTTAGCAAATTTGGC；

CDR2：ATTAGCACCGGCGGCTATTATACC；

CDR3：CGTGGCTATAGCAGCACCAAAGAATGGATGGATTAT；

所述轻链CDR1-3的碱基序列分别为：

CDR1：ACCGATATTGATGATGAT；

CDR2：GAAGGCAACAGCTTTATTCCG；

CDR3：CAGCAGCTGCAGAGCTTTAACGTGCCGCTGACC。

所述的单链抗体在制备抗癌药物中的应用。

进一步的，所述抗癌药物，是治疗癌症组织中有EGFRvIII存在的癌症的药物。本申请的单链抗体，是抗EGFRvIII单链抗体，具有良好的生物活性，能够有效的与EGFRvIII蛋白进行结合，使用该抗体偶联的抗体偶联药物，对有EGFRvIII存在的的靶细胞有较好的靶向性及杀伤效果。

进一步的，所述抗癌药物，是治疗肺癌、结肠直肠癌、多形性胶质母细胞瘤、胸腺癌、头颈癌中一种或多种的药物。目前已经在许多人类恶性肿瘤中检测到EGFRvIII的存在，包括肺癌、结肠直肠癌、多形性胶质母细胞瘤、胸腺癌和头颈癌。然而，在包括正常乳腺组织在内的成人组织中，并没有发现可检测水平EGFRvIII的存在，可作为一个靶标治疗的理想靶点。本申请的抗EGFRvIII单链抗体，对肺癌、结肠直肠癌、多形性胶质母细胞瘤、胸腺癌、头颈癌等具有良好的靶向性。

进一步的，所述制备抗癌药物，是使用所述的单链抗体与小分子药物连接，得到抗体药物偶联物。

与现有技术相比，本发明创造的技术效果体现在：

(1)本发明利用基因工程制备并筛选的抗EGFRvIII单链抗体，所得的抗EGFRvIII单链抗体特异性较高，具有良好的生物活性，能够有效的与EGFRvIII蛋白进行结合。

(2)使用本发明的抗EGFRvIII单链抗体与抗肿瘤药物偶联之后的抗体偶联药物对多种有EGFRvIII的存在癌细胞组织具有良好的靶向性，对有EGFRvIII的存在的靶标细胞具有良好的杀伤效果，对于非靶标细胞的杀伤力极低。

(3)相较于完整抗体，本发明的抗EGFRvIII单链抗体与药物偶联物能够降低完整抗体与药物偶联物在体内的清除速率，延长半衰期，从而提高药物的体内利用率，具有更好的体内药动学特性。

附图说明

图1是DKMG细胞免疫荧光实验照片图。

图2是U87MG细胞免疫荧光实验照片图。

图3是PD0721突变体蛋白与MMAE偶联物对表达EGFRvIII靶标的人胶质母细胞瘤细胞DKMG的体外抗肿瘤活性结果图。

图4是PD0721突变体蛋白与MMAE偶联物对不表达EGFRvIII靶标的人脑星形胶质母细胞瘤细胞U87MG的体外抗肿瘤活性结果图。

具体实施方式

下面结合具体的实施方式来对本发明的技术方案做进一步的限定，但要求保护的范围不仅局限于所作的描述。

实施例

单链抗体的筛选制备：

1.免疫动物

首先使用EGFRvIII多肽(LEEKKGNYVVTDHC)以及佐剂免疫8周龄BALB/c小鼠10只，分为实验组(EGFRvIII多肽与佐剂1：1混合，用量为100μg/只)和对照组(佐剂用量为100μg/只)。

2.ELISA检测免疫结果

在免疫第30天，将小鼠断尾取血，200μl/只，于离心机中2000rpm/min离心5min。取血清于干净的1.5mL离心管，-20℃保存。用PBS(pH7.2)稀释EGFRvⅢ多肽至1μg/mL，以100μl/孔加入酶标板，4℃包被12h。每孔加入300μl PBST洗板5次，以300μl/孔加入1％BSA-PBST溶液，37℃封闭2h。使用PBST洗板5次，加入用PBS稀释至不同浓度的血清100μl/孔(1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200)和阴性对照(用佐剂免疫的小鼠血清)，于37℃反应1h。使用PBST洗板5次，以100μl/孔加入HRP标记羊抗鼠多克隆抗体(1:10000)，于37℃反应45min。使用PBST洗板5次，以100μl/孔加入显色液(TMB)，于37℃避光反应45min(血清的效价越高，其反应的颜色越深)。每孔加入100μl 2mol/L硫酸以终止其反应(溶液颜色由蓝变黄)。于酶标仪(BIO-RAD，型号Model680)以450nm为检测波长、630nm为参比波长检测.若样品的OD值大于阴性组OD值得2.1倍，视为阳性，检测结果如表1，根据检测结果选取效价最高的小鼠(1号小鼠)进行下一步实验。

表1免疫效果的测定

3.杂交瘤细胞株的构建

3.1 SP2/0骨髓瘤细胞的培养

SP2/0骨髓瘤细胞用含10％胎牛血清的1640培养基于37℃、5％CO₂恒温培养箱中培育，24h后更换培养基，每隔2天按1:4比例传代。

3.2饲养细胞的制备

选取效价最高的BALB/c小鼠(已被免疫)，摘除眼球采血，于离心后取血清至干净的15mL离心管中作为阳性血清，血清保存于-20℃。脱颈处死小鼠后，用75％酒精浸泡小鼠6min，解剖小鼠，取出脾脏制备成单细胞悬液，并吸取适量细胞使用台酚蓝染液作活细胞计数。

3.3细胞融合

对脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞分别计数，将SP2/0骨髓瘤细胞和脾细胞按1:8混合，离心去除细胞液，使用1640不完全培养基清洗一次，去除细胞液后，缓慢的加入1ml 50％的PEG 3350并摇晃1min。加入不完全培养基终止融合，离心后弃上清，用完全培养基将细胞重悬，以100μl/孔加入96孔板中，外围降入PBS提供合适的环境共4块板，置于37℃，5％CO₂培养温箱中培养。

3.4杂交瘤细胞株的筛选

待细胞融合第3天将1640培养基换为HAT培养基，100μl/孔；待细胞融合第10天将培养基换成HT完全培养基，100μl/孔；细胞融合第14天改用完全培养基培养细胞，100μl/孔，继续观察细胞。在细胞融合后的第14天取培养基上清液，按上述方法进行间接ELISA实验，结果如表2、表3、表4、表5，选取效价最高的孔，进行进一步筛选。将初次筛选的阳性孔细胞(OD值大于1或者接近1的孔)消化下来，用完全培养基将细胞稀释至2×10⁴个，以100μl/孔加入96孔板(外围每孔加入PBS 100μl)，筛选条件同上，在培养第14天取培养基上清，按上述方法进行间接ELISA实验，结果如表7、表8、表9和表10。结果表明2F4为效价最好的杂交瘤细胞。

表2杂交瘤细胞初次筛选结果(板1)

表3杂交瘤细胞初次筛选结果(板2)

表4杂交瘤细胞初次筛选结果(板3)

表5杂交瘤细胞初次筛选结果(板4)

表6杂交瘤细胞第二次筛选结果(1D6)

表7杂交瘤细胞第二次筛选结果(2F4)

表8杂交瘤细胞第二次筛选结果(3C10)

表9杂交瘤细胞第二次筛选结果(4E9)

4.单克隆抗体的序列测定

取筛选出的活性最高的杂交瘤细胞，按照

Super总RNA提取试剂盒说明书提取总RNA和5’RACE反转录cDNA。以上游引物5’-ATATTCAGATGACCCAGAGT-3’和下游引物5’-TTAATTTCAACTTTGGTGCC-3’钓取重链可变区基因；以上游引物5’-AGGTTCAGCTGCAAGAAAGC-3’和下游引物5’-CTGCTAACGGTAACCATTGT-3’钓取轻链可变区基因。

5.构建重链、轻链表达载体

使用柔性多肽“SGGGSGGGGSGGGGS”将重链可变区基因与轻链可变区基因连接起来，并将重组可变区基因片段通过TA连接与pET-22b(+)载体相连，转化感受态细菌，挑取阳性克隆培养，获得重组可变区基因pET-22b(+)质粒。

6.进行易错PCR扩增

根据上述构建的重组可变区基因pET-22b(+)质粒为模板，进行易错PCR扩增。PCR引物设计如下：

上游引物：5’-CCATGGTAATACGACTCACTATAGGG-3’

下游引物：5’-CTCGAGTGCTAGTTATTGCTCAGCGG-3’

PCR扩增体系为50μL，其中：5μL 10x易错PCR缓冲液，14μL Mg²⁺(25mmol/L)，4μLdNTP(2.5mmol/L dGTP、2.5mmol/L dATP、2.5mmol/L dCTP和2.5mmol/L dTTP混合物)，1μL上游引物(l0 pmol/μL)，1μL下游引物(10pmol/μL)，3μL 5mmol/LMnCl，1μL质粒模板(10pmol/L)，5U Taq DNA聚合酶，灭菌超纯水补至50μL。

PCR扩增程序为：94℃变性5min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸2min，30次循环，最后再72℃延伸5min。PCR产物经过电泳检测，其条带单一、清晰。

将易错PCR产物用PCR纯化试剂盒进行纯化回收。纯化后的易错PCR产物用限制性内切酶Xho I和Nco I于37℃进行酶切。酶切条件为：DNA 40μL、10x green buffer 10μL、Xho I 2.5μL、Nco I 2.5μL、ddH₂0 44μL，37℃酶切30min。酶切后的PCR产物用PCR纯化试剂盒进行纯化。

pET-22b(+)用限制性内切酶Xho I和Nco I进行双酶切，酶切条件为：DNA 80μL、10x green buffer 10μL、Xho I 2.5μL、Nco I 2.5μL和ddH₂O 5μL，37℃酶切30min。经酶切后的pET-22b(+)进行电泳纯化并回收。

经酶切、纯化后的PCR产物与pET-22b(+)连接。连接条件为：10x T4 buffer2μL、酶切后的PCR产物8μL、酶切后的质粒载体9μL和T4连接酶lμL，连接温度为22℃，连接25min。采用热激法将连接产物转化到大肠杆菌BL21(λDE3)感受态细胞(氯化钙法)中。转化产物涂布于含有终浓度为100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基,37℃培养12h。

7.突变抗体的诱导表达

通过易错PCR方法构建的突变体，采用96孔板进行表达。将LB固体培养基平板上的单菌落逐个挑到每孔含有600μL LB培养基(含50mg/L氨苄青霉素)的96孔板中(种子板)，于37℃、180r/min培养过夜。培养好的菌液按每孔10％的接种量，接种到新的每孔含有900μLTB培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)的96孔板(表达板)中。同时，种子板中每个孔加入100μL 50％的甘油，-80℃保存。表达板于37℃，200r/min摇床中进行培养，待菌液的OD₆₀₀达到0.6左右时，每孔加入2μL 0.5mg/L的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)进行诱导。诱导8h后，4℃12000r/min离心10min，弃上清液，再用PBS缓冲液洗涤2次，相同条件离心收集菌体。

8.突变抗体文库的筛选

收集好的菌体放入-80℃冰箱过夜，然后每个孔加入150μL的裂解液PMSF，于37℃反应约30min，4500r/min离心10min，收集上清液，稀释一定的倍数后，按上述方法进行间接ELISA实验，结果如表10、表11，选取反应活性最高上清液所对应的菌株，命名为PD0721株，供后续实验。

表10 PD721突变抗体文库筛选结果(板1)

表11 PD721突变抗体文库筛选结果(板2)

9.对筛选得到的突变蛋白进行测序

将步骤5获得的PD0721菌株于37℃180r/min培养过夜。收集菌体并按照常规的裂解方式提取质粒，送上海生工生物工程有限公司测序，获得质粒中的突变基因PD0721的序列如下所示：

CAGGTGCAGCTGCAGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTGAAACCGGGCGGCAGCCTGAAACTGAGCTGCGCGGCGAGCGGCTTTACCTTTAGCAAATTTGGCATGAGCTGGGTGCGTCAGACCCCGGATAAACGTCTGGAATGGGTGGCGACCATTAGCACCGGCGGCTATTATACCTATTATCCGGATAGCGTGAAAGGCCGTTTTACCATTAGCCGTGATAACGCGAAAAACACCCTGTATCTGCAGATGAGCAGCCTGAAAAGCGAAGATACCGCGATGTATTATTGCGCGCGTGGCTATAGCAGCACCAAAGAATGGATGGATTATTGGGGCCAGGGCACCATGGTGACCGTGAGCAGCAGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGATATTCAGATGACCCAGAGCCCGAGCAGCCTGAGCGCGAGCGTGGGCGATCGTGTGACCATTACCTGCCAGGCGAGCACCGATATTGATGATGATATGAACTGGTATCAGCAGAAACCGGGCAAAACCCCGAAACTGCTGATTTATGAAGGCAACAGCTTTATTCCGGGCGTGCCGAGCCGTTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTTTATTTTTACCATTAGCAGCCTGCAGCCGGAAGATATTGCGACCTATTATTGCCAGCAGCTGCAGAGCTTTAACGTGCCGCTGACCTTTGGCGGCGGCACCAAAGTGGAAATTAAA；

其编码的氨基酸序列如下所示：

QVQLQESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSKFGMSWVRQTPDKRLEWVATISTGGYYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARGYSSTKEWMDYWGQGTMVTVSSSGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASTDIDDDMNWYQQKPGKTPKLLIYEGNSFIPGVPSRFSGSGSGTDFIFTISSLQPEDIATYYCQQLQSFNVPLTFGGGTKVEIK。

10.免疫荧光实验

将DKMG与U87MG细胞以合适的密度铺激光共聚焦培养皿(2×10⁴-5×10⁵个/孔)，37℃培养24h。待细胞贴壁后，弃去孔中液体，使用PBS清洗细胞3次，加入终浓度未20μg/mL的单链抗体PD0721，37℃孵育2h。弃去孔中液体，使用PBS清洗细胞3次，加入冰的4％多聚甲醛，室温固定15-20min。弃去细胞固定液，使用PBS清洗细胞3次，使用0.1％TritonX-100，室温通透细胞15min。弃去细胞通透液，使用PBS清洗细胞3次，加入2％BSA，37℃封闭2h。弃去细胞封闭液，每孔加入使用BSA-PBS稀释的FITC标记的抗体(稀释比例为1:500)，37℃避光孵育15min。弃去荧光标记的抗体，使用PBS清洗细胞3次，加入可覆盖孔板量的使用PBS稀释的DAPI避光孵育5min。弃去DAPI染色液，使用PBS清洗细胞3次，使用λ_488nm的激发光观察FITC的绿色荧光，λ_405nm的激发光观察DAPI的蓝色荧光，使用荧光显微镜进行观察、拍照。结果如图1、2所示，对于靶标细胞，PD0721单链抗体能够与其结合，因此细胞周围有绿色荧光信号；对于非靶标细胞，由于PD0721单链抗体不能够与其进行特异性的结合，因此细胞周围没有绿色荧光信号。

11.PD0721与MMAE偶联

取0.5mg PD0721抗体蛋白溶解于0.8mL PBS(pH 6.0，含10μM ZnCl₂)中，加入6μL磷酸三(β-氯乙基)酯(TCEP)，37℃水浴2h。边搅拌边加入用50μL 30％乙腈/水溶解的10倍过量vcMMAE(10倍过量即反应体系中vcMMAE的摩尔量大于等于PD0721的10倍)，4℃反应40min，加入过量的半胱氨酸终止反应。用截留分子量为10kDa的超滤管除去反应体系中的小分子。所得到的偶联物过0.22μm孔径的水膜除菌，-20℃保存备用。

11.偶联物的体外抗肿瘤活性测定

选择两个类型的细胞：表达EGFRvIII靶标的DKMG、不表达EGFRvIII靶标的U87MG，对PD0721突变抗体与MMAE偶联物的体外抗肿瘤活性进行测定。

下面以表达EGFRvIII靶标的DKMG细胞为例对试验步骤作详细说明，包括：

(1)细胞DKMG消化成为单个细胞后，稀释为1×10⁴个/mL，铺96孔板(每孔100μL)，正常条件下继续培养24小时。

(2)将细胞分为实验组，分别加入不同浓度的PD0721-vcMMAE(0.5、1、2.5、5、10、20μg/mL)；阴性对照组，加入PD0721突变抗体；空白对照组，加入等量培养基。各组皆设置3个复孔。

(3)各组加入相应试剂后，37℃继续培养96h，观察PD0721-vcMMAE偶联物和PD0721突变抗体对目的细胞的杀伤能力。

(4)培养结束后，每孔加入10μL CCK-8显色液，置于培养箱中孵育显色2h，450nm波长处检测吸光度。

(5)数据处理：以实验组中OD值高于同等稀释度的阴性对照的样品为阳性。结果如图3、4所示。对于靶细胞，与PD0721单链抗体相比，偶联物杀伤作用明显更强；对于非靶标细胞，偶联物的细胞杀伤作用虽然较PD0721单链抗体要高，但是其细胞杀伤作用增强幅度明显低于靶标细胞组。

12.偶联物的药动学研究

为了研究单链抗体与药物的偶联物是否达到了改善完整抗体与药物偶联物的体内药动学性质的目的，采用SD大鼠进行验证。将SD大鼠随机分为实验组、对照组，一组5只，分别尾静脉注射PD0721单链抗体与药物偶联物(含MMAE 2mg/kg)以及相应的全长抗体与药物偶联物(含MMAE 2mg/kg)，给药后0.25、0.5、0.75、1、2、4、8、12、24和48h时间点眼眶取血，使用ELISA方法测定实验组、对照组的药物浓度。测试结果如表12所示，可以看到，单链抗体与药物偶联物能够降低完整抗体与药物偶联物在体内的清除速率，延长半衰期，从而提高药物的体内利用率。

表12时间-血药浓度表

最后，应当指出，以上实施例仅是本发明较有代表性的例子。显然，本发明的技术方案并不限于上述实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

<110> 贵州医科大学

<120> 一种靶向EGFRvIII的单链抗体及其应用

<141> 2020-11-17

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Gly Phe Thr Phe Ser Lys Phe Gly

1 5

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Ile Ser Thr Gly Gly Tyr Tyr Thr

1 5

<210> 3

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Arg Gly Tyr Ser Ser Thr Lys Glu Trp Asn Asp Tyr

1 5 10

<210> 4

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Thr Asp Ile Asp Asp Asp

1 5

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Glu Gly Asn Ser Phe Ile Pro

1 5

<210> 6

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Gln Gln Leu Gln Ser Phe Asn Val Pro Leu Thr

1 5 10

<210> 7

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Thr Gly Gly Tyr Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Tyr Ser Ser Thr Lys Glu Trp Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 8

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 8

Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val

1 5 10 15

Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Thr Asp Ile Asp Asp

20 25 30

Asp Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Thr Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Glu Gly Asn Ser Phe Ile Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ile Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln

65 70 75 80

Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Gln Ser Phe Asn

85 90 95

Val Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ggctttacct ttagcaaatt tggc 24

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

attagcaccg gcggctatta tacc 24

<210> 12

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

cgtggctata gcagcaccaa agaatggatg gattat 36

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

accgatattg atgatgat 18

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gaaggcaaca gctttattcc g 21

<210> 15

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

cagcagctgc agagctttaa cgtgccgctg acc 33

<210> 15

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

ccatggtaat acgactcact ataggg 26

<210> 16

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

ctcgagtgct agttattgct cagcgg 26

<210> 17

<211> 732

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

caggtgcagc tgcaggaaag cggcggcggc ctggtgaaac cgggcggcag cctgaaactg 60

agctgcgcgg cgagcggctt tacctttagc aaatttggca tgagctgggt gcgtcagacc 120

ccggataaac gtctggaatg ggtggcgacc attagcaccg gcggctatta tacctattat 180

ccggatagcg tgaaaggccg ttttaccatt agccgtgata acgcgaaaaa caccctgtat 240

ctgcagatga gcagcctgaa aagcgaagat accgcgatgt attattgcgc gcgtggctat 300

agcagcacca aagaatggat ggattattgg ggccagggca ccatggtgac cgtgagcagc 360

agcggcggcg gcagcggcgg cggcggcagc ggcggcggcg gcagcgatat tcagatgacc 420

cagagcccga gcagcctgag cgcgagcgtg ggcgatcgtg tgaccattac ctgccaggcg 480

agcaccgata ttgatgatga tatgaactgg tatcagcaga aaccgggcaa aaccccgaaa 540

ctgctgattt atgaaggcaa cagctttatt ccgggcgtgc cgagccgttt tagcggcagc 600

ggcagcggca ccgattttat ttttaccatt agcagcctgc agccggaaga tattgcgacc 660

tattattgcc agcagctgca gagctttaac gtgccgctga cctttggcgg cggcaccaaa 720

gtggaaatta aa 732

<210> 18

<211> 244

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 18

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Thr Gly Gly Tyr Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Tyr Ser Ser Thr Lys Glu Trp Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser

130 135 140

Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala

145 150 155 160

Ser Thr Asp Ile Asp Asp Asp Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly

165 170 175

Lys Thr Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Glu Gly Asn Ser Phe Ile Pro Gly

180 185 190

Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ile Phe

195 200 205

Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln

210 215 220

Gln Leu Gln Ser Phe Asn Val Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys

225 230 235 240

Val Glu Ile Lys

Claims

1.一种抗EGFRvIII的单链抗体，其特征在于，包括重链CDR1-3和轻链CDR1-3，所述重链CDR1-3的氨基酸序列分别为：

CDR1：GFTFSKFG；

CDR2：ISTGGYYT；

CDR3：RGYSSTKEWNDY；

所述轻链CDR1-3的氨基酸序列分别为：

CDR1：TDIDDD；

CDR2：EGNSFIP；

CDR3：QQLQSFNVPLT。

2.如权利要求1所述的单链抗体，其特征在于，所述重链可变区的氨基酸序列为： QVQLQESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSKFGMSWVRQTPDKRLEWVATISTGGYYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARGYSSTKEWMDYWGQGTMVTVSS；

所述轻链可变区的氨基酸序列为： SDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASTDIDDDMNWYQQKPGKTPKLLIYEGNSFIPGVPSRFSGSGSGTDFIFTISSLQPEDIATYYCQQLQSFNVPLTFGGGTKVEIK。

3.权利要求1-2任一项所述的单链抗体在制备抗多形性胶质母细胞瘤药物中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，使用所述的单链抗体与小分子药物连接，得到抗体药物偶联物。