ES2636451T3 - Epítopo del receptor del activador del plasminógeno tipo uroquinasa - Google Patents

Abstract

Péptido aislado de hasta 40 aminoácidos que comprende la secuencia de aminoácidos CCTKSGCNHPDLDVQYRSG, CCTKSGCNHPDLDVQYRS, CCTKSGCNHPDLDVQYR, CCTKSGCNHPDLDVQY o CCTKSGCNHPDLDVQ, donde el segundo y el tercer residuo de cisteína de la secuencia son disulfuros unidos entre sí formando un enlace disulfuro.

Description

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DESCRIPCION

Epftopo del receptor del activador del plasminogeno tipo uroquinasa.

Sector de la tecnica

La presente invencion se refiere a un epftopo del receptor del activador del plasminogeno tipo uroquinasa (uPAR). Tambien se divulgan anticuerpos monoclonales que se unen inmunoespecfficamente a este epftopo y usos de los mismos para el tratamiento o prevencion de una enfermedad, por ej., el cancer. Estos anticuerpos pueden inhibir la interaccion de complejos uPA/uPAR con otras moleculas con las que interaction estos complejos. Los anticuerpos pueden ser utilizados en metodos terapeuticos y de diagnostico, particularmente del cancer.

Estado de la tecnica

Un elevado volumen de pruebas procedentes de estudios in vitro e in vivo ha establecido que el sistema activador del plasminogeno tipo uroquinasa (uPA) es fundamental para el proceso de metastasis, convirtiendolo en un objetivo prometedor para el desarrollo de medicamentos para el cancer, (Mazar, AP et al. (1999) Angiogenesis 3: 15-32). Ademas del uPA, su receptor de la superficie celular (uPAR) es otro objetivo adecuado para el diseno y desarrollo de agentes de diagnostico y terapeuticos para el cancer (Mazar, AP (2001) Anti-Cancer Drugs 12: 397-400) porque:

(a) uPAR se expresa selectivamente en algunas celulas tumorales, celulas endoteliales angiogenicas ("ECs") y otras celulas asociadas a tumores, como celulas inflamatorias asociadas a tumores y fibroblastos asociados a tumores, pero no en la mayorfa de celulas normales, quiescentes;

(b) uPAR es un importante participante en varias vfas intracelulares y extracelulares necesarias para la metastasis que actualmente son objeto de intensos esfuerzos de desarrollo de medicamentos; y

(c) es posible interferir en varios puntos diferentes a lo largo de la via del uPA. Por lo tanto, uPA y uPAR son objetivos prometedores para el desarrollo de terapias y diagnosticos utiles contra muchos tipos diferentes de tumores/canceres.

uPAR asociado a membranas es una protefna anclada a glicosilfosfatidilinositol (GPI) (Slound, E.M., Blood 105:1847-1848 (2005)). uPAR se compone de tres dominios; el dominio 1 (D1) es el dominio N-terminal, el dominio 2 (D2) conecta el D1 al dominio 3 (D3), y D3 es el dominio C-terminal que ancla la molecula a la membrana celular a traves de un extremo GPI a Gly283 de D3 (Montuori et al., J. Biol, Chem. 277:46932-46939 (2002); Dano et al., Fibrinolysis 8:189-203 (1994)). Cuando uPAR se escinde en la molecula de anclaje GPI por la fosfolipasa C (Ploug et al., J Biol Chem. 266:1926-1933 (1991)) o por la fosfolipasa D, se libera de la membrana celular uPAR soluble (suPAR) (Wilhelm et al., J. Cell Physiol. 180:225-235 (1999)).

El Sistema uPA/uPAR y el cancer

La metastasis y la angiogenesis comparten muchas caracterfsticas funcionales comunes que caracterizan los procesos invasivos y migratorios de celulas tumorales y ECs. Estas caracterfsticas incluyen (1) la concentracion de proteasa y expresion de integrinas, (2) la perdida de contactos celula-celula y celula-matriz, (3) el aumento de la respuesta a factores de diferenciacion y crecimiento, y (4) la remodelacion de la matriz extracelular (ECM) y membrana basal (BasM). Todas ellas contribuyen a la progresion tumoral.

El "sistema" uPA, que comprende la serina proteasa uPA, su receptor uPAR y su inhibidor serpina especffico, inhibidor del activador del plasminogeno tipo 1 (PAI-1), desempena un papel central en muchas de estas actividades. La actividad de este sistema es responsable de:

(1) iniciar cascadas que tienen como resultado la activacion del plasminogeno, activando varias pro- metaloproteasas (proM-MPs),

(2) liberacion y procesado de factores de crecimiento latentes como el factor-2 de crecimiento de fibroblastos (FGF-2), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), y factor-p de crecimiento transformante (TGFp),

(3) (a) interacciones con componentes de ECM tales como vitronectina (Vn) y fibronectina (Fn), (b) interacciones directas con varias integrinas incluyendo a5p1 y avp3 y (c) remodelar el BasM y ECM para promover la motilidad celular.

Ademas, el sistema uPA tambien puede iniciar la renovacion de fibrinas localizadas que puede desempenar un papel en la angiogenesis.

La expresion de uPA y uPAR ha sido demostrada en numerosos tipos de tumores incluyendo el glioblastoma, carcinomas celulares renales, hepatocelulares, de prostata, mama y colon (Mizukami IF et al. (1994) Clin Immunol y Immunopathol 71:96-104; Hsu DW et al., (1995) Am J Pathol 147:114-23; de Witte JH et al. (1999) Br J Cancer 79:1190-8). La expresion de uPA y uPAR es normalmente mayor en formas de enfermedad mas agresivas. En celulas tumorales, esta expresion suele ser mayor en el frente invasivo del tumor (Buo, L et al., (1995) Human Pathol

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26:1133-1138; Yamamoto M et al. (1994) Cancer Res 54:5016-5020). Se ha registrado una fuerte tincion inmunohistoqufmica para uPAR en vasos sangufneos asociados al frente invasivo de carcinomas celulares renales, de colon y mama (Bastholm L et al. Appl Immunohistochem Mol Morphol 7: 39-47; Nakata S et al. (1998) Int. J. Cancer 79:179-186). En el estudio del carcinoma de colon, uPAR se ha colocalizado con VEGF. La expresion de uPA y uPAR tambien ha sido observada en macrofagos asociados a tumores en varios tipos de tumores (Ohtani H et al.) (1995) Int J Cancer 62:691-6; Xu Y et al. (1997) Hum Pathol 28:206-13). uPA es quimiotactico para monocitos y actua de mediador tanto en la adhesion como en la migracion de estas celulas. La adhesion y migracion requieren unicamente la presencia de uPAR aunque no la actividad catalftica de uPA. Por lo tanto, se cree que el sistema uPA contribuye a la progresion tumoral actuando sobre multiples tipos de celulas asociadas a tumores.

Varios estudios recientes han evaluado el potencial terapeutico de inhibir la union de uPA a uPAR en sistemas singenicos. El suministro de un fragmento de uPA amino-terminal de murino codificado por adenovirus ("ATF" en abreviatura -- este es el dominio de uPA que contiene la zona de union uPAR) directamente a los tumores tuvo como resultado (a) la supresion de neovascularizacion y (b) detencion del crecimiento del tumor (Li H et al. (1998) Gene Ther 5:1105-1113). Debido a la "especificidad" de la especie, cabrfa esperar que el ATF de murino se uniera solamente a ECs huespedes de murino y leucocitos, no a celulas tumorales humanas. Ello indica que la inhibicion tumoral fue propiciada por la supresion de la respuesta angiogenica del huesped. Finalmente se produjo un anticuerpo policlonal en contra de un fragmento de residuo-100 de uPAR de rata selectivamente localizado en un tumor de mama de rata que crecio a partir de celulas de la lfnea celular Mat BIII (Rabbani SA et al. (2002) Cancer Res 62: 2390-97). Este anticuerpo policlonal inhibio completamente el crecimiento del tumor y produjo la regresion tumoral.

Lamentablemente, a pesar de la promesa de tener como objetivo el sistema uPA a efectos terapeuticos y de diagnostico, los esfuerzos de la investigacion no han tenido como resultado el desarrollo de agentes adecuados para casos clfnicos. Los enfoques de moleculas pequenas se han visto obstaculizados por (1) la dificultad de inhibir de forma potente la interaccion protefna-protefna (por ej., uPA-uPAR o uPAR-integrina), y (2) la falta de pistas adecuadas o de informacion sobre estructuras susceptibles de conducir a desarrollos de la qufmica medicinal. Se han identificado varios peptidos inhibidores potentes de la interaccion uPA-uPAR pero se verfan afectados de las normalmente malas propiedades farmacologicas de los peptidos y no han mostrado los niveles necesarios de actividad incluso en ensayos basados en celulas (Ploug M et al. (2001) Biochemistry 40:12157-68).

Descripcion breve de la invencion

La presente invencion se basa, en parte, en la caracterizacion del epftopo del anticuerpo monoclonal especffico del uPAR, ATN-658. Por consiguiente, la presente invencion proporciona un peptido aislado o purificado consistente en la secuencia de aminoacidos CCTKSGCNHPDLDVQYPSG (SEQ ID NO: 9), CCTKSGCNHPDLDVQYPS (SEQ ID NO: 10), CCTKSGCNHPDLDVQYP (SEQ ID NO: 11), CCTKSGCNHPDLDVQY (SEQ ID NO: 12), o

CCTKSGCNHPDLDVQ (SEQ ID NO: 13). La secuencia del epftopo tambien puede formar parte de una secuencia mas larga, por ej., 20, 25, 30, 35, 40 aminoacidos, donde la secuencia mas larga es un fragmento de uPAR humano y comprende la secuencia del epftopo.

En un modo de realizacion, la presente invencion proporciona metodos de producir un anticuerpo, que consisten en (i) inmunizar un mamffero no humano con un peptido (opcionalmente, purificado) de la invencion; (ii) aislar esplenocitos de dicho mamffero; (iii) fusionar dichos esplenocitos a celulas de mieloma; y (iv) seleccionar un hibridoma. En otro modo de realizacion, la presente invencion proporciona metodos de producir un anticuerpo, que consisten en (i) inmunizar un mamffero no humano con un peptido que comprende un epftopo dependiente de la conformacion definido por (a) CCTKSGCNHPDLDVQYPSG (SEQ ID NO: 9), CCTKSGCNHPDLDVQYPS (SEQ ID NO: 10), CCTKSGCNHPDLDVQYP (SEQ ID NO: 11), CCTKSGCNHPDLDVQY (SEQ ID NO: 12) o

CCTKSGCNHPDLDVQ (SEQ ID NO: 13); y (b) CGSSDMSCERGRHQSL (SEQ ID NO: 14) de uPAR humano (SEQ ID NO: 15); (ii) aislar esplenocitos de dicho mamffero; (iii) fusionar dichos esplenocitos a celulas de mieloma; y (iv) seleccionar un hibridoma que secrete un anticuerpo que fije dicho peptido. La presente divulgacion proporciona metodos de producir un anticuerpo, que comprenden (i) inmunizar un mamffero con un peptido que incluye un epftopo dependiente de la conformacion definido por (a) KSGCNHPDLD (SEQ iD NO: 16); y (b)

CGSSDMSCERGRHQSL (SEQ ID NO: 14) de un uPAR humano (SEQ ID NO: 15); (ii) aislar esplenocitos de dicho mamffero; (iii) fusionar dichos esplenocitos a celulas de mieloma; y (iv) seleccionar un hibridoma que secrete un anticuerpo que fije dicho peptido. Se divulgan metodos para producir un anticuerpo, que comprenden (i) inmunizar un mamffero con un fragmento de uPAR humano (opcionalmente purificado) comprendiendo un epftopo dependiente de la conformacion definido por (a) KSGCNHPDLD (SEQ ID NO: 16); y (b) CGSSDMSCERGRHQSL (SEQ ID NO: 14) de un uPAR humano (SEQ ID NO: 15); (ii) aislar esplenocitos de dicho mamffero; (iii) fusionar dichos esplenocitos a celulas de mieloma; y (iv) seleccionar un hibridoma que secrete un anticuerpo que fije dicho peptido. En un modo de realizacion, los metodos de producir un anticuerpo comprenden (i) inmunizar un mamffero no humano con un fragmento de uPAR humano (opcionalmente purificado) comprendiendo los dominios 2 y 3 de uPAR humano (SEQ ID NO: 15); (ii) aislar esplenocitos de dicho mamffero; (iii) fusionar dichos esplenocitos a celulas de mieloma; y (iv) seleccionar un hibridoma que secrete un anticuerpo que fije dicho fragmento. En otro modo de realizacion, los metodos de producir un anticuerpo comprenden (i) inmunizar un mamffero con un fragmento aislado de uPAR humano (SEQ ID NO: 15), en el que el extremo amino de dicho fragmento se encuentra en cualquiera de

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los numeros aminoacidos 93-98 y el extremo carboxilo de dicho fragmento se encuentra en cualquiera de los aminoacidos 279-283, o un derivado de los mismos conteniendo solamente sustitutos conservadores relativos a la secuencia de dicho fragmento; (ii) aislar esplenocitos de dicho mamffero; (iii) fusionar dichos esplenocitos a celulas de mieloma; y (iv) seleccionar un hibridoma que secrete un anticuerpo que fije dicho fragmento. Un mamffero no humano puede ser un raton, conejo, cabra, rata, gato, perro, etc. La invencion tambien comprende metodos de producir un anticuerpo utilizando expresion en fago.

La presente divulgacion presenta anticuerpos o fragmentos fijadores del antfgeno de los mismos, que se fijan inmunoespecfficamente a un epftopo definido por la secuencia de aminoacidos CCTKSGCNHPDLDVQYPSG (SEQ ID NO: 9), CCTKSGCNHPDLDVQYPS (SEQ ID NO: 10), CCTKSGCNHPDLDVQYP (SEQ ID NO: 11), CCTKSGCNHPDLDVQY (SEQ ID NO: 12) o CCTKSGCNHPDLDVQ (SEQ ID NO: 13). Se divulgan anticuerpos o fragmentos fijadores del antfgeno de los mismos, que se fijan inmunoespecfficamente a un epftopo definido por la secuencia de aminoacidos KSGCNHPDLD (SEQ ID NO: 16). En ciertos modos de realizacion, mutar el epftopo en el residuo aminoacido 268 reduce o suprime la afinidad de union inmunoespecffica del anticuerpo. Debe tenerse en cuenta que todas las referencias en esta aplicacion a numeros de aminoacidos en la secuencia uPAR humana corresponden a una numeracion a partir del extremo amino del uPAR procesado, que carece de los 22 aminoacidos terminales mostrados en la Figura 1, a menos que se indique explfcitamente lo contrario. Tambien se divulgan anticuerpos, o fragmentos fijadores de antfgenos de los mismos, que se unen inmunoespecfficamente a un epftopo dependiente de conformacion definido por (i)CCTKSGCNHPDLDVQYPSG (SEQ ID NO: 9), CCTKSGCNHPDLDVQYPS (SEQ ID NO: 10), CCTKSGCNHPDLDVQYP (SEQ ID NO: 11),

CCTKSGCNHPDLDVQY (SEQ ID NO: 12) o CCTKSGCNHPDLDVQ (SEQ ID NO: 13); y (ii) CGSSDMSCERGRHQSL (SEQ ID NO: 14) en el contexto de un uPAR humano (SeQ ID NO: 15). En algunos modos de realizacion, los anticuerpos o fragmentos fijadores del antfgeno de los mismos, se unen inmunoespecfficamente a un epftopo dependiente de conformacion definido por (i) KSGCNHPDLD (SEQ ID nO: 16); y (ii) CGSSDMSCERGRHQSL (SEQ ID NO: 14) en el contexto de un uPAR humano (SEQ ID NO: 15). En algunos modos de realizacion, la union de un anticuerpo al epftopo se demuestra por una reduccion en dicha union por dicho anticuerpo cuando el residuo K (Lys) en la posicion 268 en uPAR humano muta a un residuo E (Glu) (uPAR K268E) oaun residuo A (Ala) (uPAR K268A). De manera preferente, la cantidad de union se demuestra por co- inmunoprecipitacion del anticuerpo y uPAR K268E o uPAR K268A. En otros modos de realizacion, la union de un anticuerpo al epftopo se demuestra por una reduccion en dicha union por dicho anticuerpo cuando el residuo H (Hys) en la posicion 273 en uPAR humano muta a un residuo A (Ala) (uPAR H273A). De manera preferente, la cantidad de union se demuestra por co-inmunoprecipitacion del anticuerpo y uPAR H273A. En modos de realizacion particulares, la union de un anticuerpo al epftopo se demuestra por una reduccion en dicha union por dicho anticuerpo cuando el residuo D (Asp) en la posicion 275 o 277 en uPAR humano muta a un residuo A (Ala) (uPAR D275A o uPAR D277A, respectivamente). De manera preferente, la cantidad de union se demuestra por co-inmunoprecipitacion del anticuerpo y uPAR D275A o uPAR D277A, respectivamente. En los modos de realizacion anteriores, por ejemplo, una reduccion de la union por el anticuerpo se demuestra por una cantidad reducida de uPAR mutado (por ej., uPAR K268E, uPAR K268A, uPAR H273A, upAr D275A, o uPAR D277A) que se co-inmunoprecipita con el anticuerpo con relacion a la cantidad de uPAR natural (por ej., uPAR unido a membrana o suPAR) o un fragmento de suPAR (por ej., D2D3 suPAR) que co-inmunoprecipita con el anticuerpo.

En algunos modos de realizacion, la union del anticuerpo a un epftopo de la invencion se demuestra mediante un ensayo de intercambio de deuterio, en el que la union de un anticuerpo (por ej., ATN-658) a un epftopo de una protefna (por ej., suPAR humano) reduce la capacidad de ese epftopo de intercambiar deuterio. En modos de realizacion particulares, suPAR humano entra en contacto con un anticuerpo, y la union del anticuerpo a un epftopo de uPAR humano se demuestra por una reduccion en el nivel de deuteracion en el epftopo en presencia del anticuerpo en condiciones de union, con relacion a la deuteracion en el epftopo en ausencia del anticuerpo. A la inversa, una zona de suPAR que no esta en contacto con el anticuerpo posee el mismo o similar nivel de deuteracion en presencia o ausencia del anticuerpo en condiciones de union. De manera preferente, el ensayo de deuteracion se realiza con un fragmento de uPAR humano que contenga, o consista en los dominios 2 y 3 (D2D3). En modos de realizacion especfficos, la union del anticuerpo a un epftopo de suPAR humano se demuestra por una reduccion del nivel de deuteracion en el epftopo de suPAR humano, en presencia del anticuerpo en condiciones de union, de al menos el 10%, o al menos del 20%, o al menos del 30%, o al menos del 40%, o al menos del 50%, con relacion al nivel de deuteracion en el epftopo en ausencia del anticuerpo.

De manera preferente, los anticuerpos o los fragmentos de los mismos segun la invencion se afslan o purifican. En ciertos modos de realizacion, el anticuerpo, o el fragmento fijador del antfgeno del mismo es un anticuerpo monoclonal (preferentemente un IgG) o un scFv. En ciertos modos de realizacion, el anticuerpo segun la invencion puede ser un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo quimerico. En ciertos modos de realizacion, el anticuerpo es un anticuerpo bi-especffico. El ciertos modos de realizacion, el anticuerpo no es ATN- 658.

En un modo de realizacion preferente, los anticuerpos modulan la senalizacion en sentido descendente del receptor del activador del plasminogeno tipo uroquinasa y pueden interferir con uPAR e inhibir su senalizacion, incluyendo, sin animo exhaustivo, (a) el ensamblaje de fibronectina mediado por uPAR, (b) la union de fibronectina o un fragmento de la misma a integrina a5v1 y/o (c) el ensamblaje de componentes de vitronectina. Los anticuerpos

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tambien pueden regular a la baja el numero de moleculas uPAR en la membrana celular.

En un modo de realizacion preferente, los anticuerpos segun la invencion se conjugan con un agente terapeutico o marcador detectable. Un marcador detectable incluye, sin animo exhaustivo, un radionucleido, un agente que se puede registrar en imagenes PET, un agente que se puede registrar en imagenes MRI, un agente fluorescente, un fluorogeno, un cromoforo, un cromogeno, un agente fosforescente, un quimioluminiscente o un bioluminiscente. Los radionucleidos representativos incluyen, sin animo exhaustivo: 3H, 14C, 35S, 67Ga, 68Ga, 72As, 89Zr, 97Ru, 99Tc, 111In,

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I, I, I, Yb and Tl. Los fluorescentes o fluorogenos representativos incluyen, sin animo exhaustivo, fluorescefna, rodamina, dansilo, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaldehfdo, fluorescamina, un derivado de la fluorescefna, Oregon Green, Rhodamine Green, Rhodol Green y Texas Red. Un agente terapeutico incluye, sin animo exhaustivo, un medicamento quimio-terapeutico, una toxina o un radionucleido terapeutico.

Tambien se divulga un compuesto farmaceutico que comprende un anticuerpo o fragmento fijador del antfgeno del mismo; y un vehfculo aceptable a nivel farmaceutico. Los compuestos farmaceuticos pueden utilizarse en metodos para inhibir la migracion celular, invasion celular, proliferacion celular o angiogenesis o para inducir apoptosis, por contacto con celulas asociadas a una migracion, invasion, proliferacion o angiogenesis celular no deseada, con una cantidad efectiva de un compuesto farmaceutico segun la invencion. Los compuestos farmaceuticos tambien pueden utilizarse en metodos para tratar a un sujeto con una enfermedad, trastorno o estado caracterizado por una angiogenesis no deseada, crecimiento tumoral y/o metastasis tumoral, administrando al sujeto una cantidad terapeuticamente efectiva del compuesto farmaceutico segun la invencion.

Descripcion breve de las figuras

Los detalles de la invencion se aprecian en las figuras que se acompanan, no pretendiendo estas ser limitativas del alcance de la invencion:

- La Figura 1 presenta la secuencia de aminoacidos de la forma no procesada de uPAR humano (UniProtKB/Swiss-Prot Accession No. Q03405 (SEQ ID NO: 15). La forma procesada (madura) de uPAR humano carece de los primeros 22 aminoacidos (indicado en negrita).

- La Figura 2 muestra datos de un ensayo de union de ATN-658 y ATN-617. Se incubaron celulas HeLa con 5nM 125I-scuPA (uPA monocatenario, ver Holmes et al.; Biotechnology 3:923-929 (1985)) en presencia o ausencia de 300nM de scuPA no marcado o de 300nM ATN-658. ATN-617, un anticuerpo monoclonal anti- uPAR que bloquea la union de uPA a uPAR aparece compitiendo como control con la union de scuPA. Los datos muestran que el anticuerpo monoclonal ATN-658 no compite con la union de uPA a celulas HeLa. La union de ATN-658 a celulas HeLa no inhibio la union de 125I-scuPA.

- La Figura 3 muestra el resultado de un ensayo de crecimiento tumoral en un modelo de raton de cancer de ovario. Los datos muestran que ATN-658 inhibe el crecimiento tumoral en el modelo de cancer de ovario A2780 tan efectivamente como el cisplatino. Las celulas A2780 expresan solamente uPAR y no uPA.

- La Figura 4 muestra el resultado de un ensayo de crecimiento tumoral en un modelo de raton de cancer de pulmon. Los datos muestran que ATN-658 inhibe el crecimiento tumoral en un modelo de cancer de pulmon A549 (celulas no pequenas) en el que se inocularon 106 celulas tumorales. Las celulas A549 expresan tanto uPA como uPAR.

- La Figura 5A es una tabla que muestra los 9 residuos aminoacidos de uPAR que difieren entre humanos, monos verdes africanos y macacos comedores de cangrejos y de cola larga.

- La Figura 5B muestra los resultados de un ensayo de co-inmunoprecipitacion realizado con ATN-658 (o ATN-615 como control) y uPAR de mono, natural o con las mutaciones indicadas. Los datos de inmunoprecipitacion muestran que ATN-658 no se une a uPAR de mono, sino que una mutacion de uPAR de mono en la posicion 268 desde E (Glutamina) a K (Lisina), que corresponde al aminoacido en la posicion 268 en uPAR humano, realiza la union de ATN-658. Mutar los otros residuos aminoacidos de uPAR de mono a los correspondientes residuos aminoacidos de uPAR humano no realizo la union de ATN-658.

- La Figura 6 es una tabla que presenta los datos de union de un analisis de la mutagenesis mediante alanina de uPAR humano. Los datos de la tabla muestran que mutaciones de varios residuos de aminoacidos, es decir, residuos aminoacidos 268, 273, 275 y 277, de uPAR humano reducen la union de ATN-658 al epftopo de uPAR. Se indica la relativa afinidad de union de ATN-658 al correspondiente uPAR humano (natural o mutado), designando la afinidad elevada de union como ++++ y las afinidades menores como +++, ++ y +.

- La Figura 7A muestra un diagrama esquematico que describe las etapas y el principio subyacente al ensayo de Intercambio de Deuterio utilizado para trazar el epftopo de uPAR humano al que se une ATN- 658; y las Figuras 7B y 7C muestran los datos de trazado del epftopo de los ensayos de Intercambio de Deuterio con uPAR humano D2D3 en presencia y ausencia de ATN-658. El porcentaje aproximado de reduccion (diferencia) en nivel de deuteracion se indica para la correspondiente region del epftopo.

Descripcion detallada de la invencion

uPAR es un objetivo ideal para anticuerpos porque se expresa en la superficie celular. La expresion de uPAR en el

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interfaz tumor-vasculatura (en celulas tumorales invasivas, celulas endoteliales angiogenicas o macrofagos asociados a tumores) sugiere que los anticuerpos dirigidos a esta protema no experimental los mismos obstaculos a su difusion que han impedido a otros anticuerpos monoclonales penetrar en tumores y servir de agentes de diagnostico o ejercer efectos terapeuticos. Y lo que es importante, uPAR no se expresa normalmente en tejidos inactivos, lo cual debena minimizar el potencial de toxicidad cuando se emplea un anticuerpo terapeutico y minimizar senales no espedficas (o falsos positivos) al emplear un anticuerpo para diagnostico.

La presente invencion se basa, en parte, en la caracterizacion de los inventores del epftopo objeto del anticuerpo monoclonal espedfico del uPAR, ATN-658. El hibridoma que secreta el anticuerpo monoclonal ATN-658 ha sido depositado segun las disposiciones del Tratado de Budapest con la American Type Culture Collection (10801 University Blvd., Manassas, VA. 20110-2209) el 1 de febrero de 2017, y asignado aTcC Accession No. PTA-8191. Este anticuerpo no afecta a la union de uPA a su receptor. Los anticuerpos que se unen a este epftopo presentan vfas de senalizacion en sentido descendente, incluyendo ligandos "en sentido descendente" como integrinas, protema relacionada con el receptor de lipoprotema de baja densidad (LRP) y otros agentes de union. Estas interacciones en sentido descendente se consideran importantes para los procesos de migracion, invasion y proliferacion celular. Es por lo tanto deseable enfocar terapeuticamente estos procesos o detectar el proceso o los componentes implicados mediante diagnostico.

Por consiguiente, la presente divulgacion se refiere a metodos y compuestos que contemplan la prevencion y tratamiento del cancer. Un aspecto particular de la divulgacion se refiere a metodos y composiciones que contienen compuestos que inhiben la proliferacion e invasion de celulas cancengenas.

La divulgacion tambien presenta metodos de diagnostico utilizando los anticuerpos del uPAR segun la invencion. Los metodos de diagnostico tambien pueden utilizarse para pronosticar o anticipar la progresion del cancer. En modos de realizacion particulares, los metodos de diagnostico presentan metodos de representar en imagenes y localizar metastasis y metodos de diagnostico y pronostico utilizando tejidos y fluidos distales al lugar del tumor primario (asf como metodos que utilizan tejidos y fluidos del tumor primario). En otros modos de realizacion, los metodos de diagnostico presentan metodos de representar imagenes y localizar metastasis y metodos de diagnostico y pronostico in vivo.

1. Epftopo del anticuerpo monoclonal especffico del uPAR ATN-658

Los presentes inventores han trazado un epftopo en uPAR que no esta implicado en la union a uPA. Este epftopo ha sido trazado por su interaccion con el anticuerpo monoclonal del uPAR aTN-658, descrito en WO 2005/116077. Las secuencias de region variable de ATN-658 se establecen a continuacion:

ATN-658: Secuencias de region variable

La secuencia de aminoacidos de consenso (codigo de una sola letra) de polipetidos de region variable de cadena ligera (Vl) y de region variable de cadena pesada (Vh) del anticuerpo monoclonal ATN-658 se muestran debajo. Las regiones que determinan la complementariedad (CDRs) para cada region variable estan resaltadas (cursivas, negrita, subrayado)

ATN-658 VL Protema de consenso (SEQ ID NO: 1):

DWMTQTPLT LSVTIGQPAS ISCKSSOSLL DSDGKTYLNf) LLQRPGQSPK RLIYLVSKLD 5GVPDRFTGS GSGTDFTLKX SRVEAEDLGV YYCWOGTHFP L7FGAGTKLE LKRADAAPTV SIFPPSSEQL TSGGASVVCF L

ATN-658 Vh Protema de consenso (SEQ ID NO: 2):

EVQLQQSGPE LVKTGASVKI SCKAS GYSFT SYYMHvNKQS HGKSLEWIGF INPYNGGASY NOKIKGRATF TVDTSSRTAY MQFNSLTSED SAVYYCAR5J YGHSVLDYitiQ QGTSVSVSSA KTTPPSVYPL APGSAAQTNS M

TABLA 1: Caracteristicas de CDRs de cadenas L y H de ATN-658 L

CDR*

N° de residuos Secuencia' SEQ ID N°

CDR L1

16 KSSQSLLDSDGKTYLN 3

CDR L2

7 LVSKLDS 4

CDR L3

9 WQGTHFPLT 5

CDR H1

10 GYSFTSYYMH 6

CDR H2

17 EINPYNGGASYNQKIKG 7

CDR H3

10 SIYGHSVLDY 8

*CDR-L1: primer CDR de cadena L; CDR-H2: 2° CDR de cadena H, etc.

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Este anticuerpo reconoce el complejo uPA-uPAR.

Este anticuerpo fue generado contra un epftopo en el fragmento D2D3 uPAR. Se ha demostrado que un epftopo en D2D3 es crftico para la actividad pro-migratoria de uPA (Andolfo A et al. (2002) Thromb Haemost 88: 298-306). Por lo tanto, se espera que los anticuerpos generados contra el fragmento D2D3 donde este epftopo ya esta expuesto, tengan actividad anti-migratoria.

TABLA 2: secuencias del epftopo de uPAR

Secuencia

Aminoacidos de uPAR humano1 SEQ ID N°

CCTKSGCNHPDLDVQYPSG

265-283 9

CCTKSGCNHPDLDVQYPS

265-282 10

CCTKSGCNHPDLDVQYP

265-281 11

CCTKSGCNHPDLDVQY

265-280 12

CCTKSGCNHPDLDVQ

265-279 13

CGSSDMSCERGRHQSL

98-114 14

KSGCNHPDLD

268-277 16

1 La numeracion de aminoacidos refleja la forma procesada de uPAR

En un modo de realizacion, el anticuerpo reconoce un epftopo definido por la secuencia de aminoacidos de SEQ ID N°: 9, 10, 11, 12, 13, o 16.

En un modo de realizacion alternativo, el anticuerpo reconoce un epftopo dependiente de conformacion definido por (i) una secuencia de aminoacidos de SEQ ID N°: 9, 10, 11, 12, 13, o 16; y (ii) una secuencia de aminoacidos de SEQ ID N°: 14 en el contexto de uPAR humano (SEQ ID N°: 15). En este caso, se puede utilizar uPAR soluble largo (suPAR) (residuos 1-283, dominios 1,2, y 3) como inmunogeno. Sin embargo, un experto en la materia reconocera que se puede utilizar un fragmento mas corto de suPAR como inmunogeno siempre que se mantenga la conformacion correcta.

En algunos aspectos, un epftopo dependiente de conformacion comprende o consiste en secuencias contiguas de aminoacidos de un fragmento de uPAR humano desde la posicion 98 a 277, 279, 280, 281, 282, o 283. En otro aspecto, un epftopo dependiente de conformacion comprende o consiste en un fragmento aislado de uPAR humano (SEQ ID N°: 15), en el que el extremo amino de dicho fragmento se encuentra en uno cualquiera de los numeros 9398 y el extremo carboxilo de dicho fragmento se encuentra cualquiera de los aminoacidos 277-283, o un derivado de los mismos que contenga solamente sustituciones conservadoras relativas a la secuencia de dicho fragmento. Tambien se presentan protefnas de fusion que comprenden dicho fragmento y una secuencia de una protefna diferente. En un aspecto preferente, el epftopo dependiente de conformacion conserva su conformacion original, tal como se demuestra, por ej., por modelado molecular. En otros aspectos, el epftopo dependiente de conformacion se define por (i) una secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 9, 10, 11, 12, 13, o 16; y (ii) una secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 14, donde se coloca una secuencia de peptidos de enlace entre las secuencias de aminoacidos de (i) y (ii), para que se mantenga la conformacion original. En un modo de realizacion especffico, la secuencia de peptidos de enlace imita la conformacion original de uPAR. En un modo de realizacion, la secuencia de peptidos de enlace es heterologa a uPAR humano. En otro modo de realizacion, la secuencia de peptidos de enlace es la secuencia interviniente de uPAR humano en la que se han hecho sustituciones conservadoras de aminoacidos. Por ejemplo, uno o mas residuos de aminoacidos de la secuencia pueden ser sustituidos por otro aminoacido de polaridad similar que actua como un equivalente funcional, produciendo una alteracion silenciosa. Las sustituciones de un aminoacido dentro de la secuencia pueden seleccionarse a partir de otros miembros de la clase a la que pertenece el aminoacido. Por ejemplo, los aminoacidos no polares (hidrofobicos) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano y metionina. Los aminoacidos neutros polares incluyen glicina, serina, treonina, cistefna, tirosina, asparagina y glutamina. Los aminoacidos (basicos) con carga positiva incluyen arginina, lisina e histidina. Los aminoacidos (acidos) con carga negativa incluyen acido aspartico y acido glutamico. Se entiende por lo general que dichas sustituciones son sustituciones conservadoras. Las sustituciones conservadoras de uno o mas residuos de aminoacidos se introducen de manera preferente en la secuencia de peptidos en lugares donde no perturben la conformacion o actividad original.

Peptidos mas largos que comprenden estos epftopos uPAR tambien son contemplados por la presente invencion. Por ejemplo, los peptidos uPAR pueden comprender hasta 20, 30, 40 aminoacidos. En un modo de realizacion los peptidos comprenden residuos de aminoacidos contiguos de uPAR. Estos peptidos mas largos consistiran por lo general en un fragmento de uPAR humano y comprenderan la secuencia de epftopo de uPAR. En otro modo de realizacion, el uPAR es uPAR humano.

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La secuencia de aminoacidos de la forma no procesada de uPAR humano UniProtKB/Swiss-Prot Accession No. Q03405 (SEQ ID NO: 15) esta representada en la Figura 1.

La forma procesada (madura) de uPAR humano elimina los primeros 22 aminoacidos. Los residuos C-terminal 284313 (numerados a partir del extremo amino de la protefna madura) tambien son eliminados por el procesado post- translacional cuando uPAR se ancla a la membrana plasmatica por un extremo GPI (ver Moller et al., Eur. J. Biochem. 208:493-500 (1992); Low M. G., FASEB J. 3:1600-1608 (1989)). La referencia a uPAR (incluyendo suPAR) en esta aplicacion hace referencia a uPAR procesado (maduro) (conteniendo aminoacidos 1-283) a menos que se indique explfcitamente lo contrario.

En algunos modos de realizacion, mutar uno o mas residuos de aminoacidos de las secuencias de epftopos de la Tabla 2 reduce o anula la afinidad de union inmunoespecffica del anticuerpo, p. ej., ATN-658, al epftopo, p. ej., tal como esta contenido en uPAR humano, que puede estar asociado a membrana o suPAR. En un modo de realizacion particular, una mutacion en el residuo aminoacido 268 de uPAR humano o los epftopos de la Tabla 2 reduce o anula la afinidad de union inmunoespecffica del anticuerpo o fragmentos fijadores del antfgeno del mismo al epftopo. En un modo de realizacion especffico, la union de un anticuerpo al epftopo se demuestra por una reduccion en dicha union por dicho anticuerpo cuando el residuo K (Lys) en la posicion 268 en uPAR humano muta a un residuo E (Glu) o a un residuo A (Ala) (uPAR K268A). En otro modo de realizacion, una mutacion en el residuo aminoacido 273 de uPAR humano o los epftopos de la Tabla 2 reduce o anula la afinidad de union inmunoespecffica del anticuerpo o fragmentos fijadores del antfgeno del mismo al epftopo. En un modo de realizacion especffico, la union de un anticuerpo al epftopo se demuestra por una reduccion en dicha union por dicho anticuerpo cuando el residuo H (Hys) en la posicion 273 en uPAR humano muta a un residuo A (Ala) (uPAR H273A). En otro modo de realizacion, una mutacion en el residuo aminoacido 275 de uPAR humano o los epftopos de la Tabla 2 reduce o anula la afinidad de union inmunoespecffica del anticuerpo o fragmentos fijadores del antfgeno del mismo al epftopo. En un modo de realizacion especffico, la union de un anticuerpo al epftopo se demuestra por una reduccion en dicha union por dicho anticuerpo cuando el residuo D (Asp) en la posicion 275 en uPAR humano muta a un residuo A (Ala) (uPAR H275A). En un modo de realizacion, una mutacion en el residuo aminoacido 277 de uPAR humano o los epftopos de la Tabla 2 reduce o anula la afinidad de union inmunoespecffica del anticuerpo o fragmentos fijadores del antfgeno del mismo al epftopo. En un modo de realizacion especffico, la union de un anticuerpo al epftopo se demuestra por una reduccion en dicha union por dicho anticuerpo cuando el residuo D (Asp) en la posicion 277 en uPAR humano muta a un residuo A (Ala) (uPAR H277A). En modos de realizacion especfficos, la mutacion de uno o mas residuos de uPAR humano, por ej., 268, 273, 275, y/o 277, por ej., tal como se describe en la presente invencion, o la mutacion de cualquiera de los epftopos de la Tabla 2 reduce la afinidad de union inmunoespecffica del anticuerpo o de un fragmento fijador del antfgeno del mismo en al menos el 5%, al menos el 10%, al menos el 20%, al menos el 30%, al menos el 40% o al menos el 50% con relacion a la afinidad del anticuerpo con un uPAR humano natural, por ej., uPAR unido a membrana, suPAR) o a un fragmento de suPAR (por ej., D2D3 suPAR).

La afinidad de union del anticuerpo o fragmento fijador del antfgeno del mismo a uPAR humano o a un fragmento (por ej. D2D3 suPAR) que contiene un epftopo del mismo puede determinarse por metodos muy conocidos en el estado de la tecnica, por ej., sin animo exhaustivo, por ensayos de co-inmunoprecipitacion, ensayo BIAcore, ensayo de intercambio de deuterio y ELISA. En un modo de realizacion particular, la union de un anticuerpo al epftopo se demuestra por una reduccion de al menos el 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60% o 70% en dicha union por dicho anticuerpo cuando el residuo K (Lys) en la posicion 268 en uPAR humano muta a un residuo E (Glu) (uPAR K268E) oaun residuo A (Ala) (uPAR K268A). De manera preferente, la cantidad de union se demuestra por co- inmunoprecipitacion del anticuerpo y uPAR K268E o uPAR K268A, respectivamente. En ciertos modos de realizacion, la union de un anticuerpo al epftopo se demuestra por una reduccion de al menos el 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90% en dicha union por dicho anticuerpo cuando el residuo H (His) en la posicion 273 en uPAR humano muta a un residuo A (Ala) (uPAR K273A). De manera preferente, la cantidad de union se demuestra por co-inmunoprecipitacion del anticuerpo y uPAR H273A. En otros modos de realizacion, la union de un anticuerpo al epftopo se demuestra por una reduccion de al menos el 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90% en dicha union por dicho anticuerpo cuando el residuo D (Asp) en la posicion 275 o 277 en uPAR humano muta a un residuo A (Ala) (uPAR K275A o uPAR 0277A, respectivamente). De manera preferente, la cantidad de union se demuestra por co-inmunoprecipitacion del anticuerpo y uPAR 0275A o uPAR 0277A, respectivamente. Por ejemplo, una reduccion de la union por el anticuerpo se demuestra por una cantidad reducida de uPAR mutado (por ej., uPAR K268E, uPAR K268A, uPAR H273A, upAr 0275A, o uPAR 0277A) que se co-inmunoprecipita con el anticuerpo con relacion a la cantidad de uPAR natural (por ej., uPAR unido a membrana, suPAR) o un fragmento de suPAR (por ej., D2D3 suPAR) que co-inmunoprecipita con el anticuerpo.

En otros aspectos de la invencion, la union del anticuerpo a un epftopo de la invencion se demuestra mediante un ensayo del intercambio de deuterio, en la que la union de un anticuerpo (por ej., ATN-658) a un epftopo de una protefna (por ej., suPAR humano) reduce la capacidad de ese epftopo de intercambiar deuterio. En modos de realizacion particulares, suPAR humano entra en contacto con un anticuerpo, y la union del anticuerpo a un epftopo de uPAR humano se demuestra por una reduccion en el nivel de deuteracion en el epftopo en presencia del anticuerpo, en condiciones de union, con relacion a la deuteracion en el epftopo en ausencia del anticuerpo. A la inversa, una zona de suPAR que no esta en contacto con el anticuerpo posee el mismo o similar nivel de deuteracion en presencia o ausencia del anticuerpo en condiciones de union. De manera preferente, el ensayo de

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deuteracion se realiza con un fragmento de uPAR humano que contenga, o consista en los dominios 2 y 3 (D2D3) (aminoacidos 88-283). En modos de realizacion espedficos, la union del anticuerpo a un epftopo de suPAR humano se demuestra por una reduccion del nivel de deuteracion en el epftopo de suPAR humano, en presencia del anticuerpo en condiciones de union, de al menos el 10%, o al menos del 20%, o al menos del 30%, o al menos del 40%, o al menos del 50%, con relacion al nivel de deuteracion en el epftopo en ausencia del anticuerpo. En modos de realizacion particulares, la reduccion del nivel de deuteracion de al menos 10%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, o al menos 75% en el epftopo de suPAR se demuestra en presencia del anticuerpo en condiciones de union, con relacion al nivel de deuteracion en el epftopo de suPAR en ausencia del anticuerpo. En un modo de realizacion particular, el anticuerpo esta inmovilizado.

El epftopo uPAR y peptidos que comprenden estas secuencias pueden tener utilidad en el diagnostico y metodos terapeuticos que aqrn se describen.

2. Anticuerpos del uPAR

Esta divulgacion proporciona un anticuerpo aislado, o un fragmento fijador del antfgeno del mismo, que se une inmunoespedficamente a un epftopo de uPAR definido por la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 9, 10, 11, 12 o 13. La divulgacion tambien procura un anticuerpo aislado, o fragmento fijador del antfgeno del mismo, que se une inmunoespedficamente a un epftopo dependiente de conformacion definido por (i) CCTKSGCNHPDLDVQYPSG (SEQ ID NO: 9), CCTKSGCNHPDLDVQYPS (SEQ ID NO: 10), CCTKSGCNHPDLDVQYP (SEQ ID NO: 11), CCTKSGCNHPDLDVQY (SEQ ID NO: 12) o CCTKSGCNHPDLDVQ (SEQ ID NO: 13); y (ii) CGSSDMSCERGRHQSL (SeQ ID NO: 14) en el contexto de un uPAR humano (SEQ ID NO: 15). Esta divulgacion proporciona un anticuerpo aislado, o un fragmento fijador del antfgeno del mismo, que se une inmunoespedficamente a un epftopo de uPAR definido por la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 16. La divulgacion tambien proporciona un anticuerpo aislado o un fragmento fijador del antfgeno del mismo, se une inmunoespedficamente a un epftopo dependiente de conformacion definido por (i) KSGCNHPDLD (SEQ ID NO: 16); y (ii) CGSSDMSCERGRHQSL (SEQ ID NO: 14) en el contexto de un uPAR humano (SEQ ID NO: 15).

Se cree que estos anticuerpos se unen a un complejo binario uPA-uPAR, pero no sustancialmente a (a) uPA libre o (b) la region de uPAR que reconoce y se une a uPA, de modo que el mAb (anticuerpo monoclonal) no inhibe la union uPA-uPAR. Tal como se utiliza aqrn, "unirse inmunoespedficamente" significa que el anticuerpo, o un fragmento fijador del antfgeno del mismo, se une al antfgeno a traves de su region de reconocimiento del antfgeno de su dominio variable.

2.1. Produccion de anticuerpos monoclonales utilizando epftopos

Los metodos para producir y buscar anticuerpos espedficos utilizando tecnologfa de hibridoma son rutinarios y bien conocidos en el estado de la tecnica, por ejemplo, en Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling, et al., en: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563681 (Elsevier, N.Y., 1981), Kohler and Milstein, Nature 256: 495-497 (1975); U.S. Patent No. 4,376,110; Monoclonal Antibodies and Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, New York, NY (1980); H. Zola et al., in Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, CRC Press, 1982). Un animal, preferentemente un raton, es primovacunado con un inmunogeno como se ha mencionado para suscitar la respuesta del anticuerpo deseada en el animal primovacunado. En otros modos de realizacion, se primovacuna a un mamfero no humano con un inmunogeno como se ha mencionado para suscitar la respuesta del anticuerpo deseada en el mamfero no humano primovacunado.

En resumen, se puede inmunizar ratones con un epftopo de uPAR y una vez detectada la respuesta inmune, por ej., se detectan anticuerpos espedficos del uPAR en el suero del raton, se estirpa el bazo del raton y se aislan esplenocitos. Los esplenocitos se fusionan mediante tecnicas muy conocidas a celulas de mieloma adecuadas, por ejemplo, celulas de la lrnea celular SP20 disponible a partir de ATCC. Se seleccionan hibridomas y se clonan por dilucion limitada. Se valoran los clones de hibridoma mediante metodos conocidos en el estado de la tecnica en busca de celulas que secreten anticuerpos capaces de unir uPAR. Se puede generar ftquido asdtico, que por lo general contiene altos niveles de anticuerpos, inmunizando ratones con clones de hibridoma positivos.

Las secuencias de epftopos de la Tabla 2 se utilizan como un inmunogeno para la generacion de los anticuerpos de la descripcion. En un modo de realizacion, se utiliza un peptido consistente en la secuencia de aminoacidos CCTKSGCNHPDLDVQYPSG (SEQ ID NO: 9), CCTKSGCNHPDLDVQYPS (SEQ ID NO: 10),

CCTKSGCNHPDLDVQYP (SEQ ID NO: 11), CCTKSGCNHPDLDVQY (SEQ ID NO: 12), o CCTKSGCNHPDLDVQ (SEQ ID NO: 13). En otro modo de realizacion, se utiliza un fragmento de uPAR humano, de hasta 20, 30 o 40 aminoacidos, comprendiendo la secuencia de aminoacidos CCTKSGCNHPDLDVQYPSG (SEQ ID NO: 9), CCTKSGCNHPDLDVQYPS (SEQ ID NO: 10), CCTKSGCNHPDLDVQYP (SEQ ID NO: 11),

CCTKSGCNHPDLDVQY (SEQ ID NO: 12), o CCTKSGCNHPDLDVQ (SEQ ID NO: 13). En otro modo de realizacion se utiliza un peptido que comprende un epftopo dependiente de conformacion definido por (i) CCTKSGCNHPDLDVQYPSG (SEQ ID NO: 9), CCTKSGCNHPDLDVQYPS (SEQ ID NO: 10),

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CCTKSGCNHPDLDVQYP (SEQ ID NO: 11), CCTKSGCNHPDLDVQY (SEQ ID NO: 12) o CCTKSGCNHPDLDVQ (SEQ ID NO: 13); y (ii) CGSSDMSCERGRHQSL (SEQ ID NO: 14) en el contexto de un uPAR humano (SEQ ID NO: 15). Tambien se divulga el uso de un peptido que comprende o, alternativamente, consiste en un epftopo dependiente de conformacion definido por (i) (i) KSGCNHPdLd (SEQ ID NO: 16); and (ii) CGSSDMSCERGRHqSl (SEQ ID NO: 14) de uPAR humano (SEQ ID NO: 15).

En algunos aspectos, dicho epftopo dependiente de conformacion comprende o consiste en secuencias contiguas de aminoacidos de un fragmento de uPAR humano desde la posicion 98 a 279, 280, 281, 282, o 283. En un aspecto preferente, el epftopo dependiente de conformacion conserva su conformacion original, tal como se demuestra, por ej., por modelado molecular. En otros aspectos, el epftopo dependiente de conformacion se define por (i) una secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 9, 10, 11, 12, 13, o 16; y (ii) una secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 14, donde se coloca una secuencia de peptidos de enlace entre las secuencias de aminoacidos de (i) y (ii), para que se mantenga la conformacion original. En un modo de realizacion especffico, la secuencia de peptidos de enlace imita la conformacion original de uPAR. En un modo de realizacion, la secuencia de peptidos de enlace es heterologa a uPAR humano. En otro modo de realizacion, la secuencia de peptidos de enlace es la secuencia interviniente de uPAR humano en la que se han hecho sustituciones conservadoras de aminoacidos. Las sustituciones conservadoras de uno o mas residuos de aminoacidos se introducen de manera preferente en la secuencia de peptidos en lugares donde no perturben la conformacion o actividad original. Por ejemplo, uno o mas residuos de aminoacidos de la secuencia pueden ser sustituidos por otro aminoacido de polaridad similar que actua como un equivalente funcional, produciendo una alteracion silenciosa. Las sustituciones de un aminoacido dentro de la secuencia pueden seleccionarse a partir de otros miembros de la clase a la que pertenece el aminoacido. Por ejemplo, los aminoacidos no polares (hidrofobicos) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano y metionina. Los aminoacidos neutros polares incluyen glicina, serina, treonina, cistefna, tirosina, asparagina y glutamina. Los aminoacidos (basicos) con carga positiva incluyen arginina, lisina e histidina. Los aminoacidos (acidos) con carga negativa incluyen acido aspartico y acido glutamico. Se entiende por lo general que dichas sustituciones son sustituciones conservadoras.

En otros modos de realizacion, un peptido o fragmento de uPAR humano que comprende o consiste en los dominios 2 y 3 (D2D3) correspondiente a los residuos 88-283 de uPAR soluble (suPAR) se utiliza como inmunogeno. Los peptidos que comprendan estas secuencias pueden producirse por una variedad de formas conocidas en el estado de la tecnica, por ej., expresion de genes clonados utilizando metodos recombinantes convencionales, aislamiento de celulas de origen, poblaciones de celulas que expresen altos niveles de, por ej., uPA o uPAR, etc. En caso de fragmentos mas cortos, pueden ser sintetizados qufmicamente.

Linfocitos B de nodulos linfaticos, bazos o sangre periferica de un animal primovacunado se fusionan con celulas de mieloma, generalmente en presencia de un agente favorecedor de la fusion como el polietilenglicol (PEG). Cualquiera de una serie de lfneas de celulas de mieloma de murino estan disponibles para dicho uso: lfneas de mieloma P3-NS1/1-Ag4-1, P3-x63-k0Ag8.653, Sp2/0-Agl4, o HL1-653 (disponibles en ATCC, Rockville, MD). Las etapas subsiguientes incluyen el cultivo en medio selectivo para que al final las celulas de mieloma parentales desactivadas y los linfocitos del donante mueran mientras que solo sobrevivan las celulas del hibridoma. Estas se clonan y cultivan y sus sobrenadantes se examinan para detectar la presencia de anticuerpos de la especificidad deseada, por ej., por tecnicas de inmunoensayo. Los clones positivos se clonan, por ej., por dilucion limitada, y se afslan los anticuerpos monoclonales.

Los hibridomas producidos segun estos metodos se pueden propagar in vitro o in vivo (en lfquido ascftico) utilizando tecnicas conocidas en el estado de la tecnica (ver en general Fink et al., Prog. Clin. Pathol. 9:121-33 (1984)). En general, la lfnea de celulas individual se propaga en cultivo y el medio de cultivo que contiene altas concentraciones de un unico anticuerpo monoclonal puede ser recogido por decantacion, filtrado o centrifugado.

Un metodo preferente para producir un mAb de acuerdo con la presente invencion es el siguiente.

Un epftopo de la tabla 2 se conjuga preferentemente con una protefna portadora, por ej., KLH, y se inyecta en ratones BALB/c intraperitonealmente (i.p.) en adyuvante completo de Freund (por ej., conjugado 50 pg), seguido de dos inyecciones adicionales de la misma dosis en adyuvante incompleto de Freund en intervalos de dos semanas. Despues de un mes, se administra una inyeccion final i.p. (por ej., 50 pg en 0,5 ml PBS) y preferentemente tambien de manera intravenosa (i.v.) (por ej., 50 pg en 0,2 ml) sin adyuvante.

Se recolectan celulas del bazo tres dfas despues de la inyeccion final y se fusionan con P3X63AF8/653 u otras celulas de mieloma utiizando tecnicas estandar.

Despues de la inmunizacion utilizando protocolos estandar, se emplean tecnicas convencionales para generar lfneas de celulas de hibridoma de los animales inmunizados y para generar anticuerpos monoclonales que tengan las propiedades deseadas.

3. Cribado y caracterizacion de anticuerpos del uPAR

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Para el cribado primario es preferible suPAR puro inmovilizado sobre plastico. Muchas lineas de celulas tumorales que sobreexpresan uPAR son muy conocidas y disponibles al publico; se pueden utilizar para el cribado. Por ejemplo, tambien pueden utilizarse celulas como la lfnea HeLa que sobreexpresan uPAR para demostrar la union celular de un mAb anti-uPAR. Las celulas se distribuyen por lo general en microplacas de 96 pocillos. Las celulas pueden fijarse, por ej., con metanol/acetona (50/50), y detectarse la union mediante tincion de inmunofluorescencia. De manera alternativa, los mAbs pueden etiquetarse, utilizando isotopos radiactivos u otros trazadores como biotina, y detectarse la union mediante la medicion de radioactividad o biotina.

En un modo de realizacion, un sobrenadante de hibridomas (por ej., 50 pl) se anade a pocillos que contengan 293 celulas fijadas durante aproximadamente 1,5 h. a 37°C. Las placas se lavan dos veces en tampon de lavado (como PBS/0.05% Tween-20), y se anade IgG de cabra anti raton conjugado con rojo de Rodamina (por ej., 30 pl/pocillo) en una dilucion adecuada, como 1:100, durante 1,5 h a 37°C. Despues del lavado en un tampon de lavado, se examinan las celulas para detectar la presencia de inmunofluorescencia; en el modo de realizacion aquf descrito, se utiliza un microscopio de fluorescencia.

En este modo de realizacion, la inmunofluorescencia es la base para determinar si un sobrenadante de hibridomas contiene un anticuerpo especffico para el complejo uPA/uPAR (aunque tambien puede utilizarse la tincion inmunohistoqufmica). Si los sobrenadantes muestran una tincion positiva se seleccionan y expanden los clones de hibridomas y se prueba la reactividad de los sobrenadantes al complejo mediante ELISA.

En un ensayo ELISA preferente, el peptido se acopla a ovalbumina (OVA) como protefna portadora y el conjugado peptido/OVA se distribuye en pocillos de una placa EIA de 96 pocillos que reciben, por ej., 2 pg/ml de conjugado en 50 pl de tampon de recubrimiento (0.2 M Na2CO3/NaHCO3, pH 9.6). Las placas se incuban durante la noche a 4° C, bloqueadas con un tampon de bloqueo adecuado, por ej., PBS que contenga 1% BSA (200 pl/pocillo) durante la noche a 4° C. Los sobrenadantes de hibridomas (por ej., 50 pl) se anaden a los pocillos durante 1,5 horas a temperatura ambiente.

Las placas se lavan dos veces en tampon de lavado (por ej., PBS/ 0,05% Tween-20), y se anade anticuerpo secundario acoplado a enzima, como IgG de cabra anti-raton acoplado a fosfatasa alcalina (50 pl/pocillo) en una dilucion adecuada, por ej., 1:2000. Las placas se incuban durante 1,5 horas a TA. Tras lavar 4x en tampon de lavado, se anade un sustrato cromogenico adecuado para la enzima, por ej., CP-nitrofenilfosfato en este modo de realizacion (disponible en Kirkegaard and Perry Co., Gaithersburg, MD), durante aproximadamente 30 minutos y se mide la absorbencia a una longitud de onda adecuada al producto coloreado (aquf 405nm). Los sobrenadantes de hibridomas que reaccionan con fuerza con el peptido portador del epftopo (por ej., A405 >1.0 cuando los controles negativos son <0.02) son reclonados (preferentemente dos veces) y se confirma de nuevo la reactividad de mAb mediante ELISA como anteriormente.

Los anticuerpos anti-uPAR de la divulgacion se ponen a prueba preferentemente en modelos de tumores xenogeneicos, de los que dos modelos preferentes son los modelos A2780 y A549 (descritos con mas detalle mas adelante).

Los anticuerpos se evaluan para detectar actividad anti-angiogenica directa en un modelo in vivo de tapon Matrigel. Se utilizan anticuerpos radioyodinados para probar la internalizacion de los anticuerpos utilizando celulas MDA MB 231 que expresan tanto el receptor como el ligando. La internalizacion de anticuerpos tambien se mide en presencia de PAI-1: complejos uPA.

4. Formas de anticuerpos

Los anticuerpos utilizados en los metodos de la divulgacion incluyen, sin animo exhaustivo, anticuerpos monoclonales, anticuerpos sinteticos, anticuerpos multiespecfficos (incluyendo anticuerpos bi-especfficos), anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos quimericos, Fvs monocatenarios (scFv) (incluyendo scFvs bi-especfficos), anticuerpos monocatenarios, fragmentos Fab, fragmentos F(ab'), Fvs unidos a disulfuros (sdFv), y fragmentos de union a epftopos de cualquiera de los anteriores. En particular, los anticuerpos utilizados en los metodos de la presente descripcion incluyen moleculas de inmunoglobulina y porciones inmunologicamente activas de moleculas de inmunoglobulina, es decir, moleculas que contienen un punto de union a antfgeno que se une inmunoespecfficamente a uPAR. Las moleculas de inmunoglobulina de la divulgacion pueden ser de cualquier tipo (por ej., IgG, IgE, IgM, IgD, IgA and IgY), clase (e.g., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 y IgA2) o subclase de moleculas de inmunoglobulina. Tambien se incluyen anticuerpos anti-idiotfpicos especfficos para el idiotipo de, por ejemplo, un anticuerpo anti-uPA/uPAR.

La divulgacion abarca tambien los derivados de anticuerpos . El termino "derivado" tal como se usa aquf hace referencia a un polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos de un anticuerpo que se une inmunoespecfficamente a un polipeptido de uPAR, o un fragmento de anticuerpo que se une inmunoespecfficamente a un polipeptido de uPAR, que ha sido alterado por la introduccion de sustituciones, supresiones o adiciones de residuos de aminoacidos (es decir, mutaciones). En algunos modos de realizacion, un derivado de anticuerpo o fragmento del mismo comprende sustituciones, supresiones o adiciones de residuos de aminoacidos en una o mas

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CDRs. El derivado del anticuerpo puede tener sustancialmente la misma union, mejor union o peor union cuando se compara con un anticuerpo no derivado. En modos de realizacion espedficos, se han sustituido, suprimido o anadido (es decir, mutado) uno, dos, tres, cuatro o cinco residuos de aminoacidos de la CDR. El termino "derivado" tal como se usa aqrn tambien se refiere a un anticuerpo que se une inmunoespedficamente a uPAR, o un fragmento de anticuerpo que se une inmunoespedficamente a un uPAR que ha sido modificado, es decir, por la fijacion covalente de cualquier tipo de molecula al polipeptido. Por ejemplo, pero sin animo exhaustivo, un anticuerpo del uPAR, o fragmento de anticuerpo del uPAR puede ser modificado, por ej., por glicosilacion, acetilacion, pegilacion, fosforilacion, amidacion, derivatizacion por grupos de bloqueo/protectores conocidos, escision proteolftica, union a un ligando celular u otra protema, etc. Un derivado de un anticuerpo del uPAR, o fragmento de anticuerpo, puede ser alterado por modificaciones qrnmicas usando tecnicas conocidas para los expertos en la materia, incluyendo, sin animo exhaustivo, escision qrnmica, acetilacion, formilacion, smtesis metabolica de tunicamicina, etc. Ademas, un derivado de un anticuerpo del uPAR o fragmento de anticuerpo, puede contener uno o mas aminoacidos no clasicos.

Los anticuerpos usados en los metodos de la divulgacion pueden ser de origen animal incluyendo aves y mamfteros (por ej., humanos, murinos, asnos, ovejas, conejos, cabras, conejillos de indias, camellos, caballos o pollos). En un modo de realizacion espedfico, los metodos de la invencion pueden ser de un mam^era no humano. De manera preferente, los anticuerpos son humanos o anticuerpos monoclonales humanizados. Como se utiliza aqrn, los anticuerpos "humanos" incluyen anticuerpos que tienen la secuencia de aminoacidos de la inmunoglobulina humana e incluyen anticuerpos aislados de bancos de inmunoglobulina humana o de ratones u otros animales que expresen anticuerpos de genes humanos.

Los anticuerpos usados en los metodos de la presente divulgacion pueden ser monoespedficos, biespedficos, triespedficos o de una multiespecificidad mayor. Los anticuerpos multiespedficos pueden unirse inmunoespedficamente a diferentes epftopos de uPAR o pueden unirse inmunoespedficamente a uPAR y a un epftopo heterologo, como un polipeptido heterologo o un material de soporte solido. Ver, por ej., las publicaciones internacionales nros. WO 93/17715, WO 92/08802, WO 91/00360, y WO 92/05793; Tutt, et al., 1991, J. Immunol. 147:60-69; patentes estadounidenses nros. 4,474,893, 4,714,681, 4,925,648, 5,573,920, y 5,601,819; y Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148:1547-1553. En ciertos modos de realizacion, un anticuerpo biespedfico que se une al epftopo de ATN-658 y otro epftopo uPAR. Ver Gardsvoll et al., 2006, J. Biol. Chem. 281(28):19260-72; Gardsvoll et al., 1999, J. Biol. Chem. 274(53):37995-8003.

Los anticuerpos de la presente divulgacion tambien pueden ser generados utilizando varios metodos de expresion en fago conocidos en el estado de la tecnica. En los metodos de expresion en fago, los dominios de anticuerpos funcionales se expresan en la superficie de partfculas de fago que transportan las secuencias polinucleotidas que los codifican. En particular, secuencias de ADN que codifican dominios VH y VL son amplificadas a partir de bibliotecas de ADNc animal (por ej., bibliotecas de ADNc de tejidos linfoides murinos o humanos). El ADN que codifica los dominios Vh y Vl se recombinan juntos con un enlace scFv por PCR y se clonan en un vector fagemida (por ej., p CANTAB 6 o pComb 3 HSS). El vector es electroporado en E. coli y el E. coli se infecta con fagos ayudantes. Los fagos utilizados en estos metodos son por lo general fagos filamentosos incluyendo fd y M13 y los dominios Vh and Vl se fusionan por lo general de manera recombinante al gen III o gen VIII del fago. Los fagos que expresan un dominio de union a antfgeno que se une al epftopo uPAR de interes pueden ser seleccionados o identificados con antfgeno, por ej., utilizando antfgeno marcado o antfgeno unido o fijado a una superficie solida o gota. Ejemplos de metodos de expresion en fago que pueden utilizarse para hacer los anticuerpos de la presente divulgacion incluyen los mencionados en Brinkman et al., 1995, J. Immunol. Metodos 182:41-50; Ames et al., 1995, J. Immunol. Metodos 184:177; Kettleborough et al., 1994, Eur. J. Immunol. 24:952-958; Persic et al., 1997, Gene 187:9; Burton et al., 1994, Advances in Immunology 57:191-280; Solicitud Internacional nro.. PCT/GB91/01134; Publicaciones Internacionales nros. WO 90/02809, WO 91/10737, WO 92/01047, WO 92/18619, WO 93/1 1236, WO 95/15982, WO 95/20401, and WO97/13844; and U.S. Patent Nos. 5,698,426, 5,223,409, 5,403,484, 5,580,717, 5,427,908, 5,750,753, 5,821,047, 5,571,698, 5,427,908, 5,516,637, 5,780,225, 5,658,727, 5,733,743 and 5,969,108.

Tal como se describe en las anteriores referencias, despues de la seleccion del fago, las regiones de codificacion de anticuerpos del fago pueden aislarse y usarse para generar anticuerpos completos, incluyendo anticuerpos humanos, o cualquier otro fragmento de union a antfgeno deseado y expresado en cualquier huesped deseado, incluyendo celulas de mamftero, de insecto, de vegetales, levadura, y bacterias, por ej., tal como se describe mas adelante. Tambien pueden emplearse tecnicas para producir de forma recombinante fragmentos Fab, Fab' y F(ab')2 utilizando metodos conocidos en el estado de la tecnica como los divulgados en la Publicacion Internacional nro. WO 92/22324; Mullinax et al., 1992, BioTechniques 12:864; Sawai et al., 1995, AJRI 34:26; y Better et al., 1988, Science 240:1041.

Para generar anticuerpos completos, se puede emplear iniciadores PCR incluyendo secuencias de nucleotidos VH o VL, un punto de restriccion y una secuencia flanqueadora para proteger el punto de restriccion para amplificar las secuencias Vh o Vl en clones scFv. Utilizando tecnicas de clonado conocidas por los expertos en la materia, los dominios Vh amplificados por PCR pueden clonarse en vectores que expresen una region constante Vh, por ej., la region constante humana gamma 4, y los dominios Vl amplificados por PCR pueden clonarse en vectores que expresen una region VL constante, por ej., regiones constantes humanas kappa o lambda. Los dominios Vh y Vl tambien pueden clonarse en un vector que exprese las regiones constantes necesarias. Los vectores de conversion

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de cadena pesada y los vectores de conversion de cadena ligera son co-transfectados a continuacion a lineas de celulas para generar lineas de celulas estables o transitorias que expresen anticuerpos de longitud completa, por ej., IgG, usando tecnicas conocidas por los expertos en la materia.

4.1. Fragmentos de anticuerpos

Se entiende que el termino "anticuerpo" incluye tanto moleculas de inmunoglobulina intacta (Ig) como fragmentos y derivados de ellas, que pueden ser producidas por escision proteolftica de moleculas Ig o por manipulacion genetica o quimica. Los fragmentos incluyen, por ejemplo, Fab, Fab', F(ab')2 y Fv, cada uno de los cuales es capaz de unirse a antigenos. Los "fragmentos" aquf descritos incluyen un peptido o polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos de al menos 5 residuos de aminoacidos contiguos, al menos 10 residuos de aminoacidos contiguos, al menos 15 residuos de aminoacidos contiguos, al menos 20 residuos de aminoacidos contiguos, al menos 25 residuos de aminoacidos contiguos, al menos 40 residuos de aminoacidos contiguos, al menos 50 residuos de aminoacidos contiguos, al menos 60 residuos de aminoacidos contiguos, al menos 70 residuos de aminoacidos contiguos, al menos 80 residuos de aminoacidos contiguos, al menos 90 residuos de aminoacidos contiguos, al menos 100 residuos de aminoacidos contiguos, al menos 125 residuos de aminoacidos contiguos, al menos 150 residuos de aminoacidos contiguos, al menos 175 residuos de aminoacidos contiguos, al menos 200 residuos de aminoacidos contiguos, o al menos 250 residuos de aminoacidos contiguos de la secuencia de aminoacidos de un anticuerpo que se une inmunoespecfficamente a polipeptido de uPAR. De manera preferente, los fragmentos de anticuerpos son fragmentos de union a epftopo.

Un fragmento Fab es una proteina multimerica que consiste en la porcion de una molecula Ig que contiene las porciones inmunologicamente activas de una cadena de Ig pesada (H) y una cadena Ig ligera (L) acopladas de forma covalente y capaces de combinarse especificamente con antigeno. Un fragmento (Fab') 2 es un tetramero que incluye un fragmento de dos cadenas H y dos cadenas L. El fragmento Fv es una proteina multimerica que consiste en las porciones inmunologicamente activas de una region (VH) variable (V) de cadena Ig H y una region (VL) de cadena Ig L acopladas de forma covalente y capaces de combinarse especificamente con antigenos. Estos fragmentos carecen del fragmento Fc de anticuerpo intacto y tienen la ventaja adicional, si se usan terapeuticamente, de quitarse mas rapidamente de la circulacion y sufrir menos union de tejido no especffica que los anticuerpos intactos. Estos diversos fragmentos se producen utilizando tecnicas convencionales como escision por proteasa o escision quimica (ver, por ej., Rousseaux et al., Meth.Enzymol., 121:663-69(1986)). Por ejemplo, el tratamiento con papafna de Ig produce fragmentos Fab; el tratamiento con pepsina produce fragmentos F(ab')2. Estos fragmentos pueden producirse tambien por manipulacion genetica o de protefnas usando metodos bien conocidos en el estado de la tecnica. Por ejemplo, un fragmento Fab tambien puede prepararse expresando en una celula huesped adecuada las porciones deseadas de la cadena H y cadena L Ig usando metodos bien conocidos en el estado de la tecnica. Los fragmentos Fv se preparan normalmente expresando en una celula huesped adecuada las porciones deseadas de region VH y region VL Ig usando metodos bien conocidos por la tecnica.

4.2. Anticuerpos monocatenarios

Los anticuerpos de la presente divulgacion pueden ser producidos como un anticuerpo monocatenario o ScFv en lugar de la estructura normal multimerica. La proteina fijadora del antigeno de cadena sencilla o el anticuerpo monocatenario, tambien conocido como "scFv", es un polipetido compuesto de una secuencia de aminoacidos Ig VL unido a una secuencia de aminoacidos Ig VH por un peptido que une el extremo C de la secuencia VL al extremo N de la secuencia Vh. (Skerra, A. et al. (1988) Science, 240: 1038-1041; Pluckthun, A. et al. (1989) Methods Enzymol. 178: 497-515; Winter, G. et al. (1991) Nature, 349: 293-299); Bird et al., (1988) Science 242: 423; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879; Jost CR et al., J Biol Chem. 1994 269:26267-26273; patentes estadounidenses nros. 4,704,692; 4,853,871; 4,94,6778; 5,260,203; 5,455,030). Secuencias de ADN que codifican regiones V de la cadena H y la cadena L estan ligadas a un enlace que codifica al menos 4 aminoacidos (normalmente pequenos aminoacidos neutros). La proteina codificada por esta fusion permite el ensamblaje de una region variable funcional que conserva la especificidad y afinidad del anticuerpo original. En modos de realizacion especfficos, scFvs incluyen scFvs biespecfficos y scFvs humanizados.

Un metodo para producir anticuerpos monocatenarios es unir dos o mas peptidos o polipeptidos juntos mediante tecnicas de quimica de protefnas. Por ejemplo, los peptidos y polipeptidos pueden sintetizarse qufmicamente utilizando el equipo de laboratorio actualmente disponible usando o bien Fmoc (9-fluorenilmetiloxicarbonilo) o tBoc (tert-butiloxicarbonilo). (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). Un experto en la materia puede apreciar inmediatamente que un peptido o un polipeptido correspondiente a una cadena de anticuerpos o fragmento fijador del antigeno de los mismos puede ser sintetizado por reacciones qufmicas estandar. Por ejemplo, un peptido o polipeptido pueden sintetizarse pero no escindirse de su resina de sfntesis mientras que el otro fragmento de anticuerpo puede ser sintetizado y posteriormente escindido de la resina, dejando expuesto por lo tanto un grupo terminal que es funcionalmente bloqueado en el otro fragmento. Por reacciones de condensacion de peptidos, estos dos fragmentos pueden unirse covalentemente a traves de un enlace peptfdico en sus extremos C y N, respectivamente para formar un anticuerpo, o un fragmento del mismo. (Grunt, GA, Synthetic Peptides: A User Guide, W. H. Freeman and Co., N.Y. (1992); Bodansky, M et al., eds, Principles of Peptide Synthesis, Springer- Verlag Inc., N.Y. (1993)).

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Se pueden seleccionar anticuerpos para las propiedades particulares que se deseen. En el caso de un anticuerpo para utilizar in vivo, los procedimientos de cribado de anticuerpo pueden incluir cualquiera de los bioensayos in vitro o in vivo que miden la fijacion a por ej., un complejo uPA/uPAR o uPAR-integrina, a celulas que expresan el polipeptido o epftopo del peptido relevantes.

4.3. Anticuerpos humanos, humanizado y quimericos

Para algunos usos, incluyendo el uso in vivo de anticuerpos en humanos y ensayos de deteccion in vitro, puede ser preferible usar anticuerpos humanos o quimericos. Los anticuerpos completamente humanos son particularmente deseables para el tratamiento terapeutico de sujetos humanos.

Un anticuerpo quimerico es una molecula en la que diferentes porciones del anticuerpo son derivadas de diferentes moleculas de inmunoglobulina. Los metodos para producir anticuerpos quimericos son conocidos en el estado de la tecnica. Ver, por ej., Morrison 1985, Science 229:1202; Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214; Gillies et al., 1989, J. Immunol. Methods 125:191-202; y patentes estadounidenses nros. 6,311,415, 5,807,715,4,816,567, y 4,816,397. Los anticuerpos quimericos que comprenden una o mas CDRs de una especie y regiones marco de otra especie diferente pueden ser producidos utilizando una variedad de tecnicas conocidas en el estado de la tecnica incluyendo, por ejemplo, injertos CDR (EP 239,400; Publicacion internacional nro. WO 91/09967; y patentes estadounidenses nros. 5,225,539, 5,530,101, y 5,585,089), la remodelacion de la superficie (EP 592,106; EP 519,596; Padlan, 1991, Molecular Immunology 28(4/5):489-498; Studnicka et al., 1994, Protein Engineering 7:805; and Roguska et al., 1994, PNAS 91:969), y el intercambio de cadenas (patente estadounidense nro. 5,565,332).

Se pueden preparar anticuerpos, fragmentos o derivados que tengan cadenas quimericas H y cadenas L de la misma o diferente especificidad de fijacion de region V mediante la asociacion adecuada de las cadenas de polipeptidos individuales, como ensenan, por ejemplo Sears et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72: 353-357 (1975).

Con este metodo, se cultivan separadamente huespedes que expresan cadenas H quimericas (o sus derivados) a partir de huespedes que expresan cadenas quimericas L (o sus derivados), y las cadenas Ig se recuperan separadamente y luego se asocian. De manera alternativa, los huespedes pueden ser co-cultivados y dejar que las cadenas se asocien espontaneamente en el medio de cultivo, seguido de la recuperacion del Ig, fragmento o derivado ensamblados.

Tal como se utiliza aquf, el termino "anticuerpo quimerico" incluye Igs. monovalentes, divalentes o polivalentes. Un Ab quimerico monovalente es un dfmero HL formado por una cadena H quimerica asociada a traves de puentes de disulfuro con una cadena L quimerica. Un Ab quimerico divalente es un tetramero H2L2 formado por dos dfmeros HL asociados a traves de al menos un puente disulfuro. Un Ab quimerico polivalente tambien puede ser producido, por ejemplo, empleando una region CH que se una (por ej., de una cadena H IgM, denominada la cadena p).

La descripcion tambien proporciona "derivados" de los anticuerpos quimericos, termino que incluye aquellas protefnas codificadas por genes truncados o modificados para producir especies moleculares que se parezcan funcionalmente a los fragmentos de Ig. Las modificaciones incluyen, sin animo exhaustivo, la adicion de secuencias geneticas que codifiquen protefnas citotoxicas como toxinas vegetales y bacterianas. Los fragmentos y derivados pueden ser producidos a partir de cualquiera de los huespedes descritos.

Un anticuerpo humanizado se refiere a un anticuerpo no humano (por ej., murino) que es un anticuerpo quimerico que contiene una secuencia minima derivada de inmunoglobulina no humana. En su mayorfa, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los residuos de region hipervariable del receptor son reemplazados por residuos de region hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante) como raton, rata, conejo o primate no humano que tenga la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. Un anticuerpo humanizado comprende sustancialmente todos de al menos uno, y normalmente dos, dominios variables en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las que una inmunoglobulina no humana (por ej., anticuerpo de donante) y todas o sustancialmente todas las regiones marco son las de una secuencia de consenso de inmunoglobulina humana. De manera preferente, un anticuerpo humanizado tambien comprende al menos una porcion de una region constante de inmunoglobulina (Fc), normalmente la de una inmunoglobulina humana. Generalmente el anticuerpo contendra tanto la cadena ligera como al menos el dominio variable de la cadena pesada. El anticuerpo tambien puede incluir las regiones CH1, bisagra, CH2, CH3 y CH4 de la cadena pesada. El anticuerpo humanizado puede ser seleccionado a partir de cualquier clase de inmunoglobulinas, incluyendo IgM, IgG, IgD, IgA e IgE, y cualquier isotipo, incluyendo IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Generalmente el dominio constante es un dominio constante fijador del complemento del que conviene que el anticuerpo humanizado muestre actividad citotoxica y la clase es normalmente IgG1. Cuando dicha actividad citotoxica no es deseable, el dominio constante puede ser de la clase IgG2. El anticuerpo humanizado puede comprender secuencias de mas de una clase o isotipo, y seleccionar dominios particulares constantes para optimizar las funciones deseadas del efector entra dentro de las competencias normales de la tecnica. El marco y regiones CDR de un anticuerpo humanizado no necesitan corresponder precisamente a las secuencias parentales, por ej., el marco de consenso o CDR del donante pueden ser mutagenizados por sustitucion, insercion o supresion de al menos un residuo para que el residuo del

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marco o CDR en ese punto no corresponda ni al anticuerpo de consenso o importacion. Dichas mutaciones, sin embargo, no seran extensivas. Por lo general, al menos el 75% de residuos de anticuerpo humanizado corresponded a los de la region del marco parental (FR) y secuencias CDR, mas a menudo el 90%, y mas preferiblemente mas del 95%. Se puede producir anticuerpos humanizados usando una variedad de tecnicas conocidas por la tecnica, incluyendo sin animo exhaustivo, los injertos CDR (patente europea nro. EP 239,400; publicacion internacional nro. WO 91/09967; y patentes estadounidenses nros. 5,225,539, 5,530,101 y 5,585,089), la remodelacion de la superficie (patentes europeas nros. EP 592,106 y EP 519,596; Padlan, 1991, Molecular Immunology 28(4/5):489-498; Studnicka et al., 1994, Protein Engineering 7(6):805-814; y Roguska et al., 1994, PNAS 91:969-973), el intercambio de cadenas (patente estadounidense nro. 5,565,332), y tecnicas descritas en, p. ej., las patentes estadounidenses nros. 6,407,213, 5,766,886, 5,585,089, la publicacion internacional nro. WO 9317105, Tan et al., 2002, J. Immunol. 169:1119-25, Caldas et al., 2000, Protein Eng. 13:353-60, Morea et al., 2000, Methods 20:267-79, Baca et al., 1997, J. Biol. Chem. 272:10678-84, Roguska et al., 1996, Protein Eng. 9:895-904, Couto et al., 1995, Cancer Res. 55 (23 Supp): 5973s-5977s, Couto et al., 1995, Cancer Res. 55:1717-22, Sandhu, 1994, Gene 150:409-10, Pedersen et al., 1994, J. Mol. Biol. 235:959-73, Jones et al., 1986, Nature 321:522-525, Riechmann et al., 1988, Nature 332:323, y Presta, 1992, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596. Los anticuerpos humanos pueden realizarse mediante una variedad de metodos conocidos por la tecnica incluyendo metodos de expresion en fago descritos anteriormente utilizando bancos de anticuerpos derivados de secuencias de inmunoglobulina humana. Ver tambien patentes estadounidenses nros. 4,444,887 and 4,716,111; y publicaciones internacionales nros. WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735, y WO 91/10741. A menudo, los residuos marco de las regiones marco seran sustituidos por el correspondiente residuo del anticuerpo donante de CDR para alterar, y preferentemente mejorar, la fijacion del antfgeno. Estas sustituciones marco se identifican mediante metodos bien conocidos de la tecnica, por ej., por el modelado de las interacciones de los residuos marco y CDR para identificar residuos marco importantes para la fijacion del antfgeno y comparacion de secuencias para identificar residuos marco inusuales en posiciones particulares. (Ver, p. ej., Queen et al., patente estadounidense nro. 5,585,089; y Riechmann et al., 1988, Nature 332:323.)

En un modo de realizacion, un anticuerpo humanizado de la descripcion se fija inmunespecfficamente a uPAR y comprende una, dos o tres CDRs VL de un anticuerpo de uPAR en regiones marco humanas. En otro modo de realizacion, un anticuerpo humanizado de la descripcion se fija inmunespecfficamente a uPAR y comprende una, dos o tres CDRs VH en regiones marco humanas. En un modo de realizacion preferente, un anticuerpo humanizado de la descripcion se fija inmunespecfficamente a uPAR y comprende una, dos o tres CDRs Vl y ademas comprende una, dos o tres CDRs Vh en regiones marco humanas. En un modo de realizacion preferente, un anticuerpo humanizado de la descripcion se fija inmunespecfficamente a uPAR y comprende tres CDRs Vl y tres CDRs Vh en regiones marco humanas. A menudo, los residuos marco de las regiones marco seran sustituidos por el correspondiente residuo del anticuerpo donante de CDR para alterar, y preferentemente mejorar, la fijacion del antfgeno. Estas sustituciones marco se identifican mediante metodos bien conocidos de la tecnica, por ej., por el modelado de las interacciones de los residuos marco y CDR para identificar residuos marco importantes para la fijacion del antfgeno y comparacion de secuencias para identificar residuos marco inusuales en posiciones particulares. (Ver, por ej., patente estadounidense nro. 5,585,089; y Riechmann et al., 1988, Nature 332:323.)

Por lo tanto, en un modo de realizacion, los anticuerpos quimericos de la descripcion comprenden cadenas Ig H y L quimericas individuales. La cadena H quimerica comprende una region de fijacion del antfgeno derivada de la cadena H de un Ab no humano especffico para, por ej., un complejo uPA/uPAR o uPAR-integrina que esta unido a al menos una porcion de una region CH humana. Una cadena quimerica L comprende una region de union al antfgeno derivada de la cadena L de un anticuerpo no humano especffico para el antfgeno de destino unido a al menos una porcion de una region Cl humana. Tal como se utiliza aquf, el termino "region de union al antfgeno" se refiere a esa porcion de una molecula de anticuerpo que contiene los residuos aminoacidos que interaction con un antfgeno y confieren al anticuerpo su especificidad y afinidad para con el antfgeno. La region del anticuerpo incluye los residuos aminoacidos "marco" necesarios para mantener la conformacion correcta de los residuos de union a antfgeno (o "de contacto").

Los anticuerpos humanos son anticuerpos que se producen utilizando ratones transgenicos que son incapaces de expresar inmunoglobulinas endogenas funcionales pero que pueden expresar genes de inmunoglobulina humana. Por ejemplo, los complejos de genes de inmunoglobulina de cadena ligera o pesada humanos se pueden introducir aleatoriamente o por recombinacion homologa en celulas madre embrionicas de raton. De manera alternativa, la region variable, region constante y region de diversidad humanas se pueden introducir en las celulas madre embrionicas de raton ademas de los genes de cadena ligera y pesada humanos. Los genes de inmunoglobulina de raton de cadena ligera y pesada pueden ser hechos no funcionales separada o simultaneamente con la introduccion de loci de inmunoglobulina humanos por recombinacion homologa. En particular, la supresion de homocigotos de la region JH impide la produccion de anticuerpos endogenos. Las celulas madre embrionicas modificadas se expanden y microinyectan en blastocistos para producir ratones quimericos. Los ratones quimericos se utilizan a continuacion para producir descendencia homocigota que exprese anticuerpos humanos. Los ratones transgenicos se inmunizan de la forma normal con un antfgeno seleccionado, por ej., todo o parte de un polipeptido de la invencion. Anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antfgeno pueden obtenerse de ratones transgenicos, inmunizados utilizando tecnologfa de hibridomas convencional. Los transgenes de inmunoglobulina humanos albergados por los ratones transgenicos se reorganizan durante la diferenciacion de celulas B y posteriormente experimentan cambio de clase y

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mutacion somatica. Por lo tanto, utilizando dicha tecnica, es posible producir anticuerpos IgG, IgA, IgM e IgE terapeuticamente utiles. Para un resumen de esta tecnologfa para producir anticuerpos humanos, ver Lonberg y Huszar (1995, Int. Rev. Immunol. 13:65-93). Para una descripcion detallada de esta tecnologfa para producir anticuerpos humanos y anticuerpos monoclonales humanos y protocolos para producir dichos anticuerpos, ver, por ej., las publicaciones internacionales nros. WO 98/24893, WO 96/34096, y WO 96/33735; y las patentes estadounidenses nros. 5,413,923, 5,625,126, 5,633,425, 5,569,825, 5,661,016, 5,545,806, 5,814,318, y 5,939,598. Ademas, se puede contactar con empresas como Abgenix, Inc. (Fremont, CA) y Medarex (Princeton, NJ) para obtener anticuerpos humanos dirigidos contra un antfgeno seleccionado utilizando tecnologfa similar a la descrita anteriormente.

La region de union a antfgeno del anticuerpo quimerico (o un anticuerpo monoclonal humano) de la presente descripcion se deriva preferentemente de un anticuerpo no humano especffico para, por ej., complejo uPA/uPAR o uPAR/integrina. Fuentes preferentes para la codificacion del ADN como un anticuerpo no humano incluyen lfneas de celulas que producen anticuerpos, preferentemente hibridomas, por ej., el hibridoma ATN-658.

De manera alternativa, el anticuerpo no humano productor de celulas de las que se deriva la region V del Ab de la descripcion puede ser un linfocito B obtenido de la sangre, bazo, nodulos linfaticos u otros tejidos de un animal inmunizado con D2D3 de suPAR. La celula productora de Ab que aporta las secuencias de nucleotidos que codifican la region de union a antfgeno del anticuerpo quimerico de la presente descripcion tambien puede ser producida por transformacion de una celula no humana, como de un primate, o de una celula humana. Por ejemplo, un linfocito B que produce un anticuerpo especffico, por ej., un complejo uPA/uPAR o uPAR-integrina puede ser infectado y transformado con un virus como el virus Epstein-Barr para obtener una celula productora de Ab inmortal (Kozbor et al. Immunol. Today 4:72-79 (1983)). De manera alternativa, el linfocito B puede ser transformado proporcionando un gen transformado o producto de gen transformador, como bien se conoce en la tecnica. De manera preferente, la region de union a antfgeno sera de origen murino. En otros modos de realizacion, la region de union a antfgeno puede derivarse de otras especies animales, en particular roedores como ratas o hamsters.

El anticuerpo monoclonal quimerico de la presente descripcion puede ser producido en grandes cantidades inyectando celulas de hibridoma o transfectoma secretando el anticuerpo a la cavidad peritoneal de ratones y, tras el tiempo adecuado, recolectando el lfquido ascftico que contiene una elevada titulacion del anticuerpo monoclonal y aislando el anticuerpo monoclonal del mismo. Para dicha produccion in vivo del mAb con un hibridoma no murino (por ej. de rata o humano), las celulas de hibridoma se cultivan preferentemente en ratones desnudos atfmicos o irradiados.

De manera alternativa, los anticuerpos pueden ser producidos cultivando celulas de hibridoma (o transfectoma) in vitro y aislando el mAb secretado del medio de cultivo celular.

Los genes humanos que codifican las regiones C constantes de los anticuerpos quimericos de la presente descripcion pueden derivarse de un banco de hfgado fetal humano o de cualquier celula humana incluyendo aquellos que expresan y producen Igs. humanos. La region humana CH puede derivarse de cualquiera de las clases o isotipos conocidos de cadenas H humanas, incluyendo gamma, mi, alfa, delta o eta, y subtipos de los mismos, como G1, G2, G3 and G4.

Dado que el isotipo de cadena H es responsable de las diversas funciones del efector de un Ab, la eleccion de region CH estara guiada por las funciones de efector deseadas, como la fijacion de complementos, o actividad en citotoxicidad celular dependiente de Ab (ADCC). De manera preferente, la region CH deriva de y1 (IgG1), y3 (IgG3), Y4 (IgG4), o p (IgM).

La region CL humana puede derivarse de cualquier isotipo de cadena L humana, k o A.

Genes que codifican regiones Ig humanas se obtienen de celulas humanas por tecnicas de clonacion estandar (Sambrook J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY(1989)). Los genes de region C humana estan facilmente disponibles a partir de clones conocidos que contienen genes que representan las dos clases de cadenas L, las cinco clases de cadenas H y subclases de los mismos. Fragmentos de Ab quimericos, como F(ab')2 y Fab, pueden prepararse disenando un gen de cadena H quimerico que este adecuadamente truncado. Por ejemplo, un gen quimerico que codifique una porcion de cadena H de un fragmento F(ab')2 incluirfa secuencias de ADN que codifiquen la region bisagra, dominio y CH de la cadena H, seguido por un codon de terminacion translacional para producir la molecula truncada.

En general, los anticuerpos quimericos de la presente descripcion se producen clonando segmentos de ADN que codifican regiones de union a antfgeno de cadena H y L de un anticuerpo especffico de la descripcion, preferentemente no humano, y uniendo estos segmentos de ADN a segmentos de ADN que codifiquen regiones CH y CL humanas, respectivamente, para producir genes que codifican Ig quimericos.

Por lo tanto, en un modo de realizacion preferente, un gen fusionado que comprende un primer segmento de ADN que codifica al menos la region de union a antfgeno de origen no humano, como una region V funcionalmente

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reorganizada con segmento (J) de union, fijado a un segundo segmento de ADN que codifica al menos una parte de una region C humana.

El ADN que codifica la region de union a Ab puede ser ADN genomico o ADNc. Una alternativa conveniente al uso de fragmentos de gen cromosomial como fuente de ADN que codifica el segmento de union a antfgeno de region V murino es el uso de ADNc para la construccion de genes Ig quimericos, tal como menciona Liu et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3439 (1987); J. Immuno. 139:3521 (1987).

El uso de ADNc requiere que los elementos de expresion del gen adecuados para la celula huesped se combinen con el gen a fin de lograr la sfntesis de la protefna deseada. El uso de secuencias de ADNc tiene ventajas sobre las secuencias genomicas (que contienen intrones), porque las secuencias de ADNc pueden expresarse en bacterias y otros huespedes que carecen de sistemas de empalme de ARN adecuados.

Por lo tanto, en un modo de realizacion que utiliza ADNc que codifica la region V de Ab, el metodo de producir Ab quimerico implica varios pasos, indicados a continuacion:

1. Aislamiento del ARN mensajero (ARNm) de la lfnea de celulas que produce el mAb, clonacion y produccion de ADNc a partir del mismo;

2. Preparacion de una biblioteca de ADNc de longitud completa a partir de ARNm purificado de los que los segmentos de genes de region V adecuados de los genes de cadena L y H pueden ser: (i) identificados con probetas adecuadas, (ii) secuenciados, y (iii) hechos compatibles con un segmento de gen C;

3. Preparacion de segmentos de gen de region C por preparacion y clonacion de ADNc;

4. Construccion de secuencias de codificacion de cadena H o L completa por enlace de los segmentos de gen de region V clonados especfficos a gen de region C humano clonado, tal como se ha descrito arriba;

5. Expresion y produccion de cadenas L y H quimericas en huespedes seleccionados, incluyendo celulas eucariotas y procariotas.

Una caracterfstica comun de todos los genes de cadena L y H Ig y sus ARNm codificados es la region J. Las regiones J de cadena H y L tienen secuencias diferentes, pero existe un grado elevado de homologfa de secuencia (mayor del 80%) entre cada grupo, especialmente cerca de la region C. Esta homologfa es aprovechada en este metodo y se puede utilizar secuencias de consenso de regiones J de cadena H y L para disenar oligonucleotidos para su uso como iniciadores para introducir puntos de restriccion utiles en la region J para el posterior enlace de segmentos de region V a segmentos de region C humanos.

Vectores de ADNc de region C preparados a partir de celulas humanas pueden ser modificados por mutagenesis dirigida para colocar un punto de restriccion en la posicion analoga en la secuencia humana. Por ejemplo, se puede clonar la region C de cadena k (Ck) y la region C y-1 humana completa (CY-1). En este caso, el metodo alternativo basado en clones de region C genomica como fuente para vectores de region C no permitirfan expresarse a estos genes en sistemas bacterianos donde no haya enzimas necesarias para eliminar las secuencias intervinientes. Los segmentos de region V clonados son eliminados y ligados a vectores de region C de cadena L o H.

De manera alternativa, la region C y-1 humana puede ser modificada introduciendo un codon de terminacion generando asf una secuencia de genes que codifica la porcion de cadena H de una molecula Fab. Las secuencias de codificacion con regiones V y C enlazadas son transferidas a continuacion a vehfculos de expresion adecuados para su expresion en huespedes apropiados, procariotas y eucariotas.

Se dice que dos secuencias de ADN codificadoras estan "operativamente enlazadas" si el enlace tiene como resultado una secuencia continuamente traducible sin alteracion o interrupcion del marco de lectura del triplete. Una secuencia de codificacion de ADN esta operativamente enlazada a un elemento de expresion genica si el enlace permite la funcion correcta de ese elemento de expresion genica para tener como resultado la expresion de la secuencia de codificacion.

Vehfculos de expresion incluyen plasmidos y otros vectores. Entre estos vehfculos los preferidos son vehfculos que transportan una secuencia de cadena cH o CL humana funcionalmente completa con puntos de restriccion adecuados manipulados de forma que la secuencia de cadena VH o VL con entremos cohesivos adecuados pueda ser facilmente insertada en ellos. Los vehfculos que contienen una secuencia de cadena CH o CL humana sirven por lo tanto como intermediarios para la expresion de cualquier cadena L o H completa deseada en cualquier huesped adecuado.

Un anticuerpo humano-raton quimerico sera normalmente sintetizado a partir de genes producidos por los promotores genicos cromosomiales originarios de las regiones V de cadena H y L del raton utilizados en los constructos. El empalme se produce por lo general entre el sitio donador de empalme en la region J del raton y el sitio aceptor de empalme que precede a la region C humana y tambien en las regiones de empalme que se producen en la region CH humana; la terminacion de transcripcion y poliadenilacion se produce en sitios cromosomicos nativos de retorno (downstream) de las regiones de codificacion humanas.

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Elementos de expresion genica utiles para la expresion de genes de ADNc incluyen: (a) promotores de transcripcion viral y sus elementos potenciadores, tales como el promotor temprano del SV40 (Okayama, H. et al., Mol. Cell. Biol. 3:280 (1983)), Virus del sarcoma de Rous LTR (Gorman C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 79:6777 (1982) y Virus de la leucemia murina de Moloney LTR (Grosschedl, R. et al., Cell 41:885 (1985)); (b) sitios de poliadenilacion y regiones de empalme como los derivados de la region tardfa de SV40 (Okayama et al., supra) y sitios de poliadenilacion como en SV40 (Okoyama et al., supra).

Los genes de ADNc Ig pueden expresarse como se describe en Liu et al.., supra, y Weidle, UH et al.., Gene 51:2129 (1987), utiizando como elementos de expresion el promotor temprano del SV40 y su potenciador, los potenciadores del promotor de cadena H Ig de raton, empalme de ARNm de region tardfa del SV40, secuencia interviniente beta globina de conejo, sitios de poliadenilacion de beta globina de conejo e Ig, y elementos de poliadenilacion del SV40. Para genes Ig compuestos en parte de ADNc, en parte de ADN genomico (Whittle, N et al., Protein Eng. 1:499-505 (1987)), el promotor transcripcional es citomegalovirus humano, los potenciadores del promotor son citomegalovirus e Ig raton/humano y las regiones de poliadenilacion y empalme de ARNm provienen de secuencias Ig cromosomicas nativas. En un modo de realizacion, para la expresion de genes de ADNc en celulas de roedores, el promotor transcripcional es una secuencia LTR viral, los potenciadores del promotor transcripcional son tanto el potenciador de cadena H Ig de raton como el potenciador LTR viral, la region de empalme contiene un intron mayor de 31 bp, y las regiones de terminacion de transcripcion y poliadenilacion se derivan de la secuencia cromosomica nativa correspondiente a la cadena Ig que se esta sintetizando. En otros modos de realizacion, secuencias de ADNc que codifican otras protefnas se combinan con los elementos de expresion arriba indicados para lograr la expresion de las protefnas en celulas de mamffero.

Cada gen fusionado se ensambla en, o inserta en un vector de expresion. Las celulas receptoras capaces de expresar el producto genico de cadena de Ig quimerico se transfectan por separado con un gen codificador de cadena L o de cadena H quimerico o se co-transfectan con un gen de cadena L o cadena H quimerico. Las celulas receptoras transfectadas se cultivan en condiciones que permitan la expresion de los genes incorporados y las cadenas Ig expresadas o fragmentos o anticuerpos intactos se recuperan del cultivo. En un modo de realizacion, los genes fusionados que codifican las cadenas L y H quimericas o porciones de las mismas, se ensamblan en vectores de expresion separados que son utilizados a continuacion para co-transfectar una celula receptora.

Cada vector puede contener dos genes seleccionables, un primer gen seleccionable disenado para su seleccion en un sistema bacteriano y un segundo gen seleccionable disenado para su seleccion en un sistema eucariota, donde cada vector tiene un par diferente de genes. Esta estrategia tiene como resultado vectores que primero dirigen la produccion y permiten la amplificacion de los genes fusionados en un sistema bacteriano. Los genes asf producidos y amplificados en un huesped bacteriano se utilizan a continuacion para co-transfectar una celula eucariota, y permitir la seleccion de una celula co-transfectada que transporte los genes transfectados deseados. Ejemplos de genes seleccionables para su uso en un sistema bacteriano son el gen que confiere resistencia a la ampicilina y el gen que confiere resistencia al cloranfenicol. Los genes seleccionables preferentes para su uso en transfectantes eucariotas incluyen el gen xantina-guanina-fosforrilbosil-transferasa (designado como gpt) y el gen fosfotransferasa de Tn5 (designado como neo)

La seleccion de celulas que expresan gpt se basa en el hecho de que la enzima codificada por este gen utiliza xantina como sustrato para la sfntesis de nucleotidos de purina, mientras que la enzima endogena analoga no puede.

En un medio que contiene (1) acido micofenolico, que bloquea la conversion de monofosfato de inosina en monofosfato de xantina (XMP), y (2) xantina, solo pueden sobrevivir las celulas que expresa el gen gpt. El producto del gen neo bloquea la inhibicion de la sfntesis de protefna por el antibiotico g418 y otros antibioticos de la clase neomicina.

Los dos procedimientos de seleccion se pueden utilizar simultanea o secuencialmente para seleccionarlos para la expresion de genes de cadena de Ig introducidos en dos vectores de ADN diferentes en una celula eucariota. No es necesario incluir marcadores seleccionables diferentes para las celulas eucariotas; se puede co-transfectar un vector de cadena H y L, que contenga cada uno el mismo marcador seleccionable. Tras la seleccion de las celulas resistentes apropiadas, la mayorfa de los clones contendran copias integradas de ambos vectores de cadena H y L.

De manera alternativa, los genes fusionados que codifican las cadenas H y L quimericas pueden ser ensamblados en el mismo vector de expresion.

Para la transfeccion de los vectores de expresion y la produccion del anticuerpo quimerico, la lfnea celular receptora preferente es una celula de mieloma. Las celulas de mieloma pueden sintetizar, ensamblar y secretar Igs codificados por genes Ig transfectados y poseen el mecanismo para la glicosilacion del Ig. Una celula receptora particularmente preferente es la celula de mieloma que no produce Ig SP2/0 (ATCC No. CRL 8287). Las celulas SP2/0 producen solamente Ig codificado por los genes transfectados. Las celulas de mieloma pueden cultivarse en cultivo o en la cavidad peritoneal de un raton, donde se puede obtener Ig secretado a partir del lfquido ascftico. Otras celulas receptoras adecuadas incluyen celulas linfoides como linfocitos B de origen humano o no humano, celulas de

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hibridoma de origen humano o no humano o celulas de heterohibridoma interespecie.

El vector de expresion portador de un constructo de anticuerpo quimerico de la presente descripcion puede ser introducido en una celula huesped adecuada por una variedad de medios adecuados, incluyendo medios bioqufmicos como transformacion, transfeccion, conjugacion, fusion del protoplasto, precipitacion del fosfato de calcio, y aplicacion con policaciones tales como dietilaminoetil dextrano (DEAE), y medios mecanicos como electroporacion, microinyeccion directa y bombardeo por microproyectiles.

Las secuencias o genes de codificacion de Ig quimericos de la presente descripcion tambien pueden expresarse en celulas de mamffero no linfoides o en otras celulas eucariotas, tales como levadura o celulas procariotas, en particular bacterias. La levadura proporciona ventajas sustanciales sobre las bacterias para la produccion de cadenas L y H de Ig. Las levaduras realizan modificaciones de peptidos post-translacionales incluyendo glicosilacion. Actualmente existen una serie de estrategias de ADN recombinante que utilizan fuertes secuencias promotoras y plasmidos con un alto numero de copias que pueden utilizarse para la produccion de las protefnas deseadas en la levadura. La levadura reconoce secuencias lfderes de productos genicos de mamfferos clonados y secreta peptidos portadores de secuencias lfderes (por ej. pre-peptidos). Los sistemas de expresion genica de la levadura pueden ser evaluados de forma rutinaria para detectar los niveles de produccion, secrecion y estabilidad de protefnas de cadena H y L quimericas y anticuerpos quimericos ensamblados. Se puede utilizar cualquiera de una serie de sistemas de expresion genica de la levadura que incorpore elementos terminadores y promotores de los genes expresados activamente que codifican enzimas glicolfticas producidas en grandes cantidades cuando las levaduras se cultivan en un medio rico en glucosa. Genes glicolfticos conocidos pueden proporcionar tambien senales de control de transcripcion muy eficientes. Por ejemplo, se pueden utilizar las senales terminadoras y promotoras del gen de fosfoglicerato quinasa (PGK). Se puede adoptar varios metodos para evaluar los plasmidos de expresion optima para la expresion de ADNc de Ig clonado en la levadura (ver Glover, D. M., ed., DNA Cloning, IRL Press, 1985).

Tambien se pueden utilizar cepas bacterianas como huespedes para la produccion de moleculas Ab o fragmentos de Ab descritos aquf. Y tambien se pueden utilizar cepas K12 de E. coli como E. coli W3110 (ATCC No 27325), y otras enterobacterias como Salmonella typhimurium o Serratia marcescens, y diversas especies de Pseudomonas.

Vectores de plasmidos que contienen secuencias de control y replicon que se derivan de especies compatibles con una celula huesped se utilizan en conexion con estos huespedes bacterianos. El vector es portador de un sitio de replicacion, asf como de genes especfficos que son capaces de proporcionar seleccion fenotfpica en celulas transformadas. Se puede utilizar una serie de metodos para evaluar los plasmidos de expresion para la produccion de anticuerpos quimericos o cadenas de anticuerpos codificadas por los ADNc de Ig clonados en bacterias (ver Glover, supra).

Los huespedes preferentes son celulas de mamffero, cultivadas in vitro o in vivo. Las celulas de mamffero proporcionan modificaciones post-translacionales a moleculas de protefnas Ig incluyendo supresion de peptidos lfder, ensamblado y doblado de cadenas H y L, glicosilacion de moleculas de Ab, y secrecion de la protefna Ab funcional.

Celulas de mamffero que pueden ser utiles como huespedes para la produccion de protefnas de Ab, ademas de las celulas de origen linfoide descritas anteriormente, pueden ser celulas de origen de fibroblastos, como Vero (ATCC CRL 81) o CHO-K (ATCC CRL 61). Hay muchos sistemas de vectores disponibles para la expresion de genes de cadena H y L clonados en celulas de mamffero (ver Glover, supra). Se pueden aplicar diferentes metodos para obtener Abs H2L2 completos.

Para uso in vivo, particularmente para la inyeccion en humanos, es aconsejable reducir la inmunogenicidad de los anticuerpos monoclonales haciendo anticuerpos quimericos raton-humano (o roedor-humano) como se ha mencionado, o humanizando los anticuerpos utilizando metodos conocidos de la tecnica. El anticuerpo humanizado puede ser el producto de un animal que tenga genes de region constante de Ig humanos transgenicos (ver por ejemplo WO90/10077 y WO90/04036). De manera alternativa, el anticuerpo objeto de interes puede ser geneticamente manipulado para sustituir los dominios bisagra, CHI, CH2, CH3 y/o el dominio marco con la correspondiente secuencia humana (ver WO 92/02190).

5. Conjugados de anticuerpos

La presente descripcion comprende el empleo de anticuerpos o fragmentos de los mismos fusionados de manera recombinante o conjugados qufmicamente (incluyendo conjugaciones tanto covalentes como no covalentes) con un polipeptido heterologo (o porcion del mismo, preferentemente a un polipeptido de al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 70, al menos 80, al menos 90 o al menos 100 aminoacidos) para generar protefnas de fusion. La fusion no requiere ser necesariamente directa, pero puede ocurrir a traves de secuencias de enlace. Por ejemplo, se puede utilizar anticuerpos para dirigir polipeptidos heterologos hacia tipos de celulas particulares, tanto in vitro como in vivo, fusionando o conjugando los anticuerpos con anticuerpos especfficos para receptores de superficie celular particulares. Anticuerpos fusionados o conjugados con

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polipeptidos heterologos tambien pueden utilizarse en inmunoensayos in vitro y metodos de purificacion utilizando metodos conocidos por la tecnica. Ver por ej., la publicacion internacional WO 93/21232; EP 439,095; Naramura et al., 1994, Immunol. Lett. 39:91-99; la patente estadounidense 5,474,981; Gillies et al., 1992, PNAS 89:1428-1432; y Fell et al., 1991, J. Immunol. 146:2446-2452.

La presente descripcion tambien incluye composiciones que comprenden polipetidos heterologos fusionados o conjugados con fragmentos de anticuerpos. Por ejemplo, los polipeptidos heterologos pueden fusionarse o conjugarse a un fragmento Fab, fragmento Fd, fragmento Fv, fragmento F(ab)2, o porcion del mismo. Los metodos para fusionar o conjugar polipeptidos a porciones de anticuerpos son bien conocidos en la tecnica. Ver, p. ej., las patentes estadounidenses nros. 5,336,603, 5,622,929, 5,359,046, 5,349,053,5,447,851, y 5,112,946; EP 307,434; EP 367,166; las publicaciones internacionales nros. WO 96/04388 y WO 91/06570; Ashkenazi et al., 1991, PNAS 88: 10535-10539; Zheng et al., 1995, J. Immunol. 154:5590-5600; y Vil et al., 1992, PNAS 89:1133711341.

Se puede generar otras protefnas de fusion mediante tecnicas de barajado de genes, barajado de motivos, barajado de exones y/o barajado de codones (denominado colectivamente "barajado de ADN"). El barajado de ADN puede emplearse para alterar las actividades de los anticuerpos de la descripcion o fragmentos de los mismos, por ej., anticuerpos o fragmentos de los mismos con mayores afinidades y menores indices de disociacion). Ver, en general, las patentes estadounidenses nros. 5,605,793; 5,811,238; 5,830,721; 5,834,252; y 5,837,458, y Patten et al., 1997, Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33; Harayama, 1998, Trends Biotechnol. 16:76; Hansson, et al., 1999, J. Mol. Biol. 287:265; y Lorenzo and Blasco, 1998, BioTechniques 24:308. Anticuerpos o fragmentos de ellos, o anticuerpos codificados o fragmentos de ellos, pueden alterarse al ser sometidos a mutagenesis aleatoria por PCR propensa a error, insercion de nucleotido aleatoria u otros metodos antes de la recombinacion. Una o mas porciones de un polinucleotido que codifica un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se unen inmunoespecfficamente a uPAR pueden recombinarse con uno o mas componentes, motivos, secciones, partes, dominios, fragmentos, etc. de una o mas moleculas heterologas.

Ademas, los anticuerpos o fragmentos de los mismos pueden fusionarse a secuencias de marcadores, como un peptido para facilitar la purificacion. En modos de realizacion preferentes, la secuencia de aminoacidos marcadora es un peptido de hexahistidina, como la etiqueta proporcionada en un vector pQE (QIAGEN, Inc. 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311), entre otros, muchos de los cuales estan disponibles comercialmente. Como se describe en Gentz et al., 1989, PNAS 86:821, por ejemplo, la hexahistidina permite una purificacion conveniente de la proteina de fusion. Otras etiquetas de peptidos para purificacion incluyen, sin animo exhaustivo, la etiqueta "HA" hemaglutinina que corresponde a un epftopo derivado de la proteina de hemaglutinina de la gripe (Wilson et al., Cell 37:767) y la etiqueta "flag".

5.1. Anticuerpos etiquetados diagnosticamente

En otros modos de realizacion, anticuerpos de la presente descripcion o fragmentos o variantes de los mismos se conjugan con un agente detectable o de diagnostico. Dichos anticuerpos pueden ser utiles para controlar o diagnosticar el desarrollo o progresion de un cancer como parte de un procedimiento de ensayo clfnico, como determinar la eficacia de una terapia particular.

El termino "etiquetado diagnosticamente" significa que el presente anticuerpo lleva adjunta una etiqueta detectable diagnosticamente. Hay muchas etiquetas diferentes y metodos de etiquetar conocidos por los expertos en la materia, descritos a continuacion Clases generales de etiquetas que pueden utilizarse en la presente descripcion incluyen isotopos radioactivos, isotopos paramagneticos, y compuestos que pueden ser representados en imagenes por tomograffa por emision de positrones (PET), compuestos de colores o fluorescentes, etc. Etiquetas detectables adecuadas incluyen las radioactivas, fluorescentes, fluorogenicas, cromogenicas y otras etiquetas qufmicas. Radioetiquetas utiles (radionucleidos) que se detectan simplemente por contador gamma, contador de centelleo o autorradiograffa incluyen 3H, 125I, 131I, 135S and 14C. 131I es tambien un util isotopo terapeutico (ver mas abajo).

Una serie de patentes de EE UU describen metodos y composiciones para acomplejar metales en moleculas mas grandes incluyendo la descripcion de agentes quelantes utiles. Los metales son preferentemente atomos de metales detectables, incluyendo radionucleidos y son acomplejados con protefnas y otras moleculas. Estos documentos incluyen: Patentes estadounidenses 5,627,286; 5,618,513; 5,567,408; 5,443,816; y 5,561,220.

Etiquetas comunes fluorescentes incluyen fluorescefna, rodamina, dansilo, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o- ftaldehfdo y fluorescamina. El fluoroforo, como el grupo dansilo, debe ser excitado por luz de una longitud de onda particular, para ser fluorescente. Ver por ejemplo, Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Sixth Ed., Molecular Probes, Eugene, OR., 1996). La fluorescefna, derivados de ella y moleculas similares a la fluoriscefna como Oregon Green™ y sus derivados, Rhodamine Green™ y Rhodol Green™, se acoplan a grupos amina utilizando los grupos reactivos de isotiocianato, sucinimidil ester o diclorotriacinil. De manera similar, los fluoroforos tambien pueden acoplarse a tioles utilizando maleimida, iodoacetamida y grupos reactivos de aziridina. Las rodaminas de longitud de onda larga, que son basicamente derivados de Rhodamine Green™ con sustituyentes en los nitrogenos, se encuentran entre los reactivos de etiqueta fluorescente fotoestables mas conocidos. Sus espectros no se ven afectados por cambios en pH entre 4 y 10, una ventaja importante sobre las

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fluorescefnas para muchas aplicaciones biologicas. Este grupo incluye las tetrametilrodaminas, X-rodaminas y derivados de Texas Red™. Otros fluoroforos preferentes para derivar el peptido segun esta invencion son los que son excitados por luz ultravioleta. Ejemplos son el azul cascade, derivados de cumarina, naftalenos (de los que es mimebro el cloruro de dansilo, pirenos y derivados de piridiloxazola. Tambien se incluyen como etiquetas dos materiales organicos relacionados que han sido descritos recientemente: nanocristales semiconductores, que comprenden por ejemplo, sulfato de cadmio ((Bruchez, M et al., Science 281:2013-2016 (1998), y puntos cuanticos, {por ej., seleniuro Cd terminado por sulfuro de cinc (Chan, WC et al., Science 281:2016-2018 (1998)).

En otro metodo, se deja que el grupo amino del anticuerpo reaccione con reactivos que dan productos fluorescentes, por ejemplo, fluorescamina, dialdehfdos como o-ftaldialdehfdo, naftaleno- 2,3-dicarboxilato y antraceno-2,3- dicarboxilato. Derivados de 7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol (NBD), tanto el cloruro como el fluoruro sin utiles para modificar aminas para obtener productos fluorescentes.

El anticuerpo de la descripcion tambien puede ser etiquetado para deteccion utilizando metales que emiten fluorescencia como 152Eu u otros de la serie de lantanidos. Estos metales pueden fijarse al peptido utilizando grupos quelantes de metales como acido dietilentriaminopentaacetico (DTPA) o acido etilendiaminotetraacetico (EDTa). DTPA, por ejemplo, esta disponible como anhfdrido, que puede modificar rapidamente los peptidos que contienen NH2 de esta invencion.

Para diagnostico o terapia in vivo, los radionucleoides pueden estar fijados al anticuerpo ya sea directa o indirectamente utilizando un agente quelante como DOTA y DTPA. Ejemplos de dichos radionucleoides son 99Tc, 123I, 125I, 131I, 111In, 97Ru, 67Cu, 67Ga, 8Ga, 72As, 89Zr, 90Y y 201Ti. En general, la cantidad de anticuerpo etiquetado necesario para detectabilidad en uso diagnostico variara dependiendo de consideraciones como la edad, condicion, sexo y magnitud de la enfermedad en el paciente, contraindicaciones, si las hubiera, y otras variables y debe ser ajustada por el medico o persona que hace el diagnostico. La dosificacion puede variar de 0.001 mg/kg a 100 mg/kg.

El anticuerpo tambien puede hacerse detectable acoplandolo a un compuesto fosforescente o quimioluminiscente. La presencia del peptido etiquetado quimioluminiscente se determina a continuacion detectando la presencia de luminiscencia que surge durante una reaccion qufmica. Ejemplos de quimioluminiscentes especialmente utiles son luminol, isoluminol, ester teromatico de acridinio, sal de acridinio y ester oxalato. Tambien puede utilizarse un compuesto bioluminiscente para etiquetar los peptidos. La bioluminiscencia es un tipo de quimioluminiscencia que se encuentra en sistemas biologicos en los que una protefna catalftica aumenta la eficiencia de la reaccion quimioluminiscente. La presencia de una protefna bioluminiscente esta determinada por la deteccion de la presencia de luminiscencia. Importantes compuestos bioluminiscentes a efectos de etiquetado son luciferina, luciferasa y aequorina.

En otros modo de realizacion, se utiliza la deteccion colorimetrica, basada en compuestos cromogenicos que tienen o provocan cromoforos con elevados coeficientes de extincion.

La deteccion in situ del peptido etiquetado puede realizarse retirando una muestra histologica de un sujeto y examinandola al microscopio en las condiciones adecuadas para detectar la etiqueta. Las personas entrenadas percibiran inmediatamente que cualquiera de una amplia variedad de metodos histologicos (como procedimientos de tincion) pueden ser modificados para conseguir esa deteccion in situ.

Para imagenes por radioisotopos in vivo para diagnostico, el tipo de instrumento de deteccion disponible es un factor importante para seleccionar un radionucleoide. El radionucleoide elegido debe tener un tipo de desintegracion que sea detectable por un instrumento particular. En general, cualquier metodo convencional para visualizar imagenes de diagnostico puede ser utilizado de acuerdo con esta invencion. Otro factor para seleccionar un radionucleoide para diagnostico in vivo es que su semivida sea lo suficientemente larga para que la etiqueta siga siendo detectable en el momento de maxima absorcion por el tejido de destino, pero lo suficientemente corta para minimizar la irradiacion nociva del huesped. En un modo de realizacion preferente, un radionucleido utilizado para representacion optica in vivo no emite partfculas sino que produce un gran numero de fotones en una gama de 140-200 keV, que pueden ser rapidamente detectados por camaras gamma convencionales.

La representacion optica in vivo puede utilizarse para detectar metastasis ocultas que no son observables por otros metodos. La representacion optica puede ser utilizada, por ejemplo, para visualizar tumores de manera no invasiva.

5.2. Anticuerpos etiquetados terapeuticamente

La presente descripcion comprende tambien el uso de anticuerpos o fragmentos de ellos conjugados con un agente terapeutico. En un modo de realizacion, los anticuerpos monoclonales descritos aquf son "terapeuticamente conjugados" o "terapeuticamente etiquetados" (terminos que pretenden ser intercambiables) y se usan para proporcionar un agente terapeutico en el sitio en el que se alojan y se unen, como los sitios de metastasis de tumores o focos de infeccion/inflamacion, restenosis o fibrosis. El termino "terapeuticamente conjugado" significa que el anticuerpo monoclonal modificado se conjuga con otro agente terapeutico que es dirigido o bien a la causa subyacente o a un "componente" de la invasion tumoral, angiogenesis, inflamacion u otra patologfa. Un polipeptido

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terapeuticamente etiquetado lleva una "etiqueta" terapeutica adecuada tambien denominada aquf "porcion terapeutica". Una porcion terapeutica es un atomo, una molecula, un compuesto o cualquier componente qufmico anadido al peptido que lo vuelve activo para tratar una enfermedad o estado target, fundamentalmente asociado a angiogenesis indeseada. La porcion terapeutica puede estar unida directa o indirectamente al anticuerpo monoclonal. El anticuerpo monoclonal etiquetado terapeuticamente se administra como un compuesto farmaceutico que comprende un vehfculo o excipiente farmaceuticamente aceptable y esta preferentemente en una forma adecuada para su inyeccion.

Ejemplos de radioisotopos terapeuticos utiles (ordenados por numero atomico) incluyen 47Sc, 67Cu, 90Y, 109Pd, 125I, 131I, 86Re, 188Re, 199Au, 211At, 212Pb and 217Bi. Los atomos pueden ser conjugados al peptido directamente, indirectamente como parte de un quelato, o en el caso de yodo, indirectamente como parte de un grupo Bolton- Hunter yodado. El radioyodo puede introducirse o bien antes o despues de que este grupo sea acoplado al compuesto peptfdico.

Dosis preferentes de los conjugados radionucleidos son una funcion de la radioactividad especffica a suministrar al sitio de destino que varfa segun el tipo de tumor, situacion del tumor y vascularizacion, cinetica y biodistribucion del portador del peptido, energfa de emision radioactiva por el nucleido, etc. Los expertos en el campo de la radioterapia pueden ajustar rapidamente la dosis del peptido en conjuncion con la dosis del nucleido particular para proporcionar el beneficio terapeutico deseado sin experimentacion indebida.

Otro enfoque terapeutico incluido aquf es el uso de terapia por captura de neutrones de boro, en la que se suministra un peptido boronado al sitio de destino deseado, como un tumor, preferentemente un tumor intracraneal (Barth, RF, Cancer Invest. 14: 534-550 (1996); Mishima, Y (ed.), Cancer Neutron Capture Therapy, New York: Plenum Publishing Corp., 1996; Soloway, AH et al., (eds), J. Neuro-Oncol. 33: 1- 188 (1997). El isotopo estable 10B es irradiado con neutrones termicos de baja energfa (<0.025eV), y la captura nuclear resultante produce nucleos 7Li y partfculas-a que tienen elevada transferencia de energfa lineal y longitudes respectivas de paso optico de aproximadamente 9 y 5 m. Este metodo esta basado en la acumulacion 10B en el tumor con niveles inferiores en sangre, celulas endoteliales y tejido normal, (por ej. cerebral). Dicho suministro ha sido realizado utilizando factor de crecimiento epidermico (Yang. W et al., Cancer Res 57:4333-4339 (1997).

Otros agentes terapeuticos que pueden acoplarse a los anticuerpos monoclonales segun el metodo de la descripcion son farmacos, profarmacos, enzimas para activar profarmacos, agentes fotosensibilizadores, terapeutica del acido nucleico, vectores antisentido, vectores virales, lectinas y otras toxinas.

Las lectinas son protefnas, comunmente derivadas de vegetales, que se fijan a carbohidratos. Entre otras actividades, algunas lectinas son toxicas. Algunas de las sustancias mas citotoxicas conocidas son toxinas protefnicas de origen bacteriano y vegetal (Frankel, AE et. al., Ann. Rev. Med. 37:125-142 (1986)). Estas moleculas se fijan a la superficie celular e inhiben la sfntesis de protefnas celulares. Las toxinas vegetales mas comunmente usadas son la ricina y abrina; las toxinas bacterianas mas usadas son la toxina difterica y la exotoxina A Pseudomonas. En ricina y abrina, las funciones toxicas y de union estan contenidas en dos subunidades de protefnas separadas, las cadenas A y B. La cadena B de la ricina se une a los carbohidratos de la superficie de la celula y promueve la absorcion de la cadena A en la celula. Una vez dentro de la celula, la cadena A de la ricina inhibe la sfntesis de protefnas desactivando la subunidad 60S del ribosoma eucariota Endo, Y. et al., Biol. Chem. 262: 5908-5912 (1987)). Otras toxinas de origen vegetal, que son protefnas inhibidoras ribosomicas monocatenarias, incluyen la protefna antiviral de hierba camfn, proteina del germen del trigo, gelonina, diantinas, momorcarinas, tricosantina y muchas otras 195:1-8 (1986)). La toxina difterica y la exotoxina A Pseudomonas son tambien protenicas de cadena simple y sus funciones de fijacion y toxicidad residen en dominios separados de la misma protefna. La exotoxina A Pseudomona tiene la misma actividad catalftica que la toxina difterica. La ricina se ha utilizado terapeuticamente fijando su cadena-a toxica a moleculas de destino como Abs para procurar el suministro del efecto toxico en un sitio especffico. Las toxinas bacterianas tambien se han utilizado como conjugados anti- tumorales. Como se pretende aquf, una cadena o dominio de peptido toxico se conjuga a un compuesto de esta descripcion y se suministra en un sitio de destino donde se desea la actividad toxica, como un foco metastasico.

La conjugacion de toxinas a protefnas como Abs u otros ligandos es conocida por la tecnica (Olsnes, S. et al., Immunol. Today 10:291-295 (1989) ; Vitetta, ES et al., Ann. Rev. Immunol. 3: 197-212 (1985)).

Un anticuerpo o un fragmento del mismo puede conjugarse a una porcion terapeutica como una citotoxina, por ej., un agente citostatico o citocidal, un agente terapeutico o un ion metalico radioactivo, por ej., emisores alfa. Una citotoxina o agente citotoxico incluye cualquier agente que sea perjudicial para las celulas. Ejemplos incluyen paclitaxel, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, metrotrexato, mitomicina, etoposido, teniposido, vincristina, vinblastina, colquicina, doxorubicina, daunorubicina, dihidroxiantraceno diona, Mitomicina C, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-dehidrotestosterona, glucocorticoidess, procafna, tetracafna, lidocafna, propranolol, puromicina, epirubicina, y ciclofosfamida y analogos u homologos de los mismos. Los agentes teraputicos incluyen, sin animo limitativo, antimetabolitos (por ej.., metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracilo decarbazina), agentes alquilantes (por ej., mecloretamina, tioepa clorambucilo, melfalano, carmustina (BCNU) y lomustina (CCNU), ciclofosphamida, busulfano, dibromo manitol, estreptozotocina, mitomicina

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C, y cisdiclorodiamina platino (II) (DDP) cisplatina), antraciclinas (por ej., daunorubicina (antes daunomicina) y doxorubicina), antibioticos (por ej., dactinomicina (antes actinomicina), bleomicina, mitramicina, y antramicina (AMC)), y agentes anti-mitoticos (por ej., vincristina y vinblastina).

Ademas, un anticuerpo o fragmento del mismo puede conjugarse con un agente terapeutico o porcion de farmaco que modifique una respuesta biologica dada. Agentes terapeuticos o porciones de farmaco no deben interpretarse como limitados a agentes terapeuticos qufmicos clasicos. Por ejemplo, la porcion de farmaco puede ser una protefna o polipeptido que posea una actividad biologica deseada. Dichas protefnas pueden incluir, por ejemplo, una toxina como un abrino, ricino A, exotoxina pseudomonas, toxina del colera, o toxina difterica; una protefna como el factor de necrosis tumoral, interferon-alfa, interferon-p, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento derivado de plaquetas, activador plasminogeno del tejido, un agente apoptotico, por ej. TNF-a, TNF-p, AIM I (ver publicacion internacional nro. WO 97/33899), AIM II (ver, International Publication No. WO 97/34911), Ligando Fas (Takahashi et al., 1994, J. Iminunol., 6:1567), y VEGI (ver publicacion internacional nro. WO 99/23105), un agente trombotico o un agente anti-angiogenico, por ej., angiostatina o endostatina; o, un modificador de la respuesta biologica como, por ejemplo, una linfoquina ({por ej., interleuquina-1 ("IL-1"), interleuquina-2 ("IL-2"), interleuquina-6 ("IL-6"), factor estimulante de la colonia de macrofagos de granulocitos ("GM-CSF"), y actor estimulante de la colonia de granulocitos ("G-CSF")), o un factor de crecimiento (por ej.., hormona de crecimiento ("GH")).

Ademas, un anticuerpo puede conjugarse a porciones terapeuticas como quelantes macrocfclicos utiles para conjugar iones radiometalicos (ver mas arriba para ejemplos de materiales radioactivos). En ciertos modos de realizacion, el agente quelante macrocfclilo es acido 1, 4, 7, 10 tetraazaciclododecano N, N', N'', N''' tetraacetico (DOTA) que puede fijarse al anticuerpo por medio de una molecula de enlace. Dichas moleculas de enlace se conocen normalmente en la tecnica y estan descritas en Denardo et al., 1998, Clin Cancer Res. 4:2483-90; Peterson et al., 1999, Bioconjug. Chem. 10:553; and Zimmerman et al., 1999, Nucl. Med. Biol. 26:943-50.

Las tecnicas para conjugar porciones terapeuticas con anticuerpos son bien conocidas. Las porciones pueden conjugarse con anticuerpos por cualquier metodo conocido de la tecnica, incluyendo, sin animo exhaustivo, enlace Schiff/aldehfdo, enlace sulfidrilo, enlace acido-labil, enlace cis-aconitilo, enlace hidrazona, enlace enzimaticamente degradable (ver en general Garnett, 2002, Adv. Drug Deliv. Rev. 53:171-216). Otras tecnicas para conjugar porciones terapeuticas con anticuerpos son bien conocidas, ver, por ej., Amon el al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy," en Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery," en Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review," en Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy," en Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), y Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62:119-58. Los metodos para fusionar o conjugar polipeptidos con porciones de polipetidos son bien conocidos en el estado de la tecnica. Ver, p. ej., las patentes estadounidenses nros. 5,336,603, 5,622,929, 5,359,046, 5,349,053,5,447,851, y 5,112,946; EP 307,434; EP 367,166; las publicaciones internacionales nros. WO 96/04388 y WO 91/06570; Ashkenazi et al., 1991, PNAS 88: 10535-10539; Zheng et al., 1995, J. Immunol. 154:5590-5600; y Vil et al., 1992, PNAS 89:1133711341. La fusion de un anticuerpo a una porcion no requiere ser necesariamente directa, pero puede ocurrir a traves de secuencias de enlace. Dichas moleculas de enlace se conocen normalmente en el estado de la tecnica y estan descritas en Denardo et al., 1998, Clin Cancer Res. 4:2483-90; Peterson et al., 1999, Bioconjug. Chem. 10:553; Zimmerman et al., 1999, Nucl. Med. Biol. 26:943-50; Garnett, 2002, Adv. Drug Deliv. Rev. 53:171-216.

De manera alternativa, un anticuerpo puede conjugarse con un segundo anticuerpo para formar un heteroconjugado de anticuerpo como lo describe Segal en la patente estadounidense nro. 4,676,980.

Los anticuerpos tambien pueden fijarse a soportes solidos, que son especialmente utiles para inmunoensayos o purificacion del antfgeno de destino. Dichos soportes solidos incluyen, sin animo exhaustivo, vidrio, celulosa, poliacrilamida, nilon, poliestireno, cloruro de polivinilo o polipropileno.

6. Compuestos farmaceuticos y terapeuticos y su administracion

Los compuestos que pueden ser empleados en los compuestos farmaceuticos de la descripcion incluyen todas las moleculas de polipeptidos, preferentemente, anticuerpos monoclonales, descritos anteriormente, asf como las sales farmaceuticamente aceptables de estos compuestos. En un modo de realizacion especffico, el termino "farmaceuticamente aceptable" significa autorizado por un organismo reglamentario de un gobierno federal o estatal o que aparezca en la farmacopea estadounidense u otra farmacopea reconocida para su uso en animales, mas especialmente en humanos. El termino "vehfculo" se refiere a un diluyente, adyuvante, por ej., adyuvante de Freund (completo e incompleto) o mas preferentemente, el adyuvante MF59C.1 disponible en Chiron, Emeryville, CA), excipiente o vehfculo con el que se administra el producto terapeutico. Dichos vehfculos farmaceuticos pueden ser lfquidos esteriles, como agua y aceites, incluyendo los derivados del petroleo, animales, vegetales o sinteticos, como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sesamo y similares. El agua es un vehfculo preferente cuando el compuesto farmaceutico se administra por via intravenosa. Las soluciones salinas y soluciones de glicerol

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y dextrosa acuosa tambien pueden emplearse como vehfculos liquidos, en particular en las soluciones inyectables. Otros excipientes farmaceuticos adecuados incluyen almidon, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, cal, gel de sflice, estearato de sodio, monoestearato de glicerilo, talco, cloruro de sodio, leche desnatada en polvo, glicerilo, propileno, glicol, agua, etanol y similares. El compuesto, si se desea, tambien puede contener cantidades menores de agentes emulsionantes o humectantes, o agentes tamponadores de pH. Estos compuestos pueden adoptar la forma de soluciones, suspensiones, emulsion, pastillas, pfldoras, capsulas, polvo, formulas de liberacion sostenida, etc.

Los compuestos de la descripcion pueden formularse como formas neutras o sales.

Las sales de los compuestos de la invencion con una adicion acida farmaceuticamente aceptable que contengan un grupo basico se forman cuando sea pertinente con acidos fuertes o moderadamente fuertes, no toxicos, organicos o inorganicos mediante metodos conocidos por la tecnica. Ejemplos de sales con adicion de acidos que se incluyen en esta invencion son sales de maleato, fumarato, lactato, oxalato, metanesulfonato, etanosulfonato, bencenosulfonato, tartarto, citrato, hidrocloruro, hidrobromuro, sulfato, fosfato y nitrato.

Sales de compuestos de la invencion con adicion de bases farmaceuticamente aceptables que contienen un grupo acido se preparan mediante metodos conocidos a partir de bases organicas e inorganicas e incluyen, por ejemplo, bases de suelos alcalinos y alcalino-metalicos no toxicos, como hidroxido de amonio y potasio, sodio, calcio; y bases organicas no toxicas como trietilamina, butilamina, piperazina y tri(hidroximetil)metilamina.

En general, los ingredientes de compuestos de la descripcion se suministran o bien por separado o mezclados en forma de dosis unitarias, por ejemplo, como un polvo liofilizado seco o concentrado sin agua en un recipiente hermeticamente sellado como una ampolla o bolsita indicando la cantidad de agente activo. Cuando se debe administrar un compuesto por infusion, se puede dispensar con una botella de infusion que contenga agua o solucion salida esteril. Cuando el compuesto se administra por inyeccion, se puede suministrar una ampolla de agua esteril para inyeccion o solucion salina para que los ingredientes puedan mezclarse antes de su administracion.

Los compuestos de la descripcion, asf como las sales farmaceuticamente aceptables de los mismos, pueden incorporarse en formas de dosis convenientes, como capsulas, obleas impregnadas, pastillas o preparados inyectables. Se puede emplear vehfculos solidos o liquidos farmaceuticamente aceptables.

Vehfculos solidos incluyen almidon, lactosa, sulfato de calcio dihidrato, terra alba, sacarosa, talco, gelatina, agar, pectina, acacia, estearato de magnesio y acido estearico. Los vehfculos liquidos incluyen sirope, aceite de cacahuete, solucion salina, agua, dextrosa, glicerilo, etc. De manera similar, el vehfculo o diluyente incluye cualquier material de liberacion prolongada, como monoesterato de glicerilo o distearato de glicerilo, solo o con una cera.

Cuando se utiliza un vehfculo lfquido, el preparado puede tener la forma de jarabe, elixir, emulsion, capsula de gelatina blanda, lfquido inyectable esteril, (por ej., una solucion), como una ampolla, o una suspension lfquida acuosa o no acuosa. Un resumen de dichos compuestos farmaceuticos puede encontrarse, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton Pennsylvania (Gennaro18th ed. 1990).

Los preparados farmaceuticos se realizan siguiendo tecnicas convencionales de qufmica farmaceutica que implican etapas tales como mezclar, granular y comprimir, cuando son para pastillas, o mezclar, rellenar y disolver los ingredientes, segun proceda, para obtener los productos deseados para administracion oral, parenteral, topica, transdermica, intravaginal, intrapeneana, intranasal, intrabronquial, intracraneal, intraocular, intraural y rectal. Los compuestos farmaceuticos tambien pueden contener cantidades menores de sustancias auxiliares no toxicas como agentes humectantes y emulsionantes, agentes tamponadores del pH, etc.

La presente invencion puede ser utilizada en el diagnostico o tratamiento de cualquiera de una serie de especies y generos animales y tambien es aplicable en la practica de la medicina veterinaria o humana. Por lo tanto, los compuestos farmaceuticos pueden utilizarse para tratar animales comerciales y domesticos, incluyendo aves y de forma mas preferente, mamfferos, asf como humanos.

El termino "administracion sistemica" se refiere a la administracion de un compuesto o agente como el polipetido, que aquf se describe, de una manera que tenga como resultado la introduccion del compuesto en el sistema circulatorio del sujeto o permite de otro modo su difusion a traves del cuerpo, como por ejemplo, por infusion o inyeccion intravenosa (i.v.). La administracion "regional" se refiere a la administracion en un espacio anatomico, especffico y algo mas limitado, como intraperitoneal, intratecal, subdural o en un organo especffico. Los ejemplos incluyen administracion intravaginal, intrapeneana, intranasal, intrabronquial(o instilacion pulmonar), intracraneal, intra-aural o intraocular. El termino "administracion local" se refiere a la administracion de un compuesto o farmaco en un espacio anatomico limitado o circunscrito, como inyeccion intratumoral en una masa tumoral, inyecciones subcutaneas (s.c.), intramusculares (i.m.). Alguien experto en la tecnica comprendera que la administracion local o regional a menudo tendra como resultado la entrada de un compuesto en el sistema circulatorio, es decir, de manera que s.c. o i.m. son tambien rutas para la administracion sistemica. Preparados inyectables o infusibles pueden obtenerse de forma convencional, ya sea como soluciones o suspensiones, formas solidas adecuadas para solucion

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o suspension en liquido antes de la inyeccion o infusion, o como emulsiones. Aunque las rutas preferentes de administracion son sistemicas, como i.v., el compuesto farmaceutico puede administrate por via topica o transdermica, por ej., como un unguento, crema o gel; por via oral o rectal, por ej., como un supositorio.

Para su aplicacion topica, el compuesto puede incorporarse a vehfculos de aplicacion topica como una pomada o unguento. El vehfculo del ingrediente activo puede ser en forma de spray o no. Las formas no spray pueden ser formas solidas o semi-solidas que comprenden un vehfculo de aplicacion topica y que tenga una viscosidad dinamica preferentemente mayor que la del agua. Formulas adecuadas incluyen, sin animo exhaustivo, soluciones, suspensiones, emulsiones, cremas, unguentos, polvos, linimentos, pomadas, etc. Si se desea, se pueden esterilizar o mezclar con agentes auxiliares, por ej., conservantes, estabilizantes, agentes humectantes, tampones o sales para influir en la presion osmotica, etc.

Vehfculos preferentes para preparados topicos no en spray incluyen bases de unguentos, por ej. polietilenglicol-1000 (PEG-1000); cremas convencionales como crema HEB; geles; asf como vaselina, etc.

Tambien adecuados para su aplicacion topica asf como para instilacion pulmonar son los preparados en aerosol en los que el compuesto, preferentemente en combinacion con un material portador inerte liquido o solido, se envasa en un frasco comprimible o mezclado con un propulsante normalmente gaseoso, volatil a presion.

Los preparados en aerosol pueden contener disolventes, tampones, agentes tensoactivos, perfumes, y/o antioxidantes ademas de los compuestos de la invencion.

Para las aplicaciones topicas preferentes, especialmente para humanos, es preferible administrar una cantidad efectiva del compuesto en una zona afectada, por ej., la epidermis, membrana mucosa, ojos, etc.

Esta cantidad variara por lo general de aproximadamente 0,001 mg a 1 g por aplicacion, dependiendo de la zona a tratar, la gravedad de los sfntomas y la naturaleza del vehfculo topico empleado.

Otros vehfculos de aceptacion farmaceutica para composiciones de polipetidos de la presente invencion son liposomas, composiciones farmaceuticas en las que la protefna activa esta contenida, o bien dispersa o presente de diferentes formas en corpusculos que consisten en capas concentricas acuosas adheridas a capas lipfdicas. El polipetido activo esta preferentemente presente en la capa acuosa y en la capa lipfdica, dentro o fuera, o en cualquier caso, en el sistema no homogeneo generalmente conocido como suspension liposomica.

La capa hidrofobica, o capa lipfdica, en general, pero no exclusivamente, comprende fosfolfpidos como la lecitina y esfingomielina, esteroides como colesterol, sustancias surfactantes mas o menos ionicas como dicetil fosfato, estearilamina o acido fosfatfdico, y/o otros materiales de naturaleza hidrofobica. Los expertos en la tecnica apreciaran otros modos de realizacion adecuados de las presentes formulaciones liposomiales.

Composiciones terapeuticas para tratar tumores y cancer pueden comprender, ademas del peptido, uno o mas agentes anti-tumorales adicionales, como inhibidores mitoticos, por ej., vinblastina; agentes alquilantes, por ej., ciclofosfamida; inhibidores de folatos, por ej., metotrexato, piritrexima o trimetrexato; antimetabolitos, por ej., 5- fluorouracilo y arabinosido de citosina; antibioticos intercalantes, por ej., adriamicina y bleomicina; enzimas o inhibidores de enzimas, por ej., asparaginasa, inhibidores de topoisomerasa como etoposido; o modificadores de la respuesta biologica, por ej. interferones o interleucinas. De hecho, composiciones farmaceuticas que comprendan cualquier agente terapeutico contra el cancer conocido en combinacion con los peptidos aquf descritos entran dentro del alcance de la presente invencion. La composicion farmaceutica tambien puede comprender uno o mas medicamentos para tratar sfntomas adicionales que puedan afectar a los pacientes de destino, como por ejemplo, agentes anti-infecciosos, incluyendo antibacterianos, anti-fungicos, anti-parasitos, antivirales, y anti-coccidiales.

La dosis terapeutica administrada es una cantidad que es terapeuticamente efectiva, como saben o pueden averiguar rapidamente las personas expertas en la tecnica. La dosis tambien dependera de la edad, salud, peso del receptor, tipo de tratamiento simultaneo, frecuencia del tratamiento y naturaleza del efecto deseado, como, por ejemplo, efectos anti-inflamatorios o efecto anti-bacteriano.

Se conocen varios sistemas de suministro que se pueden utilizar para administrar un anticuerpo monoclonal de la descripcion o la combinacion de un anticuerpo monoclonal de la descripcion y un agente profilactico o agente terapeutico util para prevenir o tratar el cancer, por ej., encapsulacion en liposomas, micropartfculas, microcapsulas, celulas recombinantes capaces de expresar el anticuerpo o fragmento del anticuerpo, endocitosis mediada por receptor (ver, por ej., Wu y Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432), construccion de un acido nucleico como parte de un retroviral u otro vector, etc. Metodos de administrar un agente profilactico o terapeutico de la descripcion incluyen, sin animo exhaustivo, administracion parenteral, por ej., intradermica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa y subcutanea), epidural y mucosal (por ej., via intranasal, oral e inhalacion). En un modo de realizacion especffico, agentes terapeuticos o profilacticos de la descripcion se administran por via intramuscular, intravenosa o subcutanea. Los agentes terapeuticos o profilacticos pueden administrarse por cualquier via conveniente, por ejemplo, por inyeccion en bolo o infusion, por absorcion a traves de los tejidos epitelial o mucocutaneo (por ej.,

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mucosa oral, mucosa rectal e intestinal, etc.) y pueden administrarse junto con otros agentes biologicamente activos. La administracion puede ser sistemica o local.

En un modo de realizacion especffico, puede ser deseable administrar los agentes profilacticos o terapeuticos de la descripcion localmente en la zona que necesita tratamiento; esto puede realizarse por ejemplo, por infusion local, por inyeccion o por medio de un implante, siendo dicho implante de un material poroso, no poroso, o gelatinoso, incluyendo membranas, como membranas o fibras silastic.

En otro modo de realizacion, el agente profilactico o terapeutico puede ser suministrado en un sistema de liberacion sostenida o controlada. En un modo de realizacion, se puede utilizar una bomba para lograr la liberacion sostenida o controlada (ver Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:20; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574). En otro modo de realizacion, se pueden emplear materiales polimericos para obtener la liberacion sostenida o controlada de los anticuerpos de la descripcion o fragmentos de los mismos (ver, por ej., Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas, 1983, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61; ver tambien Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 7 1:105); las patentes estadounidenses nros. 5,679,377; 5,916,597; 5,912,015; 5,989,463; 5,128,326; las publicaciones internacionales nros. WO 99/15154 y WO 99/20253. Ejemplos de polfmeros utilizados en formulaciones de liberacion sostenida incluyen, sin animo exhaustivo, poli-2-hidroxietil-metacrilato), poli(metil- metacrilato), poli(acido acrflico), poli(etilen-co-vinil acetato), poli(acido metacrflico), poliglicolidos (PLG), polianhfdridos, poli(N-vinil pirrolidona), poli(alcohol vinflico), poliacrilamida, poli(etilenglicol), polilactidas (PLA), poli(lactida-co-glicolidos) (PLGA), y poliortoesteres. En un modo de realizacion preferente, el polfmero empleado en una formulacion de liberacion sostenida es inerte, libre de impurezas, estable en almacenaje, esteril y biodegradable. En otro modo de realizacion, un sistema de liberacion sostenida o controlada puede colocarse cerca del objetivo profilactico o terapeutico, requiriendo por tanto solo una fraccion de la dosis sistemica (ver, por ej. Goodson, en Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)).

Se trata de los sistemas de liberacion controlada en el artfculo de Langer (1990, Science 249:1527-1533). Cualquier tecnica conocida por los expertos en la tecnica puede ser utilizada para producir formulaciones de liberacion sostenida que comprenden uno o mas agentes terapeuticos de la descripcion. Ver, por ej., la patente estadounidense nro. 4,526,938; las publicaciones internacionales nros. WO 91/05548 y WO 96/20698; Ning et al.,

1996, Radiotherapy & Oncology 39:179-189; Song et al., 1995, PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397; Cleek et al., 1997, Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854; y Lam et al.,

1997, Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 26:759-760.

7. Metodos terapeuticos

Los metodos de esta descripcion pueden utilizarse para inhibir la invasion y crecimiento tumoral en un sujeto o para suprimir la angiogenesis inducida por tumores inhibiendo el crecimiento y migracion celular endotelial. Al inhibir el crecimiento o invasion de un tumor o angiogenesis, los metodos tienen como resultado la inhibicion de la metastasis tumoral. Se administra a un sujeto, preferentemente un mamffero, como un no primate (por ej., vacas, cerdos, caballos, gatos, perros, ratas, etc.) y a un primate (por ej., mono y humano), mas preferentemente un humano, una cantidad del compuesto efectiva para inhibir el crecimiento, invasion o angiogenesis tumoral. El compuesto de sales farmaceuticamente aceptable del mismo se administra preferentemente en forma de una composicion farmaceutica como se ha descrito mas arriba.

La cantidad de la composicion de la descripcion que sera efectiva en la prevencion o tratamiento del cancer puede ser determinada por tecnicas de investigacion estandar. Se puede extrapolar las dosis efectivas de las curvas de respuesta a las dosis derivadas de sistemas de prueba con modelos animales o in vitro. Por ejemplo, la dosificacion de la composicion que sera efectiva en la prevencion o tratamiento del cancer puede determinarse administrando la composicion a un modelo animal, como por ej., los modelos animales descritos aquf o conocidos por los expertos en la tecnica. Ademas, los ensayos in vitro pueden emplearse opcionalmente para identificar gamas de dosificacion optimas.

Dosis de las protefnas (incluyendo anticuerpos), peptidos, multfmeros de peptidos, etc., incluyen preferentemente unidades de dosificacion farmaceutica que comprenden una cantidad efectiva del peptido. La forma de unidad de dosificacion se refiere a unidades ffsicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para un sujeto mamffero; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de material activo calculada para producir el efecto terapeutico deseado, en asociacion con el vehfculo farmaceutico requerido. La especificacion de las formas de unidades de dosificacion esta dictada por y directamente dependiente de (a) las caracterfsticas unicas del material activo y el efecto terapeutico particular a lograr, y (b) las limitaciones inherentes de la tecnica de realizar dicho compuesto activo para el tratamiento y sensibilidad de sujetos individuales.

Por una cantidad efectiva se quiere decir una cantidad suficiente para lograr una concentracion de estado constante in vivo que tenga como resultado una reduccion mensurable de cualquier parametro relevante de enfermedad y

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puede incluir crecimiento de tumor metastasico o primario, cualquier indice aceptado de reactividad inflamatoria o una prolongacion mensurable de intervalo sin enfermedad o de supervivencia. Por ejemplo, se considera eficaz una reduccion del crecimiento del tumor en el 20% de pacientes (Frei III, E., The Cancer Journal 3:127-136 (1997)). Sin embargo, un efecto de esa magnitud no se considera que sea un requisito minimo para que la dosis sea efectiva de acuerdo con esta descripcion.

En un modo de realizacion, una dosis efectiva es preferentemente 10 veces y mas preferentemente 100 veces mayor que la dosis efectiva al 50% (ED50) del compuesto en un ensayo in vivo tal como se describe aquf.

La seleccion de la dosis efectiva preferente puede determinarse (por ej., mediante ensayos clfnicos) por un experto basada en la consideracion de varios factores que seran conocidos por alguien con una competencia normal en la tecnica. Dichos factores incluyen el peptido preciso o derivado seleccionado, la enfermedad o estado, la via de administracion, la salud y peso del receptor, la existencia de otro tratamiento paralelo, si lo hubiera, la frecuencia del tratamiento, la naturaleza del efecto deseado, por ejemplo, inhibicion de la metastasis del tumor y la opinion del tecnico competente.

Una dosis preferente para tratar un sujeto, preferentemente mamffero, mas preferentemente humano, con un tumor es una cantidad de hasta 100 miligramos de compuesto activo basado en el polipeptido por kilogramo de peso corporal. Una dosis unica tfpica del peptido o peptidomimetico esta entre 1 ng y aprox. 100 mg/kg de peso corporal. Para anticuerpos, la dosis administrada a un paciente es normalmente de 0,1 mg/kg a 100 mg/kg del peso corporal del paciente. De manera preferente, la dosis administrada a un paciente esta entre 0,1 mg/kg y 20 mg/kg de peso corporal del paciente, mas preferentemente 1 mg/kg a 10 mg/kg del peso corporal del paciente. Para administracion topica, se recomiendan dosis en la gama de 0.01-20% de concentracion (por peso) del compuesto, preferentemente 1-5%. Para administracion intravenosa es preferible una dosis diaria total en la gama de 0,1 miligramos a 7 gramos. Las gamas anteriores son orientativas, dado que el numero de variables en un regimen de tratamiento individual es grande y se esperan desviaciones considerables de estos valores preferentes. En general, los anticuerpos humanos y humanizados tienen una semivida mas larga dentro del cuerpo humano que los anticuerpos de otras especies debido a la respuesta inmune a polipeptidos extranos. Por lo tanto, dosis mas bajas de anticuerpos humanos y una administracion menos frecuente suelen ser a menudo posibles.

Una cantidad efectiva o dosis del peptido para inhibir la proliferacion celular endotelial o migracion in vitro se encuentra en la gama de 1 picogramo a aproximadamente 5 nanogramos por celula. Las dosis efectivas y gamas de dosificacion optima pueden determinarse in vitro utilizando los metodos aquf descritos.

Los compuestos de la invencion se caracterizan por producir un efecto inhibidor sobre la proliferacion, migracion, invasion celular endotelial o celulas tumorales, o sobre la angiogenesis o metastasis tumoral o reacciones inflamatorias. Los compuestos son especialmente utiles para producir un efecto anti-tumoral en un huesped mamffero, preferentemente humano, que alberga un tumor en el que la inhibicion de la angiogenesis tiene como resultado la reduccion de tamano o indice de crecimiento del tumor o destruccion del tumor. Preferentemente, el sujeto es un humano.

Un ejemplo mas largo de enfermedad o estado contra los que es efectivo el metodo anterior incluye crecimiento primario de un tumor solido, leucemia o linfoma; invasion tumoral, metastasis o crecimiento de metastasis tumorales; hiperplasia benigna; aterosclerosis; angiogenesis del miocardio; restenosis vascular post angioplastia con balon; formacion de neointima despues de trauma vascular; restenosis por injerto vascular; formacion colateral coronaria; trombosis venosa profunda; angiogenesis de extremidad isquemica; telangiectasia; granuloma piogenico; trastorno de la cornea; rubeosis; glaucoma neovascular; retinopatfa diabetica y de otro tipo; fibroplasia retrolental; neovascularizacion diabetica; degeneracion macular; endometriosis; artritis; fibrosis asociada a un estado inflamatorio cronico, lesion de la medula espinal incluyendo isquemia y fibrosis; fibrosis pulmonar, fibrosis inducida por la quimioterapia; curacion de heridas con cicatrices y fibrosis; ulceras pepticas; fractura osea; queloides; o un trastorno de vasculogenesis, hematopoiesis, ovulacion, menstruacion, embarazo o placentacion asociados a una invasion celular patogena o con angiogenesis.

Una enfermedad o estado preferente a ser tratado con el metodo anterior es el crecimiento, invasion o metastasis tumoral. Esto incluye los tumores cerebrales. Ejemplos de dichos tumores cerebrales son astrocitoma, astrocitoma anaplastico, glioblastoma, glioblastoma multiforme, astrocitoma pilocftico, xantoastrocitoma pleiomorfico, astrocitoma subependimal de celulas gigantes, astrocitoma fibrilar, astrocitoma gemistocftico, astrocitoma protoplastico, oligodendroglioma, oligodendroglioma anaplastico, ependimoma, ependimoma anaplastico, ependimoma mixopapilar, subependimoma, oligoastrocitoma mixtos y oligoastrocitoma maligno.

El metodo tambien se utiliza para tratar una enfermedad uterina como la endometriosis y neovascularizacion ocular patogena como la asociada con, o a causa de, retinopatfa diabetica proliferativa, degeneracion macular neovascular relacionada con la edad, retinopatfa de prematuridad, retinopatfa de celulas falciformes u oclusion venosa de la retina.

Los inhibidores de la angiogenesis pueden desempenar un papel en la prevencion de la angiogenesis inflamatoria y

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gliosis tras una lesion de la medula espinal traumatica, promoviendo el restablecimiento de la conectividad neuronal (Wamil, AW et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A. 95:13188-13193 (1998)). Por lo tanto, las composiciones de la presente descripcion se administran lo antes posible tras una lesion de la medula espinal traumatica y durante varios dfas hasta unas dos semanas despues para inhibir la angiogenesis y gliosis que impedirfan estericamente el restablecimiento de la conectividad neuronal. El tratamiento reduce la zona danada en el sitio de la lesion de la medula espinal y facilita la regeneracion de la funcion neuronal y por lo tanto previene la paralisis. Se espera que los compuestos de la invencion tambien protejan a los axones de degeneracion Walleriana, despolarizacion mediada por aminobutirato inversa (que se produce en las neuronas traumatizadas) y mejoren la recuperacion de la conductividad neuronal de celulas del sistema nervioso central aisladas y tejidos en cultivo.

Para otros agentes terapeuticos del cancer administrados a un paciente, son conocidas sus dosis tfpicas. Se describe la administracion de dosis menores en regfmenes de tratamiento en combinacion que las dosis recomendadas para la administracion de agentes unicos.

La descripcion estipula cualquier metodo de administrar dosis mas bajas de agentes terapeuticos o profilacticos conocidos, agentes que anteriormente se consideraron efectivos para la prevencion o tratamiento del cancer. Preferentemente, se administran dosis mas bajas de conocidas terapias anti-cancer en combinacion con dosis mas bajas de los anticuerpos monoclonales de la descripcion.

Como se utiliza aquf, el termino "en combinacion" se refiere al uso de mas de un agente terapeutico y/o profilactico. El uso del termino "en combinacion" no restringe el orden en el que se administran agentes profilacticos y/o terapeuticos a un sujeto con un trastorno celular hiperproliferativo, especialmente cancer. Se puede administrar un primer agente profilactico o terapeutico antes de (por ej., 1 minuto, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas, o 12 semanas antes), simultaneamente con, o posteriormente a (por ej., 1 minuto, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas, o 12 semanas despues) la administracion de un segundo agente profilactico o terapeutico a un sujeto que tuvo, tiene o puede tener un desorden celular hiperproliferativo, especialmente cancer. Los agentes profilacticos o terapeuticos se administran a un sujeto en una secuencia y en un intervalo de tiempo de manera que el agente de la invencion puede actuar junto con el otro agente para proporcionar mayores ventajas que si fueran administrados de otro modo. Cualquier agente profilactico o terapeutico adicional puede ser administrado en cualquier orden con los otros agentes profilacticos o terapeuticos adicionales.

8. Ensayos

8.1. Empleo de anticuerpos para detectar complejos uPA o uPAR por inmunoensayo

Los anticuerpos de esta descripcion son utiles en inmunoensayos para detectar moleculas que contienen estos epftopos en muestra de tejido o fluido corporal como suero o plasma. Dichos anticuerpos detectarfan el antfgeno o un fragmento portador de epftopo del mismo. Asf, la proteolisis en el medio tumoral tiene como resultado la liberacion de los fragmentos o en el tejido.

Para este proposito se puede emplear cualquier inmunoensayo convencional conocido, aunque los inmunoensayos de enzimas como ELISA son los preferentes. Los metodos de inmunoensayo tambien se describen en referencias citadas anteriormente.

Los inmunoensayos competitivos se utilizan normalmente para detectar moleculas en una muestra de prueba que son ligandos para el complejo que pueden imitar los anticuerpos monoclonales en su especificidad de union, afinidad, capacidad, etc. En un modo de realizacion de un ensayo de union competitiva, se mide la cantidad de anticuerpo unida al complejo (directa o indirectamente usando anti-Ig etiquetado). La competencia (es decir, menos union de anticuerpo a complejo) en la presencia de la muestra de prueba es la evidencia de que uno o mas componentes de la muestra se unen al complejo). Se espera que la mayorfa de compuestos sometidos a ensayo se unan con afinidades moderadas (aproximadamente 1-10 pM).

En otro modo de realizacion, un soporte solido, por ej., una microplaca, se recubre con el mAb de interes. La muestra de prueba se anade e incuba, por ej., durante unos 30 minutos para permitir la union de moleculas relevantes al anticuerpo. Las placas se lavan y el complejo, en forma detectablemente etiquetada (por ej., biotinilado), se anade como ligando competitivo, y se deja competir con la muestra de prueba por unirse al

anticuerpo. Un resultado "positivo" de la muestra de prueba se expresara como menos union del complejo

etiquetado unido a la fase solida. Este metodo, en el que la solucion del complejo y la solucion de la muestra no se anaden simultaneamente evita los confusos efectos de la muestra de prueba que se une directamente al complejo, porque cualquier muestra de prueba presente debe ser primero captada por el mAb inmovilizado. De manera preferente, para asegurar que la union sea especffica, se realizan una serie de diluciones para obtener una curva de dilucion. Esta mostrara si, por ejemplo, hay una relacion union/senal menor del 50% con la mitad de la muestra. A

falta de dichos efectos de dilucion, se puede concluir que multiples entidades de union estan participando en el

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ensayo. Los resultados son mas rigurosos si la union de moleculas en el sitio de union del mAb tienen afinidades similares.

8.1.1. Ensayos inmunohistoqufmicos

Un ensayo preferente para detectar los antfgenos en un tejido es por inmunohistoqufmica, utilizando cualquiera de los metodos de ensayo convencionales, que abundan en la tecnica. Un ensayo preferente es el descrito en los ejemplos siguientes. Para una descripcion de dicho metodos, ver, por ejemplo, Dabbs, DJ, Diagnostic Immunohistochemistry, Churchill Livingstone, 2001.

8.1.2. Inmunoensayos no histologicos

Los inmunoensayos preferentes son inmunoensayos de enzimas (EIA) como ELISA, que emplea antfgenos o Abs inmovilizados en soportes solidos. Para las presentes composiciones y metodos, el soporte solido es prefe rente me nte uno de poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrano, nilon, poliacrilamida, difluoruro de polivinilideno, celulosa natural, celulosa modificada, nitrocelulosa, agarosa y perlas magneticas. En un modo de realizacion preferente, la superficie de poliestireno o de otras placas multipocillos de plastico sirve de soporte solido. En otro modo de realizacion, se utiliza un soporte solido al que se fija el Ab o el antfgeno en el fondo o se coloca libremente en los pocillos de placas multipocillos. Tambien se pueden utilizar placas multipocillos en las que los fondos de los pocillos comprenden material de nitrocelulosa o similar a traves del cual el lfquido puede fluir bajo presion o vacfo.

Inmunoensayos tfpicos y preferentes incluyen ensayos "directos" en los que el Ab inmovilizado sobre un soporte solido entra primero en contacto con la muestra sometida a prueba para unir o "extraer" el antfgeno de la muestra por formacion de un complejo ab-antfgeno inmovilizado binario. Despues de la incubacion adecuada, el soporte solido se lava para eliminar el residuo de la muestra fluida incluyendo antfgeno sin fijar, si lo hubiera, para luego entrar en contacto con la solucion que contiene una cantidad desconocida de anticuerpo etiquetado (que funciona como una "molecula marcadora"). Tras una segunda incubacion, que permite al anticuerpo etiquetado crear un complejo con el antfgeno inmovilizado a traves de Ab no etiquetado, el soporte solido se lava una segunda vez para eliminar el Ab etiquetado que no ha reaccionado y se mide la etiqueta inmovilizada. Este tipo de ensayo sandwich directo puede ser un simple ensayo "sf/no" para determinar esta presente el antfgeno o puede hacerse cuantitativo comparando la cantidad de anticuerpo etiquetado inmovilizado con la cantidad inmovilizada cuando se utiliza una muestra estandar que contiene una cantidad conocida de antfgeno.

Tambien pueden utilizarse los llamados ensayos sandwich llamados "simultaneos" e "inversos". Un ensayo simultaneo implica una unica etapa de incubacion dado que el anticuerpo inmovilizado y el anticuerpo etiquetado se anaden simultaneamente a la muestra. Tras la incubacion adecuada, el soporte solido se lava para eliminar el residuo de la muestra y el anticuerpo etiquetado no complejo. La presencia o cantidad de anticuerpo etiquetado asociado con el soporte solido es determinado a continuacion como en el ensayo sandwich "directo" convencional anterior.

En un ensayo "inverso", se anade una solucion del anticuerpo etiquetado a la muestra tras un periodo de incubacion adecuado por adicion de anticuerpo no etiquetado inmovilizado. Tras una segunda incubacion, el material de fase solida se lava de manera convencional para liberarlo del residuo de la muestra y del anticuerpo etiquetado que no ha reaccionado. A continuacion se realiza la determinacion del anticuerpo inmovilizado asociado con el soporte solido como en los ensayos "simultaneo" y "directo".

8.2. Ensayos de union de anticuerpo a uPAR sobre celulas completas

El Ab dirigido a uPAR y/o conjugado del mismo se somete a prueba de union a uPAR, preferentemente midiendo la

inhibicion de la union de [125I]DFP-uPA a uPAR en un ensayo competitivo de union a ligando o etiquetando

directamente el Ab con [125I]. El ensayo puede emplear celulas completas que expresen uPAR, por ejemplo lfneas de

celulas como A2780 o HeLa. Un ensayo preferente se realiza como sigue. Se siembran celulas (aprox. 5 x

104/pocillo) en un medio (por ej., MEM con sales Earl/10% FBS + antibioticos) en placas de 24 pocillos, y luego se

incuban en una atmosfera de CO2 al 5% humeda hasta que las celulas alcancen una confluencia del 70%. uPA de

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elevado peso molecular catalfticamente inactivado (DFP-uPA) es radioyodado utilizando Iodogen (Pierce) hasta una actividad especffica de aprox. 250.000 cpm/pg. Las placas que contienen celulas se enfrfan en hielo y las celulas se lavan dos veces (5 minutos cada vez) con PBS frfo/0,05% Tween-80. Abs de prueba y/o sus conjugados se diluyen en serie en PBS frfo/0,01% BSA/0,01% Tween-80 y se anaden a cada pocillo hasta un volumen final de 0,3 mL 10 minutos antes de la adicion de [125I]DFP-uPA. Cada pocillos recibe a continuacion 9.500 cpm de [125I]DFP-uPA a una concentracion final de 0,2 nM). Las placas se incuban a continuacion a 4°C durante 2 horas, y despues de ese tiempo las celulas se lavan 3 x (5 minutos cada) con PBS frfo/ 0,05% Tween-80. Se anade NaOH a cada pocillo en 0,5 mL para lisar las celulas, y la placa se incuba durante 5 minutos a temperatura ambiente o hasta que todas las celulas de cada pocillo estan lisadas tal como se determina por examen microscopico. Se aspira a continuacion el contenido de cada pocillo y se determina el recuento total en cada pocillo utilizando un contador gamma. Cada compuesto se prueba por triplicado y los resultados se expresan como porcentaje de la radioactividad medida en

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pocillos que contengan solo [125I]DFP-uPA, lo cual representa la union maxima (100%).

La inhibicion de la union de [125I]DFP-uPA a uPAR esta por lo general relacionada con la dosis, de manera que la concentracion del compuesto de prueba necesario para producir una inhibicion del 50% de union (el valor IC50), que se espera caiga en la parte lineal de la curva, se determina facilmente. En general, Abs y/o conjugados del mismo tienen valores IC50 de menos de 10"5 M. Preferentemente, Abs y/o sus conjugados tienen valores IC50 de menos de 10"6 M, mas preferentemente, menos de 10"7M.

8.3. Ensayos de actividad biologica de anticuerpos anti-uPAR u otros ligandos

Los expertos en la tecnica apreciaran que los ensayos in vivo e in vitro utiles para medir la actividad de los Abs u otros ligandos de union a uPAR de la descripcion o de sus conjugados, tal como se describe aquf, pretenden ser ilustrativos y en ningun caso exhaustivos o restrictivos.

8.3.1. Ensayo de migracion de EC

En estudios de migracion de EC, los pocillos transwell se recubren con colageno tipo I (50 pg/mL) anadiendo 200 pL de la solucion de colageno por transwell, incubando a continuacion durante la noche a 37°C. Los transwell se ensamblan en una placa de 24 pocillos y se anade un quimioatrayente (por ej., FGF-2) a la camara del fondo en un volumen total de medio de 0,8 mL. ECs, como celulas endoteliales de venas umbilicales humanas (HUVEC) que han sido desprendidas del cultivo monocapa utilizando tripsina, se diluyen a una concentracion final de aprox. 106 celulas/mL con medio libre de suero y 0,2 mL de esta suspension celular se anade a la camara superior de cada transwell. Se puede anadir los inhibidores a someter a prueba a las camaras superior e inferior y se deja que la migracion proceda durante 5 horas en una atmosfera humidificada a 37°C. Los transwells se retiran de la placa tintada utilizando DiffQuik®. Las celulas que no migraron se retiran de la camara superior frotando con un bastoncillo de algodon y las membranas se desprenden, se montan sobre platinas, y se cuentan bajo un campo microscopico de alta resolucion (400x) para determinar el numero de celulas migradas.

8.3.2. Ensayo biologico de actividad anti-invasiva

La actividad de las celulas como ECs o celulas tumorales (por ej., celulas de carcinoma prostatico humano PC-3) de invadir a traves de una membrana de base reconstituida (Matrigel®) en un ensayo conocido como un sistema de ensayo de invasion Matrigel® es bien conocida (Kleinman et al., Biochemistry 1986, 25: 312-318; Parish et al., 1992, Int. J. Cancer 52:378-383). Matrigel® es una membrana de base reconstituida que contiene colageno de tipo IV, laminina, proteoglicanos de sulfato de heparan como perlecan (que se une a y localiza bFGF), vitronectina asf como el factor-p de crecimiento transformante (TGFp), activador de plasminogeno tipo uroquinasa , activador de plasminogeno de tejidos (tPA) y la serpina conocida como inhibidor del activador de plasminogeno tipo 1 (PAI-1) (Chambers et al., Canc Res. 1995, 55:1578-1585). Es aceptado en la tecnica que los resultados obtenidos en este tipo de ensayos para Abs y/o conjugados de los mismos y otros ligandos que se dirigen a receptores extracelulares o enzimas son predictivos de la eficacia de estos Abs y/o conjugados de los mismos in vivo (Rabbani et al., Int. J. Cancer 1995, 63: 840-845).

Dichos ensayos emplean insertos de cultivo de tejidos transwell. Las celulas invasivas se definen como celulas que penetran a traves de Matrigel® y el aspecto superior de una membrana de policarbonato y se adhieren al fondo de la membrana. Transwells (por ej. de Costar) conteniendo membranas de policarbonato (tamano poros 8,0 pm) se recubren con Matrigel® (por ej.,, de Collaborative Research), que ha sido diluido en PBS esteril a una concentracion final de 75 pg/mL (por ej., 60 pL de Matrigel diluido por inserto) y se colocan en una placa de 24 pocillos. Las membranas se secan durante la noche en una caja de seguridad biologica, y luego se rehidratan anadiendo 100 pL de medio, por ej., DMEM, complementado con antibioticos durante 1 hora en una mesa vibratoria. El DMEM se retira de cada inserto por aspiracion y se anade 0,8 mL de DMEM completo (+/10/ FBS y antibioticos) a cada pocillo de la placa de 24 pocillos de manera que rodee la parte exterior del transwell ("camara inferior"). Se anade DMEM fresco con antibioticos (100pL), Glu-plasminogeno humano (5 pg/mL), y cualquier inhibidor que se vaya se someter a prueba a la parte superior, dentro del transwell ("camara superior"). Se realiza una tripsinizacion y una re-suspension de las celulas que se van a someter a prueba en DMEM + antibioticos y se anaden a la camara superior del transwell a una concentracion final de aprox. 8x105 celulas/mL. El volumen final de la camara superior se ajusta a 200 pL. La placa ensamblada se incuba a continuacion en una atmosfera de CO2 al 5% humeda durante 72 horas aprox. Despues de la incubacion, se procede a la fijacion y tincion de las celulas con DiffQuik® (tincion Giemsa) y a continuacion se frota la camara superior con un bastoncillo de algodon para retirar el Matrigel® y las celulas que no penetraron por la membrana. Las membranas se desprenden del transwell utilizando una cuchilla X-acto®, montada sobre platinas utilizando Permount® y cubreobjetos, y luego se recuentan al microscopio utilizando alta resolucion (por ej. 400x). Se calcula un numero medio de celulas invasivas a partir de 5-10 campos recontados y se representan como una funcion de la concentracion de inhibidor.

8.3.3. Ensayos de formacion en tubo de actividad angiogenica

ECs, por ejemplo, celulas endoteliales de venas umbilicales humanas (HUVEC) o celulas endoteliales

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microvasculares humanas (HMVEC) que pueden prepararse o obtenerse comercialmente, se mezclan a una concentracion de 2 x 105 celulas/mL con fibrinogeno (5 mg(mL en solucion salina tamponada con fosfato (PBS) en una proporcion de 1:1 (v/v). Se anade trombina (5 unidades / mL concentracion final) y la mezcla se transfiere inmediatamente a un placa de 24 pocillos (0,5 mL por pocillo). Se deja que se forme el gel de fibrina y luego se anade VEGF y bFGF a los pocillos (cada uno a 5 ng/mL de concentracion final) junto con el compuesto de la prueba. Las celulas se incuban a 37°C en CO2 al 5% durante 4 dfas y pasado ese tiempo se cuentan las celulas de cada pocillo y se clasifican como redondeadas, alargadas sin ramificaciones, alargadas con una ramificacion o alargadas con 2 o mas ramificaciones. Los resultados se expresan como la media de 5 pocillos diferentes por cada concentracion de compuesto. Normalmente, en presencia de los inhibidores angiogenicos, las celulas siguen siendo o bien redondeadas o forman tubos indiferenciados, por ej., 0 o 1 ramificacion). Este ensayo esta considerado predictivo de la eficacia angiogenica (o anti-angiogenica) in vivo (Min et al., Cancer Res. 1996, 56: 2428-2433).

En un ensayo alternativo, la formacion de tubos EC se observa cuando se cultivan ECs en Matrigell® (Schnaper HW et al., J. Cell. Physiol. 1995, 165:107-118). 104 EC/pocillo se transfieren a placas de 24 pocillos recubiertas de Matrigel® y se cuantifica la formacion de tubos despues de 48 horas. Los inhibidores se someten a prueba anadiendolos o bien en el momento de anadir los ECs o en diversos momentos a continuacion. La formacion de tubos tambien puede ser estimulada anadiendo (a) un factor de crecimiento angiogenico como bFGF o VEGF, (b) un agente estimulador de la diferenciacion (por ej., PMA) o (c) una combinacion de los mismos.

Sin animo de cenirnos a ninguna teorfa en concreto, este ensayo modela la angiogenesis presentando a las ECs un tipo particular de membrana de base, a saber, la capa de matriz que se supone que las ECs migrantes y diferenciadoras encontrarfan en primer lugar. Ademas de factores de crecimiento unidos a matriz, los componentes de matriz encontrados en Matrigel® (y en membranas de base in situ), o los productos proteolfticos del mismo, tambien pueden ser estimulantes para la formacion de tubos lo cual convierte este modelo en complementario del modelo de angiogenesis de gel de fibrina previamente descrito (Blood, CH et al., Biochim. Biophys. Acta 1990, 1032:89-118; Odedra, R et al., Pharmac. Ther. 1991, 49:111-124).

8.3.4. Ensayos para la inhibicion de la proliferacion celular

La capacidad de los Abs y/o conjugados de esta descripcion de inhibir la proliferacion de ECs puede determinarse en un formato de 96 pocillos. El colageno de tipo I (gelatina) se utiliza para recubrir los pocillos de la placa (0.1-1 mg/mL en PBS, 0.1 mL por pocillo durante 30 minutos a temperatura ambiente). Despues de lavar la placa (3x usando PBS), se siembran 3-6 x 103 celulas por pocillo y se deja que se fijen durante 4 horas (37°C/5% CO2) en Medio de Crecimiento Endotelial (EGM; Clonetics) o medio M199 complementado con FBS 0.1-2% . El medio y las celulas fijadas se retira al cabo de 4 horas y se anade a cada pocillo medio nuevo complementado con FbFGF (1-10 ng/mL) o VEGF (1-10 ng/mL). Por ultimo se anaden anticuerpos y/o conjugados a someter a prueba y se deja incubar la placa durante 24-48 horas (37°C/5% CO2). El compuesto cromogenico MTS (Promega) se anade a cada pocillo y se deja incubar de 1 a 4 horas. El desarrollo del color en cada pocillo es directamente proporcional al numero de celulas, sirviendo por lo tanto como sustituto para recontar celulas. La absorbencia lefda a 490nm se utiliza para determinar las diferencias en numeros de celulas, es decir, proliferacion, entre pocillos de control y los que contienen Abs de prueba y/o conjugados.

Tambien se puede utilizar un ensayo similar empleando celulas tumorales adherentes cultivadas. Sin embargo, en este formato puede omitirse el colageno. Se siembran las celulas tumorales (por ej., 3-10 x 103/pocillo) y se deja que se adhieran durante la noche. A continuacion se anade medio libre de suero y se fuerza a las celulas a sincronizar durante 24 horas. Luego se anade medio + FBS al 10% a cada pocillo para estimular la proliferacion. En algunos pocillos se incluye anticuerpos y/o conjugados a someter a prueba. Despues de 24 horas se anade MTS a la placa y el ensayo se desarrolla y lee como se ha mencionado

8.3.5. Ensayos de citotoxicidad

Los efectos citotoxicos y anti-proliferativos de Abs y/o sus conjugados pueden determinarse para varios tipos de celulas incluyendo celulas tumorales, ECs, fibroblastos y macrofagos. Esto es especialmente util cuando se somete a prueba un Ab que ha sido conjugado con una porcion terapeutica como una toxina o una radioterapeutica. Por ejemplo, se espera que un conjugado de uno de los Abs de la descripcion con reactivo Bolton-Hunter que ha sido yodado con 131I inhiba la proliferacion de celulas que expresan uPAR (mas probablemente induciendo apoptosis). Se esperan efectos anti-proliferativos contra celulas tumorales y celulas endoteliales estimuladas pero, en algunas circunstancias contra celulas endoteliales no quiescentes o fibroblastos dermicos humanos normales. Cualquier efecto anti-proliferativo o citotoxico observado en las celulas normales puede representar toxicidad no especffica del conjugado.

Un ensayo tfpico implicarfa la siembra de celulas a una densidad de 5-10.000 celulas por pocillo en una placa de 96 pocillos. El compuesto a someter a prueba se anade a una concentracion 10x IC50 medido en un ensayo de union (esto variara en funcion del conjugado) y se dejara incubar con las celulas durante 30 minutos. Las celulas se lavan 3X con medio, luego se anade medio fresco que contenga (3H]timidina (1 pCi/mL) a las celulas y se dejan incubar a 37°C en 5% CO2 durante 24 y 48 horas. Las celulas son lisadas en diversos momentos utilizando 1 M NaOH y se

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hacen recuentos por pocillo utilizando un contador-p. La proliferacion puede medirse no radioactivamente utilizando reactivo MTS o CyQuant® para medir el numero total de celulas. Para ensayos de citotoxicidad (medicion de lisis celular), se utiliza un kit de citotoxicidad de 96 pocillos Promega. Si hay pruebas de actividad anti-proliferativa, se puede medir la induccion de apoptosis utilizando TumorTACS (Genzyme).

8.3.6. Ensayo de actividad de la caspasa-3

La capacidad de los Abs y/o conjugados de promover la apoptosis de ECs puede determinarse midiendo la activacion de la caspasa-3. Se utiliza colageno de tipo I (gelatina) para recubrir una placa P100 y se siembran 5x105 ECs en EGM + FbS 10%. Despues de 24 horas (a 37°C/5% CO2) el medio se reemplaza por EGM + FBS 2%, 10 ng/ml bFGF y el compuesto de prueba deseado. Las celulas se recolectan despues de 6 horas, se preparan lisados celulares en detergente Triton X-100 1% y los lisados se valoran utilizando el Kit de Ensayo EnzChek®Caspase-3 (probetas moleculares) segun las instrucciones del fabricante.

8.3.7. Modelos de xenoinjertos de crecimiento de tumor subcutaneo

Carcinoma ovarico humano

Se establecio una lfnea de cancer ovarico humano A2780 a partir de tejido tumoral de una paciente no tratada. Las celulas A2780 se mantienen como una monocapa en medio RPMI 1640 complementado con 2 mM glutamina, 0,01 mg/mL de insulina bovina, y FBS al 10%. (Hamilton, TC et al., Sem. Oncol. 1984; 11:285-293; Behrens, BC et al., Cancer Res. 1987; 47:414-418). Se inocularon dos millones de A2780 en el flanco derecho de ratones desnudos hembras Balb/c. El tumor A2780 se programa en estadios del rango de 50 a 200 mm3 antes de administrar el tratamiento. El Ab de control de IgG asf como los mAbs de uPAR anti-D2D3 se administran por via intraperitoneal a 10 mg/kg dos veces por semana el lunes y el viernes. El grupo de tratamiento con cisplatina fue programado a 1000 mm3; los animales recibieron 6 mg/kg una vez a la semana. El volumen de los tumores se midio dos veces por semana. En el momento del sacrificio, se obtuvo plasma y se extirpo el tumor de cada animal. La mitad del tumor se congelo inmediatamente para su evaluacion bioqufmica y el resto se coloco en fijador de cinc para su evaluacion histologica.

Carcinoma pulmonar humano

Se establecio una lfnea celular (ATCC Catalogo No. CCL-185) de carcinoma pulmonar humano, A549, a traves de un explante de tejido carcinomatoso pulmonar de un hombre caucasico de 58 anos (Giard, DJ et al., J. Natl. Cancer Inst. 51:1417-23 (1973)). Celulas A549 se mantienen en medio F12K de Ham complementadas con 2 mM L- glutamina, 0,15% de NaHCO3, y FBS al 10%.

Aproximadamente 106 celulas de carcinoma A549 se inoculan en el flanco derecho de ratones hembra (SCID) con inmunodeficiencia combinada grave C.B-17/Sys scid/scid). El tratamiento se inicia preferentemente el dfa despues de la inoculacion del tumor. El Ab de control de IgG (y el control de PBS) asf como el mAbs de uPAR anti-D2D3 ATN-658 se administran por via intraperitoneal a 10 mg/kg dos veces por semana el lunes y el viernes. Inicialmente el volumen del tumor se mide una vez a la semana. Cuando el volumen en el grupo de tratamiento excede de 300 mm3, las mediciones se obtienen dos veces por semana.

En el momento del sacrificio, se obtuvo plasma y se extirpo el tumor de cada animal. La mitad del tumor se congelo inmediatamente para su evaluacion bioqufmica y el resto se coloco en fijador de cinc para su evaluacion histologica.

8.3.8. Modelo de xenoinjerto de metastasis

Abs y/o conjugados se someten a prueba de inhibicion de metastasis tardfa utilizando un modelo de metastasis experimental como el de Crowley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993, 90 5021-5025). La metastasis tardfa implica las etapas en que las celulas tumorales se fijan y extravasan, invaden localmente, se siembran, proliferan e inducen angiogenesis. Se inoculan en ratones desnudos celulas de carcinoma prostatico humano (PC-3) transfectadas con un gen marcador, preferiblemente gen de protefna fluorescente verde (GFP), pero como alternativa con un gen que codifica las enzimas cloranfenicol acetil-transferasa (CAT), luciferasa o LacZ. Este metodo permite la utilizacion de cualquiera de estos marcadores (deteccion por fluorescencia de GFP o deteccion colorimetrica histoqufmica de varias enzimas) para seguir el destino de estas celulas. Se inyectan las celulas, preferentemente iv, y se identifican las metastasis al cabo de 14 dfas aproximadamente, particularmente en los pulmones pero tambien en nodos linfaticos regionales, femures y cerebro. Esto simula el tropismo organico de las metastasis que se producen de forma natural en el cancer de prostata humano. Por ejemplo, se inyectan celulas PC- 3 que expresan GFP ( (106 celulas por raton) en las venas de la cola de ratones desnudos (nu/nu). Los animales son tratados con una composicion de prueba a 100pg/animal/dfa. IP. Celulas y focos metastasicos se visualizan y cuantifican mediante microscopia de fluorescencia o histoqufmica por microscopia optica o se tritura el tejido y se realiza un ensayo colorimetrico cuantitativo de la etiqueta detectable.

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La divulgacion proporciona un pack o kit farmaceutico que comprende uno o mas recipientes rellenos de un anticuerpo uPAR de la divulgacion. Adicionalmente, tambien se puede incluir uno o mas de otros agentes terapeuticos o profilacticos para el tratamiento del cancer en el pack o kit farmaceutico. La divulgacion tambien presenta un pack o kit farmaceutico que comprende uno o mas recipientes rellenos con uno o mas de los ingredientes de las composiciones farmaceuticas de la divulgacion. De manera opcional, dichos recipientes pueden ir acompanados de (a) un aviso en la forma prescrita por una agencia del gobierno que regula la fabricacion, uso o venta de productos farmaceuticos o biologicos, aviso que recoge la autorizacion de la agencia de la fabricacion, uso o venta para administracion a humanos.

La presente divulgacion presenta kits que pueden utilizarse en los metodos mencionados. En un modo de realizacion, un kit comprende uno o mas anticuerpos uPAR de la divulgacion. En otro modo de realizacion, el kit tambien comprende uno o mas agentes terapeuticos o profilacticos utiles para el tratamiento del cancer, en uno o mas recipientes. En ciertos modos de realizacion, el otro agente profilactico o terapeutico es un agente quimioterapeutico. En otros modos de realizacion, el otro agente profilactico o terapeutico es un agente terapeutico hormonal o biologico.

10. Metodos generales

Metodos generales de biologfa molecular han sido ampliamente descritos en el campo (Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd (or later) Edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989; Ausubel, F et al., Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, Wiley-Interscience, New York, (current edition) ; Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990) ; Glover, DM, ed., DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II, IRL Press, 1985; Alberts, B. et al., Molecular Biology of the Cell, 4th (or later) Ed., Garland Publishing, Inc., New York, NY (2002) ; Watson, JD et al., Recombinant dNa, 2nd Ed. (o posteriormente) Ed., WH Freeman & Co.; 2nd edition (1993) ; and Old, RW et al., Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering, 5th (or later) ed., Univ. of Calif. Press, Berkeley (1994).

En la divulgacion, se hace referencia a diversas metodologfas conocidas por aquellos competentes en el ambito de la inmunologfa, biologfa celular y biologfa molecular. Obras de referencia estandar que establecen los principios generales de la inmunologfa incluyen Abbas, AK et al., Cellular and Molecular Immunology (Fourth Ed.), W. B. Saunders Co., Philadelphia, 2000; Janeway, CA et al., Immunobiology. The Immune System in Health and Disease, 4th ed., Garland Publishing Co., New York, 1999; Roitt, I et al., Immunology, (current ed.) C. V. Mosby Co., St. Louis, MO (1999) ; Klein, J, Immunology, Blackwell Scientific Publications, Inc., Cambridge, MA, (1990).

A menos que se indique lo contrario, se entiende que una secuencia de acido nucleico particular comprende variantes de sustitucion conservadora del mismo, por ej. sustituciones de codones degenerados y una secuencia complementaria. El termino "acido nucleico" es sinonimo de "polinucleotido" e incluye un gen, una molecula ADNc, una molecula de ARNm, asf como un fragmento de cualquiera de ellas como un oligonucleotido, y ademas, sus equivalentes (se explica con mas detalle mas adelante). Los tamanos de los acidos nucleicos se indican o bien como kilobases 8kb) o bien como pares de bases (bp). Son estimaciones derivadas de electroforesis en gel de poliacrilamida o agarosa (PAGE), de secuencias de acido nucleico que son determinadas por el usuario o estan publicadas. El tamano de la protefna se indica como masa molecular en kilodaltons (kDa) o como longitud (numero de residuos de aminoacidos). El tamano de la protefna se estima a partir de PAGE, por secuenciacion, a partir de presuntas secuencias de aminoacidos basadas en la secuencia de acido nucleico codificadora o de secuencias de aminoacidos publicadas.

De manera especffica, las moleculas de ADN que codifican la secuencia de aminoacidos correspondiente a los polipeptidos de la presente invencion, o variantes activas los mismos, pueden sintetizarse por la reaccion de cadena de polimerasa (PCR) (ver, por ejemplo, Patente U.S. N° 4,683,202) usando iniciadores derivados de la secuencia de la protefna divulgada aquf. Estas secuencias de ADNc pueden ensamblarse a un vector de expresion de eucariotas y procariotas y el vector resultante puede ser utilizado para dirigir la sfntesis del polipeptido de fusion o su fragmento o derivado por las celulas huesped adecuadas, por ej., celulas COS o CHO.

Las secuencias de acido nucleico de esta divulgacion pueden ser ADN o ARN.

Celulas huespedes eucariotas o procariotas transformadas o transfectadas para expresar los presentes polipeptidos entran dentro del alcance de la divulgacion. Por ejemplo, el polipeptido puede expresarse en celulas bacterianas como E. coli, celulas de insectos (baculovirus), levadura, o celulas de mamffero como celulas de ovario de hamster chino (CHO) o celulas humanas (que son preferibles para uso terapeutico humano de celulas transfectadas). Los expertos en el campo conocen otros huespedes adecuados. La expresion en celulas eucariotas conduce a glicosilacion parcial o completa y/o formacion de enlaces disulfuro inter o intra-cadena relevantes del polipeptido recombinante. Ejemplos de vectores para expresion en levadura S. cerevisiae incluyen pYepSec (Baldari et al., 1987, EMBO J. 6: 229-234), pMFa (Kurjan et al. 1982 Cell 30: 933-943), pJRY88 (Schultz et al., 1987, Gene 54: 113123), and pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.). Vectores de baculovirus disponibles para expresion de protefnas en celulas de insectos cultivadas incluyen la serie pAc (Smith et al., 1983, Mol. Cell Biol. 3:2156-2165) y la

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serie pVL (Lucklow et al., (1989) Virology 170:31-39). En general, se utilizan celulas COS (Gluzman 1981 Cell 23:175-182) en conjuncion con vectores como pCDM 8 (Aruffo et al., supra, para expresion/amplificacion transiente en celulas de mamffero, mientras que las celulas CHO (CHO dhfr-negativo) se utilizan con vectores como pMT2PC (Kaufman et al., 1987, EMBO J. 6: 187-195) para la amplificacion/expresion estable en celulas de mamffero. La lfnea de celulas de mieloma NSO (un sistema de expresion de glutamina sintetasa) esta disponible en Celltech Ltd.

La construccion de vectores adecuados que contengan las secuencias de control y codificacion deseadas emplea tecnicas de restriccion y ligadura estandar que son bien conocidas en el estado de la tecnica. Plasmidos aislados, secuencias de ADN o oligonucleotidos sintetizados son escindidos, adaptados o religados en la forma deseada. Las secuencias de ADN que forman los vectores estan disponibles en una serie de fuentes.

Vectores determinantes y sistemas de control se encuentran por lo general en vectores "huesped" disponibles que se utilizan para el grueso de las secuencias en construccion. Para la secuencia de codificacion pertinente, la construccion inicial puede ser, y generalmente es, una cuestion de recuperar las secuencias adecuadas de bibliotecas de ADN genomico o ADNc. Sin embargo, una vez que la secuencia es revelada, es posible sintetizar la secuencia entera de genes in vitro empezando por los derivados de nucleotidos individuales. La secuencia entera de genes para genes de longitud en el rango de 500-1000 bp puede prepararse sintetizando oligonucleotidos complementarios superpuestos individuales y rellenando porciones no superpuestas monocatenarias utilizando ADN polimerasa en presencia de los trifosfatos deoxiribonucleotidos. Este enfoque se ha utilizado con exito en la construccion de varios genes de secuencia conocida. Ver, por ejemplo, Edge, Nature 1981, 292:756; Nambair et al., Science 1984, 223:1299; and Jay, J. Biol. Chem. 1984,259:6311. Oligonucleotidos sinteticos se preparan mediante metodos descritos en referencias citadas anteriormente o por Beaucage et al., Tetrahedron Lett. 1981, 22:1859; and Matteucci et al., J. Am. Chem. Soc. 1981, 103:3185.

Los componentes de los vectores deseados pueden escindirse o ligarse utilizando procedimientos de ligadura y restriccion estandar. La escision de ADN de un sitio especffico se realiza tratando con la enzima de restriccion adecuada (o enzimas) en condiciones que se conocen por lo general en la materia, y cuyos detalles son especificados por el fabricante de estas enzimas de restriccion disponibles en el comercio. Ver, por ej., New England Biolabs, Product Catalog. Si se desea, la separacion por tamanos de los fragmentos escindidos puede realizarse mediante tecnicas estandar de electroforesis en gel de agarosa o gel de poliacrilamida, por ej. Meth. Enzymol. (1980) 65:499-560).

Se utiliza uno cualquiera de una serie de metodos para introducir mutaciones en la secuencia de codificacion para generar variantes si se van a producir de manera recombinante. Estas mutaciones incluyen inserciones o supresiones simples, supresiones sistematicas, inserciones o sustituciones de racimos de bases o sustituciones de bases unicas. La modificacion de la secuencia de ADN por mutagenesis dirigida al sitio es una tecnica muy conocida para la que existen protocolos y reactivos en el comercio (Zoller et al., Nucleic Acids Res. 1982,10:6487-6500; Adelman et al., DNA 1983, 2:183-193)). El ADN aislado se analiza por restriccion y/o secuenciado por el metodo de nucleotido didesoxi (Sanger, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1977,74:5463; Messing, et al., Nucleic Acids Res. 1981, 9:3091 o Maxam et al., Meth. Enzymol, supra).

ADN vector puede introducirse en celulas de mamffero mediante tecnicas convencionales como co- precipitacion de cloruro de calcio o fosfato de calcio, transfeccion mediada por dextrano-DEAE, lipofeccion o electroporacion. Metodos adecuados para transformar celulas huesped pueden encontrarse en Sambrook et al. supra y otros textos estandar. En vectores de expresion de fusion, un sitio de escision proteolftica es introducido en el empalme del grupo marcador y la protefna de destino para permitir la separacion de la protefna de destino del grupo marcador despues de la purificacion de la protefna de fusion. Enzimas proteolfticas para dicha escision y sus secuencias de reconocimiento incluyen Factor Xa, trombina y enteroquinasa.

Despues de haber descrito la invencion de manera general, se entendera mejor mediante la referencia a los siguientes ejemplos que se proporcionan a modo de ilustracion y no pretenden limitar el ambito de la presente invencion, a menos que se especifique.

Ejemplos

1. MATERIALES Y METODOS

1.1. Lmeas de celulas que expresan protefnas

El sistema de expresion de Drosophila (DESTM; Invitrogen, Inc.) utiliza la lfnea de celulas Schneider 2 (S2), derivada de Drosophila melanogaster, y vectores plasmidicos para la expresion de protefnas heterologas. Los vectores plasmfdicos para expresion en celulas S2 son muy versatiles, permitiendo la expresion inducible de una protefna producida por el promotor de metaloteionefna (MT). El mismo plasmido tambien permite que la protefna sea secretada de la celula a los medios circundantes, simplificando grandemente la purificacion de la protefna. Copias multiples del vector pueden ser insertadas establemente en el ADN genomico de celulas S2, incrementando los niveles de expresion de protefnas. Las protefnas expresadas en celulas S2 estan mfnimamente glicosiladas lo cual

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es importante para la generacion de Abs dirigidos contra el componente protefna de uPAR. Productos tfpicos de protefnas despues de purificacion son 25-50 mg/L con una pureza del 95 por ciento aproximadamente. Se han generado lineas de celulas que expresan las siguientes protefnas: suPAR, D1, D2D3, scupA, ATF1-143, ATF1-135, Kringle47-143, and Kringle47-135. Ademas, se han generado clones para suPAR en los que se han abolidos los sitios de N-glicosilacion.

1.2. Reactivos

125I fue adquirido como Na125I (480-630 MBq [13-17 mCi] por pg de yodo) de Amersham Corp.

1.3. Lineas de celulas tumorales

Se utilizaron las siguientes lineas de celulas y tumores: A549, HeLa, y A2780. Se establecio una lfnea de cancer ovarico humano A2780 a partir de tejido tumoral de una paciente no tratada. Las celulas A2780 se mantienen como una monocapa en medio RPMI 1640 complementado con 2 mM glutamina, 0,01 mg/mL de insulina bovina, y FBS al 10%. Ver supra. Carcinoma pulmonar humano, A549, ATCC Catalogo N° CCL-185, descrito mas arriba, se mantiene en medio F12K de Ham complementado con 2 mM L-glutamina, 0.15% NaHCO3, y FBS al 10%.

Celulas A2780 (2x106) fueron inoculadas en el flanco derecho de ratones desnudos hembra Balb/c. El tumor fue programado en estadios del rango de 50 a 200 mm3 antes de iniciar el tratamiento. El anticuerpo de control de IgG asf como los mAbs de uPAR anti-D2D3 fueron administrados por via intraperitoneal a 10 mg/kg dos veces por semana el lunes y el viernes. El grupo de tratamiento con cisplatina fue programado a 1000 mm3; los animales recibieron 6 mg/kg una vez a la semana. El volumen de los tumores se midio dos veces por semana.

Celulas de carcinoma A549 (106) fueron inoculadas en el flanco derecho de ratones hembra C.B-17/Sys (scid/scid) (scid: Inmunodeficiencia combinada grave). El tratamiento se inicio al dfa siguiente de la inoculacion del tumor. El Ab de control de IgG (y el control de PBS) asf como el mAb de uPAR anti-D2D3 ATN-658 fueron administrados por via intraperitoneal a 10 mg/kg dos veces por semana el lunes y el viernes. Inicialmente los volumenes del tumor se midieron una vez a la semana. Cuando el volumen en el grupo de tratamiento excedio de 300 mm3, las mediciones se obtuvieron dos veces por semana.

En el momento del sacrificio, se obtuvo plasma y se extirpo el tumor de cada animal. La mitad del tumor se congelo inmediatamente para su evaluacion bioqufmica y el resto se coloco en fijador de cinc para su evaluacion histologica.

2. Union de uPA a uPAR

La union de uPA a uPAR se midio utilizando celulas uPA y HeLa etiquetadas- 125I (ver Figura 2). Las celulas HeLa expresan cantidades abundantes de uPAR pero no expresan uPA. En resumen, 100 pg de scuPA fue etiquetado con 100 pCi de [125I]Nal utilizando reactivo de yodacion Iodo-Gen™ (Pierce Biotechnology Inc.). El Nal etiquetado no incorporado se retiro de la protefna etiquetada utilizando una columna de exclusion por tamano y la protefna etiquetada eluida en solucion salina tamponada con Tris conteniendo albumina de suero bovino al 0,1%. Se incubaron celulas HeLa con concentraciones crecientes de [125I]-scuPA diluido en PBS conteniendo BSA al 0,1% durante 2 horas a 4° C. Las celulas se lavaron a fondo con PBS/0.1% BSA, las monocapas de celulas lisadas con 1M NaOH y se determino el numero total de uniones. Se determino la union especffica incubando celulas con [125I]- scuPA en presencia de un gran exceso de scuPA no etiquetado. La union tambien se realizo con celulas MDA- MB231 que expresan tanto uPA como uPAR. Para determinar la union de scuPA, se retira primero el uPA endogeno de la superficie de celulas MDA-MB231 lavando con un tampon que contenga 0,1 M gilicina/100 mM NaCl, pH 3 durante 5 minutos a 4° C. Este protocolo tambien se utilizo para determinar la union de [125I]-ATF a celulas HeLa. La capacidad de Abs de inhibir la union de [125I]-scuPA o la union de [125I]-ATF a celulas HeLa se determino incubando celulas con cantidades crecientes de Ab no etiquetado durante 15 minutos a 4° C, antes de la adicion de la protefna etiquetada- [125I].

ATN-658 no inhibe la union de scuPA a uPAR (Figura 2) en la superficie de celulas HeLa y es capaz de unirse a celulas HeLa en presencia de scuPA. Por lo tanto, ATN-658 puede dirigirse tanto a receptores ocupados y no ocupados en la superficie de la celula.

La union de scuPA a uPAR tambien fue medida utilizando celulas HeLa y scuPA biotinilado. En resumen, se sembro celulas HeLa en una placa de 24 pocillos a 150.000 celulas por pocillo 24 horas antes de realizar el ensayo de union. Se preparo 3 ml de 30 nM biotina-ATN-615, 3 ml de 30 nM biotina-ATN-658 y 3 mL de 100 nM biotina-scuPA y se diluyeron en serie con 2 ml de tampon por cada 1 ml de reactivo. Las celulas HeLa sembradas se lavaron 2 veces con 1 ml de tampon de lavado (1xHBSS/0.1% BSA) seguido de incubacion con biotina-scuPA, biotina-ATN-658 o biotina-ATN-615 durante 1 hora a temperatura ambiente en tampon de union (1xHBSS/0.1% BSA). Se puede anadir ATN-658, ATN-617, o scuPA sin etiquetar para valorar la union competitiva y no especffica. Las celulas se lavaron luego dos veces con 1 ml de tampon de lavado. Se anadio 250 pl Avidina-HRP (1 pl en 20 ml de tampon) a cada pocillo y se dejo incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente, seguido de 3 lavados. A continuacion, se anadio sustrato OPD (250 pl) a cada pocillo, y se dejo que se formara un color amarillo antes de detener la reaccion

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con 50 pl 1M H2S04 (para placa de 24 pocillos) Se hicieron lecturas a OD 490 nm para analizar el color de cada pocillo de la placa.

3. Actividades de mAbs in vivo

Se sometio a prueba la capacidad de anticuerpos de inhibir el crecimiento de tumores in vivo en dos modelos: el modelo de cancer pulmonar humano de celulas no pequenas A549 y el modelo de cancer ovarico A2780 utilizando los protocolos y condiciones descritas en la Seccion 6.1. El tratamiento se inicio al dfa siguiente de la inoculacion del tumor. El Ab de control de IgG (y el control de PBS) asf como el mAb de uPAR anti-D2D3 ATN-658 se administraron por via intraperitoneal a 10 mg/kg dos veces por semana el lunes y el viernes.

4. Identificacion de epftopos ATN-658

Cada uno de los residuos de mono verde no homologos fue cambiado al correspondiente residuo humano, es decir, el aminoacido 125 fue cambiado de M a V; el aminoacido 192 fue cambiado de H a R, etc.). Todos los numeros de aminoacidos hacen referencia a la forma procesada madura de uPAR humano, es decir, despues de eliminar el peptido senal de aminoacido 22. Los efectos de estos cambios fueron evaluados para ver la capacidad de ATN-658 de inmunoprecipitar el suPAR de mono mutado despues de expresion transiente en celulas s2. La unica mutacion que restauro la union fue cuando el aminoacido 268 fue mutado de E a K (ver Figura 5B). Dado que mutar los aminoacidos 262 y 264 no tuvo efecto sobre la union de ATN-658 a uPAR de mono, el extremo N del epftopo fue definido como aminoacido 265. La mutagenesis de exploracion con alanina de uPAR humano empezando en aminoacido 267 identifico aminoacidos 268 (K) a 277 (D) como parte del epftopo (ver Figura 6). Ver, Vajdos et al., 2002, J Mol Biol. 320(2):415-28; Nisihara et al., 2001, J Immunol. 167(6):3266-75; and Zhang et al., 1999, Int Immunol. 11 (12):1935-44. Mutar aminoacidos 268 (K), 273 (H), 275 (D), or 277 (D) en Ala en uPAR humano tuvo como resultado la union reducida de ATN-658 al uPAR humano mutado como se demuestra en ensayos de co- inmunoprecipitacion. Aunque el epftopo parece estar contiguo, puede ser un epftopo dependiente de conformacion ya que la reduccion destruye la capacidad de uPAR de ser reconocido por aTN-658. Probablemente es debido al hecho de que hay un enlace disulfuro dentro del epftopo (Cys266-Cys271) que parece estabilizar el epftopo. La secuencia del epftopo se establece a continuacion.

C C T K S G C N H P D L D V Q Y R S G (SEQ ID NO: 9)

Esta secuencia representa aminoacidos 265-283 de la secuencia uPAR humano maduro. El epftopo se puede detener en Q279 dado que los aminoacidos 280-283 parecen ser flexibles y no son visibles en la estructura de cristal.

Una secuencia adicional que comprende aminoacidos 98-114 de uPAR maduro fue identificada utilizando espectrometrfa de masas por intercambio de deuterio. Ver Hamuro et al., 2006, Protein Sci. 15(8): 1883-92; Baerga- Ortiz et al., 2002, Protein Sci. 11(6):1300-8. La secuencia del epftopo se establece a continuacion:

C G S S D M S C E R G R H Q S L Q (SEQ ID NO: 14)

Este metodo mide el intercambio de deuterio de una protefna en presencia y ausencia de un anticuerpo. La union de un anticuerpo a un epftopo en una protefna disminuye la capacidad de ese epftopo de intercambiar deuterio y una comparacion de digestas proteolfticas de una protefna que experimenta intercambio de deuterio en presencia o ausencia de anticuerpo utilizando espectrometrfa de masas localiza el epftopo que esta unido, al detectar el intercambio de deuterio reducido en el epftopo (ver Figura 7A). Por lo tanto, el intercambio de deuterio de suPAR D2D3 fue analizado por espectrometrfa de masas en presencia y ausencia de ATN-658. Las Figuras 7B y 7C presentan los resultados obtenidos de dos experimentos independientes de intercambio de deuterio. En las Figuras 7B y 7C se muestra el nivel de deuteracion detectado en cada residuo aminoacido de suPAR D2D3 en presencia y ausencia de ATN-658. Tambien se muestra la diferencia en los niveles de deuteracion detectado en cada residuo aminoacido de suPAR D2D3 en presencia y ausencia de ATN-658. Se identificaron dos secuencias de epftopos que tuvieron el grado mas elevado de proteccion en presencia de ATN-658: una region que abarca aminoacidos 268-277 (SEQ ID NO: 16) (que esta incluida en el epftopo identificado utilizando mutagenesis dirigida a un sitio) y una segunda region que abarca aminoacidos 98-114 (SEQ ID NO: 14) (ver Figuras 7B y 7C). En particular, la region que abarca aminoacidos 268-277 (SEQ ID NO: 16) posefa las mayores diferencias en el nivel de deuteracion en presencia y ausencia de ATN-658 con relacion al resto de regiones de suPAR D2D3.

5. Ensayo para anticuerpos que reconocen el mismo epftopo que ATN-658 utilizando ATN-658 biotilinado

El anticuerpo anti-D2D3, ATN-658, es biotinilado utilizando EZ-linkTM sulfo-NHS-LC-biotin (Pierce Biotechnology Inc.) segun instrucciones del fabricante. Normalmente, un exceso molar de 20 veces el reactivo que etiqueta la biotina se utiliza para etiquetar ATN-658 y la biotina no incorporada se retira del Ab etiquetado utilizando una columna de exclusion por tamano. Para garantizar que el anticuerpo etiquetado retuvo su afinidad a uPAR, se somete a prueba Biotina-ATN-658 en ensayo ELISA para union a suPAR. Se detecta Biotina-ATN-658 unida utilizando estreptavidina conjugada-HRP. Se realiza un ensayo de competicion para identificar anticuerpos que

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reconozcan el mismo epltopo como ATN-658. En resumen, placas con elevada union a protelnas EIA/RIA de 96 pocillos se recubren con 100 ng/pocillo de suPAR durante la noche a 4° C. Despues del bloqueo de union no especlfica con caselna al 1%, se lavan las placas con PBS y los anticuerpos a someter a prueba, diluidos en PBS/caselna al 0.1% conteniendo 0,2 nM de Biotina-ATN-658, se anaden a los pocillos apropiados. Se incuban las placas durante otra hora mas a temperatura ambiente, se lavan a fondo con PBS/0.05% Tween-20 y se detecta la Biotina-ATN-658 unida utilizando estreptavidina conjugada-HRP y el sustrato apropiado.

Los expertos en la materia reconoceran, o sera capaces de averiguar no utilizando mas que experimentacion rutinaria, muchos equivalentes de los modos de realization especlficos de la invention descritos aqul. Se pretende que tales equivalentes esten incluidos en las siguientes reivindicaciones.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Attenuon, LLC

<120> EPITOPO RECEPTOR DEL ACTIVADOR DEL PLASMINOGENO TIPO UROQUINASA, ANTICUERPOS MONOCLONALES DERIVADOS DEL MISMO Y METODOS DE USO

<130> 9715-051-228

<140>

<141>

<150> 60/873,627 <151 > 2006-12-08 <150> 60/930,034 <151 > 2007-05-11 <160> 16

<170> FastSEQ Windows 4.0

<210> 1 <211> 141 <212> PRT <213> raton

<220>

<223> region variable de cadena ligera de anticuerpo ATN-658 <400> 1

Asp Val Val Met Thr Gin Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr lie Gly

10

15

Gin Pro Ala Ser lie Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Asp Ser

20

25

30

Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gin Arg Pro Gly Gin Ser

35

40

45

Pro Lys Arg Leu lie Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro

50

55

60

Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys He

65

70

75

80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gin Gly

85

90

95

Thr His Phe Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100

105

110

Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser lie Phe Pro Pro Ser Ser Glu

115

120

125

Gin Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu

130

135

140

<210> 2 <211> 141 <212> PRT

5

10

15

20

25

30

35

40

45

<213> raton

<220>

<223> region variable de cadena pesada de anticuerpo ATN-658 <400> 2

Glu

val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Thr Gly Ala

1

5 10 15

Ser

Val Lys lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr

Met His Trp val Lys Gin Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp lie

35 40 45

Gly

Glu lie Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Ala Ser Tyr Asn Gin Lys lie

50 55 60

Lys

Gly Arg Ala Thr Phe Thr Val Asp Thr Ser Ser Arg Thr Ala Tyr

65

70 75 80

Met

Gin Phe Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala

Arg Ser lie Tyr Gly His Ser Val Leu Asp Tyr Trp Gly Gin Gly

100 105 110

Thr

Ser Val Ser Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr

115 120 125

Pro

Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gin Thr Asn Ser Met

130 135 140

<210>3 <211> 16 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> CDR L1 of ATN-658 <400> 3

Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn 15 10 15

<210>4 <211>7 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> CDR L2 de ATN-658 <400> 4

Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser 1 5

<210>5 <211>9 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> CDR L3 de ATN-658 <400> 5

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Trp Gin Gly Thr His Phe Pro Leu Thr 1 5

<210>6 <211> 10 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> CDR H1 of ATN-658 <400> 6

Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Tyr Met His 15 10

<210>7 <211> 17 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> CDR H2 of ATN-658 <400> 7

Glu lie Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Ala Ser Tyr Asn Gin Lys lie Lys 15 10 15

Gly

<210> 8 <211> 10 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> CDR H3 de ATN-658 <400> 8

Ser lie Tyr Gly His Ser Val Leu Asp Tyr 15 10

<210>9 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens

<220>

<223> aminoacido 265-283 de uPAR humano <400> 9

Cys Cys Thr Lys Ser Gly Cys Asn His Pro Asp Leu Asp Val Gin Tyr 1 5 10 15

Pro Ser Gly

<210> 10 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens

<220>

<223> aminoacido 265-282 de uPAR humano <400> 10

5

10

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20

25

30

35

40

45

50

55

60

Cys Cys Thr Lys Ser Gly Cys Asn His Pro Asp Leu Asp Val Gin Tyr 15 10 15

Pro Ser

<210> 11 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens

<220>

<223> aminoacido 265-281 de uPAR humano

<400> 11

Cys Cys Thr Lys Ser Gly Cys Asn His Pro Asp Leu Asp Val Gin Tyr 15 10 15

Pro

<210> 12 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens

<220>

<223> aminoacido 265-280 de uPAR humano <400> 12

Cys Cys Thr Lys Ser Gly Cys Asn His Pro Asp Leu Asp Val Gin Tyr 15 10 15

<210> 13 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens

<220>

<223> aminoacido 265-279 de uPAR humano

<400> 13

Cys Cys Thr Lys Ser Gly Cys Asn His Pro Asp Leu Asp Val Gin 1 5 10 15

<210> 14 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens

<220>

<223> aminoacido 98-114 de uPAR humano <400> 14

Cys Gly Ser Ser Asp Met Ser Cys Glu Arg Gly Arg His Gin Ser Leu 15 10 15

<210> 15 <211> 335 <212> PRT <213> Homo sapiens

<220>

<223> uPAR humano (GenBank accession No. Q03405)

<400> 15

Met

Gly His Pro Pro Leu Leu Pro Leu Leu Leu Leu Leu His Thr Cys

1

5 10 15

Val

Pro Ala Ser Trp Gly Leu Arg Cys Met Gin Cys Lys Thr Asn Gly

20 25 30

Asp

Cys Arg Val Glu Glu Cys Ala Leu Gly Gin Asp Leu Cys Arg Thr

35 40 45

Thr

He Val Arg Leu Trp Glu Glu Gly Glu Glu Leu Glu Leu Val Glu

50 55 60

Lys

Ser Cys Thr His Ser Glu Lys Thr Asn Arg Thr Leu Ser Tyr Arg

65

70 75 80

Thr

Gly Leu Lys lie Thr Ser Leu Thr Glu Val Val Cys Gly Leu Asp

85 90 95

Leu

Cys Asn Gin Gly Asn Ser Gly Arg Ala Val Thr Tyr Ser Arg Ser

100 105 110

Arg

Tyr Leu Glu Cys lie Ser Cys Gly Ser Ser Asp Met Ser Cys Glu

115 120 125

Arg

Gly Arg His Gin Ser Leu Gin Cys Arg Ser Pro Glu Glu Gin Cys

130 135 140

Leu

Asp Val Val Thr His Trp lie Gin Glu Gly Glu Glu Gly Arg Pro

145

150 155 160

Lys

ASp Asp Arg His Leu Arg Gly Cys Gly Tyr Leu Pro Gly Cys Pro

165 170 175

Gly

Ser Asn Gly Phe His Asn Asn Asp Thr Phe His Phe Leu Lys Cys

180 IBS 190

Cys

Asn Thr Thr Lys Cys Asn Glu Gly Pro lie Leu Glu Leu Glu Asn

195 200 205

Leu

Pro Gin Asn Gly Arg Gin Cys Tyr Ser Cys Lys Gly Asn Ser Thr

210 215 220

His

Gly Cys Ser Ser Glu Glu Thr Phe Leu He Asp Cys Arg Gly Pro

225

230 235 240

Met

Asn Gin Cys Leu Val Ala Thr Gly Thr His Glu Pro Lys Asn Gin

245 250 255

Ser

Tyr Met Val Arg Gly Cys Ala Thr Ala Ser Met Cys Gin His Ala

260 265 270

His

Leu Gly Asp Ala Phe Ser Met Asn His He Asp Val Ser Cys Cys

275 280 285

Thr

Lys Ser Gly Cys Asn His Pro Asp Leu Asp Val Gin Tyr Arg Ser

290 295 300

Gly

Ala Ala Pro Gin Pro Gly Pro Ala His Leu Ser Leu Thr He Thr

305

310 315 320

Leu

Leu

Met Thr Ala Arg Leu Trp Gly Gly Thr Leu Leu Trp Thr

325 330 335

<210> 16 5 <211> 10

<212> PRT <213> Homo sapiens

<220>

10 <223> aminoacido 268-277 de uPAR humano

<400> 16

Lys Ser Gly Cys Asn His Pro Asp Leu Asp 15 10

15

Claims (7)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   REIVINDICACIONES

   1. Peptido aislado de hasta 40 aminoacidos que comprende la secuencia de aminoacidos CCTKSGCNHPDLDVQYRSG, CCTKSGCNHPDLDVQYRS, CCTKSGCNHPDLDVQYR, CCTKSGCNHPDLDVQY o CCTKSGCNHPDLDVQ, donde el segundo y el tercer residuo de cistefna de la secuencia son disulfuros unidos entre si formando un enlace disulfuro.
2. 2. Peptido aislado, segun la reivindicacion 1, que consiste en la secuencia de aminoacidos CCTKSGCNHPDLDVQYRSG, CCTKSGCNHPDLDVQYRS, CCTKSGCNHPDLDVQYR, CCTKSGCNHPDLDVQY or CCTKSGCNHPDLDVQ.
3. 3. Peptido aislado, segun la reivindicacion 1, que consiste en un fragmento de uPAR humano como se muestra en la Figura 1.
4. 4. Peptido aislado, segun la reivindicacion 1 o 3, donde dicho peptido tiene una longitud de hasta 30 aminoacidos.
5. 5. Peptido aislado, segun la reivindicacion 4, donde dicho peptido tiene una longitud de hasta 20 aminoacidos.
6. 6. Peptido aislado, segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3-5, cuya secuencia:

   (i) consiste en un fragmento de uPAR humano en el que Cys 265 es el amino terminal del peptido; y

   (ii) comprende la secuencia de aminoacidos CCTKSGCNHPDLDVQYRS, CCTKSGCNHpDlDVQYR, CCTKSGCNHPDLDVQY, o CCTKSGCNHPDLDVQ.
7. 7. Metodo para producir un anticuerpo, que comprende:

   (i) inmunizar a un mamffero no humano con un inmunogeno que comprende un peptido segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6;

   (ii) aislar esplenocitos de dicho mamffero;

   (iii) fusionar dichos esplenocitos a celulas de mieloma; y

   (iv) seleccionar un hibridoma que secreta un anticuerpo que se une a dicho peptido.