ES2692657T3

ES2692657T3 - Proteínas de enlace al antígeno del receptor de oncastatina

Info

Publication number: ES2692657T3
Application number: ES14734671.2T
Authority: ES
Inventors: Heather A. Arnett; Sabine S. Escobar; Chadwick T. King; Ai Ching Lim; Saravanakumar NARAYANAN; Paul H. Weinreb; Nels E. Pederson
Original assignee: Kiniksa Phamaceuticals Ltd
Current assignee: Kiniksa Phamaceuticals Ltd
Priority date: 2013-05-30
Filing date: 2014-05-30
Publication date: 2018-12-04
Anticipated expiration: 2034-05-30
Also published as: SI3456743T1; JP2020022482A; AU2014273966A1; JP6606122B2; PL3456743T3; EP3004167A2; KR102652165B1; HK1221961A1; SG11201508829QA; US9738721B1; EA201592285A1; NZ713636A; PT3456743T; KR20160011644A; CA2910732A1; HK1249522A1; JP6243521B2; BR112015029643B1; US20180002429A1; HUE040548T2

Abstract

Una proteína de unión al antígeno del receptor de oncostatina M (OSMR), en la que la proteína de unión al antígeno es un anticuerpo, en el que el anticuerpo comprende: un dominio variable de cadena ligera que comprende una región 1 determinante de complementariedad de cadena ligera (LCDR1) que tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO:31; una región 2 determinante de complementariedad de cadena ligera (LCDR2) que tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO:34; y una región 3 determinante de complementariedad de cadena ligera (LCDR3) que tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO:37; y un dominio variable de cadena pesada que comprende una región 1 determinante de complementariedad de cadena pesada (HCDR1) que tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO:13; una región 2 determinante de complementariedad de cadena pesada (HCDR2) que tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO:16; y una región 3 determinante de la complementariedad de la cadena pesada (HCDR3) que tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO:19, en donde el anticuerpo inhibe la unión de la oncostatina humana M (OSM) y la interleuquina 31 humana a la OSMR humana, y en donde el anticuerpo reduce la señalización de OSMR mediada por OSM y mediada por interleuquina humana en células humanas que expresan OSMR.

Description

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DESCRIPCION

Protemas de enlace al antigeno del receptor de oncastatina ANTECEDENTES DE LA INVENCION

[0001] La oncostatina M (OSM) y la interleucina-31 (IL-31) son miembros de la superfamilia IL-6 y comparten una subunidad de receptor, oncostatina M receptor-p (OsMr) (Dillon et al., Nat. Immunol. 5 (7): 752-60, 2004). Todos los miembros de esta familia, excepto IL-31, comparten la cadena comun de la glucoprotema 130 (gp130) en sus complejos de receptores multimericos. Las senales de OSM a traves de un complejo de receptor heterodimerico que contiene OSMR y gp130, mientras que IL-31 utiliza un receptor similar a gp130, IL-31R, en combinacion con OsMr (Dillon et al., Supra; Dreuw et al., J. Biol. Chem. 279 (34): 36l12-20, 2004). En general, OSMR y gp130 se expresan de manera bastante ubicua a traves de tejidos y tipos de celulas, y pueden inducirse bajo una variedad de condiciones de estimulacion. La expresion de IL-31R parece ser relativamente mas restringida y estrictamente regulada. En humanos y ratones por igual, la expresion del ARNm de IL-31R es detectable en niveles bajos en tejidos como la traquea, el musculo esqueletico, el timo y la medula osea (Dillon et al., Supra). Aunque el nivel de expresion es totalmente diferente, tanto la IL-31R como la OSMR se expresan conjuntamente en una multitud de tejidos, incluidas las celulas epiteliales intestinales y de la piel, lo que sugiere que esos tejidos deben responder a la IL-31 (Dillon et al., Supra; Dambacher et al., Gut 56 (9): 1257-65, 2007). Mientras que la OSMR se expresa constitutivamente en el pulmon en las celulas epiteliales, la expresion de IL-31R es insignificante a niveles bajos en el tejido pulmonar, pero esta regulada al alza en varios metodos de estimulacion de las vfas respiratorias (Dillon et al., Supra; Jawa et al., J. Interferon Cytokine Res. 28 (4): 207-19, 2008).

[0002] Secretados principalmente por linfocitos T, macrofagos y neutrofilos, OSM e IL-31 estan ambos regulados al alza en una variedad de estados de enfermedad que involucran inflamacion. La OSM se ha implicado en diversas funciones biologicas, incluida la formacion de huesos, la degradacion del cartflago, la captacion de colesterol, el dolor y la inflamacion (Cawston y otros, Arthritis Rheum. 41 (10): 1760-71, 1998; Hasegawa y otros, Rheumatology (Oxford) 38 (7): 612-7, 1999; Levy et al., J. Hepatol. 32 (2): 218-26, 2000; Manicourt et al., Arthritis. Rheum. 43 (2): 281-8, 2000; de Hooge y otros, Am J. Pathol. 160 (5): 1733-43, 2002; Luzina y otros, Arthritis Rheum 48 (8): 226274, 2003; Morikawa y otros, J. Neurosci. 24 (8): 1941-7, 2004; Kong et al., J. Lipid Res. 46 (6): 1163-71, 2005). Se ha demostrado que la OSM es un potente modulador de la matriz extracelular (ECM) en una variedad de contextos, lo que sugiere que la OSM puede mediar consecuencias patologicas aparentemente opuestas, incluida la fibrosis (un exceso de ECM) y la degradacion del cartflago (una degradacion de la ECM). Segun el tipo de tejido y el medio ambiente, estos dos efectos se observaron cuando la OSM se sobreexpreso o se administro exogenamente en pulmones o articulaciones de ratones, respectivamente (Richards et al., Biochem. Soc. Trans. 30 (2): 107- 11, 2002; Hui et al., Arthritis Rheum. 48 (12): 3404-18, 2003; Rowan et al., Am. J. Pathol. 162 (6): 1975-84, 2003). Ademas, anteriormente se ha demostrado que la OSM esta regulada al alza en las patologfas humanas donde existen este tipo de consecuencias (Cawston y otros, supra; Haseguerta y otros, supra; Levy y otros, supra; Manicourt y otros, supra Luzina et al., Supra). Predominantemente, una citoquina de accion local, oSm se regula al alza en el lfquido sinovial de las articulaciones de pacientes con artritis reumatoide (AR) (Cawston et al., Supra; Manicourt et al., Supra), en el lavado broncoalevolar (BAL) de pacientes con esclerodermia asociada a enfermedad pulmonar intersticial (Luzina et al., supra), fibrosis pulmonar idiopatica (FPI) y en los tugados de pacientes con cirrosis (Levy et al., supra). El impacto propuesto en la ECM por la OSM se puede atribuir en parte a la capacidad de la OSM para cambiar el equilibrio entre las metaloproteinasas de matriz (MMP) y los inhibidores tisulares de las MMP (TIMP). Los TIMP se unen a las MMP en una proporcion de 1:1 con una afinidad alta que resulta en una perdida de la actividad proteolttica de la MMP. TIMP-1 y TIMP-3 han demostrado previamente estar regulados diferencialmente por OSM, lo que resulta en un aumento en TIMP-1 y una disminucion en TIMP-3 (Gatsios et al., Eur. J. Biochem. 241 (1): 56-63, 1996). Ademas de regular la digestion de los componentes de la matriz extracelular, las MMP tambien estan implicadas en la escision y posterior activacion de varias protemas, incluido el TGF-p, una potente citoquina pro- fibrotica (Leask et al., FaSeB J. 18). 7): 816-27, 2004). Tambien se ha informado que OSM es capaz de inducir directamente la transcripcion de colageno tipo I in vitro (Hasegawa et al., J. Rheumatol. 25 (2): 308-13, 1998).

[0003] La expresion de tanto OSM como IL-31 se ha encontrado en la piel de pacientes con psoriasis y dermatitis atopica, y las mutaciones en OSMR y IL-31R se han relacionado con amiloidosis cutanea sistemica. La sobreexpresion transgenica de IL-31 en todo el sistema indujo una respuesta inflamatoria pruntica en la piel de ratones. Tanto OSM como IL-31 senalan a traves de OSMR en las neuronas, donde se les ha sugerido que promuevan respuestas nociceptivas y prunticas.

[0004] En conjunto, estos enlaces a enfermedades humanas y la capacidad de OSM e IL-31 para promover una amplia gama de patologfas, que incluyen al menos inflamacion, remodelacion de la matriz extracelular, dolor y prurito, sugieren que el bloqueo de OsMr es un objetivo util para intervencion terapeutica en muchas enfermedades y trastornos asociados a la OSMR. El documento US2006171951 describe anticuerpos contra el receptor de oncostatina M.

Diveu et al. 2004, Eur. Cytokine Netw., 15 (4): 291-302 describe que la expresion predominante de la isoforma larga del receptor tipo GP130 (GPL) es necesaria para la senalizacion de interleucina-31.

Jalal et al. 2010, J Interferon Cytokine Res., 30 (12): 865-73 describe el papel de la gp130 en la patogenesis de

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enfermedades inflamatorias y otras en las que esta implicado el receptor gp130.

Repovic et al. 2003, Oncogene., 22 (50): 8117-24 describe la induccion de oncostatina-M de la expresion del factor de crecimiento endotelial vascular en celulas de astroglioma.

Rudikoff et al. 1982, Proc Natl Acad Sci EE.UU., 79(6): 1979-83 describe que las sustituciones de aminoacidos individuales pueden alterar la especificidad de union a antigeno.

Panka et al., PNAS. 1988, 85 (9): 3080-3084 describe que las diferencias en el marco de la region variable pueden dar como resultado una afinidad disminuida o incrementada de los anticuerpos anti-digoxina variantes.

SUMARIO DE LA INVENCION

[0005] La presente invencion proporciona una protema de union a antigeno de receptor de oncostatina M (OSMR), en donde la protema de union a antigeno es un anticuerpo, en el que el anticuerpo comprende:

un dominio variable de cadena ligera que comprende una region 1 determinante de complementariedad de cadena ligera (LCDR1) que tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO:31; una region 2 determinante de complementariedad de cadena ligera (LCDR2) que tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO:34; y una region 3 determinante de complementariedad de cadena ligera (LCDR3) que tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO:37; y

un dominio variable de cadena pesada que comprende una region 1 determinante de complementariedad de cadena pesada (HCDR1) que tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO:13; una region 2 determinante de complementariedad de cadena pesada (HCDR2) que tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO:16; y una region 3 determinante de la complementariedad de la cadena pesada (HCDR3) que tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO:19, en donde el anticuerpo inhibe la union de la oncostatina M humana (OSM) y la interleuquina 31 humana a la OSMR humana, y en donde el anticuerpo reduce la Senalizacion de OSMR mediada por oSm e interleuquina humana 31 en celulas humanas que expresan OSMR.

[0006] La presente invencion tambien proporciona una composicion farmaceutica que comprende el anticuerpo de la invencion.

[0007] La presente invencion tambien proporciona un acido nucleico aislado que codifica el anticuerpo de la invencion.

[0008] La invencion tambien proporciona un vector de expresion que comprende el acido nucleico aislado de la invencion.

[0009] La invencion tambien proporciona una celula huesped recombinante que comprende el acido nucleico aislado de la invencion.

[0010] La presente invencion tambien proporciona un metodo para hacer un anticuerpo que se une al receptor de oncostatina M (OSMR), comprendiendo el metodo:

a) cultivar la celula huesped recombinante de la invencion; y

b) aislar el anticuerpo de dicho cultivo.

[0011] La presente divulgacion proporciona protemas de union al antfgeno anti-OSMR, por ejemplo, anticuerpos y fragmentos funcionales de los mismos, que tienen propiedades susceptibles a la produccion comercial y el uso terapeutico en seres humanos. Las protemas de union al antfgeno anti-OSMR son utiles en los metodos de tratamiento de enfermedades y trastornos asociados con OSMR y, en particular, los asociados con la union de OSM o IL-31 a OSMR. En este documento se proporcionan los anticuerpos de union a OSMR que se unen a OSMR con alta afinidad y bloquean de manera efectiva la union de OSM y/o IL-31 a OSMR, reduciendo asf la senalizacion mediada por OSMR en la celula.

[0012] La presente descripcion tambien proporciona una protema de union a antfgeno OSMR que comprende a) un dominio variable de cadena ligera que tiene al menos 90% de identidad, al menos 95% de identidad, o es identica a la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, o SEQ ID NO:29; b) un dominio variable de cadena pesada que tiene al menos 90% de identidad, al menos 95% de identidad, o es identica a la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, o SEQ ID NO:11; o c) el dominio variable de la cadena ligera de a) y el dominio variable de la cadena pesada de b).

[0013] Las protemas de union a antfgeno preferidas de la divulgacion incluyen las que comprenden un dominio variable de cadena ligera que tiene al menos 90%, al menos 95%, o es identica a la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID NO:27 y un dominio de variable de cadena pesada que tiene al menos el 90%, al menos el 95%, o es identica a las secuencias de aminoacidos expuestas en la SEQ ID NO:9; aquellas que comprenden un dominio variable de cadena ligera que tiene al menos un 90%, al menos un 95%, o es identica a la secuencia de

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aminoacidos expuesta en la SEQ ID NO:28 y un dominio variable de cadena pesada que tiene al menos un 90%, al menos un 95%, o es identica a la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID NO:10; y aquellas que comprenden un dominio variable de cadena ligera que tiene al menos 90%, al menos 95%, o es identica a la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID NO:29 y un dominio variable de cadena pesada que tiene al menos 90%, al menos 95%, o es identica a la secuencia de aminoacidos establecida en la SEQ ID NO:11. Las protemas de union al antigeno OSMR que comprenden un dominio variable de cadena pesada que tiene una relacion de secuencia definida anteriormente con la SEQ ID NO:9 pueden contener opcionalmente un aminoacido distinto de asparagina (por ejemplo, acido aspartico) en la posicion correspondiente a la posicion 73 en la SEQ ID NO:9. En tales realizaciones, el dominio variable de cadena pesada comprende opcionalmente la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID NO:53.

Las protemas de union al antigeno OSMR que comprenden un dominio variable de cadena pesada que tiene una relacion de secuencia definida anteriormente con la SEQ ID NO:10 pueden contener opcionalmente un aminoacido distinto de asparagina (por ejemplo, acido aspartico) en la posicion correspondiente a la posicion 73 en la SEQ ID NO:10. En tales realizaciones, el dominio variable de cadena pesada comprende opcionalmente la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID NO:54.

[0014] La presente descripcion tambien proporciona una protema de union a antigeno OSMR que comprende a) un dominio variable de cadena ligera que tiene no mas de diez o no mas de cinco aminoacidos adiciones, eliminaciones o sustituciones de la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, o SEQ ID NO:29; b) un dominio variable de cadena pesada que tiene no mas de diez o no mas de cinco adiciones, eliminaciones o sustituciones de aminoacidos de la secuencia de aminoacidos establecida en la SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, o SEQ ID NO: 11; o c) el dominio variable de la cadena ligera de a) y el dominio variable de la cadena pesada de b).

[0015] Las protemas de union a antigeno preferidas de la divulgacion incluyen las que comprenden un dominio variable de cadena ligera que tiene no mas de diez o no mas de cinco adiciones, eliminaciones o sustituciones de aminoacidos de la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID NO:27 y un dominio variable de cadena pesada que tiene no mas de diez o no mas de cinco adiciones, eliminaciones o sustituciones de aminoacidos de la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID NO:9; aquellas que comprenden un dominio variable de cadena ligera que tiene no mas de diez o no mas de cinco adiciones, eliminaciones o sustituciones de aminoacidos de la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID NO:28 y un dominio variable de cadena pesada que no tiene mas de diez o ningun mas de cinco adiciones, eliminaciones o sustituciones de aminoacidos de la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID NO:10; y aquellos que comprenden un dominio variable de cadena ligera que tiene no mas de diez o no mas de cinco adiciones, eliminaciones o sustituciones de aminoacidos de la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID NO:29 y un dominio variable de cadena pesada que no tiene mas de diez o no mas de cinco adiciones, eliminaciones o sustituciones de aminoacidos de la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID NO:11.

Las protemas de union al antfgeno OSMR que comprenden un dominio variable de cadena pesada que tiene una relacion de secuencia definida anteriormente con la SEQ ID NO:9 pueden contener opcionalmente un aminoacido distinto de asparagina (por ejemplo, acido aspartico) en la posicion correspondiente a la posicion 73 en la SEQ ID NO:9. En tales realizaciones, el dominio variable de cadena pesada comprende opcionalmente la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID NO:53.

Las protemas de union al antfgeno OSMR que comprenden un dominio variable de cadena pesada que tiene una relacion de secuencia definida anteriormente con la SEQ ID NO:10 pueden contener opcionalmente un aminoacido distinto de asparagina (por ejemplo, acido aspartico) en la posicion correspondiente a la posicion 73 en la SEQ ID NO:10. En tales realizaciones, el dominio variable de cadena pesada comprende opcionalmente la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID NO:54.

[0016] La presente descripcion tambien proporciona una protema de union a antfgeno OSMR que contiene un dominio variable de cadena ligera que comprende a) un LCDRI que no tiene mas de tres adiciones, eliminaciones o sustituciones de aminoacidos de la secuencia LCDR1 expuesta en la SEQ ID NO:30; un LCDR2 que no tiene mas de tres adiciones, eliminaciones o sustituciones de aminoacidos de la secuencia de LCDR2 expuesta en la SEQ ID NO:33; y un LCDR3 que no tiene mas de tres adiciones, eliminaciones o sustituciones de aminoacidos de la secuencia LCDR3 expuesta en la SEQ ID NO:36; b) un LCDR1 que no tiene mas de tres adiciones, eliminaciones o sustituciones de aminoacidos de la secuencia LCDR1 expuesta en la SEQ ID NO:31; un LCDR2 que no tiene mas de tres adiciones, eliminaciones o sustituciones de aminoacidos de la secuencia LCDR2 expuesta en la SEQ ID NO:34; y un LCDR3 que no tiene mas de tres adiciones, eliminaciones o sustituciones de aminoacidos de la secuencia de LCDR3 expuesta en la SEQ ID NO:37; o c) un LCDR1 que no tiene mas de tres adiciones, eliminaciones o sustituciones de aminoacidos de la secuencia LCDR1 expuesta en la SEQ ID NO:32; un LCDR2 que no tiene mas de tres adiciones, eliminaciones o sustituciones de aminoacidos de la secuencia LCDR2 expuesta en la SEQ ID NO:35; y un LCDR3 que no tiene mas de tres adiciones, eliminaciones o sustituciones de aminoacidos de la secuencia LCDR3 expuesta en la SEQ ID NO:38; y un dominio variable de cadena pesada que comprende d) un HCDR1 que no tiene mas de tres adiciones, eliminaciones o sustituciones de aminoacidos de la secuencia HCDR1 expuesta en la SEQ ID NO:12; un HCDR2 que no tiene mas de tres adiciones, eliminaciones o sustituciones de aminoacidos de la secuencia HCDR2 expuesta en la SEQ ID NO:15; y un HCDR3 que no tiene mas de tres adiciones, eliminaciones o sustituciones de aminoacidos de la secuencia HCDR3 expuesta en la SEQ ID NO:18; e) un HCDR1 que no tiene mas de tres adiciones, eliminaciones o sustituciones de aminoacidos de la secuencia

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HCDR1 expuesta en la SEQ ID NO:13; un HCDR2 que no tiene mas de tres adiciones, eliminaciones o sustituciones de aminoacidos de la secuencia HCDR2 expuesta en la SEQ ID NO:16; y un HCDR3 que no tiene mas de tres adiciones, eliminaciones o sustituciones de aminoacidos de la secuencia HCDR3 expuesta en la SEQ ID NO:19; o f) un HCDR1 que no tiene mas de tres adiciones, eliminaciones o sustituciones de aminoacidos de la secuencia HCDR1 expuesta en la SEQ ID NO:14; un HCDR2 que no tiene mas de tres adiciones, eliminaciones o sustituciones de aminoacidos de la secuencia HCDR2 expuesta en la SEQ ID NO:17; y un HCDR3 que no tiene mas de tres adiciones, eliminaciones o sustituciones de aminoacidos de la secuencia HCDR3 expuesta en la SEQ ID NO:20.

[0017] Protemas de union a antigeno de OSMR preferidas de la descripcion anteriormente mencionada incluyen las que comprenden la cadena ligera del dominio variable de a) y la cadena pesada del dominio variable de d); aquellas que comprenden el dominio variable de cadena ligera de b) y el dominio variable de cadena pesada de e); y aquellas que comprenden el dominio variable de la cadena ligera de c) y el dominio variable de la cadena pesada de f).

Las protemas de union al antigeno OSMR que comprenden el dominio variable de la cadena ligera de a) y el dominio variable de la cadena pesada de d) pueden opcionalmente contener un dominio variable de la cadena pesada que comprende un aminoacido distinto de la asparagina (por ejemplo, acido aspartico) en la posicion correspondiente a posicion 73 en SEQ ID NO:9. En tales realizaciones, el dominio variable de cadena pesada comprende opcionalmente la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID NO:53.

Protemas de union al antigeno OSMR que comprenden el dominio variable de la cadena ligera de b) y el dominio variable de la cadena pesada de e) puede contener opcionalmente un dominio variable de cadena pesada que comprende un aminoacido distinto de asparagina (por ejemplo, acido aspartico) en la posicion correspondiente a la posicion 73 en la SEQ ID NO:10. En tales realizaciones, el dominio variable de cadena pesada comprende opcionalmente la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID NO:54.

[0018] La protema de union a antfgeno OSMR de la presente descripcion se une a OSMR humana con una afinidad de menor o igual que 1 x 10-10 M.

[0019] La protema de union a antfgeno OSMR de la presente invencion inhibe la union de la OSM humana a OSMR humana e/o IL-31 humana a OSMR humana.

[0020] La protema de union a antfgeno OSMR de la presente invencion reduce senalizacion OSMR humana mediada por OSM y/o mediada por IL-31 humana en las celulas que expresan OSMR humana.

[0021] La protema de union a antfgeno OSMR de la presente descripcion reduce senalizacion OSMR mediada por mono cynomolgus OSM y/o mediada por IL-31 en celulas que expresan mono cynomolgus OSMR.

[0022] La protema de union a antfgeno OSMR de la presente invencion de union es un anticuerpo, tal como un anticuerpo humano. Los anticuerpos preferidos de la divulgacion incluyen aquellos anticuerpos que comprenden una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID NO:24 y una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID NO:6; aquellos que comprenden una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID: 25 y una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID NO:7; y aquellos que comprenden una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID: 26 y una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID NO:8.

Los anticuerpos adicionales incluyen aquellos anticuerpos que comprenden una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID nO:24 y una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID NO:50; aquellos que comprenden una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID: 25 y una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID NO:51; y aquellos que comprenden una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID: 26 y una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID NO:52.

[0023] La presente descripcion proporciona acidos nucleicos o acidos nucleicos aislados que codifican uno o mas componentes de polipeptido de una protema de union a antfgeno OSMR, por ejemplo, una cadena ligera de anticuerpo o una cadena pesada de anticuerpo. En realizaciones preferidas, el acido nucleico codifica un polipeptido que comprende:

a) un dominio variable de cadena ligera que tiene al menos un 95% de identidad con la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID NO:27, la SEQ ID NO:28 o la SEQ ID NO:29;

b) un dominio variable de cadena pesada que tiene al menos un 95% de identidad con la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID No:9, la SEQ ID NO:10, o la SEQ ID NO:11;

c) un dominio variable de cadena ligera que tiene no mas de cinco adiciones, eliminaciones o sustituciones de aminoacidos de la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID NO:27, la SEQ ID NO:28 o la SEQ ID NO:29;

d) un dominio variable de cadena pesada que no tiene mas de cinco adiciones, eliminaciones o sustituciones de

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aminoacidos de la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, o SEQ ID NO:11;

e) un dominio variable de cadena ligera que comprende:

i) un LCDR1 que no tiene mas de tres adiciones, eliminaciones o sustituciones de aminoacidos de la

secuencia LCDR1 expuesta en la SEQ ID NO:30; un LCDR2 que no tiene mas de tres adiciones,

eliminaciones o sustituciones de aminoacidos de la secuencia de LCDR2 expuesta en la SEQ ID NO:33; y un LCDR3 que no tiene mas de tres adiciones, eliminaciones o sustituciones de aminoacidos de la secuencia LCDR3 expuesta en la SEQ ID NO:36;

ii) un LCDR1 que no tiene mas de tres adiciones, eliminaciones o sustituciones de aminoacidos de la

secuencia LCDR1 expuesta en la SEQ ID NO:31; un LCDR2 que no tiene mas de tres adiciones,

eliminaciones o sustituciones de aminoacidos de la secuencia LCDR2 expuesta en la SEQ ID NO:34; y un LCDR3 que no tiene mas de tres adiciones, eliminaciones o sustituciones de aminoacidos de la secuencia de LCDR3 expuesta en la SEQ ID NO:37; o

iii) un LCDR1 que no tiene mas de tres adiciones, eliminaciones o sustituciones de aminoacidos de la

secuencia LCDR1 expuesta en la SEQ ID NO:32; un LCDR2 que no tiene mas de tres adiciones,

eliminaciones o sustituciones de aminoacidos de la secuencia LCDR2 expuesta en la SEQ ID NO:35; y un LCDR3 que no tiene mas de tres adiciones, eliminaciones o sustituciones de aminoacidos de la secuencia LCDR3 expuesta en la SEQ ID NO:38; o

f) un dominio variable de cadena pesada que comprende:

i) un HCDR1 que no tenga mas de tres adiciones, eliminaciones o sustituciones de aminoacidos de la secuencia HCDR1 expuesta en la SEQ ID NO:12; un HCDR2 que no tiene mas de tres adiciones, eliminaciones o sustituciones de aminoacidos de la secuencia HCDR2 expuesta en la SEQ ID NO:15; y un HCDR3 que no tiene mas de tres adiciones, eliminaciones o sustituciones de aminoacidos de la secuencia HCDR3 expuesta en la SEQ ID NO:18;

ii) un HCDR1 que no tiene mas de tres adiciones, eliminaciones o sustituciones de aminoacidos de la

secuencia HCDR1 expuesta en la SEQ ID NO:13; un HCDR2 que no tiene mas de tres adiciones,

eliminaciones o sustituciones de aminoacidos de la secuencia HCDR2 expuesta en la SEQ ID NO:16; y un HCDR3 que no tiene mas de tres adiciones, eliminaciones o sustituciones de aminoacidos de la secuencia HCDR3 expuesta en la SEQ ID NO:19; o

iii) un HCDR1 que no tiene mas de tres adiciones, eliminaciones o sustituciones de aminoacidos de la

secuencia HCDR1 expuesta en la SEQ ID NO:14; un HCDR2 que no tiene mas de tres adiciones,

eliminaciones o sustituciones de aminoacidos de la secuencia HCDR2 expuesta en la SEQ ID NO:17; y un HCDR3 que no tiene mas de tres adiciones, eliminaciones o sustituciones de aminoacidos de la secuencia HCDR3 expuesta en la SEQ ID NO:20.

En ciertas realizaciones, el acido nucleico o acido nucleico aislado codifica un polipeptido que comprende la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID NO:53 o la SEQ ID NO:54.

En ciertas realizaciones, el acido nucleico o acido nucleico aislado codifica un polipeptido que comprende la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID NO:50, la SEQ ID NO:51, o la SEQ ID nO:52.

[0024] En ciertas realizaciones de la descripcion, el acido nucleico o el acido nucleico aislado que codifica una cadena ligera de anticuerpo y es al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, o es 100% identica a la secuencia de nucleotidos expuesta en la SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22 o SEQ ID NO:23. En otras realizaciones del noveno aspecto, el acido nucleico o el acido nucleico aislado codifica una cadena pesada de anticuerpo y es al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 95%, o es 100% identica a la secuencia de nucleotidos expuesta en la SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, o SEQ ID NO:5.

En ciertas realizaciones, la cadena pesada esta codificada por un acido nucleico que comprende una secuencia de nucleotidos expuesta en la SEQ ID No:47, la SEQ ID NO:48 o la SEQ ID NO:49.

[0025] La presente invencion proporciona un vector de expresion que comprende uno o mas acidos nucleicos o acidos nucleicos aislados de la invencion. En ciertas realizaciones, el vector de expresion codifica una cadena ligera de anticuerpo, una cadena pesada de anticuerpo, o tanto una cadena ligera de anticuerpo como una cadena pesada.

[0026] La presente invencion tambien proporciona una celula huesped recombinante que comprende uno o mas acidos nucleicos o acidos nucleicos aislados de la invencion unidos operativamente a un promotor, incluyendo las celulas huesped recombinantes que comprenden uno o mas vectores de expresion de la invencion. En realizaciones preferidas, la celula huesped recombinante secreta un anticuerpo que se une a OSMR. Las celulas huesped preferidas son celulas huesped de mairnfero, que incluyen lmeas celulares CHO.

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[0027] La presente descripcion proporciona metodos de tratamiento de un trastorno autoinmune, un trastorno inflamatorio, o un trastorno asociado con la deposicion de matriz extracelular o remodelacion, comprendiendo dicho metodo la administracion de una cantidad terapeuticamente eficaz de una protema unida a antigeno OSMR de una descripcion cualquiera de un paciente que lo necesite. En realizaciones preferidas, la protema de union a antigeno OSMR es un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoacidos de dominio variable de cadena ligera como se indica en la SEQ ID NO:27 y una secuencia de aminoacidos de dominio variable de cadena pesada como se establece en la SEQ ID NO:9 (por ejemplo, Ab1), un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoacidos del dominio variable de la cadena ligera como se establece en la SEQ ID NO:28 y una secuencia de aminoacidos del dominio variable de la cadena pesada como se establece en la SEQ ID NO:10 (por ejemplo, Ab2), o anticuerpo que comprende una secuencia de aminoacidos de dominio variable de cadena ligera como se expone en la SEQ ID NO:29 y una secuencia de aminoacidos de dominio variable de cadena pesada como se expone en la SEQ ID NO:11 (por ejemplo, Ab3). En algunas realizaciones, la protema de union al antigeno OSMR es un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoacidos del dominio variable de la cadena ligera como se establece en la SEQ ID NO:27 y una secuencia de aminoacidos del dominio variable de la cadena pesada como se establece en la SEQ ID NO:53, o un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoacidos de dominio variable de cadena ligera como se expone en la SEQ ID NO:28 y una secuencia de aminoacidos de dominio variable de cadena pesada como se expone en la SEQ ID NO:54. En realizaciones preferidas, la protema de union a antigeno OSMR inhibe la union de OSM a OSMR o IL-31 a OSMR. En realizaciones particularmente preferidas, el trastorno autoinmune, el trastorno inflamatorio o el trastorno asociado con el deposito o remodelacion de la matriz extracelular es fibrosis, degradacion del carfflago, artritis, artritis reumatoide, esclerodermia, enfermedad pulmonar intersticial asociada a la esclerodermia, fibrosis pulmonar idiopatica, cirrosis, psoriasis, dermatitis atopica, amiloidosis cutanea sistemica, amiloidosis cutanea primaria, inflamacion, inflamacion del prurito, prurigo nodular y dolor.

[0028] La presente invencion proporciona un metodo de fabricacion de una protema unida a antfgeno OSMR de la invencion de union mediante el cultivo de una celula huesped recombinante de la invencion y aislar la protema de union a antfgeno OSMR a partir de dicho cultivo.

[0029] La presente descripcion tambien proporciona protemas de union a antfgeno OSMR de la divulgacion que compiten cruzadamente con un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en:

a) un anticuerpo que comprende una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos expuesta en la

SEQ ID: 24 y una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID NO:6;

b) un anticuerpo que comprende una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos expuesta en la

SEQ ID: 25 y una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID NO:7; y

c) un anticuerpo que comprende una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos expuesta en la

SEQ ID: 26 y una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID NO:8.

DESCRIPCION DETALLADA

[0030] Los encabezados de seccion usados en este documento son solo para fines de organizacion y no deben interpretarse como limitantes del objeto descrito.

[0031] Las tecnicas estandar se pueden utilizar para ADN recombinante, smtesis de oligonucleotidos, cultivo de tejidos y la transformacion, purificacion de protemas, etc. Las reacciones enzimaticas y tecnicas de purificacion se pueden realizar segun las especificaciones del fabricante o comunmente lograrse en la tecnica o como se describe aqm. Los siguientes procedimientos y tecnicas pueden realizarse generalmente de acuerdo con metodos convencionales bien conocidos en la tecnica y como se describe en varias referencias generales y mas espedficas que se citan y discuten a lo largo de la memoria descriptiva. Vease, por ejemplo, Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manuel, 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. A menos que se proporcionen definiciones espedficas, la nomenclatura utilizada y los procedimientos de laboratorio. y las tecnicas de qmmica analftica, qmmica organica y qmmica medica y farmaceutica descritas en este documento son aquellas bien conocidas y comunmente utilizadas en la tecnica. Se pueden usar tecnicas estandar para la smtesis qmmica, analisis qmmica, preparacion farmaceutica, formulacion y administracion y tratamiento de pacientes.

OSMR

[0032] Las protemas de union a antfgeno descritas en el presente documento se unen a OSMR. La senal OSM e IL- 31 a traves de OSMR. OSMR es un miembro de la familia de receptores de citoquinas tipo I. El OSMR heterodimeriza con la glucoprotema 130 (tambien conocida como gp130, transductor de senal de interleucina 6 (IL6ST), IL6-beta o CD130) para formar el OSMR tipo II. OSMR tambien se heterodimeriza con el receptor A de IL- 31 (IL31RA) para formar el receptor de IL-31 y, por lo tanto, transduce los eventos de senalizacion inducidos por OSM e IL-31. En realizaciones ejemplares, una protema de union a antfgeno OSMR se une a OSMR y evita la senalizacion mediada por OSM e/o IL-31 en celulas que expresan OSMR.

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[0033] Las secuencias de OSMR humana son conocidas en la tecnica. En diversos aspectos, las secuencias de la protema OSMR humana se proporcionan en los numeros de acceso de GenBank AAI25210, AAI25211, NP_003990 y EAW55976. En la Tabla 1 se proporciona una secuencia de aminoacidos de OSMR humana ejemplar (SEQ ID NO:1). La protema esta formada por varios dominios: Los aminoacidos 1-27 corresponden a la secuencia senal que puede escindirse durante el procesamiento de la protema en celulas de mairnferos; los aminoacidos 28-740 corresponden al dominio extracelular; y los aminoacidos 741-761 corresponden al dominio transmembrana. En realizaciones preferidas, las protemas de union a antfgeno descritas en este documento se unen al dominio extracelular de OSMR y evitan la interaccion de OSM e/o IL-31 con OSMR.

[0034] Las secuencias de OSM humana se conocen en la tecnica. En varios aspectos, las secuencias de la protema OSM humana se proporcionan en los numeros de acceso de GenBank CAG30420, CAG46504, NP_065391, P13725, AAC05173, EAW59864 y AAH11589. En la Tabla 1 se proporciona una secuencia de aminoacidos de OSM humana ejemplar (SEQ ID NO:39). Los aminoacidos 1-25 corresponden a la secuencia senal; los aminoacidos 26220 corresponden a la protema madura; y los aminoacidos 221-252 corresponden a la secuencia del propeptido.

[0035] Las secuencias de IL-31 son conocidas en la tecnica. En varios aspectos, las secuencias de la protema IL-31 humana se proporcionan en los numeros de acceso de GenBank NP_001014358, AAS86448, AAI32999, AAI33001, Q6EBC2 y EAW98310. Una secuencia de aminoacidos de IL-31 humana ejemplar (SEQ ID NO:41) se proporciona en la Tabla 1. Los aminoacidos 1-23 corresponden a la secuencia de senal putativa.

[0036] Las secuencias de IL31RA humana son conocidas en la tecnica. En varios aspectos, las secuencias de la protema IL31RA humana se proporcionan en los numeros de acceso de GenBank AAS86447, NP_001229567 y CBL94051. En la Tabla 1 se proporciona una secuencia de aminoacidos de IL31RA (v4, isoforma 3) ejemplar (SEQ ID NO:43). Los aminoacidos 1-32 corresponden a la secuencia senal; y los aminoacidos 533-553 corresponden a la secuencia transmembrana.

[0037] Las secuencias gp130 humanas son conocidas en la tecnica. En varios aspectos, las secuencias de la protema gp130 humana se proporcionan en los numeros de acceso de GenBank AAI17403, AAI17405, EAW54936, NP_002175, ABK41905 y AAA59155. Una secuencia de aminoacidos de gp130 humana ejemplar (SEQ ID NO:45) se proporciona en la Tabla 1. La protema esta formada por varios dominios: los aminoacidos 1-22 corresponden a la secuencia senal; los aminoacidos 23-619 corresponden al dominio extracelular; los aminoacidos 620-641 corresponden al dominio transmembrana; y los aminoacidos 642-918 corresponden al dominio citoplasmico.

Tabla 1

Secuencia de aminoacidos de OSMR humana (SEQ ID NO: 1)

MA LF A V F QTTF FLTLLSLRT YQS E VL AERLPLTP VSLK VSTN STRQS L H LQ WT V HN L P

YHQELKMVFQ1QISRIETSNVIWVGNYSTTVKWNQVLHWSWESELPLECATHFVRIK.S

LVDDAKFPEPNFWSNWSSWEEVSVQDSTGQDILFVFPKDKLVEEGTNVTICYVSRNIQ

NNVSCYLEGKQIHGEQLDPHVTAFNLNSVPFIRNKGTNIYCEASQGNVSEGMKGIVLF

VSKVLEEPKDFSCETEDFKTLHCTWDPGTDTALGWSKQPSQSYTLFESFSGEKKLCTH

KNWCNWQ1TQDSQETYNFTLIAENYLRKRSVNILFNLTHRVYLMNPFSVNFENVNAT

NAIMTWKVHSIRNNFTYLCQIELHGEGKMMQYNVSIKVNGEYFLSELEPATEYMARV

R.CADASHFWKWSEWSGQNFTTLEAAPSEAPDVWRIVSLEPGNHTVTLFWKPLSKLH/

NGKILFYNVVVENLDKPSSSELHSIPAPANSTKLILDRCSYQICVIANNSVGASPASVIVI

SADPENKEVEEERIAGTEGGFSLSWKPQPGDVIGYVVDWCDHTQDVLGDFQWKNVG

PNTTSTVISTDAFRPGVRYDFRIYGLSTKRIACLLEKKTGYSQELAPSDNPHVLVDTLTS

HSFTLSWKDYSTESQPGFIQGYHVYLKSKARQCHPRFEKAVLSDGSECCKYKIDNPEE

KALIVDNLKPESFYEFF1TPFTSAGEGPSATFTKVTTPDEHSSMLIHILLPMVFCVLLIMV

MCYLKSQWIKETCYPDIPDPYKSSILSLIKFKENPHLI1MNVSDCIPDAIEVVSKPEGTKJ

QFLGTRKSLTETELTKPNYLYLLPTEKNHSGPGPCICFENLTYNQAASDSGSCGHVPVS

PKAPSMLGLMTSPENVLKALEKNYMNSLGEIPAGETSLNYVSQLASPMFGDKDSLPTT'

Secuencia de aminoacidos de OSM humana (SEQ ID NO: 39)

MGVLLTQRTLLSLVLALLFPSMASMAAIGSCSKEYRVLLGQLQKQTDLMQDTSRLLD

PYIRIQGLDVPKLREHCRERPGAFPSEETLRGLGRRGFLQTLNATLGCVLHRLADLEQI

LPKAQDLERSGLN1EDLEKLQMARPNILGLRNNIYCMAQLLDNSDTAEPTKAGRGAS(

PPTPTPASDAFQRKLEGCRFLHGYHRFMHSVGRVFSKWGESPNRSRRHSPHQALRKG

VRRTRPSRKGKRLMTRGQLPR

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Secuencia de aminoacidos de IL-31 humana (SEQ ID NO: 41)

MASHSGPSTS VLFLF CC LGG WL A SHT LPVRLLRPSDD V QKIV EELQS LSKMLLKD VEE EKGVLVSQNYTLPCLSPDAQPPNN1HSPAIRAYLKTIRQLDNKSVIDEIIEHLDKLIFQD/ PETMSVPTDTHECKRFILTISOOFSECMDLALKSLTSGAOOATT

Secuencia de aminoacidos de IL31RA humana (SEQ ID NO: 43)

M K LS PQ PSC VN LGM M WT WAL WM L PS LCK FS LAALP AKPENI SC VYYYR KN LTCT WS PGKETSYTQYTVKRTYAFGEKHDNCTTNSSTSENRASCSFFLPRITIPDNYTIEVEAENC DGVIKSHMTYWRLEN1AKTEPPKIFRVKPVLGIKRMIQIEWIKPELAPVSSDLKYTLRFB TVNSTSWMEVNFAKNRKDKNQTYNLTGLQPFTEYVIALRCAVKESKFWSDWSQEKM GMTEEEAPCGLELWRVLKPAEADGRRPVRLLWKKARGAPVLEKTLGYNIWYYPESN TNLTETMNTTNQQLELHLGGESFWVSMISYNSLGKSPVATLRIPAIQEKSFQCIEVMQ7) CVAEDQLVVKWQSSALDVNTWMIEWFPDVDSEPTTLSWESVSQATNWTIQQDKLKP FWCYNISVYPMLHDKVGEPYS1QAYAKEGVPSEGPETKVENIGVKTVTITWKEIPKSEF KGIICNYTIFYQAEGGKGFSKTVNSSILQYGLESLKRKTSYIVQVMASTSAGGTNGTSIE FKTLSFSVFEIILITSLIGGGLLILIILTVAYGLKKPNKLTHLCWPTVPNPAESSIATWHGD DFKDKLNLKESDDSVNTEDRILKPCSTPSDKLVIDKLVVNFGNVLQEIFTDEARTGQEE NLGGEKNGTR1LSSCPTSI

Secuencia de aminoacidos de gp130 humana (SEQ ID NO: 45)

M LTLQT WLV Q A LEI FLTTEST G ELLDPCG YISPESPW QLH SNFT A VC VLKEKCMDYF HVNANYiVWKTNHFTIPKEQYTllNRTASSVTFTDIASLNlQLTCNILTFGQLEQNVYGI TIISGLPPEKPKNLSCIVNEGKKMRCEWDGGRETHLETNFTLKSEWATHKFADCKAKR

DTpTSCTVDYSWYFW1EVWEAENALGKVTSDHJNFDpVYKVKpNppHNLSVJNSE

ELSSILKLTWTNPSIKSVIILKYNIQYRTKDASTWSQIPPEDTASTRSSFTVQDLKPFTEY

VFRIRCM KEDGKG Y WS D WSEE ASGITY EDRPSKAPS F W Y KID PSHT QG Y RTV Q L V WF TLPPFEANGKIL DYE VTLTR W KS H LQN YTVN ATKLT VN LTN DR Y L ATLT V RNLV G KS D AAVLTIPACDF Q ATHP VMDLK AFPKDN MEW V£ WTTPRES VKKYFLE W CVLSDK AP CITDWQQEDGTVHRTYLRGNLAESKCYL1TVTPVYADGPGSPESIKAYLKQAPPSKGP TVRTKKVGKNEAVLEWDQLPVDVQNGFIRNYTIFYRTIIGNETAVNVDSSHTEYTLSS

LTSDTLYMVRMAAYTDEGGKDGpEFTFTTpKFAQGE[EA1wpvcLAFLLTTLLGVLF

CFNKRDLIKKHIWPNVPDPSKSH1AQWSPHTPPRHNFNSKDQMYSDSNFTDVSVVE1V

ANDKKPFPEDLKSLDLFKKEKJNTEGHSSGIGGSSCMSSSRPSISSSDENESSQNTSSTV

QYSTVVHSGYRHQVPSVQVFSRSESTQPLLDSEERPEDLQLVE)HVDGGDGILPRQQYF

KQNCSQHESSPDISHFERSKQVSSVNEEDFVRLKQQISDHISQSCGSGQMKMFQEVSA

ADAFGPGTEGOVERFETVGMEAATDEGMPKSYLPOTVROGGYMPO

[0038] En realizaciones particulares de la presente descripcion, las protemas de union a antigeno aqu descritas se unen tanto OSMR humana y mono cynomolgus con alta afinidad, incluyendo los que se unen con alta afinidad y bloquear la interaccion de OSM de mono cynomolgus e/o IL-31 a OSMR mono cynomolgus. Estas caractensticas permiten estudios de toxicologfa informativa en primates no humanos.

[0039] Una secuencia de protema OSMR de macaco Rhesus (Macaca mulatta) se conoce en la tecnica y se proporciona en GenBank n° de acceso XP_001083745. En la Tabla 2 se proporciona un ejemplo de secuencia de aminoacidos OSMR de mono cinomolgo (Macaca fascicularis) (SEQ ID nO:2). La protema esta formada por varios dominios: los aminoacidos 1-27 corresponden a la secuencia de senal que se puede escindir durante el procesamiento de la protema en celulas de mairnferos; los aminoacidos 28-737 corresponden al dominio extracelular; y los aminoacidos 738-757 corresponden al dominio transmembrana. En realizaciones preferidas, las protemas de union a antfgeno descritas en este documento se unen al dominio extracelular de OSMr y evitan la interaccion de OSM e/o IL-31 con OSMR.

[0040] Una secuencia de la protema OSM de macaco Rhesus (Macaca mulatta) se conoce en la tecnica y se proporciona en GenBank n° de acceso NP_001181403. En la Tabla 2 se proporciona una secuencia de aminoacidos OSM ejemplar de mono cynomolgus (Macaca fascicularis) (SEQ ID NO:40). Los aminoacidos 1-196 corresponden a la OSM cinomolgus madura.

[0041] Una secuencia de protema IL-31 de macaco Rhesus (Macaca mulatta) se conoce en la tecnica y se proporciona en GenBank n° de acceso XP_001096743. En la Tabla 2 se proporciona una secuencia de aminoacidos IL-31 ejemplar de mono cynomolgus (Macaca fascicularis) (SEQ ID NO:42). Esta secuencia representa el IL-31 de

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mono cynomolgus maduro.

[0042] Una secuencia de aminoacido IL31RA mono cynomolgus ejemplar (Macaca fascicularis) (SEQ ID NO:44) se proporciona en la Tabla 2. Los aminoacidos 1-19 corresponden a la secuencia senal; y los aminoacidos 520-540 corresponden al dominio transmembrana.

[0043] Una secuencia de la protema gp130 de macaco Rhesus (Macaca mulatta) se conoce en la tecnica y se proporciona en GenBank n° de acceso NP_001252920. En la Tabla 2 se proporciona un ejemplo de secuencia de aminoacidos de gp130 de mono cynomolgus (Macaca fascicularis) (SEQ ID NO:46). La protema esta formada por varios dominios: los aminoacidos 1-22 corresponden a la secuencia senal; los aminoacidos 23-619 corresponden al dominio extracelular; los aminoacidos 620-641 corresponden al dominio transmembrana; y los aminoacidos 642-918 corresponden al dominio citoplasmico.

Tabla 2

Secuencia de aminoacidos OSMR de mono cynomolgus (SEQ ID NO: 2)

MALFVVFQTTFFLILLSLRTYQSEVLAERLPLTPVSLKVSTNSIHQSLHLQWTVI INI.PY

HQELKMVFQIQISR1ETSNVVWVGNYSTPVKWNQVLHWSWESELPLECATHF V R1KS

V1DDASFPEPNFWSNWSSWEEVSVQDYLGRGTLFVFPKDKLVEEGSNVTICYVSRMQ

N1MVSCYLEGKQIHGEQLDPHVTAFNLNSVPFIRNRGTNIYCEASQGNVSKGIEGIY'LEV

SKVLEEPKDFSCESQDFKTLHCTWDPGTDTALGWSKQPSQSYTLFESFSGEKKI.CTIIK

N WC N WQ1TQDSQE M YN FT LI A EN Y L RKRSVNILFN LTH R VY L MN PFS VN F EN V N A T N

A1MTWKVHSMRNN FTYLCQJELHGEGKMMQY D VSIN VN GEY F LSELEPATEY VIA R V

RCADASHFWKWTEWSGQNFTTLEAAPSEAPDVWRSVNSEPGNHTVTLFWKPl.SKI.il

ANGKiLFYNVVVENLDKPSRSELRSlPAPANSTKLILDRCSYQICVTANNSVGASPASII

VISADPENKEVEEERIAGTEGGFSLSWKPQPGDVIGYVVDWCDHPQDVLQWKWCjPN

TTSTVISTDAFRPGVRYDFR1YGLSTKRIACLLEKKTGYSQELAPSDNPHVLVDVII .TSII

SFTLSWKDYSTESQPGFIQGYHVYLKSKARQCHPRFQKAVLSDGSECCRYKIDNPI-EK

AL1VDNLKPESFYEFF VTPFTSAGEGPN ATFTKVTTPDEHSSMLIRILLPM VFCV L LI MIX

CYLKSQWIKETCYPD1PDPYKSSILSLIKFKENPHLT1MNVSDCIPDAIEVVSKPEGTKJQ

LLGTRKSLTETELTKPNYLYLLPTEKNHSGPGPCICFENFTYNQAASDAGSCGHVPVPP

KAPPSMLGLMTSPENVLKALEKNYMNSLGEVPAGETSLNYVSQLASPMSGDKDSLPT

NPVEPPHCSEYKMQMAVPLRLALPPPTENSSLSSITLLDPGEHYR

Secuencia de aminoacidos OSM de mono cynomolgus (SEQ ID NO: 40)

AAMGSCSKEYRMLLGQLQKQTDLMQDTSRLLDPYIRIQGLDIPKLREHCRESPGAFPS

EETLRGLGRRGFLQTLNATLGRILHRLADLEQHLPKAQDLERSGLNIEDLEKLQMARI

NVLGLRNNVYCMAQLLDNSDMTEPTKAGRGTPQPPTPTPTSDVFQRKLEGCSFLRG^

HRFMHSVGRVFSKWGESPNRSRR

Secuencia de aminoacidos de IL-31 de mono cynomolgus (SEQ ID NO: 42)

TLPVHFLQPSDIQKIVEELQSLSKMLLKDVKEDKGVLVSQNYTLPCLTPDAQPPNIIHS]

AIRAYLKTIRQLDNKSVIDEIIEHLDKLIFQDAPETNISVPTDTHECKRFILTISQQFSECV

DLALKSLTSGAQQATT

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Secuencia de aminoacidos de IL31RA del mono cynomolgus (SEQ ID NO: 44)

MMWTWALWMFPLLCKFGLAALPAKPEN1SCVYYYRKNLTCTWSPGKETSYTQYTAB

RTYAFGKKHDNCTTSSSTSENRASCSFFLPRITIPDNYTIEVEAENGDGVIKSDMTCWR

LEDIAKTEPPEIFSVKPVLG1KRMIRIEWIKPELAPVSSDLKYALRFRTVNSTSWMEVNF

AKNRKDTNQTYNLMGLQAFTEYVVALRCAVKESKFWSDWSQEKMGMTEEEAPCGL

ELWRVLKPTEVDGRRPVRLLWKKARGAPVLEKTLGYNIWYFPENNTNLTETVNTTN

QQLELHLGGESYWVSMISYNSLGKSPVTTLRIPAIQEKSFRCIEVMQACLAEDQLVVK

WQSSALDVNTWMIEWFPDMDSEHPTLSWESVSQATNWTIQQDKLKPFWCYNISVYP

MLHDKVGEPYS1QAYAKEGIPSKGPETKVENIGVKTVTITWKEIPKSERKG1ICNYTIFY

QAEGGTGFSKTVNSSILQYGLESLKRKTSYTVRVMASTSAGGINGTSINFKTLSFSVFE1

ILITSL1GGGLLILIILTVAYGLKKPNKLTHLCWPSVPNPAESS1ATWRGDDFKDKLNLK

ESDDSVNTEDRILKPCSTPSDKLVIDKSVVNFGNVLQEMFTDEARTGQENNLGGEKNE

NRILSSCPTSI

Secuencia de aminoacidos de gp130 de mono cynomolgus (SEQ ID NO: 46)

MLTLQTWVVQALFIFLTTESIGELLDPCGYISPESPVVQLHS'NFTAVCVLKEKCMDYFF VNANYIVWKTNHFTIPKEQYTIINRTASSVTFTDISSLNIQLTCNILTFGQLEQNVYGITIl SGLPPEKPKNLSCIVNEGKKMRCEWNRGRETHLETNFTLKSEWATHKFADCKAKRD7 PTSCTVDYSTVYFVNIEVWVEAENALGKVTSDHINFDPVYKVKPNPPHNLSVINSEELS SILKLTWTNPSIKSVIRLKYNIQYRTKDASTWSQIPPEDTASTRSSFTVQDLKPFTEYVF RICCMKEDGKGYWSDWSEEANGITYEDRPSKAPSFWYKIDPSHAQGYRTVQLMWKT LPPFE ANGKILD YE VTLTR WKSHLQN YTVN DT KLTVN LTN DRY VATLT ARN L VGKS E AA VLTIPACDF Q ATHPVMDLBCAFPKDNML W VE WTTPRE S VKKYILE W C VL SDKAPC1 AIXVQQEDG I VlIR'nil .RGNI.AFSKC YUTVTPVA AiXiPGSPFSIKAYLKQAPPSKGPTN R I KKVfjKM AVI.l.W l)QI PYI)\ Q\GI IR\Y I II YR I IIGM l:\VW DSSII HA I I SSI. 11 DIIA V1VRV1 AA'i I DIXiCiRIXiPI I HI! I'KI AQC.IIi: \l\A P\ ( I.Al I I III I.G\ IKT\ K.RDI IKKIIIWPW PDPSRSI IIAQWSPIITPPRI l\l SSKI)Q\IYSI)( i\l l l)VS\ \ I II \\l) kkPIPIDI KSI 1)1 I Kkl klYH GIISSGIGGSSCAISSSRPSISSSDI \l SS(>\ I SS l \ QA S I VYI1SGYRI IQYPSYQYFSRSFS IQPI l DSI I RPI 1)1 Ql \ 1)11\ l)GSI)l)ll PRQQVI KQ\( SQIIISSPDISIII I RSKQ\ SSWI I DIA Rl kQQI SI )l 11SQSCG SGI ■ VIK M IQ I ASA AI )PFG PGH:GQ\ I RI I I l(j\1I AAII)r(iVIPKSVl PO IA'ROGC.VMPQ

Proteinas de union al antigeno OSMR

[0044] La presente descripcion proporciona protemas de union a antigeno que se unen espedficamente OSMR. Las realizaciones de proteinas de union a antigeno comprenden peptidos y/o polipeptidos que se unen espedficamente a OSMR. Dichos peptidos o polipeptidos pueden incluir opcionalmente una o mas modificaciones de la traduccion de puertos. Las realizaciones de proteinas de union a antigeno incluyen anticuerpos y fragmentos de los mismos, como se define aqu de manera diversa, que se unen espedficamente a OSMR. Estos incluyen anticuerpos que se unen espedficamente a OSMR humana, incluidos aquellos que inhiben a OSM e/o IL-31 de unirse y/o activar OSMR.

[0045] Las proteinas de la invencion de union al antigeno se unen espedficamente a OSMR. "Se une espedficamente" como se usa en este documento significa que la protema de union a antigeno se une preferentemente a OSMR sobre otras proteinas. En algunas realizaciones, "se une espedficamente" significa que la protema de union al antigeno OSMR tiene una afinidad mas alta por OSMR que por otras proteinas. Las proteinas de union a antigeno OSMR que se unen espedficamente a OSMR pueden tener una afinidad de union por OSMR humana menor o igual que 1 x 10-7 M, menor o igual que 2 x 10-7 M, menor o igual que 3 x 10-7 M, menor o igual que 4 x 10-7 M, menor o igual que 5 x 10-7 M, menor o igual que 6 x 10-7 M, menor o igual que 7 x 10-7 M, menor o igual que 8 x 10-7 M, menor o igual que 9 x 10-7 M, menor o igual que 1 x 10-8 M, menor o igual que 2 x 10-8 M, menor o igual que 3 x 10-8 M, menor o igual que 4 x 10-8 M, menor o igual que 5 x 10-8 M, menor o igual que 6 x 10-8 M, menor o igual que 7 x 10-8 M, menor o igual que 8 x 10-8 M, menor o igual que 9 x 10-8 M, menor o igual que 1 x 10-9 M, menor o igual que 2 x 10-9 M, menor o igual que 3 x 10-9 M, menor o igual que 4 x 10-9 M, menor o igual que 5 x 10-9 M, menor o igual que 6 x 10-9 M, menor o igual que 7 x 10-9 M, menor o igual que 8 x 10-9 M, menor o igual que 9 x 10-9 M, menor o igual que 1 x 10-10 M, menor o igual que 2 x 10-10 M, menor o igual que 3 x 10-10 M, menor o igual que 4 x 10-10 M, menor o igual que 5 x 10-10 M, menor o igual que 6 x 10-10 M, menor o igual que 7 x 10-10 M, menor o igual que 8 x 10-10 M, menor o igual que 9 x 10-10 M, menor o igual que 1 x 10-11 M, menor o igual que 2 x 10-11 M, menor o igual que 3 x 10-11 M, de menor o igual que 4 x 10-11 M, menor o igual que 5 x 10-11 M, menor o igual que 6 x

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10-11 M, menor o igual que 7 x 10-11 M, menor o igual que 8 x 10-11 M, menor o igual que 9 x 10-11 M, menor o igual que 1 x 10-12 M, menor o igual que 2 x 10-12 M, menor o igual que 3 x 10-12 M, menor o igual que 4 x 10-12 M, menor o igual que 5 x 10-12 M, menor o igual que 6 x 10-12 M, menor o igual que 7 x 10-12 M, menor o igual que 8 x 10-12 M, o menor o igual que 9 x 10-12 M.

[0046] Los metodos para medir la afinidad de union de una protema de union a antigeno son bien conocidos en la tecnica. Los metodos de uso comun para la determinacion de afinidad incluyen la Resonancia de Plasmon de Superficie (SPR) (Morton y Myszka "Kinetic analysis of macromolecular interactions using surface plasmon resonance biosensors" Methods in Enzymology (1998) 295, 268-294), Bio-Layer Interferometry, (Abdiche et al "Determining Kinetics and Affinities of Protein Interactions Using a Parallel Real-time Label-free Biosensor, the Octet" Analytical Biochemistry (2008) 377, 209-217), Kinetic Exclusion Assay (KinExA) (Darling y Brault "Kinetic exclusion assay technology: characterization of molecular interactions" Assay and Drug Dev Tech (2004) 2, 647-657), calorimetna isotermica (Pierce et al "Isothermal Titration Calorimetry of Protein-Protein Interactions" Methods (1999) 19, 213-221) y ultracentrifugacion analftica (Lebowitz et al. "Modern analytical ultracentrifugation in protein science: A tutorial review" Protein Science (2002), 11: 2067-2079). El ejemplo 5 proporciona metodos ejemplares de determinacion de afinidad.

[0047] Se entiende que cuando se hace referencia a las diversas realizaciones de los anticuerpos de union a OSMR en el presente documento, que tambien abarca fragmentos de union a OSMR de los mismos. Un fragmento de union a OSMR comprende cualquiera de los fragmentos o dominios de anticuerpos descritos en el presente documento que conserva la capacidad de unirse espedficamente a OSMR. El fragmento de union a OSMR puede estar en cualquiera de los armazones descritos en este documento.

[0048] En ciertas realizaciones terapeuticas, una protema de union a antfgeno OSMR inhibe la union de OSM e/o IL- 31 a OSMR e/o inhibe una o mas actividades biologicas asociadas con la union de OSM e/o IL-31 a OSMR, por ejemplo, senalizacion mediada por OSM e/o IL-31. Se dice que tales protemas de union a antfgeno son "neutralizantes". En ciertas realizaciones, la protema de union a antfgeno OSMR neutralizante se une espedficamente a OSMR e inhibe la union de OSM e/o IL-31 a OSMR desde cualquier lugar entre el 10% y el 100%, tal como en al menos aproximadamente 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% o mas. Por ejemplo, las protemas de union a antfgeno OSMR pueden probarse para determinar su capacidad neutralizante mediante la determinacion de la capacidad de la protema de union a antfgeno para bloquear la union de OSM e/o IL-31 a OSMR, vease, por ejemplo, la OSMR humana y los ensayos de bloqueo OSMR de cynomolgus de los Ejemplos 2 y 3, respectivamente. Alternativamente, las protemas de union al antfgeno OSMR pueden analizarse para determinar su capacidad neutralizadora en un ensayo que mide el efecto de la presencia de la protema de union al antfgeno OSMr en un ensayo que mide la funcion biologica mediada por OSM e/o IL-31. Por ejemplo, la capacidad de la OSM para inducir una respuesta biologica, como la estimulacion de la actividad del activador del plasminogeno en celulas endoteliales aorticas bovinas cultivadas, la regulacion de la expresion de IL-6 en celulas endoteliales humanas y la estimulacion de la captacion de LDL y la regulacion positiva de receptores de LDL de superficie celular en celulas HepG2. Alternativamente, la capacidad de IL-31 para inducir inflamacion en la piel.

[0049] Las realizaciones de protemas de union a antfgeno comprenden una estructura de armazon, como se define aqrn de manera diversa, con una o mas regiones determinantes de complementariedad (CDR). Las realizaciones incluyen ademas protemas de union a antfgeno que comprenden una estructura de armazon con uno o mas dominios variables de anticuerpo, pesados o ligeros. Las realizaciones incluyen anticuerpos que comprenden un dominio variable de cadena ligera seleccionado del grupo que consiste en el dominio variable de cadena ligera (LCv) de Ab1, LCv de Ab2 y LCv de Ab3 (SEQ ID NO:27-29, respectivamente) y/o un dominio variable de cadena pesada seleccionado del grupo que consiste en el dominio variable de cadena pesada (HCv), Ab2 HCv y Ab3 HCv (SEQ ID NOS: 9-11, respectivamente), y fragmentos, derivados, mutemas y variantes de los mismos.

Una variante ejemplar del dominio variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO:9 contiene un aminoacido distinto de la asparagina (por ejemplo, acido aspartico) en la posicion correspondiente a la posicion 73 en la SEQ ID NO:9. La secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID NO:53 es un ejemplo de una variante de dominio variable de cadena pesada de la SEQ ID NO:9.

Una variante ejemplar del dominio variable de la cadena pesada de SEQ ID NO:10 contiene un aminoacido distinto de asparagina (por ejemplo, acido aspartico) en la posicion correspondiente a la posicion 73 en SEQ ID NO:10. La secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID NO:54 es un ejemplo de una variante de dominio variable de cadena pesada de la SEQ ID No:10.

[0050] Una cadena ligera ejemplar que comprende Ab1 LCv es una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID NO:24.

[0051] Una cadena ligera ejemplar que comprende Ab2 LCv es una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID NO:25.

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[0052] Una cadena ligera ejemplar que comprende Ab3 LCv es una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID NO:26.

[0053] Una cadena pesada ejemplar que comprende Ab1 VHC es una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID NO:6.

Una cadena pesada ejemplar que comprende una variante de Ab1 HCv es una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID NO:50.

[0054] Una cadena pesada ejemplar que comprende Ab2 VHC es una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ iD NO:7.

[0055] Una cadena pesada ejemplar que comprende una variante de Ab2 VHC es una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID NO:51.

[0056] Una cadena pesada ejemplar que comprende Ab3 HCv es una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ iD NO:8.

[0057] Una cadena pesada ejemplar que comprende una variante de Ab3 HCv es una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID NO:52.

[0058] Los ejemplos adicionales de los andamios que se contemplan incluyen, pero no estan limitados a: fibronectina, neocarzinostatina CBM4-2, lipocalinas, receptor de celulas T, protema dominio -A (protema Z), Im9, protemas TPR, dominios de dedos de zinc, pVIII, polipeptido pancreatico aviar, GCN4, dominio WW homcologfa Src dominio 3, dominios PDZ, TEM-1 beta-lactamasa, tiorredoxina, nucleasa estafilococica, dominios de dedo PHD, CL- 2, BPTI, APPI, HPSTI, ecotina, LACI-D1, LDTI, MTI-II, toxinas de escorpion, peptido de insecto defensina-A, EETI-II, Min-23, CBD, PBP, citocromo b-562, dominios del receptor Ld1, gamma-cristalina, ubiquitina, transferrina y dominios de tipo lectina de tipo C. Los andamios sin anticuerpos y su uso como terapeuticos se revisan en Gebauer y Skerra, Curr. Opin. Chem. Biol., 13: 245-255 (2009) y Binz et al., Nat. Biotech., 23 (10): 1257-68 (2005).

[0059] Los aspectos de la divulgacion incluyen anticuerpos que comprenden los siguientes dominios variables: Ab1 LCv/Ab1 HCv (SEQ ID NO:27/SEQ ID NO:9), Ab2 LCv/Ab2 HCv (SEQ ID NO:28/SEQ ID NO:10), Ab3 LCv/Ab3 HCv (SEQ ID NO:29/SEQ ID NO:11), y combinaciones de los mismos, asf como fragmentos, derivados, mutemas y variantes de los mismos. Tambien se incluyen los anticuerpos que comprenden los siguientes dominios variables: SEQ ID NO:27/SEQ ID NO:53; y SEQ ID NO:28/SEQ ID NO:54.

[0060] Los anticuerpos ejemplares de la divulgacion incluyen Ab1 (SEQ ID NO:24/SEQ ID NO:6), Ab2 (SEQ ID NO:25/SEQ ID NO:7) y Ab3 (SEQ ID NO:26/SEQ ID) NO: 8).

Los anticuerpos ejemplares adicionales incluyen: SEQ ID NO:24/SEQ ID NO:50; SEQ ID NO:25/SEQ ID NO:51; y SEQ ID NO:26/SEQ ID NO:52.

[0061] Tfpicamente, cada dominio variable de un anticuerpo de cadena ligera o pesada comprende tres CDR. El dominio variable de cadena pesada comprende una cadena pesada CDR1 (HCDR1), una cadena pesada CDR2 (HCDR2) y una cadena pesada CDR3 (HCDR3). El dominio variable de la cadena ligera comprende una cadena ligera CDR1 (LCDR1), una cadena ligera CDR2 (LCDR2) y una cadena ligera CDR3 (LCDR3). En ciertas realizaciones, una protema de union a antfgeno comprende una o mas CDR contenidas dentro de los dominios variables preferidos descritos en este documento.

[0062] Los ejemplos de dichas CDR incluyen, pero no se limitan a:

las CDR de Ab1 LCv: LCDR1 (SEQ ID NO:30), LCDR2 (SEQ ID NO:33) y LCDR3 (SEQ ID NO:36); las CDR de Ab2 LCv: LCDR1 (SEQ ID NO:31), LCDR2 (SEQ ID NO:34) y LCDR3 (SEQ ID NO:37); las CDR de Ab3 LCv: LCDR1 (SEQ ID NO:32), LCDR2 (SEQ ID NO:35) y LCDR3 (SEQ ID NO:38); las CDR de Ab1 HCv: HCDR1 (SEQ ID NO:12), HCDR2 (SEQ ID NO:15) y HCDR3 (SEQ ID NO:18); las CDR de Ab2 HCv: HCDR1 (SEQ ID NO:13), HCDR2 (SEQ ID NO:16) y HCDR3 (SEQ ID NO:19); y las CDR de Ab3 HCv: HCDR1 (SEQ ID NO:14), HCDR2 (SEQ ID NO:17) y HCDR3 (SEQ ID NO:20).

[0063] En algunas realizaciones, la protema de union a antfgeno comprende: a) un polipeptido, por ejemplo, una cadena ligera, que comprende una LCDR1 que tiene una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOS: 30, 31, y 32; un LCDR2 que tiene una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:33, 34 y 35; y/o un LCDR3 que tiene una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID nO:36, 37 y 38; y/o B) un polipeptido, por ejemplo, una cadena pesada, que

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comprende un HCDR1 que tiene una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:l2, 13 y 14; un HCDR2 que tiene una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID nO:15, 16 y 17; y/o un HCDR3 que tiene una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:18, 19 y 20.

[0064] En realizaciones adicionales, la protema de union a antigeno comprenden A) una secuencia de aminoacidos de cadena ligera que comprende una lCdR1, LCDR2 y LCDR3 de cualquiera de Abl LCV, Ab2 LCV, y Ab3 LCv y B) una secuencia de aminoacidos de la cadena pesada que comprende un HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de cualquiera de Ab1 HCv, Ab2 HCv y Ab3 HCv.

[0065] En ciertas realizaciones, las CDR incluyen no mas de uno, no mas de dos, no mas de tres, no mas de cuatro, no mas de cinco, o sin adiciones de acido mas de seis amino, deleciones, o sustituciones de una CDR ejemplar establecida en el presente documento.

[0066] Los aspectos de la divulgacion incluyen anticuerpos que comprenden un dominio variable de cadena ligera seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NOS: 27, 28 y 29. Los aspectos de la divulgacion incluyen anticuerpos que comprenden un dominio variable de cadena pesada seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NOS: 9, 10 y 11. Otros aspectos de la divulgacion incluyen anticuerpos que comprenden A) un dominio variable de cadena ligera seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO:27, 28 y 29, y B) un dominio variable de cadena pesada seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NOS: 9, 10 y 11.

[0067] Los anticuerpos de la invencion pueden comprender cualquier region constante conocida en la tecnica. La region constante de la cadena ligera puede ser, por ejemplo, una region constante de la cadena ligera de tipo kappa o lambda, por ejemplo, una region constante de la cadena ligera de tipo kappa o lambda. La region constante de la cadena pesada puede ser, por ejemplo, una region constante de la cadena pesada de tipo alfa, delta, epsilon, gamma o mu, por ejemplo, una region humana constante de tipo alfa, delta, epsilon, gamma o mu de la cadena pesada. En una realizacion, la region constante de la cadena ligera o pesada es un fragmento, derivado, variante o mutema de una region constante natural.

[0068] Los aspectos de la divulgacion incluyen anticuerpos que comprenden una region variable de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOS: 27, 28 y 29 que tienen no mas de uno, no mas de dos, no mas de tres, no mas de cuatro, no mas de cinco, no mas de seis, no mas de siete, no mas de ocho, no mas de nueve, o no mas de diez adiciones, eliminaciones o sustituciones de aminoacidos. Los aspectos de la divulgacion incluyen anticuerpos que comprenden una region variable de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:9, 10 y 11 que tienen no mas de uno, no mas de dos, no mas de tres, no mas de cuatro, no mas de cinco, no mas de seis, no mas de siete, no mas de ocho, no mas de nueve, o no mas de diez adiciones, eliminaciones o sustituciones de aminoacidos. Otros aspectos de la divulgacion incluyen anticuerpos que comprenden A) que comprenden una region variable de cadena ligera seleccionada del grupo que consta de SEQ ID NO:27, 28 y 29 que tienen no mas de uno, no mas de dos, no mas de tres, no mas de cuatro, no mas de cinco, no mas de seis, no mas de siete, no mas de ocho, no mas de nueve, o no mas de diez adiciones, eliminaciones o sustituciones de aminoacidos, y B) una region variable de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOS: 9, 10 y 11 que tienen no mas de uno, no mas de dos, no mas de tres, no mas de cuatro, no mas de cinco, no mas de seis, no mas de siete, no mas de ocho, no mas de nueve, o no mas de diez adiciones, eliminaciones o sustituciones de aminoacidos.

[0069] En una variacion, la protema de union a antfgeno comprende una secuencia de aminoacidos que es al menos 80%, al menos 81%, al menos 82%, al menos 83%, al menos 84%, al menos 85%, al menos 86%, al menos 87%, al menos 88%, al menos 89%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99% identico a una secuencia de aminoacidos de la region variable de la cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:27, 28 y 29. En otra variacion, la protema de union al antfgeno comprende una secuencia de aminoacidos que es al menos 80%, al menos 81%, al menos 82%, al menos 83%, al menos 84%, al menos 85%, al menos 86%, al menos 87%, al menos el 88%, al menos el 89%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, o al menos el 99% identica a una secuencia de aminoacidos de la region variable de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:9, 10, y 11. En otra realizacion adicional, la protema de union a antfgeno comprende A) una secuencia de aminoacidos que es al menos 80%, al menos 81%, al menos 82%, al menos 83%, al menos 84%, al menos 85%, al menos el 86%, al menos el 87%, al menos el 88%, al menos el 89%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98% o al menos el 99% identica a una secuencia de aminoacidos de la region variable de la cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:27, 28 y 29, y B) una secuencia de aminoacidos que es al menos 80%, al menos 81%, al menos 82%, al menos 83%, al menos 84%, al menos 85%, al menos 86%, al menos 87%, al menos 88%, al menos 89%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, o al menos el 99% identica a una secuencia de aminoacidos de la region variable de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:9, 10 y 11.

Las protemas de union al antfgeno OSMR que comprenden un dominio variable de cadena pesada que tiene una

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relacion de secuencia definida anteriormente con la SEQ ID NO:9 pueden contener opcionalmente un aminoacido distinto de asparagina (por ejemplo, acido aspartico) en la posicion correspondiente a la posicion 73 en la SEQ ID NO:9. En tales realizaciones, el dominio variable de cadena pesada comprende opcionalmente la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID NO:53.

[0070] En ciertas realizaciones, la protema de union a antigeno comprende una cadena ligera y/o CDR3 de cadena pesada. En algunas realizaciones, la protema de union a antigeno comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo de secuencias expuestas en las SEQ ID NO:36, 37, 38, 18, 19 y 20. En ciertas realizaciones, la secuencia de aminoacidos no incluye mas de uno, no mas de dos, no mas de tres, no mas de cuatro, no mas de cinco, o no mas de seis adiciones, eliminaciones o sustituciones de aminoacidos de la secuencia ejemplar establecida en la SEQ ID NO:36, 37, 38, 18, 19 y 20. Asf, las realizaciones de la presente divulgacion incluyen una protema de union a antigeno que comprende una secuencia de aminoacidos que es al menos 80%, al menos 81%, al menos 82%, al menos 83%, al menos 84%, al menos 85%, al menos 86%, al menos 87%, al menos 88%, al menos 89%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99% identica a una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo de secuencias expuestas en las SEQ ID NO:36, 37, 38, 18, 19 y 20.

[0071] En ciertas realizaciones, la protema de union a antigeno comprende una cadena ligera y/o CDR2 de cadena pesada. En algunas realizaciones, la protema de union a antigeno comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo de secuencias expuestas en las SEQ ID NO:33, 34, 35, 15, 16 y 17. En ciertas realizaciones, la secuencia de aminoacidos no incluye mas de uno, no mas de dos, no mas de tres, no mas de cuatro, no mas de cinco, o no mas de seis adiciones, eliminaciones o sustituciones de aminoacidos de la secuencia ejemplar establecida en la SEQ ID NO:33, 34, 35, 15, 16 y 17. Por lo tanto, las realizaciones de la presente divulgacion incluyen una protema de union a antfgeno que comprende una secuencia de aminoacidos que es al menos 80%, al menos 81%, al menos 82%, al menos 83%, al menos 84%, al menos 85%, al menos 86%, al menos 87%, al menos 88%, al menos 89%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99% identica a una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo de secuencias expuestas en las SEQ ID NO:33, 34, 35, 15, 16 y 17.

[0072] En ciertas realizaciones, la protema de union a antfgeno comprende una cadena ligera y/o cadena pesada de CDR1. En algunas realizaciones, la protema de union a antfgeno comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo de secuencias expuestas en las SEQ ID NO:30, 31, 32, 12, 13 y 14. En ciertas realizaciones, la secuencia de aminoacidos no incluye mas de uno, no mas de dos, no mas de tres, no mas de cuatro, no mas de cinco, o no mas de seis adiciones, eliminaciones o sustituciones de aminoacidos de la secuencia de ejemplo establecida en la SEQ ID NO:30, 31, 32, 12, 13 y 14. Por lo tanto, las realizaciones de la presente divulgacion incluyen una protema de union a antfgeno que comprende una secuencia de aminoacidos que es al menos 80%, al menos 81%, al menos 82%, al menos 83%, al menos 84%, al menos 85%, al menos 86%, al menos 87%, al menos 88%, al menos 89%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99% identica a una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo de secuencias expuestas en las SEQ ID NO:30, 31, 32, 12, 13 y 14.

[0073] Las protemas de la divulgacion comprenden los andamios de anticuerpos tradicionales, incluyendo anticuerpos humanos y monoclonales, anticuerpos biespedficos, diacuerpos, minicuerpos, anticuerpos de dominio, anticuerpos sinteticos de union a antfgeno (algunas veces se hace referencia en esta memoria como "mimeticos de anticuerpo"), quimericos Anticuerpos, fusiones de anticuerpos (a veces denominados "conjugados de anticuerpos") y fragmentos de cada uno, respectivamente. Las CDR descritas anteriormente, incluidas varias combinaciones de las CDR, pueden ser injertadas en cualquiera de los siguientes andamios.

[0074] Tal como se utiliza aqrn, el termino "anticuerpo" se refiere a las diversas formas de protemas monomericas o multimericas que comprenden una o mas cadenas polipeptfdicas que se une espedficamente a un antfgeno, tal como se describe diversamente en la presente memoria. En ciertas realizaciones, los anticuerpos se producen mediante tecnicas de ADN recombinante. En realizaciones adicionales, los anticuerpos se producen por escision enzimatica o qmmica de anticuerpos naturales. En otro aspecto, el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en: a) un anticuerpo humano; b) un anticuerpo humanizado; c) un anticuerpo quimerico; d) un anticuerpo monoclonal; e) un anticuerpo policlonal; f) un anticuerpo recombinante; g) un fragmento de union a antfgeno; h) un anticuerpo de cadena sencilla; i) un diacuerpo; j) un triacuerpo, k) un tetracuerpo, 1) un fragmento Fab; m) un fragmento F(ab')2, n) un anticuerpo IgA, o) un anticuerpo IgD, p) un anticuerpo IgE, q) un anticuerpo IgG1, r) un anticuerpo IgG2, s) un anticuerpo IgG3, t) un anticuerpo IgG4, y u) un anticuerpo IgM.

[0075] Una region variable o dominio comprende al menos tres CDRs de cadena pesada o ligera incrustados dentro de una region marco (regiones marco designadas FR1, FR2, FR3, y FR4). Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins

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of Immu- nological Interest, Public Health Service N.I.H., Bethesda, MD. Las unidades estructurales de anticuerpos tradicionales tipicamente comprenden un tetramero. Cada tetramero esta compuesto tipicamente de dos pares identicos de cadenas polipeptidicas, cada par tiene una cadena "ligera" y una "pesada". La porcion amino-terminal de cada cadena incluye una region variable de aproximadamente 100 a 110 o mas aminoacidos principalmente responsables del reconocimiento de antigenos. La porcion carboxi-terminal de cada cadena define una region constante responsable principalmente de la funcion efectora. Las cadenas ligeras humanas se clasifican como cadenas ligeras kappa o lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como mu, delta, gamma, alfa o epsilon, y definen el isotipo del anticuerpo como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente. IgG tiene varias subclases, incluidas, entre otras, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. IgM tiene subclases, incluidas, entre otras, IgM1 e IgM2. Las realizaciones de la invencion incluyen todas estas clases y subclases de anticuerpos que incorporan un dominio variable o CDR de las protemas de union a antfgeno de la invencion.

[0076] Algunos anticuerpos de origen natural, tales como los encontrados en camellos y llamas, son dfmeros que consisten en dos cadenas pesadas y no incluyen cadenas ligeras. La invencion abarca anticuerpos dimericos de dos cadenas pesadas, o fragmentos de los mismos, que pueden unirse a OSMR.

[0077] Las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras tipicamente exhiben la misma estructura general de regiones marco relativamente conservadas (FR) unidas por tres regiones hipervariables, es decir, regiones determinantes de complementariedad o CDR. Las CDR son las principales responsables del reconocimiento y la union del antfgeno. Las CDR de las dos cadenas de cada par estan alineadas por las regiones marco, permitiendo la union a un epitope espedfico. Desde el extremo N al terminal C, tanto las cadenas ligeras como las pesadas comprenden los dominios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. La asignacion de aminoacidos a cada dominio esta de acuerdo con las definiciones de Kabat.

[0078] Las CDR constituyen los principales puntos de contacto de la superficie para la union al antfgeno. La CDR3 o la cadena ligera y, en particular, la CDR3 de la cadena pesada pueden constituir los determinantes mas importantes en la union del antfgeno dentro de las regiones variables de la cadena ligera y pesada. En algunos anticuerpos, la CDR3 de cadena pesada parece constituir el area principal de contacto entre el antfgeno y el anticuerpo. Los esquemas de seleccion in vitro en los que se vana cDR3 solo se pueden usar para variar las propiedades de union de un anticuerpo o determinar que residuos contribuyen a la union de un antfgeno.

[0079] Los anticuerpos de origen natural incluyen tfpicamente una secuencia senal, que dirige el anticuerpo en la via celular para la secrecion de protemas y que normalmente no esta presente en el anticuerpo maduro. Un polinucleotido que codifica un anticuerpo de la invencion puede codificar una secuencia de senal natural o una secuencia de senal heterologa como se describe a continuacion.

[0080] En una realizacion, la protema de union a antfgeno es un anticuerpo que comprende de una a seis de las CDRs de ejemplo descritas en el presente documento. Los anticuerpos de la invencion pueden ser de cualquier tipo, incluyendo IgM, IgG (incluyendo anticuerpos IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgD, IgA o IgE. En una realizacion espedfica, la protema de union a antfgeno es un anticuerpo de tipo IgG, por ejemplo, un anticuerpo IgG1.

[0081] En algunas realizaciones, por ejemplo cuando la protema de union a antfgeno es un anticuerpo con cadenas pesadas y ligeras completas, las CDRs son todas de la misma especie, por ejemplo, humana. Alternativamente, por ejemplo, en realizaciones en las que la protema de union a antfgeno contiene menos de seis CDR de las secuencias descritas anteriormente, las CDR adicionales pueden ser de otras especies o pueden ser CDR humanas diferentes de las representadas en las secuencias ejemplares. Por ejemplo, las regiones HCDR3 y LCDR3 de las secuencias apropiadas identificadas en el presente documento pueden usarse con HCDR1, HCDR2, LCDR1 y LCDR2 que se seleccionan opcionalmente de especies alternativas o diferentes secuencias de anticuerpos humanos, o combinaciones de los mismos. Por ejemplo, las CDR de la invencion pueden reemplazar las regiones CDR de anticuerpos quimericos o humanizados comercialmente relevantes.

[0082] Las realizaciones espedficas utilizan componentes de andamio de las protemas que son componentes humanos de union a antfgeno. En algunas realizaciones, sin embargo, los componentes del andamio pueden ser una mezcla de diferentes especies. Como tal, si la protema de union a antfgeno es un anticuerpo, dicho anticuerpo puede ser un anticuerpo quimerico y/o un anticuerpo humanizado. En general, tanto "anticuerpos quimericos" como anticuerpos humanizados "se refieren a anticuerpos que combinan regiones de mas de una especie. Por ejemplo, "anticuerpos quimericos" tradicionalmente comprenden regiones variables de un raton (o rata, en algunos casos) y la(s) region(es) constante(s) de un humano.

[0083] "Anticuerpos humanizados" generalmente se refieren a anticuerpos no humanos que han intercambiado las regiones marco de dominio variable por secuencias encontradas en anticuerpos humanos. En general, en un anticuerpo humanizado, el anticuerpo completo, excepto una o mas CDR, esta codificado por un polinucleotido de origen humano o es identico a dicho anticuerpo, excepto dentro de una o mas CDR. Las CDR, algunas o todas codificadas por acidos nucleicos que se originan en un organismo no humano, se injertan en el marco de la lamina beta de una region variable de anticuerpo humano para crear un anticuerpo, cuya especificidad esta determinada por las CDR injertadas. La creacion de tales anticuerpos se describe, por ejemplo, en WO 92/11018, Jones 1986,

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Nature 321: 522-525, Verhoeyen et al., 1988, Science 239: 1534-1536. Los anticuerpos humanizados tambien se pueden generar utilizando ratones con un sistema inmune creado por ingeniena genetica (Roque et al., 2004, Biotechnol. Prog. 20: 639-654). En las realizaciones ejemplares descritas en el presente documento, las CDR identificadas son humanas, y por tanto los anticuerpos tanto humanizados como quimericos en este contexto incluyen algunas CDR no humanas; por ejemplo, se pueden generar anticuerpos humanizados que comprenden las regiones HCDR3 y LCDR3, con una o mas de las otras regiones CDR que son de un origen de especie diferente.

[0084] En una realizacion, la protema de union a antfgeno OSMR es un anticuerpo multiespedfico, y en particular un anticuerpo bioespedfico, tambien denominado a veces como "diacuerpos". Estos son anticuerpos que se unen a dos o mas antfgenos diferentes o epitopes diferentes en un solo antfgeno. En ciertas realizaciones, un anticuerpo biespedfico se une a OSMR y un antfgeno en una celula efectora humana (por ejemplo, una celula T). Dichos anticuerpos son utiles para dirigir una respuesta de celulas efectoras contra celulas que expresan OSMR, tales como una celula tumoral que expresa OSMR. En realizaciones preferidas, el antfgeno de celulas efectoras humanas es CD3. Patente de EE.UU. N° 7.235.641. Los metodos para producir anticuerpos biespedficos son conocidos en la tecnica. Uno de estos metodos involucra la ingeniena de la porcion Fc de las cadenas pesadas para crear "mandos" y "orificios" que facilitan la formacion de heterodfmeros de las cadenas pesadas cuando se expresan conjuntamente en una celula. US 7.695.963. Otro metodo tambien involucra la ingeniena de la parte Fc de la cadena pesada, pero utiliza la direccion electrostatica para fomentar la formacion de heterodfmeros al tiempo que desalienta la formacion de las cadenas pesadas cuando se coexpresa en una celula. WO 09/089.004.

[0085] En una realizacion, La protema de union a antfgeno OSMR de union es un minicuerpo. Los minicuerpos son protemas similares a anticuerpos minimizadas que comprenden un scFv unido a un dominio CH3 (Hu et al., 1996, Cancer Res. 56: 3055-3061).

[0086] En una realizacion, la protema de union a antfgeno OSMR de union es un anticuerpo de dominio; vease, por ejemplo, la patente de EE.UU. n° 6.248.516. Los anticuerpos de dominio (dAbs) son dominios de union funcional de anticuerpos, correspondientes a las regiones variables de las cadenas pesada (VH) o ligera (VL) de anticuerpos humanos. Los dAB tienen un peso molecular de aproximadamente 13 kDa, o menos de una decima parte del tamano de un anticuerpo completo. Los dAB se expresan bien en una variedad de hospedadores que incluyen sistemas de celulas bacterianas, de levadura y de mamfferos. Ademas, los dAb son altamente estables y retienen la actividad incluso despues de ser sometidos a condiciones severas, como la liofilizacion o la desnaturalizacion por calor. Vease, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos 6.291.158; 6.582.915; 6.593.081; 6.172.197; Numero de serie de Estados Unidos 2004/0110941; Patente europea 0368684; Patente de Estados Unidos 6.696.245, WO04/058821, WO04/003019 y WO03/002609.

[0087] En una realizacion, La protema de union a antfgeno OSMR de union es un fragmento de anticuerpo, que es un fragmento de cualquiera de los anticuerpos descritos en este documento que retienen la especificidad de union a OSMR. En diversas realizaciones, las protemas de union al anticuerpo comprenden, pero no se limitan a, fragmentos F(ab), F(ab'), F(ab')2, Fv o Fv de una sola cadena. Como irnnimo, un anticuerpo, como se entiende en este documento, comprende un polipeptido que puede unirse espedficamente a OSMR que comprende la totalidad o parte de una region variable de cadena ligera o pesada, tal como una o mas CDR.

[0088] Otros ejemplos de fragmentos de anticuerpos de union OSMR incluyen, pero no se limitan a, (i) el fragmento Fab que consiste en dominios VL, VH, CL y CHI, (ii) el fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CHI, (iii) el fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un unico anticuerpo; (iv) el fragmento dAb (Ward et al., 1989, Nature 341: 544-546) que consiste en una sola variable, (v) regiones CDR aisladas, (vi) fragmentos F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados (vii) moleculas Fv de una sola cadena (scFv), en donde un dominio VH y un dominio VL estan vinculados por un enlazador peptfdico que permite que los dos dominios se asocien para formar un sitio de union a antfgeno (Bird et al., 1988, Science 242: 423-426, Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 85: 5879-5883), (viii) dfmeros Fv de cadena sencilla biespedficos (PCT/US92/09965) y (ix) "diacuerpos” o “triacuerpos", fragmentos multivalentes o multiespedficos construidos por fusion genica (Tomlinson et al., 2000, Methods Enzymol. 326: 461-479; WO94/13804; Holliger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 90: 6444-6448). Los fragmentos de anticuerpos pueden ser modificados. Por ejemplo, las moleculas pueden estabilizarse mediante la incorporacion de puentes disulfuro que unen los dominios VH y VL (Reiter et al., 1996, Nature Biotech. 14: 1239-1245). Los aspectos de la invencion incluyen realizaciones en las que los componentes no CDR de estos fragmentos son secuencias humanas.

[0089] En una realizacion, la protema de union a antfgeno OSMR es un anticuerpo completamente humano. En esta realizacion, tal como se describe anteriormente, las estructuras espedficas comprenden cadenas pesadas y ligeras completas representadas que comprenden las regiones CDR. Realizaciones adicionales utilizan una o mas de las CDR de la invencion, con las otras CDR, regiones marco, regiones J y D, regiones constantes, etc., procedentes de otros anticuerpos humanos. Por ejemplo, las CDR de la invencion pueden reemplazar a las CDR de cualquier numero de anticuerpos humanos, particularmente anticuerpos comercialmente relevantes.

[0090] Los anticuerpos de cadena unica pueden formarse mediante la vinculacion de cadena pesada y ligera de fragmentos de dominio variable (region Fv) a traves de un puente de aminoacidos (peptido enlazador corto),

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resultando en una unica cadena de polipeptido. Tales Fv de cadena sencilla (scFv) se han preparado mediante la fusion de ADN que codifica un enlazador peptfdico entre los ADN que codifican los dos polipeptidos de dominio variable (Vl y Vh). Los polipeptidos resultantes pueden plegarse sobre s^ mismos para formar monomeros de union a antfgeno, o pueden formar multimeros (por ejemplo, d^eros, tnmeros o tetrameros), dependiendo de la longitud de un enlazador flexible entre los dos dominios variables (Kortt et al. 1997, Prot. Eng. 10: 423; Kortt et al., 2001, Biomol. Eng. 18: 95-108). Al combinar diferentes polipeptidos que comprenden Vl y Vh, se pueden formar scFv multimericos que se unen a diferentes epttopos (Kriangkum et al., 2001, Biomol. Eng. 18: 31-40). Las tecnicas desarrolladas para la produccion de anticuerpos de cadena unica incluyen las descritas en la Patente de EE.UU. n° 4.946.778; Bird, 1988, Science 242: 423; Huston y otros, 1988, Proc. Natl Acad Sci. EE.UU. 85: 5879; Ward et al., 1989, Nature 334: 544, de Graaf et al., 2002, Methods Mol Biol. 178: 379-87. Anticuerpos de cadena unica derivados de los anticuerpos proporcionados en el presente documento (incluidos, entre otros, scFv que comprenden las combinaciones de dominios variables de Ab1 LCv/Ab1 HCv (SEQ ID NO:27/SEQ ID NO:9), Ab2 LCv/Ab2 HCv (SEQ ID NO:28/SEQ ID NO: 10), y Ab3 LCv/Ab3 HCv (SEQ ID NO:29/SEQ ID NO:11), y sus combinaciones estan abarcadas por la presente divulgacion. Los anticuerpos de cadena unica ejemplares incluyen las siguientes combinaciones de dominio variable: SEQ ID NO:27/SEQ ID NO:53 y SEQ ID NO:28/SEQ ID NO:54.

[0091] En una realizacion, La protema de union a antigeno OSMR de union es una protema de fusion de anticuerpo (a veces denominado en este documento como un "conjugado de anticuerpo"). El companero conjugado puede ser proteinaceo o no proteico; esta ultima se genera generalmente usando grupos funcionales en la protema de union al antfgeno y en el companero conjugado. En ciertas realizaciones, el anticuerpo se conjuga con un producto qmmico no proteico (farmaco) para formar un conjugado farmacologico de anticuerpo.

[0092] En una realizacion, la protema de union a antfgeno OSMR es un analogo de anticuerpo, a veces denominado "anticuerpos sinteticos." Por ejemplo, una variedad de trabajos utilizan andamios alternativos de protemas o andamios artificiales con CDR injertadas. Tales andamiajes incluyen, pero no se limitan a, mutaciones introducidas para estabilizar la estructura tridimensional de la protema de union, asf como andamios totalmente sinteticos que consisten, por ejemplo, en polfmeros biocompatibles. Vease, por ejemplo, Korndorfer et al., 2003, Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics, Volume 53, Issue 1: 121-129. Roque et al., 2004, Biotechnol. Prog. 20: 639654. Ademas, se pueden utilizar los mimeticos de anticuerpos peptfdicos ("PAM"), asf como el trabajo basado en mimeticos de anticuerpos que utilizan componentes de fibroneccion como un andamio.

[0093] Por "protema", como se usa en el presente documento, se entiende al menos dos aminoacidos unidos covalentemente, que incluyen protemas, polipeptidos, oligopeptidos y peptidos. En algunas realizaciones, los dos o mas aminoacidos unidos covalentemente estan unidos por un enlace peptfdico. La protema puede estar formada por aminoacidos naturales y enlaces peptfdicos, por ejemplo, cuando la protema se elabora de forma recombinante utilizando sistemas de expresion y celulas huesped, como se describe a continuacion. Alternativamente, la protema puede incluir aminoacidos sinteticos (por ejemplo, homofenilalanina, citrulina, ornitina y norleucina), o estructuras peptidomimeticas, es decir, "analogos de peptidos o protemas", tales como peptoides (vease, Simon et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 89: 9367), que puede ser resistente a las proteasas u otras condiciones fisiologicas y/o de almacenamiento. Dichos aminoacidos sinteticos pueden incorporarse en particular cuando la protema de union a antfgeno se sintetiza in vitro mediante metodos convencionales bien conocidos en la tecnica. Ademas, se puede usar cualquier combinacion de estructuras/residuos peptidomimeticos, sinteticos y naturales. "Aminoacido" tambien incluye residuos de iminoacidos tales como prolina e hidroxiprolina. El aminoacido "grupo R" o "cadena lateral" puede estar en la configuracion (L) o en la configuracion (S). En una realizacion espedfica, los aminoacidos estan en la configuracion (L) o (S).

[0094] En ciertos aspectos, la invencion proporciona protemas de union a antfgeno recombinante, en donde la protema de union a antfgeno es un anticuerpo, que une OSMR y, en algunas realizaciones, una OSMR humana recombinante o porcion de la misma. En este contexto, una "protema recombinante" es una protema elaborada utilizando tecnicas recombinantes que utilizan cualquier tecnica y metodo conocido en la tecnica, es decir, a traves de la expresion de un acido nucleico recombinante como se describe en el presente documento. Los metodos y tecnicas para la produccion de protemas recombinantes son bien conocidos en la tecnica. Las realizaciones de la invencion incluyen protemas de union a antfgeno recombinantes, en las que la protema de union a antfgeno es un anticuerpo, que se une a OSMR de tipo salvaje y variantes del mismo.

[0095] "Que consiste esencialmente en" significa que la secuencia de aminoacidos puede variar de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, o 15% con respecto a la secuencia recitada SEQ ID NO:y todavfa retienen la actividad biologica, como se describe en la presente memoria.

[0096] En algunas realizaciones, las protemas de la divulgacion de union al antfgeno son protemas aisladas o sustancialmente protemas puras. Una protema "aislada" no esta acompanada por al menos parte del material con el que normalmente se asocia en su estado natural, por ejemplo, constituye al menos aproximadamente el 5%, o al menos aproximadamente el 50% en peso de la protema total en una muestra dada. Se entiende que la protema aislada puede constituir del 5 al 99,9% en peso del contenido total de protemas, dependiendo de las circunstancias. Por ejemplo, la protema se puede preparar a una concentracion significativamente mayor mediante el uso de un promotor inducible o un promotor de alta expresion, de manera que la protema se elabora en niveles de

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concentracion incrementados. La definicion incluye la produccion de una protema de union a antfgeno en una amplia variedad de organismos y/o celulas huesped que se conocen en la tecnica.

[0097] Para las secuencias de aminoacidos, identidad de secuencia y/o similitud se determina mediante el uso de tecnicas estandar conocidas en la tecnica, incluyendo, pero no limitado al algoritmo de identidad de secuencia local de Smith y Waterman, 1981, Adv. Apl. Mates. 2: 482, el algoritmo de alineamiento de identidad de secuencia de Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443, el metodo de busqueda de similitud de Pearson y Lipman, 1988, Proc. Nat. Acad Sci. EE.UU. 85: 2444, implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin), el programa de secuencia Best Fit descrito por Devereux et al., 1984, Nucl. Acid Res. 12: 387395, preferiblemente usando la configuracion predeterminada, o por inspeccion. Preferiblemente, el porcentaje de identidad se calcula mediante FastDB en base a los siguientes parametros: penalizacion de falta de coincidencia de 1; penalizacion de hueco de 1; penalizacion por tamano de hueco de 0,33; y una penalizacion de union de 30, "Current Methods in Sequence Comparison and Analysis ", Macromolecule Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications, pp 127-149 (1988), Alan R. Liss, Inc.

[0098] Un ejemplo de un algoritmo util es PILEUP. PILEUP crea una alineacion de secuencias multiples a partir de un grupo de secuencias relacionadas que utilizan alineaciones progresivas, por pares. Tambien puede trazar un arbol que muestra las relaciones de agrupamiento usadas para crear la alineacion. PILEUP utiliza una simplificacion del metodo de alineacion progresiva de Feng & Doolittle, 1987, J. Mol. Evol. 35: 351-360; el metodo es similar al descrito por Higgins y Sharp, 1989, CABIOS 5: 151-153. Parametros utiles de PILEUP que incluyen un peso de espacio predeterminado de 3,00, un peso de longitud de espacio predeterminado de 0,10 y espacios finales ponderados.

[0099] Otro ejemplo de un algoritmo util es el algoritmo BLAST, descrito en: Altschul et al, 1990, J. Mol.. Biol. 215: 403-410; Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402; y Karin et al., 1993, Proc. Natl Acad Sci. EE.UU. 90: 5873-5787. Un programa BLAST particularmente util es el programa WU-BLAST-2 que se obtuvo de Altschul et al., 1996, Methods in Enzymology 266: 460-480. WU-BLAST-2 usa varios parametros de busqueda, la mayona de los cuales estan configurados en los valores predeterminados. Los parametros ajustables se configuran con los siguientes valores: intervalo de superposicion = 1, fraccion de superposicion = 0,125, umbral de palabra (T) = II. Los parametros HSP S y HSP S2 son valores dinamicos y los establece el propio programa dependiendo de la composicion de la secuencia particular y la composicion de la base de datos en particular en la que se busca la secuencia de interes; sin embargo, los valores pueden ser ajustados para aumentar la sensibilidad.

[0100] Un algoritmo util adicional es el BLAST con huecos, segun lo informado por Altschul et al., 1993, Nucl. Acidos Res. 25: 3389-3402. BLAST con gap usa puntuaciones de sustitucion BLOSUM-62; parametro umbral T establecido en 9; el metodo de dos aciertos para desencadenar extensiones sin espacios, cobra longitudes de brecha de k un costo de 10+k; Xu se establece en 16 y Xg se establece en 40 para la etapa de busqueda de la base de datos y en 67 para la etapa de salida de los algoritmos. Las alineaciones con espacios se activan mediante una puntuacion correspondiente a aproximadamente 22 bits.

[0101] En general, la homologfa de aminoacidos, la similitud o la identidad entre las CDR variantes individuales son al menos el 80% de las secuencias representadas en el presente documento, y mas tfpicamente con homologfas o identidades cada vez mas preferidas de al menos el 85%, 90%, 91%. 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% y casi el 100%. De manera similar, el "porcentaje de identidad de secuencia de acido nucleico (%) con respecto a la secuencia de acido nucleico de las protemas de union identificadas en este documento se define como el porcentaje de residuos de nucleotidos en una secuencia candidata que son identicos a los residuos de nucleotidos en la secuencia de codificacion de la protema de union al antfgeno. Un metodo espedfico utiliza el modulo BLASTN de WU-BLAST-2 establecido en los parametros predeterminados, con el intervalo de superposicion y la fraccion de solapamiento establecidos en 1 y 0,125, respectivamente.

[0102] En general, la secuencia de acido nucleico de homologfa, similitud o identidad entre las secuencias de nucleotidos codificando CDR variantes individuales y las secuencias de nucleotidos representadas en el presente documento son al menos 80%, y mas tfpicamente con homologfas preferiblemente crecientes o identidades de al menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99%, y casi el 100%.

[0103] Por lo tanto, una "variante CDR" es una con la homologfa especificada, similitud o identidad a la CDR padre de la invencion, y comparte funcion biologica, incluyendo, pero no limitado a, al menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o el 99% de la especificidad y/o actividad de la CDR principal.

[0104] Mientras que el sitio o region para introducir una variacion de secuencia de aminoacidos esta predeterminado, la mutacion per se no necesita estar predeterminada. Por ejemplo, con el fin de optimizar el rendimiento de una mutacion en un sitio dado, se puede llevar a cabo una mutagenesis aleatoria en el codon o region diana y las variantes de CDR de la protema de union al antfgeno expresadas pueden analizarse para la

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combinacion optima de actividad deseada. Las tecnicas para realizar mutaciones de sustitucion en sitios predeterminados en el ADN que tiene una secuencia conocida son bien conocidas, por ejemplo, mutagenesis del cebador M13 y mutagenesis por PCR. La seleccion de los mutantes se realiza mediante ensayos de las actividades de la protema de union al antigeno, como la union a OSMR.

[0105] Las sustituciones de aminoacidos son tipicamente de residuos individuales; las inserciones generalmente seran del orden de aproximadamente uno (1) a aproximadamente veinte (20) residuos de aminoacidos, aunque se pueden tolerar inserciones considerablemente mas grandes. Las eliminaciones vanan de aproximadamente uno (1) a aproximadamente veinte (20) residuos de aminoacidos, aunque en algunos casos las eliminaciones pueden ser mucho mas grandes.

[0106] Las sustituciones, eliminaciones, inserciones o cualquier combinacion de las mismas se pueden usar para llegar a un derivado o variante final. Generalmente, estos cambios se realizan en unos pocos aminoacidos para minimizar la alteracion de la molecula, particularmente la inmunogenicidad y especificidad de la protema de union al antigeno. Sin embargo, cambios mayores pueden ser tolerados en ciertas circunstancias. Las sustituciones conservativas generalmente se realizan de acuerdo con la siguiente tabla que se muestra en la Tabla 3.

Tabla 3

Residuo Original: Sustituciones ejemplares

Ala: Ser

Arg: Lys

Asn: Gln, His

Asp: Glu

Cys: Ser

Gln: Asn

Glu: Asp

Gly: Pro

His: Asn, Gln

Ile: Leu, Val

Leu: Ile, Val

Lys: Arg, Gln, Glu

Met: Leu, Ile

Phe: Met, Leu, Tyr

Ser: Thr

Thr: Ser

Trp: Tyr

Tyr: Trp, Phe

Val: Ile, Leu

[0107] Los cambios sustanciales en la funcion o identidad inmunologica se realizan seleccionando sustituciones que son menos conservadoras que las que se muestran en la Tabla 3. Por ejemplo, pueden hacerse sustituciones que afectan mas significativamente: la estructura del esqueleto del polipeptido en el area de la alteracion, por ejemplo la estructura alfa-helicoidal o de hoja beta; la carga o hidrofobicidad de la molecula en el sitio diana; o la mayor parte de la cadena lateral. Las sustituciones que en general se espera que produzcan los mayores cambios en las propiedades del polipeptido son aquellas en las que (a) un residuo hidrofflico, por ejemplo, serilo o treonilo, se sustituye por un residuo hidrofobico, por ejemplo, leucilo, isoleucilo, fenilalanilo, valilo o alanilo; (b) una cistema o prolina se sustituye por cualquier otro residuo; (c) un residuo que tiene una cadena lateral electropositiva, por ejemplo, lisilo, arginilo o histidilo, se sustituye por un residuo electronegativo, por ejemplo, glutamilo o aspartilo; o (d) un residuo que tiene una cadena lateral voluminosa, por ejemplo, fenilalanina, se sustituye por uno que no tiene una cadena lateral, por ejemplo, glicina.

[0108] Las variantes exhiben tfpicamente la misma actividad biologica cualitativa y provocaran la misma respuesta inmune que el analogo de origen natural, aunque las variantes tambien se seleccionan para modificar las caractensticas de las protemas de la protema de union segun sea necesario antfgeno. Alternativamente, la variante puede disenarse de manera que se altera la actividad biologica de la protema de union al antfgeno. Por ejemplo, los sitios de glicosilacion pueden alterarse o eliminarse como se explica en el presente documento.

[0109] Otros derivados de anticuerpos OSMR dentro del alcance de esta invencion incluyen conjugados covalentes o agregativos de anticuerpos OSMR, o sus fragmentos, con otras protemas o polipeptidos, tales como mediante la expresion de protemas de fusion recombinantes que comprenden polipeptidos heterologos fusionados al termino N o al termino C de un polipeptido de anticuerpo OSMr. Por ejemplo, el peptido conjugado puede ser un polipeptido de senal heterologa (o lfder), por ejemplo, el lfder del factor alfa de la levadura, o un peptido tal como una etiqueta de epftopo. Las protemas de fusion que contienen anticuerpos OSMR pueden comprender peptidos anadidos para facilitar la purificacion o identificacion del anticuerpo OSMR (por ejemplo, poli-His). Un polipeptido de anticuerpo OSMR tambien se puede unir al peptido FLAG como se describe en Hopp et al., Bio/Technology 6: 1204, 1988, y en

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la patente de EE.UU. 5.011.912. El peptido FLAG es altamente antigenico y proporciona un epttopo unido de manera reversible por un anticuerpo monoclonal espedfico (mAb), que permite un ensayo rapido y una purificacion facil de la protema recombinante expresada. Los reactivos utiles para preparar protemas de fusion en los que el peptido FLAG se fusiona con un polipeptido dado estan disponibles comercialmente (Sigma, St. Louis, MO).

[0110] En una realizacion, un oligomero se prepara utilizando polipeptidos derivados de inmunoglobulinas. La preparacion de protemas de fusion que comprenden ciertos polipeptidos heterologos fusionados a varias porciones de polipeptidos derivados de anticuerpos (incluido el dominio Fc) se ha descrito, por ejemplo, por Ashkenazi et al., 1991, PNAS EE.UU. 88: 10535; Byrn et al., 1990, Nature 344: 677; y Hollenbaugh et al., 1992 "Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins", en Current Protocols in Immunology, Suppl. 4, paginas 10.19.1 -10.19.11.

[0111] Una realizacion de la presente dislcosure esta dirigida a un dfmero que comprende dos protemas de fusion creadas fusionando un fragmento de union de OSMR de un anticuerpo OSMR a la region Fc de un anticuerpo. El dfmero puede ser hecho, por ejemplo, mediante la insercion de una fusion genica que codifica la protema de fusion en un vector de expresion apropiado, expresando la fusion genica en celulas huesped transformadas con el vector de expresion recombinante, y permitiendo que la protema de fusion expresada se junte de manera muy similar a las moleculas de anticuerpos, con lo cual se forman enlaces de disulfuro entre cadenas entre restos Fc para dar el dfmero.

[0112] El termino "polipeptido Fc" como se usa en este documento incluye formas nativas y de mutema de los polipeptidos derivados de la region Fc de un anticuerpo. Tambien se incluyen formas truncadas de tales polipeptidos que contienen la region bisagra que promueve la dimerizacion. Las protemas de fusion que comprenden restos Fc (y oligomeros formados a partir de ellos) ofrecen la ventaja de una purificacion facil mediante cromatograffa de afinidad sobre columnas de Protema A o Protema G.

[0113] Un polipeptido Fc adecuado, descrito en la solicitud PCT WO 93/10151, es un polipeptido de cadena sencilla que se extiende desde la region bisagra N-terminal al C-terminal nativo de la region Fc de un anticuerpo IgG humano. Otro polipeptido de Fc util es la mutema de Fc descrita en la patente de EE.UU. 5.457.035 y en Baum et al., 1994, EMBO J. 13: 3992-4001. La secuencia de aminoacidos de esta mutema es identica a la de la secuencia Fc nativa presentada en el documento WO 93/10151, excepto que el aminoacido 19 se ha cambiado de Leu a Ala, el aminoacido 20 se ha cambiado de Leu a Glu, y el aminoacido 22 se ha cambiado de Gly a Ala. La mutema muestra una afinidad reducida por los receptores Fc.

[0114] En otras realizaciones, la porcion variable de las cadenas pesada y/o ligera de un anticuerpo OSMR se puede sustituir por la porcion variable de una cadena pesada y/o ligera de anticuerpo.

[0115] Otro metodo para preparar derivados de anticuerpos OSMR oligomericos implica el uso de una cremallera de leucina. Los dominios de cremallera de leucina son peptidos que promueven la oligomerizacion de las protemas en las que se encuentran. Las cremalleras de leucina se identificaron originalmente en varias protemas de union al ADN (Landschulz et al., Science 240: 1759-64, 1988), y desde entonces se han encontrado en una variedad de protemas diferentes. Entre las cremalleras de leucina conocidas se encuentran los peptidos naturales y sus derivados que dimerizan o trimerizan. Ejemplos de dominios de cremallera de leucina adecuados para producir protemas oligericas solubles se describen en la solicitud PCT WO 94/10308, y la cremallera de leucina derivada de la protema D del surfactante de pulmon (SPD) descrita en Hoppe et al., 1994, FEBS Letters 344: 191. El uso de una cremallera de leucina modificada que permite la trimerizacion estable de una protema heterologa fusionada a la misma se describe en Fanslow et al., 1994, Semin. Immunol. 6: 267-78. En un enfoque, las protemas de fusion recombinantes que comprenden el fragmento de anticuerpo OSMR o el derivado fusionado con un peptido de cremallera de leucina se expresan en celulas hospedadoras adecuadas, y los fragmentos o derivados de anticuerpo OSMR oligomericos solubles que se forman se recuperan del sobrenadante del cultivo.

[0116] Las modificaciones covalentes de las protemas de union a antfgeno se incluyen dentro del alcance de esta invencion, y generalmente, pero no siempre, se realizan despues de la traduccion. Por ejemplo, varios tipos de modificaciones covalentes de la protema de union al antfgeno se introducen en la molecula haciendo reaccionar residuos de aminoacidos espedficos de la protema de union al antfgeno con un agente de derivatizacion organico que es capaz de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas o con los residuos terminales N o C.

[0117] Los residuos de cisteinilo se hacen reaccionar mas comunmente con a-haloacetatos (y las aminas correspondientes), tales como acido cloroacetico o cloroacetamida, para dar derivados de carboximetilo o carboxiamidometilo. Los residuos de cisteinilo tambien se derivan por reaccion con bromotrifluoroacetona, acido a- bromo p-(5-imidozoflo)propionico, fosfato de cloroacetilo, N-alquilmaleimidas, disulfuro de 3-nitro-2-piridilo, disulfuro de metilo 2-piridilo, p-clorhidrato de carbono, 2-cloromercuri-4-nitrofenol, o cloro-7-nitrobenzo -2-oxa-1,3-diazol.

[0118] Los residuos de histidilo se derivan por reaccion con dietilpirocarbonato a pH 5,5-7,0 porque este agente es relativamente espedfico para la cadena lateral de histidilo. El bromuro de para-bromofenacilo tambien es util; la reaccion se realiza preferiblemente en cacodilato de sodio 0,1 M a pH 6,0.

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[0119] Los residuos del terminal lisinilo y amino se hacen reaccionar con antudridos succmicos u otros antudridos de acido carbox^lico. La derivacion con estos agentes tiene el efecto de revertir la carga de los residuos lisinilo. Otros reactivos adecuados para derivar residuos que contienen alfa-amino incluyen imidoesteres tales como picolinimidato de metilo; fosfato de piridoxal; piridoxal; cloroborohidruro; acido trinitrobencenosulfonico; O-metilisourea; 2,4- pentanediona; y reaccion catalizada con transaminasa con glioxilato.

[0120] Los residuos de arginilo se modifican mediante reaccion con uno o varios reactivos convencionales, entre ellos fenilglioxal, 2,3-butanodiona, 1,2-ciclohexanodiona, y ninhidrina. La derivacion de residuos de arginina requiere que la reaccion se realice en condiciones alcalinas debido a la alta pKa del grupo funcional guanidina. Ademas, estos reactivos pueden reaccionar con los grupos de lisina y con el grupo arginina epsilon-amino.

[0121] La modificacion espedfica de los residuos de tirosilo puede realizarse, con interes particular en la introduccion de marcadores espectrales en los residuos de tirosilo por reaccion con compuestos de diazonio aromaticos o tetranitrometano. Mas comunmente, se usan N-acetilo-midizol y tetranitrometano para formar especies de tirosilo de O-acetilo y derivados de 3-nitro, respectivamente. Los residuos de tirosilo se yodan utilizando 125I o 131I para preparar protemas marcadas para su uso en radioinmunoensayo, siendo adecuado el metodo de cloramina T descrito anteriormente.

[0122] Los grupos laterales de carboxilo (aspartilo o glutamilo) se modifican selectivamente mediante reaccion con carbodiimidas (R'-N=C=N--R'), donde R y R' son, opcionalmente, grupos de alquilo diferentes, tales como 1- ciclohexilo-3-(2-morfolinilo-4-etilo) carbodiimida o 1-etilo-3-(4-azonia-4,4-dimetilpentilo) carbodiimida. Ademas, los residuos de aspartilo y glutamilo se convierten en residuos de asguinilo y glutaminilo por reaccion con iones de amonio.

[0123] La derivacion con agentes bifuncionales es util para reticular protemas de union a antfgeno a una matriz de

soporte insoluble en agua o superficie para uso en una variedad de metodos. Los agentes de reticulacion usados comunmente incluyen, por ejemplo, 1,1-bis(di-azoacetilo)-2-feniletano, glutaraldetudo, esteres de N-

hidroxisuccinimida, por ejemplo, esteres con acido 4-azidosalidlico, imidoesteres homobifuncionales, incluyendo esteres disucciniirndicos tales como 3,3'-ditiobis(succinimidilpropionato) y maleimidas bifuncionales tales como bis- N-maleimido-1,8-octano. Los agentes derivados como el metilo-3-[(p-azidofenilo)ditio]propioimidato producen intermedios fotoactivables que son capaces de formar enlaces cruzados en presencia de luz. Alternativamente, matrices reactivas insolubles en agua tales como carbohidratos activados con bromuro de cianogeno y los sustratos reactivos descritos en la patente de EE.UU. N° 3.969.287; 3.691.016; 4.195.128; 4.247.642; 4.229.537; y 4.330.440 se emplean para la inmovilizacion de protemas.

[0124] Los residuos de glutaminilo y asparaginilo se desmitifican con frecuencia a los residuos de glutamilo y aspartilo correspondientes, respectivamente. Alternativamente, estos residuos son desamidados en condiciones ligeramente acidas. Cualquiera de las formas de estos residuos cae dentro del alcance de esta invencion.

[0125] Otras modificaciones incluyen hidroxilacion de prolina y lisina, fosforilacion de grupos hidroxilo de residuos serilo o treonilo, metilacion de los grupos amino a de lisina, arginina y cadenas laterales de histidina (TE Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, WH Freeman & Co., San Francisco, 1983, pp. 79-86), acetilacion de la amina N-terminal y la amidacion de cualquier grupo carboxilo C-terminal.

[0126] Otro tipo de modificacion covalente de la protema de union a antfgeno incluida dentro del alcance de esta invencion comprende la alteracion del patron de glicosilacion de la protema. Como se conoce en la tecnica, los patrones de glicosilacion pueden depender tanto de la secuencia de la protema (por ejemplo, la presencia o ausencia de residuos de aminoacidos de glicosilacion particulares, como se discute mas adelante), o la celula u organismo huesped en el que se produce la protema. Sistemas de expresion particulares se discuten a continuacion.

[0127] La glicosilacion de polipeptidos esta tfpicamente ligada en N o ligada en O. Ligada en N se refiere a la union del resto de carbohidrato a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias de tri-peptidos asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, donde X es cualquier aminoacido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la union enzimatica del resto de carbohidrato a la cadena lateral de asparagina. Por lo tanto, la presencia de cualquiera de estas secuencias de tres peptidos en un polipeptido crea un sitio potencial de glicosilacion. La glicosilacion ligada a O se refiere a la union de uno de los azucares N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa, a un hidroxiaminoacido, mas comunmente serina o treonina, aunque tambien se puede usar 5- hidroxiprolina o 5-hidroxilisina.

[0128] La adicion de sitios de glicosilacion a la protema de union a antfgeno se realiza convenientemente alterando la secuencia de aminoacidos de modo que contenga una o mas de las secuencias de tri-peptidos descritas anteriormente (para los sitios de glicosilacion unidos a N). La alteracion tambien se puede hacer mediante la adicion o la sustitucion de uno o mas residuos de serina o treonina en la secuencia de inicio (para los sitios de glicosilacion unidos a O). Para mayor facilidad, la secuencia de aminoacidos de la protema de union a antfgeno se altera preferiblemente a traves de cambios en el nivel de ADN, particularmente mutando el ADN que codifica el polipeptido diana en bases preseleccionadas de manera que se generen codones que se traduciran en los aminoacidos

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[0129] Otros medios para aumentar el numero de grupos carbohidrato en la protema de union a antigeno es mediante acoplamiento qmmico o enzimatico de glicosidos a la protema. Estos procedimientos son ventajosos ya que no requieren la produccion de la protema en una celula huesped que tiene capacidades de glicosilacion para la glicosilacion ligada a N y O. Dependiendo del modo de acoplamiento utilizado, los azucares se pueden unir a (a) arginina e histidina, (b) grupos carboxilo libres, (c) grupos sulfhidrilo libres tales como los de cistema, (d) grupos hidroxilo libres tales como los de serina, treonina o hidroxiprolina, (e) residuos aromaticos como los de fenilalanina, tirosina o triptofano, o (f) el grupo amida de la glutamina. Estos metodos se describen en el documento WO 87/05330 publicado el 11 de septiembre de 1987 y en Aplin y Wriston, 1981, CRC Crit. Rev. Biochem., Pp. 259-306.

[0130] La eliminacion de restos de carbohidratos presentes en la protema de union al antfgeno de partida se puede realizar de manera qmmica o enzimatica. La desglicosilacion qmmica requiere la exposicion de la protema al compuesto acido trifluorometanosulfonico o un compuesto equivalente. Este tratamiento da como resultado la escision de la mayona o todos los azucares, excepto el azucar de enlace (N-acetilglucosamina o N- acetilgalactosamina), mientras se deja el polipeptido intacto. La desglicosilacion qmmica esta descrita por Hakimuddin et al., 1987, Arch. Biochem. Biofis 259: 52 y por Edge et al., 1981, Anal. Biochem. 118: 131. La escision enzimatica de restos de carbohidratos en polipeptidos se puede lograr mediante el uso de una variedad de endo y exo-glicosidasas como se describe por Thotakura et al., 1987, Meth. Enzymol. 138: 350. La glicosilacion en los sitios potenciales de glucosilacion se puede prevenir mediante el uso del compuesto tunicamicina como lo describen Duskin et al., 1982, J. Biol. Chem. 257: 3105. La tunicamicina bloquea la formacion de enlaces protema-N-glucosido.

[0131] Otro tipo de modificacion covalente de la protema de union a antfgeno comprende la union del antfgeno de la protema de union a diversos poftmeros no proteicos, incluyendo, pero no limitado a, diversos polioles tales como polietilenglicol, polipropilenglicol o polioxialquilenos, de la manera establecida en la patente de EE.UU. Nos 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 o 4.179.337. Ademas, como se conoce en la tecnica, las sustituciones de aminoacidos pueden realizarse en diversas posiciones dentro de la protema de union a antfgeno para facilitar la adicion de poftmeros tales como PEG.

[0132] En algunas realizaciones, la modificacion covalente de las protemas de la invencion de union a antfgeno comprende la adicion de una o mas etiquetas.

[0133] El termino "grupo de etiquetado" significa cualquier etiqueta detectable. Los ejemplos de grupos de etiquetado adecuados incluyen, entre otros, los siguientes: radioisotopos o radionuclidos (por ejemplo, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I), grupos fluorescentes (p. ej., FITC, rodamina, lantanidos fosforicos), grupos enzimaticos (p. ej., peroxidasa de rabano picante, p-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina), grupos quimioluminiscentes, grupos de biotinilo o epftopos polipeptfdicos predeterminados reconocidos por un reportero secundario (p. ej., cremallera de leucina) secuencias de pares, sitios de union para anticuerpos secundarios, dominios de union a metales, etiquetas de epftopo). En algunas realizaciones, el grupo de marcaje esta acoplado a la protema de union a antfgeno mediante brazos espaciadores de varias longitudes para reducir el potencial impedimento esterico. Se conocen diversos metodos para marcar protemas en la tecnica y se pueden usar para realizar la presente invencion.

[0134] En general, los marcadores se clasifican en una variedad de clases, segun el ensayo en el que se detectaran: a) marcadores isotopicos, que pueden ser isotopos radiactivos o pesados; b) etiquetas magneticas (por ejemplo, partfculas magneticas); c) restos activos redox; d) colorantes opticos; grupos enzimaticos (por ejemplo, peroxidasa de rabano picante, p-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina); e) grupos biotinilados; y f) epftopos de polipeptidos predeterminados reconocidos por un informador secundario (por ejemplo, secuencias de pares de cremalleras de leucina, sitios de union para anticuerpos secundarios, dominios de union a metales, etiquetas de epftopos, etc.). En algunas realizaciones, el grupo de marcaje esta acoplado a la protema de union a antfgeno mediante brazos espaciadores de varias longitudes para reducir el potencial impedimento esterico. Se conocen diversos metodos para marcar protemas en la tecnica y se pueden usar para realizar la presente invencion.

[0135] Etiquetas espedficas incluyen tintes opticos, incluyendo, pero no limitado a, cromoforos, fosforos y fluoroforos, siendo estos ultimos espedficos en muchos casos. Los fluoroforos pueden ser fluorescentes de "molecula pequena" o fluorescentes proteicos.

[0136] Por "etiqueta fluorescente" se entiende cualquier molecula que puede detectarse a traves de sus propiedades fluorescentes inherentes. Los marcadores fluorescentes adecuados incluyen, pero no se limitan a, fluorescema, rodamina, tetrametilrodamina, eosina, eritrosina, cumarina, metilo-cumarinas, pireno, malacita verde, estilbeno, Lucifer Yellow, Cascade BlueJ, Texas Red, IAEDANS, EDANS, BODIPY FL, LC Red 640, Cy 5, Cy 5.5, LC Red 705, Oregon Green, los colorantes Alexa-Fluor (Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633 Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680), Cascade Blue, Cascade Yellow y R- fierieririna (PE) (Molecular Probes, Eugene, OR), FITC, Rhodamine y Texas Red (Pierce, Rockford, IL), Cy5, Cy5.5, Cy7 (Amersham Life Science, Pittsburgh, PA). Los colorantes opticos adecuados, incluidos los fluoroforos, se describen en Molecular Probes Handbook de Richard P. Haugland.

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[0137] Marcadores fluorescentes protemicos adecuados tambien incluyen, pero no se limitan a, protema verde fluorescente, incluyendo Renilla, Ptilosarcus, o especies de Aequorea de GFP (Chalfie et al, 1994, Science 263: 802805), EGFP (Clontech Laboratorios, Inc., Numero de Acceso Genbank U55762), protema azul fluorescente (BFP, Quantum Biotechnologies, Inc. 1801 de Maisonneuve Blvd. West, 8° piso, Montreal, Quebec, Canada H3H 1J9; Stauber, 1998, Biotechniques 24: 462 -471; Heim et al., 1996, Curr. Biol. 6: 178-182), protema fluorescente amarilla mejorada (EYFP, Clontech Laboratories, Inc.), luciferasa (Ichiki et al., 1993, J. Immunol. 150: 5408-5417), p galactosidasa (Nolan et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 85: 2603-2607) y Renilla (WO92/15673, WO95/07463, WO98/14605, WO98/26277, WO99/49019, patentes de EE.UU. Nos 5292658, 5418155, 5683888, 5741668, 5777079, 5804387, 5874304, 5876995, 5925558).

[0138] Las protemas de union a antigeno ejemplares descritas en el presente documento tienen propiedades basadas en el epftopo distinto en OSMR enlazado por la protema de union a antigeno. El termino "epftopo" significa los aminoacidos de una molecula diana que se ponen en contacto con una protema de union a antfgeno, por ejemplo, un anticuerpo, cuando la protema de union a antigeno esta unida a la molecula diana. Un epftopo puede ser contiguo o no contiguo (por ejemplo, (i) en un polipeptido de cadena unica, los residuos de aminoacidos que no son contiguos entre sf en la secuencia del polipeptido pero que dentro del contexto de la molecula diana estan unidos por la protema de union a antigeno, o (ii) en un receptor multimerico que comprende dos o mas componentes individuales, por ejemplo, OSMR y gp130 o OSMR y el receptor A de IL-31, los residuos de aminoacidos estan presentes en uno o mas de los componentes individuales pero aun estan unidos por la protema de union al antigeno. Los determinantes del epftopo pueden incluir grupos de moleculas qmmicamente activas en la superficie, tales como aminoacidos, cadenas laterales de azucar, grupos fosforilo o sulfonilo, y pueden tener caractensticas estructurales tridimensionales espedficas y/o caractensticas de carga espedficas. Generalmente, protemas de union a antfgeno espedficas para una molecula diana particular reconoceran preferentemente un epftopo en la molecula diana en una mezcla compleja de protemas y/o macromoleculas.

[0139] Los metodos para caracterizar el epftopo unido por una protema de union a antfgeno son bien conocidos en la tecnica, incluidos, entre otros, binning (competicion cruzada) (Miller et al "Epitope binning of murine monoclonal antibodies by a multi- plexed pairing assay" J Immunol Methods (2011) 365, 118-25), mapeo de peptidos (p. ej., PEPSPOT™) (Albert et al "The B-cell Epitope of the Monoclonal Anti-Factor VIII Antibody ESH8 Characterized by Peptide Array Analysis" 2008 Thromb. Hemost. 99, 634-7), metodos de mutagenesis como quimeras (Song et al "Epitope Mapping of Ibalizumab, a Humanized Anti-CD4 Monoclonal Antibody with Anti-HIV-1 Activity in Infected Patients" J. Virol. (2010) 84, 6935-6942), escaneo de alanina (Cunningham and Wells "High-resolution epitope mapping of HGH-receptor interactions by alanine-scanning mutagenesis" Science (1989) 244, 1081-1085), escaneo de arginina (Lim et al "A diversity of antibody epitopes can induce signaling through the erythropoietin receptor" Biochemistry (2010) 49, 3797-3804), metodos de intercambio de HD (Coates et al "Epitope mapping by amide hydrogen/deuterium exchange coupled with immobilization of antibody, on-line proteolysis, liquid chromatography and mass spectrometry" Rapid Commun. Mass Spectrom. (2009) 23 639-647), metodos de saturacion cruzada de RMN (Morgan et al "Precise epitope mapping of malaria parasite inhibitory antibodies by TROSY NMR crosssaturation" Biochemistry (2005) 44, 518-23) y cristalograffa (Gerhardt et al "Structure of IL-17A in complex with a potent, fully human neutralizing antibody" J. Mol. Biol (2009) 394, 905-21). Los metodos vanan en el nivel de detalle que proporcionan en cuanto a los aminoacidos que comprenden el epftopo. El Ejemplo 4 proporciona un metodo ejemplar de agrupamiento de epftopos.

[0140] Las protemas de union al antfgeno de la presente divulgacion incluyen las que tienen un epftopo de solapamiento con una protema de union a antfgeno ejemplar descrito en el presente documento, por ejemplo, Ab1, Ab2, o Ab3. En ciertas realizaciones, la protema de union a antfgeno tiene un epftopo identico en cuanto a las protemas de union a antfgeno ejemplares. En otras realizaciones, la protema de union a antfgeno se une solo a un subconjunto de los mismos aminoacidos que la protema de union a antfgeno ejemplar.

[0141] En ciertas realizaciones, la protema de union a antfgeno OSMR tiene un epftopo identico o superposicion como Ab1, Ab2, o Ab3, y comprende a) un dominio variable de cadena ligera que tiene al menos 90% de identidad, una identidad de al menos el 95%, o es identica a la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, o SEQ ID NO:29; b) un dominio variable de cadena pesada que tiene al menos 90% de identidad, al menos 95% de identidad, o es identico a la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, o SEQ ID NO:11; o c) el dominio variable de la cadena ligera de a) y el dominio variable de la cadena pesada de b).

[0142] En ciertas realizaciones, la protema de union al antfgeno OSMR tiene un epitope identico o superpuesto como Ab1, Ab2 o Ab3, y comprende un dominio variable de cadena ligera que tiene al menos el 90%, al menos el 95%, o es identica al amino la secuencia acida expuesta en la SEQ ID NO:27 y un dominio variable de cadena pesada que tiene al menos el 90%, al menos el 95%, o es identica a la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID NO:9; aquellos que comprenden un dominio variable de cadena ligera que tiene al menos un 90%, al menos un 95%, o es identica a la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID nO:28 y un dominio variable de cadena pesada que tiene al menos un 90%, al menos un 95%, o es identica a la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID NO:10; y aquellos que comprenden un dominio variable de cadena ligera que tiene al menos 90%, al menos 95%, o es identica a la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID NO:29 y un dominio variable de cadena pesada que tiene al menos 90%, al menos 95%, o es identica a la secuencia de aminoacidos establecida en la SEQ

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ID NO:11.

[0143] En dertas realizaciones, la protema de union al antigeno OSMR tiene un epttopo identico o superpuesto como Ab1, Ab2 o Ab3, y comprende a) un dominio variable de cadena ligera que tiene no mas de diez o no mas de cinco adiciones, eliminaciones o sustituciones de aminoacidos de la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, o SEQ ID NO:29; b) un dominio variable de cadena pesada que tiene no mas de diez o no mas de cinco adiciones, eliminaciones o sustituciones de aminoacidos de la secuencia de aminoacidos establecida en la SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, o SEQ ID NO:11; o c) el dominio variable de la cadena ligera de a) y el dominio variable de la cadena pesada de b).

[0144] En ciertas realizaciones, la protema de union al antigeno OSMR tiene un epitope identico o superpuesto

como Ab1, Ab2 o Ab3, y comprende un dominio variable de cadena ligera que tiene no mas de diez o no mas de cinco adiciones, eliminaciones o sustituciones de aminoacidos de la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID NO:27 y un dominio variable de cadena pesada que no tiene mas de diez o no mas de cinco adiciones, eliminaciones o sustituciones de aminoacidos de la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID NO:9;

aquellos que comprenden un dominio variable de cadena ligera que tiene no mas de diez o no mas de cinco

adiciones, eliminaciones o sustituciones de aminoacidos de la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID NO:28 y un dominio variable de cadena pesada que no tiene mas de diez o no mas de cinco adiciones, eliminaciones o sustituciones de aminoacidos de la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID NO:10; y

adiciones, eliminaciones o sustituciones de aminoacidos de la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID NO:29 y un dominio variable de cadena pesada que no tiene mas de diez o no mas de cinco adiciones, eliminaciones o sustituciones de aminoacidos de la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID NO:11.

[0145] En ciertas realizaciones, la protema de union al antfgeno OSMR tiene un epttopo identico o superpuesto como Ab1, Ab2 o Ab3, y comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende a) un LCDR1 que no tiene mas de tres adiciones, eliminaciones o sustituciones de la secuencia LCDR1 expuesta en la SEQ ID NO:30; un LCDR2 que no tiene mas de tres adiciones, eliminaciones o sustituciones de aminoacidos de la secuencia de LCDR2 expuesta en la SEQ ID NO:33; y un LCDR3 que no tiene mas de tres adiciones, eliminaciones o sustituciones de aminoacidos de la secuencia LCDR3 expuesta en la SEQ ID NO:36; b) un LCDR1 que no tiene mas de tres adiciones, eliminaciones o sustituciones de aminoacidos de la secuencia LCDR1 expuesta en la SEQ ID NO:31; un LCDR2 que no tiene mas de tres adiciones, eliminaciones o sustituciones de aminoacidos de la secuencia LCDR2 expuesta en la SEQ ID NO:34; y un LCDR3 que no tiene mas de tres adiciones, eliminaciones o sustituciones de aminoacidos de la secuencia de LCDR3 expuesta en la SEQ ID NO:37; o c) un LCDR1 que no tiene mas de tres adiciones, eliminaciones o sustituciones de aminoacidos de la secuencia LCDR1 expuesta en la SEQ ID NO:32; un LCDR2 que no tiene mas de tres adiciones, eliminaciones o sustituciones de aminoacidos de la secuencia LCDR2 expuesta en la SEQ ID NO:35; y un LCDR3 que no tiene mas de tres adiciones, eliminaciones o sustituciones de aminoacidos de la secuencia LCDR3 expuesta en la SEQ ID NO:38; y un dominio variable de cadena pesada que comprende d) un HCDR1 que no tiene mas de tres adiciones, eliminaciones o sustituciones de aminoacidos de la secuencia HCDR1 indicada en la SEQ ID NO:12; un HCDR2 que no tiene mas de tres adiciones, eliminaciones o sustituciones de aminoacidos de la secuencia HCDR2 expuesta en la SEQ ID NO:15; y un HCDR3 que no tiene mas de tres adiciones, eliminaciones o sustituciones de aminoacidos de la secuencia HCDR3 expuesta en la SEQ ID NO:18; e) un HCDR1 que no tiene mas de tres adiciones, eliminaciones o sustituciones de aminoacidos de la secuencia HCDR1 expuesta en la SEQ ID NO:13; un HCDR2 que no tiene mas de tres adiciones, eliminaciones o sustituciones de aminoacidos de la secuencia HCDR2 expuesta en la SEQ ID NO:16; y un HCDR3 que no tiene mas de tres adiciones, eliminaciones o sustituciones de aminoacidos de la secuencia HCDR3 expuesta en la SEQ ID NO:19; o f) un HCDR1 que no tiene mas de tres adiciones, eliminaciones o sustituciones de aminoacidos de la secuencia HCDR1 expuesta en la SEQ ID NO:14; un HCDR2 que no tiene mas de tres adiciones, eliminaciones o sustituciones de aminoacidos de la secuencia HCDR2 expuesta en la SEQ ID NO:17; y un HCDR3 que no tiene mas de tres adiciones, eliminaciones o sustituciones de aminoacidos de la secuencia HCDR3 expuesta en la SEQ ID NO:20.

[0146] Protemas de union a antfgeno OSMR preferidas anteriormente descritas incluyen las que comprenden la cadena ligera del dominio variable de a) y la cadena pesada del dominio variable de d); aquellas que comprenden el dominio variable de cadena ligera de b) y el dominio variable de cadena pesada de e); y aquellas que comprenden el dominio variable de la cadena ligera de c) y el dominio variable de la cadena pesada de f).

Las protemas de union al antfgeno OSMR que comprenden el dominio variable de la cadena ligera de a) y el dominio variable de la cadena pesada de d) pueden opcionalmente contener un dominio variable de la cadena

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pesada que comprende un aminoacido distinto de la asparagina (por ejemplo, acido aspartico) en la posicion correspondiente a posicion 73 en SEQ ID NO:9. En tales realizaciones, el dominio variable de cadena pesada comprende opcionalmente la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID NO:53.

Las protemas de union al antigeno OSMR que comprenden el dominio variable de la cadena ligera de b) y el dominio variable de la cadena pesada de e) pueden contener opcionalmente un dominio variable de la cadena pesada que comprende un aminoacido distinto de la asparagina (por ejemplo, acido aspartico) en la posicion correspondiente a posicion 73 en SEQ ID NO:10. En tales realizaciones, el dominio variable de cadena pesada comprende opcionalmente la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID NO:54.

[0147] Las protemas de union a antigeno que tienen un eptiopo identico o eptiopo solapado a menudo competiran cruzadamente por la union al antigeno. Por lo tanto, en ciertas realizaciones, una protema de union a antigeno de la presente divulgacion compite de forma cruzada con Ab1, Ab2 o Ab3. "Competencia cruzada" o "competir cruzadamente" significa que las protemas de union a antigeno compiten por el mismo eptiopo o sitio de union en un objetivo. Dicha competencia se puede determinar mediante un ensayo en el que la protema de union al antigeno de referencia (por ejemplo, el anticuerpo o su porcion de union al antigeno) previene o inhibe la union espedfica de una protema de union al antigeno de prueba, y viceversa. Se pueden usar numerosos tipos de ensayos de union competitiva para determinar si una molecula de prueba compite con una molecula de referencia para la union. Los ejemplos de ensayos que pueden emplearse incluyen radioinmunoensayo directo o indirecto en fase solida (RIA), inmunoensayo enzimatico directo o indirecto en fase solida (EIA), ensayo de competicion en sandwich (vease, por ejemplo, Stahli et al. (1983) Methods in Enzymology 9: 242 -253), EIA de biotina-avidina directa en fase solida (vease, por ejemplo, Kirkland et al., (1986) J. Immunol. 137: 3614-9), ensayo marcado directo en fase solida, ensayo sandwich marcado directo en fase solida, Luminex (Jia et al. "A novel method of Multiplexed Competitive Antibody Binning for the characterization of monoclonal antibodies" J. Immunological Methods (2004) 288, 91-98) y resonancia de plasmon de superficie (Song et al. "Epitope Mapping of Ibalizumab, a Humanized Anti-CD4 Monoclonal Antibody with Anti-HIV-1 Activity in Infected Patients" J. Virol. (2010) 84, 6935-42). En el Ejemplo 5 se describe un metodo ejemplar para determinar la competencia cruzada. Generalmente, cuando una protema de union a antigeno competidor esta presente en exceso, inhibira la union de una protema de union a antigeno de referencia a un antigeno comun en al menos el 50%, 55%, 60%, 65%, 70% o 75%. En algunos casos, la union se inhibe en al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mas.

Polinucleotidos que codifican las protemas de union al antigeno OSMR

[0148] En la presente descripcion se incluyen acidos nucleicos o acidos nucleicos aislados que codifican protemas de union a antigeno OSMR, incluyendo anticuerpos, como se define en el presente documento. Los acidos nucleicos preferidos incluyen aquellos que codifican las cadenas ligeras y pesadas ejemplares descritas en el presente documento.

[0149] Un acido nucleico ejemplar que codifica Ab1 LC es un acido nucleico que comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO:21.

[0150] Un acido nucleico ejemplar que codifica Ab2 LC es un acido nucleico que comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO:22.

[0151] Un acido nucleico ejemplar que codifica Ab3 LC es un acido nucleico que comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO:23.

[0152] Un acido nucleico ejemplar que codifica Ab1 HC es un acido nucleico que comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO:3.

[0153] Un acido nucleico ejemplar que codifica Ab2 HC es un acido nucleico que comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO:4.

[0154] Un acido nucleico ejemplar que codifica Ab3 HC es un acido nucleico que comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO:5. Un ejemplo de acido nucleico que codifica una variante Ab1 Hc es un acido nucleico que comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO:47. Un ejemplo de acido nucleico que codifica una variante Ab2 HC es un acido nucleico que comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO:48. Un ejemplo de acido nucleico que codifica una variante Ab3 HC es un acido nucleico que comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO:49.

[0155] Los aspectos de la presente divulgacion incluyen variantes de polinucleotidos (por ejemplo, debido a la degeneracion) que codifican las secuencias de aminoacidos descritas en el presente documento.

[0156] Los aspectos de la presente divulgacion incluyen una variedad de realizaciones que incluyen, pero no se limitan a, las siguientes realizaciones ejemplares.

[0157] Un acido nucleico aislado que comprende un polinucleotido, en el que dicho polinucleotido codifica uno o mas polipeptidos que comprenden una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en:

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A.

1. una secuencia de dominio variable de cadena ligera que es al menos un 90% identica a una secuencia de dominio variable de cadena ligera establecida en la SEQ ID NO:27-29;

2. una secuencia de dominio variable de cadena pesada que es al menos un 90% identica a una secuencia de dominio variable de cadena pesada establecida en la SEQ ID NO:9-11;

3. un dominio variable de cadena ligera de (1) y un dominio variable de cadena pesada de (2);

B. un dominio variable de cadena ligera que comprende un CDR1, CDR2, CDR3 y/o un dominio variable de cadena pesada que comprende un CDR1, CDR2, CDR3 que son iguales o difieren en no mas de un total de tres adiciones, sustituciones y/o eliminaciones de aminoacidos en cada CDR de las siguientes secuencias:

1. una cadena ligera CDR1 (SEQ ID NO:30), CDR2 (SEQ ID NO:33), CDR3 (SEQ ID NO:36) o una cadena pesada CDR1 (SEQ ID NO:12), CDR2 (SEQ ID NO:15), CDR3 (SEQ ID NO:18) de Ab1;

2. una cadena ligera CDR1 (SEQ ID NO:31), CDR2 (SEQ ID NO:34), CDR3 (SEQ ID NO:37) o una cadena pesada CDR1 (SEQ ID NO:13), CDR2 (SEQ ID NO:16), CDR3 (SEQ ID NO:19) de Ab2; y

3. una cadena ligera CDR1 (SEQ ID NO:32), CDR2 (SEQ ID NO:35), CDR3 (SEQ ID NO:38) o una cadena pesada CDR1 (SEQ ID NO:14), CDR2 (SEQ ID NO:17), CDR3 (SEQ ID NO:20) de Ab3.

En algunas realizaciones, el acido nucleico codifica un polipeptido que comprende la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID NO:53 o la SEQ ID NO:54.

En algunas realizaciones, el acido nucleico codifica un polipeptido que comprende la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID NO:50, la SEQ ID NO:51 o la SEQ ID NO:52.

[0158] En realizaciones preferidas, el polipeptido codificado por el acido nucleico o el acido nucleico aislado es un componente de una protema de union a antfgeno que se une OSMR.

[0159] Las secuencias de nucleotidos correspondientes a las secuencias de aminoacidos descritas en el presente documento, para ser utilizadas como sondas o cebadores para el aislamiento de acidos nucleicos o como secuencias de consulta para busquedas en bases de datos, pueden obtenerse mediante una "traduccion inversa" de las secuencias de aminoacidos o por identificacion de regiones de identidad de aminoacidos con polipeptidos para los cuales se ha identificado la secuencia de ADN codificante. El procedimiento bien conocido de reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) se puede emplear para aislar y amplificar una secuencia de ADN que codifica protemas de union a antfgeno OSMR o una combinacion deseada de fragmentos de polipeptido de protema de union a antfgeno OSMR. Los oligonucleotidos que definen los terminos deseados de la combinacion de fragmentos de ADN se emplean como cebadores 5' y 3'. Los oligonucleotidos pueden contener adicionalmente sitios de reconocimiento para endonucleasas de restriccion, para facilitar la insercion de la combinacion amplificada de fragmentos de ADN en un vector de expresion. Las tecnicas de PCR se describen en Saiki et al., Science 239: 487 (1988); Metodologfa del ADN recombinante, Wu et al., Eds., Academic Press, Inc., San Diego (1989), pp. 189-196; y PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et. al., eds., Academic Press, Inc. (1990).

[0160] Las moleculas de acido nucleico de la invencion incluyen ADN y ARN tanto en forma de cadena unica como de doble cadena, asf como las correspondientes secuencias complementarias. El ADN incluye, por ejemplo, ADNc, ADN genomico, ADN sintetizado qmmicamente, ADN amplificado por PCR y combinaciones de los mismos. Las moleculas de acido nucleico de la invencion incluyen genes de longitud completa o moleculas de ADNc, asf como una combinacion de fragmentos de los mismos. Los acidos nucleicos de la invencion se derivan preferentemente de fuentes humanas, pero la invencion incluye tambien los derivados de especies no humanas.

[0161] En algunas realizaciones, los acidos nucleicos de la invencion son acidos nucleicos aislados. Un "acido nucleico aislado" es un acido nucleico que se ha separado de las secuencias geneticas adyacentes presentes en el genoma del organismo a partir del cual se aislo el acido nucleico, en el caso de acidos nucleicos aislados de fuentes naturales. En el caso de acidos nucleicos sintetizados enzimaticamente a partir de una plantilla o qmmicamente, tales como productos de PCR, moleculas de ADNc u oligonucleotidos, por ejemplo, se entiende que los acidos nucleicos resultantes de tales procesos son acidos nucleicos aislados. Una molecula de acido nucleico aislada se refiere a una molecula de acido nucleico en forma de un fragmento separado o como un componente de una construccion de acido nucleico mas grande. En una realizacion preferida, los acidos nucleicos estan sustancialmente libres de material endogeno contaminante. La molecula de acido nucleico se ha derivado preferiblemente de ADN o ARN aislado al menos una vez en forma sustancialmente pura y en una cantidad o concentracion que permite la identificacion, manipulacion y recuperacion de sus secuencias de nucleotidos componentes mediante metodos bioqmmicos estandar (como los descritos en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)). Dichas secuencias se proporcionan y/o construyen preferiblemente en forma de un marco de lectura abierto no interrumpido por secuencias internas no traducidas, o

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intrones, que tipicamente estan presentes en los genes eucarioticos. Las secuencias de ADN no traducido pueden estar presentes en 5' o 3' desde un marco de lectura abierto, donde las mismas no interfieren con la manipulacion o la expresion de la region de codificacion.

[0162] La presente descripcion tambien incluye acidos nucleicos o acidos nucleicos aislados que hibridan en condiciones moderadamente rigurosas, y mas preferiblemente condiciones altamente rigurosas, a los acidos nucleicos que codifican protemas de union al antigeno OSMR como se describe aqrn. Sambrook, Fritsch y Maniatis (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, capftulos 9 y 11, y Current Protocols in Molecular Biology, 1995, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., secciones 2.10 y 6.3-6.4), y pueden determinarse facilmente por los expertos en la tecnica. en, por ejemplo, la longitud y/o composicion de la base del ADN. Una forma de lograr condiciones moderadamente estrictas implica el uso de una solucion de prelavado que contenga 5 x SSC, 0,5% SDS, 1,0 mM EDTA (pH 8,0), tampon de hibridacion de aproximadamente 50% de formamida, 6 x SSC y una temperatura de hibridacion de aproximadamente 55 grados C (u otras soluciones de hibridacion similares, como una que contiene aproximadamente 50% de formamida, con una temperatura de hibridacion de alrededor de 42 grados C) y condiciones de lavado de alrededor de 60 grados C, en 0,5 x SSC, 0,1% SDS. En general, las condiciones altamente rigurosas se definen como condiciones de hibridacion como las anteriores, pero con un lavado a aproximadamente 68 grados C, 0,2 x SSC, SDS al 0,1%. SSPE (1xSSPE es 0,15 M NaCl, 10 mM NaH.sub.2 PO.sub.4 y 1,25 mM EDTA, pH 7,4) puede ser sustituido por SSC (1xSSC es 0,15 M NaCl y 15 mM citrato sodico) en la hibridacion y lavar los tampones; los lavados se realizan durante 15 minutos despues de que se completa la hibridacion. Debe entenderse que la temperatura de lavado y la concentracion de la sal de lavado se pueden ajustar segun sea necesario para lograr un grado de rigurosidad deseado aplicando los principios basicos que gobiernan las reacciones de hibridacion y la estabilidad duplex, tal como conocen los expertos en la tecnica y se describen mas adelante (vease, por ejemplo, Sambrook et al., 1989). Cuando se hibrida un acido nucleico con un acido nucleico diana de secuencia desconocida, se supone que la longitud del tubrido es la del acido nucleico hibridante. Cuando se hibridan acidos nucleicos de secuencia conocida, la longitud del hfbrido se puede determinar alineando las secuencias de los acidos nucleicos e identificando la region o regiones de complementariedad de secuencia optima. La temperatura de hibridacion para los hfbridos que se anticipa que tendra menos de 50 pares de bases de longitud debe ser de 5 a 10°C menos que la temperatura de fusion (Tm) del hfbrido, donde la Tm se determina de acuerdo con las siguientes ecuaciones. Para hfbridos de menos de 18 pares de bases de longitud, Tm (grados C) = 2(# de bases A + T) + 4 (# de bases #G + C). Para hfbridos de mas de 18 pares de bases de longitud, Tm (grados C) = 81,5 + 16,6 (log-10 [Na+]) + 0,41 (% G + C) - (600/N), donde N es el numero de bases en el tubrido, y [Na+] es la concentracion de iones de sodio en el tampon de hibridacion ([Na+] para 1xSSC = 0,165M). Preferiblemente, cada uno de dichos acidos nucleicos hibridantes tiene una longitud de al menos 15 Nucleotidos (o mas preferiblemente al menos 18 nucleotidos, o al menos 20 nucleotidos, o al menos 25 nucleotidos, o al menos 30 nucleotidos, o al menos 40 nucleotidos, o lo mas preferiblemente al menos 50 nucleotidos), o al menos el 25% (mas preferiblemente al menos el 50%, o al menos el 60%, o al menos el 70%, y lo mas preferiblemente al menos el 80%) de la longitud del acido nucleico de la presente divulgacion a la que hibrida, y tiene al menos un 60% de identidad de secuencia (mas preferiblemente al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 81%, al menos un 82%, al menos un 83%, al menos 84%, al menos 85%, al menos 86%, al menos 87%, al menos 88%, al menos 89%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos el 99%, y lo mas preferiblemente al menos el 99,5% con el acido nucleico de la presente invencion con el que hibrida, donde la identidad de secuencia se determina al comparar las secuencias de los acidos nucleicos que se hibridan cuando se alinean para maximizar la superposicion y la identidad, al tiempo que se minimizan las brechas de secuencia como se describe con mas detalle anteriormente.

[0163] Las variantes de acuerdo con la invencion se preparan normalmente por mutagenesis espedfica de sitio de nucleotidos en el ADN que codifica la protema de union al antfgeno, el uso de cassette o mutagenesis por PCR u otras tecnicas bien conocidas en la tecnica, para producir ADN que codifica la variante, y a partir de entonces expresando el ADN recombinante en cultivo celular como se describe aqrn. Sin embargo, los fragmentos de protemas de union a antfgeno que comprenden CDR variantes que tienen hasta aproximadamente 100-150 residuos pueden prepararse por smtesis in vitro utilizando tecnicas establecidas. Las variantes exhiben tfpicamente la misma actividad biologica cualitativa que el analogo natural, por ejemplo, la union a OSMR, aunque tambien se pueden seleccionar variantes que tengan caractensticas modificadas, como se describira mas detalladamente a continuacion.

[0164] Como se apreciara por aquellos en la tecnica, debido a la degeneracion del codigo genetico, un numero extremadamente grande de acidos nucleicos puede estar hecho, todos los cuales codifican las CDR (y las cadenas pesadas y ligeras u otros componentes de la protema de union al antfgeno) de la presente invencion. Por lo tanto, habiendo identificado una secuencia de aminoacidos particular, los expertos en la tecnica podnan producir cualquier numero de acidos nucleicos diferentes, simplemente modificando la secuencia de uno o mas codones de una manera que no cambie la secuencia de aminoacidos de la protema codificada.

[0165] La presente invencion tambien proporciona sistemas de expresion y las construcciones en forma de plasmidos, vectores de expresion, de la transcripcion o casetes de expresion que comprenden al menos un polinucleotido como anteriormente. Ademas, la invencion proporciona celulas huesped que comprenden tales

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sistemas de expresion o construcciones.

[0166] Tfpicamente, los vectores de expresion usados en cualquiera de las celulas huesped contendran secuencias para el mantenimiento del plasmido y para la clonacion y expresion de secuencias de nucleotidos exogenas. Dichas secuencias, denominadas colectivamente como "secuencias flanqueantes" en ciertas realizaciones, incluiran tipicamente una o mas de las siguientes secuencias de nucleotidos: un promotor, una o mas secuencias potenciadoras, un origen de replicacion, una secuencia de terminacion transcripcional, una secuencia completa de intrones que contiene un sitio de empalme donador y aceptor, una secuencia que codifica una secuencia lfder para la secrecion de polipeptidos, un sitio de union a ribosoma, una secuencia de poliadenilacion, una region de poliligador para insertar el acido nucleico que codifica el polipeptido a expresar y un elemento marcador seleccionable. Cada una de estas secuencias se discute a continuacion.

[0167] Opcionalmente, el vector puede contener una secuencia codificante de "etiqueta", es decir, una molecula de oligonucleotido ubicada en el extremo 5' o 3' de la secuencia de codificacion de protema de union a antfgeno OSMR; la secuencia de oligonucleotidos codifica poliHis (como hexaHis), u otra "etiqueta" como FLAG, HA (virus de la influenza hemaglutinina) o myc, para la cual existen anticuerpos disponibles comercialmente. Esta etiqueta se fusiona tfpicamente con el polipeptido tras la expresion del polipeptido, y puede servir como un medio para la purificacion por afinidad o la deteccion de la protema de union al antfgeno OSMR de la celula huesped. La purificacion por afinidad se puede lograr, por ejemplo, mediante cromatograffa en columna usando anticuerpos contra la etiqueta como una matriz de afinidad. Opcionalmente, la etiqueta puede eliminarse posteriormente de la protema de union al antfgeno OSMR purificada por diversos medios, como el uso de ciertas peptidasas para la escision.

[0168] Las secuencias flanqueantes pueden ser homologas (es decir, de la misma especie y/o cepa que la celula

huesped), heterologas (es decir, de una especie distinta de la especie o cepa de la celula huesped), hubridas (es

decir, una combinacion de flancos). secuencias de mas de una fuente), sinteticas o nativas. Como tal, la fuente de una secuencia flanqueante puede ser cualquier organismo procariotico o eucariotico, cualquier organismo vertebrado o invertebrado, o cualquier planta, siempre que la secuencia flanqueante sea funcional y pueda ser activada por la maquinaria de la celula huesped.

[0169] Las secuencias flanqueantes utiles en los vectores de esta invencion pueden obtenerse por cualquiera de

varios metodos bien conocidos en la tecnica. Tfpicamente, las secuencias flanqueantes utiles en el presente documento se habran identificado previamente mediante mapeo y/o mediante digestion con endonucleasas de restriccion y, por lo tanto, se pueden aislar de la fuente de tejido adecuada utilizando las endonucleasas de

restriccion apropiadas. En algunos casos, la secuencia de nucleotidos completa de una secuencia flanqueante

puede ser conocida. Aqrn, la secuencia de flanqueo se puede sintetizar usando los metodos descritos aqrn para la smtesis o clonacion de acidos nucleicos.

[0170] Si se conoce toda o solo una parte de la secuencia flanqueante, puede obtenerse usando la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) y/o mediante el cribado de una biblioteca genomica con una sonda adecuada, tal como un oligonucleotido y/o fragmento de secuencia flanqueante de la misma u otra especie. Cuando la secuencia flanqueante no se conoce, un fragmento de ADN que contiene una secuencia flanqueante puede aislarse de una pieza mas grande de ADN que puede contener, por ejemplo, una secuencia codificante o incluso otro gen o genes. El aislamiento se puede lograr mediante digestion con endonucleasas de restriccion para producir el fragmento de ADN adecuado, seguido de un aislamiento con purificacion en gel de agarosa, cromatograffa en columna Qiagen® (Chatsworth, CA), u otros metodos conocidos por los expertos en la tecnica. La seleccion de enzimas adecuadas para lograr este proposito sera facilmente evidente para un experto en la tecnica.

[0171] Un origen de replicacion es tfpicamente una parte de aquellos vectores de expresion procariotas adquiridos comercialmente, y las ayudas de origen en la amplificacion del vector en una celula huesped. Si el vector de eleccion no contiene un origen de sitio de replicacion, uno puede sintetizarse qmmicamente basandose en una secuencia conocida y ligarse en el vector. Por ejemplo, el origen de la replicacion del plasmido pBR322 (New England Biolabs, Beverly, Ma) es adecuado para la mayona de las bacterias gramnegativas y varios ongenes virales (por ejemplo, SV40, polioma, adenovirus, virus de la vesmula estomatica (VSV), o los papilomavirus, como el VPH o el vAp, son utiles para clonar vectores en celulas de mamfferos. En general, el origen del componente de replicacion no es necesario para los vectores de expresion de marnfferos (por ejemplo, el origen de SV40 a menudo se usa solo porque tambien contiene el promotor temprano del virus).

[0172] Una secuencia de terminacion de la transcripcion se localiza tfpicamente 3' al extremo de una region codificante de polipeptido y sirve para terminar la transcripcion. Normalmente, una secuencia de terminacion de la transcripcion en celulas procariotas es un fragmento rico en GC seguido de una secuencia poli-T. Si bien la secuencia se puede clonar facilmente de una biblioteca o incluso comprarse comercialmente como parte de un vector, tambien se puede sintetizar facilmente usando metodos para la smtesis de acidos nucleicos, como los descritos en este documento.

[0173] Un gen marcador seleccionable codifica una protema necesaria para la supervivencia y crecimiento de una

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celula huesped cultivada en un medio de cultivo selectivo. Los genes marcadores de seleccion tipicos codifican protemas que (a) confieren resistencia a los antibioticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, tetraciclina o kanamicina para celulas huesped procariotas; (b) complementar las deficiencias auxotroficas de la celula; o (c) suministrar nutrientes cnticos no disponibles en medios complejos o definidos. Los marcadores seleccionables espedficos son el gen de resistencia a la kanamicina, el gen de resistencia a la ampicilina y el gen de resistencia a la tetraciclina. Ventajosamente, tambien se puede usar un gen de resistencia a la neomicina para la seleccion en celulas huesped tanto procariotas como eucariotas.

[0174] Otros genes seleccionables pueden ser usados para amplificar el gen que sera expresado. La amplificacion es el proceso en el que los genes que se requieren para la produccion de una protema cntica para el crecimiento o la supervivencia celular se reiteran en tandem dentro de los cromosomas de generaciones sucesivas de celulas recombinantes. Los ejemplos de marcadores seleccionables adecuados para celulas de mairnfero incluyen reductasa de dihidrofolato (DHFR) y genes de timidina quinasa sin promotor. Los transformantes de celulas de mamnfero se colocan bajo presion de seleccion, en la que solo los transformantes estan adaptados unicamente para sobrevivir en virtud del gen seleccionable presente en el vector. La presion de seleccion se impone cultivando las celulas transformadas en condiciones en las que la concentracion del agente de seleccion en el medio aumenta sucesivamente, lo que lleva a la amplificacion tanto del gen seleccionable como del ADN que codifica otro gen, como un anticuerpo de protema de union a antfgeno que se une al polipeptido OSMR. Como resultado, se sintetizan a partir del aDn amplificado mayores cantidades de un polipeptido, como una protema de union al antfgeno OSMR.

[0175] Un sitio de union a ribosomas es generalmente necesario para la iniciacion de traduccion de mRNA y se caracteriza por una secuencia Shine-Dalgarno (procariotas) o una secuencia Kozak (eucariotas). El elemento se encuentra tfpicamente en 3' con respecto al promotor y 5' con respecto a la secuencia de codificacion del polipeptido a expresar. En ciertas realizaciones, una o mas regiones codificantes pueden estar unidas operativamente a un sitio de union a ribosoma interno (IRES), permitiendo la traduccion de dos marcos de lectura abiertos de una sola transcripcion de ARN.

[0176] En algunos casos, como cuando se desea la glicosilacion en un sistema de expresion de la celula huesped eucariotica, se pueden manipular las diversas presecuencias o prosecuencias para mejorar la glicosilacion o el rendimiento. Por ejemplo, uno puede alterar el sitio de escision de la peptidasa de un peptido senal particular, o agregar secuencias, que tambien pueden afectar la glicosilacion. El producto de protema final puede tener, en la posicion -1 (en relacion con el primer aminoacido de la protema madura) uno o mas aminoacidos adicionales relacionados con la expresion, que pueden no haber sido totalmente eliminados. Por ejemplo, el producto proteico final puede tener uno o dos residuos de aminoacidos encontrados en el sitio de escision de la peptidasa, unido al termino amino. Alternativamente, el uso de algunos sitios de escision enzimatica puede resultar en una forma ligeramente truncada del polipeptido deseado, si la enzima corta en dicha area dentro del polipeptido maduro.

[0177] Los vectores de expresion y clonacion de la invencion tfpicamente contendran un promotor que es reconocido por el organismo huesped y esta unido operativamente a la molecula que codifica la protema de union al antfgeno OSMR. Los promotores son secuencias no transcritas ubicadas aguas arriba (es decir, 5') al codon de inicio de un gen estructural (generalmente dentro de aproximadamente 100 a 1000 pb) que controlan la transcripcion del gen estructural. Los promotores se agrupan convencionalmente en una de dos clases: promotores inducibles y promotores constitutivos. Los promotores inducibles inician mayores niveles de transcripcion del ADN bajo su control en respuesta a algun cambio en las condiciones de cultivo, como la presencia o ausencia de un nutriente o un cambio en la temperatura. Los promotores constitutivos, por otro lado, transcriben uniformemente el gen al que estan operativamente vinculados, es decir, con poco o ningun control sobre la expresion genica. Un gran numero de promotores, reconocidos por una variedad de celulas hospedadoras potenciales, son bien conocidos. Un promotor adecuado esta unido operativamente al ADN que codifica la cadena pesada o ligera que comprende una protema de union a antfgeno OSMR de la invencion eliminando el promotor del ADN fuente mediante digestion con enzimas de restriccion e insertando la secuencia promotora deseada en el vector.

[0178] Los promotores adecuados para uso con huespedes de levadura tambien son bien conocidos en la tecnica. Los potenciadores de levadura se usan ventajosamente con promotores de levadura. Los promotores adecuados para uso con celulas huesped de mamfferos son bien conocidos e incluyen, entre otros, los obtenidos de genomas de virus como el virus del polioma, el virus de la viruela aviar, el adenovirus (como el adenovirus 2), el virus del papiloma bovino y el virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, retrovirus, virus de la hepatitis B y, lo mas preferible, virus de simio 40 (SV40). Otros promotores de mamfferos adecuados incluyen promotores de mamfferos heterologos, por ejemplo, promotores de choque termico y el promotor de actina.

[0179] Los promotores adicionales que pueden ser de interes incluyen, pero no se limitan a: promotor temprano de SV40 (Benoist et al, 1981, Nature 290:. 304-310); Promotor de CMV (Thomsen et al., 1984, Proc. Natl. Acad. EE.UU. 81: 659-663); el promotor contenido en la repeticion terminal larga 3' del virus del sarcoma de Rous (Yamamoto et al., 1980, Cell 22: 787-797); promotor del herpes timidina quinasa (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 78: 1444-1445); promotor y secuencias reguladoras del gen de la metalotionina Prinster et al., 1982, Nature 296: 39-42); y promotores procarioticos tales como el promotor de beta-lactamasa (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 75: 3727-3731); o el promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 80: 21-

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25). Tambien son de interes las siguientes regiones de control de la transcripcion animal, que exhiben especificidad de tejido y se han utilizado en animales transgenicos: la region de control del gen de la elastasa I que es activa en celulas acinares pancreaticas (Swift et al., 1984, Cell 38: 639-646 Ornitz y otros, 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50: 399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7: 425-515); la region de control del gen de la insulina que es activa en las celulas beta pancreaticas (Hanahan, 1985, Nature 315: 115-122); la region de control del gen de la inmunoglobulina que es activa en las celulas linfoides (Grosschedl et al., 1984, Cell 38: 647-658; Adames et al.,

1985, Nature 318: 533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell Biol. 7: 1436-1444); la region de control del virus del tumor mamario de raton que es activa en las celulas testiculares, mamarias, linfoides y mastocitos (Leder et al.,

1986, Cell 45: 485-495); la region de control del gen de la albumina que es activa en el tngado (Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1: 268-276); la region de control del gen de la alfa-feto-protema que esta activa en el tngado (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5: 1639-1648; Hammer et al., 1987, Science 253: 53-58); la region de control del gen de la alfa-1-antitripsina que esta activa en el tngado (Kelsey et al., 1987, Genes and Devel. 1: 161-171); la region de control del gen de la beta-globina que esta activa en las celulas mieloides (Mogram et al., 1985, Nature 315: 338-340; Kollias et al., 1986, Cell 46: 89-94); la region de control del gen de la protema basica de la mielina que es activa en las celulas de oligodendrocitos en el cerebro (Readhead et al., 1987, Cell 48: 703-712); la region de control del gen de la cadena ligera-2 de la miosina que esta activa en el musculo esqueletico (Sani, 1985, Nature 314: 283-286); y la region de control del gen de la hormona liberadora gonadotropica que esta activa en el hipotalamo (Mason et al., 1986, Science 234: 1372-1378).

[0180] Una secuencia de intensificador puede insertarse en el vector para aumentar la transcripcion de la cadena ligera de ADN que codifica o de la cadena pesada que comprende una protema de union a antfgeno OSMR de la invencion por eucariotas superiores. Los potenciadores son elementos del ADN que actuan en cis, generalmente de aproximadamente 10-300 pb de longitud, que actuan sobre el promotor para aumentar la transcripcion. Los potenciadores son relativamente independientes de la orientacion y la posicion, y se han encontrado en las posiciones 5' y 3' de la unidad de transcripcion. Se conocen varias secuencias potenciadoras disponibles de genes de mairnferos (p. ej., globina, elastasa, albumina, alfa-feto-protema e insulina). Tfpicamente, sin embargo, se usa un potenciador de un virus. El potenciador de SV40, el potenciador del promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador de polioma y los potenciadores de adenovirus conocidos en la tecnica son elementos potenciadores ejemplares para la activacion de promotores eucarioticos. Mientras que un potenciador puede posicionarse en el vector 5' o 3' a una secuencia de codificacion, tfpicamente se ubica en un sitio 5' desde el promotor. Se puede incorporar una secuencia que codifica una secuencia senal nativa o heterologa apropiada (secuencia lfder o peptido senal) en un vector de expresion, para promover la secrecion extracelular del anticuerpo. La eleccion del peptido o lfder de senal depende del tipo de celulas huesped en las que se producira el anticuerpo, y una secuencia de senal heterologa puede reemplazar la secuencia de senal nativa. Los ejemplos de peptidos de senal que son funcionales en celulas huesped de mairnferos incluyen los siguientes: la secuencia de senal para la interleucina-7 (IL-7) descrita en la Patente de EE.UU. N° 4.965.195; la secuencia senal para el receptor de interleucina-2 descrita en Cosman et al., 1984, Nature 312: 768; el peptido senal del receptor de interleucina-4 descrito en la Patente EP N° 0367 566; el peptido senal del receptor de interleucina 1 de tipo I descrito en la patente de EE.UU. N° 4.968.607; el peptido senal del receptor de interleucina-1 tipo II descrito en la Patente EP N° 0 460 846.

[0181] El vector puede contener uno o mas elementos que facilitan la expresion cuando el vector se integra en el genoma de la celula huesped. Los ejemplos incluyen un elemento EASE (Aldrich et al. 2003 Biotechnol Prog. 19: 1433-38) y una region de union a la matriz (MAR). Los MAR median la organizacion estructural de la cromatina y pueden aislar el efecto de "posicion" del vactor integrado. Por lo tanto, los MAR son particularmente utiles cuando el vector se utiliza para crear transfectantes estables. Se conocen en la tecnica varios acidos nucleicos naturales y sinteticos que contienen MAR, por ejemplo, la patente de EE.UU. N° 6.239.328; 7.326.567; 6.177.612; 6.388.066; 6.245.974; 7.259.010; 6.037.525; 7.422.874; 7.129.062.

[0182] Los vectores de expresion de la invencion pueden construirse a partir de un vector de inicio tal como un vector disponible comercialmente. Tales vectores pueden o no contener todas las secuencias flanqueantes deseadas. Cuando una o mas de las secuencias flanqueantes descritas en el presente documento no estan ya presentes en el vector, pueden obtenerse individualmente y ligarse en el vector. Los metodos utilizados para obtener cada una de las secuencias flanqueantes son bien conocidos por los expertos en la tecnica.

[0183] Despues de que se haya construido el vector y se haya insertado una molecula de acido nucleico que codifica una cadena ligera, una cadena pesada o una cadena ligera y una cadena pesada que comprende una secuencia de union al antfgeno OSMR en el sitio apropiado del vector, el vector completado puede insertarse en una celula huesped adecuada para la amplificacion y/o expresion de polipeptidos. La transformacion de un vector de expresion para una protema de union al antfgeno OSMR en una celula hospedadora seleccionada se puede realizar mediante metodos bien conocidos que incluyen transfeccion, infeccion, coprecipitacion con fosfato de calcio, electroporacion, microinyeccion, lipofeccion, transfeccion mediada por DEAE-dextrano u otras tecnicas conocidas. El metodo seleccionado sera en parte una funcion del tipo de celula huesped que se utilizara. Estos metodos y otros metodos adecuados son bien conocidos por los expertos en la tecnica, y se exponen, por ejemplo, en Sambrook et al., 2001, supra.

[0184] Una celula huesped, cuando se cultiva en condiciones apropiadas, sintetiza una protema de union a antfgeno

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OSMR que puede recogerse posteriormente del medio de cultivo (si la celula huesped lo secreta al medio) o directamente de la celula huesped que la produce (si no se secreta). La seleccion de una celula huesped apropiada dependera de varios factores, como los niveles de expresion deseados, las modificaciones de polipeptidos que son deseables o necesarias para la actividad (como la glucosilacion o la fosforilacion) y la facilidad de plegamiento en una molecula biologicamente activa. Una celula huesped puede ser eucariotica o procariotica.

[0185] Lmeas celulares de mai^ero disponibles como huespedes para expresion son bien conocidas en la tecnica e incluyen, pero no se limitan a, lmeas celulares inmortalizadas disponibles de la American Type Culture Collection (ATCC) y las lmeas celulares utilizadas en un sistema de expresion conocido en la tecnica se puede usar para hacer los polipeptidos recombinantes de la invencion. En general, las celulas huesped se transforman con un vector de expresion recombinante que comprende ADN que codifica un polipeptido de anticuerpo anti-OSMR deseado. Entre las celulas huesped que pueden emplearse se encuentran procariotas, levaduras o celulas eucariotas superiores. Los procariotas incluyen organismos gram negativos o gram positivos, por ejemplo, E. coli o bacilos. Las celulas eucariotas superiores incluyen celulas de insecto y lmeas celulares establecidas de origen mairnfero. Los ejemplos de lmeas celulares hospedadoras de mamfferos adecuadas incluyen la lmea COS-7 de celulas de rinon de mono (ATCC CRL 1651) (Gluzman et al., 1981, Cell 23: 175), celulas L, celulas 293, celulas C127, celulas 3T3 (ATCC CCL 163), celulas de ovario de hamster chino (CHO), o sus derivados como Veggie CHO y lmeas celulares relacionadas que crecen en medios sin suero (Rasmussen et al., 1998, Cytotechnology 28: 31), celulas HeLa, lmeas celulares BHK (ATCC CRL 10), y la lmea celular CVI/EBNA derivada de la lmea celular CVI (aTcC CCL 70) de rinon de mono verde africano como se describe por McMahan et al., 1991, EMBO J. 10: 2821, celulas de rinon embrionario humano tales como 293, 293 EBNA o MSR 293, celulas A431 epidermicas humanas, celulas Colo205 humanas, otras lmeas celulares de primate transformadas, celulas diploides normales, cepas celulares derivadas de cultivo in vitro de tejido primario, explantes primarios, HL-60, U937, HaK o Jurkat Celulas. Opcionalmente, se pueden usar lmeas celulares de marnfferos tales como HepG2/3B, KB, NIH 3T3 o S49, por ejemplo, para la expresion del polipeptido cuando es deseable usar el polipeptido en diversos ensayos de transduccion de senales o indicadores. Alternativamente, es posible producir el polipeptido en eucariotas inferiores, como la levadura, o en procariotas, como las bacterias. Las levaduras adecuadas incluyen Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, cepas de Kluyveromyces, Candida, o cualquier cepa de levadura capaz de expresar polipeptidos heterologos. Las cepas bacterianas adecuadas incluyen Escherichia coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, o cualquier cepa bacteriana capaz de expresar polipeptidos heterologos. Si el polipeptido se fabrica en levaduras o bacterias, puede ser conveniente modificar el polipeptido producido en el, por ejemplo, por fosforilacion o glicosilacion de los sitios apropiados, con el fin de obtener el polipeptido funcional. Tales uniones covalentes se pueden lograr utilizando metodos qmmicos o enzimaticos conocidos. El polipeptido tambien puede producirse uniendo operativamente el acido nucleico o el acido nucleico aislado de la invencion a secuencias de control adecuadas en uno o mas vectores de expresion de insectos, y empleando un sistema de expresion de insectos. Los materiales y metodos para los sistemas de expresion de celulas de baculovirus/insecto estan disponibles comercialmente en forma de kit de, por ejemplo, Invitrogen, San Diego, CA, EE.UU. (el kit MaxBac®), y dichos metodos son bien conocidos en la tecnica, como se describe en Summers y Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987), y Luckow and Summers, Bio/Technology 6:47 (1988). Los sistemas de traduccion libres de celulas tambien podnan emplearse para producir polipeptidos utilizando ARN derivados de construcciones de acido nucleico descritas en el presente documento. Los vectores de clonacion y expresion apropiados para uso con huespedes celulares bacterianas, fungicas, de levadura y de mamfferos se describen por Pouwels et al. (Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, Nueva York, 1985). Una celula huesped que comprende un acido nucleico o un acido nucleico aislado de la invencion, preferiblemente unida operativamente a al menos una secuencia de control de expresion, es una "celula huesped recombinante".

[0186] En ciertas realizaciones, las lmeas celulares se pueden seleccionar a traves de la determinacion de que lmeas celulares tienen altos niveles de expresion y constitutivamente producir protemas de union a antigenos con propiedades de union OSMR. En otra realizacion, puede seleccionarse una lmea celular del linaje de celulas B que no fabrica su propio anticuerpo pero tiene la capacidad de producir y secretar un anticuerpo heterologo.

Protemas de union al antigeno OSMR que agotan las celulas

[0187] En realizaciones preferidas, la protema de union a antigeno OSMR se une OSMR e inhibe la OSM y/o de union IL-31, lo que reduce OSM- y/o la senalizacion mediada por IL-31 en celulas de expresion de OSMR. Sin embargo, en ciertas realizaciones, la protema de union a antigeno OSMR se une a OSMR y se dirige a una celula que expresa OSMR para su agotamiento. En diversos aspectos, la protema de union al antigeno OSMR inhibe la union de OSM e/o IL-31 y se dirige a la celula OSMR para su agotamiento.

[0188] Las protemas de union al antigeno OSMR que agotan las celulas son particularmente utiles para tratar enfermedades o trastornos asociados con la sobreexpresion de OSMR, por ejemplo, una enfermedad autoinmune, enfermedad inflamatoria, una enfermedad o trastorno asociado con el deposito o remodelacion de la matriz extracelular, o tumor que expresa OSMR. Los metodos para dirigirse a celulas con protemas de union a antigeno, por ejemplo, anticuerpos, son bien conocidos en la tecnica. Realizaciones ejemplares se discuten a continuacion.

Conjugados de anticuerpos

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[0189] Las realizaciones de la invencion incluyen conjugados de farmaco de anticuerpo (ADC). En general, el ADC comprende un anticuerpo conjugado con un agente quimioterapeutico, por ejemplo, un agente citotoxico, un agente citostatico, una toxina o un agente radioactivo. Se puede usar una molecula enlazadora para conjugar el farmaco al anticuerpo. Una amplia variedad de enlazadores y farmacos utiles en tecnologfa de ADC se conocen en la tecnica y se pueden usar en realizaciones de la presente invencion. (Vease US20090028856; US2009/0274713; US2007/0031402; WO2005/084390; WO2009/099728; US5208020; US5416064; US5475092; 5585499; 6436931; 6372738; y 6340701).

Enlazadores

[0190] En ciertas realizaciones, el ADC comprende un enlazador compuesto por uno o mas componentes del enlazador. Los componentes enlazadores ejemplares incluyen 6-maleimidocaproMo, maleimidopropanoMo, valina- citrulina, alanina-fenilalanina, p-amino-benziloxicarbonilo, y aquellos resultantes de la conjugacion con reactivos enlazadores, incluyendo, entre otros, N-succinimidilo 4-(2-piridiltio) pentanoato ("SPP"), N-succinimidilo 4-(N- maleimidometilo) ciclohexano-1 carboxilato ("SMCC", tambien denominado en el presente documento "MCC") y N- succinimidilo (4-yodo-acetilo) aminobenzoato ("SIAB").

[0191] Los enlazadores pueden ser un enlazador "escindible" o un enlazador "no escindible" (Ducry and Stump, Bioconjugate Chem. 2010, 21, 5-13). Los enlazadores escindibles estan disenados para liberar el farmaco cuando se someten a ciertos factores ambientales, por ejemplo, cuando se internaliza en la celula diana. Los enlazadores escindibles incluyen enlazadores acidos labiles, enlazadores sensibles a proteasas, enlazadores fotolabiles, enlazadores dimetilo o enlazadores que contienen disulfuro. Los enlazadores no escindibles tienden a permanecer asociados covalentemente con al menos un aminoacido del anticuerpo y el farmaco tras la internalizacion y degradacion dentro de la celula diana. Un enlazador no escindible ejemplar es MCC.

Las drogas

[0192] En ciertas realizaciones, el anticuerpo se conjuga con un agente quimioterapeutico. Los ejemplos de agentes quimioterapeuticos incluyen agentes alquilantes, tales como tiotepa y ciclofosfamida (CYTOXAN™); sulfonatos de alquilo tales como busulfan, improsulfan y piposulfan; aziridinas, tales como benzodopa, carboquona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilaminasas que incluyen altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilenotiofosforamida y trimetilolomelamina; acetogeninas (especialmente bulatacina y bulatacinona); una camptotecina (incluido el topotecan analogo sintetico); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluidos sus analogos sinteticos adozelesina, carzelesina y bizelesina); criptoficinas (particularmente criptoficina 1 y criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluidos los analogos sinteticos, KW-2189 y CBI-TMI); eleuterobina; pancratistatina; una sarcodictina; espongistatina; mostazas nitrogenadas como clorambucilo, clomafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecholetamina, clorhidrato de oxido de mecloretamina, melfalan, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mosto de uracilo; nitrosureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibioticos, como los antibioticos enedina (por ejemplo, caliqueamicina, especialmente caliqueamicina .gamma1 y caliqueamicina teta I, vease, por ejemplo, Angew Chem. Intl. Ed. Engl. 33: 183-186 (1994); dinemicina, incluida la dinemicina A; asf como cromoforos de neocarzinostatina y cromomoforos antibioticos de enedina de cromoprotema relacionados), aclacinomisinas, acetinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, caminomicina, carzinofilina; cromomicinas, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorubicina, (incluyendo morfolino-doxorubicina, cianomorfolino- doxorubicina, 2-pirrolino-doxorubicina y deoxidoxorubicina), epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, nitomicinas, acido micofenolico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; antimetabolitos, como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); analogos del acido folico, tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; analogos de purina, tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; analogos de pirimidina tales como, ancitabina, aza-citidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, 5-FU; androgenos, tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; antiadrenales, tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; rellenador de acido folico, tal como acido frolmico; aceglatona; glicosido de aldofosfamida; acido aminolevulmico; bestrabucilo de amsacrina; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina diaziquona; elfomitina; acetato de eliptinio; una epotilona; etoglucido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinano; lonidamina; maitansinoides, tales como maitansina y ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina pentostatina; phenamet; pirarubicina; acido podofilmico; 2-etilhidracida; procarbazina; PSK®; razoxano; rizoxina; sizofuran; espirogermanio; acido tenuazonico; triaziquona; 2,2',2”-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina); uretano; vindesina; dacarbazina; manacostina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gactosina; C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, por ejemplo, paclitaxel (TAXOL™, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) y doxetaxel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, Francia); clorambucilo; gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; analogos del platino como el cisplatino y el carboplatino; vinblastina; platino; etoposido (VP-16); ifosfamida; fenomeno de la mitomicina; desprendimiento; mitoxantrona; CPT-11; inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluorometilomitina (DMFO); acido retinoico; capecitabina; y sales, acidos o derivados farmaceuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores. Tambien se incluyen en esta definicion agentes antihormonales que actuan para regular o inhibir la accion de la hormona sobre tumores, tales como antiestrogenos que incluyen, por

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ejemplo, tamoxifeno, raloxifeno, inhibidores de la aromatasa 4(5)-imidazoles, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, queoxifeno, LY117018, onapristona y toremifeno (Fareston); y antiandrogenos, tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida y goserelina; ARNsi y sales, acidos o derivados farmaceuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores. Otros agentes quimioterapeuticos que se pueden usar con la presente invencion se describen en la publicacion de Estados Unidos n° 20080171040 o en la publicacion de Estados Unidos n° 20080305044.

[0193] Se contempla que un anticuerpo puede conjugarse con dos o mas diferentes agentes quimioterapeuticos o una composicion farmaceutica puede comprender una mezcla de anticuerpos en la que el componente de anticuerpo es identico a excepcion de que se conjuga con un agente quimioterapeutico diferente. Dichas realizaciones pueden ser utiles para dirigirse a multiples rutas biologicas con una celula diana.

[0194] En realizaciones preferidas, el ADC comprende un anticuerpo conjugado a una o mas moleculas de maitansinoide, que son inhibidores mitoticos que actuan inhibiendo la polimerizacion de tubulina. Los maitansinoides, que incluyen diversas modificaciones, se describen en la patente de EE.UU. N° 3896111; 4151042; 4137230; 4248870; 4256746; 4260608; 4265814; 4294757; 4307016; 4308268; 4309428; 4313946; 4315929; 4317821; 4322348; 4331598; 4361650; 4364866; 4424219; 4450254; 4362663; 4371533; y WO 2009/099728. Los restos de farmaco maitansinoide pueden aislarse de fuentes naturales, producirse mediante tecnologfa recombinante o prepararse sinteticamente. Los ejemplos de maitansinoides incluyen decloro C-19 (Patente de EE.UU. N° 4256746), hidroxi C-20 (o demetilo C-20) +/- decloro C-19 (Patentes de EE.UU. Nos 4307016 y 4361650), 20-desmetoxi (o C-20-aciloxi (-OCOR), +/- decloro (Patente de EE.UU. N° 4294757), C-9-SH (Patente de EE.UU. N° 4.424.219), C-14-alcoximetilo (demetoxi/CH2OR) (Patente de EE.UU. N° 4.331.598), C-14-hidroximetilo o aciloximetilo (CH2OH o CH2OAc) (Patente de EE.UU. N° 4.450.254), C-15-hidroxi/aciloxi (Patente de EE.UU. N° 4.364.866), C- 15-metoxi (Patentes de EE.UU. Nos 4.313.946 y 4.315.929), C-18-N-demetilo (Patentes de EE.UU. Nos 4.362.663 y 4.322.348), y 4.5-deoxi (Patente de EE.UU. N° 4.371.533).

[0195] Se pueden usar varias posiciones en los compuestos de maitansinoide como la posicion de enlace, dependiendo del tipo de enlace deseado. Por ejemplo, para formar un enlace ester, la posicion C-3 tiene un grupo hidroxilo, la posicion C-14 modificada con hidrozimetilo, La posicion C-15 modificada con un grupo hidroxilo, y la posicion C-20 que tiene un grupo hidroxilo son todas adecuadas (Patentes de EE.UU. Nos 5208020, RE39 151, y 6913748; Pub. de Solicitud de Patente de EE.UU. Nos 20060167245 y 20070037972, y WO 2009099728).

[0196] Los maitansinoides preferidos incluyen los conocidos en la tecnica como DM1, DM3 y DM4 (Sol. de Pub. de Pat. Nos 2009030924 y 20050276812).

[0197] Los ADCs que contienen maitansinoides, metodos para hacer tales ADCs, y su uso terapeutico se describen en las Patentes de EE.UU. Nos 5208020 y 5416064, Sol. de Pat. de Patente de EE.UU. N° 20050276812, y WO 2009099728. Los enlazadores que son utiles para hacer ADCs de maitansinoide son conocidos en la tecnica (Patente de EE.UU. 5208020 y Publicacion de Patente de EE.UU. Nos 2005016993 y 20090274713). Los ADC de maitansinoides que comprenden un enlazador SMCC pueden prepararse como se describe en la Pub. de patente de EE.UU. N° 2005/0276812.

Anticuerpos mejorados de la funcion efectora

[0198] Una de las funciones de la porcion Fc de un anticuerpo es para comunicarse con el sistema inmune cuando el anticuerpo se une a su diana. Esto se considera "funcion efectora". La comunicacion conduce a la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), la fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP) y/o la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). La ADCC y la ADCP estan mediadas a traves de la union de Fc a receptores Fc en la superficie de las celulas del sistema inmunologico. CDC esta mediado a traves de la union del Fc con protemas del sistema del complemento, por ejemplo, C1q.

[0199] Las subclases de IgG vanan en su capacidad de mediar funciones efectoras. Por ejemplo, IgG1 es muy superior a IgG2 e IgG4 en la mediacion de ADCC y CDC. Por lo tanto, en realizaciones en las que una celula que expresa OSMR se dirige a la destruccion, se preferina un anticuerpo IgG1 anti-OSMR.

[0200] La funcion efectora de un anticuerpo se puede aumentar o disminuir, mediante la introduccion de una o mas mutaciones en el Fc. Las realizaciones de la invencion incluyen anticuerpos que tienen un Fc disenado para aumentar la funcion efectora (documento US 7.317.091 y Strohl, Curr. Opin. Biotech., 20: 685-691, 2009). Las moleculas ejemplares de IgG1 Fc que tienen una funcion efectora aumentada incluyen (en base al esquema de numeracion de Kabat) aquellas con las siguientes sustituciones:

S239D/I332E

S239D/A330S/I332E

S239D/A330L/I332E

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S298A/D333A/K334A

P247I/A339D

P247I/A339Q

D280H/K290S

D280H/K290S/S298D

D280H/K290S/S298V

F243L/R292P/Y300L

F243L/R292P/Y300L/P396L

F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L

G236A/S239D/I332E

K326A/E333A

K326W/E333S

K290E/S298G/T299A

K290N/S298G/T299A

K290E/S298G/T299A/K326E

K290N/S298G/T299A/K326E

[0201] Otras realizaciones de la invencion incluyen anticuerpos que tienen una Fc disenada para reducir la funcion efectora. Las moleculas Fc ejemplares que tienen una funcion efectora disminuida incluyen (segun el esquema de numeracion de Kabat) aquellas con las siguientes sustituciones:

N297A (IgG1)

L234A/L235A (IgG1)

V234A/G237A (IgG2)

L235A/G237A/E318A (IgG4)

H268Q/V309/A330S/A331S (IgG2)

C220S/C226S/C229/P238S (IgG1)

C226SC229S/E233P/L234V/L235A (IgG1)

L234F/L235E/P331S (IgG1)

S267E/L328F (IgG1)

[0202] Otro metodo de aumento de la funcion efectora de Fc de IgG que contiene protemas es mediante la reduccion de la fucosilacion de la Fc. La eliminacion de la fucosa del nucleo de los oligosacaridos de tipo complejo biantenario unidos a la Fc incremento en gran medida la funcion de efector de ADCC sin alterar la union del antfgeno o la funcion de efector de CDC. Se conocen varias formas de reducir o abolir la fucosilacion de moleculas que contienen Fc, por ejemplo, anticuerpos. Estos incluyen la expresion recombinante en ciertas lmeas celulares de mairnferos que incluyen una lmea celular eliminada de FUT8, una lmea CHO variante Lec13, una lmea celular de hibridoma de rata YB2/0, una lmea celular que comprende un pequeno ARN interferente espedficamente contra el gen FUT8 y una lmea celular que coexpresa p-1,4-A/-acetilglucosaminiltransferasa III y Golgi a-manosidasa II. Alternativamente, la molecula que contiene Fc puede expresarse en una celula no mamffera tal como una celula vegetal, levadura o celula procariota, por ejemplo, E. coli. Por lo tanto, en ciertas realizaciones de la invencion, una composicion comprende un anticuerpo de la invencion que tiene fucosilacion reducida o que carece de fucosilacion en conjunto.

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Composiciones farmaceuticas

[0203] En algunas realizaciones, la invencion proporciona una composicion farmaceutica que comprende una cantidad terapeuticamente eficaz de uno o una pluralidad de protemas de union de antigenos de la invencion junto con diluyentes farmaceuticamente eficaces, portador, solubilizante, emulsionante, conservante, y/o adyuvante. En ciertas realizaciones, la protema de union a antigeno es un anticuerpo. Las composiciones farmaceuticas de la invencion incluyen, pero no se limitan a, composiciones lfquidas, congeladas y liofilizadas.

[0204] Preferiblemente, los materiales de formulacion no son toxicos para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas. En realizaciones espedficas, se proporcionan composiciones farmaceuticas que comprenden una cantidad terapeuticamente eficaz de una protema de union a antigeno OSMR, por ejemplo, un anticuerpo de union a OSMR.

[0205] En ciertas realizaciones, la composicion farmaceutica puede contener materiales de formulacion para modificar, mantener o conservar, por ejemplo, el pH, osmolaridad, viscosidad, claridad, color, isotonicidad, olor, esterilidad, estabilidad, velocidad de disolucion o liberacion, la adsorcion o penetracion de la composicion. En tales realizaciones, los materiales de formulacion adecuados incluyen, pero no se limitan a, aminoacidos (tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina, prolina o lisina); antimicrobianos; antioxidantes (como acido ascorbico, sulfito de sodio o hidrogenosulfito de sodio); tampones (tales como borato, bicarbonato, Tris-HCl, citratos, fosfatos u otros acidos organicos); agentes de carga (como manitol o glicina); agentes quelantes (como el acido etilendiamino tetraacetico (EDTA)); agentes complejantes (tales como cafema, polivinilpirrolidona, beta-ciclodextrina o hidroxipropilo-beta-ciclodextrina); rellenos monosacaridos; disacaridos; y otros carbohidratos (como glucosa, manosa o dextrinas); protemas (como la albumina serica, gelatina o inmunoglobulinas); agentes colorantes, aromatizantes y diluyentes; agentes emulsionantes; polfmeros hidrofilos (tales como polivinilpirrolidona); polipeptidos de bajo peso molecular; contraiones formadores de sal (como el sodio); conservantes (tales como cloruro de benzalconio, acido benzoico, acido salidlico, timerosal, alcohol fenetflico, metilparabeno, propilparabeno, clorhexidina, acido sorbico o peroxido de hidrogeno); disolventes (como glicerina, propilenglicol o polietilenglicol); alcoholes de azucar (como manitol o sorbitol); agentes de suspension; tensioactivos o agentes humectantes (tales como pluronics, PEG, esteres de sorbitan, polisorbatos tales como polisorbato 20, polisorbato, triton, trometamina, lecitina, colesterol, tiloxapal); agentes potenciadores de la estabilidad (tales como sacarosa o sorbitol); agentes potenciadores de la tonicidad (tales como haluros de metales alcalinos, preferiblemente cloruro de sodio o potasio, manitol sorbitol); vehmulos de reparto; diluyentes excipientes y/o adyuvantes farmaceuticos. Vease, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18a Edicion, (AR Genrmo, ed.), 199o, Mack Publishing Company.

[0206] En ciertas realizaciones, la composicion farmaceutica optima sera determinada por un experto en la tecnica dependiendo de, por ejemplo, la via de administracion prevista, el formato de administracion y la dosis deseada. vease, por ejemplo, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, supra. En ciertas realizaciones, tales composiciones pueden influir en el estado ffsico, la estabilidad, la velocidad de liberacion in vivo y la velocidad de eliminacion in vivo de las protemas de union a antfgeno de la invencion. En ciertas realizaciones, el vehmulo o vehmulo primario en una composicion farmaceutica puede ser de naturaleza acuosa o no acuosa. Por ejemplo, un vehmulo o vehmulo adecuado puede ser agua para inyeccion, solucion salina fisiologica o lfquido cefalorraqrndeo artificial, posiblemente suplementado con otros materiales comunes en composiciones para administracion parenteral. La solucion salina tamponada neutra o la solucion salina mezclada con albumina serica son otros vehmulos ejemplares. En realizaciones espedficas, las composiciones farmaceuticas comprenden un tampon Tris de aproximadamente pH 7,0-8,5, o un tampon de acetato de aproximadamente pH 4,0-5,5, y pueden incluir ademas sorbitol o un sustituto adecuado para el mismo. En ciertas realizaciones de la invencion, las composiciones de protemas de union al antfgeno OSMR de la invencion pueden prepararse para el almacenamiento mezclando la composicion seleccionada que tenga el grado de pureza deseado con agentes de formulacion opcionales (REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, supra) en forma de torta liofilizada o una solucion acuosa. Ademas, en ciertas realizaciones, el producto de la protema de union al antfgeno OSMR puede formularse como un liofilizado usando excipientes apropiados tales como sacarosa.

[0207] Las composiciones farmaceuticas de la invencion se pueden seleccionar para la administracion parenteral. Alternativamente, las composiciones pueden seleccionarse para inhalacion o para administracion a traves del tracto digestivo, tal como por via oral. La preparacion de tales composiciones farmaceuticamente aceptables esta dentro de los conocimientos de la tecnica. Los componentes de la formulacion estan presentes preferiblemente en concentraciones que son aceptables para el sitio de administracion. En ciertas realizaciones, se usan tampones para mantener la composicion a pH fisiologico o a un pH ligeramente inferior, tfpicamente dentro de un intervalo de pH de aproximadamente 5 a aproximadamente 8.

[0208] Cuando se contempla la administracion parenteral, las composiciones terapeuticas para uso en esta invencion pueden proporcionarse en forma de una solucion acuosa libre de pirogenos, parenteralmente aceptable que comprende la protema de union a antfgeno de OSMR deseada en un vehmulo farmaceuticamente aceptable. Un vehmulo particularmente adecuado para la inyeccion parenteral es agua destilada esteril en la que la protema de union al antfgeno OSMR se formula como una solucion isotonica esteril, conservada adecuadamente. En ciertas realizaciones, la preparacion puede involucrar la formulacion de la molecula deseada con un agente, como

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microesferas inyectables, partroulas bioerosionables, compuestos polimericos (como acido polilactico o acido poliglicolico), perlas o liposomas, que pueden proporcionar liberacion del producto que puede ser entregado a traves de inyeccion de deposito. En ciertas realizaciones, tambien se puede usar acido hialuronico, que tiene el efecto de promover una duracion sostenida en la circulacion. En ciertas realizaciones, se pueden usar dispositivos de administracion de farmacos implantables para introducir la protema de union a antfgeno deseada.

[0209] Las composiciones farmaceuticas de la invencion se pueden formular para inhalacion. En estas realizaciones, las protemas de union a antigeno OSMR de la invencion se formulan ventajosamente como un polvo seco e inhalable. En realizaciones espedficas, las soluciones de inhalacion de protemas de union al antigeno OSMR tambien se pueden formular con un propelente para el suministro de aerosol. En ciertas realizaciones, las soluciones pueden ser nebulizadas. La administracion pulmonar y los metodos de formulacion, por lo tanto, se describen adicionalmente en la Solicitud de Patente Internacional N° PCT/US94/001875, que describe la administracion pulmonar de protemas modificadas qmmicamente.

[0210] Tambien se contempla que las formulaciones pueden administrarse por via oral. Las protemas de union al antigeno OSMR que se administran de esta manera se pueden formular con o sin vehroulos que se utilizan habitualmente en la composicion de formas de dosificacion solidas, como tabletas y capsulas. En ciertas realizaciones, se puede disenar una capsula para liberar la porcion activa de la formulacion en el punto del tracto gastrointestinal cuando se maximiza la biodisponibilidad y se minimiza la degradacion presistemica. Se pueden incluir agentes adicionales para facilitar la absorcion de la protema de union al antfgeno OSMR. Tambien se pueden emplear diluyentes, saborizantes, ceras de bajo punto de fusion, aceites vegetales, lubricantes, agentes de suspension, agentes desintegrantes de comprimidos y aglutinantes.

[0211] Las composiciones farmaceuticas adicionales seran evidentes para los expertos en la tecnica, incluyendo formulaciones que implican protemas de union a antigeno OSMR en formulaciones de administracion sostenida o controlada de union. Los expertos en la materia tambien conocen tecnicas para formular una variedad de otros medios de administracion sostenida o controlada, tales como portadores de liposomas, micropartmulas bioerosionables o perlas porosas e inyecciones de depositos. Vease, por ejemplo, la solicitud de patente internacional n° PCT/US93/00829, que describe la liberacion controlada de micropartroulas polimericas porosas para el suministro de composiciones farmaceuticas. Las preparaciones de liberacion sostenida pueden incluir matrices de polfmeros semipermeables en forma de artroulos conformados, por ejemplo, pelroulas o microcapsulas. Las matrices de liberacion sostenida pueden incluir poliesteres, hidrogeles, polilactidas (como se describe en la Patente de EE.UU. N° 3.773.919 y en la Publicacion de Solicitud de Patente Europea N° EP 058481), copolfmeros de acido L- glutamico y gamma-etilo-L-glutamato (Sidman et al., 1983, Biopolymers 2: 547-556), poli (2-hidroxietilo-metacrilato) (Langer et al., 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15: 167-277 y Langer, 1982, Chem. Tech. 12: 98-105), acetato de vinilo de etileno (Langer et al., 1981, supra) o acido poli-D(-)-3-hidroxibutmco (publicacion de solicitud de patente europea n° EP 133.988). Las composiciones de liberacion sostenida tambien pueden incluir liposomas que pueden prepararse por cualquiera de varios metodos conocidos en la tecnica. Vease, por ejemplo, Eppstein et al., 1985, Proc. Natl Acad Sci. EE.UU. 82: 3688-3692; Publicacion de Solicitud de Patente Europea Nos EP 036.676; EP 088.046 y EP 143.949.

[0212] Las composiciones farmaceuticas utilizadas para la administracion in vivo se proporcionan tfpicamente como preparaciones esteriles. La esterilizacion se puede lograr mediante filtracion a traves de membranas de filtracion esteriles. Cuando la composicion esta liofilizada, la esterilizacion utilizando este metodo puede realizarse antes o despues de la liofilizacion y reconstitucion. Las composiciones para administracion parenteral se pueden almacenar en forma liofilizada o en una solucion. Las composiciones parenterales generalmente se colocan en un recipiente que tiene un puerto de acceso esteril, por ejemplo, una bolsa de solucion intravenosa o vial que tiene un tapon perforable por una aguja de inyeccion hipodermica.

[0213] Los aspectos de la invencion incluyen formulaciones de auto-tamponamiento de las protemas de union al antfgeno OSMR de la invencion, que pueden usarse como composiciones farmaceuticas, como se describe en la solicitud de patente internacional WO 06138181 A2 (PCT/US2006/022599).

[0214] Como se discutio anteriormente, ciertas formas de realizacion proporcionan composiciones de protemas de union a antfgeno OSMR, composiciones particularmente farmaceuticas de protemas de union a antfgeno OSMR que comprenden, ademas de las protemas de union al antfgeno OSMR, uno o mas excipientes tales como los descritos ilustrativamente en esta seccion y en otros lugares aqrn. Los excipientes se pueden usar en la invencion a este respecto para una amplia variedad de propositos, tales como el ajuste de las propiedades ffsicas, qrnmicas o biologicas de las formulaciones, como el ajuste de la viscosidad y los procesos de la invencion para mejorar la efectividad y/o para estabilizar tales formulaciones y procesos contra la degradacion y el deterioro debido, por ejemplo, a las tensiones que se producen durante la fabricacion, envfo, almacenamiento, preparacion previa al uso, administracion, y posteriormente.

[0215] Una variedad de exposiciones estan disponibles en la estabilizacion de protemas y materiales y metodos de formulacion utiles en este sentido, tales como Arakawa et al., "Solvent interactions in pharmaceutical formulations", Pharm Res. 8 (3): 285-91 (1991); Kendrick et al., "Physical stabilization of proteins in aqueous solution," in:

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RATIONAL DESIGN OF STABLE PROTEIN FORMULATIONS: THEORY AND PRACTICE, Carpenter and Manning, eds. Pharmaceutical Biotechnology. 13: 61-84 (2002), y Randolph et al., "Surfactant-protein interactions", Pharm Biotechnol. 13: 159-75 (2002), particularmente en partes pertinentes a excipientes y procesos de los mismos para formulaciones de protemas auto-tamponadas de acuerdo con la presente invencion, especialmente en productos farmaceuticos de protemas y procesos para usos medicos veterinarios y/o humanos.

[0216] Las sales pueden ser utilizadas de acuerdo con ciertas realizaciones de la invencion para, por ejemplo, ajustar la fuerza ionica y/o la isotonicidad de una formulacion y/o para mejorar la solubilidad y/o estabilidad ffsica de una protema u otro ingrediente de una composicion de acuerdo con la invencion.

[0217] Como es bien conocido, los iones pueden estabilizar el estado nativo de protemas mediante la union a residuos cargados en la superficie de la protema y protegiendo grupos cargados y polares en la protema y la reduccion de la fuerza de sus interacciones electrostaticas, interacciones atractivas y repulsivas. Los iones tambien pueden estabilizar el estado desnaturalizado de una protema al unirse, en particular, a los enlaces pepffdicos desnaturalizados (--CONH) de la protema. Ademas, la interaccion ionica con grupos cargados y polares en una protema tambien puede reducir las interacciones electrostaticas intermoleculares y, por lo tanto, prevenir o reducir la agregacion de protemas y la insolubilidad.

[0218] Las especies ionicas difieren significativamente en sus efectos sobre las protemas. Se han desarrollado una serie de clasificaciones categoricas de iones y sus efectos sobre las protemas que se pueden usar para formular composiciones farmaceuticas de acuerdo con la invencion. Un ejemplo es la serie Hofmeister, que clasifica los solutos no ionicos y polares por su efecto sobre la estabilidad conformacional de las protemas en solucion. Los solutos estabilizantes se conocen como "cosmotropicos". Los solutos desestabilizadores se conocen como "caotropicos". Los cosmotropos se usan comunmente en altas concentraciones (por ejemplo, >1 sulfato de amonio molar) para precipitar las protemas de la solucion ("salado"). Los caotropos se usan comunmente para dentaduras postizas y/o para solubilizar protemas ("extraccion de sales"). La efectividad relativa de los iones para "adicion de sales" y "extraccion de sales" define su posicion en la serie de Hofmeister.

[0219] Los aminoacidos libres se pueden utilizar en formulaciones de protemas de union al anffgeno OSMR de acuerdo con diversas realizaciones de la invencion como agentes de carga, estabilizadores, y antioxidantes, asf como otros usos estandar. Se pueden usar lisina, prolina, serina y alanina para estabilizar protemas en una formulacion. La glicina es util en la liofilizacion para asegurar la estructura y propiedades correctas de la torta. La arginina puede ser util para inhibir la agregacion de protemas, tanto en formulaciones ffquidas como en liofilizadas. La metionina es util como antioxidante.

[0220] Los polioles incluyen azucares, por ejemplo, manitol, sacarosa y sorbitol y alcoholes polifffdricos tales como, por ejemplo, glicerol y propilenglicol, y, para los fines de la discusion en el presente documento, polietilenglicol (PEG) y sustancias relacionadas. Los polioles son cosmotropicos. Son agentes estabilizantes utiles en formulaciones tanto ffquidas como liofilizadas para proteger las protemas de los procesos de degradacion ffsica y qmmica. Los polioles tambien son utiles para ajustar la tonicidad de las formulaciones.

[0221] Entre los polioles utiles en realizaciones seleccionadas de la invencion esta el manitol, comunmente usado para asegurar la estabilidad estructural de la torta en formulaciones liofilizadas. Asegura estabilidad estructural a la torta. Generalmente se usa con un lioprotector, por ejemplo, sacarosa. El sorbitol y la sacarosa se encuentran entre los agentes preferidos para ajustar la tonicidad y como estabilizadores para proteger contra las tensiones de congelacion y descongelacion durante el transporte o la preparacion de bultos durante el proceso de fabricacion. La reduccion de azucares (que contienen grupos aldefffdo o cetona libres), como la glucosa y la lactosa, puede glicar los residuos de lisina y arginina de la superficie. Por lo tanto, generalmente no estan entre los polioles preferidos para uso de acuerdo con la invencion. Ademas, los azucares que forman tales especies reactivas, como la sacarosa, que se hidroliza a fructosa y glucosa en condiciones acidas, y en consecuencia engendran la glicacion, tampoco se encuentran entre los polioles preferidos de la invencion a este respecto. El PEG es util para estabilizar protemas y como crioprotector y se puede usar en la invencion a este respecto.

[0222] Las realizaciones de las formulaciones de protemas de union a anffgeno OSMR comprenden ademas tensioactivos. Las moleculas de protemas pueden ser susceptibles a la adsorcion en las superficies y a la desnaturalizacion y la consiguiente agregacion en las interfaces aire-ffquido, solido-ffquido y ffquido-ffquido. Estos efectos generalmente se escalan inversamente con la concentracion de protema. Estas interacciones perjudiciales generalmente se escalan inversamente con la concentracion de protemas y, por lo general, se ven agravadas por la agitacion ffsica, como la generada durante el envm y manejo de un producto.

[0223] Los tensioactivos habitualmente se utilizan para prevenir, minimizar o reducir la adsorcion superficial. Los tensioactivos utiles en la invencion a este respecto incluyen polisorbato 20, polisorbato 80, otros esteres de acidos grasos de polietoxilatos de sorbitan, y poloxamero 188.

[0224] Los tensioactivos tambien son comunmente utilizados para controlar la estabilidad conformacional para protemas. El uso de surfactantes en este sentido es espedfico de protemas, ya que cualquier surfactante dado

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tipicamente estabilizara algunas protemas y desestabilizara otras.

[0225] Los polisorbatos son susceptibles a la degradacion oxidativa y a menudo, tal como se suministran, contienen cantidades suficientes de peroxidos para provocar la oxidacion de cadenas laterales de residuos de protemas, especialmente metionina. En consecuencia, los polisorbatos se deben usar con cuidado y, cuando se usan, se deben emplear a su concentracion efectiva mas baja. En este sentido, los polisorbatos ejemplifican la regla general de que los excipientes deben usarse en sus concentraciones efectivas mas bajas.

[0226] Las realizaciones de las formulaciones de protemas de union a antigeno OSMR comprenden ademas uno o mas antioxidantes. Hasta cierto punto, la oxidacion de protemas puede ser prevenida en formulaciones farmaceuticas manteniendo niveles adecuados de oxfgeno y temperatura ambiente y evitando la exposicion a la luz. Tambien se pueden usar excipientes antioxidantes para prevenir la degradacion oxidativa de las protemas. Entre los antioxidantes utiles a este respecto se encuentran los agentes reductores, los eliminadores de radicales libres/oxfgeno y los agentes quelantes. Los antioxidantes para uso en formulaciones de protemas terapeuticas de acuerdo con la invencion son preferiblemente solubles en agua y mantienen su actividad durante toda la vida util de un producto. El EDTA es un antioxidante preferido de acuerdo con la invencion a este respecto.

[0227] Los antioxidantes pueden danar las protemas. Por ejemplo, los agentes reductores, como el glutation en particular, pueden interrumpir los enlaces disulfuro intramoleculares. Por lo tanto, los antioxidantes para uso en la invencion se seleccionan para, entre otras cosas, eliminar o reducir suficientemente la posibilidad de que danen protemas en la formulacion.

[0228] Las formulaciones de acuerdo con la invencion pueden incluir iones metalicos que son cofactores de protemas y que son necesarios para formar complejos de coordinacion de protemas, tales como el zinc necesario para formar ciertas suspensiones de insulina. Los iones metalicos tambien pueden inhibir algunos procesos que degradan las protemas. Sin embargo, los iones metalicos tambien catalizan los procesos ffsicos y qmmicos que degradan las protemas.

[0229] Los iones de magnesio (10-120 mM) se pueden utilizar para inhibir la isomerizacion de acido aspartico a acido isoaspartico. Los iones Ca+2 (hasta 100 mM) pueden aumentar la estabilidad de la desoxirribonucleasa humana. Mg+2, Mn+2 y Zn+2, sin embargo, pueden desestabilizar la rhDNasa. De manera similar, Ca+2 y Sr+2 pueden estabilizar el Factor VIII, se pueden desestabilizar con Mg+2, Mn+2 y Zn+2, Cu+2 y Fe+2, y su agregacion se puede aumentar con iones Al+3.

[0230] Las realizaciones de las formulaciones de protemas de union a antfgeno OSMR comprenden ademas uno o mas conservantes. Los conservantes son necesarios cuando se desarrollan formulaciones parenterales de dosis multiples que involucran mas de una extraccion del mismo envase. Su funcion principal es inhibir el crecimiento microbiano y garantizar la esterilidad del producto durante todo el penodo de validez o el uso del medicamento. Los conservantes comunmente utilizados incluyen alcohol bendlico, fenol y m-cresol. Si bien los conservantes tienen una larga historia de uso con parentales de molecula pequena, el desarrollo de formulaciones de protemas que incluyan conservantes puede ser un desafm. Los conservantes casi siempre tienen un efecto desestabilizador (agregacion) sobre las protemas, y esto se ha convertido en un factor importante para limitar su uso en formulaciones de protemas de dosis multiples. Hasta la fecha, la mayona de los medicamentos proteicos han sido formulados para un solo uso. Sin embargo, cuando las formulaciones de dosis multiples son posibles, tienen la ventaja adicional de permitir la comodidad del paciente y una mayor capacidad de comercializacion. Un buen ejemplo es el de la hormona del crecimiento humano (hGH), donde el desarrollo de formulaciones preservadas ha llevado a la comercializacion de presentaciones de bolfgrafos de inyeccion de uso multiple mas convenientes. Al menos cuatro de estos dispositivos de pluma que contienen formulaciones conservadas de hGH estan actualmente disponibles en el mercado. Norditropina (lfquido, Novo Nordisk), Nutropina AQ (lfquido, Genentech) y Genotropina (liofilizado - cartucho de doble camara, Pharmacia y Upjohn) contienen fenol, mientras que Somatrope (Eli Lilly) esta formulado con m-cresol.

[0231] Varios aspectos deben considerarse durante la formulacion y el desarrollo de formas de dosificacion preservadas. La concentracion conservante efectiva en el medicamento debe ser optimizada. Esto requiere probar un conservante dado en la forma de dosificacion con rangos de concentracion que confieran efectividad antimicrobiana sin comprometer la estabilidad de la protema.

[0232] Como se podna esperar, el desarrollo de formulaciones lfquidas que contienen conservantes son mas diffciles que las formulaciones liofilizadas. Los productos liofilizados pueden liofilizarse sin el conservante y reconstituirse con un conservante que contiene diluyente en el momento de su uso. Esto acorta el tiempo durante el cual un conservante esta en contacto con la protema, minimizando significativamente los riesgos de estabilidad asociados. Con las formulaciones lfquidas, la efectividad y la estabilidad del conservante se deben mantener durante toda la vida util del producto (alrededor de 18 a 24 meses). Un punto importante a tener en cuenta es que la efectividad del conservante debe demostrarse en la formulacion final que contiene el farmaco activo y todos los componentes del excipiente.

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[0233] Las formulaciones de protemas de union al antigeno OSMR generalmente se disenaran para vfas espedficas y metodos de administracion, para dosis de administracion espedficas y frecuencias de administracion, para tratamientos espedficos de enfermedades espedficas, con rangos de biodisponibilidad y persistencia, entre otras cosas. Por lo tanto, las formulaciones pueden disenarse de acuerdo con la invencion para ser administradas por cualquier via adecuada, incluyendo pero no limitandose a la via oral, auditiva, oftalmica, rectal y vaginal, y parenteral, incluidas la inyeccion intravenosa e intraarterial, la inyeccion intramuscular, y inyeccion subcutanea.

[0234] Una vez que la composicion farmaceutica ha sido formulada, puede ser almacenada en viales esteriles como una solucion, suspension, gel, emulsion, solido, cristal, o como un polvo deshidratado o liofilizado. Dichas formulaciones pueden almacenarse en una forma lista para uso o en una forma (por ejemplo, liofilizada) que se reconstituye antes de la administracion. La presente descripcion tambien proporciona kits para producir una unidad de administracion de dosis unica. Los kits de la descripcion pueden contener cada uno un primer recipiente que tiene una protema seca y un segundo recipiente que tiene una formulacion acuosa. En ciertas realizaciones de esta descripcion, se proporcionan kits que contienen jeringas precargadas de una sola camara y varias camaras (por ejemplo, jeringas lfquidas y liojeringas).

[0235] La cantidad terapeuticamente eficaz de una composicion farmaceutica que contiene protema de union al antfgeno OSMR a ser empleada dependera, por ejemplo, del contexto y los objetivos terapeuticos. Un experto en la materia apreciara que los niveles de dosificacion apropiados para el tratamiento variaran dependiendo, en parte, de la molecula administrada, la indicacion para la cual se esta utilizando la protema de union al antfgeno OSMR, la via de administracion y el tamano (peso corporal), superficie corporal o tamano del organo) y/o afeccion (la edad y la salud general) del paciente. En ciertas realizaciones, el medico puede titular la dosis y modificar la via de administracion para obtener el efecto terapeutico optimo. Una dosis tfpica puede variar desde aproximadamente 0,1 |jg/kg hasta aproximadamente 30 mg/kg o mas, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. En realizaciones espedficas, la dosis puede variar desde 1,0 jg/kg hasta aproximadamente 20 mg/kg, opcionalmente desde 10 jg/kg hasta aproximadamente 10 mg/kg o desde 100 jg/kg hasta aproximadamente 5 mg/kg .

[0236] Una cantidad terapeuticamente efectiva de una protema de union a antfgeno OSMR resulta preferiblemente en una disminucion en la severidad de los smtomas de la enfermedad, en un aumento en la frecuencia o en la duracion de los penodos libres de smtomas de la enfermedad, o en una prevencion del deterioro o discapacidad debida a la afliccion de la enfermedad.

[0237] Las composiciones farmaceuticas se pueden administrar usando un dispositivo medico. Ejemplos de dispositivos medicos para administrar composiciones farmaceuticas se describen en las patentes de EE.UU. Nos 4.475.196; 4.439.196; 4.447.224; 4.447.233; 4.486.194; 4.487.603; 4.596.556; 4.790.824; 4.941.880; 5.064.413; 5.312.335; 5.312.335; 5.383.851; y 5.399.163.

Metodos para diagnosticar o tratar una enfermedad o trastorno asociado con OSMR

[0238] La protema de union a antfgenos OSMR de la invencion de union son particularmente utiles para la deteccion de OSMR en una muestra biologica. En ciertas realizaciones, una muestra biologica obtenida de un paciente se pone en contacto con una protema de union a antfgeno OSMR. La union de la protema de union al antfgeno OSMR a OSMR luego se detecta para determinar la presencia o la cantidad relativa de OSMR en la muestra. Tales metodos pueden ser utiles para diagnosticar o determinar pacientes que son susceptibles de tratamiento con una protema de union a antfgeno OSMR.

[0239] En ciertas realizaciones, una protema unida a antfgeno OSMR de la invencion de union se utiliza para diagnosticar, detectar o tratar un trastorno autoinmune, trastorno inflamatorio, o trastorno asociado con la deposicion de matriz extracelular o remodelacion.

[0240] En el tratamiento de estos trastornos, la protema de union a antfgeno OSMR puede dirigirse a las celulas de expresion de OSMR del sistema inmune para la destruccion y/o puede bloquear la interaccion de OSMR con OSM e/o IL-31.

[0241] Las enfermedades o trastornos que estan asociados con la senalizacion mediada por OSMR son particularmente susceptibles de tratamiento con una o mas protemas de union a antfgeno OSMR descritas en el presente documento. Dichos trastornos incluyen, entre otros, inflamacion, dolor, prurito, prurigo nodular, dermatitis, asma, enfermedad autoinmune, enfermedades autoinmunes paraneoplasicas, inflamacion del cartflago, fibrosis (que incluye, entre otros, fibrosis pulmonar y fibrosis de la piel), enfermedad fibrotica, enfermedad pulmonar obstructiva cronica (EPOC), neumonitis intersticial, deposito anormal de colageno, amiloidosis cutanea sistemica, amiloidosis cutanea primaria, enfermedad de Behcet, poliposis nasal, cirrosis hepatica, degradacion del cartflago, degradacion osea, artritis, artritis reumatoide, artritis juvenil, artritis reumatoide juvenil, artritis reumatoide juvenil pauciarticular, artritis reumatoide juvenil poliarticular, artritis reumatoide juvenil de inicio sistemico, artritis enteropatica juvenil, espondilitis anquilosante juvenil, artritis enteropatico juvenil, artritis reactivo juvenil, smdrome de Reter juvenil, smdrome SEA (seronegatividad, entesopatfa, smdrome de artropatfa), dermatomiositis, artritis psoriatico juvenil, escleroderma juvenil, eritematoso de lupus sistemico juvenil, vasculitis juvenil, artrisis reumatoide pauciarticular,

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artritis reumatoide poliarticular, artritis reumatoide juvenil de inicio sistemico, espondilitis anquilosante, artritis enteropatico, artritis reactivo, smdrome de Reter, smdrome SEA (seronegatividad, entesopatia, smdrome de artropatfa), dermatomiositis, artritis psoriasica, esclerodermia, enfermedad intersticial asociada a esclerodermia, vasculitis, miolitis, polimiolitis, dermatomiolitis, poliarteritis nodossa, granulomatosis de Wegener, arteritis, ploimialgia reumatica, sarcoidosis, scleroderma, esclerosis, esclerosis biliar primario, colangitis esclerosante, smdrome de Sjogren, psoriasis, psoriasis en placa, psoriasis guttata, psoriasis inversa, psoriasis pustulosa, psoriasis eritrodermica, dermatitis, dermatitis atopica, ateroesclerosis, lupus, enfermedad de Still, eritematoso de lupus sistemico (SLE), miastenia grave, enfermedad intestinal inflamatoria (EII), enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, enfermedad celfaca, esclerosis multiple (EM), asma, EPOC, rinosinusitis, rinosinusitis con polipos, esofogitis de eosinofilia, eosinofila, Enfermedad de Guillain-Barre, diabetes mellitus tipo I, tiroiditis (p. ej., "enfermedad" de Graves), enfermedad de Addison, fenomeno de Reynaud, hepatitis autoinmune, GVHD, rechazo de trasplante, dano renal, enfermedad cardiovascular, infeccion, sepsis, infeccion por VIH, traumatismo, nefropatfa por aloinjerto renal, nefropatfa por IgA, nefropatia diabetica, retinopatfa diabetica, degeneracion macular, atresia biliar, insuficiencia cardfaca congestiva, aterosclerosis, reestenosis, fibrosis inducida por radiacion, fibrosis inducida por quimioterapia, quemaduras, traumatismo quirurgico, glomeruloesclerosis y similares.

[0242] En realizaciones preferidas, el trastorno autoinmune, el trastorno inflamatorio o el trastorno asociado a la deposicion o remodelacion de la matriz extracelular es la fibrosis, la degradacion del cartflago, la artritis, la artritis reumatoide, la esclerodermia, la enfermedad pulmonar intersticial asociada a la esclerodermia, la fibrosis pulmonar idiopatica, la cirrosis, psoriasis, dermatitis atopica, amiloidosis cutanea sistemica, amiloidosis cutanea primaria, inflamacion, inflamacion pruriginosa, prurigo nodular y dolor.

[0243] En ciertas realizaciones, una protema de union a antfgeno OSMR de la invencion se usa para diagnosticar, detectar o tratar un cancer o trastorno tumorigenico. Al tratar un cancer o un trastorno tumorigenico, la protema de union al antfgeno OSMR puede apuntar a las celulas que expresan OSMR para su destruccion y/o puede bloquear la interaccion de OSM e/o IL-31 con OSMR, reduciendo asf la senalizacion mediada por OSMR. Se contempla que las protemas de union al antfgeno OSMR que bloquean la senalizacion mediada por OSM e/o IL-31 senan utiles para promover una mejor supervivencia en pacientes con cancer. El cancer o los trastornos tumorigenicos que pueden diagnosticarse, detectarse o tratarse con una protema de union al antfgeno OSMR incluyen, entre otros, tumores solidos en general, cancer de pulmon, cancer de ovario, cancer de mama, cancer de prostata, cancer de endometrio, cancer de rinon, cancer de esofago, cancer pancreatico, carcinoma de celulas escamosas, melanoma uveal, cancer cervical, cancer colorrectal, vejiga, cerebro, pancreas, cabeza, cuello, tugado, leucemia, linfoma y enfermedad de Hodgkin, mieloma multiple, melanoma, cancer gastrico, cancer astrodtico, estomago y adenocarcinoma pulmonar.

[0244] Protemas de union al antfgeno se pueden utilizar para inhibir el crecimiento tumoral, la progresion y/o metastasis. Dicha inhibicion puede controlarse utilizando diversos metodos. Por ejemplo, la inhibicion puede reducir el tamano del tumor y/o disminuir la actividad metabolica dentro de un tumor. Ambos parametros pueden medirse por MRI o PET, por ejemplo. La inhibicion tambien puede controlarse mediante una biopsia para determinar el nivel de necrosis, la muerte de las celulas tumorales y el nivel de vascularizacion dentro del tumor. La extension de la metastasis puede controlarse utilizando metodos conocidos.

[0245] El uso de cualquiera y todos los ejemplos, o lenguaje ejemplar (por ejemplo, "tal como") proporcionado en este documento, pretende meramente ilustrar mejor las realizaciones de la invencion y no plantea una limitacion en el alcance de la invencion a menos que se reivindique lo contrario. Ningun lenguaje en la especificacion debe interpretarse por indicar que cualquier elemento no reivindicado es esencial para la practica de la invencion.

EJEMPLOS

[0246] Los siguientes ejemplos, tanto reales como profeticos, se proporcionan para el proposito de ilustrar realizaciones espedficas o caractensticas de la presente invencion y no estan destinados a limitar su alcance.

EJEMPLO 1: Produccion de anticuerpos anti-OSMR utilizando la plataforma XENOMOUSE®

[0247] Se generaron anticuerpos completamente humanos dirigidos contra OSMR humanas utilizando la tecnologfa XENOMOUSE® (como se describe en las patentes de EE.UU. Nos 6.114.598; 6.162.963; 6.833.268; 7.049.426; 7.064.244; y en Green et al., Nature Genetics 7: 13-21, 1994; Mendez et al., Nature Genetics 15: 146-56; 1997; Green et al., J. Ex. Med. 188: 483-95, 1998; y Kellermann et al., Current Opinion in Biotechnology, 13: 593 -7, 2002).

[0248] Para producir anticuerpos para OSMR, dos cepas diferentes de animales XENOMOUSE®, es decir, los ratones XMG2-KL y XMG4-KL, se inmunizaron con protemas solubles OSMR-Fc humana (preparadas por Amgen, Seattle, WA). Se utilizo una cantidad adecuada de inmunogeno (es decir, diez pg/raton de protema OSMR-Fc humana soluble) para la inmunizacion inicial de animales XENOMOUSE® de acuerdo con los metodos descritos en la Solicitud de Patente de EE.UU. N° de serie 08/759,620, presentada en diciembre 3, 1996 y las Solicitudes de Patente Internacional Nos WO 98/24893, publicadas el 11 de junio de 1998 y WO 00/76310, publicadas el 21 de diciembre de 2000. Despues de la inmunizacion inicial, las inmunizaciones de refuerzo posteriores de inmunogeno

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(cinco pg/raton de humano soluble) La protema OSMR-Fc) se administro de forma programada y durante el tiempo necesario para inducir un tftulo adecuado de anticuerpo anti-OSMR en los ratones.

[0249] Los sueros se recogieron en aproximadamente cuatro semanas despues de la primera inyeccion y los tttulos espedficos se determinaron por ELISA. El protocolo utilizado para dar tftulo a los animales XENOMOUSE® fue el siguiente: las placas de union a medio Costar 3368 se recubrieron con neutravadina a 8 pg/mL (50 pL/pocillo) y se incubaron a 4°C en IXPBS/0,05% de azida durante la noche. Las placas se lavaron usando TiterTek de 3 ciclos de lavado con agua RO. Las placas se bloquearon utilizando 250 pL de 1XPBS/1% de leche y se incubaron durante al menos 30 minutos a temperatura ambiente. El bloque se lavo usando un lavado de 3 tiempos TiterTek con agua de RO. Luego se capturo huOSMR-FNFH biotinilado (preparado por Amgen, Seattle, WA) a 2 pg/mL en 1XPBS/1% de leche/10mM Ca2 + (diluyente de ensayo) 50 pL/pocillo y se incubo durante 1 hora a temperatura ambiente. Luego se lavo con TiterTek en 3 ciclos de lavado con agua RO. Para el anticuerpo primario, los sueros se valoraron 1:3 por duplicado de 1:100. Esto se realizo en un diluyente de ensayo de 50 pL/pocillo y se incubo durante 1 hora a temperatura ambiente. Luego se lavo con TiterTek en 3 ciclos de lavado con agua RO. El anticuerpo secundario fue IgG Fc HRP anti humana de cabra a 400 ng/mL en el diluyente de ensayo a 50 pL/pocillo. Esto se incubo durante 1 hora a temperatura ambiente. Luego se lavo con un lavado de 3 tiempos TiterTek con agua de RO y se seco sobre toallas de papel. Para el sustrato, se utilizo una solucion TMB de un solo paso (Neogen, Lexington, Kentucky) (50 pL/pocillo) y se dejo que el sustrato se desarrollara durante 30 minutos a temperatura ambiente.

[0250] Se identificaron los animales que presentan tftulos adecuados. Se identificaron cinco animales XMG2KL con una respuesta inmune de IgG espedfica a OSMR. Los bazos y los ganglios linfaticos de drenaje se recogieron de estos animales y se agruparon para la generacion de hibridomas. Cinco animales XMG4KL con respuestas inmunitarias espedficas se recolectaron de manera similar y se avanzaron como una campana de deteccion de fusion separada. Celulas B enriquecidas de animales inmunes se fusionaron con celulas no mielosas secretoras P3 x 63Ag8.653 ((Coleccion americana de cultivos tipo CRL-1580; Kearney et al, J. Immunol. 123: 1548-50, 1979) para generar hibridomas usando el estandar tecnicas (Kohler et al., Nature 256, 495-7, 1975).

[0251] Los hibridomas se colocaron en placas a alta densidad (multiples clones de hibridomas diferentes por pocillo) en placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos y se cultivaron durante cuatro semanas. Se examinaron los sobrenadantes de la lmea de hibridoma para determinar su union a OSMR humana y cinomolgico de longitud completa expresados en celulas 293T transfectadas transitoriamente mediante la tecnologfa de ensayo de microvolumen fluorometrico (FMAT) (Applied Biosystems, Foster City, CA). Brevemente, en placas FMAT de 384 pocillos, se combinaron 40 pl de una mezcla de 3.000 celulas transfectadas con OSMR 293T y 15.000 celulas 293T parentales con 15 pL de sobrenadante de hibridoma y 10 pL de cadena ligera antihumana (hukappa/hulambda) Alexa647 (Invitrogen, Carlsbad, CA) anticuerpo secundario marcado (1,0 pg/mL concentracion final). Las placas se incubaron luego durante tres horas a temperatura ambiente y se leyo la fluorescencia usando el lector FMAt. Estas pantallas identificaron 885 lmeas de hibridoma que se unen a OSMR humana y cinomologo.

EJEMPLO 2: Ensayos de bloqueo OSMR humana

[0252] La capacidad de los anticuerpos OSMR para bloquear la senalizacion a traves OSMR humana se determino usando dos ensayos con oncostatina humana M (OSM) o interleucina humana 31 (IL-31) como el ligando. En combinacion, los ensayos se usaron para determinar si los anticuerpos podnan inhibir la senalizacion de OSMR activada a traves de la union de OSM e/o IL-31.

[0253] En la primera pantalla, se evaluaron los anticuerpos para determinar su capacidad para bloquear la senalizacion de OSM a traves de OSMR. La estimulacion de los fibroblastos de pulmon humano normal primario con OSM induce la fosforilacion de STAT3 y su posterior translocacion al nucleo. Las celulas se sembraron a 3.000 celulas por pocillo en placas Costar de 384 pocillos y se dejaron adherir durante la noche. Las celulas se trataron previamente con sobrenadantes de anticuerpos durante veinte minutos y luego se estimularon con OSM humana 80 pM durante 30 minutos. Las celulas luego se lavaron 3X en PBS, se fijaron con una solucion de formaldeddo al 3.5%, se lavaron (3X en PBST) y se permeabilizaron con una solucion de Triton X-100 al 0,5%. Las celulas luego se tineron con un anticuerpo anti-phosphoSTAT3 durante una hora, se lavaron y se tineron con un anticuerpo conjugado con AlexaFluor (todo contenido dentro del HitKit de Cellomics). Las placas se cubrieron y leyeron en el instrumento ArrayScan utilizando el algoritmo propietario de Cellomics para generar un valor de intensidad nuclear y un valor de intensidad citoplasmica. Los resultados se informaron como la diferencia entre estos dos valores y se normalizaron aun mas para controlar los datos que contienen celulas estimuladas al maximo y celulas tratadas con medios (POC).

[0254] En el segundo ensayo, se evaluaron los anticuerpos para su capacidad de inhibir una senal proliferativa de IL-31 a traves de OSMR en una lmea celular estable que sobreexpresa IL-31RA4 humana y OSMR. Las celulas BaF3 se transfectaron de manera estable con dos plasmidos: pcDNA3.1 + huOSMRb (NeoR) y pcDNA3.1 + huIL31RA4 (ZeoR). En ausencia de IL-3 murino, esta lmea celular solo es capaz de proliferar en respuesta a la IL-31 humana y, por lo tanto, podna usarse para evaluar espedficamente la capacidad de bloqueo de los anticuerpos anti- OSMR. Las celulas BaF3 se colocaron en placas de 96 pocillos a una densidad de 20.000 celulas por pocillo. Los anticuerpos y el ligando (huIL-31, Peprotech) se agregaron a los pocillos hasta un volumen final de 100 pL, y las

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placas se incubaron durante 72 horas en 5% de CO2, camara humidificada a 37C. Despues de la incubacion, se agregaron 20 pL de Alamar Blue a cada pocillo y las placas se devolvieron a la incubadora. Las placas se leyeron en un lector de placa Vmax de Molecular Devices (570-600 nm) en varios puntos de tiempo posteriores a la adicion de Alamar Blue.

[0255] Los resultados de los dos ensayos se presentan en la Tabla 4 a continuacion. Se examinaron mas de 3.000 sobrenadantes de hibridoma para determinar su capacidad de bloqueo en estos dos ensayos; los 200 bloqueadores principales se ensayaron en una titulacion de 4 puntos, y se eligieron 14 para la produccion de protema recombinante y pruebas adicionales. La CI50 para tres anticuerpos ejemplares (anticuerpos 1-3) se muestra para ambos ensayos. Algunos anticuerpos inhibieron la translocacion de STAT3 inducida por OSM mas completamente que inhibieron la proliferacion inducida por IL-31, y viceversa. Sin embargo, los tres anticuerpos eran potentes inhibidores de la senalizacion mediada por OSM e IL-31.

Tabla 4

CI50: Ab1 Ab2 Ab3

OSM: 157 pM 252 pM 1,35 nM

IL-31: 35,2 pM 27,6 pM 780 pM

EJEMPLO 3: Ensayos de bloqueo OSMR de Cynomolgus

[0256] La capacidad de los anticuerpos OSMR para bloquear la senalizacion a traves OSMR cynomolgus se exploro usando dos ensayos, ya sea con OSM humana o IL-31 humana como el ligando.

[0257] En la primera pantalla, se evaluaron los anticuerpos para determinar su capacidad para bloquear la senalizacion de OSM a traves de OSMR cynomolgus utilizando una lmea de celulas epiteliales de rinon primario. La estimulacion de estas celulas con cynomolgus (cyno) OSM induce la fosforilacion de STAT3 y su posterior translocacion al nucleo. Las celulas se sembraron a 3.000 celulas por pocillo en placas Costar de 384 pocillos y se dejaron adherir durante la noche. Las celulas se trataron previamente con sobrenadantes de anticuerpos durante veinte minutos y, a continuacion, se estimularon con 80% de picosis OSM durante 30 minutos. Las celulas luego se lavaron 3X en PBS, se fijaron con una solucion de formaldelmdo al 3,5%, se lavaron (3X en PBST) y se permeabilizaron con una solucion de Triton X-100 al 0,5%. Las celulas luego se tineron con un anticuerpo anti- phosphoSTAT3 durante una hora, se lavaron y se tineron con un anticuerpo conjugado con AlexaFluor (todo contenido dentro del HitKit de Cellomics). Las placas se cubrieron y leyeron en el instrumento ArrayScan utilizando el algoritmo propietario de Cellomics para generar un valor de intensidad nuclear y un valor de intensidad citoplasmica. Los resultados se informaron como la diferencia entre estos dos valores y se normalizaron aun mas para controlar los datos que contienen celulas estimuladas al maximo y celulas tratadas con medios (POC).

[0258] En el segundo ensayo, se evaluaron los anticuerpos para su capacidad de inhibir una senal proliferativa de IL-31 a traves de OSMR cynomolgus en una lmea celular estable que sobreexpresa cyno IL-31RA y OSMR. De manera similar al Ejemplo 2, las celulas BaF3 se colocaron en placas de 96 pocillos a una densidad de 20.000 celulas por pocillo. Anticuerpos y ligando (cynomolgus IL-31, en casa, es decir, Amgen, Seattle, WA) se agregaron a los pocillos hasta un volumen final de 100 pL, y las placas se incubaron durante 72 horas en CO2 al 5%, camara humidificada a 37C. Despues de la incubacion, se agregaron 20 pL de Alamar Blue a cada pocillo y las placas se devolvieron a la incubadora. Las placas se leyeron en el lector de placas Molecular Devices Vmax (570-600 nm) en varios puntos de tiempo posteriores a la adicion de Alamar Blue.

[0259] Los resultados de los dos ensayos se presentan en la Tabla 5 a continuacion con la CI50 para cada anticuerpo se muestra para ambos ensayos. Los resultados confirman que cada uno de los anticuerpos 1, 2 y 3 son potentes inhibidores de la senalizacion mediada por OSM e IL-31.

Tabla 5

CI50: Ab1 Ab2 Ab3

OSM: 1,26 nM 518 pM 1,24 nM

IL-31: 225 pM 29,3 pM 6,87 nM

EJEMPLO 4: Combinacion de epitopos de anticuerpos anti-OSMR

[0260] Se realizaron estudios de competicion de anticuerpos para caracterizar los epftopos de los anticuerpos anti- OSMR xenomouse. Se puede considerar que los anticuerpos que compiten entre sf vinculan el mismo sitio con la diana. En estos experimentos, se capturaron OSMR o anticuerpos irrelevantes en perlas de Luminex recubiertas con estreptavidina previamente unidas a un anticuerpo de captura (anticuerpo anti-IgG Fc de raton monovalente biotinilado). Se anadio antfgeno o tampon OSMR (sin antfgeno) a los pocillos, y se anadio un anticuerpo de sonda a

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cada pocillo y se detecto con un anticuerpo anti-IgG Fc de raton monovalente marcado con PE. Se midio la intensidad media de fluorescencia de cada pocillo. Para una referencia completa, vease Jia et al., J. Immunol. Methods 288: 91-8, 2004. La deteccion de fluorescencia en un pozo dado indico que el anticuerpo de la sonda era capaz de unirse a OSMR, incluso en presencia del otro anticuerpo OSMR, lo que demuestra que se unen a epitopes separados. Se encontro un mmimo de tres contenedores como se muestra en la Tabla 6 a continuacion.

Tabla 6

Combinacion 1: Ab4

Combinacion 2: Ab1, Ab2, Ab3, Ab5, Ab6, Ab7, Ab8, Ab9, Ab10, Ab11, Ab12 y Ab13

Combinacion 3: Ab14

EJEMPLO 5: Determinacion de afinidad de anticuerpos anti-OSMR

[0261] Se determinaron las afinidades de los anticuerpos anti-OSMR. Se realizaron determinaciones constantes de la velocidad cinetica para investigar la interaccion de los anticuerpos 1-3 (Abs 1-3) con la OSMR humana.

[0262] El analisis del biosensor se realizo a 25°C en un sistema de tampon HBS-EP + (IX) (HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 3,0 mM, surfactante P20 al 0,05%) utilizando un biosensor optico Biacore 3000 equipado con un Sensor de chip CM5. Todos los reactivos se mantuvieron a 8°C antes de la inyeccion. La IgG antihumana de cabra (Jackson ImmunoResearch, n.° 109-005-098) se inmovilizo (< 3000 RU) en el chip sensor mediante un acoplamiento de amina estandar a las Celulas de Flujo 1 y 2 y luego se bloqueo con etanolamina. Se preparo hOSMR.FH en tampon de funcionamiento a 150 nM y se diluyo 3 veces hasta 0,617 nM. Los anticuerpos 1-3 se diluyeron (0,25 a 0,5 jg/ml) en un tampon de funcionamiento. Los anticuerpos se inyectaron (15 jL) en la celula de flujo 2 a una velocidad de flujo de 10 jL/min. Cerca de 50 RU de anticuerpo fue capturado. La superficie se dejo estabilizar (90 s) y luego cada concentracion (150, 50,0, 16,7, 5,56, 1,85 y 0,617) de hOSMR se paso sobre las celulas de flujo 1 y 2 a una velocidad de flujo de 50 jL/min para observar la asociacion (5 min) y disociacion (5 min). Las muestras se ejecutaron por duplicado y en orden aleatorio.

[0263] Se inyectaron blancos de analito de tampon (0 nM hOSMR) antes, entre y despues de las inyecciones de muestra. Se inyectaron anticuerpos (15 jL) sobre la celula de flujo 2 a una velocidad de flujo de 10 jE/min. Cerca de 50 RU de anticuerpo fue capturado. La superficie se dejo estabilizar (90 s) y luego cada concentracion (150 nM) de hOSMR se paso sobre las celulas de flujo 1 y 2 a un caudal de 50 jL/min para observar la asociacion (5 min) y la disociacion (1-2 h). Las muestras se realizaron por triplicado.

[0264] Se inyectaron blancos de analito de tampon (0 nM hOSMR) antes y despues de las inyecciones de muestra. La superficie se regenero a un caudal de 50 jL/min con dos inyecciones de glicina 10 mM (pH 1,5, 50 jL). Esto fue seguido por una inyeccion de tampon (15 s).

[0265] Los datos se analizaron con el software Scrubber 2.0 de la siguiente manera. Los datos de la celula de flujo 2 se restaron de los datos de la celula de flujo 1 (referencia en blanco). Los datos de referencia restados (2-1) se restaron (doble referencia) de los datos de concentracion 0 nM mas cercanos. Los datos de disociacion larga con doble referencia se ajustaron a un modelo de union 1:1 para determinar la constante de velocidad de disociacion (kd). Esta constante de velocidad de disociacion se uso como un parametro fijo para ajustar los datos de disociacion corta de doble referencia en un modelo de union 1:1 para determinar la constante de velocidad de asociacion (ka) y la constante de disociacion de equilibrio (Kd).

[0266] Los reactivos se portaron bien bajo las condiciones experimentales y los datos (vease la Tabla 7 a continuacion) encajan bastante bien en un modelo de union 1:1.

Tabla 7

Anticuerpo: Antigeno ka (1/Ms) kd (1/s) Kd (pM)

Ab1: huOSMR 4,47 x 105 9,95 x 10-5 221

Ab2: huOSMR 5,50 x 105 1,81 x 10-5 32,7

Ab3: huOSMR 9,47 x 104 1,02 x 10-4 1080

EJEMPLO 6: Anticuerpos anti-OSMR

[0267] Los anticuerpos totalmente humanos dirigidos contra OSMR humana se generaron utilizando la tecnologfa XENOMOUSE® se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 1. Cada uno de los anticuerpos 1, 2, y 3 demostraron ser potentes inhibidores de senalizacion mediada por OsM- y/o IL-31. Las secuencias de los anticuerpos 1, 2 y 3 (es decir, Ab1, Ab2 y Ab3) se determinaron y se exponen en la Tabla 8 a continuacion.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Tabla 8

Descripcion: SEQ ID NO Secuencia

Ab1 - nucleotido de cadena pesada: 3 caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggc ctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggatacaccttcaccagtt atgatatcaactgggtgcgacaggccactggacaggggcttgagtgg atgggatggatgaaccctaatagtggtaacacagactatgcacagaa gttccagggcagagtcaccatgaccaggaacatttccataagcacgg cctacattgagctgagcagcctgagatctgaggacacggccgtttat tactgtgcgagagatatggtggctgcgaatacggattactacttcta ctacggtatggacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctcct cagctagcaccaagggcccatcggtcttccccctggcgccctgctcc aggagcacctccgagagcacagcggccctgggctgcctggtcaagga ctacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgctctga ccagcggcgtgcacaccttcccagctgtcctacagtcctcaggactc tactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcaacttcggcac ccagacctacacctgcaacgtagatcacaagcccagcaacaccaagg tggacaagacagttgagcgcaaatgttgtgtcgagtgcccaccgtgc ccagcaccacctgtggcaggaccgtcagtcttcctcttccccccaaa acccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcg tggtggtggacgtgagccacgaagaccccgaggtccagttcaactgg tacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccacggga ggagcagttcaacagcacgttccgtgtggtcagcgtcctcaccgttg tgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctcc aacaaaggcctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaaaccaa agggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccggg aggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggc ttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagcc ggagaacaactacaagaccacacctcccatgctggactccgacggct ccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcag caggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaa ccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa

5

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Descripcion: SEQ ID NO Secuencia

Ab2 - nucleotido de cadena pesada: 4 caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggc ctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggatacaccttcaccagtt atgaaatcaactgggtgcgacaggccactggacaagggcttgagtgg atgggatggatgaaccctaacagtggttacacaggctatgcacagaa gttccagggcagagtcaccatgaccaggaacacctccataagcacag cctacatggaaatgagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtat tactgtgcgagagatatagtggctgcgaatacggattactacttcta ttatggtatggacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctcct cagctagcaccaagggcccatcggtcttccccctggcgccctgctcc aggagcacctccgagagcacagcggccctgggctgcctggtcaagga ctacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgctctga ccagcggcgtgcacaccttcccagctgtcctacagtcctcaggactc tactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcaacttcggcac ccagacctacacctgcaacgtagatcacaagcccagcaacaccaagg tggacaagacagttgagcgcaaatgttgtgtcgagtgcccaccgtgc ccagcaccacctgtggcaggaccgtcagtcttcctcttccccccaaa acccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcg tggtggtggacgtgagccacgaagaccccgaggtccagttcaactgg tacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccacggga ggagcagttcaacagcacgttccgtgtggtcagcgtcctcaccgttg tgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctcc aacaaaggcctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaaaccaa agggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccggg aggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggc ttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagcc ggagaacaactacaagaccacacctcccatgctggactccgacggct ccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcag caggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaa ccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa

Ab3 - nucleotido de cadena pesada: 5 caggttcatctggtgcagtctggagctgaggtgaagaagcctggggc ctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggttacacctttaccagct atggtatcagctgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtgg atgggatggctcagcacttacagtggtaacacaaactatgcacagaa gctccagggcagagtcaccatgaccacagacacatccacgagcacag cctacatggagctgaggagcctgagatctgacgacacggccgtgtat tactgtgcgagagggaacttctactactacggtatggacgtctgggg ccaggggaccacggtcaccgtctcctcagctagcaccaagggcccat cggtcttccccctggcgccctgctccaggagcacctccgagagcaca gcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgac ggtgtcgtggaactcaggcgctctgaccagcggcgtgcacaccttcc cagctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtg accgtgccctccagcaacttcggcacccagacctacacctgcaacgt

5

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Descripcion: SEQ ID NO Secuencia


: agatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagacagttgagcgca aatgttgtgtcgagtgcccaccgtgcccagcaccacctgtggcagga ccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgat ctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccacg aagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtg cataatgccaagacaaagccacgggaggagcagttcaacagcacgtt ccgtgtggtcagcgtcctcaccgttgtgcaccaggactggctgaacg gcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccagccccc atcgagaaaaccatctccaaaaccaaagggcagccccgagaaccaca ggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccagg tcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgcc gtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccac acctcccatgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagc tcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgc tccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcct ctccctgtctccgggtaaa

Ab1 - protema de cadena pesada: 6 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYDINWVRQATGQGLEW MGWMNPNSGNTDYAQKFQGRVTMTRNISISTAYIELSSLRSEDTAVY YCARDMVAANTDYYFYYGMDVWGQGTTVTVSSA5TKGPSVFPLAPCS RSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL YSLSSWTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPC PAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVQFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTWHQDWLNGKEYKCKVS NKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

Ab2 - protema de cadena pesada: 7 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYEINWVRQATGQGLEW MGWMNPNSGYTGYAQKFQGRVTMTRNTSISTAYMEMSSLRSEDTAVY YCARDIVAANTDYYFYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCS RSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL YSLSSWTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPC PAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVQFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTWHQDWLNGKEYKCKVS NKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

Ab3 - protema de cadena pesada: 8 QVHLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGISWVRQAPGQGLEW MGWLSTYSGNTNYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVY YCARGNFYYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSEST AAL GC LVK DY F PE PVTV SWNS GALT SGVH T F PAVLQ SSGLYSLS SVV TVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAG PSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVWDVSHEDPEVQFNWYVDGVEV HNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAP IEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSC SVMHEALHNHYTQKSLSLS PGK

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Descripcion: SEQ ID NO Secuencia

Ab1 - protema de cadena pesada: 9 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYDINWVRQATGQGLEW MGWMNPN S GNTDYAQKFQGRVTMTKNISISTAYIELS SLRSE DTAVY Y CARDMVAANIDYYFYY GMDVWGQGTTVTVSS

Ab2 - protema de cadena pesada: 10 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYEINWVRQATGQGLEW MGWMNPNSGYTGYAQKFQGRVTMTRNTSISTAYMEMSSLRSEDTAVY YCARDIVAANTDYYFYYGMDVWGQGTTVTVSS

Ab3 - protema de cadena pesada: 11 QVHLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGISWVRQAPGQGLEW MGWLSTYSGNTNYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVY YCARGNFYYYGMDVWGQGTTVTVSS

Ab1 - CDR1 de cadena pesada: 12 SYDIN

Ab2 - CDR1 de cadena pesada: 13 SYEIN

Ab3 - CDR1 de cadena pesada: 14 SYGIS

Ab1 - CDR2 de cadena pesada: 15 WMNPNSGNTDYAQKFQG

Ab2 - CDR2 de cadena pesada: 16 WMGWMNPNSGYTGYAQKFQG

Ab3 - CDR2 de cadena pesada: 17 WLSTYSGNTNYAQKLQG

Ab1 - CDR3 de cadena pesada: 18 DMVAANTDYYFYYGMDV

Ab2 - CDR3 de cadena pesada: 19 DIVAANTDYYFYYGMDV

Ab3 - CDR3 de cadena pesada: 20 GNFYYYGMDV

Ab1 - nucleotido de la cadena ligera: 21 cagtctgtgctgactcagccaccctcagcatctgggacccccgggca gagggtcaccatctcttgttctggaagcagctccaacgtcggaagta atactgtaagctggtaccaacagctcccaggaacggcccccaaactc ctcatctatactaataatcggcggccctccggggtccctgaccgatt ctctggctccaagtctggcacctcagcctccctggccatcagtgggc tccagtctgaggatgaggctgattatttctgtgcagcgttagatgac agtctgaatggtgtggtattcggcggagggaccaaactgaccgtcct aggccaaccgaaagcggcgccctcggtcactctgttcccgccctcct ctgaggagcttcaagccaacaaggccacactggtgtgtctcataagt gacttctacccgggagccgtgacagtggcctggaaggcagatagcag ccccgtcaaggcgggagtggagaccaccacaccctccaaacaaagca acaacaagtacgcggccagcagctatctgagcctgacgcctgagcag tggaagtcccacagaagctacagctgccaggtcacgcatgaagggag caccgtggagaagacagtggcccctacagaatgttca

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Descripcion: SEQ ID NO Secuencia

Ab2 - nucleotido de la cadena ligera: 22 cagtctgtgctgactcagccaccctcagcgtctgggacccccgggca gagggtcaccatctcttgttctggaagcaactccaacatcggaagta atactgtcaactggtaccaccagctcccaggaacggcccccaaactc ctcatctataatattaataagcggccctcaggggtccctgaccgatt ctctggctccaagtctggctcctcagcctccctggccatcagtgggc tccagtctgaggatgaggctgattattactgttcaacatgggatgac agcctggatggtgtggtattcggcggagggaccaagctgaccgtcct aggccaaccgaaagcggcgccctcggtcactctgttcccgccctcct ctgaggagcttcaagccaacaaggccacactggtgtgtctcataagt gacttctacccgggagccgtgacagtggcctggaaggcagatagcag ccccgtcaaggcgggagtggagaccaccacaccctccaaacaaagca acaacaagtacgcggccagcagctatctgagcctgacgcctgagcag tggaagtcccacagaagctacagctgccaggtcacgcatgaagggag caccgtggagaagacagtggcccctacagaatgttca

Ab3 - nucleotido de la cadena ligera: 23 gaaattgtgttgacgcagtctccaggcaccctgtctttgtctccagg ggaaagagccaccctctcctgcagggccagtcagagtgttagcagca gctacttagcctggtaccagcagaaacctggccaggctcccaggctc ctcatctttggtgcttccagcagggccactggcatcccagacaggtt cagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcagac tggagcctgaagattttgcagtgtattactgtcagcagtatggtagc tcgcctccgatcaccttcggccaagggacacgactggagattaaacg tacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagc agttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttc tatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctcca atcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggaca gcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactac gagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgag ctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt

Ab1 - protema de cadena ligera: 24 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNVGSNTVSWYQQLPGTAPKL LIYTNNRRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYFCAALDD SLNGWFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLIS D FY PGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQ WKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS

Ab2 - protema de cadena ligera: 25 GSVLTQPPSASGTPGQ RVTISCSGSNSNIGSNTVNWYHQLPGTAPKL LIYNINKRPSGVPDRFSGSKSGSSASLAISGLQSEDEADYYCSTWDD SLDGWFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLIS DFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQ WKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS

Ab3 - protema de cadena ligera: 26 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRL LIFGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGS SPPITFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNF YPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADY EKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

Ab1 - Variable de cadena ligera: 27 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNVGSNTVSWYQQLPGTAPKL LIYTNNRRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYFCAALDD SLNGWFGGGTKLTVLG

5

10

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Descripcion: SEQ ID NO Secuencia

Ab2 - Variable Cadena Ligera: 28 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSNSNIGSNTVNWYHQLPGTAPKL LIYNINKRPSGVPDRFSGSKSGSSASLAISGLQSEDEADYYCSTWDD SLDGWFGGGTKLTVLG

Ab3 - Variable Cadena Ligera: 29 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRL LIFGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGS SPPITFGQGTRLEIKR

Ab1 - CDR1 de Cadena Ligera: 30 SGSSSNVGSNTVS

Ab2 - CDR1 de Cadena Ligera: 31 SGSNSNIGSNTVN

Ab3 - CDR1 de Cadena Ligera: 32 RASQSVSSSYLA

Ab1 - CDR2 de Cadena Ligera: 33 TNNRRPS

Ab2 - CDR2 de Cadena Ligera: 34 NINKRPS

Ab3 - CDR2 de Cadena Ligera: 35 GASSRAT

Ab1 - CDR3 de Cadena Ligera: 36 AALDDSLNGVV

Ab2 - CDR3 de Cadena Ligera: 37 STWDDSLDGVV

Ab3 - CDR3 de Cadena Ligera: 38 QQYGSSPPIT

EJEMPLO 7: Anticuerpos anti-OSMR modificados

[0268] Se generaron las versiones modificadas de Ab1, Ab2 y Ab3. Para las tres formas modificadas de los anticuerpos, se elimino la lisina en el extremo C de la cadena pesada. Para Ab1 y Ab2, el sitio de glicosilacion en la posicion 73 se elimino sustituyendo la asparagina en la posicion 73 con un acido aspartico. Estas variantes se denominan Ab1-N73D y Ab2-N73D. Las secuencias de los anticuerpos modificados se exponen en la Tabla 9 a continuacion (los nucleotidos modificados y los aminoacidos estan subrayados).

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Tabla 9

Descripcion: SEQ ID NO Secuencia

Ab1 version 2 - Nucleotido de cadena pesada (se elimino la lisina N73D/C- terminal): 47 caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggc ctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggatacaccttcaccagtt atgatatcaactgggtgcgacaggccactggacaggggcttgagtgg atgggatggatgaaccctaatagtggtaacacagactatgcacagaa gttccagggcagagtcaccatgaccagggacatttccataagcacgg cctacattgagctgagcagcctgagatctgaggacacggccgtttat tactgtgcgagagatatggtggctgcgaatacggattactacttcta ctacggtatggacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctcct cagctagcaccaagggcccatcggtcttccccctggcgccctgctcc aggagcacctccgagagcacagcggccctgggctgcctggtcaagga ctacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgctctga ccagcggcgtgcacaccttcccagctgtcctacagtcctcaggactc tactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcaacttcggcac ccagacctacacctgcaacgtagatcacaagcccagcaacaccaagg tggacaagacagttgagcgcaaatgttgtgtcgagtgcccaccgtgc ccagcaccacctgtggcaggaccgtcagtcttcctcttccccccaaa acccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcg tggtggtggacgtgagccacgaagaccccgaggtccagttcaactgg tacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccacggga ggagcagttcaacagcacgttccgtgtggtcagcgtcctcaccgttg tgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctcc aacaaaggcctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaaaccaa agggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccggg aggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggc ttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagcc ggagaacaactacaagaccacacctcccatgctggactccgacggct ccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcag caggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaa ccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggt

5

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15

20

25

30

35

40

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50

55

60

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Descripcion: SEQ ID NO Secuencia

Ab2 version 2 - Nucleotido de cadena pesada (se elimino la lisina N73D/C- terminal): 48 eaggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagectggggc ctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggatacaccttcaccagtt atgaaatcaactgggtgcgacaggccactggacaagggcttgagtgg atgggatggatgaaccctaacagtggttacacaggctatgcacagaa gttccagggcagagtcaccatgaccagggacacctccataagcacag cctacatggaaatgagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtat tactgtgcgagagatatagtggctgcgaatacggattactacttcta ttatggtatggacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctcct cagctagcaccaagggcccatcggtcttccccctggcgccctgctcc aggagcacctccgagagcacagcggccctgggctgcctggtcaagga ctacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgctctga ccagcggcgtgcacaccttcccagctgtcctacagtcctcaggactc tactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcaacttcggcac ccagacctacacctgcaacgtagatcacaagcccagcaacaccaagg tggacaagacagttgagcgcaaatgttgtgtcgagtgcccaccgtgc ccagcaccacctgtggcaggaccgtcagtcttcctcttccccccaaa acccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcg tggtggtggacgtgagccacgaagaccccgaggtccagttcaactgg tacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccacggga ggagcagttcaacagcacgttccgtgtggtcagcgtcctcaccgttg tgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctcc aacaaaggcctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaaaccaa agggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccggg aggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggc ttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagcc ggagaacaactacaagaccacacctcccatgctggactccgacggct ccttcttectctacagcaagcteaccgtggaeaagagcaggtggcag caggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaa ccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggt

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65

Descripcion: SEQ ID NO Secuencia

Ab3 - Nucleotido de cadena pesada (se elimino la lisina C- terminal): 49 eaggttcatetggtgcagtctggagetgaggtgaagaageetggggc ctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggttacacctttaccagct atggtatcagctgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtgg atgggatggctcagcacttacagtggtaacacaaactatgcacagaa gctccagggcagagtcaccatgaccacagacacatccacgagcacag cctacatggagctgaggagcctgagatctgacgacacggccgtgtat tactgtgcgagagggaacttctactactacggtatggacgtctgggg ccaggggaccacggtcaccgtctcctcagctageaccaagggcccat cggtcttccccctggcgccctgctccaggagcacctccgagagcaca gcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgac ggtgtcgtggaactcaggcgctctgaccagcggcgtgcacaccttcc cagctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtg accgtgccctccagcaacttcggcacccagacctacacctgcaacgt agatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagacagttgagcgca aatgttgtgtcgagtgcccaccgtgcccagcaccacctgtggcagga ccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgat ctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagecacg aagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtg cataatgccaagacaaagccacgggaggagcagttcaacagcacgtt ccgtgtggtcagcgtcctcaccgttgtgcaccaggactggctgaacg gcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccagccccc atcgagaaaaccatctccaaaaccaaagggcagccccgagaaccaca ggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccagg tcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgcc gtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccac acctcccatgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagc tcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgc tccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcct ctccctgtctccgggt

Ab1 version 2: protema de cadena pesada (se elimino la lisina N73D/C- terminal): 50 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYDINWVRQATGQGLEW MGWMN PNSGNTDYAQK FQGRVTMTRDISISTAYIELSSLRSEDTAVY YCARDMVAANTDYYFYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCS RSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL YSLSSWTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPC PAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVQFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVS NKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

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Descripcion: SEQ ID NO Secuencia

Ab2 version 2 - Protema de cadena pesada (se elimino lisina N73D/C- terminal): 51 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYEINWVRQATGQGLEW MGWMNPNSGYTGYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMEMSSLRSEDTAVY YCARDIVAANTDYYFYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCS R S T SE S TAA LG C LVK DY F P E PVTVS WNS GALT SGVHT FPAVLQS SGL YSLSSWTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPC PAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVQFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTWHQDWLNGKEYKCKVS NKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVF S C SVMH EALHNHYTQK3LSLSPG

Ab3 version 2 - Protema de cadena pesada: 52 QVHLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGISWVRQAPGQGLETa1 MGWLSTYSGNTNYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVY

(se elimino lisina C- terminal): YCARGNFYYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSEST AALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSW TVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVQFNWYVDGVEV HNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTWHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAP IEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSC SVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

Ab1 version 2 - Region variable de cadena pesada (se elimino lisina N73D/C- terminal): 53 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYDINWVRQATGQGLEW MGWMNPNSGNTDYAQKFQGRVTMTRDISISTAYIELSSLRSEDTAVY Y CARDMVAANTDYY FYYGMDVWGQGTTVTVSS

Ab2 version 2 - Region variable de cadena pesada (se elimino lisina N73D/C- terminal): 54 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYEINWVRQATGQGLEW MGWMNPNSGYTGYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMEMSSLRSEDTAVY Y CARDIVAANT DYY FYYGMDVWGQGT TVTVS S

[0269] Los experimented ELISA se realizaron en varios formates (Captura ELISA para el formato sin avidez; Sandwich ELISA para el formato en fase de solucion; y ELISA directo para el formato de avidez en estado solido) utilizando anticuerpos que contienen las regiones variables de Ab1 o Ab2 (o la variante N73D de Ab1 o Ab2) con diferentes regiones Fc.

[0270] Ab1 y Ab2 contienen cada uno los dominios CHI, CH2, CH3 de origen IgG2 humano. Tal como se usa en el presente documento, los terminos "Ab1" y "Ab1 IgG2 WT" se refieren al mismo anticuerpo. De manera similar, los terminos "Ab2" y "Ab2 IgG2 WT" se refieren al mismo anticuerpo.

[0271] Los anticuerpos identificados como "IgG4P agly/IgG1" contienen las regiones variables de Ab1 o Ab2 (o la variante N73D de Ab1 o Ab2) fusionadas con el domino CH1 de la IgG4 humana, la bisagra de la IgG4 humana con una mutacion de Ser a Pro (en la posicion 228) para reducir la mezcla aleatoria, el dominio CH2 de IgG4 humana con una mutacion de Asn a Gln (en la posicion 297) para eliminar el sitio de glicosilacion unido a N, y el dominio CH3 de la IgG1 humana. El marco "IgG4P agly/IgG1" se describe en la solicitud de patente publicada de EE.UU. N° US 2012/0100140.

[0272] Los resultados de ELISA indican que la eliminacion de sitios de glicosilacion a traves de la sustitucion N73D

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no afecto a la union de los anticuerpos modificados a OSMR. Vease Tabla 10.

Tabla 10

Anticuerpo: Captura (CE50) nM Sandwich (CE50) nM Directo (CE50) nM

Ab1 IgG2 WT: 10,2 0,581 0,184

Ab1 N73D IgG2: 4,85 0,359 0,0728

Ab1 N73D IgG4P agly/IgG1: 2,86 0,05 0,0626

Ab2 IgG2 WT: 3,63 0,366 0,182

Ab2 N73D IgG2: 5,49 0,343 0,179

Ab2 N73D IgG4P agly/IgG1: 1,61 0,064 0,0558

[0273] Los estudios de union se realizaron utilizando el metodo BIAcore. Los anticuerpos que contienen las regiones variables de Ab1 o Ab2 (o la variante N73D de Ab1 o Ab2) con diferentes regiones Fc se inmovilizaron en un chip CM4 (GE lifesciences) segun los protocolos del fabricante. Se uso OSMR soluble como el analito. La eliminacion del sitio de glicosilacion en Ab1 y Ab2 a traves de la sustitucion N73D mejoro las afinidades de union. Para Ab1, la sustitucion mejoro la tasa de Kon, mientras que para Ab2 mejoro la tasa de Koff. Vease Tabla 11.

Tabla 11

Anticuerpo: Kon (M-1s-1) Koff (1/s) KD (M)

Ab1 IgG2 WT: 1,64E + 05 1,50E-04 0,913E-9

Ab1 N73D IgG2: 2,49E + 05 1,68E-04 0,675E-9

Ab2 IgG2 WT: 1,88E + 05 1,89E-04 1,01E-09

Ab2 N73D IgG2: 1,73E + 05 4,99E-05 0,289E-9

[0274] La estabilidad de los fragmentos Fab se determino mediante la evaluacion del desplegamiento termico de anticuerpos. La alta temperatura de fusion de los fragmentos Fab se correlaciona directamente con una mayor estabilidad. La eliminacion de los sitios de glicosilacion en Ab2 a traves de la sustitucion N73D no afecto la estabilidad termica de los fragmentos Fab y mostro efectos menores en Ab1, segun se evaluo mediante experimentos de fluorimetna de barrido diferencial. Vease Tabla 12.

Tabla 12

Anticuerpo: Fab Tm (Celsius) Error estandar (Celsius)

Ab1 IgG2 WT: 73,24 0,0097

Ab1 N73D IgG2: 71,21 0,005

Ab1 N73D IgG4P agly/IgG1: 74,23 0,014

Ab2 IgG2 WT: 76,71 0,0096

Ab2 N73D IgG2: 76,54 0,14

Ab2 N73D IgG4P agly/IgG1: 76,69 0,018

[0275] Se evaluo la capacidad de los anticuerpos anti-OSMR modificados para bloquear la senalizacion a traves de OSMR humana. Se evaluo la capacidad de los anticuerpos modificados para inhibir la proliferacion de una lmea celular BaF_hu-IL31R/OSMR/gp130 en presencia de IL31, OSM o IL31 y OsM. Los resultados se presentan en las Tablas 13 y 14 a continuacion, con el CI50 para cada anticuerpo mostrado. Los resultados confirman que las versiones modificadas de Ab1 y Ab2 son potentes inhibidores de la senalizacion mediada por OSM e IL-31.

Tabla 13

Anticuerpo: IL31 (CI50) OSM (CI50) IL31/OSM (CI50)

Ab2: 0,3828 0,3528 < 1,9

Ab1 IgG2 WT: 0,6691 0,5298 4,004

Ab1 N73D IgG2: 0,7565 0,5226 3,702

Ab1 N73D IgG4P agly/IgG1: 0,4672 0,5657 3,080

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Tabla 14

Anticuerpo: IL31 (CI50) OSM (CI50) IL31/OSM (CI50)

Ab2: 0,4426 0,4019 1,8

Ab2 IgG2 WT: 0,3671 0,4758 2,049

Ab2 N73D IgG2: 0,2191 0,1859 1,474

Ab2 N73D IgG4P agly/IgG1: 0,2838 0,2401 1,276

LISTADO DE SECUENCIAS

[0276]

<110> BIOGEN IDEC MA INC.

Arnett, et al.

<120> PROTEfNAS DE UNION AL AN^GENO DE RECEPTOR M DE ONCOSTATINA <130> 01017/47340 <160> 46

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1 <211> 979 <212> PRT <213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE <223> OSMR Humana

<400> 1

Claims

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40

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REIVINDICACIONES

1. Una protema de union al antigeno del receptor de oncostatina M (OSMR), en la que la protema de union al antigeno es un anticuerpo, en el que el anticuerpo comprende:

un dominio variable de cadena ligera que comprende una region 1 determinante de complementariedad de cadena ligera (LCDR1) que tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO:31; una region 2 determinante de complementariedad de cadena ligera (LCDR2) que tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO:34; y una region 3 determinante de complementariedad de cadena ligera (LCDR3) que tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO:37; y

un dominio variable de cadena pesada que comprende una region 1 determinante de complementariedad de cadena pesada (HCDR1) que tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO:13; una region 2 determinante de complementariedad de cadena pesada (HCDR2) que tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO:16; y una region 3 determinante de la complementariedad de la cadena pesada (HCDR3) que tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO:19, en donde el anticuerpo inhibe la union de la oncostatina humana M (OSM) y la interleuquina 31 humana a la OSMR humana, y en donde el anticuerpo reduce la senalizacion de OSMR mediada por oSm y mediada por interleuquina humana en celulas humanas que expresan OSMR.
2. El anticuerpo de la reivindicacion 1, en el que el dominio variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID NO:28.
3. El anticuerpo de la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en el que el dominio variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID NO:54.
4. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que comprende una cadena ligera y una cadena pesada, en donde la cadena ligera comprende la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID: 25.
5. El anticuerpo de la reivindicacion 4, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
6. El anticuerpo de la reivindicacion 4 o la reivindicacion 5, en el que el anticuerpo es un anticuerpo humano.
7. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que el anticuerpo se une a OSMR humana con una afinidad menor o igual a 1 X 10'9 M.
8. Una composicion farmaceutica que comprende el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, junto con un diluyente, vehmulo, solubilizante, emulsionante, conservante y/o adyuvante farmaceuticamente eficaz.
9. Un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 o la composicion de la reivindicacion 8, para uso en el tratamiento de un trastorno autoinmune, un trastorno inflamatorio o un trastorno asociado con la deposicion o remodelacion de la matriz extracelular.
10. El anticuerpo o la composicion para su uso de acuerdo con la reivindicacion 9, en el que el trastorno autoinmune, el trastorno inflamatorio o el trastorno asociado con la deposicion o remodelacion de la matriz extracelular es fibrosis, degradacion del cartflago, artritis, artritis reumatoide, esclerodermia, enfermedad pulmonar asociada a esclerodermia intersticial, fibrosis pulmonar idiopatica, cirrosis, psoriasis, dermatitis atopica, amiloidosis cutanea sistemica, amiloidosis cutanea primaria, inflamacion, prurito, prurigo nodular y dolor.
11. El anticuerpo o la composicion para uso de acuerdo con la reivindicacion 9 o la reivindicacion 10, en donde el anticuerpo o la composicion se administra por administracion intravenosa o administracion subcutanea.
12. Un acido nucleico aislado que codifica un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7.
13. Un vector de expresion que comprende el acido nucleico aislado de la reivindicacion 12.
14. Una celula huesped recombinante que comprende un acido nucleico aislado de la reivindicacion 12, unido operativamente a un promotor.
15. Un metodo para producir una protema de union al antfgeno del receptor de oncostatina M (OSMR), en donde la protema de union al antfgeno es un anticuerpo, comprendiendo el metodo:

a) el cultivo de una celula huesped recombinante de la reivindicacion 14; y

b) el aislamiento del anticuerpo de dicho cultivo.