CN116410312A

CN116410312A - 一种新型upar单域抗体的开发

Info

Publication number: CN116410312A
Application number: CN202111642915.9A
Authority: CN
Inventors: 杨林; 游凤涛
Original assignee: Persongen Biotherapeutics Suzhou Co ltd
Current assignee: Persongen Biotherapeutics Suzhou Co ltd
Priority date: 2021-12-29
Filing date: 2021-12-29
Publication date: 2023-07-11
Also published as: WO2023125842A1

Abstract

本发明提供了抗UPAR单域抗体。具体地，本发明通过噬菌体展示库筛选技术获得了多个抗UPAR的单域抗体。本发明的抗UPAR的单域抗体能够高效地与UPAR结合，具备在相关疾病治疗中的应用前景。

Description

一种新型UPAR单域抗体的开发

技术领域

本发明涉及生物医药领域。具体地说，本发明涉及抗UPAR单域抗体。

背景技术

近年来，人口老龄化已逐渐成为社会关注的焦点，而衰老与感染性疾病、心血管疾病、神经退行性疾病、自身免疫失调性疾病、肿瘤等疾病的发生率升高直接相关。机体衰老伴随着免疫功能的紊乱是这些疾病发生的重要原因之一。

近年来已开发出几种小分子抗衰老剂，虽然能够消除衰老细胞但是其治疗效果低且伴有严重的副作用。越来越多的科研人员致力于开发一种能够安全有效地清除衰老细胞的“抗衰老剂”。CAR-T疗法是目前一种突破性的癌症治疗手段，通过基因编辑技术在T细胞上装上具有定位功能的CAR(肿瘤嵌合抗原受体)，就可以达到识别肿瘤细胞，诱发免疫反应，并且高效杀伤肿瘤细胞的目的。这一治疗方法的出现也为科研人员在抗衰老剂的研究中提供了新的思路。如果CAR-T细胞能够识别衰老细胞，就可以将抗肿瘤疗法转变成抗衰老的疗法。传统的疾病干预方法是患病之后的治疗，随着医学技术的发展，将干预的时间点提前，预防衰老及衰老相关恶性疾病的发生将是一个新的趋势。

目前针对抗衰老的代表性药物有：雷帕霉素、达沙替尼+槲皮素、漆黄素和UBX0101等抗衰老剂，但是这些药物具有潜在的副作用，其一是对衰老细胞的靶向清除能力依然不够精确，会对正常细胞造成损伤；其二由于过早使用抗衰老药物会引发干细胞枯竭，而过晚使用则会影响效果；其三是衰老细胞被大量杀死后，留下的产物通常无法得到及时的清除，这也会成为危害健康的潜在风险。所以开发新型的抗衰老药物是待解决的需求，而CAR-T细胞药物的开发，极可能会成为治疗衰老的一种趋势。开发识别衰老细胞的第一步应该是确定衰老细胞的表面特征。有文章报道通过对三个独立的由衰老模型建立的RNA测序数据，分析了衰老的人和小鼠细胞中发现的跨膜蛋白的表达，最终确定了尿激酶型纤溶酶原激动剂受体(UPAR)为衰老细胞的“身份证”。

然而，目前本领域尚缺少针对UPAR的，可以用于构建靶向UPAR的CAR-T细胞药物或其他药物的纳米抗体。

因此，本领域有需要开发一种UPAR纳米抗体。

发明内容

本发明的目的在于提供一种针对UPAR的单域抗体及其应用。

在本发明的第一方面，提供了一种抗UPAR单域抗体，所述抗UPAR单域抗体VHH链的互补决定区CDR为选自下组的一种或多种：

(1)SEQ ID NO:16所示的CDR1、SEQ ID NO:17所示的CDR2、和SEQ ID NO:18所示的CDR3；

(2)SEQ ID NO:19所示的CDR1、SEQ ID NO:20所示的CDR2、和SEQ ID NO:21所示的CDR3；

(3)SEQ ID NO:22所示的CDR1、SEQ ID NO:23所示的CDR2、和SEQ ID NO:24所示的CDR3；

(4)SEQ ID NO:25所示的CDR1、SEQ ID NO:26所示的CDR2、和SEQ ID NO:27所示的CDR3；

(5)SEQ ID NO:28所示的CDR1、SEQ ID NO:29所示的CDR2、和SEQ ID NO:30所示的CDR3；

(6)SEQ ID NO:31所示的CDR1、SEQ ID NO:32所示的CDR2、和SEQ ID NO:33所示的CDR3；

(7)SEQ ID NO:34所示的CDR1、SEQ ID NO:35所示的CDR2、和SEQ ID NO:36所示的CDR3；

(8)SEQ ID NO:37所示的CDR1、SEQ ID NO:38所示的CDR2、和SEQ ID NO:39所示的CDR3；

(9)SEQ ID NO:40所示的CDR1、SEQ ID NO:26所示的CDR2、和SEQ ID NO:41所示的CDR3；

(10)SEQ ID NO:42所示的CDR1、SEQ ID NO:43所示的CDR2、和SEQ ID NO:44所示的CDR3；

(11)SEQ ID NO:45所示的CDR1、SEQ ID NO:46所示的CDR2、和SEQ ID NO:47所示的CDR3；

(12)SEQ ID NO:48所示的CDR1、SEQ ID NO:49所示的CDR2、和SEQ ID NO:50所示的CDR3；

(13)SEQ ID NO:51所示的CDR1、SEQ ID NO:38所示的CDR2、和SEQ ID NO:52所示的CDR3；和

(14)SEQ ID NO:37所示的CDR1、SEQ ID NO:53所示的CDR2、和SEQ ID NO:54所示的CDR3。

在另一优选例中，所述的抗UPAR单域抗体的VHH链还具有框架区(FR)。

在另一优选例中，所述的FR具有衍生自SEQ ID NO:1-15中任一项所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述的抗UPAR单域抗体的VHH链的氨基酸序列选自SEQ ID NO:1-15所示的序列。

在另一优选例中，所述的抗UPAR单域抗体的VHH链的氨基酸序列选自SEQ ID NO:3、10或15所示的序列。

在另一优选例中，所述的抗UPAR的单域抗体包括单体、二价体(二价抗体)、和/或多价抗体。

在另一优选例中，所述的抗UPAR的单域抗体为二价体。

在另一优选例中，所述的抗UPAR单域抗体包括人源化抗体、骆驼源抗体、嵌合抗体。

在本发明的第二方面，提供了一种抗UPAR的抗体，所述抗体包括一个或多个如本发明第一方面所述的抗UPAR的单域抗体的VHH链。

在另一优选例中，所述的抗UPAR的抗体包括单体、二价体(二价抗体)、和/或多价抗体。

在另一优选例中，所述二价(或多价)是指，在所述免疫偶联物的氨基酸序列中包含2个(或多个)相同的或不同的如本发明第一方面所述的抗UPAR单域抗体的VHH链序列。

在本发明的第三方面，提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码选自下组的蛋白质：如本发明第一方面所述的抗UPAR单域抗体、或如本发明第二方面所述的抗体。

在另一优选例中，本发明涉及编码本发明的抗UPAR单域抗体的核酸分子。本发明的核酸可为RNA、DNA或cDNA。

在本发明的第四方面，提供了一种表达载体，所述表达载体含有如本发明第三方面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的表达载体选自下组：DNA、RNA、病毒载体、质粒、转座子、其他基因转移系统、或其组合。

在另一优选例中，所述的表达载体为pcDNA3.4-hIgG1-Fc2质粒。

在本发明的第五方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有如本发明第四方面所述的表达载体，或其基因组中整合有如本发明第三方面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的宿主细胞包括原核细胞或真核细胞。

在另一优选例中，所述的宿主细胞选自下组：大肠杆菌、酵母细胞、哺乳动物细胞。

在另一优选例中，所述的宿主细胞为293F细胞。

在本发明的第六方面，提供了一种产生抗UPAR单域抗体的方法，包括步骤：

(a)在适合产生单域抗体的条件下，培养如本发明第五方面所述的宿主细胞，从而获得含所述抗UPAR单域抗体的培养物；

(b)从所述培养物中分离和/或回收所述的抗UPAR单域抗体；和

(c)任选地，对步骤(b)获得的抗UPAR单域抗体进行纯化和/或修饰。

在本发明的第七方面，提供了一种免疫偶联物，所述免疫偶联物含有：

(a)如本发明第一方面所述的抗UPAR单域抗体、或如本发明第二方面所述的针对UPAR的抗体；和

(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、细胞因子、放射性核素、酶、金纳米颗粒/纳米棒、纳米磁粒、病毒外壳蛋白或VLP，或其组合。

在另一优选例中，所述的放射性核素包括：

(i)诊断用同位素，所述的诊断用同位素选自下组：Tc-99m、Ga-68、F-18、I-123、I-125、I-131、In-111、Ga-67、Cu-64、Zr-89、C-11、Lu-177、Re-188，或其组合；和/或

(ii)治疗用同位素，所述的治疗用同位素选自下组：Lu-177、Y-90、Ac-225、As-211、Bi-212、Bi-213、Cs-137、Cr-51、Co-60、Dy-165、Er-169、Fm-255、Au-198、Ho-166、I-125、I-131、Ir-192、Fe-59、Pb-212、Mo-99、pd-103、P-32、K-42、Re-186、Re-188、Sm-153、Ra223、Ru-106、Na24、Sr89、Tb-149、Th-227、Xe-133、Yb-169、Yb-177，或其组合。

在另一优选例中，所述偶联部分为可检测标记物。

在另一优选例中，所述偶联部分选自下组：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂，或能够产生可检测产物的酶、放射性核素、生物毒素、细胞因子(如IL-2等)、抗体、抗体Fc片段、抗体scFv片段、金纳米颗粒/纳米棒、病毒颗粒、脂质体、纳米磁粒、前药激活酶(例如，DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))或任何形式的纳米颗粒。

在另一优选例中，所述免疫偶联物含有：多价(如二价)的如本发明第一方面所述的抗UPAR单域抗体的VHH链。

在本发明的第八方面，提供了如本发明第一方面所述的抗UPAR单域抗体，如本发明第二方面所述的针对UPAR的抗体，或如本发明第七方面所述的免疫偶联物的用途，用于制备：

(1)预防和/或治疗UPAR相关的疾病的药物；

(2)检测UPAR的试剂。

在另一优选例中，所述的UPAR相关疾病包括衰老相关疾病、癌症或肿瘤。

在另一优选例中，所述癌症或肿瘤选自下组：血液肿瘤、淋巴瘤、实体瘤、或其组合。

在另一优选例中，所述血液肿瘤选自下组：急性髓细胞白血病(AML)、多发性骨髓瘤(MM)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴白血病(ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、或其组合。

在另一优选例中，所述淋巴瘤选自下组：霍奇金淋巴瘤(HL)，弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡淋巴瘤(FL)、慢性淋巴细胞白细胞(CLL)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、边缘区淋巴瘤(MZL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、伯基特淋巴瘤(BL)以及其他复杂B细胞非霍奇金淋巴瘤。

在另一优选例中，所述实体瘤选自下组：胃癌、胃癌腹膜转移、肝癌、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、宫颈癌、卵巢癌、淋巴癌、鼻咽癌、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、脑胶质瘤、子宫内膜癌、睾丸癌、结直肠癌、尿路肿瘤、甲状腺癌、或其组合。

在另一优选例中，所述的药物用于治疗衰老相关疾病。

在另一优选例中，所述的衰老相关疾病包括：感染性疾病、心血管疾病、神经退行性疾病、自身免疫失调性疾病、肿瘤、或其组合。

在另一优选例中，所述的药物被施用于人，或非人哺乳动物。

在另一优选例中，所示试剂为诊断试剂，较佳地，所述的诊断试剂为检测片或检测板。

在另一优选例中，所述诊断试剂用于：检测样品中的UPAR或其片段。

在本发明的第九方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有：

(i)如本发明第一方面所述的抗UPAR单域抗体、如本发明第二方面所述的针对UPAR的抗体，或如本发明第七方面所述的免疫偶联物；和

(ii)药学上可接受的载体。

在本发明的第十方面，提供了一种重组蛋白，所述的重组蛋白具有：

(i)如本发明第一方面所述的抗UPAR单域抗体、或如本发明第二方面所述的针对UPAR的抗体；和

(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。

在另一优选例中，所述的标签序列包括Fc标签、HA标签和His标签。

在另一优选例中，所述的重组蛋白特异性结合于UPAR。

在本发明的第十一方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒含有如本发明第一方面所述的抗UPAR单域抗体、如本发明第二方面所述的针对UPAR的抗体，或如本发明第七方面所述的免疫偶联物。

在本发明的第十二方面，提供了一种预防和/或治疗UPAR相关疾病的方法，所述方法包括，给需要的对象施用如本发明第一方面所述的抗UPAR单域抗体、如本发明第二方面所述的针对UPAR的抗体，或如本发明第七方面所述的免疫偶联物。

在另一优选例中，所述的对象包括哺乳动物，如人。

在另一优选例中，所述的UPAR相关疾病包括癌症或自身免疫性疾病。

在本发明的第十三方面，提供了一种体外检测样品中UPAR或其片段的方法，所述方法包括步骤：

(1)在体外，将所述样品与如本发明第一方面所述的抗UPAR单域抗体、如本发明第二方面所述的针对UPAR的抗体，或如本发明第七方面所述的免疫偶联物接触；

(2)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在UPAR或其片段。

在另一优选例中，所述的检测包括诊断性的或非诊断性的。

在本发明的第十四方面，提供了一种针对UPAR相关疾病的诊断方法，包括步骤：

(i)从诊断对象获取一样品，将所述的样品与如本发明第一方面所述的抗UPAR单域抗体、如本发明第二方面所述的针对UPAR的抗体、或如本发明第七方面所述的免疫偶联物接触；和

(ii)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示所述的对象患有UPAR相关疾病。

在本发明的第十五方面，提供了一种重组多肽的制备方法，所述的重组多肽是如本发明第一方面所述的抗UPAR单域抗体、如本发明第二方面所述的针对UPAR的抗体，所述的方法包括：

(a)在适合表达的条件下，培养如本发明第五方面所述的宿主细胞；和

(b)从培养物中分离出所述的重组多肽。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。

图1显示了UPAR-His重组蛋白表达的SDS-PAGE检测结果。泳道1代表UPAR-His的蛋白条带，泳道M代表蛋白Marker。

图2显示了UPAR-His重组蛋白活性检测结果。。

图3显示了免疫血清的ELISA检测结果。

图4显示了VHH片段的PCR扩增结果。左图是第一轮PCR结果，右图是第二轮PCR结果。

图5显示了不同单克隆测序结果的比对结果。

图6显示了固相淘选筛选抗体的phage Elisa检测结果。

图7显示了噬菌体展示库淘选获得的不同克隆抗体的流式检测结果。

图8显示了不同克隆的UPAR抗体表达纯化后的流式检测结果。

图9显示了三个代表性UPAR抗体(1-F09、3-E04、3-H02)的亲和力检测结果。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，经过大量的筛选，成功获得多个抗UPAR的单域抗体。具体地，本发明利用UPAR-Fc抗原蛋白免疫骆驼，利用噬菌体展示技术筛选免疫单域抗体基因库(噬菌体展示库)，并进行淘选和鉴定，从而获得了针对UPAR的单域抗体基因。实验结果表明，本发明获得的抗UPAR的单域抗体能够有效地与UPAR结合。具备在UPAR相关疾病，尤其是肿瘤和衰老相关性疾病中应用的前景。在此基础上完成了本发明。

术语

如本文所用，术语“本发明抗体”、“本发明的抗体”、“本发明的抗UPAR单域抗体”、“抗UPAR的单域抗体”具有相同的含义，可互换使用，均指特异性识别和结合于UPAR的抗体。

抗体

如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。

如本文所用，术语“单域抗体”、“VHH”、“纳米抗体(nanobody)”、“单域抗体”(single domain antibody,sdAb，或纳米抗体nanobody)具有相同的含义并可互换使用，指克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的单域抗体(VHH)，它是具有完整功能的最小的抗原结合片段。通常先获得天然缺失轻链和重链恒定区1(CH1)的抗体后，再克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的单域抗体(VHH)。

如本文所用，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈b-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分b折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等,NIH Publ.No.91-3242,卷I，647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。

如本领域技术人员所知，免疫偶联物及融合表达产物包括：药物、毒素、细胞因子(cytokine)、放射性核素、酶和其他诊断或治疗分子与本发明的抗体或其片段结合而形成的偶联物。本发明还包括与所述的针对UPAR的纳米抗体或其片段结合的细胞表面标记物或抗原。

如本文所用，术语“重链可变区”与“VH”可互换使用。

如本文所用，术语“可变区”与“互补决定区(complementarity determiningregion,CDR)”可互换使用。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链可变区包括包括三个互补决定区CDR1、CDR2、和CDR3。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链包括上述重链可变区和重链恒定区。

在本发明中，术语“本发明抗体”、“本发明蛋白”、或“本发明多肽”可互换使用，都指特异性结合UPAR的多肽，例如具有重链可变区的蛋白或多肽。它们可含有或不含起始甲硫氨酸。

本发明还提供了具有本发明抗体的其他蛋白质或融合表达产物。具体地，本发明包括具有含可变区的重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该可变区与本发明抗体的重链可变区相同或至少90％同源性，较佳地至少95％同源性。

术语“特异性结合”、“选择性结合”、“选择性地结合”和“特异性地结合”是指抗体对预先确定的抗原上的表位的结合。通常，抗体以大约小于10^-7M，例如大约小于10^-8M、10^-9M或l0^-10M或更小的亲和力(KD)结合。

一般，抗体的抗原结合特性可由位于重链可变区的3个特定的区域来描述，称为可变区域(CDR)，将该段间隔成4个框架区域(FR)，4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。

本发明抗体的重链的可变区特别令人感兴趣，因为它们中至少部分涉及结合抗原。因此，本发明包括那些具有带CDR的抗体重链可变区的分子，只要其CDR与此处鉴定的CDR具有90％以上(较佳地95％以上，最佳地98％以上)的同源性。

本发明不仅包括完整的抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。

如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明抗体相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与6His标签形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

本发明抗体指具有UPAR结合活性的、包括上述CDR区的多肽。该术语还包括具有与本发明抗体相同功能的、包含上述CDR区的多肽的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括本发明抗体的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与本发明抗体的编码DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗本发明抗体的抗血清获得的多肽或蛋白。

本发明还提供了其他多肽，如包含抗体或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了本发明抗体的片段。通常，该片段具有本发明抗体的至少约50个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

在本发明中，“本发明抗体的保守性变异体”指与本发明抗体的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。

表A

发明还提供了编码上述抗体或其片段或其融合蛋白的多核苷酸分子。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。

编码本发明的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC,0.1％SDS,60℃；或(2)杂交时加有变性剂,如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上,更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明的抗体的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可将重链的编码序列和表达标签(如6His)融合在一起，形成融合蛋白。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。本发明所涉及的生物分子(核酸、蛋白等)包括以分离的形式存在的生物分子。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS7、293细胞的动物细胞等。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔,脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

本发明的抗体可以单独使用，也可与可检测标记物(为诊断目的)、治疗剂、PK(蛋白激酶)修饰部分或任何以上这些物质的组合结合或偶联。

用于诊断目的可检测标记物包括但不限于：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶。

可与本发明抗体结合或偶联的治疗剂包括但不限于：1.放射性核素；2.生物毒；3.细胞因子如IL-2等；4.金纳米颗粒/纳米棒；5.病毒颗粒；6.脂质体；7.纳米磁粒；8.前药激活酶(例如，DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))等。

UPAR

如本文所用，术语“UPAR”指尿激酶型纤溶酶原激活物受体(Urokinase-typeplasminogen activator receptor)。UPAR是一个通过GPI锚定在细胞膜上的多域糖蛋白细胞表面受体，其能够以高亲和力结合尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)，从而促进纤溶酶原细胞的激活，可在纤维蛋白溶解、伤口愈合、或肿瘤发生过程中促进细胞外基质的降解，并且可以促进肿瘤细胞运动，侵袭和存活。UPAR的一部分在配体结合后被蛋白水解切割生成可溶解的UPAR(sUPAR)。

对先前发表的关于人类组织中蛋白和RNA表达的数据进行的检查显示，UPAR要么未被检测到，要么在人体的大部分器官(包括中枢神经系统、心脏和肝脏)中以低水平存在。然而研究发现，UPAR在体内和体外衰老细胞中都有高表达。在体内外的多种模型中证实了衰老细胞可以诱导UPAR的表达。在每个模型系统中均可以观察到UPAR阳性细胞数量的增加和血清中sUPAR水平的增加。这些结果都表明UPAR是靶向衰老细胞的CAR-T细胞非常好的一个靶点。另外，UPAR在很多实体肿瘤细胞株中也有表达，表明UPAR也是靶向实体肿瘤的一个理想靶点。

药物组合物

本发明还提供了一种组合物。优选地，所述的组合物是药物组合物，它含有上述的抗体或其活性片段或其融合蛋白，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：腹膜内、静脉内、或局部给药。

本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％,较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本发明上述的抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约10微克/千克体重-约50毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。

使用药物组合物时，是将安全有效量的免疫偶联物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约50毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约10毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

抗UPAR的单域抗体

本发明提供了抗UPAR的单域抗体，其能够特异性结合于UPAR。

在本发明的一方面，提供了抗UPAR单域抗体，其特征在于，所述抗UPAR单域抗体VHH链的互补决定区CDR为选自下组的一种或多种：

在优选的实施方式中，所述的抗UPAR单域抗体的VHH链的氨基酸序列选自SEQ IDNO:1-15所示的序列。更优选地，所述的抗UPAR单域抗体的VHH链具有选自SEQ ID NO:3、10或15所示的氨基酸序列。

本发明的纳米抗体对UPAR具有高亲和力。所述高亲和力指本发明的抗体以小于10^-6M，优选地小于10^-7M，更优选地小于10^-8M或更小的亲和力(KD)与UPAR结合。

本发明的纳米抗体具有纳米抗体的优点，例如分子量小，组织穿透快，溶解度和稳定性高，抗原结合特异性高，免疫原性弱。并且，由于纳米抗体药物分子量较小，纳米抗体还能识别一些单克隆抗体药物不能识别的隐形抗原表位，另外，在人体内，纳米抗体可能会比鼠源抗体产生更低的免疫原性。因此用纳米抗体序列构建抗体药物或CAR-T药物比用鼠源单链抗体序列构建的抗体药物或CAR-T药物具有更大的优势。

本发明的UPAR纳米抗体，可以用于构建靶向治疗衰老相关疾病或肿瘤的UPAR纳米抗体药物或基于UPAR纳米抗体序列的CAR-T药物。

在本发明的另一方面，还提供了抗UPAR的抗体，所述抗体可以是单价的或多价的，并且可以包括一个或多个相同的或不同的本发明抗UPAR的单域抗体的VHH链，优选地，所述VHH链具有SEQ ID NO:3、10或15所示的氨基酸序列。

检测方法

本发明还涉及检测UPAR的方法。该方法步骤大致如下：获得细胞和/或组织样本；将样本溶解在介质中；检测在所述溶解的样本中UPAR的水平。

在本发明的检测方法中，所使用的样本没有特别限制，代表性的例子是存在于细胞保存液中的含细胞的样本。

试剂盒

本发明还提供了一种含有本发明的抗体(或其片段)或检测板的试剂盒，在本发明的一个优选例中，所述的试剂盒还包括容器、使用说明书、缓冲剂等。

本发明还提供了用于检测UPAR水平的检测试剂盒，该试剂盒包括识别UPAR的抗体，用于溶解样本的裂解介质，检测所需的通用试剂和缓冲液，如各种缓冲液、检测标记、检测底物等。该检测试剂盒可以是体外诊断装置。

应用

如上所述，本发明的抗体有广泛生物应用价值和临床应用价值，其应用涉及到与UPAR相关的疾病的诊断和治疗、基础医学研究、生物学研究等多个领域。一个优选的应用是用于针对UPAR相关疾病的临床诊断、预防和治疗。

本发明的主要优点包括：

1)本发明抗体能够特异性结合UPAR；

2)本发明抗体对UPAR具有高亲和力；

3)本发明的UPAR纳米抗体具有分子量小，组织穿透快，溶解度和稳定性高，抗原结合特异性高，免疫原性弱等优点。可用于抗衰老药物或癌症治疗药物开发。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

实验试剂、耗材及设备：

主要试剂：琼脂(Sigma,CAT#A1296)；蛋白胨(Sigma,CAT#93926)；酵母提取物(OXOID,CAT#:LP0021)；氯化钠(阿拉丁,CAT#:C111533)；氯化钾(阿拉丁,CAT#:P112133)；硫酸镁(国药,CAT#:10013018)；氯化镁(国药,CAT#:10012818)；葡萄糖(生工,CAT#:GT1991)；SfiI(NEB,CAT#:R0123L)；T4 DNA ligase(TaKaRa,CAT#:2011A)；PrimeScript^TMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa,CAT#:6210B)；NuHi power mix(新海生物,CAT#:NH9303)；3M醋酸钠(pH5.2-6)(Sigma,CAT#:126-96-5)；DNA片段回收试剂盒(TakaRa,CAT#:9761)；胶回收试剂盒(Qiagen,CAT#:28706)；天根质粒大抽试剂盒(天根,CAT#:DP117)；HRP-M13(Sino Biolo,CAT#:11973-MM05)；PE-anti-Human IgG(eBioscience,Cat#:12-4998-82)；Rabbit anti-Llama IgG(H+L)Secondary Antibody[HRP](Novus，CAT#NBP1-75095)；SS320感受态(iCarTab)；pComF噬菌体展示载体(iCarTab)；NHS-biotin(APExBIO,CAT#:A8002)；HRP-Streptavidin(Boster,CAT#:BA1088)；链霉亲和素磁珠(NEB,CAT#:S14205)；抗体亲和力检测缓冲液：HBS-EP+10X(GE,Cat#BR100669)；氨基偶联试剂盒(GE,Cat#BR100050)；10mM Glycine 2.5(GE,Cat#BR100356)；S系列CM5芯片(GE,Cat#29149603)；PBS(Gbico,CAT#14190-250)；DMEM(Gbico,CAT#41965-062)；RPMI1640(Gbico,CAT#61870044)；FBS(Gbico,CAT#10099-141)；Genomic DNA Purification Kit(Lifetech，CAT#K0512)；Polybrene(Sigma，CAT#107689-10G)；LVtransm转染试剂(iCarTab,Cat#LVTran100)；淋巴细胞分离液(Stem Cell,CAT#18051)；X-Vivo 15无血清培养基(Lonza,CAT#04-418Q)；

Human T-Expander CD3/CD28(Thermo,CAT#11141D)；IL-2(北京远策药业有限责任公司，国药准字S10980067)；IL-7(PrimeGene,CAT#101-07)；IL-15(PrimeGene,CAT#101-15)；Bright-GloTM Luciferase Assay System(Promega,CAT#E2610)；IL-2ELISA kit(R&D,CAT#D2050)；IFN-γELISA kit(R&D,CAT#DIF50)。

主要耗材：50mL Falcon离心管(Corning,CAT#352070)；电击杯(Bio-Rad0.2cm)；RNase free 1.5ml EP管(QSP,CAT#:509-GRD-Q)；200μL RNase free PCR管(Axygen,PCR-02D-C)；T125摇瓶(Corning,CAT#431143)；15mL Falcon离心管(Corning,CAT#430052)；6孔板(Corning,CAT#3516)；96孔板(Corning,CAT#3365)。

主要设备：电转仪(EppendorfMultiporator)；离心机(湘仪H1650R)；恒温培养箱(上海精宏DNP-9052)；恒温震荡培养箱(朗越DZ-85A)；超净工作台(苏净安泰SW-CJ-1FD)；PCR仪(Applied Biosystems ABI2720)；生物安全柜(海尔，HR40-IIA2)；流式细胞仪(Thermo Attune Nxt flow cytometer)；Thermo 3111CO2培养箱；BiaCore T200。

实验方法

1.抗原制备

1)通过基因合成UPAR胞外段(23AA-303AA)序列，在C端添加His标签，亚克隆至真核表达载体中，构建抗原表达载体。

2)将构建好的UPAR-His蛋白表达载体进行质粒大抽，瞬时转染293细胞后，连续培养8天，离心收集培养基上清，用0.45μm的滤膜过滤，滤液转至无菌离心管中，使用Ni-NTA柱进行纯化。

3)使用uPA对纯化的抗原进行生物学活性检测。

2.抗原免疫美洲无峰驼

采用上述制备的抗原免疫1只羊驼，皮下多点免疫3次免疫，流程如下表所示。

表1羊驼免疫方案

3.免疫效价的检测

1)采集5ml外周血，将收集有血液样本的离心管置于37℃培养箱内放置1小时；然后将血液样本转移至4℃过夜；

2)将血清转移至一个新的无菌离心管中，5000rpm离心20min；采用ELISA检测免疫效价。

4.PBMC分离

采集100ml外周血，使用淋巴细胞分离液分选PBMC。

提取RNA，使用PrimeScript^TM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit进行反转录，制备cDNA。方法如下：

在200μLPCR中配制表2的反应混合液MIX1：

表2反应混合液MIX1配方

65℃保温5min后，冰上迅速冷却；

在上述PCR管中配制表3的反应液：

表3反应液配方

吹打混匀后，分装80μL/管，置于PCR仪中42℃1小时，70℃热失活15分钟，最后将cDNA样品置于冰上或-20℃长期保存。

5.VHH片段的扩增

如表4所示配置第一轮PCR反应体系(50μL/管)。

表4第一轮PCR反应体系

配置好PCR反应体系后，按照如下表5程序设置PCR仪：

表5PCR程序

使用1％的琼脂糖进行电泳分析PCR产物，分离分子量大小为750bp左右的片段。使用胶回收试剂盒回收PCR产物，并用NanoDrop测定浓度。

按表6配置二轮PCR反应体系(50μL/管)

表6二轮PCR反应体系

配置好PCR反应体系后，按照表7的程序设置PCR仪：

表7二轮PCR程序

使用1％的琼脂糖进行电泳分析PCR产物，分离分子量大小为400bp左右的VHH片段。使用胶回收试剂盒回收VHH PCR产物，并用NanoDrop测定浓度。

6.噬菌体展示库的构建

噬菌体展示载体的构建:

1)使用SfiI分别酶切pCom F载体和上述获得的VHH PCR胶回收产物，50℃酶切过夜。

2)使用1％的琼脂糖凝胶分离pCom F载体片段，切取5000bp的载体片段进行胶回收；同时使用DNA片段回收试剂盒纯化PCR酶切产物，并用NanoDrop测定浓度。

3)酶切好的pCom F载体和VHH片段使用T4 ligase连接，16℃连接过夜。

噬菌体连接产物电转化大肠杆菌：

1)准备电转杯、连接产物和电转感受态置于冰上预冷；

2)取预冷的建库连接产物加入到电转感受态中，置于冰上1min，向每个电转杯中加入70μL DNA/感受态混合物，将电转杯放于冰上；

3)按照2500V，5ms进行电转；

4)电击结束后，立刻加入平衡至室温的SOC培养基重悬菌体，37℃摇床培养1小时。

5)取菌液15mL直接进行噬菌体拯救，其余5mL电转产物加入等体积的50％甘油，均匀混合后保存在-80℃。

6)另外取菌液20μL，加入980μL 2YT培养基进行稀释后，取100μL稀释后产物，加入900μL 2YT培养基进行第二步稀释，取50μL均匀涂布在含有氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养过夜。

7)第二天，取出平板，计算每个连接能够产生的克隆数，计算库容。

8)同时挑取平板上的单克隆20个到含氨苄青霉素的2YT培养基中，37℃震荡培养约6-8小时，送菌液测序(测序通用引物M13R)，计算库的多样性。

7.噬菌体展示库的淘选

噬菌体展示库的复苏和拯救及噬菌体沉淀步骤如下：

1)将电转后的转化产物用2YT稀释调整至OD600为0.2左右，加入终浓度为100ug/mL的氨苄青霉素置于恒温摇床中，37℃，225rpm培养，至OD600为0.5时停止；

2)投入M13KO7，摇匀后37℃静置30min后，37℃，225rpm培养1h。

3)M13KO7体积＝10×体积×OD600×5×108/M13KO7滴度

4)将菌液6000rpm离心10min后用2YT-AK培养基重悬，25℃，200rpm过夜培养；

5)将菌液10000rpm离心15min；

6)弃去沉淀，将上清转至新的离心管，管内加入1/5菌液体积的PEG/NaCl，混匀后放置4℃，静置2h。

7)将沉淀的噬菌体上清，10000rpm，4℃，离心30min；弃去上清，每个50ml离心管的沉淀(噬菌体)用1ml无菌PBS重悬；

8)将重悬的噬菌体转移至1.5mLEP管中，置于离心机中，12000g，4℃，离心5min；

9)将上清转移至新的1.5mlEP管，每管加入250μl的PEG/NaCl，混匀后4℃静置10min,

10)12000g离心10min，弃上清，加入1mlPBS重悬，

11)12000g离心5min，弃沉淀，将上清转移至新的1.5mlEP管，

12)12000g离心5mi，将上清转移至新的1.5mlEP管，得到噬菌体原始库。

13)取10μl沉淀投入90μl 2YT培养基，记做10^-1，依次往后10倍稀释至10^-9，取10^-7、10^-8、10^-9三个梯度20μl稀释好的样品投入200μl事先准备好的OD600为0.5的ER2738，混匀后放于37℃水浴锅，静置10min，每108μl涂1块LB-AMP固体平板，37℃过夜，第二天数斑以确定Titer。

14)Titer计算：选取斑数在30-300之间的平板，两块平板取平均值，斑数量乘以稀释倍数再乘以100得到titer。

8.噬菌体展示库的淘选(panning)

噬菌体展示库的固相panning步骤如下：

使用ELISA板，包被目的蛋白，经历数次洗脱步骤后，使用TEA将结合在固定抗原上的重组噬菌体洗脱下来，并进行扩增；经历3-4轮淘选后，挑选单克隆进行测序。

1)用PBS稀释抗原至50μg/ml，150μl/well，共包被3well，置于4℃包被过夜；

2)吸去target蛋白，用3％MPBS室温封闭1h；

3)将lib phage或上轮扩增的沉淀用450μl 3％MPBS稀释，将6×10¹¹Pfu的phage(每孔2×10¹¹Pfu)投入到对照蛋白包被孔中，每孔投入150μl的稀释好的phage，室温孵育1h；

4)吸去target蛋白的MPBS，并将对照孔中的phage转至包被target蛋白的孔中，室温孵育1-1.5h；

5)将phage吸去，用0.05％PBST洗涤8-10次，每次2-3min，再用PBS洗涤4-5次，每次2-3min，同时用PBS洗涤事先封闭的1.5mlEP管；

6)用1×TEA洗脱6～8min，每孔200μl，收集洗脱下来的产物至预先封闭过的EP管中，每孔再加入100μl Tris-HCl中和；

7)取10μl output产物投入90μl 2YT培养基，记做100，依次往后10倍稀释至10^-2，取10¹、10⁰、10^-1、10^-2四个梯度各20μl稀释好的样品投入200μl事先准备好的OD600为0.5的ER2738(10¹是直接将未稀释的产物20μl加入ER2738)，混匀后放于37℃水浴锅，静置10min，每108μl涂1块LB-AMP固体平板，37℃过夜，第二天数斑以确定Titer。

8)Titer计算：选取斑数在30-300之间的平板，两块平板取平均值，用斑数量乘以稀释倍数再乘以洗脱体积。

噬菌体展示库的cell-based panning步骤如下：

使用过表达靶蛋白的重组细胞株，将噬菌体库依次与空细胞和过表达靶蛋白的细胞进行孵育后，经数次洗涤洗去非特异性结合的噬菌体后，使用甘氨酸或TEA将结合在细胞表面上的重组噬菌体洗脱下来，并进行扩增；经历3-4轮淘选后，挑选单克隆进行ELISA检测。

1)提前一天用1％PBSA封闭1.5ml EP管，4℃过夜；

2)Target cell和control cell各取1x10⁷，用PBS洗涤三次，用10mL1％PBSA重悬，放置于脱色摇床室温低速封闭1h；

3)向control cell中投入1x10¹¹的噬菌体，孵育1h，target cell继续封闭；

4)将孵育结束的细胞置于离心机中，1000g离心5min，弃去target cell上清(1％PBSA)，并将control cell的上清小心吸出，加入到target cell管中，重悬后，置于摇床，低速孵育1h；

5)将target cell置于离心机中，1000g离心5min；(同时用PBS洗涤三次昨天封闭的1.5ml EP管)，弃去target cell上清，加入4ml PBS重悬，分装至封闭的1.5ml EP管，用PBS离心洗涤5次，再将细胞转移至另外四个EP管，继续洗涤5次，然后将细胞转移至同一个EP管中；

6)用200μl PBS重悬细胞，然后加入200μl 2xTEA迅速吹吸，直至溶液不再粘稠，再加入200μl Tris-HCl中和，即得到产物；

7)测定Output库的titer，同固相panning方案。

9.Phage ELISA

1)分装2YT-Amp培养基至96孔深孔板，每孔500μl，挑取output平板上的单克隆，37℃，225rpm培养至OD600直至0.5；最后两孔H11和H12不挑克隆，只放培养基，作为空白对照；

2)同时用CBS包被抗原至ELISA板，浓度1μg/ml，100μl/well，37℃，包被2h；

3)另取一块96孔深孔板，分装2YT-A培养基，每孔500μl，用排枪依次吸取OD600为0.5的菌液10μl至新分装的96孔板中，置于37℃，225rpm培养过夜，此为送样测序菌液；

4)向OD600为0.5的菌液中，加入M13KO7，混匀后放于37℃，静置15min；

5)M13KO7体积＝10×体积×OD600×5×10⁸/M13KO7滴度

6)将侵染结束的菌液置于摇床上，37℃，225rpm培养45min；

7)将菌液置于离心机中，4000rpm离心10min，弃去上清，用2YT-AK培养基重悬，每孔800μl，重置于摇床中，30℃，210rpm过夜培养。

8)同时ELISA板甩掉抗原，用PBST洗液洗三遍后，用3％MPBS封闭250μl/well，4℃过夜；并额外封闭一块空白板，作为BLANK；

9)第二天，将96孔深孔板置于离心机中，4000rpm离心10min；将ELISA板中的牛奶弃去，用200μL PBST洗涤4次；在每孔先加入50μl PBST，再一一对应加入50μL离心后的噬菌体上清，置4℃孵育1h；弃去上清，并用PBST洗涤5次；用PBST稀释HRP-Anti M13二抗，每孔100μl，4℃孵育45min后，洗去二抗，PBST洗5次，TMB常温显色10min，盐酸终止，读数，选取S/N比大的值的克隆，用保种的菌液送测。

10.Overlap PCR产物的扩增，瞬时转染和检测

10.1第一轮PCR：扩增CMV、VHH及FC

1)配置PCR反应体系【50μL体系/反应】(CMV及FC片段可以多制备)(CMV片段扩增引物：CMV-F及PCom-R1；VHH片段扩增引物：PCom-F1及PCom-R2；FC片段扩增引物:PCom-F2及PGK-R)

成分及用量：上游引物(5μM)2μL、下游引物(5μM)2μL、NuHi Power mix(2×)25μL、模板(质粒或菌液)1μL、无菌水补足至50μL。

PCR反应程序如下：95℃10分钟；(95℃15秒；56℃30秒；68℃60秒)×25个循环；68℃10分钟。

2)取50μL PCR产物，加入1/10体积10×loading buffer，使用1％的琼脂糖进行电泳分析，CMV及FC的条带大小为750bp左右，VHH的条带大小为560bp左右。

3)从胶上切除目的条带，并纯化PCR产物，并用NanoDrop测定浓度(如浓度过高，可稀释进行后续反应)。

10.2第二轮PCR：Overlap Extension PCR连接CMV、VHH及FC

1)配置PCR反应体系：

成分及用量：CMV 1st产物50ng、VHH 1st产物50ng、FC 1st产物50ng、NuHi Powermix(2×)25μL、无菌水补足至46μL。

PCR反应程序如下：

95℃10分；(95℃15秒；60℃30秒；68℃120秒)×15个循环。

加入引物CMV-F及PGK-R各2ul。

PCR反应程序如下：

95℃10分；(95℃15秒；60℃30秒；68℃120秒)×20个循环；68℃10分钟。

4)使用TakaRa的DNA片段回收试剂盒纯化overlap PCR产物，并用NanoDrop测定浓度，至少需要10μgPCR产物。用于后续细胞转染验证。

5)转染步骤同真核表达载体的转染。

11.单域抗体的瞬时转染表达

1.从冰箱中取出LVTransm转染试剂及抗体表达载体pcDNA3.4-hIgG1-Fc2或overlap PCR产物，室温解冻后，用移液枪上下吹打完全混匀。取出PBS缓冲液，温热至室温。取500μLPBS至24孔板的一个孔，加入4μg pcDNA3.4-hIgG1-Fc2，移液枪上下吹打充分混匀后，加入12μLLVTransm，立即用移液器上下吹打混匀，室温下静置10分钟。此处的混合物称为DNA/LVTransm复合物。

2.将上述532μL DNA/LVTransm复合物加入到1.5mL 293F细胞中，轻轻晃动充分混匀。将细胞置于37℃、5％CO2培养箱，130RPM培养6～8小时后，加入1.5mL新鲜的293培养基，将细胞重新放回培养箱中继续培养。

3.连续培养3天后，离心收集培养基上清，用0.45μm的滤膜过滤，滤液转至无菌离心管中，进行后续的流式和ELISA检测。

12.VHH真核表达载体的构建

根据噬菌体单克隆Elisa检测结果，挑选阳性克隆进行测序，获得VHH抗体序列。将分析获得的VHH抗体序列分别进行基因合成，与human IgG1Fc串联亚克隆至表达载体pcDNA3.4-hIgG1-Fc2中。载体经测序验证无误后，使用Qiagen质粒大抽试剂盒制备去内毒素质粒备用。

13.流式检测重组抗体与靶蛋白的结合

1.从液氮中复苏CHO-S和CHO-S/UPAR细胞株细胞株，调整细胞状态至对数生长期。

2.将两种细胞分别分为若干份，每份细胞的数量为5*10^5个细胞。

3.将表达的抗体分别孵育靶细胞，充分混匀后，室温孵育1小时。

4.800xg室温离心5分钟，去掉含有抗体的上清，使用PBS洗涤细胞3次。

5.加入1μL PE标记的Anti-human IgG，充分混匀后，室温避光孵育30分钟。

6.800xg室温离心5分钟，去掉含有二抗的上清，使用PBS洗涤细胞3次。

7.使用500uL PBS重悬细胞，进行流式分析。

14.单域抗体的表达纯化

1.从冰箱中取出LVTransm转染试剂及单链抗体表达载体，室温解冻后，用移液枪上下吹打完全混匀。取出PBS或HBSS缓冲液，温热至室温。取2mL PBS至6孔板的一个孔，分别加入130μg pcDNA3.4-hIgG1-Fc2，移液枪上下吹打充分混匀后，加入400μL LVTransm，立即用移液器上下吹打混匀，室温下静置10分钟。

2.将上述DNA/LVTransm复合物加入到50mL 293F细胞中，轻轻晃动充分混匀。将细胞置于37℃、5％CO2培养箱，130RPM培养6～8小时后，加入50mL新鲜的293培养基，将细胞重新放回培养箱中继续培养。

3.连续培养7天后，离心收集培养基上清，用0.45μm的滤膜过滤，滤液转至无菌离心管中，使用Protein A柱子纯化抗体。

15.重组抗体亲和力检测

将UPAR重组蛋白使用10mM Acetate缓冲液固定在CM5芯片上，分别以制备的单域抗体作为流动相，检测候选单域抗体与靶蛋白UPAR的结合能力。

实施例1UPAR-His重组蛋白表达及纯化

1.1UPAR-His重组蛋白活性检测

使用上述的实验方法1制备UPAR-His抗原，SDS-PAGE检测UPAR-His蛋白的表达。结果如图1所示。泳道1为UPAR-His蛋白条带，理论分子量32.3kDa，SDS-PAGE检测为45kDa左右。

在ELISA板上包被2μg/ml uPA(近岸，C393)，使用五倍梯度稀释的biotinUPAR-His为一抗，二抗为streptavidin-HRP。

结果：根据ELISA检测结果，UPAR-His可以结合其天然配体uPA(见图2)，具有生物学活性，可以用于羊驼免疫和抗体的筛选。

1.2免疫效价ELISA检测

使用上述的实验方法2免疫美洲无峰驼。并使用实验方法3进行免疫效价的检测。具体地，取羊驼三免后血清，按照图3所示的稀释梯度进行有限稀释，使用UPAR-His抗原预包被的96孔板进行ELISA检测。

结果：根据ELISA检测效果(见图3)，免疫血清与UPAR-His结合，且随血清稀释梯度OD450值呈梯度变化，表明免疫成功。用IgG，subclasses2+3二抗进行检测也有较高的免疫效价。采集100mL外周血，安排进行建库。

1.3 VHH片段的扩增

使用上述的实验方法4和5进行PBMC分离和VHH片段的扩增。具体地，从实施例1.2中经过免疫的羊驼外周血中，提取总RNA，逆转录为cDNA后，使用单域抗体扩增引物进行两轮nest PCR。

结果：图4为PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果。第一轮PCR获得1000bp和750bp左右的两条PCR条带，从胶上回收750bp的片段作为二轮PCR的模板。第二轮PCR获得450bp左右的条带，即为VHH片段。

1.4噬菌体展示库多样性分析

使用上述的实验方法6进行噬菌体展示库的构建和多样性分析。具体地，将实施例1.3中扩增得到的VHH片段用SfiI酶切后亚克隆至噬菌体展示载体pComF中，连接产物电转化SS320大肠杆菌感受态细胞，构建单域抗体噬菌体展示库。经计算，噬菌体展示库库容为2.53E8。从噬菌体展示库中，随机挑选20个单克隆进行测序，分析构建噬菌体展示库的多样性。

结果：如图5所示。根据测序结果比对显示，噬菌体展示库空载率及抗体重复率不高于10％。

1.5噬菌体展示库固相淘选

使用上述的实验方法7进行噬菌体展示库的固相淘选。具体地，分别包被UPAR-His和Fc重组蛋白，将构建的噬菌体展示库进行四次筛选富集，富集阳性克隆。

1.6噬菌体展示库固相淘选产物phage ELISA

从实施例1.5中富集的噬菌体阳性克隆中，挑选噬菌体单克隆，使用上述的实验方法8进行Phage ELISA鉴定。

具体地，选取固相panning第1，2，3轮output进行phage ELISA实验；分别包被UPAR-His抗原蛋白，进行phage Elisa检测，对照组为直接封闭的孔板和Fc包被的孔。

结果：phage ELISA检测结果如图6所示。选择S/N比值在5以上，且与Fc不结合的克隆进行测序，分析序列抗体。抗原固相淘选共获得18个不同的抗体。

1.7 overlap产物瞬时转染产物流式分析检测

在本实施例中，对实施例1.6中筛选并测序的18种VHH抗体序列进行载体构建和表达检测。在候选抗体序列的N端和C端分别通过Overlap PCR添加CMV启动子、信号肽及humanIgG1 Fc标签，纯化PCR产物瞬时转染293细胞，表达抗体进行流式检测。

结果：FACS检测结果如图7所示。在噬菌体展示库淘选获得的18个克隆中，共挑选到15个合适的克隆进行表达载体合成。与过表达UPAR细胞株的结合非常弱的两个克隆(1-A2和1-D2)和与已知序列相似度高的克隆(3-F4)未进行表达载体合成。

1.8候选抗体的表达和纯化，流式检测

将候选抗体表达载体瞬时转染HEK293，将上清中表达的抗体用protein A纯化，进行蛋白定量和SDS-PAGE检测。并将候选的15个单域抗体与过表达细胞株CHO-S/UPAR及其母细胞株进行流式检测。

结果：流式检测结果显示候选的15个单域抗体均可与CHO-S/UPAR特异性结合(见图8)。

15个抗体测序得到的序列如下：

1)pcDNA3.4-SDAB20-7-26-2-1-B4-hFC

QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLDYYAIGWFRQAPGKEREGVSCISSTGGSTNYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAADTHYLTVCYDRLGFDYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:1)；

2)pcDNA3.4-SDAB20-7-26-2-1-F1-hFC

EVQLAESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYTMSWVRQAPGKGLEWVSAIDSDGGVTSYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAVYYCANGGYCSGYGCYPRLLSQGTLVTVSS(SEQ ID NO:2)；

3)pcDNA3.4-SDAB20-7-26-2-1-F9-hFC

QSLLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLDYYAIGWFRQAPGKEREEVSCISSGGGSTNYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAKRNFMLYLVQCPYEYDYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:3)；

4)pcDNA3.4-SDAB20-7-26-2-1-F10-hFC

QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSILSIRAVGWYRQAPGKQRELVALITSDGTTHYALSVKGRFTISRDNAKTTVYLQMNSLKPEDTAVYYCNREDYARRYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:4)；

5)pcDNA3.4-SDAB20-7-26-2-1-G1-hFC

QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGNSLRRYAIGWFRQAPGKEREGVVCISTVGGSSYYVDSVKGRFTISEDNVKNTAYLQMNSLEPEDTAVYYCAAANRLYCPAYGSAGYDYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:5)；

6)pcDNA3.4-SDAB20-7-26-2-1-G2-hFC

QSQLAESGGGLVQPGGSLRLSCVASRFSLDAYAIAWFRQAPGKEREGVSCISSIGGRTNYADPVKGRFTISRDNAKNTAYLEMNSLQPEDTAVYYCAAVQRLFGPCLLSGGMDYWGKGTPVTVSS(SEQ ID NO:6)；

7)pcDNA3.4-SDAB20-7-26-2-1-H2-hFC

QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTLDYYAIAWFRQAPGKGREGVSCISSSGGRTNYADSVKGRFTVSRDNVKNTVYLQMNSLKPEDTAVYNCAAGGDLSCYGTPTSIWQYDLWGQGTQVTVAS(SEQ ID NO:7)；

8)pcDNA3.4-SDAB20-7-26-2-1-H8-hFC

QRQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSEFTLDYYAIGWFRQAPGKEREGVSCISSSGGSTVYADSVKGRFTISADNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAGSLLLFRLCVSRLYEYDYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:8)；

9)pcDNA3.4-SDAB20-7-26-2-3-E03-hFC

AVQLVDSGGGLVQAGGSLRLSCAASGIRLSSNAMAWYRQAPGKQRGLVALITSDGTTNYVDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCKREPYLSTRGYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:9)；

10)pcDNA3.4-SDAB20-7-26-2-3-E04-hFC

QLRLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLDYYDIGWFRQAPGKEREGVSCIGRISGDTDYAESVKGRFTASRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAERRFFGGGCRRSVDNMDSWGKGTLVTVSS(SEQ ID NO:10)；

11)pcDNA3.4-SDAB20-7-26-2-3-E06-hFC

EVQLVESGGGLVQAGGSLTLSCVASASGSILRLNAMGWYRQAPAKQRELVALITRDGSTNYPDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLSPEDTAVYYCYVQNHYSNYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:11)；

12)pcDNA3.4-SDAB20-7-26-2-3-E09-hFC

AVQLVDSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMGWARQVPGKGLEWVSIIYRDGNTYYTDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAPVETVAARRRDYWGQGTQVNVSS(SEQ ID NO:12)；

13)pcDNA3.4-SDAB20-7-26-2-3-E10-hFC

AVQLVDSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMGWARQVPGKGLEWVSIIYRDGNTYYTDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAPVETVAARRRDYWGQGTQVNVSS(SEQ ID NO:13)；

14)pcDNA3.4-SDAB20-7-26-2-3-G07-hFC

RLQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGKALDYYSIGWFRQAPRKQREGVSCISSSGGSTNYADSVKGRFTISRDNAKDTVYLQMNSLKPEDTADYYCAVVSTVLCGLGIYEYDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:14)；

15)pcDNA3.4-SDAB20-7-26-2-3-H02-hFC

QLTLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASEFTLDYYAIGWFRQAPGKEREGVSCISSSDGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAIGGLLLLRLWERGNYEFDYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:15)。

其中，以下划线标示出了各VHH链的CDR区。

各抗体CDR区氨基酸序列如表9所示。

表9本发明抗体CDR区氨基酸序列

/>

实施例2抗体亲和力检测

选取结合率最高的3株代表性抗体(1-F09、3-E04、3-H02)，使用上述实验方法15进行抗体亲和力检测。

结果：如图9及表10所示。

表10重组抗体亲和力检测结果

	Kon	Koff	KD
				1-F09	6.764×10⁴M^-1S^-1	1.008×10^-4S^-1	1.49×10^-9M
3-E04	6.268×10⁴M^-1S^-1	1.395×10^-3S^-1	2.226×10^-8M
				3-H02	1.322×10⁵M^-1S^-1	1.731×10^-4S^-1	1.310×10^-9M

本实施例证明，本发明的三种代表性抗体1-F09、3-E04、3-H02对UPAR均具有高亲和力。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 博生吉医药科技（苏州）有限公司

<120> 一种新型UPAR单域抗体的开发

<130> P2021-3292

<160> 54

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Tyr Tyr

20 25 30

Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val

35 40 45

Ser Cys Ile Ser Ser Thr Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Asp Thr His Tyr Leu Thr Val Cys Tyr Asp Arg Leu Gly Phe

100 105 110

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 2

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Glu Val Gln Leu Ala Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Asp Ser Asp Gly Gly Val Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Asn Gly Gly Tyr Cys Ser Gly Tyr Gly Cys Tyr Pro Arg Leu Leu

100 105 110

Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 3

<211> 126

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Gln Ser Leu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Asp Tyr Tyr

20 25 30

Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Glu Val

35 40 45

Ser Cys Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Lys Arg Asn Phe Met Leu Tyr Leu Val Gln Cys Pro Tyr Glu

100 105 110

Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 4

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Leu Ser Ile Arg

20 25 30

Ala Val Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Leu Ile Thr Ser Asp Gly Thr Thr His Tyr Ala Leu Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn

85 90 95

Arg Glu Asp Tyr Ala Arg Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 5

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asn Ser Leu Arg Arg Tyr

20 25 30

Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val

35 40 45

Val Cys Ile Ser Thr Val Gly Gly Ser Ser Tyr Tyr Val Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Glu Asp Asn Val Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Glu Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Ala Asn Arg Leu Tyr Cys Pro Ala Tyr Gly Ser Ala Gly Tyr

100 105 110

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 6

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Gln Ser Gln Leu Ala Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Arg Phe Ser Leu Asp Ala Tyr

20 25 30

Ala Ile Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val

35 40 45

Ser Cys Ile Ser Ser Ile Gly Gly Arg Thr Asn Tyr Ala Asp Pro Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Glu Met Asn Ser Leu Gln Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Val Gln Arg Leu Phe Gly Pro Cys Leu Leu Ser Gly Gly Met

100 105 110

Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 7

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Gln Ser Gln Leu Ala Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Arg Phe Ser Leu Asp Ala Tyr

20 25 30

Ala Ile Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val

35 40 45

Ser Cys Ile Ser Ser Ile Gly Gly Arg Thr Asn Tyr Ala Asp Pro Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Glu Met Asn Ser Leu Gln Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Val Gln Arg Leu Phe Gly Pro Cys Leu Leu Ser Gly Gly Met

100 105 110

Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 8

<211> 127

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Gln Arg Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Glu Phe Thr Leu Asp Tyr Tyr

20 25 30

Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val

35 40 45

Ser Cys Ile Ser Ser Ser Gly Gly Ser Thr Val Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

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Ala Ala Gly Ser Leu Leu Leu Phe Arg Leu Cys Val Ser Arg Leu Tyr

100 105 110

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115 120 125

<210> 9

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Ala Val Gln Leu Val Asp Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Arg Leu Ser Ser Asn

20 25 30

Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Gly Leu Val

35 40 45

Ala Leu Ile Thr Ser Asp Gly Thr Thr Asn Tyr Val Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Lys

85 90 95

Arg Glu Pro Tyr Leu Ser Thr Arg Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 10

<211> 127

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Gln Leu Arg Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Tyr Tyr

20 25 30

Asp Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val

35 40 45

Ser Cys Ile Gly Arg Ile Ser Gly Asp Thr Asp Tyr Ala Glu Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ala Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Glu Arg Arg Phe Phe Gly Gly Gly Cys Arg Arg Ser Val Asp

100 105 110

Asn Met Asp Ser Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 11

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Thr Leu Ser Cys Val Ala Ser Ala Ser Gly Ser Ile Leu Arg

20 25 30

Leu Asn Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Ala Lys Gln Arg Glu

35 40 45

Leu Val Ala Leu Ile Thr Arg Asp Gly Ser Thr Asn Tyr Pro Asp Ser

50 55 60

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val

65 70 75 80

Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Ser Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Tyr Val Gln Asn His Tyr Ser Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln

100 105 110

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115

<210> 12

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Ala Val Gln Leu Val Asp Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Gly Trp Ala Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ile Ile Tyr Arg Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Pro Val Glu Thr Val Ala Ala Arg Arg Arg Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Gln Val Asn Val Ser Ser

115

<210> 13

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Ala Val Gln Leu Val Asp Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Gly Trp Ala Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ile Ile Tyr Arg Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

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Pro Val Glu Thr Val Ala Ala Arg Arg Arg Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

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115

<210> 14

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

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1 5 10 15

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20 25 30

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<210> 15

<211> 127

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

Gln Leu Thr Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Phe Thr Leu Asp Tyr Tyr

20 25 30

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<210> 16

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

Gly Phe Thr Leu Asp Tyr Tyr Ala

1 5

<210> 17

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

Ile Ser Ser Thr Gly Gly Ser Thr

1 5

<210> 18

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

Tyr Tyr Cys Ala Ala Asp Thr His Tyr Leu Thr Val Cys Tyr Asp Arg

1 5 10 15

Leu Gly Phe Asp Tyr

20

<210> 19

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Thr

1 5

<210> 20

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

Ile Asp Ser Asp Gly Gly Val Thr

1 5

<210> 21

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

Tyr Tyr Cys Ala Asn Gly Gly Tyr Cys Ser Gly Tyr Gly Cys Tyr Pro

1 5 10 15

Arg Leu

<210> 22

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

Gly Phe Ser Leu Asp Tyr Tyr Ala

1 5

<210> 23

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ser Thr

1 5

<210> 24

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

Tyr Tyr Cys Ala Ala Lys Arg Asn Phe Met Leu Tyr Leu Val Gln Cys

1 5 10 15

Pro Tyr Glu Tyr Asp Tyr

20

<210> 25

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

Gly Ser Ile Leu Ser Ile Arg Ala

1 5

<210> 26

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

Leu Ile Thr Ser Asp Gly Thr Thr

1 5

<210> 27

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

Tyr Tyr Cys Asn Arg Glu Asp Tyr Ala Arg Arg Tyr

1 5 10

<210> 28

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

Gly Asn Ser Leu Arg Arg Tyr Ala

1 5

<210> 29

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

Ile Ser Thr Val Gly Gly Ser Ser

1 5

<210> 30

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

Tyr Tyr Cys Ala Ala Ala Asn Arg Leu Tyr Cys Pro Ala Tyr Gly Ser

1 5 10 15

Ala Gly Tyr Asp

20

<210> 31

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

Arg Phe Ser Leu Asp Ala Tyr Ala

1 5

<210> 32

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

Ile Ser Ser Ile Gly Gly Arg Thr

1 5

<210> 33

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

Tyr Tyr Cys Ala Ala Val Gln Arg Leu Phe Gly Pro Cys Leu Leu Ser

1 5 10 15

Gly Gly Met Asp Tyr

20

<210> 34

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

Gly Ser Thr Leu Asp Tyr Tyr Ala

1 5

<210> 35

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

Ile Ser Ser Ser Gly Gly Arg Thr

1 5

<210> 36

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

Tyr Asn Cys Ala Ala Gly Gly Asp Leu Ser Cys Tyr Gly Thr Pro Thr

1 5 10 15

Ser Ile Trp Gln Tyr Asp Leu

20

<210> 37

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

Glu Phe Thr Leu Asp Tyr Tyr Ala

1 5

<210> 38

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

Ile Ser Ser Ser Gly Gly Ser Thr

1 5

<210> 39

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Ser Leu Leu Leu Phe Arg Leu Cys Val Ser

1 5 10 15

Arg Leu Tyr Glu Tyr Asp Tyr

20

<210> 40

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

Gly Ile Arg Leu Ser Ser Asn Ala

1 5

<210> 41

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

Tyr Tyr Cys Lys Arg Glu Pro Tyr Leu Ser Thr Arg Gly Tyr

1 5 10

<210> 42

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

Gly Phe Thr Leu Asp Tyr Tyr Asp

1 5

<210> 43

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 43

Ile Gly Arg Ile Ser Gly Asp Thr

1 5

<210> 44

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 44

Tyr Tyr Cys Ala Ala Glu Arg Arg Phe Phe Gly Gly Gly Cys Arg Arg

1 5 10 15

Ser Val Asp Asn Met Asp Ser

20

<210> 45

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 45

Ala Ser Ala Ser Gly Ser Ile Leu Arg Leu

1 5 10

<210> 46

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 46

Leu Ile Thr Arg Asp Gly Ser Thr

1 5

<210> 47

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 47

Tyr Tyr Cys Tyr Val Gln Asn His Tyr Ser Asn Tyr

1 5 10

<210> 48

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 48

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala

1 5

<210> 49

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 49

Ile Ile Tyr Arg Asp Gly Asn Thr

1 5

<210> 50

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 50

Tyr Tyr Cys Ala Pro Val Glu Thr Val Ala Ala Arg Arg Arg Asp Tyr

1 5 10 15

<210> 51

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 51

Gly Lys Ala Leu Asp Tyr Tyr Ser

1 5

<210> 52

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 52

Tyr Tyr Cys Ala Val Val Ser Thr Val Leu Cys Gly Leu Gly Ile Tyr

1 5 10 15

Glu Tyr Asp Tyr

20

<210> 53

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 53

Ile Ser Ser Ser Asp Gly Ser Thr

1 5

<210> 54

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 54

Tyr Tyr Cys Ala Ile Gly Gly Leu Leu Leu Leu Arg Leu Trp Glu Arg

1 5 10 15

Gly Asn Tyr Glu Phe Asp Tyr

20

Claims

1.一种抗UPAR单域抗体，其特征在于，所述抗UPAR单域抗体VHH链的互补决定区CDR为选自下组的一种或多种：

2.如权利要求1所述的抗UPAR单域抗体，其特征在于，所述的抗UPAR单域抗体的VHH链的氨基酸序列选自SEQ ID NO:1-15所示的序列。

3.如权利要求1所述的抗UPAR单域抗体，其特征在于，所述的抗UPAR单域抗体包括人源化抗体、骆驼源抗体、嵌合抗体。

4.一种抗UPAR的抗体，其特征在于，所述抗体包括一个或多个如权利要求1所述的抗UPAR的单域抗体的VHH链。

5.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码选自下组的蛋白质：如权利要求1所述的抗UPAR单域抗体、或如权利要求4所述的抗体。

6.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有如权利要求5所述的多核苷酸。

7.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有如权利要求6所述的表达载体，或其基因组中整合有如权利要求5所述的多核苷酸。

8.一种产生抗UPAR单域抗体的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

(a)在适合产生单域抗体的条件下，培养如权利要求7所述的宿主细胞，从而获得含所述抗UPAR单域抗体的培养物；

(b)从所述培养物中分离和/或回收所述的抗UPAR单域抗体；和

9.一种免疫偶联物，其特征在于，所述免疫偶联物含有：

(a)如权利要求1所述的抗UPAR单域抗体、或如权利要求2所述的针对UPAR的抗体；和

10.如权利要求1-3中任一项所述的抗UPAR单域抗体，如权利要求2所述的针对UPAR的抗体，或如权利要求9所述的免疫偶联物的用途，其特征在于，用于制备：

(1)预防和/或治疗UPAR相关的疾病的药物；

(2)检测UPAR的试剂。