JP2010512324A - ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体エピトープ、それに由来するモノクローナル抗体及びそれらの使用方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体（uPAR）に特異的な抗体及びその抗原結合断片、並びに癌の処置又は予防のためのそれらの使用に関する。特に、本発明の抗体は、uPARにおける具体的なエピトープに特異的である。これらの抗体は、uPARシグナル伝達に干渉する。このような抗体は、特に癌に対する診断及び治療の方法において使用される。
【選択図】図1

Description

（関連出願の相互参照）
本願は、そのすべての内容が全体として引用により本明細書中に各々組み込まれている2006年12月8日に出願された米国仮出願第60/873,627号及び2007年5月11日に出願された米国仮出願第60/930,034号の利益を請求する。

（1．発明の分野）
本発明は、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体（uPAR）エピトープ、このエピトープに免疫特異的に結合するモノクローナル抗体、及び疾病、例えば癌の治療又は予防のためのそれらの使用に関する。これらの抗体は、uPA/uPAR複合体が相互作用するさらなる分子との該複合体の相互作用を阻害し得る。本発明の抗体は、特に癌の診断及び治療の方法において使用できる。

（2．発明の背景）
インビトロ及びインビボでの研究からの証拠の有意な多数は、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子（uPA）系が、転移の過程の中心であり、抗癌剤開発のための有望な標的となることを確立している（Mazar, APらの文献（（1999）Angiogenesis 3: 15-32）。uPAに加えて、uPAの細胞表面受容体（uPAR）は、癌の治療剤及び診断剤の設計及び開発に適した標的であり（Mazar, APらの文献（（2001）Anti-Cancer Drugs 12: 397-400）、その理由として、

（a）uPARが、いくつかの腫瘍細胞、血管新生内皮細胞（「EC」）、並びに腫瘍関連炎症細胞及び腫瘍関連線維芽細胞等の他の腫瘍関連細胞において選択的に発現するが、最も静止状態の正常細胞においては発現しないこと、

（b）uPARが、現に薬剤開発への尽力の集中した目的である転移に必要とされるいくつかの細胞外及び細胞内経路における重要な関係物質であること；並びに

（c）uPA経路に沿ったいくつかの異なる地点で干渉することが可能である
ことがある。従って、uPA及びuPARは、腫瘍/癌の多くの異なる種類に対して有用な診断剤及び治療剤の開発のための有望な標的である。

膜結合型uPARは、グリコシルホスファチジルイノシトールにより繋留された（GPIアンカー）タンパク質である（Slound, E.M.の文献（Blood 105: 1847-1848（2005）））。uPARは、3つのドメインから構成され、ドメイン1（D1）は、N末端ドメインであり、ドメイン2（D2）は、D1をドメイン（D3）へ結合し、及びD3は、D3のGPI尾部からGly²⁸³を通じて細胞膜へ分子を繋留するC末端ドメインである（Montuoriらの文献（J. Biol. Chem. 277:46932- 46939 (2002)）、Danoらの文献（Fibrinolysis 8:189-203 (1994)））。uPARが、ホスホリパーゼC（Plougらの文献（J Biol Chem. 266:1926-1933 (1991)））又はホスホリパーゼDによってGPIアンカーにおいて切断される場合、可溶性uPAR（suPAR）は、細胞膜から放出される（Wilhelmらの文献（J. Cell Physiol. 180:225-235 (1999)））。

（2.1．uPA/uPAR系及び癌）
転移及び血管新生は、腫瘍細胞及びECの浸潤性及び遊走性の過程を特徴づける多くの共通した機能特性を共有する。これらの特性は、（1）プロテアーゼ及びインテグリンの発現の上方制御、（2）細胞-細胞及び細胞-マトリックスの接触の喪失、（3）増殖因子及び分化因子に対する増大した反応性、並びに（4）細胞外マトリックス（ECM）及び基底膜（BasM）のリモデリングを含む。これらのすべてが腫瘍進行に関与する。

セリンプロテアーゼuPA、その受容体であるuPAR、及びその特異的セルピン阻害剤であるプラスミノーゲン活性化因子阻害剤1型（PAI-1）を含むuPA「系」は、これらの活性の多くにおいて中心的な役割を担う。この系の活性は、

（1）いくつかのプロメタロプロテアーゼ（proMMP）を活性化させるプラスミノーゲンの活性化を結果的に生じるカスケードを惹起すること、

（2）線維芽細胞増殖因子2（FGF-2）、血管内皮増殖因子（VEGF）、肝細胞増殖因子（HGF）、及びトランスフォーミング増殖因子β（TGFβ）等の潜在型増殖因子の放出及びプロセシング、

（3）（a）ビトロネクチン（Vn）及びフィブロネクチン（Fn）等のECMの構成成分との相互作用、（b）α5β1及びαvβ3を含むいくつかのインテグリンとの直接的な相互作用、並びに（c）細胞運動を促進するためのBasM及びECMのリモデリング
の原因である。
またさらに、uPA系は、血管新生において役割を担い得る局在型フィブリンの代謝回転を惹起できる。

uPA及びuPARの発現は、膠芽腫、前立腺癌、乳癌、結腸癌、肝細胞癌、及び腎細胞癌を含む数多くの腫瘍の種類において示されてきた（Mizukami IFらの文献（(1994) Clin Immunol and Immunopathol 71:96-104）、Hsu DWらの文献（(1995) Am J Pathol 147:114-23）、de Witte JHらの文献（(1999) Br J Cancer 79:1190-8））。uPA及びuPARの発現は、疾病のより進行性の形態において典型的により大きい。腫瘍細胞において、この発現は、腫瘍の侵襲性前面でしばしば最も高い（Buo, Lらの文献（(1995) Human Pathol 26:1133-1138）、Yamamoto Mらの文献（(1994) Cancer Res 54:5016-5020））。乳癌、結腸癌及び腎細胞癌の侵襲性前面と関連した血管におけるuPARの強力な免疫組織化学的染色が報告されている（Bastholm Lらの文献（Appl Immunohistochem Mol Morphol 7: 39-47）、Nakata Sらの文献（(1998) Int. J. Cancer 79:179-186））。結腸癌研究において、uPARはVEGFとともに局在した。また、uPA及びuPARの発現は、いくつかの腫瘍タイプにおける腫瘍関連マクロファージで観察されている（Ohtani Hらの文献（(1995) Int J Cancer 62:691-6）、Xu Yらの文献（(1997) Hum Pathol 28:206-13））。uPAは、単球に関して走化性であり、これらの細胞の接着及び遊走の両者を仲介する。接着及び遊走は、uPARの占有のみを必要とするが、uPAの触媒活性を必要としない。従って、uPA系は、複数の腫瘍関連細胞の種類に作用することによって、腫瘍の進行に関与すると信じられている。

近年のいくつかの研究は、同系においてuPARに対するuPAの結合を阻害する治療上の可能性を評価している。アデノウイルスによりコードされたuPAのマウスアミノ末端断片の腫瘍への直接的な送達の結果、（a）新血管新生の抑制及び（b）腫瘍の成長の抑止に至った（Li Hらの文献（(1998) Gene Ther 5:1105-1113））。種の「特異性」により、マウスATFは、マウス宿主EC及び白血球のみに結合するが、ヒト腫瘍細胞には結合しないと予測されるであろう。このことは、腫瘍の阻害が、宿主の血管新生反応の抑制を通じて仲介されたことを示す。最後に、ラットuPARの100残基断片に対して生じたポリクローナル抗体は、Mat BIII細胞系の細胞から発達したラット乳房腫瘍に選択的に局在した(Rabbani SAらの文献（(2002) Cancer Res 62:2390-97）)。このポリクローナル抗体は、腫瘍の成長を完全に阻害し、腫瘍の退化を生じさせた。

残念ながら、治療及び診断の目的のためにuPA系を標的にする約束にもかかわらず、研究努力は、臨床に適した薬剤の開発をもたらさなかった。小分子アプローチは、（1）タンパク質間相互作用（例えば、uPA-uPAR又はuPAR-インテグリン）を強力に阻害することが困難、かつ（2）医化学的尽力に従った適切な指導又は構造上の情報の欠失によって妨害された。uPA-uPAR相互作用のいくつかの強力なペプチド阻害剤が同定されてきたが、これらは、ペプチドの典型的に乏しい薬理学的特性が欠点であろうし、細胞ベースのアッセイにおいてでさえ活性の必要なレベルを示していない（Ploug Mらの文献（(2001) Biochemistry 40: 12157-68））。

本発明は、uPAR特異的モノクローナル抗体であるATN-658のエピトープの特徴づけに一部基づいている。従って、本発明は、アミノ酸配列

からなる単離された又は精製されたペプチドを提供する。また、エピトープ配列は、より長い配列の一部、例えば、20、25、30、35、40、45、50、75、100、150又は200アミノ酸であり、該より長めの配列は、ヒトuPARの断片であり、該エピトープ配列を含む。

一実施態様において、本発明は、（i）本発明のペプチド（場合により精製されている）を使用して哺乳動物を免疫化すること；（ii）該哺乳動物から脾細胞を単離すること；（iii）該脾細胞を骨髄腫細胞へ融合させること；及び（iv）ハイブリドーマを選別することを含む、抗体を製造する方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、（i）（a）

；及び（b）ヒトuPAR（配列番号15）の

によって定義されるコンホメーション依存的エピトープを含むエピトープを使用して哺乳動物を免疫化すること；（ii）該哺乳動物から脾細胞を単離すること；（iii）該脾細胞を骨髄腫細胞へ融合させること；及び（iv）該ペプチドを結合する抗体を分泌するハイブリドーマを選別することを含む、抗体を製造する方法を提供する。いくつかの実施態様において、本発明は、（i）（a）

；及び（b）ヒトuPAR（配列番号15）の

によって定義されるコンホメーション依存的エピトープを含むエピトープを使用して哺乳動物を免疫化すること；（ii）該哺乳動物から脾細胞を単離すること；（iii）該脾細胞を骨髄腫細胞へ融合させること；及び（iv）該ペプチドを結合する抗体を分泌するハイブリドーマを選別することを含む、抗体を製造する方法を提供する。特定の_ｔ実施態様において、抗体を製造する方法は、（i）（a）

；及び（b）ヒトuPAR（配列番号15）の

によって定義されるコンホメーション依存的エピトープを含む（場合により精製されている）ヒトuPARの断片を使用して哺乳動物を免疫化すること；（ii）該哺乳動物から脾細胞を単離すること；（iii）該脾細胞を骨髄腫細胞へ融合させること；及び（iv）該断片に結合する抗体を分泌するハイブリドーマを選別することを含む。一実施態様において、抗体を製造する方法は、（i）ヒトuPAR（配列番号15）のドメイン2及び3を含むヒトuPARの断片（場合により精製されている）を使用して哺乳動物を免疫化すること；（ii）該哺乳動物から脾細胞を単離すること；（iii）該脾細胞を骨髄腫細胞へ融合させること；及び（iv）該断片を結合する抗体を分泌するハイブリドーマを選別することを含む。別の実施態様において、抗体を製造する方法は、（i）ヒトuPAR（配列番号15）の単離された断片のアミノ末端がアミノ酸番号93〜98の何れか1つにあり、かつ該断片のカルボキシ末端がアミノ酸277〜283の何れか1つにある該断片、又は該断片の配列に対して保存的置換のみを含有するその誘導体を使用して、哺乳動物を免疫化すること；（ii）該哺乳動物から脾細胞を単離すること；（iii）該脾細胞を骨髄腫細胞へ融合させること；及び（iv）該断片を結合する抗体を分泌するハイブリドーマを選別することを含む。具体的な実施態様において、哺乳動物は、非ヒト哺乳動物、例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ラット、ネコ、イヌ等である。別の実施態様において、哺乳動物はヒトである。ファージディスプレイを使用して抗体を製造する方法も、本発明によって包含される。

本発明は、アミノ酸配列

によって定義されるエピトープへ免疫特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を提供する。ある実施態様において、抗原又はその抗原結合断片は、アミノ酸配列

によって定義されるエピトープへ免疫特異的に結合する。ある実施態様において、アミノ酸残基268にあるエピトープを変異させることは、抗体の免疫特異的結合親和性を低下させ又は消滅させる。別段の明白な記載がない限り、ヒトuPAR配列におけるアミノ酸番号に対する本願におけるすべての引用が、図１において示される22個のアミノ末端の酸を欠失する加工されたuPARのアミノ末端から付番することを指すことは留意されるべきである。また、本発明は、（i）

；及び（ii）ヒトuPAR（配列番号15）内の

によって定義されるコンホメーション依存的エピトープへ免疫特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を提供する。いくつかの実施態様において、抗体又はその抗原結合断片は、（i）

；及び（ii）ヒトuPAR（配列番号15）内の

によって定義されるコンホメーション依存的エピトープへ免疫特異的に結合する。いくつかの実施様において、ヒトuPARにおける位置268にあるK（Lys）残基がE（Glu）残基へ（uPAR K268E）又はA（Ala）残基へ（uPAR K268A）変異する場合、エピトープに対する抗体の結合は、該抗体による該結合の低下によって示される。好ましくは、結合の量は、抗体とuPAR K268E又はuPAR K268Aとの共免疫沈降によって示される。他の実施態様において、ヒトuPARにおける位置273にあるH（His）残基がA（Ala）残基へ変異する場合（uPAR H273A）、エピトープに対する抗体の結合は、該抗体による該結合の低下によって示される。好ましくは、結合の量は、抗体とuPAR H273Aとの共免疫沈降によって示される。具体的な実施態様において、ヒトuPARにおける位置275又は277にあるD（Asp）残基がA（Ala）残基へ変異する場合（それぞれuPAR D275A又はuPAR D277A）、エピトープに対する抗体の結合は、該抗体による該結合の低下によって示される。好ましくは、結合の量は、抗体とuPAR D275A又はuPAR D277Aそれぞれとの共免疫沈降によって示される。上述の実施態様において、例えば、抗体による結合の低下は、抗体と共免疫沈降する野生型uPAR（例えば、膜結合型uPAR若しくはsuPAR）又はsuPARの断片（例えば、D2D3 suPAR）の量に対する、抗体と共免疫沈降する変異したuPAR（例えば、uPAR K268E、uPAR K268A、uPAR H273A、uPAR D275A、又はuPAR D277A）の減少した量によって示される。

ある実施態様において、本発明のエピトープに対する抗体の結合は、重水素交換アッセイによって示され、この中で、タンパク質（例えば、ヒトsuPAR）のエピトープに対する抗体（例えば、ATN-658）の結合は、重水素を交換する該エピトープの能力を低下させる。具体的な実施態様において、ヒトsuPARは抗体と接触して、ヒトuPARのエピトープに対する抗体の結合は、抗体の不存在下でのエピトープ上での重水素化に対する、結合条件下で抗体の存在下又は不存在下にある場合のエピトープ上での重水素化レベルの低下によって示される。逆に、抗体によって接触されないsuPARの領域は、結合条件下で抗体の存在下又は不存在下にある場合の同一の又は同様の重水素化レベルを有する。好ましくは、重水素化アッセイは、ドメイン2及び3（D2D3）を含有し又はそれらからなるヒトuPARの断片を使用して実施される。特定の実施態様において、ヒトsuPARのエピトープに対する抗体の結合は、抗体の不存在下でのエピトープ上での重水素化レベルに対する、結合条件下で抗体の存在下にある場合のヒトsuPARのエピトープ上での重水素化レベルの少なくとも10％、又は少なくとも20％、又は少なくとも30％、又は少なくとも40％、又は少なくとも50％の低下によって示される。

好ましくは、本発明の抗体又はその断片は、単離され又は精製される。特定の実施態様において、抗体又はその抗原結合断片は、モノクローナル抗体（好ましくはIgG）又はscFvである。特定の実施態様において、本発明の抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体又はキメラ抗体であり得る。特定の実施態様において、抗体は、二重特異性抗体である。特定の実施態様において、抗体は、ATN-658ではない。

好ましい実施態様において、抗体は、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体の下流シグナル伝達を調節し、（a）フィブロネクチンのuPAR仲介性集合、（b）インテグリンα5v1に対するフィブロネクチン又はその断片の結合及び/又は（c）ビトロネクチン構成成分の集合を含むがそれらに限定されるわけではないuPARシグナル伝達に干渉できかつ阻害できる。また、抗体は、細胞膜上でのuPAR分子の数を下方制御できる。

好ましい実施態様において、本発明の抗体は、検出可能な標識又は治療剤へ複合される。検出可能な標識は、放射性核種、PET造影剤、MRI造影剤、フルオレサー（fluorescer）、フルオロゲン、発色団、色素原、ホスホレサー（phosphorescer）、ケミルミネサー（chemiluminescer）又はバイオルミネサー（bioluminescer）を含むが、これらに限定されるわけではない。代表的な放射性核種は、³H、¹⁴C、³⁵S、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、⁷²As、⁸⁹Zr、⁹⁷Ru、⁹⁹Tc、¹¹¹In、¹²³I、 ¹²⁵I、¹³¹I、¹⁶⁹Yb及び²⁰¹TIを含むが、これらに限定されるわけではない。代表的なフルオレサー又はフルオロゲンは、フルオレセイン、ローダミン、ダンシル、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、o-フタルアルデヒド、フルオレサミン、フルオレセイン誘導体、オレゴングリーン、ローダミングリーン、ロドルグリーン（Rhodol Green）及びテキサスレッドを含むが、これらに限定されるわけではない。治療剤は、化学療法剤、毒素又は治療用放射性核種を含むが、これらに限定されるわけではない。

また、本発明は、本発明の抗体又はその抗原結合断片と医薬として許容し得る担体とを含む医薬組成物を提供する。医薬組成物は、細胞の望ましくない遊走、浸潤、増殖又は血管新生と関連した細胞を、本発明の医薬組成物の有効量と接触させることによって、細胞遊走、細胞浸潤、細胞増殖又は血管新生を阻害するための、又はアポトーシスを誘導する方法において使用され得る。また、医薬組成物は、本発明の医薬組成物の治療的有効量を対象へ投与することによって、望ましくない血管新生、腫瘍成長及び/又は腫瘍転移を特徴とする疾病、障害又は状態を有する対象を処置するための方法において使用され得る。

図１は、ヒトuPAR（UniProtKB/Swiss-Prot受託番号Q03405（配列番号15））の加工されていない形態のアミノ酸配列を提供する。ヒトuPARの加工された形態（成熟型）は、(太字で示された)最初の22個のアミノ酸を欠失する。

図２は、ATN-658及びATN-617の結合アッセイデータを示す。300nMの標識されていないscuPA又は300nMのATN-658の何れかの存在下又は不存在下で、HeLa細胞を5nMの¹²⁵I-scuPA（一本鎖uPA、Holmesらの文献（Biotechnology 3:923-929 (1985)））とともにインキュベートした。uPARに対するuPAの結合を遮断する抗uPARモノクローナル抗体であるATN-617は、コントロールとしてscuPA結合と競合することが示されている。データは、モノクローナル抗体ATN-658が、HeLa細胞に対するuPAの結合と競合しないことを示す。HeLa細胞に対するATN-658の結合は、¹²⁵I-scuPAの結合を阻害しなかった。

図３は、卵巣癌のマウスモデルにおける腫瘍成長アッセイの結果を示す。データは、ATN-658が、A2780卵巣癌モデルにおける腫瘍成長を、シスプラチンと同様に効果的に阻害することを示す。A2780細胞は、uPARのみを発現し、uPAを発現しない。

図４は、肺癌のマウスモデルにおける腫瘍成長アッセイの結果を示す。データは、10⁶個の腫瘍細胞を接種したA549肺癌（非小細胞）モデルにおける腫瘍成長を阻害することを示す。A549細胞は、uPA及びuPARの両者を発現する。

図５Ａは、ヒト、アフリカミドリザル、及びカニクイザル又はオナガマカクの間で異なるuPARの9個のアミノ酸残基を示す表である。

図５Ｂは、ATN-658（又はコントロールとしてのATN-615）及び野生型の又は示された変異を有するサルuPARを使用して実施された共免疫沈降アッセイの結果を示す。免疫沈降データは、ATN-658が、サルuPARには結合しないが、ヒトuPARにおける位置268にあるアミノ酸に相当する位置268でのサルuPARのE（グルタミン）からK（リジン）への変異によって、ATN-658の結合が付与されることを示す。サルuPARの他のアミノ酸残基を、ヒトuPARの相当するアミノ酸残基へ変異させることは、ATN-658の結合を付与しなかった。

図６は、ヒトuPARのアラニンスキャニング変異誘発分析からの結合データを示す表である。表からのデータは、ヒトuPARのいくつかのアミノ酸残基、すなわちアミノ酸残基268、273、275及び277の変異が、uPARエピトープに対するATN-658の結合を低下させることを示す。個々のヒトuPAR（野生型又は変異型）に対するATN-658の相対的な結合親和性が示されており、高い結合親和性を++++として表し、より低い親和性を+++、++、及び+として表す。

図７Ａは、ATN-658が結合するヒトuPARのエピトープをマッピングするのに使用される重水素交換アッセイの背後にある段階及び原理を描く模式図を示す。 図７Ｂ及び７Ｃは、ATN-658の存在下及び不存在下でヒトuPAR D2D3を使用する重水素交換アッセイからのエピトープマッピングデータを示す。重水素化レベルの低下（差異）の近似の％を個々のエピトープ領域について示す。 図７Ｃは、ATN-658の存在下及び不存在下でヒトuPAR D2D3を使用する重水素交換アッセイからのエピトープマッピングデータを示す。重水素化レベルの低下（差異）の近似の％を個々のエピトープ領域について示す。

（5．発明の詳細な記述）
uPARは、細胞表面上で発現するので、抗体にとって理想的な標的である。（浸潤性腫瘍細胞、血管新生内皮細胞、又は腫瘍関連マクロファージにおける）腫瘍-脈管系界面でのuPARの発現は、このタンパク質を標的とする抗体が、腫瘍細胞に進入して診断剤として機能し又は治療効果を発揮するために、他のモノクローナル抗体が拡散し損なったのと同一の障壁を受けないであろうことを示唆する。重要なことに、uPARは、治療用抗体を採用する場合に毒性についての可能性を最小化すべきであり、診断用抗体を採用する場合に非特異的シグナル（又は偽陽性）を最小化すべきである静止状態の組織において正常に発現しない。

本発明は、uPAR特異的モノクローナル抗体によって標的にされるエピトープに関する本発明者の特徴づけに一部基づいている。モノクローナル抗体ATN-658を分泌するハイブリドーマは、2007年2月1日に米国培養細胞系統保存機関（10801 University Blvd., Manassas, VA. 20110-2209）により、ブダペスト条約の規定の下に寄託されており、ATCC受託番号PTA-8191を割り当てられている。この抗体は、uPA受容体に対するuPAの結合に影響を及ぼさない。このエピトープに結合する抗体は、インテグリン、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質（LRP）及び他の結合パートナー等の「下流」リガンドを含む下流シグナル伝達経路に影響を及ぼす。これらの下流相互作用は、細胞の遊走、浸潤及び増殖の過程に重要であると信じられている。従って、これらの過程を治療上標的にし、又は該過程若しくは該過程の相互作用する構成要素を診断上検出することが望ましい。

従って、本発明は、癌の予防及び治療を提供する方法及び組成物に関する。本発明の具体的な態様は、癌細胞の増殖及び浸潤を阻害する化合物を含有する方法及び組成物に関する。

本発明はさらに、本発明のuPAR抗体を使用する診断方法を提供する。また、本発明の診断方法は、癌の進行を予知し又は予測するために使用できる。具体的な実施態様において、本発明の診断方法は、転移を画像化し及び局在化させる方法、並びに、原発腫瘍部位に対して遠位の組織及び体液を使用する診断法及び予知法（及び原発腫瘍の組織及び体液を使用する方法）を提供する。他の実施態様において、本発明の診断方法は、転移を画像化し及び局在化させる方法、並びにインビボでの診断法及び予知法を提供する。

（5．1．uPAR特異的モノクローナル抗体ATN-658のエピトープ）
本発明者は、uPAに対する結合に関与しないuPAR上のエピトープをマッピングした。このエピトープは、そのすべての内容が全体として引用により組み込まれているWO2005/116077に記載されるuPARモノクローナル抗体ATN-658との該エピトープの相互作用によってマッピングされた。ATN-658の可変部配列を以下に示す。

ATN-658： 可変部配列

モノクローナル抗体ATN-658の軽鎖可変部（V_L）及び重鎖可変部（V_H）のポリペプチドの共通アミノ酸配列（一文字表記）を以下に示す。各可変部についての相補性決定領域（CDR）が強調されている（イタリック体、太字、下線付き）。
ATN-658 V_L共通タンパク質（配列番号1）：

ATN-658 V_H 共通タンパク質（配列番号2）

この抗体は、uPA-uPAR複合体を認識する。

この抗体は、uPAR D2D3断片中のエピトープに対して生じた。D2D3中のエピトープは、uPAの遊走前活性に対して重大であることが示されている（Andolfo Aらの文献（(2002) Thromb Haemost 88: 298-306））。従って、このエピトープがすでに露出されているD2D3断片に対して生じた抗体は、抗遊走活性を有すると期待される。

一実施態様において、本発明の抗体は、配列番号9、10、11、12、13、又は16のアミノ酸配列によって定義されるエピトープを認識する。

代替的な実施態様において、本発明の抗体は、（i）配列番号9、10、11、12、13、又は16のアミノ酸配列；及び（ii）ヒトuPAR（配列番号15）内での配列番号14のアミノ酸配列によって定義されるコンホメーション依存的エピトープを認識する。この場合、全長の可溶性uPAR（suPAR）（残基1〜283、ドメイン1、2、及び3）が、免疫原として使用できる。しかしながら、当業者は、適切なコンホメーションが維持される限り、suPARのより短い断片が免疫原として使用できることを認識するであろう。

いくつかの態様において、コンホメーション依存的エピトープは、位置98から277、279、280、281、282、又は283までのヒトuPARの断片の連続的なアミノ酸配列を含み又は該アミノ酸配列からなる。別の態様において、コンホメーション依存的エピトープは、ヒトuPAR（配列番号15）の単離された断片のアミノ末端が、アミノ酸番号93〜98の何れか1つにあり、かつ該断片のカルボキシ末端がアミノ酸番号277〜283の何れか1つにある該断片、又は該断片の配列に対して保存的置換のみを含有するその誘導体を含み又はそれらからなる。また、このような断片及び異なるタンパク質の配列を含む融合タンパク質が提供される。好ましい態様において、コンホメーション依存的エピトープは、例えば分子モデリングによって示されるように、その未変性のコンホメーションを保有する。他の態様において、コンホメーション依存的エピトープは、（i）配列番号9、10、11、12、13又は16のアミノ酸配列；及び（ii）配列番号14のアミノ酸配列によって定義され、リンカーペプチド配列は、（i）及び（ii）のアミノ酸配列間に配置され、それにより未変性のコンホメーションが維持される。特定の実施態様において、リンカーペプチド配列は、uPARの未変性のコンホメーションを模倣する。一実施態様において、リンカーペプチド配列は、ヒトuPARに対して異種性である。別の実施態様において、リンカーペプチド配列は、保存的アミノ酸置換が実施されたヒトuPARの介在配列である。例えば、配列内の1つ以上のアミノ酸残基は、機能的等価物として作用する類似の極性の別のアミノ酸によって置換され、結果的にサイレント変化を生じることができる。配列内の1つのアミノ酸に関する置換は、該アミノ酸の属するクラスの他のメンバーから選択され得る。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニンを含む。極性中性アミノ酸は、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、及びグルタミンを含む。正に荷電した（塩基性）アミノ酸は、アルギニン、リジン及びヒスチジンを含む。負に荷電した（酸性）アミノ酸は、アスパラギン酸及びグルタミン酸を含む。このような置換は一般的に、保存的置換であると理解される。1つ以上のアミノ酸残基の保存的置換は好ましくは、未変性のコンホメーション又は活性を妨害しないであろう部位で、ペプチド配列中に導入される。

また、これらのuPARエピトープを含むより長いペプチドが、本発明によって企図される。例えば、uPARペプチドは、20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、200個までのアミノ酸を含み得る。一実施態様において、ペプチドは、uPARの連続したアミノ酸残基を含む。これらのより長いペプチドは一般的に、ヒトuPARの断片からなるであろうし、uPARのエピトープ配列を含むであろう。別の実施態様において、uPARは、ヒトuPARである。
ヒトuPAR UniProtKB/Swiss-Prot受託番号Q03405（配列番号15））の加工されていない形態のアミノ酸配列を図１に提供する。

ヒトuPARの加工された形態（成熟型）は、最初の22個のアミノ酸を除去する。また、C末端残基284〜313（成熟型タンパク質のアミノ末端から番号付け）は、uPARがGPI尾部によって細胞膜へ繋留される場合に翻訳後加工によって除去される（Mollerらの文献（Eur. J. Biochem. 208:493-500 (1992)）、Low, M. G.の文献（FASEB J. 3:1600-1608 (1989)）参照）。本願における（suPARを含む）uPARに対する引用は、別段の明白な記載がない限り、（アミノ酸1〜283を含有する）加工された（成熟型）uPARに対する引用である。

いくつかの実施態様において、表２におけるエピトープ配列の1つ以上のアミノ酸残基を変異させることは、例えば膜結合型又はsuPARであり得るヒトuPAR中に含有されるようなエピトープに対する抗体、例えばATN-658の免疫特異的結合親和性を低下させ又は破壊する。具体的な実施態様において、ヒトuPARのアミノ酸残基268又は表２におけるエピトープでの変異は、エピトープに対する抗体又はその抗原結合断片の免疫特異的結合親和性を低下させ又は破壊する。特定の実施態様において、ヒトuPARにおける位置268にあるK（Lys）残基がE（Glu）残基へ（uPAR K268E）又はA（Ala）残基へ（uPAR K268A）変異する場合、エピトープに対する抗体の結合は、該抗体による該結合の低下によって示される。
別の実施態様において、ヒトuPARのアミノ酸残基273又は表２におけるエピトープでの変異は、エピトープに対する抗体又はその抗原結合断片の免疫特異的結合親和性を低下させ又は破壊する。特定の実施態様において、ヒトuPARにおける位置273にあるH（His）残基がA（Ala）残基へ変異する場合（uPAR H273A）、エピトープに対する抗体の結合は、該抗体による該結合の低下によって示される。ある実施態様において、ヒトuPARのアミノ酸残基275又は表２中のエピトープでの変異は、エピトープに対する抗体又はその抗原結合断片の免疫特異的結合親和性を低下させ又は破壊する。特定の実施態様において、ヒトuPARにおける位置275にあるD（Asp）残基がA（Ala）残基へ変異する場合（uPAR D275A）、エピトープに対する抗体の結合は、該抗体による該結合の低下によって示される。一実施態様において、ヒトuPARのアミノ酸残基277又は表２におけるエピトープでの変異は、エピトープに対する抗体又はその抗原結合断片の免疫特異的結合親和性を低下させ又は破壊する。特定の実施態様において、ヒトuPARにおける位置277にあるD（Asp）残基がA（Ala）残基へ変異する場合（uPAR D277A）、エピトープに対する抗体の結合は、該抗体による該結合の低下によって示される。特定の実施態様において、本明細書に記載されるようなヒトuPARの1つ以上の残基、例えば268、273、275、及び/又は277の変異、或いは表２におけるエピトープの何れかにおける変異は、野生型ヒトuPAR（例えば、膜結合型uPAR、suPAR）に対する又はsuPARの断片（例えば、D2D3 suPAR）に対する抗体の親和性に対して、抗体又はその抗原結合断片の免疫特異的結合親和性を少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％又は少なくとも50％低下させる。

ヒトuPARに対する、又はそのエピトープを含有する断片（例えば、D2D3 suPAR）に対する抗体又はその抗原結合断片の結合親和性は、例えば、これらに限定されるわけではないが、共免疫沈降アッセイ、BIAcoreアッセイ、重水素交換アッセイ、及びELISAといった、当技術分野で周知の方法によって決定できる。具体的な実施態様において、ヒトuPARにおける位置268にあるK（Lys）残基がE（Glu）残基へ（uPAR K268E）又はA（Ala）残基へ（uPAR K268A）変異する場合、エピトープに対する抗体の結合は、該抗体による該結合の少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、60％、又は70％の低下によって示される。好ましくは、結合の量は、抗体とuPAR K268E又はuPAR K268Aそれぞれとの共免疫沈降によって示される。ある実施態様において、ヒトuPARにおける位置273にあるH（His）残基がA（Ala）残基へ変異する場合（uPAR H273A）、エピトープに対する抗体の結合は、該抗体による該結合の少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％又は90％の低下によって示される。好ましくは、結合の量は、抗体とuPAR H273Aとの共免疫沈降によって示される。他の実施態様において、ヒトuPARにおける位置275又は277にあるD（Asp）残基がA（Ala）残基へ変異する場合（それぞれuPAR D275A又はuPAR D277A）、エピトープに対する抗体の結合は、該抗体による該結合の少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％又は90％の低下によって示される。好ましくは、結合の量は、抗体とuPAR D275A又はuPAR D277Aそれぞれとの共免疫沈降によって示される。例えば、抗体による結合の低下は、抗体と共免疫沈降する野生型uPAR（例えば、膜結合型uPAR、suPAR）又はsuPARの断片（例えば、D2D3 suPAR）の量に対する、抗体と共免疫沈降する変異したuPAR（例えば、uPAR K268E、uPAR K268A、uPAR H273A、uPAR D275A、又はuPAR D277A）の減少した量によって示される。

本発明の他の態様において、本発明のエピトープに対する抗体の結合は、重水素交換アッセイによって示され、この中で、タンパク質（例えば、ヒトsuPAR）のエピトープに対する抗体（例えば、ATN-658）の結合は、重水素を交換する該エピトープの能力を低下させる。具体的な実施態様において、ヒトsuPARは抗体と接触して、ヒトuPARのエピトープに対する抗体の結合は、抗体の不存在下でのエピトープ上での重水素化に対する、結合条件下で抗体の存在下にある場合のエピトープ上での重水素化レベルの低下によって示される。逆に、抗体によって接触されないsuPARの領域は、結合条件下で抗体の存在下又は不存在下にある場合の同一の又は同様の重水素化レベルを有する。好ましくは、重水素化アッセイは、ドメイン2及び3（D2D3）（アミノ酸88〜283）を含有し又はそれらからなるヒトuPARの断片を使用して実施される。特定の実施態様において、ヒトsuPARのエピトープに対する抗体の結合は、抗体の不存在下でのエピトープ上での重水素化レベルに対する、結合条件下で抗体の存在下にある場合のヒトsuPARのエピトープ上での重水素化レベルの少なくとも10％、又は少なくとも20％、又は少なくとも30％、又は少なくとも40％、又は少なくとも50％の低下によって示される。具体的な実施態様において、抗体の不存在下でsuPARのエピトープ上での重水素化レベルに対する、結合条件下での抗体の存在下の場合のsuPARのエピトープ上での重水素化レベルの少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、又は少なくとも75％の低下が示される。具体的な実施態様において、抗体は固定化されている。

uPARエピトープ及びこれらの配列を含むペプチドは、本明細書に記載される診断法及び治療法における有用性を有し得る。

（5．2．uPAR抗体）
本発明は、配列番号9、10、11、12又は13のアミノ酸配列によって定義されるuPARのエピトープへ免疫特異的に結合する、単離された抗体又はその抗原結合断片を提供する。また、本発明は、（i）

；及び（ii）ヒトuPAR（配列番号15）内での

によって定義されるコンホメーション依存的エピトープへ免疫特異的に結合する、単離された抗体又はその抗原結合断片を提供する。本発明は、配列番号16のアミノ酸配列によって定義されるuPARのエピトープへ免疫特異的に結合する、単離された抗体又はその抗原結合断片を提供する。また、本発明は、（i）

；及び（ii）ヒトuPAR（配列番号15）内での

によって定義されるコンホメーション依存的エピトープへ免疫特異的に結合する、単離された抗体又はその抗原結合断片を提供する。

これらの抗体は、二成分のuPA-uPAR複合体へ結合するが、（a）遊離uPA又は（b）uPAを認識し及び結合するuPARの領域には実質的に結合せず、それによりmAbは、uPA-uPAR結合を阻害しないと考えられている。本明細書で使用されるように、「免疫特異的に結合する」は、抗体又はその抗原結合断片が、該抗体又はその抗原結合断片の可変部の抗原認識領域を介して、抗原へ結合することを意味する。

（5．2．1．エピトープを使用するモノクローナル抗体の製造）
ハイブリドーマ技術を使用して特異的抗体を製造及びスクリーニングする方法は、当技術分野で所定かつ周知であり、例えば、Harlowらの文献（抗体：実験マニュアル（Antibodies: A Laboratory Manual）, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988）、Hammerlingらの文献（モノクローナル抗体及びT細胞ハイブリドーマ（Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas） 563-681 Elsevier, N.Y., 1981）、Kohler及びMilsteinの文献（Nature 256: 495-497 (1975)）、米国特許第4,376,110号、モノクローナル抗体及びハイブリドーマ：生物学的分析における新次元（Monoclonal Antibodies and Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses）, Plenum Press, New York, NY (1980)）、H. Zolaらの文献（モノクローナルハイブリドーマ抗体：技術及び応用（Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications）, CRC Press, 1982)）にある（該引用は、それらのすべての内容が全体として引用により組み込まれている）。動物、好ましくはマウスは、刺激された動物における望ましい抗体反応を誘発するために、上述のような免疫原を使用した免疫化によって刺激される。他の実施態様において、非ヒト哺乳動物は、刺激された非ヒト哺乳動物における望ましい抗体反応を誘発するために、上述のような免疫原を使用した免疫化によって刺激される。

簡潔には、マウスは、uPARエピトープを使用して免疫化でき、一旦免疫反応が検出され、例えば、uPARに特異的な抗体がマウス血清中で検出されると、マウス脾臓が回収されて脾臓細胞が単離される。次に、脾臓細胞は、周知の技術によって何れかの適切な骨髄腫細胞へ、例えば、ATCCから入手可能なSP20細胞系由来の細胞へ融合される。ハイブリドーマは、選択され、限界希釈によってクローニングされる。次に、ハイブリドーマクローンは、uPARを結合できる抗体を分泌する細胞について、当技術分野で公知の方法によってアッセイされる。抗体の高レベルを一般的に含有する腹水は、正のハイブリドーマクローンを使用してマウスを免疫化することによって作製できる。

表２におけるエピトープ配列は、本発明の抗体の製造のための免疫原として使用される。一実施態様において、アミノ酸配列

からなるペプチドが使用される。
別の実施態様において、アミノ酸配列

を含む20、30、40、50、60又は100個までのアミノ酸のヒトuPARの断片が使用される。一実施態様において、アミノ酸配列

を含む20、30、40、50、60又は100個までのアミノ酸のヒトuPARの断片が使用される。さらに別の実施態様において、（i）

；及び（ii）ヒトuPAR（配列番号15）内での

によって定義されるコンホメーション依存的エピトープを含むペプチドが使用される。具体的な実施態様において、（i）

；及び（ii）ヒトuPAR（配列番号15）内での

を含み又はそれに代わるものとして（i）及び（ii）からなるペプチドが使用される。

いくつかの態様において、このようなコンホメーション依存的エピトープは、位置98から277、279、280、281、282、又は283までのヒトuPARの断片の連続的なアミノ酸配列を含み又は該アミノ酸配列からなる。好ましい態様において、コンホメーション依存的エピトープは、例えば分子モデリングによって示されるように、該エピトープの未変性のコンホメーションを保有する。他の態様において、コンホメーション依存的エピトープは、（i）配列番号9、10、11、12、13、又は16のアミノ酸配列；及び（ii）配列番号14のアミノ酸配列によって定義され、リンカーペプチド配列は、（i）及び（ii）のアミノ酸配列間に配置され、それにより未変性のコンホメーションが維持される。特定の実施態様において、リンカーペプチド配列は、uPARの未変性のコンホメーションを模倣する。一実施態様において、リンカーペプチド配列は、ヒトuPARに対して異種性である。別の実施態様において、リンカーペプチド配列は、保存的アミノ酸置換が実施されたヒトuPARの介在配列である。1つ以上のアミノ酸残基の保存的置換は好ましくは、未変性のコンホメーション又は活性を妨害しないであろう部位で、ペプチド配列中に導入される。例えば、配列内の1つ以上のアミノ酸残基は、機能的等価物として作用する類似の極性の別のアミノ酸によって置換され、結果的にサイレント変化を生じることができる。配列内の1つのアミノ酸に関する置換は、該アミノ酸の属するクラスの他のメンバーから選択され得る。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニンを含む。極性中性アミノ酸は、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、及びグルタミンを含む。正に荷電した（塩基性）アミノ酸は、アルギニン、リジン及びヒスチジンを含む。負に荷電した（酸性）アミノ酸は、アスパラギン酸及びグルタミン酸を含む。このような置換は一般的に、保存的置換であると理解される。

他の実施態様において、可溶性uPAR（suPAR）の残基88〜283に相当するドメイン2及び3（D2D3）を含み又は該D2D3からなるヒトuPARのペプチド又は断片は、免疫原として使用される。これらの配列を含むペプチドは、当技術分野で公知の多様な方法、例えば、従来の組換え方法を使用するクローニングされた遺伝子の発現、起源の細胞からの単離、例えばuPA又はuPARの高レベルを発現する細胞集団等において作製できる。より短い断片の場合、該ペプチドは、化学的に合成され得る。

刺激された動物のリンパ節、脾臓又は末梢血由来のBリンパ球は、一般的にポリエチレングリコール（PEG）等の融合促進剤の存在下で、骨髄腫細胞と融合される。マウス骨髄腫細胞系の多くの何れか、すなわちP3-NS1/1-Ag4-1、P3-x63-k0Ag8.653、Sp2/0-Agl4、又はHL1-653骨髄腫系（ATCC, Rockville, MDより市販）は、このような使用のために利用可能である。その後の段階は、選択培地における増殖を含み、それにより、融合されていない親骨髄腫細胞及びドナーリンパ球細胞は最終的に死滅するのに対し、ハイブリドーマ細胞のみが生き残る。これらは、クローニングされ及び増殖され、その上清は、例えばイムノアッセイ技術によって、所望の特異性に関するAbの存在についてスクリーニングされる。陽性クローンは、例えば限界希釈によってサブクローニングされ、モノクローナル抗体が単離される。

これらの方法に従って作製されるハイブリドーマは、当技術分野で公知の技術を使用してインビトロ又はインビボで増殖できる（一般的には、Finkらの文献（Prog. Clin. Pathol. 9:121-33 (1984)）参照）。一般的には、個々の細胞系は、培養において増殖され、単一モノクローナル抗体の高濃度を含有する培地は、デカンテーション、濾過、又は遠心分離によって回収できる。

本発明に従ったmAbを作製するための好ましいアプローチは、次のとおりである。

表２におけるエピトープは好ましくは、担体タンパク質、例えばKLHへ複合され、フロイント完全アジュバント（例えば、50μg複合体）中でBALB/cマウスへ腹腔内（i.p.）注射された後、フロイント不完全アジュバント中で同一容量が2週間間隔でさらに2回注射される。1ヶ月後、最後の注射がi.p付与され（例えば、0.5mL PBS中の50μg）、好ましくはアジュバントなしで静脈内（i.v.）（例えば、0.2mL中の50μg）でも付与される。

脾臓細胞は、最後の注入の3日後に回収され、標準的な技術を使用してP3X63AF8/653又は他の骨髄腫細胞と融合される。

標準的なプロトコールを使用した免疫化の後、従来技術を採用して、免疫化された動物からハイブリドーマ細胞系が作出され、所望の特性を有するモノクローナル抗体が生成される。

（5．3．uPAR抗体のスクリーニング及び特徴づけ）
プラスチック上に固定化された純粋なsuPARは、一次スクリーニングに好ましい。uPARを過剰発現する多くの腫瘍細胞系は、周知であり、市販されており、これらは、スクリーニングのために使用され得る。また、例えば、uPARを過剰発現するHeLa系等の細胞は、抗uPAR mAbの細胞結合を示すのに使用され得る。細胞は一般的に、96ウェルのマイクロプレートにおいて播種される。細胞は、例えばメタノール/アセトン（50：50）を使用して固定され得、結合は、免疫蛍光染色によって検出され得る。或いは、mAbは、放射性同位体又はビオチン等の他のトレーサーを使用して標識され得、結合は、放射能又はビオチンの測定によって検出され得る。

一実施態様において、ハイブリドーマ上清（例えば、50μL）を、固定された293個の細胞を含有するウェルへ、37℃で約1.5時間添加する。プレートを（PBS/0.05％トゥイーン20等の）洗浄緩衝液中で2回洗浄し、ローダミンレッドの複合されたヤギ抗マウスIgGを、1：100等の適切な希釈で37℃で1.5時間添加する（例えば、30μL/ウェル）。洗浄緩衝液中で洗浄した後、免疫蛍光の存在について細胞を検討する；本明細書に記載される実施態様において、蛍光顕微鏡が使用される。

本実施態様において、免疫蛍光は、ハイブリドーマ上清が、uPA/uPAR複合体に特異的な抗体を含有するかどうかを決定するための基礎である（が、また、免疫組織化学染色が使用され得る）。上清が、陽性染色を示す場合、ハイブリドーマクラスが選別され、増量され、上清が、ELISAによって、複合体に対する反応性について検査される。

好ましいELISAにおいて、ペプチドを、担体タンパク質として卵白アルブミン（OVA）へ連結し、例えば、50μLコーティング緩衝液（0.2 M Na₂CO₃/NaHCO₃、pH 9.6）中の複合体2μg/mLを受容する96ウェルEIAプレートのウェル上へ、ペプチド/OVA複合体をコーティングする。プレートを4℃で一晩インキュベートし、適切なブロッキング緩衝液、例えば1％BSAを含有するPBS（200μL/ウェル）を使用して4℃で一晩ブロッキングする。ハイブリドーマ上清（例えば、50μL）をウェルへ、室温で1.5時間添加する。

プレートを洗浄緩衝液（例えば、PBS/0.05%トゥイーン20）中で2回洗浄し、アルカリホスファターゼを連結したヤギ抗マウスIgG等の酵素連結二次抗体を適切な希釈、例えば1：2000で添加する（50μL/ウェル）。プレートを室温で1.5時間インキュベートする。洗浄緩衝液中で4回洗浄した後、酵素のための適切な発色基質、例えば、本実施態様においてはCP-ニトロフェニルホスフェート（Kirkegaard and Perry社, Gaithersburg, MDから市販）を約30分間添加して、着色された生成物に適した波長（ここでは405nm）で吸光度を測定する。エピトープを保持するペプチドと強く反応するハイブリドーマ上清（例えば、ネガティブコントロールが0.02未満である場合、A₄₀₅＞1.0）は、再度クローニングされ（好ましくは2回）、上述のようにELISAによってmAb反応性を再度確認する。

本発明の抗uPAR抗体は好ましくは、異種腫瘍モデルにおいて検査され、このうち2つの好ましい例は、A2780及びA549モデルである（以下により詳細に記載）。

抗体は、インビボでのマトリゲルプラグモデルにおいて、直接的な抗血管新生活性について評価される。受容体及びリガンドの両者を発現するMDA MB 231細胞を使用して、放射ヨウ素標識した抗体を使用して、抗体の内部移行が検査される。また、抗体の内部移行は、PAI-1：uPA複合体の存在下で測定される。

（5．4．抗体の形態）
本発明の方法において使用される抗体は、モノクローナル抗体、合成抗体、多選択性抗体（二重特異性抗体を含む）、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、一本鎖Fv（scFv）（二重特異性scFvを含む）、一本鎖抗体、Fab断片、F(ab')断片、ジスルフィドの連結されたFv（sdFv）、及び上述の何れかのエピトープ結合断片を含むが、これらに限定されるわけではない。特に、本発明の方法において使用される抗体は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性のある部分、すなわちuPARへ免疫特異的に結合する抗原結合部位を含有する分子を含む。本発明の免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン分子の何れかの種類（例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及びIgY）、クラス（例えば、IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁及びIgA₂）又はサブクラスであり得る。また、例えば、抗uPA/uPAR抗体のイディオタイプに特異的な抗イディオタイプ抗体が含まれる。

また、抗体誘導体は、本発明によって包含される。本明細書で使用される「誘導体」という用語は、アミノ酸残基の置換、欠失若しくは付加の導入（すなわち、変異）によって変化したuPARポリペプチドへ免疫特異的に結合する抗体又はuPARポリペプチドへ免疫特異的に結合する抗体断片のアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。いくつかの実施態様において、抗体誘導体又はその断片は、1つ以上のCDRにおいてアミノ酸残基の置換、欠失又は付加を含む。抗体誘導体は、非誘導性抗体と比較した場合、実質的に同一の結合、より良好な結合、又はより劣悪な結合を有し得る。特定の実施態様において、CDRの1、2、3、4、又は5個のアミノ酸残基は、置換され、欠失され又は付加されている（すなわち、変異している）。また、本明細書で使用される「誘導体」は、すなわちポリペプチドへの分子の何れかの種類の共有結合によって修飾されたuPARへ免疫特異的に結合する抗体、又はuPARへ免疫特異的に結合する抗体断片を指す。例えば、限定するわけではないが、uPAR抗体又は抗体断片は、例えばグリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、公知の保護/遮断基による誘導体化、タンパク質分解性切断、細胞リガンド若しくは他のタンパク質への結合等によって修飾され得る。uPAR抗体又は抗体断片の誘導体は、特異的な化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成等を含むがこれらに限定されるわけではない当業者に公知の技術を使用する化学的修飾によって修飾され得る。

本発明の方法において使用される抗体は、鳥類及び哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ロバ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、又はニワトリ）を含む何れかの動物起源に由来し得る。特定の実施態様において、本発明の方法は、非ヒト哺乳動物に由来し得る。好ましくは、抗体は、ヒト又はヒト化モノクローナル抗体である。本明細書で使用されるように、「ヒト」抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、及びヒト免疫グロブリンライブラリから、又はヒト遺伝子から抗体を発現するマウス若しくは他の動物から単離された抗体を含む。

本発明の方法において使用される抗体は、単一特異性、二重特異性、三重特異性又はより大きな多選択性であり得る。多選択性抗体は、uPARの異なるエピトープへ免疫特異的に結合し得、又はuPARと、異種性ポリペプチド若しくは固体支持体材料等の異種性エピトープとの両者へ免疫特異的に結合し得る。例えば、国際公報WO 93/17715、WO 92/08802、WO 91/00360、及びWO 92/05793、Tuttらの文献（1991, J. Immunol. 147:60-69）、米国特許第4,474,893号、第4,714,681号、第4,925,648号、第5,573,920号、及び第5,601,819号、並びにKostelnyらの文献（1992, J. Immunol. 148:1547-1553）を参照されたい。本発明のある実施態様において、二重特異性抗体は、ATN-658及び別のuPARエピトープへ結合する。Gardsvollらの文献（2006, J Biol. Chem. 281(28): 19260-72）、Gardsvollらの文献（1999, J. Biol. Chem. 274(53):37995-8003）を参照されたい。

また、本発明の抗体は、当技術分野で公知の多様なファージディスプレイ法を使用して生じることができる。ファージディスプレイ法において、機能的抗体ドメインは、該ドメインをコードするポリヌクレオチド配列を保持するファージ粒子の表面上で表示される。特に、V_H及びV_LドメインをコードするDNA配列は、動物cDNAライブラリから増幅される（例えば、リンパ様組織のヒト又はマウスcDNAライブラリ）。V_H及びV_LドメインをコードするDNAは、scFvリンカーを使用してPCRによって互いに組換えられ、ファージミドベクター（例えば、pCANTAB 6又はpComb 3 HSS）へクローニングされる。ベクターは、イー・コリにおいて電気穿孔され、イー・コリは、ヘルパーファージに感染する。これらの方法において使用されるファージは、fd及びM13を含む典型的に糸状のファージであり、V_H及びV_Lドメインは通常、ファージ遺伝子III又は遺伝子VIIIの何れかへ組換えで融合される。関心対象のuPARエピトープへ結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、抗原を使用して、例えば、標識された抗原又は固体表面若しくはビーズへ結合し若しくは捕捉された抗原を使用して、選択でき又は同定できる。本発明の抗体を製造するために使用できるファージディスプレイ法の例は、それらのすべての内容が全体として引用により本明細書中に各々組み込まれているBrinkmanらの文献（1995, J. Immunol. Methods 182:41-50）、Amesらの文献（1995, J. Immunol. Methods 184:177）、Kettleboroughらの文献（1994, Eur. J. Immunol. 24:952-958）、Persicらの文献（1997, Gene 187:9）、Burtonらの文献（1994, Advances in Immunology 57:191-280）、国際出願PCT/GB9 1/01 134、国際公報WO 90/02809、WO 91/10737、WO 92/01047、WO 92/18619、WO 93/11236、WO 95/15982、WO 95/20401、及びWO97/13844、並びに米国特許第5,698,426号、第5,223,409号、第5,403,484号、第5,580,717号、第5,427,908号、第5,750,753号、第5,821,047号、第5,571,698号、第5,427,908号、第5,516,637号、第5,780,225号、第5,658,727号、第5,733,743号及び第5,969,108号に開示されているものを含む。

上述の引用文献に記載されているように、ファージ選別の後、該ファージに由来する領域をコードする抗体を単離し及び使用して、ヒト抗体を含む全抗体、又は何れかの他の所望の抗原結合断片を生じることができ、並びに、例えば以下に記載される哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、及び細菌を含む何れかの所望の宿主において発現させることができる。また、Fab、Fab'及びF(ab')2断片を組換えで製造する技術は、国際公報WO 92/22324、Mullinaxらの文献（1992, BioTechniques 12:864）、Sawaiらの文献（1995, AJRI 34:26）、及びBetterらの文献（1988, Science 240:1041）において開示されるものなど、当技術分野で公知の方法を使用して採用できる（該引用文献は、それらのすべての内容が全体として引用により組み込まれている）。

全抗体を生じるために、V_H又はV_Lヌクレオチド配列、制限部位、及び制限部位を保護するための隣接配列を含むPCRプライマーは、scFvクローンにおいてV_H又はV_L配列を増幅するために使用できる。当業者に公知のクローニング技術を利用して、PCR増幅されたV_Hドメインは、V_H定常部、例えばヒトγ4定常部を発現するベクターへクローニングでき、PCR増幅されたV_Lドメインは、VL定常部、例えばヒトκ又はλ定常部を発現するベクターへクローニングできる。また、V_H及びV_Lドメインは、必要な定常部を発現する1つのベクターへクローニングされ得る。次に、重鎖変換ベクター及び軽鎖変換ベクターが、細胞系へ同時形質移入され、当業者に公知の技術を使用して、全長の抗体、例えばIgGを発現する安定した又は一過性の細胞系を生じる。

（5．4．1．抗体断片）
「抗体」という用語は、未変化の免疫グロブリン（Ig）分子と、Ig分子のタンパク分解性切断によって製造され得又は遺伝的に若しくは化学的に組換えられ得るその断片及び誘導体との両者を含むものとして意味される。断片は例えば、Fab、Fab'、F(ab')2を含み、それらの各々は、抗原を結合できる。本明細書に記載される「断片」は、uPARポリペプチドへ免疫特異的に結合する抗体のアミノ酸配列の少なくとも5個の連続したアミノ酸残基、少なくとも10個の連続したアミノ酸残基、少なくとも15個の連続したアミノ酸残基、少なくとも20個の連続したアミノ酸残基、少なくとも25個の連続したアミノ酸残基、少なくとも40個の連続したアミノ酸残基、少なくとも50個の連続したアミノ酸残基、少なくとも60個の連続したアミノ酸残基、少なくとも70個の連続したアミノ酸残基、少なくとも80個の連続したアミノ酸残基、少なくとも90個の連続したアミノ酸残基、少なくとも100個の連続したアミノ酸残基、少なくとも125個の連続したアミノ酸残基、少なくとも150個の連続したアミノ酸残基、少なくとも175個の連続したアミノ酸残基、少なくとも200個の連続したアミノ酸残基、又は少なくとも250個の連続したアミノ酸残基のアミノ酸配列を含むペプチド又はポリペプチドを含む。好ましくは、抗体断片は、エピトープ結合断片である。

Fab断片は、互いに共有結合したIg重（H）鎖及びIg軽（L）鎖の免疫学的に活性のある部分を含有するIg分子の一部からなり、かつ抗原と特異的に結合できる多量体タンパク質である。(Fab')2断片は、2つのH鎖及び2つのL鎖からなる断片を含む四量体である。Fv断片は、互いに共有結合したIgのH鎖可変（V）部（VH）及びIgのL鎖V部（VL）からなる免疫学的に活性のある部分からなり、かつ抗原と特異的に結合できる多量体タンパク質である。これらの断片は、未変化のAbのFc断片を欠失し、治療的に使用される場合、循環からより迅速に消失し、かつ未変化の抗体よりも非特異的な組織結合をほとんど受けないというさらなる利点を有する。これらの多様な断片は、プロテアーゼ切断又は化学的切断等の従来技術を使用して製造される（例えば、Rousseauxらの文献（Meth. Enzymol., 121: 663-69(1986)）参照）。例えば、Igのパパイン処理は、Fab断片を製造し、ペプシン処理は、F(ab')2断片を製造する。また、これらの断片は、当技術分野で周知の方法を使用して、遺伝子又はタンパク質の組換えによって製造され得る。また、例えば、Fab断片は、当技術分野で周知の方法を使用して、IgのH鎖及びL鎖の所望の部分を適切な宿主細胞において発現させることによって調製され得る。Fv断片は、当技術分野で周知の方法を使用して、IgのVH部及びVL部の所望の部分を適切な宿主細胞において発現させることによって典型的に調製される。

（5．4．2．一本鎖抗体）
本発明の抗体は、正規の多量体構造の代わりに、一本鎖抗体又はscFvとして製造され得る。「scFv」とも呼ばれる一本鎖抗原結合タンパク質又は一本鎖Abは、V_L配列のC末端をV_H配列のN末端へ連結するペプチドによってIgのV_Hアミノ酸配列へ繋留されたIgのV_Lアミノ酸配列から構成されるポリペプチドである（Skerra, A.らの文献（(1988) Science, 240: 1038-1041）、Pluckthun, A.らの文献（(1989) Methods Enzymol. 178: 497-515）、Winter, G.らの文献（(1991) Nature, 349: 293-299）、Birdらの文献（(1988) Science 242: 423）、Hustonらの文献（(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879）、Jost CRらの文献（J Biol Chem. 1994 269:26267-26273）、米国特許第4,704,692号、第4,853,871号、第4,94,6778号、第5,260,203号、第5,455,030号）。H鎖及びL鎖のV部をコードするDNA配列は、少なくとも約4個のアミノ酸（典型的には小さな中性アミノ酸）をコードするリンカーへ連結される。この融合によってコードされるタンパク質によって、元々の抗体の特異性及び親和性を保有する機能的可変部の構築が可能となる。特定の実施態様において、scFvは、二重特異性scFv及びヒト化scFvを含む。

一本鎖抗体を製造する1つの方法は、タンパク質化学技術によって2つ以上のペプチド又はポリペプチドを互いに連結することである。例えば、ペプチド又はポリペプチドは、Fmoc（9-フルオレニルメチルオキシカルボニル）又はtBoc（第三ブチルオキシカルボノイル（tert-butyloxycarbonoyl））化学作用の何れかを使用して、現に利用可能な実験装置を使用して化学的に合成できる（Applied Biosystems社, Foster City, CA）。当業者は、抗体鎖又はその抗原結合断片に相当するペプチド又はポリペプチドが、標準的な化学反応によって合成できることを容易に認識できる。例えば、ペプチド又はポリペプチドは、その合成樹脂から合成できるが切断できないのに対し、Abの他の断片は合成でき、その後樹脂から切断でき、それにより他の断片において機能的に遮断されている末端基を露出できる。ペプチド濃縮反応によって、これら2つの断片は、該断片のC末端及びN末端それぞれでのペプチド結合を介して共有結合でき、Ab又はその断片を形成する（Grunt, GAの文献（合成ペプチド：ユーザーガイド（Synthetic Peptides: A User Guide）, W. H. Freeman and Co., N.Y. (1992)）、Bodansky, Mらの文献（ペプチド合成の原理（Principles of Peptide Synthesis）, Springer-Verlag社, N.Y. (1993)））。

抗体は、具体的な所望の特性について選別できる。インビボで使用されるべき抗体の場合、Abスクリーニング手法は、例えば、uPA/uPAR又はuPAR-インテグリン複合体に対する、関連ポリペプチド又はペプチドエピトープを発現する細胞に対する結合を測定するインビトロ又はインビボでのバイオアッセイの何れかを含むことができる。

（5．4．3．キメラ、ヒト化及びヒト抗体）
ヒトにおける抗体のインビボでの使用及びインビトロでの検出アッセイを含むいくつかの使用について、ヒトの又はキメラの抗体を使用することは好ましくあり得る。完全にヒトの抗体は、ヒト対象の治療的処置に対して特に望ましい。

キメラ抗体は、抗体の異なる部分が、異なる免疫グロブリン分子に由来する分子である。キメラ抗体を製造する方法は、当技術分野で公知である。例えば、それらのすべての内容が全体として引用により本明細書中に組み込まれているMorrisonの文献（1985, Science 229:1202）、Oiらの文献（1986, BioTechniques 4:214）、Gilliesらの文献（1989, J. Immunol Methods 125:191-202）、並びに米国特許第6,311,415号、第5,807,715号、第4,816,567号、及び第4,816,397号を参照されたい。1つの種に由来する1つ以上のCDRと別の種に由来するフレームワーク領域とを含むキメラ抗体は、例えば、CDR移植（欧州特許第239,400号、国際公報WO 91/09967、並びに米国特許第5,225,539号、第5,530,101号、及び第5,585,089号）、ベニアリング又は表面再仕上げ（欧州特許第592,106号、欧州特許第519,596号、Padlanの文献（1991, Molecular Immunology 28(4/5):489-498）、Studnickaらの文献（1994, Protein Engineering 7:805）及びRoguskaらの文献（1994, PNAS 91:969））、並びに鎖のシャッフリング（米国特許第5,565,332号）を含む、当技術分野で公知の多様な技術を使用して製造できる。

同一の又は異なるV部結合特異性のキメラH鎖及びL鎖を有する抗体、断片又は誘導体は、例えばSearsらの文献（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72: 353-357 (1975)）によって教示される個々のポリペプチド鎖の適切な結合によって調製できる。

本アプローチを使用して、キメラH鎖（又はその誘導体）を発現する宿主は、キメラL鎖（又はその誘導体）を発現する宿主から別個に培養され、Ig鎖は、別個に回収された後結合する。或いは、宿主は同時培養でき、培地中で鎖を自発的に結合させた後、構築されたIg、断片又は誘導体を回収する。

本明細書で使用されるように、「キメラ抗体」という用語は、一価、二価又は多価のIgを含む。一価のキメラAbは、ジスルフィド架橋を通じてキメラL鎖と結合したキメラH鎖によって形成されるHL二量体である。二価のキメラAbは、少なくとも1つのジスルフィド架橋を通じて結合した2つのHL二量体によって形成される四量体H2L2である。また、多価のキメラAbは、例えば、（例えば、μ鎖と呼ばれるIgMのH鎖から）凝集するCH領域を採用することによって製造できる。

また、本発明は、キメラ抗体の「誘導体」を提供し、この用語は、Ig断片に機能的に類似する分子種を生じるために切断され又は修飾された遺伝子によってコードされたタンパク質を含む。修飾は、植物及び細菌の毒素等の細胞傷害性タンパク質をコードする遺伝子配列の付加を含むが、これに限定されるわけではない。断片及び誘導体は、本発明の宿主の何れかから製造できる。

ヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小の配列を含有するキメラ抗体である非ヒト（例えば、マウス）抗体を指す。大部分について、ヒト化抗体は、所望の特異性、親和性、及び能力を有するマウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類等の非ヒト種（ドナー抗体）由来の高頻度可変領域残基によって、レシピエントの高頻度可変領域残基が置換されるヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。ヒト化抗体は、CDR領域のすべて又は実質的にすべてが、非ヒト免疫グロブリン（すなわち、ドナー抗体）のCDR領域に相当し、フレームワーク領域のすべて又は実質的にすべてが、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のフレームワーク領域である少なくとも1つ、及び典型的には2つの可変ドメインを含む。好ましくは、また、ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常部（Fc）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのFcを含む。通常、抗体は、軽鎖と重鎖の少なくとも可変部との両者を含有するであろう。また、抗体は、重鎖のCH1、ヒンジ、CH2、CH3、及びCH4部を含み得る。ヒト化抗体は、IgM、IgG、IgD、IgA及びIgEを含む免疫グロブリンの何れかのクラス、並びにIgG₁、IgG₂、IgG₃及びIgG₄を含む何れかのアイソタイプから選択できる。通常、定常部は、ヒト化抗体が細胞傷害性活性を呈することが望ましい補体固定定常部であり、クラスは典型的にはIgG₁である。このような細胞傷害性活性が望ましくない場合、定常部は、IgG₂クラスであり得る。ヒト化抗体は、2つ以上のクラス又はアイソタイプに由来する配列を含み得、所望のエフェクター機能を最適化するために具体的な定常部を選択することは、当技術分野における通常の技術内である。ヒト化抗体のフレームワーク及びCDR部は、親配列に精密に一致する必要がなく、例えば、ドナーCDR又はコンセンサスフレームワークは、少なくとも1つの残基の置換、挿入又は欠失によって変異誘発され得、それによりその部位のCDR又はフレームワーク残基は、コンセンサス又は移入抗体の何れにも一致しない。しかしながら、このような変異は、広範囲に及ばないであろう。通常、ヒト化抗体残基の少なくとも75％は、親フレームワーク部（FR）及びCDR配列の少なくとも75％に一致するであろうし、しばしば90％であり、及び最も好ましくは95％を超える。ヒト化抗体は、CDR移植（欧州特許第239,400号、国際公報WO 91/09967、並びに米国特許第5,225,539号、第5,530,101号、及び第5,585,089号）、ベニアリング又は表面再仕上げ（欧州特許第592,106号及び欧州特許第519,596号、Padlanの文献（1991, Molecular Immunology 28(4/5):489-498）、Studnickaらの文献（1994, Protein Engineering 7(6):805-814）、及びRoguskaらの文献（1994, PNAS 9 1:969-973））、鎖のシャッフリング（米国特許第5,565,332号）、並びに例えば米国特許第6,407,213号、第5,766,886号、第5,585,089号、国際公報WO 9317105、Tanらの文献（2002, J. Immunol. 169:1119-25）、Caldasらの文献（2000, Protein Eng. 13:353-60）、Moreaらの文献（2000, Methods 20:267-79）、Bacaらの文献（1997, J. Biol. Chem. 272:10678-84）、Roguskaらの文献（1996, Protein Eng. 9:895-904）、Coutoらの文献（1995, Cancer Res. 55 (23 Supp):5973s-5977s）、Coutoらの文献（1995, Cancer Res. 55:1717-22）、Sandhuの文献（1994, Gene 150:409-10）、Pedersenらの文献（1994, J. Mol. Biol. 235:959-73）、Jonesらの文献（1986, Nature 321:522-525）、Riechmannらの文献（1988, Nature 332:323）、及びPrestaの文献（1992, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596）に開示される技術を含むがこれらに限定されない、当技術分野で公知の多様な技術を使用して製造できる。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリを使用する上述のファージディスプレイ法を含む、当技術分野で公知の多様な方法によって作製できる。また、それらのすべての内容が全体として引用により本明細書中に各々組み込まれている米国特許第4,444,887号及び第4,716,111号、並びに国際公報WO 98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735、及びWO 91/10741を参照されたい。しばしば、フレームワーク部中のフレームワーク残基は、抗原結合を変化させ、好ましくは改良するために、CDRドナー抗体由来の一致する残基で置換されるであろう。これらのフレームワーク置換は、当技術分野で周知の方法によって、例えば、抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定するためのCDRとフレームワーク残基との相互作用のモデリング、及び特定の位置にある異常なフレームワーク残基を同定するための配列比較によって同定される（例えば、それらのすべての内容が全体として引用により本明細書中に組み込まれているQueenらの文献、米国特許第5,585,089号、及びRiechmannらの文献（1988, Nature 332:323）参照）。

一実施態様において、本発明のヒト化抗体は、uPARを免疫特異的に結合し、ヒトフレームワーク部内でuPAR抗体の1、2、又は3個のV_L CDRを含む。別の実施態様において、本発明のヒト化抗体は、uPARを免疫特異的に結合し、ヒトフレームワーク部内でuPAR抗体の1、2、又は3個のVH CDRを含む。好ましい実施態様において、本発明のヒト化抗体は、uPARを免疫特異的に結合し、1、2、又は3個のV_L CDRを含み、さらに、ヒトフレームワーク部内で1、2、又は3個のV_H CDRを含む。より好ましい実施態様において、本発明のヒト化抗体は、uPARを免疫特異的に結合し、ヒトフレームワーク部内に3個のV_L CDR及び3個のV_H CDRを含む。しばしば、フレームワーク部中のフレームワーク残基は、抗原結合を変化させ、好ましくは改良するために、CDRドナー抗体由来の一致する残基で置換されるであろう。これらのフレームワーク置換は、当技術分野で周知の方法によって、例えば、抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定するためのCDRとフレームワーク残基との相互作用のモデリング、及び特定の位置にある異常なフレームワーク残基を同定するための配列比較によって同定される（例えば、それらのすべての内容が全体として引用により本明細書中に組み込まれている米国特許第5,585,089号、及びRiechmannらの文献（1988, Nature 332:323）参照）。

従って、本発明の一実施態様において、本発明のキメラ抗体は、個々のキメラH及びLのIg鎖を含む。キメラH鎖は、例えばヒトCH部の少なくとも一部へ連結されるuPA/uPAR又はuPAR-インテグリン複合体に特異的な非ヒトAbのH鎖に由来する抗原結合領域を含む。キメラL鎖は、ヒトC_L部の少なくとも一部へ連結される標的抗原に特異的な非ヒト抗体のL鎖に由来する抗原結合領域を含む。本明細書で使用されるように、「抗原結合領域」という用語は、抗原と相互作用し、抗原に対する特異性及び親和性を抗体に付与するアミノ酸残基を含有する抗体分子のその部分を指す。抗体領域は、抗原結合（又は「接触」）残基の適切なコンホメーションを維持するのに必要な「フレームワーク」アミノ酸残基を含む。

ヒト抗体は、機能的内在性免疫グロブリンを発現できないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現できるトランスジェニックマウスを使用して製造される抗体である。例えば、ヒト重鎖及び軽鎖免疫グロブリン遺伝子複合体は、無作為に又はマウス胚性幹細胞への相同的組換えによって導入され得る。或いは、ヒト可変部、定常部及び多様性領域は、ヒト重鎖及び軽鎖遺伝子に加えて、マウス胚性幹細胞へ導入され得る。マウス重鎖及び軽鎖免疫グロブリン遺伝子は、相同的組換えによるヒト免疫グロブリン遺伝子座の導入とは別個に又は同時に非機能的にされ得る。特に、JH部のホモ接合性欠失は、内在的な抗体産生を防止する。修飾された胚性幹細胞は、キメラマウスを作出するために増量され胚盤胞へ微量注射される。次に、キメラマウスは、ヒト抗体を発現するホモ接合性子孫を作出するために交配される。トランスジェニックマウスは、選択された抗原、例えば本発明のポリペプチドのすべて又は一部を使用して、正規の様式で免疫化される。抗原に対して作られたモノクローナル抗体は、従来のハイブリドーマ技術を使用して、免疫化されたトランスジェニックマウスから得られることができる。トランスジェニックマウスによって含まれるヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、B細胞分化中に再配列し、その後、クラスの切り替え及び体細胞変異を受ける。従って、このような技術を使用して、治療的に有用なIgG、IgA、IgM及びIgE抗体を製造することは可能である。ヒト抗体を製造するための本技術に関する総説については、Lonberg及びHuszarの文献（1995, Int. Rev. Immunol. 13:65-93）を参照されたい。ヒト抗体及びヒトモノクローナル抗体を製造する本技術並びにこのような抗体を製造するプロトコールに関する詳細な論議については、例えば、それらのすべての内容が全体として引用により本明細書中に組み込まれている国際公報WO 98/24893、WO 96/34096、及びWO 96/33735、並びに米国特許第5,413,923号、第5,625,126号、第5,633,425号、第5,569,825号、第5,661,016号、第5,545,806号、第5,814,318号、及び第5,939,598号を参照されたい。さらに、Abgenix社（Fremont, CA）及びMedarex（Princeton, NJ）等の企業は、上述のものと同様の技術を使用して、選択された抗原に対して作られたヒト抗体を提供することを請うことができる。

本発明のキメラ抗体（又はヒトモノクローナル抗体）の抗原結合領域は好ましくは、例えばuPA/uPAR又はuPAR-インテグリン複合体に特異的な非ヒト抗体に由来する。このような非ヒト抗体をコードするDNAのための好ましい原料は、抗体、好ましくはハイブリドーマ、例えばATN-658ハイブリドーマを産生する細胞系を含む。

或いは、本発明のAbのV部が由来する非ヒト抗体産生細胞は、suPARのD2D3を使用して免疫化された動物の血液、脾臓、リンパ節又は他の組織から得られたBリンパ球であり得る。また、本発明のキメラ抗体の抗原結合領域をコードするヌクレオチド配列を与えるAb産生細胞は、霊長類等の非ヒト、又はヒト細胞の形質転換によって製造され得る。例えば、uPA/uPAR又はuPAR-インテグリン複合体に特異的な抗体を産生するBリンパ球は、エプスタイン・バーウイルス等のウイルスに感染し得、該ウイルスで形質転換され得、不死のAb産生細胞を生じる（Kozborらの文献（Immunol. Today 4:72-79 (1983)））。或いは、Bリンパ球は、当技術分野で周知のように、形質転換する遺伝子又は形質転換する遺伝子産物を提供することによって形質転換され得る。好ましくは、抗原結合領域は、マウス起源であろう。他の実施態様において、抗原結合領域は、他の動物種、特にラット又はハムスター等の齧歯類に由来し得る。

本発明のキメラモノクローナル抗体は、抗体を分泌するハイブリドーマ又はトランスフェクトーマ細胞をマウスの腹腔内に注射し、適切な時間の後、モノクローナル抗体の高い力価を含有する腹水を回収し、モノクローナル抗体を単離することによって、多量に製造され得る。非マウスハイブリドーマ（例えば、ラット又はヒト）を使用したmAbのインビボでのこのような製造のために、ハイブリドーマ細胞は、好ましくは照射された又は無胸腺ヌードマウスにおいて増殖される。

或いは、抗体は、ハイブリドーマ（又はトランスフェクトーマ）細胞をインビトロで培養し、分泌されたmAbを細胞培地から単離することによって製造され得る。

本発明のキメラ抗体の定常C部をコードするヒト遺伝子は、ヒト胎児肝臓ライブラリに、又はヒトIgGを発現し及び産生する細胞を含む何れかのヒト細胞に由来し得る。ヒトCH部は、γ、μ、α、δ又はεを含むヒトH鎖の公知のクラス又はアイソタイプ、並びにG1、G2、G3及びG4等のそのサブタイプの何れかに由来し得る。

H鎖アイソタイプが、Abの多様なエフェクター機能の原因であるので、CH部の選択は、補体固定等の所望のエフェクター機能、又はAb依存的な細胞傷害性（ADCC）の活性によって誘導されるであろう。好ましくは、CH部は、γ1（IgG1）、γ3（IgG3）、γ4（IgG4）、又はμ（IgM）に由来する。

ヒトCL部は、ヒトL鎖アイソタイプであるκ又はλの何れかに由来し得る。

ヒトIgのC部をコードする遺伝子は、標準的なクローニング技術によってヒト細胞から得られる（Sambrook, J.らの文献（分子クローニング：実験マニュアル2版（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition）, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY(1989)））。ヒトC部遺伝子は、L鎖の2つのクラス、H鎖の5つのクラス及びそれらのサブクラスを表す遺伝子を含有する公知のクローンから容易に入手可能である。F(ab')2及びFab等のキメラAb断片は、適宜切断されたキメラH鎖遺伝子を設計することによって調製できる。例えば、F(ab')2断片のH鎖部分をコードするキメラ遺伝子は、切断された分子を生じるために、CH、H鎖のドメイン及びヒンジ部、その後の翻訳終止コドンをコードするDNA配列を含むであろう。

一般的に、本発明のキメラ抗体は、好ましくは非ヒトの本発明の特定の抗体のH及びL鎖抗原結合領域をコードするDNAセグメントをクローニングし、これらのDNAセグメントを、ヒトCH及びCL部をコードするDNAセグメントへそれぞれ接合して、キメラIgコード遺伝子を製造することによって製造される。

従って、好ましい実施態様において、ヒトC部の少なくとも一部をコードする第二DNAセグメントへ連結された接合（J）セグメントを有する機能的に再配列されたV部など、非ヒト起源の少なくとも抗原結合領域をコードする第一DNAセグメントを含む融合された遺伝子が作製される。

Ab結合部をコードするDNAは、ゲノムDNA又はcDNAであり得る。マウスV部抗原結合セグメントをコードするDNAの原料としての染色体遺伝子断片の使用に対する便利な代替手段は、Liuらの文献（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3439 (1987); J. Immuno. 139:3521 (1987)）によって報告されるように、キメラIgG遺伝子の構築のためのcDNAの使用であり、この引用文献は、引用により本明細書に組み込まれる。cDNAの使用は、宿主細胞に適した遺伝子発現要素が、所望のタンパク質の合成を達成するために、遺伝子と組み合わされることを必要とする。cDNA配列の使用は、cDNA配列が、適切なRNAスプライシング系を欠失する細菌又は他の宿主において発現できる点で、（イントロンを含有する）ゲノム配列よりも有利である。

それゆえ、AbのV部をコードするcDNAを利用する実施態様において、キメラAbを製造する方法は、以下に概略されるいくつかの段階を包含する。

1．mAbを産生する細胞系からのメッセンジャーRNA（mRNA）の単離、クローニング及びcDNAの作製;

2．L鎖及びH鎖の遺伝子の適切なV部遺伝子セグメントが、（i）適切なプローブを使用して同定でき、（ii）配列決定でき、及び（iii）C遺伝子セグメントと適合できる、精製されたmRNAからの全長のcDNAライブラリの調製;

3．cDNAの調製及びクローニングによるC部遺伝子セグメントの調製;

4．上述のように、クローニングされたヒトC部遺伝子への、クローニングされた特定のV部遺伝子セグメントの連結による、完全なH又はL鎖コード配列の構築;

5．原核細胞及び真核細胞を含む選択された宿主におけるキメラL鎖及びH鎖の発現及び産生。

IgのH鎖及びL鎖遺伝子すべて並びにそれらをコードするmRNAに関する1つの共通した特徴はJ部である。H鎖及びL鎖のJ部は、異なる配列を有するが、配列相同性の高い程度が、各群間、特にC部近くに存在する。この相同性は、本方法において利用されており、H鎖及びL鎖のJ部のコンセンサス配列は、有用な制限部位をJ部へ導入した後、V部セグメントをヒトC部セグメントへ連結するためのプライマーとしての使用するためのオリゴヌクレオチドを設計するために使用され得る。

ヒト細胞から調製されるC部cDNAベクターは、ヒト配列における類似の位置に制限部位を配置するために、部位特異的変異誘発によって修飾できる。例えば、あるものは、完全なヒトκ鎖C（C_κ）部及び完全なヒトγ-1のC部（C_γ-1）をクローニングできる。この場合、C部ベクターのための原料としてのゲノムC部クローンに基づいた代替法は、介在配列を除去するのに必要とされる酵素が欠失している細菌の系において、これらの遺伝子を発現させないであろう。クローニングされたV部セグメントは、切除され、L鎖又はH鎖のC部ベクターへ連結される。

或いは、ヒトC_γ-1部は、終止コドンを導入し、それによりFab分子のH鎖部分をコードする遺伝子配列を生じることによって修飾できる。次に、連結されたV及びC部を有するコード配列は、原核生物又は真核生物である適切な宿主における発現のために、適切な発現媒体へ転移される。

連結が、三つ組の読み枠を変化せずに又は妨害せずに連続的に翻訳可能な配列を生じる場合、2つのコードDNA配列は、「作用可能に連結されて」いるといわれる。連結が、コード配列の発現を生じるよう遺伝子発現要素の適切な機能を生じる場合、DNAコード配列は、その遺伝子発現要素へ作用可能に連結される。

発現媒体は、プラスミド又は他のベクターを含む。これらのうち好ましいのは、適切な制限部位が操作されており、それにより適切な付着末端を有する何れかのVH鎖又はVL鎖配列が容易に挿入できる、機能的に完全なヒトCH鎖又はCL鎖配列を保有する媒体である。従って、ヒトCH鎖又はCL鎖配列を含有する媒体は、何れかの適切な宿主における何れかの所望の完全なH鎖又はL鎖の発現のための中間体として機能する。

キメラマウス-ヒト抗体は、コンストラクトにおいて使用されるマウスH鎖及びL鎖のV部に由来する染色体遺伝子プロモーターによって駆動される遺伝子から、典型的に合成されるであろう。スプライシングは通常、マウスJ部におけるスプライスドナー部位と、ヒトC部の前のスプライスアクセプター部位との間で、また、ヒトCH部内に生じるスプライス部で生じ、ポリアデニル化及び転写終止は、ヒトコード領域の下流の未変性の染色体部位で生じる。

cDNA遺伝子の発現に有用な遺伝子発現要素は、（a）SV40初期プロモーター（Okayama, H.らの文献（Mol. Cell. Biol. 3:280 (1983)））、ラウス肉腫ウイルスLTR（Gorman, C.らの文献（Proc. Natl. Acad. Sci, USA 79:6777 (1982)））、及びモロニーマウス白血病ウイルスLTR（Grosschedl, Rらの文献（Cell 41:885 (1985)））等のウイルス転写プロモーター及びそれらのエンハンサー要素、（b）SV40後期領域に由来するもの等のスプライス領域及びポリアデニル化部位（Okayamaらの文献（上述））、及び（c）SV40等におけるポリアデニル化部位（Okayamaらの文献（上述））を含む。

Ig cDNA遺伝子は、Liuらの文献（上述）及びWeidle, UHらの文献（Gene 5 1:21-29 (1987)）によって記載されるように、発現要素としてSV40初期プロモーター及びそのエンハンサー、マウスIg H鎖プロモーターエンハンサー、SV40後期領域mRNAスプライシング、ウサギB-グロビン介在配列、Ig及びウサギ3-グロビンポリアデニル化部位、並びにSV40ポリアデニル化要素を使用して発現され得る。部分的cDNA、部分的ゲノムDNA（Whittle, Nらの文献（Protein Eng. 1:499-505 (1987)））から構成されるIg遺伝子について、転写プロモーターはヒトサイトメガロウイルスであり、プロモーターエンハンサーはサイトメガロウイルス及びマウス/ヒトIgであり、mRNAスプライシング及びポリアデニル化領域は、未変性の染色体Ig配列に由来する。一実施態様において、齧歯類細胞におけるcDNA遺伝子の発現については、転写プロモーターはウイルスLTR配列であり、転写プロモーターエンハンサーはマウスIg H鎖エンハンサー及びウイルスLTRエンハンサーの何れか又は両者であり、スプライス領域は、31bpを超えるイントロンを含有し、ポリアデニル化及び転写終結領域は、合成されているIg鎖と一致する未変性の染色体配列に由来する。他の実施態様において、他のタンパク質をコードするcDNA配列は、上述の列挙された発現要素と組み合わされ、哺乳動物細胞におけるタンパク質の発現を達成する。

融合された各遺伝子は、発現ベクター中に構築され、又は発現ベクター中に挿入される。次に、キメラIg鎖遺伝子産物を発現できるレシピエント細胞に、キメラH鎖又はキメラL鎖をコードする遺伝子を単一で形質移入し、又はキメラH鎖及びキメラL鎖遺伝子を同時形質移入する。組み込まれた遺伝子の発現が可能な条件下で、形質移入されたレシピエント細胞を培養し、発現したIg鎖又は未処置の抗体若しくは断片を培養物から回収する。一実施態様において、キメラH鎖及びL鎖をコードする融合された遺伝子、又はその一部は、後でレシピエント細胞を同時形質移入するのに使用される個別の発現ベクター中に構築される。

各ベクターは、2つの選択可能な遺伝子、すなわち、細菌の系における選別のために設計された第一の選択可能な遺伝子及び真核生物の系における選別のために設計された第二の選択可能な遺伝子を含有し得、各ベクターは、遺伝子に関する異なる対を有する。この戦略は結果的に、細菌の系における融合された遺伝子の産生をまず支配し、該遺伝子の増幅を可能にするベクターを生じる。最近の宿主においてそのように産生され及び増幅された遺伝子はその後、真核細胞を同時形質移入するのに使用され、形質移入された所望の遺伝子を保有する同時形質移入された細胞の選別を可能にする。細菌の例において使用するための選択可能な遺伝子の例は、アンピシリンに対する抵抗性を付与する遺伝子、及びクロラムフェニコールに対する抵抗性を付与する遺伝子である。真核生物形質移入体において使用するのに好ましい選択可能な遺伝子は、キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（gptと命名）及びTn5由来のホスホトランスフェラーゼ遺伝子（neoと命名）を含む。

Gptを発現する細胞の選別は、この遺伝子によってコードされる酵素が、プリンヌクレオチド合成のための基質としてキサンチンを利用するのに対し、類似の内在性酵素ができないと言う事実に基づいている。

（1）イノシン一リン酸のキサンチン一リン酸（XMP）への変換を遮断するミコフェノール酸及び（2）キサンチンを含有する培地において、gpt遺伝子を発現する細胞のみが生存できる。neo遺伝子の産物は、抗生物質G418及びネオマイシンクラスの他の抗生物質によるタンパク質合成の阻害を遮断する。

2つの選別手法は、2つの異なるDNAベクターにおいて真核細胞へ導入されたIg鎖遺伝子の発現について選別するよう同時に又は連続して使用できる。真核細胞についての選択可能な異なるマーカーを含むことは必要ではなく、選択可能な同一のマーカーを各々含有するH鎖及びL鎖ベクターは、同時形質移入できる。適切に抵抗性のある細胞の選別の後、クローンの大部分は、H鎖及びL鎖の両ベクターの組み込まれたコピーを含有するであろう。

或いは、キメラH鎖及びL鎖をコードする融合された遺伝子は、同一の発現ベクターにおいて構築できる。

発現ベクターの形質移入及びキメラ抗体の産生については、好ましいレシピエント細胞系は骨髄腫細胞である。骨髄腫細胞は、形質移入されたIg遺伝子によってコードされたIgを合成でき、構築でき及び分泌でき、Igのグリコシル化についての機構を有する。特に好ましいレシピエント細胞は、Igを産生しない骨髄腫細胞SP2/0（ATCC番号CRL 8287）である。SP2/0細胞は、形質移入された遺伝子によってコードされたIgのみを産生する。骨髄腫細胞は、培地中で又はマウスの腹腔において増殖できるのに対し、分泌されたIgは、腹水から得られることができる。他の適切なレシピエント細胞は、ヒト又は非ヒト起源のBリンパ球等のリンパ様細胞、ヒト又は非ヒト起源のハイブリドーマ細胞、又は種間のヘテロハイブリドーマ細胞を含む。

本発明のキメラ抗体コンストラクトを保有する発現ベクターは、形質転換、形質移入、複合、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈殿、及びジエチルアミノエチル（DEAE）デキストラン等のポリカチオンを使用する応用等、並びに電気穿孔、直接的な微量注射、及び微粒子銃等の機械的な手段を含む多様な適切な手段の何れかによって、適切な宿主へ導入され得る。

また、本発明のキメラIgコード配列又は遺伝子は、非リンパ様哺乳動物細胞において、又は酵母等の他の真核細胞、又は原核細胞、特に細菌において発現できる。酵母は、Ig H鎖及びL鎖の産生について、細菌を上回る実質的な利点を提供する。酵母は、グリコシル化を含む翻訳後ペプチド修飾を実施する。強力なプロモーター配列と酵母において所望のタンパク質の産生に使用できる高コピー数プラスミドとを利用する多くの組換えDNA戦略がいまや存在する。酵母は、クローニングされた哺乳動物遺伝子産物のリーダー配列を認識し、リーダー配列を保有するペプチドを分泌する（すなわち、プレペプチド）。酵母遺伝子発現系は、キメラH鎖及びL鎖タンパク質並びに構築されたキメラ抗体の産生、分泌及び安定性のレベルについて所定のとおり評価できる。酵母がグルコースの豊富な培地において増殖される場合、多量に産生される解糖系酵素をコードする活発に発現した遺伝子由来のプロモーター及び終結要素を組み込んでいる一連の酵母遺伝子発現系の何れかが利用できる。また、公知の解糖系遺伝子は、非常に効率的な転写調節信号を提供できる。例えば、ホスホグリセリン酸キナーゼ（PGK）のプロモーター及び終結因子のシグナルが利用できる。多くのアプローチは、酵母におけるクローニングされたIg cDNAの発現について最適な発現プラスミドを評価するために採用され得る（Glover, D. M.の文献（DNAクローニング（DNA Cloning）, IRL Press, 1985）参照）。

また、菌株類は、本発明によって記載されるAb分子又はAb断片の産生のための宿主として利用され得、イー・コリW3110（ATCC番号27325）等のイー・コリK12株、及びサルモネラ・チフィリウム又はセラチア・マルセセンス等の他の腸内細菌、及び多様なシュードモナス種が使用され得る。

宿主細胞と適合性のある種に由来するレプリコン及び調節配列を含有するプラスミドベクターは、これらの細菌宿主と関連して使用される。ベクターは、複製部位、及び形質転換された細胞において表現型選別を提供できる特異的遺伝子を保有する。細菌におけるクローニングされたIg cDNAによってコードされるキメラ抗体又は抗体鎖の産生のための発現プラスミドを評価するために、多くのアプローチが採用され得る（Gloverの文献（上述）参照）。

好ましい宿主は、インビトロ又はインビボで増殖した哺乳動物細胞である。哺乳動物細胞は、リーダーペプチドの除去、H鎖及びL鎖の折りたたみ及び構築、Ab分子のグリコシル化、並びに機能的Abタンパク質の分泌を含むIgタンパク質分子へ翻訳後修飾を提供する。

上述のリンパ様起源の細胞に加えて、Abタンパク質の産生のための宿主として有用であり得る哺乳動物細胞は、Vero（ATCC CRL 81）又はCHO-K（ATCC CRL 61）等の線維芽細胞起源の細胞を含む。多くのベクターの系は、哺乳動物細胞におけるクローニングされたH鎖及びL鎖遺伝子の発現に利用可能である（Gloverの文献（上述）参照）。異なるアプローチは、完全なH2L2 Abを得るために続いて実施できる。

インビボでの使用のために、特にヒトへの注射のために、上述のようにマウス-ヒト（又は齧歯類-ヒト）キメラ抗体を作製することによって、又は当技術分野で公知の方法を使用して抗体をヒト化することによって、モノクローナル抗体の免疫原性を低下させることは望ましい。ヒト化抗体は、トランスジェニックヒトIg定常部遺伝子を有する動物の産物であり得る（例えば、W090/10077及びW090/04036参照）。或いは、関心対象の抗体は、CH1、CH2、CH3、ヒンジドメイン、及び/又は一致するヒト配列を有する読み枠ドメインを置換するために遺伝子操作され得る（WO92/02190参照）。

（5．5．抗体複合体）
本発明は、融合タンパク質を生じるために異種性ポリペプチド（又はその一部へ、好ましくは少なくとも10、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90又は少なくとも100個のアミノ酸）へ組換え融合され又は化学的に複合された（共有結合及び非共有結合の両者を含む）抗体又はその断片の使用を包含する。融合は、直接的である必要は必ずしもないが、リンカー配列を通じて生じ得る。例えば、抗体は、該抗体を具体的な細胞表面受容体に特異的な抗体へ融合し又は複合することによって、インビトロ又はインビボの何れかで、特定の細胞種へ異種性ポリペプチドを標的とするために使用され得る。また、異種性ポリペプチドへ融合され又は複合された抗体は、インビトロでのイムノアッセイ及び当技術分野で公知の方法を使用する精製方法において使用され得る。例えば、それらのすべての内容が全体として引用により組み込まれている国際公報WO 93/21232、欧州特許第439,095号、Naramuraらの文献（1994, Immunol. Lett. 39:91-99）、米国特許第5,474,981号、Gilliesらの文献（1992, PNAS 89:1428-1432）、及びFellらの文献（1991, J. Immunol. 146:2446-2452）を参照されたい。

さらに、本発明は、抗体断片へ融合され又は複合された異種性ポリペプチドを含む組成物を含む。例えば、異種性ポリペプチドは、Fab断片、Fd断片、Fv断片、F(ab)₂断片、又はそれらの一部へ融合され又は複合され得る。抗体の一部へポリペプチドを融合し又は複合する方法は、当技術分野で公知である。例えば、米国特許第5,336,603号、第5,622,929号、第5,359,046号、第5,349,053号、第5,447,851号、及び第5,112,946号、欧州特許第307,434号、欧州特許第367,166号、国際公報WO 96/04388及びWO 91/06570、Ashkenaziらの文献（1991, PNAS 88: 10535-10539）、Zhengらの文献（1995, J. Immunol. 154:5590-5600）、並びにVilらの文献（1992, PNAS 89:1 1337-11341）を参照されたい（該引用文献は、それらのすべての内容が全体として引用により組み込まれている）。

さらなる融合タンパク質は、遺伝子シャッフリング、モチーフシャッフリング、エキソンシャッフリング、及び/又はコドンシャッフリング（集約的に「DNAシャッフリング」と呼ばれる）の技術を通じて生じ得る。DNAシャッフリングは、本発明の抗体又はその断片の活性を変化させるために採用され得る（例えば、より高い親和性及びより低い解離速度を有する抗体又はその断片）。一般的に、米国特許第5,605,793号、第5,811,238号、第5,830,721号、第5,834,252号、及び第5,837,458号、並びにPattenらの文献（1997, Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33）、Harayamaの文献（1998, Trends Biotechnol. 16:76）、Hanssonらの文献（1999, J. Mol Biol. 287:265）、並びにLorenzo及びBlascoの文献（1998, BioTechniques 24:308）を参照されたい（これらの特許及び刊行物の各々は、それらのすべての内容が全体として引用により本明細書に組み込まれている）。抗体若しくはその断片又はコードされた抗体又はその断片は、誤りがちなPCRによる無作為な変異誘発、無作為なヌクレオチド挿入又は組換え前の他の方法に供されることによって変化し得る。抗体又は抗体断片をコードするポリヌクレオチドの1つ以上の部分がuPARへ免疫特異的に結合する抗体又は抗体断片をコードする該部分は、1つ以上の異種性分子の1つ以上の成分、モチーフ、セクション、部分、ドメイン、断片等を使用して組換えられ得る。

さらに、抗体又はその断片は、精製を容易にするためのペプチド等のマーカー配列へ融合できる。好ましい実施態様において、マーカーアミノ酸配列は、pQEベクター（QIAGEN社, 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311）において提供されるタグ等のヘキサヒスチジンペプチドであり、とりわけ、その多くは市販されている。例えば、Gentzらの文献（1989, PNAS 86:821）に記載されているように、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の便利な精製を提供する。精製に有用な他のペプチドタグは、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質（Wilsonらの文献（1984, Cell 37:767））由来のエピトープと一致する赤血球凝集素「HA」タグ、及び「フラッグ」タグを含むが、これらに限定されるわけではない。

（5．5．1．診断上標識された抗体）
他の実施態様において、本発明の抗体又はその断片若しくはバリアントは、診断薬又は検出可能な薬剤へ複合される。このような抗体は、具体的な治療の有効性を決定するなど、臨床的検査手法の一部として癌の発達又は進行をモニターし又は予知するのに有用であり得る。

「診断上標識された」という用語は、本抗体が、診断上検出可能な標識を該抗体へ付着していることを意味する。以下に記載されるように、当業者に公知の多くの異なる標識及び標識方法が存在する。本発明において使用できる標識の一般的なクラスは、放射性同位体、常磁性同位体、及び陽電子放出断層撮影（PET）、蛍光化合物又は着色化合物等によって画像化できる化合物を含む。検出可能な適切な標識は、放射性標識、蛍光標識、フルオロゲン標識、色素原標識、又は他の化学標識を含む。γカウンタ、シンチレーションカウンタ又はオートラジオグラフィーによって単純に検出される有用な放射性標識（放射性核種）は、³H、¹²⁵I、¹³¹I、¹³⁵S及び¹⁴Cを含む。また、¹³¹Iは、有用な治療用同位体である（以下参照）。

引用により本明細書中に組み込まれている多くの米国特許は、有用なキレート剤の記載を含むより大きな分子への金属の複合体形成のための方法及び組成物を開示する。金属は好ましくは、放射性核種を含む検出可能な金属原子であり、タンパク質及び他の分子へ複合体形成する。これらの文書は、米国特許第5,627,286号、第5,618,513号、第5,567,408号、第5,443,816号、及び第5,561,220号を含む。

共通の蛍光標識は、フルオレセイン、ローダミン、ダンシル、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、o-フタルアルデヒド及びフルオレサミンを含む。ダンシル基等のフルオロフォアは、フルオレス（fluoresce）に対する具体的な波長の光によって励起されなければならない。例えば、Hauglandの文献（蛍光プローブ及び研究用化学薬品に関するハンドブック6版（Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Sixth Ed.）, Molecular Probes, Eugene, OR., 1996）を参照されたい。Oregon Green（商標）及びその誘導体、Rhodamine Green（商標）及びRhodol Green（商標）等のフルオレセイン、フルオレセイン誘導体及びフルオレセイン様分子は、イソチオシアネート、スクシンイミジルエスエル又はジクロロトリアジニル反応基を使用して、アミン基へ共役される。同様に、また、フルオロフォアは、マレイミド、ヨードアセトアミド、及びアジリジン反応基を使用して、チオールへ共役され得る。基本的には窒素において置換体を有するRhodamine Green（商標）誘導体である長い波長のローダミンは、最も光安定性の公知の蛍光標識試薬である。該ローダミンのスペクトルは、pH4〜10における変化によって影響されず、多くの生物学的応用にとってフルオレセインを上回る重要な利点である。この群は、テトラメチルローダミン、Xローダミン及びTexas Red（商標）誘導体を含む。本発明に従ったペプチドを誘導体化するための他の好ましいフルオロフォアは、紫外線光によって励起されるフルオロフォアである。例は、カスケードブルー、クマリン誘導体、ナフタレン（ナフタレンのうち、ダンシルクロリドは1つのメンバーである）、ピレン及びピリジルオキサゾール誘導体を含む。また、標識として含まれるのは、近年記載された関連する2つの無機材料、すなわち、例えば硫酸カドミウムを含む半導体ナノ結晶（Bruchez, Mらの文献（Science 281 :2013-2016 (1998)））、及び量子ドット、例えば硫化亜鉛によりキャッピングされたCdセレニド（Chan, WCらの文献（Science 281 :2016-2018 (1998)））である。

さらに別のアプローチにおいて、抗体のアミノ基は、蛍光産物、例えばフルオレサミン、o-フタルジアルデヒド等のジアルデヒド、ナフタレン-2,3-ジカルボン酸及びアントラセン-2,3-ジカルボン酸を生じる試薬と反応することができる。塩化物及びフッ化物の両者の7-ニトロベンズ-2-オキサ-1,3-ジアゾール（NBD）誘導体は、アミンを修飾して蛍光産物を生じるのに有用である。

また、本発明の抗体は、¹⁵²Eu等の蛍光発光金属、又はランタニドシリーズの他の蛍光発光金属を使用した検出のために標識できる。これらの金属は、ジエチレントリアミン五酢酸（DTPA）又はエチレンジアミン四酢酸（EDTA）等の金属キレート基を使用して、ペプチドへ付着できる。例えば、DTPAは、本発明のNH₂含有ペプチドを容易に修飾できる無水物として利用可能である。

インビボでの診断又は治療のために、放射性核種は、DTPA及びDOTA等のキレート剤を直接的に又は間接的にの何れかで使用して、抗体へ結合され得る。このような放射性核種の例は、⁹⁹Tc、¹²³I、¹²⁵I、¹³¹I、¹¹¹In、⁹⁷Ru、⁶⁷Cu、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、⁷²As、⁸⁹Zr、⁹⁰Y及び²⁰¹Tiである。一般的に、診断上の使用における検出性に必要とされる標識された抗体の量は、患者の年齢、状態、性別及び疾病の程度、もしあれば禁忌、及び他の変数に応じて変動するであろうし、個々の医師又は診断医によって調整されるべきである。薬用量は、0.001mg/kg〜100mg/kgで変動し得る。

また、抗体は、リン光化合物又は化学発光化合物へ共役することによって検出可能にされ得る。次に、化学発光剤によりタグ付けされたペプチドの存在は、化学反応の時間経過の間に生じる発光の存在を検出することによって決定される。特に有用な化学発光剤の例は、ルミノール、イソルミノール、セロマティックアクリジニウム（theromatic acridinium）エステル、イミダゾール、アクリジニウム塩及びシュウ酸エステルである。同様に、生物発光化合物は、ペプチドを標識するのに使用され得る。生物発光は、触媒タンパク質が化学発光反応の効率を増大させる生物系において発見された化学発光の1種である。生物発光タンパク質の存在は、発光の存在を検出することによって決定される。標識する目的のために重要な生物発光化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及びエクオリンである。

さらに別の実施態様において、比色検出は、高い消衰係数を有する発色団を有し又は生じる色素原化合物に基づいて使用される。

標識されたペプチドのインサイツ(in situ)での検出に伴って、対象から組織学的標本が摘出され、標識を検出するのに適切な条件下で顕微鏡によって該組織学的標本が検討され得る。当業者は、（染色手法等の）組織学的方法の広範な多様性の何れかが、このようなインサイツでの検出を達成するために改変できることに容易に気づくであろう。

インビボでの診断用放射性画像化にとって、利用可能な検出機器の種類は、放射性核種を選別する上での主要因子である。選択された放射性核種は、具体的な機器によって検出可能な崩壊の1種を有しなければならない。一般的に、診断用画像を可視化する何れかの従来法は、本発明に従って利用できる。インビボでの診断のために放射性核種を選別する上での別の因子は、標識が標的組織による最大取り込み時間でなおも検出可能であるほど該放射性核種の半減期が長いが、宿主の有害な照射が最小化されるほど十分に短いことである。1つの好ましい実施態様において、インビボでの画像化に使用される放射性核種は、粒子を放出しないが、従来のγカメラによって容易に検出され得る140〜200keVの範囲の光子の多数を生じる。

インビボでの画像化は、他の方法によって観察不可能な潜在性転移を検出するのに使用され得る。画像化は、例えば、非侵襲的に腫瘍を段階分けするのに使用され得る。

（5．5．2．治療上標識された抗体）
さらに、本発明は、治療剤へ複合された抗体又はその断片の使用を包含する。一実施態様において、本明細書に記載されるモノクローナル抗体は、「治療上複合され」又は「治療上標識され」（置き換え可能であるよう企図される用語）、腫瘍転移の部位又は感染/炎症、再狭窄若しくは線維症の病巣など、化合物が目指し及び結合する部位へ、治療剤を送達するのに使用される。「治療上複合された」という用語は、修飾されたモノクローナル抗体が、腫瘍の浸潤、血管新生、炎症又は他の病理の根本的な原因又は「構成要素」の何れかに対処する別の治療剤へ複合されることを意味する。治療上標識されたポリペプチドは、本明細書中で「治療的部分」とも呼ばれる適切な治療的「標識」を保有する。治療的部分は、標的疾病又は状態を処置する上で活発にするペプチドへ付加された原子、分子、化合物又は何れかの化学成分であり、主として、望ましくない血管新生と関連したものである。治療的部分は、モノクローナル抗体へ直接的に又は間接的に結合され得る。治療上標識されたモノクローナル抗体は、医薬として許容し得る担体又は賦形剤を含む医薬組成物として投与され、好ましくは注射に適した形態にある。

（原子番号によって整理された）有用な治療用放射性同位体の例は、⁴⁷Sc、⁶⁷Cu、⁹⁰Y、¹⁰⁹Pd、¹²⁵I、¹³¹I、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、¹⁹⁹Au、²¹¹At、²¹²Pb及び²¹⁷Biを含む。これらの原子は、キレートの一部として直接的に、間接的に、又はヨウ素の場合、ヨウ素化されたボルトンハンター基の一部として間接的にペプチドへ複合できる。放射性ヨウ素は、この基がペプチド化合物へ共役される前又は後の何れかで導入できる。

放射性核種複合体の好ましい用量は、腫瘍の種類、腫瘍の位置及び脈管形成、ペプチド担体の動態及び体内分布、核種による放射能放出のエネルギー等により変動する、標的部位へ送達されるべき特異的放射能の関数である。放射線治療の当業者は、過度の実験をせずに治療上の所望の恩典をもたらすよう、具体的な核種の用量とともにペプチドの用量を容易に調整できる。

本明細書に含まれる別の治療的アプローチは、ホウ素中性子捕捉治療の使用であり、ホウ素化されたペプチドは、腫瘍、最も好ましくは頭蓋内腫瘍など、所望の標的部位へ送達される（Barth, RFの文献（Cancer Invest. 14: 534-550 (1996)）、Mishima, Yの文献（癌中性子捕捉治療（Cancer Neutron Capture Therapy）, New York: Plenum Publishing Corp., 1996）、Soloway, AHらの文献（J. Neuro-Oncol. 33: 1-188 (1997)））。安定した同位体¹⁰Bは、低エネルギー（＜0.025eV）の熱中性子で照射され、結果として生じる核捕捉は、a粒子並びに、高い線エネルギー付与並びに約9及び5mの個々の経路長を有する7Li核を生じる。本方法は、血液、内皮細胞及び正常組織（例えば、脳）においてより低レベルで腫瘍における¹⁰Bの蓄積に基づいている。このような送達は、上皮増殖因子を使用して達成されている（Yang. Wらの文献（Cancer Res 57:4333-4339 (1997)））。

本発明の方法に従ったモノクローナル抗体へ共役できる他の治療剤は、薬剤、プロドラッグ、プロドラッグを活性化する酵素、光感作剤、核酸治療剤、アンチセンスベクター、ウイルスベクター、レクチン及び他の毒素である。

レクチンは、炭水化物へ結合する、植物に普遍的に由来するタンパク質である。数ある活性のうち、いくつかのレクチンは毒性である。最も細胞傷害性のある公知の物質のいくつかは、細菌及び植物起源のタンパク質毒素である（Frankel, AEらの文献（Ann. Rev. Med. 37:125-142 (1986)））。これらの分子は細胞表面に結合し、細胞のタンパク質合成を阻害する。最も普遍的に使用される植物毒素は、リシン及びアブリンであり、最も普遍的に使用される細菌毒素は、ジフテリア毒素及びシュードモナス外毒素Aである。リシン及びアブリンにおいて、結合及び毒性機能は、2つの別個のタンパク質サブユニットであるA鎖及びB鎖に含有される。リシンB鎖は、細胞表面の炭水化物へ結合し、細胞へのA鎖の取り込みを促進する。一旦細胞の内側に入ると、リシンA鎖は、真核生物リボソームの60Sサブユニットを不活性化することによって、タンパク質合成を阻害する（Endo, Y.らの文献（J. Biol. Chem. 262: 5908-5912 (1987)））。一本鎖リボソーム阻害タンパク質である他の植物由来の毒素は、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、コムギ胚芽タンパク質、ゲロニン、ジアンチン（dianthin）、モモルカリン（momorcharin）、トリコサンチン、及び多くの他のものを含む（Strip, F.らの文献（FEBS Lett. 195:1-8 (1986)））。また、ジフテリア毒素及びシュードモナス外毒素Aは一本鎖タンパク質であり、その結合及び毒性機能は、同一タンパク質の別個のドメインに存在する。シュードモナス外毒素Aは、ジフテリア毒素と同一の触媒活性を有する。リシンは、毒性効果の部位特異的送達を可能にするAb等のターゲティング分子へ、その毒性のあるa鎖を結合することによって治療上使用されてきた。また、細菌毒素は、抗腫瘍複合体として使用されてきた。本明細書で企図されるように、毒性ペプチド鎖又はドメインは、本発明の化合物へ複合され、転移病巣など、毒性活性が望まれる標的部位へ部位特異的様式で送達される。

Ab又は他のリガンド等のタンパク質への毒素の複合は、当技術分野で公知である（Olsnes, S.らの文献（Immunol. Today 10:291-295 (1989)）、Vitetta, ESらの文献（Ann. Rev. Immunol. 3: 197-212 (1985)））。

抗体又はその断片は、細胞毒素、例えば細胞分裂阻害剤又は細胞破壊剤、治療剤又は放射性金属、例えばα放射体等の治療成分へ複合され得る。細胞毒素又は細胞傷害剤は、細胞に対して有害である何れかの薬剤を含む。例は、パクリタキセル、サイトカラシンB、グラミシジンD、臭化エチジウム、エメチン、メトトレキサート、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド（tenoposide）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシン（anthracin）ジオン、マイトマイシンC、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンD、1-デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、エピルビシン、及びシクロホスファミド、及びそれらの類似体又は相同体を含む。治療剤は、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン、5-フルオロウラシルデカルバジン（decarbazine））、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパ（thioepa）クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（BCNU）及びロムスチン（CCNU）、シクロトスファミド（cyclothosphamide）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンC、及びシスジクロロジアミン白金（II）（DDP）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（旧ダウノマイシン）及びドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（旧アクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、及びアントラマイシン（AMC））、並びに有糸分裂阻害剤（例えば、ビンクリスチン及びビンブラスチン）を含むが、これらに限定されるわけではない。

さらに、抗体又はその断片は、付与された生物反応を修飾する治療剤又は薬剤成分へ複合され得る。治療剤又は薬剤成分は、古典的な化学治療剤に限定されるものとして解釈されるべきではない。例えば、薬剤成分は、所望の生物活性を有するタンパク質又はポリペプチドであり得る。このようなタンパク質は、例えば、アブリン、リシンA、シュードモナス外毒素、コレラ毒素、又はジフテリア毒素等の毒素；腫瘍壊死因子、α-インターフェロン、β-インターフェロン、神経成長因子、血小板由来増殖因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、アポトーシス剤、例えばTNF-α、TNF-β、AIM I（国際公報WO 97/33899参照）、AIM II（国際公報WO 97/34911参照）、Fasリガンド（Takahashiらの文献（1994, J. Immunol., 6:1567））、及びVEGI（国際公報WO 99/23105参照）、血栓剤（thrombotic agent）又は抗血管新生剤、例えば、アンギオスタチン又はエンドスタチン等のタンパク質；又は、例えばリンホカイン（例えば、インターロイキン1（「IL-1」）、インターロイキン2（「IL-2」）、インターロイキン6（「IL-6」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「GM-CSF」））等の生物反応修飾剤、又は増殖因子（例えば、成長ホルモン（「GH」））を含み得る。

さらに、抗体は、放射性金属イオンを複合するのに有用な大環状キレート剤等の治療成分へ複合できる（例えば、放射性材料に関しては上述参照）。ある実施態様において、大環状キレート剤は、リンカー分子を介して抗体へ付着できるテトラアザシクロドデカン-N,N',N",N"-四酢酸（DOTA）である。このようなリンカー分子は、当技術分野で普遍的に公知であり、それらのすべての内容が全体として引用により各々組み込まれているDenardoらの文献（1998, Clin Cancer Res. 4:2483-90）、Petersonらの文献（1999, Bioconjug. Chem. 10:553）、及びZimmermanらの文献（1999, Nucl. Med. Biol. 26:943-50）に記載される。

治療成分を抗体へ複合する技術は周知である。成分は、アルデヒド/シッフ結合、スルフィドリル結合、酸に不安定な結合、シス-アコニチル結合、ヒドラゾン結合、酵素分解性結合を含むがこれらには限定されない当技術分野で公知の何れかの方法によって抗体へ複合できる（一般的にはGarnettの文献（2002, Adv. Drug Deliv. Rev. 53:171-216）参照）。治療成分を抗体へ複合するさらなる技術は周知であり、例えば、Arnonらの文献（Reisfeldら編、モノクローナル抗体及び癌治療（Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy）中の「癌治療における薬剤の免疫ターゲティングのためのモノクローナル抗体」（Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy）, pp. 243-56 (Alan R. Liss社. 1985)）、Hellstromらの文献（Robinsonら編、放出制御薬剤送達（Controlled Drug Delivery）（2版）ｔ中の「薬剤送達のための抗体」（Antibodies For Drug Delivery）, pp. 623-53 (Marcel Dekker社. 1987)）、Thorpeの文献（Pincheraら編、モノクローナル抗体'84：生物学的及び臨床的応用（Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications）中の「癌治療における細胞傷害性薬剤の抗体担体：総説（Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review）」, pp. 475-506 (1985)）、Baldwinら編、癌検出及び治療のためのモノクローナル抗体（Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy）中の「癌治療における放射性標識した抗体の治療的使用に関する分析、結果及び将来的展望」（Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy）, pp. 303-16 (Academic Press 1985)、及びThorpeらの文献（1982, Immunol. Rev. 62:119-58）を参照されたい。抗体をポリペプチド成分へ融合し又は複合する方法は、当技術分野で公知である。例えば、米国特許第5,336,603号、第5,622,929号、第5,359,046号、第5,349,053号、第5,447,851号、及び第5,112,946号、欧州特許第307,434号、欧州特許第367,166号、国際公報WO 96/04388及びWO 91/06570、Ashkenaziらの文献（1991, PNAS 88: 10535-10539）、Zhengらの文献（1995, J. Immunol. 154:5590-5600）、並びにVilらの文献（1992, PNAS 89:11337- 11341）を参照されたい。成分に対する抗体の融合は、直接的である必要は必ずしもないが、リンカー配列を通じて生じ得る。このようなリンカー分子は、当技術分野で普遍的に公知であり、それらのすべての内容が全体として引用により本明細書中に各々組み込まれているDenardoらの文献（1998, Clin Cancer Res. 4:2483-90）、Petersonらの文献（1999, Bioconjug. Chem. 10:553）、Zimmermanらの文献（1999, Nucl. Med. Biol. 26:943-50、Garnettの文献（2002, Adv. Drug Deliv. Rev. 53:171-216）に記載される。

或いは、抗体は、それらのすべての内容が全体として引用により本明細書中に組み込まれている米国特許第4,676,980号におけるSegalによって記載されるように、抗体ヘテロ複合体を形成するよう第二の抗体へ複合できる。

また、抗体は、標的抗原のイムノアッセイ又は精製に特に有用な固体支持体へ付着され得る。このような固体支持体は、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、塩化ポリビニル又はポリプロピレンを含むが、これらに限定されるわけではない。

（5．6．医薬組成物及び治療用組成物並びにそれらの投与）
本発明の医薬組成物において採用され得る化合物は、上述のポリペプチド分子、好ましくはモノクローナル抗体、及びこれらの化合物の医薬として許容し得る塩のすべてを含む。特定の実施態様において、「医薬として許容し得る」という用語は、連邦政府若しくは州政府の監督官庁によって認可され、又は米国薬局方若しくは、動物、より具体的にはヒトにおける使用について一般的に認識される他の薬局方に列挙されるものを意味する。「担体」という用語は、希釈剤、アジュバント（例えば、フロイントアジュバント（完全及び不完全））又は、より好ましくはChiron, Emeryville, CA から市販されているMF59C.1アジュバント、賦形剤、又は治療剤が投与されるのに使用される媒体を指す。このような医薬担体は、ピーナツ油、ダイズ油、鉱物油、ゴマ油等の石油、動物、植物又は合成の起源のものを含む、水及び油等の滅菌済み液体であり得る。医薬組成物が静脈内投与される場合、水は好ましい担体である。また、塩類溶液及び水性デキストロース及びグリセロール溶液は、特に注射可能な溶液のための液体担体として採用できる。適切な医薬賦形剤は、デンプン、グルコース、乳糖、ショ糖、ゼラチン、麦芽、コメ、穀粉、木炭、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、滑石、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノール等を含む。また、所望の場合、組成物は、湿潤剤若しくは乳化剤、又はpH緩衝剤の少量を含有できる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル、粉末、放出制御製剤等の形態を取り得る。

本発明の組成物は、中性又は塩の形態として製剤できる。

塩基性基を含有する本発明の化合物の医薬として許容し得る酸付加塩は、当技術分野で公知の方法によって、強力な又は中程度に強力な、非毒性の、有機又は無機酸を使用して適宜形成される。本発明に含まれる酸付加塩の例は、マレイン酸、フマル酸、乳酸、シュウ酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、酒石酸、クエン酸、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸及び硝酸の塩である。

酸性基を含有する本発明の化合物の医薬として許容し得る塩基付加塩は、有機及び無機の塩基から公知の方法によって調製され、例えば、水酸化カルシウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム及び水酸化アンモニウム等の非毒性アルカリ金属及びアルカリ土類塩基、並びにトリエチルアミン、ブチルアミン、ピペラジン、及びトリ（ヒドロキシメチル）メチルアミン等の非毒性有機塩基を含む。

一般的に、本発明の組成物の成分は、単位剤形において、例えば活性剤の量を示すアンプル若しくはサシェ等の気密性の密封容器における凍結乾燥粉末又は水を含まない濃縮剤として、別個に又は互いに混合されての何れかで供給される。組成物が注入によって投与される場合、滅菌済みの医薬等級の水又は塩類溶液を含有する注入瓶を使用して分注できる。組成物が注射によって投与される場合、注射のための滅菌水又は塩類溶液のアンプルは、成分が投与前に混合され得るよう提供できる。

本発明の化合物及び医薬として許容し得るその塩は、カプセル、浸透性ウェーハー、錠剤又は注射可能な調製物等の簡便な剤形へ組み込まれ得る。固体又は液体の医薬として許容し得る担体が採用され得る。

固体担体は、デンプン、乳糖、硫酸カルシウム二水和物、白土、ショ糖、滑石、ゼラチン、アガー、ペクチン、アカシア、ステアリン酸マグネシウム及びステアリン酸を含む。液体担体は、シロップ、ピーナツ油、オリーブ油、塩類溶液、水、デキストロース、グリセロール等を含む。同様に、担体又は希釈剤は、モノステアリン酸グリセリル又はジステアリン酸グリセリル等の何れかの持続放出材料を単独で又はワックスとともに含み得る。

液体担体が使用される場合、調製物は、シロップ、エリキシル、乳剤、軟質ゼラチンカプセル、アンプル等の注射可能な滅菌液（例えば、溶液）、又は水性若しくは非水性液体懸濁液の形態であり得る。このような医薬組成物の要約は、例えば、Remingtonの文献（Remingtonの医薬科学（Remington's Pharmaceutical Sciences）, Mack Publishing Company, Easton Pennsylvania (Gennaro18版. 1990)）において見出され得る。

医薬調製物は、錠剤の形態に必要な場合、混合、造粒及び圧縮のような段階、又は経口、非経口、局所、経皮、膣内、陰茎内、鼻内、気管支内、頭蓋内、眼内、硬膜内及び直腸投与のための所望の製品を付与するために適宜成分を混合、充填、溶解するような段階を包含する医薬化学の従来技術に従って製造される。また、医薬組成物は、湿潤剤又は乳化剤等の非毒性補助物質、pH緩衝剤等の少量を含有し得る。

本発明は、動物の属及び種の多くの何れかの診断又は処置において使用され得、ヒト又は家畜の医学の実施において等しく適用できる。従って、医薬組成物は、トリ及びより好ましくは哺乳動物、並びにヒトを含む飼い馴らされた及び市販の動物を処置するのに使用できる。

「全身性投与」という用語は、静脈内（i.v.）注射又は注入等の、対象の循環系への組成物の導入を結果的に生じ、又は身体を通じて拡散できる様式での、本明細書に記載されるポリペプチド等の組成物又は薬剤の投与を指す。「限局性」投与は、腹腔内、髄腔内、硬膜下等の特異的な、かつ幾分さらに限定された解剖学的空間への、又は特定の器官への投与を指す。例は、膣内、陰茎内、鼻内、気管支内（若しくは肺点滴注入）、頭蓋内、硬膜内又は眼内を含む。「局所投与」という用語は、腫瘤、皮下（s.c.）注射、筋肉内（i.m.）注射等の、限定された又は範囲を定められた解剖学的空間への組成物又は薬剤の投与を指す。また、局所投与又は限局性投与がしばしば、循環系への組成物の進入を結果的に生じ、すなわち、それによりまた、s.c.又はi.m.が全身性投与のための経路であることを、当業者は理解するであろう。注射可能な又は注入可能な調製物は、溶液若しくは懸濁液、注射若しくは注入の前の液体における溶液若しくは懸濁液に適した固体形態、又は乳剤の何れかとして、従来の形態で調製できる。i.v.など、投与の好ましい経路は全身性であるが、医薬組成物は、例えば軟膏、クリーム又はゲルとして局所的に又は経皮的に、経口的に、直腸に、例えば坐剤として投与され得る。

局所適用のために、化合物は、膏薬又は軟膏等の局所的に適用される媒体へ組み込まれ得る。活性成分のための担体は、スプレー可能な又はスプレー不可能な形態の何れかであり得る。スプレー不可能な形態は、局所適用に固有の担体を含み、かつ好ましくは水の動的粘性よりも大きな動的粘性を有する半固体又は固体の形態であり得る。適切な製剤は、溶液、懸濁液、乳剤、クリーム、軟膏、粉末、塗布剤、膏薬等を含むが、これらに限定されるわけではない。所望の場合、これらは、補助剤、例えば保存料、安定剤、湿潤剤、緩衝液、又は浸透圧に影響を及ぼすための塩などとともに滅菌され得又は混合され得る。

スプレー不可能な局所調製物のための好ましい媒体は、軟膏塩基、例えばポリエチレングリコール1000（PEG-1000）、HEBクリーム等の従来のクリーム、ゲル、及び石油ゼリー等を含む。

また、局所適用に及び肺の点滴注入に適しているのは、スプレー可能なエアロゾル調製物であり、好ましくは固体又は液体の不活性担体材料と組み合わされた化合物が、中身を搾り出せるプラスチック容器に、又は加圧された揮発性の通常気体の噴霧剤と混合して包装される。

エアロゾル調製物は、溶媒、緩衝液、界面活性剤、香料、及び/又は抗酸化剤を、本発明の化合物に加えて含有できる。

特にヒトのための好ましい局所適用のために、作用される領域、例えば、皮膚表面、粘膜、眼等へ化合物の有効量を投与することが好ましい。

この量は一般的に、治療されるべき面積、症状の重度、及び採用される局所媒体の性質に依存して、適用あたり約0.001mg〜約1gの範囲であろう。

本発明のポリペプチド組成物のための医薬として許容し得る他の担体は、リポソームであり、活性タンパク質が、脂質層へ付着した水性同心円層からなる微粒子に分散され又は多様に存在するかの何れかで含有される医薬組成物である。活性ポリペプチドは好ましくは、水性層に及び脂質層に、内側に又は外側に、又は何れかの事象において、リポソーム懸濁液として一般的に公知の非均一系に存在する。

疎水性層又は脂質層は一般的に、レシチン及びスフィンゴミエリン等のリン脂質、コレステロール等のステロイド、ジセチルホスフェート、ステアリルアミン又はホスファチジン酸等の多かれ少なかれイオン性の界面活性物質、及び/又は疎水性の性質の他の材料を含むが、排他的ではない。当業者は、本リポソーム製剤の他の適切な実施態様を認めるであろう。

腫瘍及び癌を治療するための治療用組成物は、ペプチドに加えて、有糸分裂阻害剤、例えばビンブラスチン等の抗腫瘍剤；アルキル化剤、例えばシクロホスファミド；葉酸阻害剤、例えばメトトレキサート、ピリトレキシム又はトレメトレキサート；代謝拮抗剤、例えば5-フルオロウラシル及びシトシンアラビノシド；挿入抗生物質、例えばアドリアマイシン及びブレオマイシン；酵素又は酵素阻害剤、例えばアスパラギナーゼ、エトポシド等のトポイソメラーゼ阻害剤；又は生物反応修飾剤、例えばインターフェロン又はインターロイキンを含み得る。実際、本明細書に開示されるペプチドとの組み合わせで何れかの公知の癌治療剤を含む医薬組成物は、本発明の範囲内である。また、医薬組成物は、標的となる患者が危険にあるさらなる症状を処置するための1つ以上の他の薬剤、例えば抗菌剤、抗真菌剤、抗寄生虫剤、抗ウイルス剤、及び抗コクシジウム剤を含み得る。

投与される治療的薬用量は、当業者に公知であり又は当業者によって容易に確かめられるように、治療効果のある量である。また、用量は、レシピエントの年齢、健康状態、及び体重、あれば併用処置の種類、処置の頻度、及び例えば抗炎症効果又は抗細菌効果等の所望の効果の性質に依存する。

多様な送達システムは、公知であり、本発明のモノクローナル抗体、又は本発明のモノクローナル抗体と癌を予防し若しくは処置するのに有用な予防剤若しくは治療剤との組み合わせを投与するのに使用でき、例えばリポソーム、微粒子、マイクロカプセルにおける被包、抗体若しくは抗体断片を発現できる組換え細胞、受容体仲介性エンドサイトーシス（例えば、Wu及びWuの文献（1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432）参照）、レトロウイルス若しくは他のベクターの一部としての核酸の構築等である。本発明の予防剤又は治療剤を投与する方法は、非経口投与（例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内及び皮下）、硬膜外及び粘膜（例えば、鼻内、吸入、及び経口経路）を含むが、これらに限定されるわけではない。特定の実施態様において、本発明の予防剤又は治療剤は、筋肉内に、静脈内に、又は皮下に投与される。予防剤又は治療剤は、何れかの便利な経路、例えば注入又はボーラス注射によって、上皮又は皮膚粘膜の裏打ち（例えば、口腔粘膜、直腸及び腸管の粘膜等）を通じての吸収によって投与され得、生物活性のある他の薬剤とともに投与され得る。投与は、全身性又は局所的であり得る。

特定の実施態様において、本発明の予防剤又は治療剤を、処置の必要な領域へ局所的に投与することは望ましくあり得、このことは、例えば局所注入によって、注射によって、又はインプラントによって達成され得るが、限定するものではなく、該インプラントは、シラスティックメンブレン等のメンブレン又はファイバーを含む多孔性、非多孔性、又はゼラチン質の材料である。

さらに別の実施態様において、予防剤又は治療剤は、放出制御又は持続放出の系で送達できる。一実施態様において、ポンプは、放出制御又は持続放出を達成するために使用され得る（Langerの文献（上述）、Seftonの文献（1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:20）、Buchwaldらの文献（1980, Surgery 88:507）、Saudekらの文献（1989, N. Engl. J. Med. 321:574）参照）。別の実施態様において、ポリマー材料は、本発明の抗体又はその断片の放出制御又は持続放出を達成するのに使用できる（例えば、Langer及びWiseの文献（放出制御の医学的応用（Medical Applications of Controlled Release）, CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974)）、Smolen及びBallの文献（規制薬剤の生物学的利用能、薬剤製造設計及び性能（Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance）, Wiley, New York (1984)）、Ranger及びPeppasの文献（1983, J. Macromol. ScL Rev. Macromol. Chem. 23:61）参照、またLevyらの文献（1985, Science 228:190）、Duringらの文献（Ann. Neurol. 25:351）、Howardらの文献（1989, J Neurosurg. 7 1:105）、米国特許第5,679,377号、第5,916,597号、第5,912,015号、第5,989,463号、第5,128,326号、国際公報WO 99/15154及びWO 99/20253参照）。持続放出製剤において使用されるポリマーの例は、ポリ（メタクリル酸2-ヒドロキシエチル）、ポリ（メタクリル酸メチル）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エチレン-酢酸ビニル共重合体）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアクリルアミド、ポリ（エチレングリコール）、ポリラクチド（PLA）、ポリ（ラクチド-グリコリド共重合体）（PLGA）、及びポリオルトエステルを含むが、これらに限定されるわけではない。好ましい実施態様において、持続放出製剤において使用されるポリマーは、不活性であり、浸出可能な不純物を含まず、保存、滅菌及び生分解性に関して安定であるさらに別の実施態様において、放出制御又は持続放出の系は、予防剤又は治療剤に近接して配置でき、従って、全身性用量の画分のみを必要とする（例えば、Goodsonの文献（放出制御の医学的応用（Medical Applications of Controlled Release）, 上述, vol. 2, pp. 115-138 (1984)）参照）。

放出制御の系は、Langerの文献（1990, Science 249:1527-1533）による総説において考察される。当業者に公知の何れかの技術は、本発明の1つ以上の治療剤を含む持続放出製剤を製造するのに使用できる。例えば、すべての内容が全体として引用により本明細書中に各々組み込まれている米国特許第4,526,938号、国際公報WO 91/05548及びWO 96/20698、Ningらの文献（1996, Radiotherapy & Oncology 39:179-189）、Songらの文献（1995, PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397）、Cleekらの文献（1997, Pro. Int'l. Symp. Control. ReI. Bioact. Mater. 24:853-854）、及びLamらの文献（1997, Proc. Int'l. Symp. Control ReI. Bioact. Mater. 24:759-760）を参照されたい。

（5．7．治療方法）
本発明の方法は、対象における腫瘍の成長及び浸潤を阻害するために、又は内皮細胞増殖及び遊走を阻害することによって、腫瘍によって誘導される血管新生を抑制するために使用され得る。腫瘍又は血管新生の成長又は浸潤を阻害することによって、本方法は、腫瘍の転移の阻害を結果的に生じる。脊椎動物対象、好ましくは非霊長類（例えば、雌ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラット等）及び霊長類（例えば、サル及びヒト）等の哺乳動物は、腫瘍の成長、浸潤又は血管新生を阻害するのに効果的な化合物の量を投与される。化合物又は医薬として許容し得るその塩は好ましくは、上述の医薬組成物の形態で投与される。

癌の予防又は処置に効果的であろう本発明の組成物の量は、標準的な研究技術によって決定できる。効果的な用量は、インビトロ又は動物モデル検査系に由来する用量反応曲線から外挿され得る例えば、癌の予防又は処置に効果的であろう組成物の薬用量は、例えば本明細書に開示され又は当業者に公知の動物モデル等の動物モデルへ組成物を投与することによって決定できる。さらに、インビトロでのアッセイは場合により、最適な薬用量範囲を同定するのを助けるために採用され得る。

（抗体を含む）タンパク質、ペプチド、ペプチド多量体等の用量は好ましくは、ペプチドの有効量を含む医薬的薬用量単位を含む。薬用量単位形態は、哺乳動物対象のための単位薬用量として適した物理的に分離した単位を指し、各単位は、必要とされる医薬担体とともに、所望の治療効果を生じるよう算出された活性材料のあらかじめ決められた量を含有する。本発明の薬用量単位形態についての明細は、（a）活性材料の独特な特徴及び達成されるべき具体的な治療効果、並びに（b）個々の対象の処置及び感度のためにこのような活性化合物を化合する当技術分野に固有の制限によって記載されており、（a）及び（b）に直接的に依存する。

有効量によって意味されるのは、疾病の何れかの関連するパラメータにおける測定可能な低下を結果的に生じ、原発腫瘍又は転移性腫瘍の成長、炎症反応の何れかの承認される指数、又は疾病のない間隔の若しくは生存の測定可能な延長を含み得るインビボでの定常状態濃度を達成するために十分な量である。例えば、患者の20％における腫瘍成長の低下は、効果的であると考えられる（Frei III, E.の文献（The Cancer Journal 3:127-136 (1997)））。しかしながら、この大きさの効果は、本発明に従って用量が効果的であるための最小必要条件であるとは考えられない。

一実施態様において、効果的な用量は、本明細書に記載されるようなインビボでのアッセイにおける化合物の50％有効量（ED₅₀）よりも好ましくは10倍、より好ましくは100倍高い。

好ましい有効量の選択は、当業者に公知であろういくつかの因子の考慮に基づいて当業者によって（例えば、臨床治験を介して）決定できる。このような因子は、選択される精確なペプチド又は誘導体、疾病又は状態、投与の経路、レシピエントの健康状態及び体重、もしあれば他の併用処置の存在、処置の頻度、所望の効果の性質、例えば腫瘍の転移の阻害、及び当業者の判断を含む。

腫瘍を有する対象、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを治療するための好ましい用量は、体重1kgあたりの活性ポリペプチドベースの化合物約100mgまでの量である。ペプチド又はペプチド模倣剤の典型的な単一薬用量は、約1ng〜約100mg/体重kgである。抗体については、患者へ投与される薬用量は典型的には、患者の体重の0.1mg/kg〜100mg/kgである。好ましくは、患者へ投与される薬用量は、患者の体重の0.1mg/kg〜20mg/kgであり、より好ましくは患者の体重の1mg/kg〜10mg/kgである。局所投与については、化合物の約0.01〜20（重量）％濃度の範囲の薬用量、好ましくは1〜5％が示唆される。約0.1mg〜約7gの範囲の1日の合計の薬用量が、静脈内投与にとって好ましい。しかしながら、個々の処置計画における変数の数が大きく、これらの好ましい値からのかなりの逸脱が期待されるので、上述の範囲は示唆的である。一般的に、ヒト及びヒト化抗体は、外来ポリペプチドに対する免疫反応により、他の種由来の抗体よりもヒトの体内でより長い半減期を有する。従って、ヒト抗体のより低い薬用量及びより低い頻度の投与がしばしば可能である。

インビトロでの内皮細胞の増殖又は遊走を阻害するためのペプチドの有効量又は用量は、細胞あたり約1pg〜約5ngの範囲である。有効量及び最適な用量範囲は、本明細書に記載される方法を使用して、インビトロで決定され得る。

本発明の化合物は、腫瘍細胞若しくは内皮細胞の増殖、遊走、浸潤、又は血管新生、腫瘍の転移若しくは炎症反応に及ぼす阻害効果を生じるものとして特徴づけられ得る。化合物は、血管新生の阻害が結果的に腫瘍のサイズ若しくは成長速度の低下又は腫瘍の破壊を生じる腫瘍を有する哺乳動物宿主、好ましくはヒトにおける抗腫瘍効果を生じる上で特に有用である。好ましくは、対象はヒトである。

上述の方法が効果的である疾病又は状態のより長い例は、固体腫瘍、白血病又はリンパ腫の原発性成長；腫瘍の浸潤、転移又は腫瘍転移の発達；良性の過形成；粥状硬化症；心筋の血管新生；バルーン血管形成術後の血管の再狭窄；血管外傷後の新生内膜形成；血管移植片再狭窄；冠状側枝形成；深部静脈血栓；虚血性肢血管新生；毛細血管拡張症；化膿性肉芽腫；角膜疾患；ルベオーシス；血管新生緑内障；糖尿病性及び他の網膜症；後水晶体線維増殖症；糖尿病性血管新生；黄斑変性症；子宮内膜症；関節炎；慢性炎症状態と関連した線維症、虚血、瘢痕化若しくは線維症を含む外傷性脊髄損傷；肺線維症、化学療法誘発性線維症；瘢痕化及び線維症を伴う創傷治癒；消化性潰瘍；骨折；ケロイド；又は病原性の細胞浸潤若しくは血管新生と関連した脈管形成、造血、排卵、月経、妊娠若しくは胎盤形成の障害を含む。

上述の方法によって処置されるべき好ましい疾病又は状態は、腫瘍の成長、浸潤又は転移である。これは脳腫瘍を含む。このような脳腫瘍の例は、星状細胞腫、退形成性星細胞腫、膠芽腫、多形膠芽腫、毛様性星細胞腫、多形性黄色星状細胞腫、上衣下巨細胞星状細胞腫、線維性星細胞腫、肥満性星細胞腫、原形質性星細胞腫、乏突起膠腫、退形成性乏突起膠腫、上衣腫、退形成性上衣腫、粘液乳頭状上衣腫、上衣下細胞腫、混合型乏突起星細胞腫及び悪性乏突起星細胞腫である。

また、本方法は、子宮内膜症等の子宮疾患、及び増殖糖尿病網膜症、血管新生加齢関連黄斑変性、未熟性の網膜症、鎌状赤血球網膜症又は網膜静脈閉塞と関連するもの又はそれらの原因等の病原性の眼の脈管形成を処置するのに使用される。

血管新生阻害剤は、外傷性脊髄損傷後の炎症性血管新生及び神経膠症を防止し、それにより神経細胞接続性の再建を促進する上で役割を担い得る（Wamil, AWらの文献（Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 95:13188-13193 (1998)））。それゆえ、本発明の組成物は、外傷性脊髄損傷後にできるだけすぐに及びその後数日間〜約2週間投与され、神経細胞接続性の再建を立体的に防止するであろう血管新生及び神経膠症を阻害する。処置は、脊髄損傷の部位での損傷の面積を減少させ、神経細胞機能の再生を容易にし、それにより麻痺を予防する。また、本発明の化合物は、ワーラー変性、（外傷を受けた神経細胞において生じる）逆行性のアミノ酪酸仲介性脱分極から軸索を保護し、培養中の単離された中枢神経系細胞及び組織の神経細胞の伝導率の回復を改善することが期待される。

患者へ投与される他の癌治療剤については、多様な癌治療剤の典型的な用量が、当技術分野において公知である。本発明を考えると、ある好ましい実施態様は、単一の薬剤の投与のために推奨される薬用量と比べて、組み合わせ処置計画における低い薬用量の投与を包含するであろう。

本発明は、癌の予防又は処置に効果的であるとすでに思われているよりも、公知の予防剤又は治療剤の低い用量を投与する方法を提供する。好ましくは、公知の抗癌療法のより低い用量は、本発明のモノクローナル抗体のより低い用量との組み合わせで投与される。

本明細書で使用されるように、「組み合わせで」という用語は、2つ以上の予防剤及び/又は治療剤の使用を指す。「組み合わせで」という用語の使用は、過剰増殖細胞障害、特に癌を有する対象へ、予防剤及び/又は治療剤が投与されるオーダーを制限しない。第一の予防剤又は治療剤は、過剰増殖細胞障害、特に癌を有した、有する又は感受性のある対象へ、第二の予防剤又は治療剤の投与の前（例えば、1分、5分、15分、30分、45分、1時間、2時間、4時間、6時間、12時間、24時間、48時間、72時間、96時間、1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、8週間、又は12週間前）、同時に、又は後（例えば、1分、5分、15分、30分、45分、1時間、2時間、4時間、6時間、12時間、24時間、48時間、72時間、96時間、1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、8週間、又は12週間後）に投与できる。予防剤又は治療剤は、本発明の薬剤が、別の方法で投与された場合よりも増大した恩典を提供するよう、他の薬剤とともに作用できるよう、連続してかつある時間間隔内で対象へ投与される。さらなる予防剤又は治療剤は、他のさらなる予防剤又は治療剤とともに、何れかの順序で投与できる。

（5．8．アッセイ）
（5．8．1．イムノアッセイによってuPA複合体又はuPAR複合体を検出するための抗体の使用）
本発明の抗体は、組織試料又は血清若しくは血漿等の体液においてこれらのエピトープを含有する分子を検出するためにイムノアッセイにおいて有用である。このような抗体は、抗原又はそのエピトープ保有断片を検出するであろう。従って、腫瘍環境においてタンパク質分解がある場合、断片の放出又は組織における放出が結果的に生じる。

当技術分野で公知の何れかの従来のイムノアッセイが、本目的のために採用され得るが、ELISA等の酵素イムノアッセイが好ましい。また、イムノアッセイ法は、上述に引用される引用文献において記載される。

競合的イムノアッセイは典型的に、結合特異性、親和性、能力等においてモノクローナル抗体を模倣し得る複合体についてのリガンドである検査試料における分子を検出するのに使用される。一実施態様である競合的結合アッセイにおいて、複合体へ結合した抗体の量が測定される（標識された抗Igを使用して直接的に又は間接的に）。検査試料の存在下での競合（すなわち、複合体への抗体のより少ない結合）は、試料の1つ以上の構成要素が複合体へ結合するという証拠である。検査されている最も多くの化合物は、中程度の親和性で結合するであろうと期待される（約1〜10μM）。

別の実施態様において、固体支持体、例えばマイクロプレートを、関心対象のmAbでコーティングする。抗体へ関連分子を結合させるために、検査試料を例えば約30分間添加し及びインキュベートする。プレートを洗浄し、検出可能に標識された形態（例えば、ビオチン化）にある複合体を競合的リガンドとして添加し、抗体に対する結合のために検査試料と競合させる。検査試料についての「正の」結果は、固相へ結合した標識された複合体のより少ない結合として表されるであろう。存在する何れかの検査試料が、固定化されたmAbによって最初に捕捉されなければならないので、複合体溶液及び試料溶液が同時には添加されない本アプローチは、複合体へ直接的に結合する検査試料の交絡効果を回避する。好ましくは、結合が特異的であることを確認するために、希釈曲線を得るよう一連の希釈を実施する。このことは、例えば、試料の半分を使用して50％のより低い結合/シグナル比があるかどうかを示すであろう。このような希釈効果の欠如において、複数の結合実態がアッセイへ進入していることが結論付けられ得る。mAb結合部位での分子結合が同様の親和性を有する場合、結果はより正確である。

（5．8．1．1．免疫組織化学アッセイ）
組織において抗原を検出する1つの好ましいアッセイは、技術が充実した何れかの従来のアッセイ方法を使用する免疫組織化学による。好ましいアッセイは、以下の実施例において記載されるものである。このような方法に関する記載については、例えば、そのすべての内容が全体として引用により組み込まれているDabbs, DJの文献（診断用免疫組織化学（Diagnostic Immunohistochemistry）, Churchill Livingstone, 2001）を参照されたい。

（5．8．1．2．非組織学的イムノアッセイ）
好ましいイムノアッセイは、固体支持体へ固定化された抗原又はAbを採用するELISA等の酵素イムノアッセイ（EIA）である。本組成物及び方法について、固体支持体は好ましくは、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、ポリアクリルアミド、ポリビニリデンジフルオリド、天然セルロース、修飾されたセルロース、ニトロセルロース、アガロース及び磁気ビーズの何れか1つである。好ましい実施態様において、ポリスチレン又は他のプラスチック多重ウェルの表面は、固体支持体として機能する。別の実施態様において、Ab又は抗原が底部へ固定され、又は多重ウェルプレートのウェルにおいてゆるく配置される固体支持体である。また、ウェルの底部がニトロセルロース又は同様のメンブレン材料を含み、液体が圧力又は真空下で除去できる多重ウェルプレートが使用され得る。

典型的な及び好ましいイムノアッセイは、固定化された二成分のAb-抗原複合体の形成によって試料から抗原を結合し又は「抽出する」ために、固体支持体へ固定化されたAbが、検査されている試料とまず接触する「順方向」アッセイを含む。適切なインキュベーションの後、もしあれば結合していない抗原を含む流体試料の残渣を除去するために固体支持体を洗浄した後、（「リポーター分子」として機能する）標識された抗体のわかっていない量を含有する溶液と接触させる。標識されていないAbを通じて、標識された抗体が、固定化された抗原と複合体形成できる第二のインキュベーションの後、未反応の標識されたAbを除去するために、固体支持体を第二の時間洗浄し、固定化された標識を測定する。順方向サンドイッチアッセイのこの種類は、抗原が存在し又は固定化された標識された抗体の量を、抗原のわかっている量を含有する標準試料が使用される場合の固定化された量と比較することによって定量され得るかどうかを決定するための単純な「はい/いいえ」アッセイであり得る。

また、いわゆる「同時」及び「逆方向」サンドイッチアッセイが使用され得る。同時アッセイは、固定化された抗体及び標識された抗体が同時に試料へ添加されるので、単一のインキュベーション段階を包含する。適切なインキュベーションの後、試料の残渣及び複合体形成していない標識された抗体を除去するために、固体支持体を洗浄する。次に、固体支持体と結合した標識された抗体の存在又は量を、上述の従来の「順方向」サンドイッチアッセイのように決定する。

「逆方向」アッセイにおいて、適切なインキュベーション時間後の固定化された標識されていない抗体の添加後に、標識された抗体の溶液を試料へ添加する。第二のインキュベーションの後、試料の残渣及び未反応の標識された抗体を除去するために、固相材料を従来の様式で洗浄する。次に、固体支持体と結合した固定化された抗体の決定を、「同時」かつ「順方向」のアッセイのように決定する。

（5．8．2．全細胞におけるuPARに対する抗体結合のためのアッセイ）
uPARターゲティングAb及び/又はその複合体は、好ましくは競合的リガンド結合アッセイにおけるuPARに対する[¹²⁵I]DFP-uPAの結合の阻害を測定することによって、又は[¹²⁵I]を使用してAbを直接標識することによって、uPARに対する結合について容易に検査される。アッセイは、uPARを発現する全細胞、例えば、A2780又はHeLa等の細胞系を採用し得る。好ましいアッセイは、以下のとおり実施される。細胞（約5×10⁴個/ウェル）を24ウェルプレートにおける培地（例えば、アールの塩を有するMEM/10％FBS＋抗生物質）に播種した後、細胞が70％コンフルエンスに到達するまで多湿の5％CO₂大気下でインキュベートする。Iodo-gen（登録商標）（Pierce）を使用して、触媒作用的に不活性化された高分子量uPA（DFP-uPA）を約250,000cpm/μgの比活性まで放射ヨウ素標識する。次に、細胞を含有するプレートを氷上で冷却し、細胞を冷PBS/0.05％トゥイーン80で2回洗浄する（各5分）。検査Ab及び/又はその複合体を冷PBS/0.1％BSA/0.01％トゥイーン80において連続希釈し、各ウェルへ0.3mLの最終容積まで添加した後、[¹²⁵I]DFP-μPAを添加する。次に、各ウェルは、0.2nMの最終濃度で[¹²⁵I]DFP-μPAの9500cpmを受容する。次に、4℃で2時間プレートをインキュベートした後、冷PBS/0.05％トゥイーン80で細胞を3回洗浄する（各5分）。NaOH（1N）を各ウェルへ0.5mLで添加して細胞を溶解し、プレートを室温で5分間、又は顕微鏡検査によって決定されるように各ウェルにおけるすべての細胞を溶解するまでインキュベートする。次に、各ウェルの内容物を吸引し、γカウンタを使用して各ウェルにおける総数を決定する。各化合物を三つ組で検査し、最大（100％）結合を表すよう採用される[¹²⁵I]DFP-uPA単独を含有するウェルにおいて測定される放射能全体の％として結果を表す。

uPARに対する[¹²⁵I]DFP-uPAの結合の阻害は通常、用量と関連しており、それにより曲線の直線部分に収まると期待される結合の50％阻害（IC₅₀値）を生じるのに必要な検査化合物の濃度が容易に決定される。一般的に、Ab及び/又はその複合体は、10^-5M未満のIC₅₀値を有する。好ましくは、Ab及び/又はその複合体は、約10^-6M未満、より好ましくは約10^-7M未満のIC₅₀値を有する。

（5．8．3．抗uPAR抗体又は他のリガンドの生物活性に関するアッセイ）
当業者は、本明細書に記載されるように、本発明のAb又は他のuPAR結合リガンドの活性を測定するのに有用なインビトロ及びインビボでのアッセイが、実例であるよう企図されるものであり、包括的でも限定的でもないことを認識するであろう。

（5．8．3．1．ECの遊走についてのアッセイ）
EC遊走研究について、トランスウェルあたりコラーゲン溶液200μLを添加した後、37℃で一晩インキュベートすることによって、トランスウェルをI型コラーゲン（50μg/mL）でコーティングする。トランスウェルを24ウェルプレートにおいて組み立て、化学誘引物質（例えば、FGF-2）を0.8mLの培地の容積全体で底部チャンバーへ添加する。トリプシンを使用して単層培養から剥離されたヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）等のECを、無血清培地で約10⁶個/mLの終濃度へ希釈し、この細胞懸濁液0.2mLを各トランスウェルの上部チャンバーへ添加する。検査されるべき阻害剤を上部及び下部の両チャンバーへ添加し得、加湿された大気中で37℃で5時間遊走を進行させる。DiffQuik（登録商標）を使用して染色されたプレートからトランスウェルを除去する。綿棒による廃棄によって、遊走しなかった細胞を上部チャンバーから除去し、メンブレンを脱離し、スライド上に包埋し、高倍率視野（400倍）の下で計数して、遊走した細胞数を決定する。

（5．8．3．2．抗浸潤活性に関する生物検定）
Matrigel（登録商標）浸潤アッセイとして公知のアッセイにおいて、再構成された基底膜（Matrigel（登録商標））を通じて浸潤するEC又は腫瘍細胞（例えば、PC-3ヒト前立腺癌細胞）等の細胞の能力は周知である（Kleinmanらの文献（Biochemistry 1986, 25: 312-318）、Parishらの文献（1992, Int. J. Cancer 52:378-383））。Matrigel（登録商標）は、IV型コラーゲン、ラミニン、（bFGFへ結合し及び局在化させる）パールカン等のヘパラン硫酸プロテオグリカン、ビトロネクチン並びにトランスフォーミング増殖因子β（TGFβ）、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（uPA）、組織プラスミノーゲン活性化因子（tPA）及びプラスミノーゲン活性化因子阻害剤1型（PAI-1）として公知のセルピンを含有する再構成された基底膜である（Chambersらの文献（Cane. Res. 1995, 55:1578-1585））。細胞外受容体又は酵素を標的にするAb及び/又はその複合体又は他のリガンドについてのアッセイのこの種類において得られる結果が、インビボでのこれらのAb及び/又はその複合体の有効性を予測することは、当技術分野で受け入れられている（Rabbaniらの文献（Int. J. Cancer 1995, 63: 840-845））。

このようなアッセイは、トランスウェル組織培養挿入物を採用する。浸潤性細胞は、Matrigel（登録商標）及びポリカーボネートメンブレンの上面を通じて横断し、かつメンブレンの底部へ接着する細胞として定義される。ポリカーボネートメンブレン（8.0μm孔サイズ）を含有するトランスウェル（例えば、Costar製）を、滅菌PBS中で約75μg/mLの終濃度へ希釈されたMatrigel（登録商標）（例えば、Collaborative Research製）でコーティングし（例えば、挿入物あたり希釈されたMatrigel（登録商標）60μL）、24ウェルプレートのウェルに配置する。生物学的安全キャビネットにおいてメンブレンを一晩乾燥させた後、振盪器上で培地、例えば抗生物質を補充されたDMEM100μLを1時間添加することによって再水和する。吸引によって各挿入物からDMEMを除去し、完全DMEM（＋/10％FBS及び抗生物質）0.8mLを24ウェルプレートの各ウェルへ添加し、それにより、トランスウェル（「下部チャンバー」）の外側を該完全DMEMで取り囲む。抗生物質（100μL）、ヒトGlu-プラスミノーゲン（5μg/mL）、及び検査されるべき何れかの阻害剤を有する新鮮なDMEMをトランスウェルの内側上部（「上部チャンバー」）へ添加する。検査されるべき細胞をトリプシン処理し、DMEM＋抗生物質において再懸濁し、約8×10⁵個/mLの終濃度でトランスウェルの上部チャンバーへ添加する。上部チャンバーの最終容積を200μLへ調整する。次に、組み立てられたプレートを多湿の5％CO₂大気下で約72時間インキュベートする。インキュベーション後、細胞を固定し、DiffQuik（登録商標）（ギムザ染色）を使用して染色した後、綿棒を使用して上部チャンバーを掻爬して、Matrigel（登録商標）及びメンブレンを通じて浸潤しなかった細胞を除去する。X-acto（登録商標）刃を使用して、トランスウェルからメンブレンを脱離し、Permount（登録商標）及びカバースリップを使用してスライド上に包埋した後、高倍率（例えば、400倍）を使用する顕微鏡下で計数する。5〜10個の計数視野からの浸潤性細胞の平均数を算出し、阻害剤濃度の関数としてプロットする。

（5．8．3．3．抗血管新生活性に関する管形成アッセイ）
調製でき又は市販されているEC、例えば、ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）又はヒト微小血管内皮細胞（HMVEC）を、1：1（v/v）の比でリン酸緩衝塩類溶液（PBS）におけるフィブリノーゲン（5mg/mL）とともに、2×10⁵個/mLの濃度で混合する。トロンビンを添加し（5単位/mL終濃度）、混合物を24ウェルプレートへ即時転移させる（ウェルあたり0.5mL）フィブリンゲルを形成させた後、検査化合物とともにVEGF及びbFGFをウェルへ（各5ng/mL終濃度で）添加する。5％CO₂において37℃で4日間細胞をインキュベートし、その時、各ウェルにおける細胞を計数し、丸まっている、分岐がなく細長い、1個の分岐があり細長い、又は2個以上の分岐があり細長いの何れかとして分類する。結果を化合物の各濃度についての5個の異なるウェルの平均として表す。典型的には、血管新生阻害剤の存在下で、細胞は、丸まったままであり又は未分化の管を形成する（例えば、0又は1個の分岐）。本アッセイは、インビボでの血管新生（又は抗血管新生）有効性を予測すると、当技術分野において認識されている（Minらの文献（Cancer Res. 1996, 56: 2428-2433））。

代替アッセイにおいて、ECをMatrigel（登録商標）において培養する場合、EC管形成を観察する（Schnaper HWらの文献（J. Cell. Physiol. 1995, 765: 107-118））。Matrigel（登録商標）をコーティングした24ウェルプレートへ10⁴個のEC/ウェルを転移させ、48時間後に管形成を定量する。ECを添加する時間又はその後の多様な時点の何れかで阻害剤を添加することによって、該阻害剤を検査する。また、（a）bFGF若しくはVEGF等の血管新生増殖因子、（b）分化刺激剤（例えば、PMA）又は（c）これらの組み合わせを添加することによって、管形成を刺激できる。

理論によって結合されることを望まないが、基底膜の具体的な種類、すなわち、遊走しており及び分化しているECが最初に遭遇すると期待されるであろうマトリックスの層をECに対して呈することによって、本アッセイは血管新生のモデルになる。また、結合した増殖因子に加え、Matrigel（登録商標）において（及びインサイツでの基底膜において）見出されるマトリックス構成要素、又はそのタンパク質分解産物は、本モデルをすでに記載されたフィブリンゲル血管新生モデルに対して相補的にするEC管形成について刺激性であり得る（Blood, CHらの文献（Biochim. Biophys. Acta 1990, 1032:89-118）、Odedra, Rらの文献（Pharmac. Ther. 1991, 49: 111-124））。

（5．8．3．4．細胞増殖の阻害についてのアッセイ）
ECの増殖を阻害する本発明のAb及び/又は複合体の能力は、96ウェルフォーマットにおいて決定され得る。I型コラーゲン（ゼラチン）を使用して、プレートのウェルをコーティングする（PBSにおける0.1〜1mg/mL、ウェルあたり0.1mL、室温で30分間）。プレートを洗浄した後（PBSを使用して3回）、3〜6×10³個をウェルあたり播種し、0.1〜2％のFBSを補充した内皮増殖培地（EGM；Clonetics）又はM199培地において4時間付着させる（37℃/5％CO₂）。培地及び付着していない細胞を4時間の終了時に除去し、bFGF（1〜10ng/mL）又はVEGF（1〜10ng/mL）を補充した新鮮培地を各ウェルへ添加する。検査されるべき抗体及び/又は複合体を最後に添加し、プレートを24〜48時間インキュベートさせる（37℃/5％CO₂）。色素原化合物MTS（Promega）を各ウェルへ添加し、1〜4時間インキュベートさせる。各ウェルにおける発色は細胞数に直接比例しており、それにより細胞を計数するための代理として機能する。490nmで読み取られた吸光度を使用して、細胞数、すなわち、対照ウェルと検査Ab及び/又は複合体を含有するウェルとの間の増殖の差異を決定する。

また、培養された接着性腫瘍細胞を採用する同様のアッセイが使用され得る。しかしながら、コラーゲンは、本フォーマットにおいて省略され得る。腫瘍細胞（例えば、3〜10×10³個/ウェル）を播種し、一晩接着させる。次に、無血清培地を添加し、細胞を24時間同期化させる。次に、培地＋10％FBSを各ウェルへ添加して、増殖を刺激する。検査されるべき抗体及び/又は複合体は、ウェルのいくつかに含まれる。24時間後、MTSをプレートへ添加し、上述のようにアッセイを展開し及び読み取る。

（5．8．3．5．細胞傷害性に関するアッセイ）
Ab及び/又はその複合体の抗増殖性及び細胞傷害性効果は、腫瘍細胞、線維芽細胞及びマクロファージを含む多様な細胞種について決定され得る。放射線治療剤又は毒素等の治療成分へ複合されたAbを検査する場合、これは特に有用である。例えば、本発明のAbの1つと、¹³¹Iを使用してヨウ素化されたボルトンハンター試薬との複合体は、（たいがいアポトーシスを誘導することによって）uPARを発現する細胞の増殖を阻害すると期待されるであろう。抗増殖性効果は、腫瘍細胞及び刺激された内皮細胞に対して期待されるであろうが、いくつかの環境下では、静止状態の内皮細胞又は正常なヒト皮膚線維芽細胞に対してはそうではない。正常細胞において観察される抗増殖性又は細胞傷害性効果は、複合体の非特異的毒性を表し得る。

典型的なアッセイは、96ウェルプレートにおいてウェルあたり5〜10,000個の密度で細胞を播種することを包含する。検査されるべき化合物を10倍濃度で添加し、結合アッセイにおいてIC₅₀を測定し（これは、複合体に応じて変動するであろう）、細胞を30分間インキュベートさせる。細胞を培地で3回洗浄した後、{³H}チミジン（1μCi/mL）を含有する新鮮培地を細胞へ添加し、5％CO₂において37℃で24及び48時間インキュベートさせる。1M NaOHを使用して多用な時点で細胞を溶解し、βカウンタを使用してウェルあたりの計数を決定する。細胞総数を測定するために、MTS試薬又はCyQuant（登録商標）を使用して、増殖を非放射能測定し得る。（細胞溶解を測定する）細胞傷害性アッセイのために、Promega96ウェル細胞傷害性キットを使用する。抗増殖活性の証拠がある場合、TumorTACS（Genzyme）を使用して、アポトーシスの誘導を測定し得る。

（5．8．3．6．カスパーゼ3活性に関するアッセイ）
カスパーゼ3の活性化を測定することによって、ECのアポトーシスを促進するAb及び/複合体の能力を決定する。I型コラーゲン（ゼラチン）を使用して、P100プレートをコーティングし、5×10⁵個のECをEGM＋10％FBSに播種する。（37℃/5％CO₂で）24時間後、培地をEGM＋2％FBS、10ng/mL bFGF及び所望の検査化合物によって置換する。6時間後に細胞を回収し、細胞可溶化液を1％トリトンX-100界面活性剤において調製し、製造元の説明書に従ってEnzChek（登録商標）カスパーゼ3アッセイキット#1（Molecular Probes）を使用して、可溶化液をアッセイする。

（5．8．3．7．皮下腫瘍成長の異種移植モデル）
ヒト卵巣癌

治療されていない患者由来の腫瘍組織から、A2780ヒト卵巣癌の系を確立した。2mMグルタミン、0.01mg/mLウシインスリン、及び10％FBSを補充したRPMI1640培地における単層としてA2780細胞を維持する（Hamilton, TCらの文献（Sem. Oncol. 1984; 77:285-293）、Behrens, BCらの文献（Cancer Res. 1987; 47:414-418））。200万個のA2780をヌードBalb/c雌マウスの右側側腹部に接種する。処置前に、A2780腫瘍を50〜200mm³へ段階分けする。IgG対照Ab及び抗D2D3uPAR mAbを腹腔内経路によって、月曜日及び金曜日の週2回10mg/kgで投与する。シスプラチン処置群を1000mm³へ段階分けし、動物は1週間に1回6mg/kgを受けた。腫瘍の体積を週2回測定した。屠殺時に、各動物から血漿を得、腫瘍を摘出する。腫瘍の半分を生化学的評価のために瞬時凍結し、残りを組織学的評価のために亜鉛固定液中に配置する。

ヒト肺癌

58歳の男性コーカサス人由来の肺癌組織の外植片培養を通じて、ヒト肺癌（ATCCカタログ番号CCL-185）細胞系であるA549を確立した（Giard, DJらの文献（J. Natl. Cancer Inst. 57:1417-23 (1973)））。2mMのL-グルタミン、0.15％NaHCO₃、及び10％FBSを補充したHamのF12K培地においてA549細胞を維持する。

C.B-17/Sys（scid/scid）重症複合免疫不全（SCID）雌マウスの右側側腹部に、約10⁶個のA549癌細胞を接種する。好ましくは、腫瘍接種後の日に処置を開始する。IgG対照Ab（及びPBS対照）並びに抗D2D3uPAR mAb ATN-658を、月曜日及び金曜日の週2回10mg/kgで腹腔内投与する。最初に、腫瘍の体積を週1回測定する。何れかの処置群における体積が300mm³を超過する場合、測定結果を週2回得る。

屠殺時に、各動物から血漿を得、腫瘍を摘出する。腫瘍の半分を生化学的評価のために瞬時凍結し、残りを組織学的評価のために亜鉛固定液中に配置する。

（5．8．3．8．転移に関する異種移植モデル）
Crowleyらの文献（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993, 90 5021-5025）のものなどの実験的転移モデルを使用して、Ab及び/又は複合体を後期転移の阻害について検査する。後期転移は、腫瘍細胞が付着し及び血管外遊出し、局所的に浸潤し、播種し、増殖し及び血管新生を誘導する段階を包含する。リポーター遺伝子、好ましくは緑色蛍光タンパク質（GFP）遺伝子を、しかし代替物としてクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）、ルシフェラーゼ又はLacZをコードする遺伝子を形質移入されたヒト前立腺癌細胞（PC-3）をヌードマウスへ接種する。これらの細胞の運命を追跡するために、本アプローチによって、これらのマーカーの何れかの利用が可能となる（多様な酵素のGFPの蛍光検出又は組織化学的比色検出）。細胞を好ましくは静脈内注射し、好ましくは肺において、しかしまた、限局的なリンパ節、大腿骨及び脳において約14日後に転移を同定する。このことは、ヒト前立腺癌において転移を自然発生する器官親和性を模倣する。例えば、GFPを発現するPC-3細胞（マウスあたり10⁶個）をヌード（nu/nu）マウスの尾静脈へ静脈内注射する。初期相を毎日付与される100μg/動物/日で検査組成物を使用して動物を処置する。蛍光顕微鏡又は光学顕微鏡組織化学によって、又は組織を粉砕すること及び検出可能な標識の定量的比色アッセイによって、単一の転移性細胞及び病巣を可視化し及び定量する。

（5．9．キット）
本発明は、本発明のuPAR抗体を充填した1つ以上の容器を含む医薬パック又はキットを提供する。さらに、また、癌の処置に有用な1つ以上の他の予防剤又は治療剤は、医薬パック又はキットに含まれ得る。また、本発明は、本発明の医薬組成物の成分の1つ以上を充填した1つ以上の容器を含む医薬パック又はキットを提供する。場合によりこのような容器とともに、医薬品又は生物製剤の製造、使用又は販売を管理する政府官庁によって指示された形態の注意書きがあり得、該注意書きは、ヒトの投与のための製造、使用又は販売に関する官庁による認可を反映する。

本発明は、上述の方法において使用され得るキットを提供する。一実施態様において、キットは、本発明の1つ以上のuPAR抗体を含む。別の実施態様において、キットはさらに、1つ以上の容器において、癌の処置に有用な1つ以上の他の予防剤又は治療剤を含む。ある実施態様において、他の予防剤又は治療剤は化学療法剤である。他の実施態様において、予防剤又は治療剤は、生物学的治療剤又はホルモン治療剤である。

（5．10．一般的な方法）
分子生物学の一般的な方法は、当技術分野において十分に記載されてきた（Sambrookらの文献（分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）2版（又はその後の版）, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989）、Ausubel, Fらの文献（分子生物学における最新プロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）, Vol. 2, Wiley-Interscience, New York, 最新版）、Krieglerらの文献（遺伝子の転移及び発現：実験室マニュアル（Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual） (1990)）、Glover, DMの文献（DNAクローニング：実用的アプローチ（DNA Cloning: A Practical Approach）, vol. I & II, IRL Press, 1985）、Alberts, B.らの文献（細胞の分子生物学（Molecular Biology of the Cell）, 4版（又はその後の版）, Garland Publishing社, New York, NY (2002)）、Watson, JDらの文献（組換えDNA（Recombinant DNA）, 2版（又はその後の版）, WH Freeman & Co.）、2版（1993）、及びOld, RWらの文献（遺伝子操作の原理：遺伝子工学への入門書（Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering）, 5版（又はその後の版）, Univ. of Calif. Press, Berkeley (1994)））。

記載において、免疫学、細胞生物学、及び分子生物学の当業者に公知の多様な方法論に対する引用が実施される。引用が実施されるこのような公知の方法論を示す刊行物及び他の材料は、まるで完全に示されているかのように、それらのすべての内容が全体として引用により本明細書中に組み込まれている。免疫学の一般的な原理を示す標準的な引用研究は、Abbas, AKらの文献（細胞及び分子免疫学（Cellular and Molecular Immunology）（4版）, W. B. Saunders Co., Philadelphia, 2000、Janeway, CAらの文献（免疫生物学−健康及び疾病における免疫系（Immunobiology. The Immune System in Health and Disease）, 4版, Garland Publishing Co., New York, 1999）、Roitt, Iらの文献（免疫学（Immunology）, （最新版）C. V. Mosby Co., St. Louis, MO (1999)）、Klein, Jの文献（免疫学（Immunology）, Blackwell Scientific Publications社, Cambridge, MA, (1990)）を含む。

別段の記載がなければ、具体的な核酸配列は、その保存的置換バリアント（例えば、変性コドン置換）及び相補的な配列を包含する。「核酸」という用語は、「ポリヌクレオチド」と同義であり、遺伝子、cDNA分子、mRNA分子、及びオリゴヌクレオチド等のこれらの何れかの断片、およびさらにその等価物を含むよう企図される（以下により完全に説明される）。核酸のサイズは、キロベース（kb）又は塩基対（bp）の何れかとして記載される。これらは、アガロース又はポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）、ユーザーによって決定され又は刊行された核酸配列に由来する概算値である。タンパク質のサイズは、キロダルトン（kDa）における分子量として又は長さ（アミノ酸残基の数）として記載される。タンパク質のサイズは、PAGEから、配列決定から、コードする核酸配列に基づいた推定アミノ酸配列から、又は刊行されたアミノ酸配列から概算される。

特に、本発明のポリペプチドと一致するアミノ酸配列又はその活性バリアントをコードするDNA分子は、本明細書に開示されるタンパク質の配列に由来するプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応（PCR）（例えば、米国特許第4,683,202号参照）によって合成できる。次に、これらのcDNA配列は、真核又は原核発現ベクターへと構築でき、結果として生じるベクターは、融合ポリペプチド若しくはその断片又は適切な宿主細胞、例えばCOS又はCHO細胞による誘導体の合成を指図するのに使用できる。

本発明の核酸配列は、DNA又はRNAであり得る。

本ポリペプチドを発現させるために形質転換され又は形質移入された原核又は真核宿主細胞は、本発明の範囲内である。例えば、ポリペプチドは、イー・コリ、昆虫細胞（バキュロウイルス）、酵母、又はチャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO）若しくは（形質移入された細胞のヒトでの治療的使用に好ましい）ヒト細胞等の哺乳動物細胞において発現し得る。他の適切な宿主は、当業者に公知である。真核細胞における発現によって、部分的な又は完全なグリコシル化、及び/又は組換えポリペプチドの関連する鎖間又は鎖内ジスルフィド結合の形成が生じる。酵母サッカロミセス・セレビシアにおける発現のためのベクターの例は、pYepSec（Baldariらの文献（1987, EMBOJ. 6: 229-234））、pMFa（Kurjanらの文献（1982 Cell 30: 933-943））、pJRY88（Schultzらの文献（1987, Gene 54: 113-123））、及びpYES2（Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.）を含む。培養された昆虫細胞（SF 9細胞）におけるタンパク質の発現に利用可能なバキュロウイルスベクターは、pAcシリーズ（Smithらの文献（1983, Mol. Cell Biol. 3:2156-2165））及びpVLシリーズ（Lucklowらの文献（(1989) Virology 170:31-39））を含む。一般的に、COS細胞（Gluzmanの文献（1981 Cell 23:175-182））は、哺乳動物細胞における一過性増幅/発現のために、pCDM8等のベクター（Aruffoらの文献（上述））とともに使用されるのに対し、CHO（dhfr陰性CHO）細胞は、哺乳動物細胞における安定した増幅/発現のためにpMT2PC等のベクター（Kaufmanらの文献（1987, EMBOJ. 6: 187-195））とともに使用される。NSO骨髄腫細胞系（グルタミン合成酵素発現系）は、Celltech Ltd.より市販される。

所望のコード配列及び対照配列を含有する適切なベクターの構築は、当技術分野で十分に理解されている標準的な連結及び制限技術を採用する。単離されたプラスミド、DNA配列、又は合成されたオリゴヌクレオチドは、切断され、目的に合わせて作られ、及び所望の形態に再度連結される。ベクターを形成するDNA配列は、多くの供給源より入手可能である。

骨格ベクター及び制御系は一般的に、構築における配列のバルクに使用される利用可能な「宿主」ベクターにおいて見出される。適切なコード配列について、最初の構築は、cDNA又はゲノムDNAライブラリから適切な配列を検索することであり得、通常そうである。しかしながら、一旦配列が開示されると、個々のヌクレオチド誘導体から出発して、インビトロでの遺伝子全体の配列を合成することは可能である。500〜1000bpの範囲の長さの遺伝子についての遺伝子全体の配列は、個々の重複する相補的なオリゴヌクレオチドを合成し、デオキシリボヌクレオチド三リン酸の存在下でDNAポリメラーゼを使用して、一本鎖形成された重複していない部分に充填することによって調製され得る。本アプローチは、公知の配列のいくつかの遺伝子の構築において成功裏に使用されてきた。例えば、Edgeの文献（Nature 1981, 292:756）、Nambairらの文献（Science 1984, 223:1299）、及びJayの文献（J Biol Chem. 1984,259:6311）を参照されたい。合成オリゴヌクレオチドは、上述に引用される引用文献において記載される方法によって、又はBeaucageらの文献（Tetrahedron Lett. 1981, 22:1859）、及びMatteucciらの文献（J. Am. Chem. Soc. 1981, 103:3185）によって調製される。

所望のベクターの構成要素は、標準的な制限及び連結手法を使用して、切除でき及び連結できる。部位特異的DNA切断は、当技術分野で一般的に理解される条件下で、適切な1つの制限酵素（又は複数の酵素）を使用して処置することによって実施され、該条件の詳細は、これらの市販の制限酵素の製造元によって指定される例えば、New England Biolabs製品カタログを参照されたい。所望の場合、切断された断片のサイズ分離は、標準的なポリアクリルアミドゲル又はアガロースゲル電気泳動技術によって実施され得る（例えば、Meth. Enzymol. (1980) 65:499-560）。

多くの方法はいずれも、バリアントが組換えで作製されるべきである場合、該バリアントを生じるようコード配列へ変異を導入するために使用される。これらの変異は、単純な欠失若しくは挿入、塩基のクラスターの系統的な欠失、挿入若しくは置換又は単一塩基の置換を含む。部位特異的変異誘発によるDNA配列の修飾は、プロトコール及び試薬が市販されている周知の技術である（Zollerらの文献（Nucleic Acids Res. 1982,10:6487-6500）、Adelmanらの文献（DNA 1983, 2:183-193））。単離されたDNAは、制限によって分析され及び/又はジデオキシヌクレオチド法によって配列決定される（Sangerの文献（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1977,74:5463）、Messingらの文献（Nucleic Acids Res. 1981, 9:3091）又はMaxamらの文献（Meth. Enzymol., 上述））。

ベクターDNAは、リン酸カルシウム又は塩化カルシウム共沈殿、DEAE-デキストラン仲介性形質移入、リポフェクション、又は電気穿孔法等の従来技術を介して、哺乳動物細胞へ導入できる。宿主細胞を形質転換する適切な方法は、Sambrookらの文献（上述）及び他の標準的な教科書において見出され得る。融合発現ベクターにおいて、タンパク質分解切断部位は、リポーター基と標的タンパク質との接合時に導入され、融合タンパク質の精製後のリポーター基からの標的タンパク質の分離が可能となる。このような切断のためのタンパク質分解酵素及び該酵素の認識配列は、第Xa因子、トロンビン及びエンテロキナーゼを含む。

本発明をここまで一般的に記載したので、説明のために提供され、別段の指定がなければ本発明を制限するよう企図されるものではない、以下の実施例に対する引用を通じて、同一のことがより容易に理解されるであろう。

（6．実施例）
（6．1．材料及び方法）
（6．1．1．タンパク質を発現する細胞系）
ショウジョウバエ発現系（DES（商標）; Invitrogen社）は、キイロショウジョウバエに由来するシュナイダー2（S2）細胞系及び異種タンパク質の発現のためのプラスミドベクターを利用する。S2細胞における発現のためのプラスミドベクターは、非常に用途が広く、メタロチオネイン（MT）プロモーターによって駆動されるタンパク質の誘導可能な発現が可能となる。また、同一のプラスミドによって、細胞から周辺の培地へとタンパク質が分泌でき、タンパク質の精製を大いに簡素化させる。ベクターの複数のコピーは、S2細胞のゲノムDNAへ安定して挿入でき、タンパク質発現のレベルを増大させる。S2細胞において発現したタンパク質は、最小にグリコシル化されており、このことは、uPARのタンパク質構成要素に向かうAbの産生にとって重要である。精製後のタンパク質の典型的な収量は、25〜50mg/Lであり、約95％の純度を有する。以下のタンパク質を発現する細胞系を作製した。すなわち、suPAR、D1、D2D3、scuPA、ATF1-143、ATF1-135、Kringle47-143、及びKringle47-135である。さらに、N結合型グリコシル化部位が破壊されたsuPARについてのクローンを作製した。

（6．1．2．試薬）
Amersham Corp.から¹²⁵IをNa¹²⁵I（μgヨウ素あたり480〜630MBq［13〜17mCi］）として購入した。

（6．1．3．腫瘍細胞系）
次の細胞及び腫瘍の系を使用した。すなわち、A549、HeLa、及びA2780である。治療されていない患者由来の腫瘍組織から、A2780ヒト卵巣癌の系を確立した。2mMグルタミン、0.01mg/mLウシインスリン、及び10％FBSを補充したRPMI1640培地における単層としてA2780細胞を維持する（上述）。2mM L-グルタミン、0.15％NaHCO₃、及び10％FBSを補充したHamのF12K培地において、上述のヒト肺癌であるA549（ATCCカタログ番号CCL-185）を維持する。

A2780細胞（2×10⁶個）をヌードBalb/c雌マウスの右側側腹部に接種した。処置を開始する前に、腫瘍を50〜200mm³の範囲へ段階分けした。IgG対照抗体及び抗D2D3uPAR mAbを、月曜日及び金曜日の週2回10mg/kgで腹腔内投与した。シスプラチン処置群を1000mm³へ段階分けし、動物は1週間に1回6mg/kgを受けた。腫瘍の体積を週2回測定した。

C.B-17/Sys（scid/scid）雌マウスの右側側腹部にA549癌細胞（10⁶個）を接種した（scid：重症複合免疫不全）。腫瘍接種の後の日に処置を開始した。IgG対照Ab（及びPBS対照）並びに抗D2D3uPAR mAb ATN-658を、月曜日及び金曜日の週2回10mg/kgで腹腔内投与した。最初に、腫瘍の体積を週1回測定した。何れかの処置群における体積が300mm³を超過した場合、測定結果を週2回得た。

屠殺時に、各動物から血漿を得、腫瘍を摘出する。腫瘍の半分を生化学的評価のために瞬時凍結し、残りを組織学的評価のために亜鉛固定液中に配置する。

（6．2．uPARに対するuPAの結合）
¹²⁵I標識されたuPA及びHeLa細胞を使用して、uPARに対するuPAの結合を測定した（図２参照）。HeLa細胞は、uPARの豊富な量を発現するが、uPAを発現しない。簡潔には、Iodo-Gen（商標）ヨウ素化試薬（Pierce Biotechnology社）を使用して、scuPA100μgを[¹²⁵I]NaI100μCiで標識した。分子ふるいカラムを使用して、組み込まれていない標識されたNaIを標識されたタンパク質から除去し、0.1％ウシ血清アルブミン（BSA）を含有するトリス緩衝塩類溶液に標識されたタンパク質を溶出した。0.1％BSAを含有するPBSに希釈した[¹²⁵I]-scuPAの増大する濃度とともにHeLa細胞を4℃で2時間インキュベートした。PBS/0.1％BSAを使用して細胞を広範に洗浄し、１M NaOHを使用して細胞単層を溶解し、結合した計数の総数を決定した。標識されていないscuPAの大過剰量の存在下で細胞を[¹²⁵I]-scuPAとともにインキュベートすることによって、特異的結合を決定した。また、uPA及びuPARの両者を発現するMDA-MB231細胞を使用して、結合を実施した。scuPAの結合を決定するために、まず、0.1Mグリシン/100mM NaCl, pH3を含有する緩衝液を使用して4℃で5分間洗浄することによって、MDA-MB231細胞の表面から内在性uPAを除去する。また、本プロトコールを使用して、HeLa細胞に対する[¹²⁵I]-ATFの結合を決定した。HeLa細胞に対する[¹²⁵I]-scuPA又は[¹²⁵I]-ATFの何れかの結合を阻害するAbの能力を、標識されていないAbの増大する量とともに細胞を4℃で15分間インキュベートした後、[¹²⁵I]標識したタンパク質の添加によって決定した。

ATN-658は、HeLa細胞の表面におけるuPARに対するscuPAの結合を阻害せず（図２）、scuPAの存在下でHeLa細胞へ結合できる。従って、ATN-658は、細胞表面の占有された受容体及び占有されていない受容体の両者を標的にできる。

また、ビオチン化scuPA及びHeLa細胞を使用して、uPARに対するscuPAの結合を測定した。簡潔には、24ウェルプレートへウェルあたり150,000個でHeLa細胞を播種し、24時間後に結合アッセイを実施した。30nMビオチン-ATN-615の3mL、30nMビオチン-ATN-658の3mL及び100nMビオチン-scuPAの3mLを調製し、試薬1mLごとにつき2mLの緩衝液で連続希釈した。播種したHeLa細胞を1mLの洗浄緩衝液（1×HBSS/0.1％BSA）で2回洗浄した後、結合緩衝液（1×HBSS/0.1％BSA）においてビオチン-scuPA、ビオチン-ATN-658又はビオチン-ATN-615とともに室温で1時間インキュベートした。非特異的及び競合的結合についてアッセイするために、標識されていないATN-658、ATN-617、又はscuPAを添加できる。次に、1mLの洗浄緩衝液を使用して、細胞を2回洗浄した。250μLのアビジン-HRP（20mL緩衝液へ1μL）を各ウェルへ添加し、室温で30分間インキュベートさせた後、3回洗浄した。その後、OPD基質（250μL）を各ウェルへ添加し、黄色を発色させた後、（24ウェルプレートについて）50μLの1M H₂SO₄を使用して反応を停止した。OD490nmでの読み取りを実施して、プレートの各ウェルの色を分析した。

（6．3．インビボでのmAbの活性）
2つのモデル、すなわちA549非小細胞ヒト肺癌モデル及びA2780卵巣癌モデルにおけるインビボでの腫瘍の成長を阻害する抗体の能力について、6．1節に記載されるプロトコール及び条件を使用して抗体を検査した。腫瘍接種の後の日に処置を開始した。IgG対照Ab（及びPBS対照）並びに抗D2D3uPAR mAb ATN-658を、月曜日及び金曜日の週2回10mg/kgで腹腔内経路によって投与した。

ATN-658は、これらの両モデルにおける成長を有意に阻害した（図３及び４）。

（6．4．ATN-658エピトープの同定）
ヒトとミドリザルのuPARタンパク質配列を比較することによって、ATN-658エピトープを同定した。ATN-658はミドリザルuPARへは結合しないので、配列における差異が交差反応性のこの欠失の原因であり得ると仮説を立てた。D2D3領域においてミドリザルとヒトのuPARの間で異なるアミノ酸が9個ある（図５Ａ参照）。

非相同的ミドリザル残基の各々を、対応するヒト残基へ変化させた（例えば、アミノ酸125をMからVへ変化させ、アミノ酸192をHからRへ変化させた等）。すべてのアミノ酸番号は、すなわち22個のアミノ酸シグナルペプチドを除去した後のヒトuPARの成熟した加工された形態を指す。S2細胞における一過性発現後の変異したサルsuPARを免疫沈降させるATN-658の能力について、これらの変化の効果を評価した。結合を回復した唯一の変異は、アミノ酸268をEからKへ変異させる場合であった（図５Ｂ参照）。アミノ酸262及び264を変異させることは、サルuPARに対するATN-658の結合に何ら効果を有さなかったので、エピトープのN末端をアミノ酸265として定義した。アミノ酸267で出発するヒトuPARのアラニン系統的変異導入法は、エピトープの一部であるとして、アミノ酸277（D）を通じてアミノ酸268（K）を同定した（図６）。Vajdosらの文献（2002, J Mol Biol. 320(2):415-28）、Nisiharaらの文献（2001, J Immunol. 167(6):3266-75）、及びZhangらの文献（1999, Int Immunol. 11(12): 1935-44）を参照されたい。ヒトuPARにおいてアミノ酸268（K）、273（H）、275（D）、又は277（D）をAlaへ変異させ多結果、共免疫沈降アッセイによって示されるように、変異したヒトuPARに対するATN-658の低下した結合が生じた。エピトープは連続的であるように見えるが、uPARがATN-658によって認識される能力を低下が破壊する点において、該エピトープはコンホメーション依存的エピトープであり得る。このことは、エピトープを安定化するように見えるエピトープ（Cys266〜Cys271）内にジスルフィドループがあるという事実によるようである。エピトープ配列を以下に示す。

本配列は、成熟ヒトuPAR配列のアミノ酸265〜283を表す。該エピトープは、アミノ酸280〜283が可撓性であるように見え、結晶構造には見えないので、Q279で停止し得る。

重水素交換質量分析を使用して、成熟uPARのアミノ酸98〜114を包含するさらなる配列を同定した。Hamuroらの文献（2006, Protein Sci. 15(8): 1883-92）、Baerga-Ortizらの文献（2002, Protein Sci. 11(6): 1300-8）を参照されたい。エピトープ配列を以下に示す。

本方法は、抗体の存在下及び不存在下でタンパク質の重水素交換を測定するタンパク質におけるエピトープに対する抗体の結合は、重水素を交換する該エピトープの能力を低下させ、質量分析を使用して抗体の存在下又は不存在下で重水素交換を受けるタンパク質由来のタンパク質分解性消化物の比較は、エピトープにおいて低下した重水素交換を検出することによって、結合したエピトープを局在化させる（図７Ａ）。従って、ATN-658の存在下及び不存在下での質量分析によって、suPAR D2D3の重水素交換を分析した。図７Ｂ及び７Ｃは、2つの独立した重水素交換実験から得られた結果を呈する。図７Ｂ及び７Ｃにおいて、ATN-658の存在下及び不存在下でのD2D3 suPARの各アミノ酸残基において検出された重水素化のレベルを示す。また、ATN-658の存在下及び不存在下でのD2D3 suPARの各アミノ酸残基において検出された重水素化のレベルにおける差異を示す。ATN-658の存在下で保護の最高の程度を有する2つのエピトープ配列を同定した。すなわち、（部位特異的変異誘発を使用して同定されたエピトープにおいて包含される）アミノ酸268〜277を包含する領域（配列番号16）及びアミノ酸98〜114を包含する第二の領域（配列番号14）である（図７Ｂ及び７C参照）。特に、酸268〜277を包含する領域（配列番号16）は、D2D3 suPARの他のすべての領域と比較して、ATN-658の存在下及び不存在下での重水素化のレベルにおける最大の差異を有した。

（6．5．ビオチン化ATN-658を使用してATN-658と同一のエピトープを認識する抗体についてのアッセイ）
製造元の説明書に従って、EZ-link（商標）スルホ-NHS-LC-ビオチン（Pierce Biotechnology社）を使用して、抗D2D3抗体であるATN-658をビオチン化する。典型的には、ビオチン標識試薬の20倍のモル過剰量を使用してATN-658を標識し、分子ふるいカラムを使用して、組み込まれていないビオチンを、標識されたAbから除去する。標識された抗体が、uPARに対する親和性を保持したことを確認するために、suPARに対する結合について、ビオチン-ATN-658をELISAアッセイにおいて検査する。HRP複合型ストレプトアビジンを使用して、結合したビオチン-ATN-658を検出する。ATN-658と同一のエピトープを認識する抗体を同定するために、競合アッセイを実施する。簡潔には、suPAR100ng/ウェルを使用して、96ウェルのEIA/RIA高タンパク質結合プレートを4℃で一晩コーティングする。1％カゼインによる非特異的結合の遮断の後、プレートをPBSで洗浄し、0.2nMビオチン-ATN-658を含有するPBS/0.1％カゼインにおいて希釈した検査されるべき抗体を、適切なウェルへ添加する。プレートを室温でさらに1時間インキュベートし、PBS/0.05％トゥイーン20で広範に洗浄し、HRP複合型ストレプトアビジン及び適切な基質を使用して、結合したビオチン-ATN-658を検出する。

当業者は、本明細書に記載される本発明の特定の実施態様に対する多くの均等物を認識するであろうし、又はわずかな所定の実験を使用して該均等物を確認できるであろう。 このような均等物は、以下の特許請求の範囲によって包含されるよう企図される。

本明細書において記載されるすべての刊行物、特許及び特許出願は、各個々の刊行物、特許又は特許出願が、引用により本明細書中に組み込まれるよう具体的に及び個々に記載された場合と同一の程度まで、明細書への引用により本明細書中に組み込まれている。

Claims (40)

1. アミノ酸配列
   

   

   からなる、単離されたペプチド。
2. 単離されたペプチドであって、その配列が、（i）ヒトuPARアミノ酸配列（配列番号15）の断片からなり；かつ（ii）アミノ酸配列
   

   

   を含み；前記ペプチドが100個までのアミノ酸長さである、前記単離されたペプチド。
3. 前記ペプチドが、アミノ酸配列
   

   

   からなる、請求項１記載の前記単離されたペプチド。
4. 前記単離されたペプチドの配列が、（i）ヒトuPARアミノ酸配列（配列番号15）の断片からなり；かつ（ii）アミノ酸配列
   

   

   を含み；前記ペプチドが100個までのアミノ酸長さである、請求項２記載の単離されたペプチド。
5. 前記ペプチドが、アミノ酸配列
   

   

   からなる、請求項１記載の単離されたペプチド。
6. 前記単離されたペプチドの配列が、（i）ヒトuPARアミノ酸配列（配列番号15）の断片からなり；かつ（ii）アミノ酸配列
   

   

   を含み；前記ペプチドが100個までのアミノ酸長さである、請求項２記載の単離されたペプチド。
7. 前記ペプチドが、50個までのアミノ酸長さである、請求項２、４及び６の何れか一項記載の単離されたペプチド。
8. 前記ペプチドが、30個までのアミノ酸長さである、請求項２、４及び６の何れか一項記載の単離されたペプチド。
9. 前記ペプチドが、20個までのアミノ酸長さである、請求項２、４及び６の何れか一項記載の単離されたペプチド。
10. 断片のアミノ末端が、アミノ酸番号93〜98の何れか一つにあり、かつ前記断片のカルボキシ末端が、アミノ酸番号277〜283の何れか一つにある、ヒトuPAR（配列番号15）の単離された断片、又は前記断片の配列と比較して保存的置換のみを含有するその誘導体。
11. 抗体を製造する方法であって、
    （i）請求項１〜９の何れか一項記載のペプチドを使用して哺乳動物を免疫化すること；
    （ii）該哺乳動物から脾細胞を単離すること；
    （iii）該脾細胞を骨髄腫細胞へ融合させること；及び
    （iv）該ペプチドを結合する抗体を分泌するハイブリドーマを選別すること
    を含む、前記方法。
12. 抗体を製造する方法であって、
    （i）請求項１０記載の断片又は誘導体を使用して哺乳動物を免疫化すること；
    （ii）前記哺乳動物から脾細胞を単離すること；
    （iii）前記脾細胞を骨髄腫細胞へ融合させること；及び
    （iv）前記断片を結合する抗体を分泌するハイブリドーマを選別すること
    を含む、前記方法。
13. 抗体を製造する方法であって、
    （i）（a）
    

    

    ；及び（b）
    

    

    によって定義されるコンホメーション依存的エピトープを含むペプチドを使用して哺乳動物を免疫化すること；
    （ii）前記哺乳動物から脾細胞を単離すること；
    （iii）前記脾細胞を骨髄腫細胞へ融合させること；及び
    （iv）前記ペプチドを結合する抗体を分泌するハイブリドーマを選別すること
    を含む、前記方法。
14. アミノ酸配列
    

    

    によって定義されるエピトープへ免疫特異的に結合する、単離された抗体、又はその抗原結合断片。
15. （i）
    

    

    ；及び（ii）ヒトuPAR（配列番号15）内での
    

    

    によって定義されるコンホメーション依存的エピトープへ免疫特異的に結合する、単離された抗体、又はその抗原結合断片。
16. ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体の下流シグナル伝達を調節し、又は細胞の表面上でuPARのレベルを制御する、請求項１４又は１５記載の抗体、又はその抗原結合断片。
17. 下流シグナル伝達の前記調節が、（a）フィブロネクチンのuPAR仲介性集合、（b）インテグリンα5v1に対するフィブロネクチン若しくはその断片の結合又は（c）ビトロネクチン成分の集合に干渉し及び阻害する、請求項１６記載の抗体、又はその抗原結合断片。
18. 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１４〜１７の何れか一項記載の前記抗体、又はその抗原結合断片。
19. 前記モノクローナル抗体がIgGである、請求項１４〜１８の何れか一項記載の抗体、又はその抗原結合断片。
20. 前記抗体がscFvである、請求項１４〜１９の何れか一項記載の抗体、又はその抗原結合断片。
21. 前記抗体がヒト抗体、ヒト化抗体又はキメラ抗体である、請求項１４〜１９の何れか一項記載の抗体、又はその抗原結合断片。
22. 二重特異性抗体である、請求項１４〜１９及び２１の何れか一項記載の抗体、又はその抗原特異的断片。
23. 検出可能な標識へ複合された、請求項１４〜２２の何れか一項記載の前記抗体、又はその抗原結合断片。
24. 前記検出可能な標識が、放射性核種、PET造影剤、MRI造影剤、フルオレサー、フルオロゲン、発色団、色素原、ホスホレサー、ケミルミネサー又はバイオルミネサーである、請求項２３記載の前記抗体、又はその抗原結合断片。
25. 前記放射性核種が、³H、¹⁴C、³⁵S、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、⁷²As、⁸⁹Zr、⁹⁷Ru、⁹⁹Tc、¹¹¹In、¹²³I、¹²⁵I、¹³¹I、¹⁶⁹Yb及び²⁰¹Tlからなる群より選択される、請求項２４記載の抗体、又はその抗原結合断片。
26. 前記標識が、フルオレセイン、ローダミン、ダンシル、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、o-フタルアルデヒド、フルオレサミン、フルオレセイン誘導体、オレゴングリーン、ローダミングリーン、ロドルグリーン及びテキサスレッドからなる群より選択されるフルオレサー又はフルオロゲンである、請求項２３記載の抗体、又はその抗原結合断片。
27. 治療薬へ複合された、請求項１４〜２２の何れか一項記載の抗体、又はその抗原結合断片。
28. 前記治療薬が、化学療法剤、毒素または治療用放射性核種である、請求項２７記載の抗体、又はその抗原結合断片。
29. 請求項１４〜２８の何れか一項記載の抗体、又はその抗原結合断片；及び医薬として許容される担体を含む、医薬組成物。
30. 細胞の望ましくない遊走、浸潤、増殖又は血管新生と関連した細胞を、請求項２９記載の医薬組成物の有効量と接触させることを含む、細胞遊走、細胞浸潤、細胞増殖又は血管新生を阻害するための、又はアポトーシスを誘導するための、方法。
31. 請求項２９記載の医薬組成物の治療的有効量を対象へ投与することを含む、望ましくない血管新生、腫瘍成長及び/又は腫瘍転移を特徴とする疾病、障害又は状態を有する該対象を処置する方法。
32. ヒトuPARにおける位置273にあるHis残基がAlaへ変異される場合（uPAR H273A）、又はヒトuPARにおける位置268にあるLys残基がGluへ変異される場合（uPAR K268E）、エピトープに対する結合が前記抗体による前記結合における低下によって示される、請求項１４〜２８の何れか一項記載の前記抗体、又はその抗原結合断片。
33. 前記低下が少なくとも50％前記結合を低下させる、請求項３２記載の抗体、又はその抗原結合断片。
34. 前記抗体とuPAR H273A又はuPAR K268Eとのそれぞれの免疫共沈降によって示されるように、前記低下が、uPAR H273A又はuPAR K268Eに対する結合を検出し損なう結果を生じる、請求項３３記載の抗体。
35. 前記結合における低下が、該抗体とuPAR H273A又はuPAR K268Eとのそれぞれの免疫共沈降によって示され、かつ該抗体とともに免疫共沈降するuPAR H273A又はuPAR K268Eの量が、該抗体とともに免疫共沈降する野生型uPARの量と比較して低下する、請求項３２記載の抗体、又はその抗原結合断片。
36. 前記エピトープに対する結合が重水素交換アッセイによって示され、かつ前記抗体の不存在下での該エピトープ上での重水素レベルと比較して、ヒトuPARのドメイン2及び3からなる断片（D2D3 uPAR）が結合条件下で該抗体と接触する場合、該エピトープに対する結合が、該エピトープ上での重水素レベルにおける低下によって示される、請求項１４〜２８の何れか一項記載の抗体、又はその抗原結合断片。
37. 重水素レベルの低下が少なくとも30％である、請求項３６記載の抗体、又はその抗原結合断片。
38. 薬剤として使用するための、請求項１４〜２８の何れか一項記載の抗体、又はその抗原結合断片。
39. 望ましくない血管新生、腫瘍成長及び/又は腫瘍転移を特徴とする疾病、障害又は状態を有する対象を処置するための薬剤として使用するための、請求項１４〜２８の何れか一項記載の抗体、又はその抗原結合断片。
40. 望ましくない血管新生、腫瘍成長及び/又は腫瘍転移を特徴とする疾病、障害又は状態を有する対象を処置するための薬剤の製造における、請求項１４〜２８の何れか一項記載の抗体、又はその抗原結合断片の、使用。

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