ES2351678T3 - Ligando de citocina para el tratamiento de asma e hiper-sensibilidad de las vías respiratorias . - Google Patents

Ligando de citocina para el tratamiento de asma e hiper-sensibilidad de las vías respiratorias . Download PDF

Info

Publication number
ES2351678T3
ES2351678T3 ES08102636T ES08102636T ES2351678T3 ES 2351678 T3 ES2351678 T3 ES 2351678T3 ES 08102636 T ES08102636 T ES 08102636T ES 08102636 T ES08102636 T ES 08102636T ES 2351678 T3 ES2351678 T3 ES 2351678T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
seq
polypeptide
cells
sequence
amino acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES08102636T
Other languages
English (en)
Inventor
Stacey R. Dillon
Cindy A. Sprecher
Maria M. Dasovich
Joseph L. Kuijper
Angela K. Hammond
Julia E. Novak
Jane A. Gross
Francis J. Grant
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zymogenetics Inc
Original Assignee
Zymogenetics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zymogenetics Inc filed Critical Zymogenetics Inc
Application granted granted Critical
Publication of ES2351678T3 publication Critical patent/ES2351678T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/566—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds
    • G01N33/567—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds utilising isolate of tissue or organ as binding agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered

Abstract

Uso de un polipéptido para la fabricación de un medicamento para tratar el asma en un mamífero, donde el polipéptido comprende una secuencia de residuos aminoácido que es por lo menos 90% idéntica a la secuencia de residuos aminoácido de un polipéptido seleccionado entre: (a) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos desde los residuos 38 (Val) hasta 152 (Leu), como se muestra en la SEC ID NO:2; (b) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos desde los residuos 27 (Leu) hasta 164 (Thr), como se muestra en la SEC ID NO:2; (c) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos desde los residuos 24 (Ser) hasta 164 (Thr), como se muestra en la SEC ID NO:2; y (d) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos desde los residuos 1 (Met) hasta 164 (Thr), como se muestra en la SEC ID NO:2.

Description

Ligando de citocina para el tratamiento de asma e hiper-sensibilidad de las vías respiratorias.
Antecedentes de la invención
La proliferación y diferenciación de células de organismos multicelulares son controladas por hormonas y factores de crecimiento polipeptídicos. Estas moléculas difundibles permiten que las células se comuniquen entre sí y actúen juntas para formar células, tejidos y órganos, y para reparar tejido dañado. Los ejemplos de hormonas y factores de crecimiento incluyen las hormonas esteroides (p. ej., estrógeno, testosterona), hormona paratiroidea, hormona estimulante de folículos, interleucinas, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), eritropoyetina (EPO) y calcito-
nina.
Las hormonas y los factores de crecimiento influyen en el metabolismo celular, uniéndose a receptores. Los receptores pueden ser proteínas de membranas integrales que se unen a vías de señalización dentro de la célula, tales como sistemas de segundos mensajeros. Otras clases de receptores son moléculas solubles, como los factores de transcripción.
Las citocinas en general estimulan la proliferación o diferenciación de células del linaje hematopoyético o participan en los mecanismos de respuestas inmunitarias e inflamatorias del organismo. Los ejemplos de citocinas que afectan la hematopoyesis son la eritropoyetina (EPO), que estimula el desarrollo de glóbulos rojos; la trombopoyetina (TPO), que estimula el desarrollo de células del linaje de megacariocitos; y el factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), que estimula el desarrollo de neutrófilos. Estas citocinas son útiles para restaurar los niveles normales de células sanguíneas en pacientes que sufren de anemia, trombocitopenia y neutropenia, o que reciben quimioterapia para el cáncer.
Las interleucinas son una familia de citocinas que median las respuestas inmunológicas, incluyendo la inflamación. Las interleucinas median una diversidad de patologías inflamatorias. Las células T desempeñan una función central para una respuesta inmunitaria y producen muchas citocinas e inmunidad adaptativa a antígenos. Las citocinas producidas por las células T han sido clasificadas como de tipo 1 y de tipo 2 (Kelso, A. Immun. Cell BioL 76: 300-317, 1998). Las citocinas de tipo 1 incluyen IL-2, IFN-\gamma, LT-\alpha, y están implicadas en respuestas inflamatorias, inmunidad vírica, inmunidad parasitaria intracelular y rechazo de aloinjertos. Las citocinas de tipo 2 incluyen IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 e IL-13, y están implicadas en respuestas humorales, inmunidad a helmintos y respuesta alérgica. Las citocinas compartidas entre los tipos 1 y 2 incluyen IL-3, GM-CSF y TNF-\alpha. Existen algunos datos que indican que el tipo 1 y el tipo 2 que producen poblaciones de células T preferencialmente migran a diferentes tipos de tejido inflamado.
Las células T maduras pueden ser activadas, es decir, por un antígeno u otro estímulo, para producir, por ejemplo, citocinas, moléculas de señalización bioquímica o receptores que influyen también sobre el destino de la población de células T.
Las células B pueden activarse mediante receptores en su superficie celular, incluyendo receptores de células B y otras moléculas accesorias para desempeñar funciones celulares accesorias, como la producción de citocinas.
Los monocitos/macrófagos y las células T pueden ser activados por receptores en su superficie celular y desempeñan un papel central en la respuesta inmunitaria, presentando antígeno a los linfocitos, y también actúan como células accesorias para los linfocitos, segregando numerosas citocinas.
Los linfocitos citolíticos naturales (NK) tienen una célula progenitora común con las células T y las células B, y desempeñan una función en la vigilancia inmunitaria. Los linfocitos citolíticos naturales, que comprenden hasta 15% de los linfocitos de la sangre, no expresan receptores de antígenos y, por lo tanto, no usan reconocimiento MHC como requerimiento para unirse a una célula diana. Los linfocitos citolíticos naturales están implicados en el reconocimiento y la destrucción de determinadas células tumorales y células infectadas por virus. Se cree que, in vivo, los linfocitos citolíticos naturales requieren activación, no obstante, se ha demostrado que, in vitro, los linfocitos citolíticos naturales destruyen algunos tipos de células tumorales sin activación.
Las actividades demostradas in vivo de la familia de citocinas ilustran el enorme potencial clínico y la necesidad de otras citocinas, agonistas de citocinas y antagonistas de citocinas. La presente invención se dirige a estas necesidades, proporcionando una nueva citocina que estimula células del linaje de células hematopoyéticas, como también composiciones y métodos relacionados.
La presente invención proporciona tales polipéptidos para estos y otros usos que deben ser claros para los expertos en la técnica a partir de las enseñanzas de la presente.
La base de datos EMBL Nº de acceso AC048338 (EBI Acc. No. EM_HUM:AC048338) provee la secuencia completa Homo sapiens 12 BAC RP11-512M8 (Roswell Park Cancer Institute Human BAC library).
\newpage
La base de datos EMBL Nº de acceso AK005939 (EBI Acc. No. EM_PRO:AK005939) provee el clon de cDNA de testículo masculino adulto Mus musculus RIKEN full-length enriched library: 1700013B14 producto: proteína hipotética, secuencia de inserción completa.
Dillon, Stacy R. et al., Nature Immunology, Julio 2004, Vol. 5(7), páginas 752-760, indica que la IL-31, una citocina producida por células T activadas, induce dermatitis en ratones.
Conti et al., Autoinmunity Reviews, Vol 6(3), 5 Febrero 2007, páginas 131-137, describe la modulación de autoinmunidad por las últimas interleucinas (con un énfasis especial en IL-32).
Sumario de la invención
La presente invención provee aplicaciones médicas para tratar asma e hiper-sensibilidad de las vías respiratorias en un mamífero, con péptidos de SEC ID NO:2 (Zcytor17lig) así como secuencias idénticas a ella en un 90%, y sus fragmentos seleccionados, como se recoge en las reivindicaciones.
Además, la presente invención provee métodos in vitro con dichos péptidos para la regulación al alza y la regulación a la baja de la expresión génica de IL-13RA a largo plazo de la actividad de señalización de IL-13 en ciertas líneas celulares epiteliales de pulmón humano, según se reivindica.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 es una ilustración de una alineación múltiple de zcytorl7lig humano (SEC ID NO:2) (mzcytor17lig), zcytor17lig de ratón (SEC ID NO:11) (mzcytor17lig), IL-3 de ratón (mIL-3) (SEC ID NO:100) e IL-3 humana (hIL-3) (SEC ID NO: 102).
La Figura 2 es una ilustración de una alineación múltiple de zcytor17lig humano (SEC ID NO:2) (zcytor17lig), y zcytor17lig de ratón (SEC ID NO: 11) (mzcytor17lig).
La Figura 3 es un trazado de hidrofilicidad Hopp/Woods de zcytor17lig humano (SEC ID NO:2).
Descripción detallada de la invención
Antes de exponer la invención en detalle, tal vez resulte útil para entenderla, definir los siguientes términos y expresiones:
La expresión "marcador de afinidad" se usa en la presente memoria para indicar un segmento de polipéptido que puede estar unido a un segundo polipéptido para proporcionar la purificación o detección del segundo polipéptido o para proveer sitios de unión del segundo polipéptido a un sustrato. En principio, como marcador de afinidad, se puede utilizar cualquier péptido o proteína para el o la cual esté disponible un anticuerpo u otro agente de unión específico. Los marcadores de afinidad incluyen una extensión de polihistidina, proteína A (Nilsson et al., EMBOJ. 4:1075, 1985; Nilsson et al., Methods Enzymol 198: 3, 1991), glutatión S transferasa (Smith y Johnson, Gene 67: 31, I998), marcador de afinidad Glu-Glu (Grussenmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA 82:7952-4, 1985), sustancia P, péptido Flag^{TM} (Hopp et al., Biotechnology 6:1204-10, 1988), péptido de unión a estreptavidina u otro epítopo antigénico o dominio de unión. Véase, en general, Ford et al., Protein Expression and Purification 2: 95-107, 1991. Los DNA que codifican marcadores de afinidad se obtienen de proveedores comerciales (p. ej., Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).
La expresión "variante alélica" se utiliza en la presente memoria para indicar cualquiera de dos o más formas alternativas de un gen que ocupa el mismo locus cromosómico. La variación alélica surge naturalmente a través de la mutación, y puede producir un polimorfismo fenotípico dentro de las poblaciones. Las mutaciones de genes pueden ser silenciosas (sin cambios en el polipéptido codificado) o pueden codificar polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos alterada. La expresión variante alélica se utiliza también para indicar una proteína codificada por una variante alélica de un gen.
Los términos "aminoterminal" y "carboxilterminal" se utilizan en la presente memoria para indicar posiciones dentro de polipéptidos. Si el contexto lo permite, estos términos se usan con referencia a una secuencia o porción de un polipéptido particular para indicar proximidad o posición relativa. Por ejemplo, una secuencia determinada ubicada carboxiterminal a una secuencia de referencia dentro de un polipéptido está ubicada próxima el término carboxilo de la secuencia de referencia, pero no está necesariamente en el término carboxilo del polipéptido completo.
La expresión "par de complemento/anticomplemento" indica restos no idénticos que forman un par estable no covalentemente asociado bajo condiciones apropiadas. Por ejemplo, biotina y avidina (o estreptavidina) son miembros prototípicos de un par de complemento/anticomplemento. Otros pares ilustrativos de complementos/anticomplementos incluyen pares receptor/ligando, pares anticuerpo/antígeno (o hapteno o epítopo), pares de polinucleótidos sentido/antisentido y similares. Cuando se desee la disociación posterior del par de complemento/anticomplemento, el par de complemento/anticomplemento preferiblemente tendrá una afinidad de unión de <10^{9} M^{-1}.
\newpage
La expresión "complementos de una molécula de polinucleótidos" indica una molécula de polinucleótidos que tiene una secuencia base complementaria y orientación inversa según lo comparado con una secuencia de referencia. Por ejemplo, la secuencia 5' ATGCACGGG 3' es complementaria a 5' CCCGTGCAT 3'.
El término "cóntigo" indica un polinucleótido que tiene una extensión contigua de secuencia idéntica o complementaria a otro polinucleótido. Se dice que las secuencias contiguas se "superponen" a una extensión determinada de secuencia de polinucleótidos o bien en su totalidad o a lo largo de una extensión parcial del polinucleótido. Por ejemplo, los cóntigos representativos para la secuencia de polinucleótidos 5'-ATGGCTTAGCTT-3' son 5'-TAGCTTgagtct-3' y 3'-gtcgacTACCGA-5'.
La expresión "secuencia de nucleótidos degenerada" indica una secuencia de nucleótidos que incluye uno o más codones degenerados (comparados con una molécula de polinucleótidos de referencia que codifica un polipéptido). Los codones degenerados contienen diferentes tripletes de nucleótidos, pero codifican el mismo residuo aminoácido (es decir, los tripletes GAU y GAC codifican cada uno Asp).
La expresión "vector de expresión" se emplea para indicar una molécula de DNA, lineal o circular, que comprende un segmento que codifica un polipéptido de interés operativamente unido a segmentos adicionales que proporcionan su transcripción. Dichos segmentos adicionales incluyen secuencias promotoras y terminadoras, y pueden también incluir uno o más orígenes de replicación, uno o más marcadores seleccionables, un potenciador, una señal de poliadenilación, etc. Los vectores de expresión en general derivan de DNA plasmídico o vírico, o pueden contener elementos de
ambos.
El término "aislado", cuando se aplica a un polinucleótido, indica que el polinucleótido ha sido eliminado de su entorno genético natural y está entonces libre de otras secuencias codificantes extrañas o indeseadas, y está en una forma adecuada para uso dentro de sistemas de producción de proteínas genotecnológicas. Dichas moléculas aisladas son aquellas que se separan de su entorno natural e incluyen clones genómicos y cDNA. Las moléculas de DNA aisladas de la presente invención están exentas de otros genes con los que se asocian comúnmente, pero pueden incluir regiones 5' y 3' naturales sin traducir, como promotores y terminadores. La identificación de regiones asociadas será obvia para el experto en la técnica (véase, por ejemplo, Dynan y Tijan, Nature 316:774-78, 1985).
Una proteína o polipéptido "aislado" es una proteína o un polipéptido que se encuentra en una condición distinta de su entorno natural, por ejemplo separado de sangre y tejido animal. En una forma preferida, el polipéptido aislado está sustancialmente libre de otros polipéptidos, particularmente otros polipéptidos de origen animal. Se prefiere proveer los polipéptidos en forma altamente purificada, es decir, pureza superior a 95%, más preferiblemente pureza superior a 99%. Cuando se utiliza en este contexto, el término "aislado" no excluye la presencia del mismo polipéptido en formas físicas alternativas, como dímeros o formas alternativamente glucosiladas o derivatizadas.
El término "neoplásico", cuando se refiere a células, indica células que sufren proliferación nueva y anormal, particularmente en un tejido en el que la proliferación es descontrolada y progresiva, provocando una neoplasia. Las células neoplásicas pueden ser malignas, es decir, invasivas, y metastásicas, o benignas.
La expresión "operativamente unido", cuando se refiere a segmentos de DNA, indica que los segmentos están dispuestos de modo que funcionan juntos para sus fines pretendidos, p. ej., la transcripción se inicia en el promotor y continúa a través del segmento codificante hacia el terminador.
El término "ortólogo" indica un polipéptido o una proteína obtenida de una especie que es la contrapartida funcional de un polipéptido o proteína de una especie diferente. Las diferencias de secuencias entre ortólogos son el resultado de la especiación.
"Parálogos" son proteínas distintas pero estructuralmente relacionadas elaboradas por un organismo. Se cree que los parálogos surgen a través de la duplicación de genes. Por ejemplo, \alpha-globina, \alpha-globina y mioglobina son parálogos entre sí.
Un "polinucleótido" es un polímero monocatenario o bicatenario de bases de desoxirribunocleótidos o ribonucleótidos leídas desde el extremo 5' al extremo 3'. Los polinucleótidos incluyen RNA y DNA, y pueden aislarse de fuentes naturales, sintetizarse in vitro o prepararse a partir de una combinación de moléculas naturales y sintéticas. Los tamaños de los polinucleótidos se expresan como pares de bases (abreviados "bp"), nucleótidos ("nt"), o kilobases ("kb"). Si el contexto lo permite, los últimos dos términos pueden describir polinucleótidos que son monocatenarios o bicatenarios. Cuando el término se aplica a moléculas bicatenarias, se usa para indicar longitud total y se entenderá que es equivalente a la expresión "pares de bases". Los expertos en la técnica reconocerán que dos cadenas de un polinucleótido bicatenario pueden diferir levemente en longitud y que sus extremos pueden escalonarse como resultado de la escisión enzimática; por lo tanto, todos los nucleótidos dentro de una molécula de polinucleótidos bicatenaria pueden no estar apareados.
Un "polipéptido" es un polímero de residuos aminoácido unidos por enlaces peptídicos, naturales o sintéticos. Los polipéptidos de menos de aproximadamente 10 residuos aminoácido comúnmente se denominan "péptidos".
\newpage
El término "promotor" se usa en la presente memoria por su significado reconocido en la técnica para indicar una porción de un gen que contiene secuencias de DNA que proporcionan la unión de RNA polimerasa y la iniciación de la transcripción. Las secuencias promotoras comúnmente, pero no siempre, se encuentran en las regiones no codificantes 5' de los genes.
Una "proteína" es una macromolécula que comprende una o más cadenas de polipéptidos. Una proteína puede también comprenden componentes no peptídicos, como grupos carbohidrato. Los carbohidratos y otros sustituyentes no peptídicos pueden ser añadidos a una proteína por la célula en la que se produce la proteína, y variarán con el tipo de célula. Las proteína se definen en la presente memoria en términos de sus estructuras de cadena principal de aminoácidos; los sustituyentes tales como los grupos carbohidrato en general no se especifican, pero pueden estar presentes de todos modos.
El término "receptor" indica una proteína asociada a una célula que se une a una molécula bioactiva (es decir, un ligando) y media el efecto del ligando sobre la célula. Los receptores unidos a membranas se caracterizan por una estructura de múltiples péptidos que comprende un dominio de unión a un ligando extracelular y un dominio efector intracelular que está típicamente implicado en la transducción de señales. La unión del ligando al receptor proporciona un cambio conformacional en el receptor, que causa una interacción entre el dominio efector y otra molécula(s) en la célula. Esta interacción, a su vez, conduce a una alteración en el metabolismo de la célula. Los eventos metabólicos que están asociados a interacciones receptor-ligando incluyen la transcripción de genes, fosforilación, desfosforilación, aumentos en la producción de AMP cíclico, movilización de calcio celular, movilización de lípidos de membrana, adhesión celular, hidrólisis de lípidos de inositol e hidrólisis de fosfolípidos. En general, los receptores pueden estar unidos a membranas, ser cistólicos o nucleares; monoméricos (p. ej., receptor de la hormona estimulante de la tiroides, receptor beta-adrenérgico) o multiméricos (p. ej., receptor de PDGF, receptor de la hormona del crecimiento, receptor de IL-3, receptor de GM-CSF, receptor de G-CSF, receptor de eritropoyetina y receptor de IL-6).
La expresión "secuencia de señal secretora " indica una secuencia de DNA que codifica un polipéptido (un "péptido secretor") que, como componente de un péptido más grande, dirige el polipéptido más grande a través de una vía secretora de una célula en la que se sintetiza. El polipéptido más grande comúnmente es escindido para eliminar el péptido secretor durante el tránsito a través de la vía secretora.
La expresión "variante de empalme" se utiliza en la presente memoria para indicar formas alternativas de RNA transcritas de un gen. La variación de empalmes surge naturalmente a través del uso de sitios de empalme alternativos dentro de una molécula de RNA transcrita, o menos normalmente entre moléculas de RNA transcritas separadamente, y puede proporcionar varios mRNA transcritos del mismo gen. Las variantes de empalme pueden codificar polipéptidos que tengan la secuencia de aminoácidos alterada. La expresión variante de empalme se utiliza también aquí para indicar una proteína codificada por una variante de empalme de un mRNA transcrito de un gen.
Se entenderá que los pesos moleculares y las longitudes de los polímeros determinados por métodos analíticos imprecisos (p. ej., electroforesis en gel) serán valores aproximados. Cuando se expresen dichos valores como "alrededor de" X o "aproximadamente" X, se entenderá que el valor establecido de X será \pm10% preciso.
La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de una nueva secuencia de DNA que codifica una proteína que tiene la estructura de una citocina de cuatro hélices. A través de procedimientos de clonación y de ensayos de proliferación descritos en detalle en la presente memoria, se ha identificado una secuencia de polinucleótidos que codifica un nuevo polipéptido ligando que es un ligando con alta especificidad hacia el receptor zcytor17 (SEC ID NO:5) y por lo menos una subunidad adicional que comprende el receptor OncostatinM beta (OSMRbeta) (SEC ID NO:7) y WSX-1 (SEC ID NO:9). Este ligando de polipéptidos, designado zcytor17lig, se aisló de una genoteca de cDNA generada a partir de células de sangre periférica humana activadas (hPBC), que se seleccionaron para CD3. CD3 es un marcador de la superficie celular único para las células de origen linfoide, particularmente las células T.
En los ejemplos que siguen, se usó una línea celular que depende de la vía unida a los receptores OSMRbeta y zcytor17, o que depende de la vía unida a los receptores OSMRbeta y WSX-1, y zcytor17 para supervivencia y multiplicación en ausencia de otros factores de crecimiento, para seleccionar una fuente del cDNA que codifica zcytor171ig. La línea celular dependiente del factor de crecimiento preferida que se usó para transfección y expresión del receptor zcytor17 fue BaF3 (Palacios y Steinmetz, Cell 41: 727-734, 1985; Mathey-Prevot et al., Mol. Cell. Biol. 6: 4133-4135, 1986). No obstante, son adecuadas para este propósito, otras líneas celulares dependientes del factor de crecimiento, por ejemplo FDC-P1 (Hapel et al., Blood 64: 786-790, 1984) y MO7e (Kiss et al., Leukemia 7: 235-240, 1993).
La secuencia de aminoácidos para los receptores de OSMR, WSX-I y zcytor17 indicó que los receptores codificados pertenecían a la subfamilia de receptores de citocina de Clase I que incluye, pero sin limitarse a ellos, los receptores de IL-2, IL-4, IL-7, Lif, IL-12, IL-15, EPO, TPO, GM-CSF y G-CSF (para revisión, véase Cosman, "The Hematopoietin Receptor Superfamily" en Cytokine 5(2): 95-106, 1993). El receptor zcytor17 se describe en detalle en la solicitud de patente de propiedad común PCT No. US01/20484 (publicación WIPO No. WO 02/00721), y WSX-1 se describe en detalle en la patente estadounidense No. 5.925.735. El análisis de distribución de tejido del mRNA del receptor zcytor17 reveló expresión en subconjuntos de células T CD4+ y CD8+ activadas, monocitos CD14+, y expresión más débil en células B CDI9+. Asimismo, el mRNA estuvo presente en ambas líneas celulares monocíticas, en reposo o activadas, THP-1 (ATCC No. TIB-202), U937 (ATCC No. CRL-1593.2) y HL60 (ATCC No. CCL-240).
La expresión de WSX-1 es la más fuerte en timo, bazo, leucocitos de sangre periférica y ganglio linfático, y también se observa una mayor expresión de células T activadas. La distribución de tejido para OSMRbeta se describe como muy amplia. La distribución de tejido de estos tres receptores indica que una diana para el Zcytor171ig pronosticado consiste en células de linaje hematopoyético, en particular células T, monocitos/macrófagos y células progenitoras linfoides y células linfoides. Otras citocinas de cuatro hélices conocidas que actúan sobre las células linfoides incluyen IL-2, IL-4, IL-7 e IL-15. Para una revisión de las citocinas de cuatro hélices, véanse, Nicola et al., Advances in Protein Chemistry 52:1-65, 1999 y Kelso, A., Immunol. Cell Biol. 76: 300-317, 1998.
Los medios condicionados (CM) de células de sangre periférica humana estimuladas con PMA/Ionomicina seleccionadas para CD3+ soportaron el crecimiento de células BaF3 que expresaron el receptor zcytor17, el receptor OSMRbeta y WSX-1, y fueron dependientes de IL-3. Los medios condicionados de células que no fueron: 1) estimuladas con PMA/Ionomicina; o que no fueron; 2) seleccionadas para CD3 (con o sin estimulación de PMA/Ionomicina) no soportaron el crecimiento de células Baf3 que expresan células que expresan los receptores zcytor17, OSMRbeta y WSX-1 (BaF3/zcytor17/WSX-l/OSMRbeta). Los experimentos de control demostraron que esta actividad proliferativa no fue atribuible a otros factores de crecimiento conocidos, y que la capacidad de dichos medios condicionados de estimular la proliferación de células que expresan los receptores zcytor17/WSX-l/OSMRbeta podría neutralizarse por una forma soluble del receptor zcytor17.
Los medios condicionados de células seleccionadas para CD3+ activadas con PMA/Ionomicina también soportaron el crecimiento de células BaF3 que expresaron el receptor zcytor17 y el receptor OSMRbeta (zcytorl7/OSMRbeta), mientras que las células BaF3 que expresan solamente el receptor zcytor17 y el receptor WSX-1 (zcytor17/WSX-l), o que contienen solamente el receptor OSMRbeta, no fueron estimuladas por estos medios condicionados.
La proliferación de células BaF3 que expresan los receptores zcytor17/WSX-l/OSMRbeta expuestas a CM de células de sangre periférica humana estimuladas con PMA/Ionomicina seleccionadas para CD3+ se identificaron por inspección visual de los cultivos y/o por ensayo de proliferación. Se conocen en la técnica muchos ensayos de proliferación adecuados que incluyen ensayos para reducción de un tinte como AlamarBlue^{TM} (AccuMed International, Inc. Westlake, Ohio), bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (Mosman, J. Immunol. Meth. 65: 55-63, 1983); 3.(4,5 dimetil tiazol-2-il)-5-3-carboximetoxifenil-2H-tetrazolio; hidróxido de 2,3-bis(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil)-5-[(fenilamino)carbonil]-2H-tetrazolio; y cloruro de cianoditolil-tetrazolio (comercializados por Polysciences, Inc., Warrington, PA); ensayos de mitogénesis, por ejemplo medición de la incorporación de ^{3}H-timidina; ensayos de exclusión de tinte, que usan, por ejemplo, negro de naftaleno o azul de tripano; absorción de tinte usando diacetil fluoresceína; y liberación de cromo. Véase, en general, Freshney, Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique. 3era ed., Wiley-Liss, 1994, que se incorpora a la presente memoria por referencia.
Se preparó una genoteca de cDNA a partir de células de sangre periférica humana primarias estimuladas con PMA y Ionomicina, seleccionadas para CD3+. La genoteca de cDNA de células de sangre periférica humana estimuladas con PMA y Ionomicina, seleccionadas para CD3+ se dividió en grupos que contenían múltiples moléculas de cDNA, y se transfectó a una línea celular hospedante, por ejemplo, células BHK 570 (No. de acceso ATCC 10314). Las células hospedantes transfectadas se cultivaron en un medio que no contenía factores de crecimiento exógenos (p. ej., FBS al 5%) y se recogió medio condicionado. Se ensayó la capacidad de los medios condicionados de estimular la proliferación de células BaF3 transfectadas con los receptores zcytor17, WSX-1 y OSMRbeta. Se identificaron grupos de CDNA que producían medio condicionado que estimulaba los receptores BaF3/zcytor17/WSX-l/OSMRbeta. Este cDNA plasmídico combinado se electroporó en E. coli. Se aisló CDNA de colonias sencillas y se transfectó individualmente a células BHK 570. Se identificaron clones positivos mediante un resultado positivo del ensayo de proliferación de los receptores BaF3/zcytor17/WSX-l/OSMRbeta, y la actividad se confirmó por neutralización de la proliferación, usando el receptor soluble zcytor17.
Se aisló un clon positivo, y el análisis de secuencia reveló que la secuencia de polinucleótidos contenida dentro del DNA plasmídico era nueva. La secuencia de señal secretora está comprendida por los residuos aminoácido 1 (Met) a 23 (Ala), y el polipéptido maduro está comprendido por los residuos aminoácido 24 (Ser) a 164 (Thr) (como se muestra en la SEC ID NO:2). Otros análisis de secuenciación N-terminal de zcytor171ig purificado de células 293T demostró un término N en el residuo 27 (Leu), como se muestra en la SEC ID NO:2, con el polipéptido maduro comprendido por los residuos aminoácido 27 (Leu) a 164 (Thr) (como se muestra en la SEC ID NO:2).
En general, se pronostica que las citocina tienen una estructura de cuatro hélices, en la que las hélices A, C y D son las más importantes en las interacciones ligando-receptor, y están más altamente conservadas entre los miembros de la familia. Haciendo referencia a la secuencia de aminoácidos zcytor17lig humana que se muestra en la SEC ID NO:2, la alineación de las secuencias de aminoácidos zcytor17lig humana, IL-3 humana y citocina humana, se pronostica que la hélice A de zcytor171ig está definida por los residuos aminoácido 38-52; la hélice B por los residuos aminoácido 83-98; la hélice C por los residuos aminoácido 104-117; y la hélice D por los residuos aminoácido 137-152; como se muestra en la SEC ID NO:2. El análisis estructural indica que el bucle A/B es largo, el bucle B/C es corto y el bucle C/D es largo. Esta estructura de bucles produce una organización helicoidal ascendente-ascendente-descendente-descendente. En base a la estructura de cuatro hélices, los residuos cisteína dentro de zcytor17lig que se conservan corresponden a los residuos aminoácido 72, 133 y 147 de la SEC ID NO:2; y 74, 137 y 151 de la SEC ID NO: 11 que se describen en la presente memoria. Coherente con la ubicación de la cisteína se confirma también la estructura de cuatro hélices. El residuo Glu también se encuentra altamente conservado en el zcytor17lig, como se muestra en la SEC ID NO:2 en el residuo 43.
Además, la secuencia de aminoácidos pronosticada de zcytor17lig murino muestra 31% identidad con la proteína humana pronosticada en toda la longitud de las secuencias (SEC ID NO:2 y SEC ID NO:11). En base a la comparación entre secuencias de zcytor17lig humano y murino, se hallaron residuos conservados en las regiones pronosticadas por codificar las hélices alfa C y D. Los correspondientes polinucleótidos que codifican las regiones, dominios, motivos, residuos y secuencias de polipéptidos de zcytor17lig humanos que se describen en la presente memoria, se muestran en la SEC ID NO:1.
Si bien la hélice D está relativamente conservada entre zcytor17lig humano y murino, la hélice C es la más conservada. Aunque ambas especies tienen aminoácidos ácidos predominantes en esta región, las diferencias pueden dar cuenta de la especificidad de las especies en la interacción entre zcytor17lig y su receptor, comprendiendo zcytor17 receptores monoméricos, heterodiméricos (p. ej., zcytor17/OSMRbeta, WSX-1/OSMRbeta, zcytor17/WSX-l) o multiméricos (p. ej., zcytorl7/OSMRbeta/WSX-1). El bucle A/B y la hélice B de zcytor17lig se conservan marginalmente, y la hélice C a través del bucle C/D en la hélice D es la más conservada entre las especies; la conservación a través de esta región indica que es funcionalmente significativa. Las hélices D de zcytor17lig murino y humano también están conservadas. Los antagonistas de los receptores Zcytor17 pueden diseñarse a través de mutaciones dentro de la hélice D de zcytor17lig. Éstas pueden incluir truncación de la proteína del residuo Thr156 (SEC ID NO:2), o la conservación de residuos que confieren unión del ligando al receptor, pero que disminuyen la actividad de señalización.
Las citocinas de cuatro hélices también se agrupan por longitud de las hélices que las componen. Las citocinas de "hélice larga" en general consisten en hélices de 24-30 residuos que incluyen IL-6, factor neurotrófico ciliar (CNTF), factor inhibidor de leucemia (UP) y hormona del crecimiento humana (hGH). Las citocinas de "hélice corta" en general consisten en hélices de 18-21 residuos e incluyen IL-2, IL-4 y GM-CSF. Se cree que Zcytor17lig es un nuevo miembro del grupo de citocinas de hélice corta. Los estudios que usan CNTF e IL-6 demostraron que una hélice CNTF puede intercambiarse por la hélice equivalente en IL-6, confiriendo propiedades de unión a CTNF a la quimera. Por ende, parece ser que los dominios funcionales de citocinas de cuatro hélices se determinan en base a la homología estructural, independientemente de la identidad de secuencia, y pueden mantener la integridad funcional en una quimera (Kallen et al., J. Biol. Chem. 274:11859-11867, 1999). En consecuencia, los dominios helicoidales de zcytor17lig serán útiles para preparar moléculas de fusión quimérica, particularmente con otras citocinas de hélice corta para determinar y modular la especificidad de unión al receptor. Son de particular interés las proteínas de fusión obtenidas mediante ingeniería genética con hélice A y/o hélice D, y las proteínas de fusión que combinan dominios helicoidales y de bucle de otras citocinas de forma corta, como IL-2, IL-4, IL-15, Lif, IL-12, IL-3 y GM-CSF.
La secuencia de polinucleótidos para IL-2 humana se muestra en la SEC ID NO:161, y la correspondiente secuencia de aminoácidos se muestra en la SEC ID NO:162. La secuencia de señal secretora está comprendida por los residuos aminoácido 1 (Met) a 20 (Ser) de la SEC ID NO:162; los nucleótidos 48 a 107 de la SEC ID NO:161. El polipéptido maduro está comprendido por los residuos aminoácido 21 (Ala) a 156 (Thr) de la SEC ID NO:162; los nucleótidos 108 a 515 de la SEC ID NO:161. La hélice A de IL-2 humana está comprendida por los residuos aminoácido 27 (Thr) a 48 (Leu) de la SEC ID NO: 162; los nucleótidos 126 a 191 de la SEC ID NO:161. La hélice B de IL-2 humana comprende la hélice B1 y la hélice B2. La hélice B1 de IL-2 humana está comprendida por los residuos aminoácido 73 (Ala) a 80 (Gin) de la SEC ID NO:162; los nucleótidos 264 a 287 de la SEC ID NO:161. La hélice B2 de IL-2 humana está comprendida por los residuos aminoácido 83 (Glu) a 92 (Val) de la SEC ID NO: 162; los nucleótidos 294 a 323 de la SEC ID NO:161. Por lo tanto, la hélice B (que comprende las hélices B1 y B2) de IL-2 está representada por la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:168 (secuencia de nucleótidos de SEC ID NO:167) en donde los residuos aminoácido 9 y 10 pueden ser cualquier aminoácido. La SEC ID NO:168 es idéntica a los aminoácidos 73 (Ala) a 92 (Val) de la SEC NO:162, en donde los aminoácidos 81 y 82 son cualquier aminoácido. En una forma preferida, la hélice B de IL-2 comprende los aminoácidos 73 (Ala) a 92 (Val) de la SEC ID NO:l62; los nucleótidos 264 a 323 de la SEC ID NO: 161. La hélice C de IL-2 humana está comprendida por los residuos aminoácido 102 (His) a 116 (Val) de la SEC ID NO:162; los nucleótidos 351 a 395 de la SEC ID NO:l61. La hélice D de IL-2 humana está comprendida por los residuos
aminoácido 134 (Thr) a 149 (Gin) de la SEC ID NO:162; los nucleótidos 447 a 494 de la SEC ID NO:161.
La secuencia de polinucleótidos para IL-4 humana se muestra en la SEC ID NO:163, y la correspondiente secuencia de aminoácidos se muestra en la SEC ID NO:164. La secuencia de señal secretora está comprendida por los residuos aminoácido 1 (Met) a 24 (Gly) de la SEC ID NO:164; los nucleótidos 64 a 135 de la SEC ID NO:163. El polipéptido maduro está comprendido por los residuos aminoácido 25 (His) a 153 (Ser) de la SEC ID NO: 164; los nucleótidos 136 a 522 de la SEC ID NO:163. La hélice A de IL-4 humana está comprendida por los residuos aminoácido 30 (Thr) a 42 (Thr) de la SEC ID NO: 164; los nucleótidos 151 a 189 de la SEC ID NO: 163. La hélice B de IL-4 humana está comprendida por los residuos aminoácido 65 (Glu) a 83 (His) de la SEC ID NO:164; los nucleótidos 256 a 312 de la SEC ID NO:163. La hélice C de IL-4 humana está comprendida por los residuos aminoácido 94 (Ala) a 118 (Ala) de la SEC ID NO: 164; los nucleótidos 343 a 417 de la SEC ID NO: 163. La hélice D de IL-4 humana está comprendida por los resi-
duos aminoácidos 133 (Leu) a 151 (Cys) de la SEC ID NO:164; los nucleótidos 460 a 516 de la SEC ID NO:163.
La secuencia de polinucleótidos para GM-CSF humano se muestra en la SEC ID NO:165 y la correspondiente secuencia de aminoácidos se muestra en la SEC ID NO:166. La secuencia de la señal secretora está comprendida por los residuos aminoácido 1 (Met) a 17 (Ser) de la SEC ID NO: 166; los nucleótidos 9 a 59 de la SEC ID NO: 165. El polipéptido maduro está comprendido por los residuos aminoácido 18 (Ala) a 144 (Glu) de la SEC ID NO:166; los nucleótidos 60 a 440 de la SEC ID NO: 165. La hélice A de GM-CSF humano está comprendida por los residuos aminoácido 30 (Trp) a 44 (Asn) de la SEC ID NO: 166; los nucleótidos 96 a 140 de la SEC ID NO: 165. La hélice B de GM-CSF humano está comprendida por los residuos aminoácido 72 (Leu) a 81 (Gln) de la SEC ID NO:166; los nucleótidos 222 a 251 de la SEC ID NO:165. La hélice C de GM-CSF humano está comprendida por los residuos aminoácido 85 (Gly) a 103 (Gln) de la SEC ID NO:166; los nucleótidos 261 a 317 de la SEC ID NO:165. La hélice D de GM-CSF humano está comprendida por los residuos aminoácido 120 (Phe) a 131 (Leu) de la SEC ID NO:166; los nucleótidos 366 a 401 de la SEC ID NO:165.
Los residuos aminoácido que comprenden las hélices A, B, C y D, para zcytor17lig, IL-3, IL-2, IL-4 y GM-CSF humanos se exponen en la Tabla 1.
TABLA 1
1
La presente invención provee moléculas de polinucleótidos, incluyendo moléculas de DNA y RNA, que codifican los polipéptidos zcytor17lig descritos en la presente memoria. Los expertos en la técnica reconocerán fácilmente que, en vista de la degeneración del código genético, es posible una variación de secuencia considerable entre estas moléculas de polinucleótidos. La SEC ID NO:3 es una secuencia de DNA degenerada que abarca todos los DNA que codifican el polipéptido zcytor171ig, y sus fragmentos, de la SEC ID NO:2. Los expertos en la técnica reconocerán que la secuencia degenerada de la SEC ID NO:3 también proporciona todas las secuencias de RNA que codifican la SEC ID NO:2 sustituyendo T por U. Por lo tanto, los polinucleótidos que codifican el polipéptido zcytor17lig, que comprenden el nucleótido 1 ó 70 al nucleótido 492 de la SEC ID NO:3, y sus equivalentes de RNA, se contemplan en la presente invención. La Tabla 2 expone los códigos de una letra utilizados dentro de la SEC ID NO:3 para indicar posiciones de nucleótidos degenerados. "Resoluciones" son los nucleótidos indicados por un código en letra. "Complemento" indica el código para el nucleótido(s) complementario. Por ejemplo, el código Y indica C o T, y su complemento R indica A o G, en donde A es complementaria a T, y G es complementaria a C.
TABLA 2
2
Los codones degenerados utilizados en la SEC ID NO:3, que abarca todos los codones posibles para un aminoácido determinado, se exponen en la Tabla 3.
TABLA 3
3
La persona con experiencia ordinaria en la técnica apreciará que se introduce cierta ambigüedad para determinar un codón degenerado, representativo de todos los codones posibles que codifican cada aminoácido. Por ejemplo, el codón degenerado para serina (WSN) puede, en algunas circunstancias, codificar arginina (AGR), y el codón degenerado para arginina (MGN) puede, en algunas circunstancias, codificar serina (AGY). Existe una relación similar entre los codones que codifican fenilalanina y leucina. Por ende, algunos polinucleótidos abarcados por la secuencia degenerada pueden codificar secuencias de aminoácidos variantes, pero el experto en la técnica puede identificar fácilmente dichas secuencias variantes por referencia a la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:2. Se puede ensayar fácilmente la funcionalidad de las secuencias variantes, como se describe en el presente documento.
La persona con experiencia ordinaria en la técnica apreciará que diferentes especies pueden exhibir "uso de codón preferencial". En general, véanse, Grantham, et al., Nuc. Acids Res. 8: 1893-912, 1980; Haas, et al. Curr. Biol. 6: 315-24, 1996; Wain-Hobson, et al., Gene 13: 355-64,1981; Grosjean y Fiers, Gene 18: 199-209, 1982; Holm, Nuc. Acids Res. 14: 3075-87, 1986; Ikemura, J. Mol. Biol 158: 573-97, 1982. Tal como se emplea en esta memoria, la expresión "uso de codón preferencial" o "codones preferenciales" es una expresión de la técnica que se refiere a codones de traducción de proteínas que se utilizan más frecuentemente en células de una especie determinada, favoreciendo así uno o algunos representantes de los posibles codones que codifican cada aminoácido (véase Tabla 3). Por ejemplo, el aminoácido Treonina (Thr) puede estar codificado por ACA, ACC, ACG o ACT, pero en células mamíferas, ACC es el codón más comúnmente utilizado; en otras especies, por ejemplo, en células de levadura, virus o bacterias de insectos pueden ser preferenciales diferentes codones Thr. Los codones preferenciales para una especie particular pueden introducirse en los polinucleótidos de la presente invención mediante una diversidad de métodos conocidos en la técnica. La introducción de secuencias de codones preferenciales a DNA recombinante puede, por ejemplo, potenciar la producción de la proteína, haciendo que la traducción de la proteína sea más eficaz dentro de un tipo o especie de célula particular. Por lo tanto, la secuencia del codón degenerado descrita en la SEC ID NO:3 sirve como molde para optimizar la expresión de polinucleótidos en diversos tipos y especies de células comúnmente utilizados en la técnica y descritos en esta memoria. Las secuencias que contienen codones preferenciales se pueden ensayar y optimizar para expresión en diversas especies, y también se pueden ensayar para funcionalidad, como se describe en este documento.
Como se observó previamente, los polinucleótidos aislados de la presente invención incluyen DNA y RNA. Los métodos para preparar DNA y RNA se conocen en la técnica. En general, el RNA se aísla de un tejido o célula que produce grandes cantidades de RNA de zcytor17lig. Dichos tejidos y células se identifican por el método Northern (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 5201, 1980), o estudiando un medio condicionado de diversos tipos de células para actividad en las células o tejidos diana. Una vez que se identifica la actividad o la célula o el tejido que produce RNA, se puede preparar un RNA total usando extracción de isotiocianato de guanidino, seguida de aislamiento por centrifugación en un gradiente CsCI (Chirgwin et al., Biochemistry 18: 52-94, 1979). Poly (A)^{+} El RNA se prepara a partir de RNA total, usando el método de Aviv y Leder (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69: 1408-12, 1972). El ARN complementario (cDNA) se prepara a partir de poly(A)+ RNA, usando métodos conocidos. Alternativamente, se puede aislar DNA genómico. Los polinucleótidos que codifican los polipéptidos zcytor17lig se identifican luego y se aíslan, por ejemplo, por hibridación o PCR.
Se puede obtener un clon de longitud total que codifica zcytor17lig por procedimientos de clonación convencionales. Se prefieren los clones de DNA complementario (cDNA), aunque para algunas aplicaciones (p. ej., expresión de animales transgénicos), puede ser preferible usar un clon genómico, o modificar un clon de cDNA para incluir por lo menos un intrón genómico. Los métodos para preparar cDNA y clones genómicos se conocen bien y están dentro del nivel de experiencia ordinaria en la técnica, e incluyen el uso de la secuencia descrita en el presente documento, o partes de ésta, para sondear o cebar una colección. Las colecciones de expresión se pueden sondear con anticuerpos para fragmentos de zcytor17lig, receptores solubles que comprenden zcytor17 u otras parejas de unión específicas.
Las secuencias de polinucleótidos Zcytor17lig descritas en la presente memoria pueden también emplearse como sondas o cebadores para clonar regiones no codificantes 5' de un gen zcytor171ig. En función de la expresión específica de tejido observada para zcytor17lig, se espera que esta región del gen proporcione expresión específica linfoide y hematopoyética. Los elementos promotores de un gen zcytor17lig podrían así usarse para dirigir la expresión específica de tejido de genes heterólogos, por ejemplo, en animales transgénicos o en pacientes tratados con genoterapia. La clonación de secuencias flanco 5' también facilita la producción de proteínas zcytor17lig por "activación de genes", como se describe en la patente estadounidense No. 5.641.670. En síntesis, la expresión de un gen zcytor17lig endógeno en una célula se altera introduciendo en el locus de zcytor17lig, un constructo de DNA que comprende por lo menos una secuencia diana, una secuencia reguladora, un exón y un sitio donante de empalme no apareado. La secuencia diana es una secuencia no codificante 5' de zcytor17lig que permite la recombinación homóloga del constructo con el locus de zcytor17lig endógeno, mediante lo cual las secuencias dentro del constructo se tornan operativamente unidas a la secuencia codificante de zcytorl7lig endógeno. De esta manera, un promotor de zcytor17lig endógeno se puede reemplazar o complementar con otras secuencias reguladoras para proporcionar expresión específica de tejido potenciada o, de otro modo, regulada.
La presente invención proporciona además polipéptidos y polinucleótidos de contrapartida a partir de otras especies (ortólogos). Estas especies incluyen, aunque sin limitarse a ello, mamíferos, aves, anfibios, reptiles, peces, insectos y otros vertebrados e invertebrados. Son de particular interés los polipéptidos zcytorl7lig de especies mamíferas, por ejemplo, polipéptidos de murinos, porcinos, ovinos, bovinos, caninos, felinos, equinos y otros primates. Los ortólogos de zcytorl7lig humano se pueden clonar usando la información y composiciones provistas por la presente invención en combinación con técnicas de clonación convencionales. Por ejemplo, se puede clonar un cDNA usando mRNA obtenido de un tipo de tejido o célula que exprese zcytor17lig, como se describe en esta memoria. Las fuentes de mRNA adecuadas se pueden identificar sondeando transferencias Northern con sondas diseñadas a partir de las secuencias descritas en este documento. Se prepara entonces una colección a partir de mRNA de un tejido o una línea celular positiva. Se puede aislar luego un cDNA que codifica zcytor17lig mediante una diversidad de métodos, como sondeando con un cDNA humano completo o parcial, o con uno o más conjuntos de sondas degeneradas en base a las secuencias descritas. También se puede clonar un cDNA usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Mullis, patente estadounidense No. 4.683.202), usando cebadores diseñados a partir de la secuencia de zcytor17lig humana representativa descrita en esta memoria. Dentro de un método adicional, la genoteca de cDNA se puede usar para transformar o transfectar células hospedantes, y la expresión del cDNA de interés se puede detectar con un anticuerpo para el polipéptido zcytor17lig, estudios de unión o ensayos de actividad. También pueden aplicarse técnicas similares para el aislamiento de clones genómicos.
La secuencia de polinucleótidos para el ortólogo de ratón de zcytor17lig ha sido identificada y se muestra en la SEC ID NO:10 y en la SEC ID NO:90, y la correspondiente secuencia de aminoácidos se muestra en la SEC ID NO:11 y en la SEC ID NO:91. La secuencia de polinucleótidos degenerados que codifica el polipéptido de la SEC ID NO:11 se muestra en la SEC ID NO:12. Para la secuencia de aminoácidos de citocina de ratón de zcytorl7lig, se predice que la hélice A está definida por los residuos aminoácido 38-52; la hélice B por los residuos aminoácido 85-98; la hélice C por los residuos aminoácido 104-118; y la hélice D por los residuos aminoácido 141-157; como se muestra en la SEC ID NO:11 y en la SEC ID NO:91. Hay 31% identidad entre las secuencias de ratón y ser humano en toda la longitud de las secuencias de aminoácidos (SEC ID NO:2 y SEC ID NO: 11) de zcytorl7lig. La secuencia madura para el zcytor17lig de ratón comienza putativamente en Met_{1}, como se muestra en la SEC ID NO:11, que corresponde a Met_{1}, como se muestra en la SEC NO:2, en la secuencia humana. Los análisis de tejido revelaron que la expresión de zcytorl7lig de ratón se halla en testículo, cerebro, células CD90+, células de próstata, glándulas salivales y piel. Otros análisis de secuenciación N-terminal de zcytorl7lig purificado de células 293T mostró un término N en el residuo 31 (Ala), como se muestra en la SEC ID NO:11 y en la SEC ID NO:91, con el polipéptido maduro comprendido por los residuos aminoácido 31 (Ala) a 163 (Cys) (como se muestra en la SEC ID NO: 11 y en la SEC ID NO:9l).
Las personas con experiencia en la técnica reconocerán que la secuencia descrita en la SEC ID NO:1 representa un alelo sencillo de zcytor17lig humano y que se espera que ocurran la variación alélica y el empalme alternativo. Las variantes alélicas de esta secuencia se pueden clonar sondeando cDNA o genotecas genómicas de diferentes individuos según procedimientos convencionales. Las variantes alélicas de la secuencia de DNA que se muestran en la SEC ID NO:1, incluyendo aquellas que contienen mutaciones silenciosas y aquellas en las que las mutaciones provocan cambios en la secuencia de aminoácidos, están dentro del alcance de la presente invención, ya que son proteínas que son variantes alélicas de la SEC ID NO:2. Los cDNA generados a partir de mRNA alternativamente empalmados, que retienen las propiedades del polipéptido zcytor17lig, se incluyen dentro del alcance de la presente invención, ya que son polipéptidos codificados por dichos cDNA y mRNA. Las variantes alélicas y las variantes de empalme de estas secuencias se pueden clonar sondeando cDNA o genotecas genómicas de diferentes individuos o tejidos según procedimientos convencionales conocidos en la técnica.
La presente invención también proporciona reactivos útiles en aplicaciones diagnósticas. Por ejemplo, el gen zcytor17lig, una sonda que comprende DNA o RNA de zcytor17lig o una de sus secuencias, se puede utilizar para determinar si el gen zcytor17lig está presente en un cromosoma humano, como el cromosoma 12, o si ha tenido lugar una mutación. Zcytor17lig está ubicado en la región 12q24.31 del cromosoma 12 (Ejemplo 13). Las aberraciones cromosómicas detectables en el locus del gen zcytor17lig incluyen, aunque sin limitarse a ello, aneuploidía, cambios en el número de copias del gen, pérdida de heterocigosidad (LOH), translocaciones, inserciones, deleciones, cambios y reordenaciones en el sitio de restricción. Dichas aberraciones pueden detectarse usando los polinucleótidos de la presente invención, empleando técnicas de genética molecular, como análisis de polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP), análisis de repeticiones cortas en tándem (STR) empleando técnicas PCR, y otras técnicas de análisis de enlazadores genéticos conocidas en el campo (Sambrook et al, ibid; Ausubel et. al., ibid; Marian, Chest 108: 255-65.1995).
El conocimiento preciso de la posición de un gen puede ser útil para una serie de propósitos, que incluyen: 1) determinar si una secuencia es parte de un cóntigo existente y obtener secuencias genéticas circundantes adicionales en diversas formas, como clones de cDNA, YAC o BAC; 2) proporcionar un posible gen candidato para una enfermedad hereditaria que muestre un enlazador a la misma región cromosómica; y 3) hacer referencia cruzada a organismos modelo, como el ratón, lo cual puede ayudar a determinar la función que podría tener un gen particular.
El experto en la técnica reconocería que la región 12q24 está frecuentemente implicada en enormes reordenaciones genómicas, a saber translocaciones, deleciones, inversiones y duplicaciones, que se asocian a diversos tipos de cáncer. La Base de Datos de Mitelman sobre Aberraciones Cromosómicas de Cáncer, en el Cancer Genome Anatomy Project, National Institutes of Health, Bethesda, Md, publicada en Internet, enumera 199 casos de cáncer con reordenaciones genómicas que implican la región 12q24. De éstos, la mayoría son parte de cariotipos complejos con otras reordenaciones; no obstante, en algunos casos, la reordenación que implica la región 12q24 es la única alteración genómica. Dada la expresión del receptor de zcytorl7lig en células de linajes linfoides y mieloides, es particularmente importante destacar que existen por lo menos 4 casos de leucemia mieloide publicados en la bibliografía, en los que o bien la translocación (2 casos: Yamagata et al, Cancer Genet Cytogenet 97: 90-93, 1997; Dunphy y Batanian, Cancer Genet Cytogenet 114: 51-57, 1999) o la duplicación (2 casos: Bonomi et al, Cancer Genet Cytogenet 108: 75-78, 1999) son la única alteración genómica. Esto indica que un gen o genes que residen dentro de 12q24 podrían estar directamente implicados en la transformación maligna de las células de estos pacientes. La sobrexpresión de zcytor17lig podría contribuir a la transformación maligna, promoviendo la proliferación aberrante de células que portan el receptor, a través de mecanismos autocrinos o paracrinos. La inhibición de la actividad del zcytor17lig podría así inhibir el crecimiento de dichas células. Alternativamente, una reordenación genómica, que provoca la inactivación del gen zcytor17lig, podría promover la transformación maligna y/o la metástasis, eliminando las funciones inmunorreguladoras del zcytor17lig. De hecho, se ha elaborado un mapa de un gen que suprime la metástasis en el cáncer de próstata a 12q24-qter (Ichikawa et al, Asian J Androl 2: 167-171, 2000). Si zcytor17lig es el gen dentro de esta región responsable de la supresión de la metástasis, entonces el zcytor17lig en sí mismo puede tener valor terapéutico en el tratamiento del cáncer.
Un diagnóstico podría ayudar a los médicos a determinar el tipo de enfermedad y la terapia adecuada asociada, o la asistencia en el asesoramiento genético. Como tales, los anticuerpos, polinucleótidos y polipéptidos anti-zcytor17lig de la invención se pueden usar para la detección del polipéptido zcytor17lig, mRNA o anticuerpos anti-zcytor17lig, sirviendo así como marcadores, y usarse directamente para detectar enfermedades genéticas o cáncer, como se describe en la presente memoria, usando métodos conocidos en la técnica y descritos en este documento. Además, las sondas polinucleotídicas de zcytor17lig se pueden usar para detectar anomalías o genotipos asociados con deleciones y translocaciones del cromosoma 12q24.3 asociadas a enfermedades humanas, u otras translocaciones implicadas en la progresión de tumores malignos u otras mutaciones de 12q24.3, que se espera estén involucradas en las reordenaciones cromosómicas de la malignidad; o en otros tipos de cáncer. De modo similar, las del polinucleótido zcytor17lig se pueden usar para detectar anomalías o genotipos asociados a la trisomía del cromosoma 12, y pérdida cromosómica asociada a enfermedades humanas o aborto espontáneo. Por ende, las sondas polinucleotídicas de zcytor17lig se pueden usar para detectar anomalías o genotipos asociados con estos defectos.
El experto en la técnica reconocería que las sondas polinucleotídicas de zcytor17lig son particularmente útiles para el diagnóstico de anomalías cromosómicas importantes asociadas a pérdida de heterogeneidad (LOH), aumento de cromosomas (p. ej., trisomía), translocación, ampliación de DNA y similares. Se sabe que las translocaciones dentro del locus cromosómico 12q24.3, en el que está ubicado el gen zcytorl7lig, se asocian a enfermedades humanas. Por ejemplo, las deleciones, translocaciones, duplicaciones y trisomía de 12q24 se asocian al cáncer, como se mencionó precedentemente. En consecuencia, ya que el gen zcytor17lig se mapea hacia esta región crítica, las sondas polinucleotídicas de zcytor17lig de la presente invención se pueden usar para detectar anomalías o genotipos asociados a la translocación, deleción, trisomía y similares de 12q24, como se describió anteriormente.
Como se analizó precedentemente, los defectos en el gen zcytor17lig propiamente dicho pueden provocar una patología humana hereditaria. Las moléculas de la presente invención, como los polipéptidos, antagonistas, agonistas, polinucleótidos y anticuerpos de la presente invención ayudarían en la detección, diagnóstico, prevención y tratamiento asociados al defecto genético de zcytor17lig. Asimismo, las sondas polinucleotídicas de zcytor17lig se pueden usar para detectar diferencias alélicas entre individuos enfermos y no enfermos en el locus del cromosoma zcytor17lig. Como tales, las secuencias de zcytor17lig se pueden usar como diagnósticas en la formación de la huella genética forense.
En general, los métodos diagnósticos utilizados en el análisis de conexión genética para detectar una anomalía o aberración genética en un paciente, se conocen en la técnica. Las sondas analíticas tendrán en general por lo menos 20 nt de longitud, aunque se pueden usar sondas un poco más cortas (p. ej., 14-17 nt). Los cebadores de PCR tiene por lo menos 5 nt de longitud, preferiblemente 15 o más, más preferiblemente 20-30 nt. Para el análisis macroscópico de genes, o DNA cromosómico, una sonda polinucleotídica de zcytor17lig puede comprender un exón entero o más. El experto en la técnica determina fácilmente los exones, comparando las secuencias de zcytor17lig (SEC ID NO:1) con el DNA genómico de zcytor17lig de ratón (SEC ID NO:76). En general, los métodos de diagnóstico utilizados en el análisis de conexión genética, para detectar una anomalía o aberración genética en un paciente, se conocen en la técnica. La mayoría de los métodos de diagnóstico comprenden las etapas de (a) obtener una muestra genética de un paciente posiblemente enfermo, un paciente enfermo o un portador posiblemente no enfermo de un alelo enfermo recesivo; (b) producir un primer producto de reacción, incubando la muestra genética con una sonda polinucleotídica de zcytor17lig, en la que el polinucleótido se hibridará a la secuencia polinucleotídica complementaria, como en el análisis RFLP, o incubando la muestra genética con cebadores sentido y antisentido en una reacción PCR bajo condiciones de reacción PCR adecuadas; (iii) visualizar el primer producto de reacción por electroforesis en gel y/u otros métodos conocidos, tales como visualizar el primer producto de reacción con una sonda polinucleotídica de zcytor17lig, en la que el polinucleótido se hibridará a la secuencia polinucleotídica complementaria de la primera reacción; y (iv) comparar el primer producto de reacción visualizado con un segundo producto de reacción de control de una muestra genética de tipo salvaje de un paciente, o de un individuo normal o control. Una diferencia entre el primer producto de reacción y el producto de reacción de control es indicativa de una anomalía genética en el paciente enfermo o posiblemente enfermo, o la presencia de un fenotipo portador recesivo heterocigótico para un paciente no enfermo, o la presencia de un defecto genético en un tumor de un paciente enfermo, o la presencia de una anomalía genética en un feto o embrión pre-implantación. Por ejemplo, una diferencia en el patrón del fragmento de restricción, la longitud de los productos PCR, la longitud de secuencias repetitivas en el locus genético de zcytorl7lig y similares, son indicativas de una anomalía genética, aberración genética o diferencia alélica en comparación con el control de tipo salvaje normal. Los controles pueden ser de miembros de la familia no afectados, o individuos no relacionados, dependiendo del ensayo y la disponibilidad de las muestras. Las muestras genéticas para uso dentro de la presente invención incluyen DNA, mRNA y cDNA genómicos aislados de cualquier tejido u otra muestra biológica de un paciente, lo que incluye, aunque sin limitarse a ello, sangre, saliva, semen, células embrionarias, líquido amniótico y similares. La sonda polinucleotídica o el cebador pueden ser RNA o DNA, y comprenderán una porción de la SEC ID NO:1, el complemento de la SEC ID NO:1, o su equivalente de RNA. Dichos métodos para mostrar el análisis de conexión genética a fenotipos de enfermedad humana se conocen en la técnica. Para referencia a los métodos basados en PCR en el diagnóstico, véanse, en general, Mathew (ed.), Protocols in Human Molecular Genetics (Humana Press, Inc. 1991), White (ed.), PCR Protocols: Current Methods and Applications (Humana Press, Inc. 1993), Cotter (ed.), Molecular Diagnosis of Cancer (Humana Press, Inc. 1996), Hanausek y Walaszek (eds.), Tumor Marker Protocols (Humana Press, Inc. 1998), Lo (ed.), Clinical Applications of PCR (Humana Press, Inc. 1998) y Meitzer (ed.), PCR in Bioanalysis (Humana Press, Inc. 1998).
Las mutaciones asociadas al locus de zcytor17lig se pueden detectar usando las moléculas de ácido nucleico de la presente invención, empleando métodos convencionales para análisis de mutación directa, como análisis de polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción, análisis de repeticiones cortas en tándem empleando técnicas PCR, análisis de sistemas de ampliación-mutación refractaria, detección de polimorfismos de conformación monocatenaria, métodos de escisión de RNase, electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante, análisis de emparejamiento incorrecto asistido por fluorescencia y otras técnicas de análisis genéticas conocidas en el campo (véanse, por ejemplo, Mathew (ed.), Protocols in Human Molecular Genetics (Humana Press, Inc. 1991), Marian, Chest 108:255 (1995), Coleman y Tsongalis, Molecular Diagnostics (Human Press, Inc. 1996), Elles (ed.) Molecular Diagnosis of Genetic Diseases (Humana Press, Inc. 1996), Landegren (ed.), Laboratory Protocols for Mutation Detection (Oxford University Press 1996), Birren et al (eds.). Genome Analysis, Vol. 2: Detecting Genes (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1998), Dracopoli et al (eds.), Current Protocols in Human Genetics (John Wiley & Sons 1998) y Richards y Ward, "Molecular Diagnostic Testing", en Principles of Molecular Medicine, páginas 83-88 (Humana Press, Inc. 1998). El análisis directo de un gen zcytor17lig para una mutación se puede realizar utilizando el DNA genómico de un sujeto. El experto en la técnica conoce los métodos para ampliar DNA genómico obtenido, por ejemplo, de linfocitos de sangre periférica (véase, por ejemplo, Dracopoli et al. (eds.), Current Protocols in Human Genetics, páginas 7.1.6 a 7.1.7 (John Wiley & Sons 1998)).
Las posiciones de los intrones en el gen zcytor17lig de ratón se determinaron por identificación de clones genómicos y posterior análisis de las uniones intrón/exón. El DNA genómico de ratón se muestra en la SEC ID NO:76. Con referencia a la SEC ID NO:76, son manifiestos tres exones codificantes separados por intrones: el primero exón codificante se encuentra entre los números de ácido nucleico 1104-1119 de la SEC ID NO:76, el segundo exón entre los números de ácido nucleico 1300-1451 de la SEC ID NO:76 y el tercer exón entre los números de ácido nucleico 2411-2998 de la SEC ID NO:76.
Dentro de las realizaciones de la invención, las moléculas de ácido nucleico que codifican zcytor17lig aislado se pueden hibridar bajo condiciones rigurosas a las moléculas de ácido nucleico que tienen la secuencia de nucleótidos de la SEC ID NO:1, a las moléculas de ácido nucleico que tienen la secuencia de nucleótidos de la 28 a 519 de la SEC ID NO:1, o a las moléculas de ácido nucleico que tienen una secuencia de nucleótidos complementaria a la SEC ID NO:1. En general, las condiciones rigurosas se seleccionan en aproximadamente 5ºC menos que el punto de fusión térmico (T_{m}) de la secuencia específica a una fuerza iónica y pH definidos. El T_{m} es la temperatura (bajo la fuerza iónica y el pH definidos) a la cual se hibrida 50% de la secuencia diana a una sonda perfectamente empare-
jada.
Un par de moléculas de ácido nucleico, como DNA-DNA, RNA-RNA y DNA-RNA, puede hibridarse si las secuencias de nucleótidos tienen el mismo grado de complementaridad. Los híbridos pueden tolerar pares de bases emparejados incorrectamente en la doble hélice, pero la estabilidad del híbrido es influenciada por el grado de emparejamiento incorrecto. El T_{m} del híbrido incorrectamente emparejado disminuye 1ºC por cada 1-1,5% de emparejamiento incorrecto del par de bases. Variando la rigurosidad de las condiciones de hibridación es posible controlar el grado de emparejamiento incorrecto que estará presente en el híbrido. El grado de rigurosidad aumenta a medida que aumenta la temperatura de hibridación y que disminuye la fuerza iónica del tampón de hibridación.
El experto en la técnica tendrá la capacidad de adaptar estas condiciones para uso con un híbrido polinucleotídico particular. El T_{m} de una secuencia diana específica es la temperatura (bajo condiciones definidas) a la cual se hibridará 50% de la secuencia diana a una sonda perfectamente emparejada. Esas condiciones, que influyen sobre el T_{m}, incluyen el tamaño y el contenido de los pares de bases de la sonda polinucleotídica, la fuerza iónica de la solución de hibridación y la presencia de agentes desestabilizantes en la solución de hibridación. Se conocen en la técnica numerosas ecuaciones para calcular el T_{m}, y son específicas de híbridos de DNA, RNA y DNA-RNA y de secuencias de sondas polinucleotídicas de longitud variable (véanse, por ejemplo, Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición (Cold Spring Harbor Press 1989); Ausubel et al., (eds.), Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Inc. 1987); Berger y Kimmel (eds.), Guide to Molecular Cloning Techniques, (Academic Press, Inc. 1987); y Wetmur, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 26:227 (1990)). Los programas para análisis de secuencias, tales como OLIGO 6.0 (LSR; Long Lake, MN) y Primer Premier 4.0 (Premier Biosoft International; Palo Alto, CA), como también los sitios de Internet, son herramientas disponibles para analizar una secuencia determinada y calcular el T_{m} en base a criterios definidos por el usuario. Dichos programas también pueden analizar una secuencia determinada bajo condiciones definidas e identificar secuencias de sondas adecuadas. Típicamente, la hibridación de secuencias de polinucleótidos más largas, >50 pares de bases, se realiza a temperaturas que oscilan entre aproximadamente 20-25ºC debajo del T_{m} calculado. Para sondas más pequeñas, <50 pares de bases, la hibridación típicamente se lleva a cabo a T_{m} o 5-10ºC debajo del T_{m} calculado. Esto permite el índice máximo de hibridación de híbridos DNA-DNA y DNA-RNA.
Después de la hibridación, las moléculas de ácido nucleico se pueden lavar para eliminar las moléculas de ácido nucleico no hibridadas bajo condiciones rigurosas, o bajo condiciones altamente rigurosas. Las condiciones de lavado rigurosas típicas incluyen el lavado en una solución de 0,5x-2x SSC con dodecilsulfato sódico (SDS) al 0,1% a 55-65ºC. Es decir, las moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido zcytor17lig variante se hibridan con una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEC ID NO:1 (o su complemento) bajo condiciones de lavado rigurosas, en las que la rigurosidad del lavado es equivalente a 0,5x-2x SSC con SDS al 0,1% a 55-65ºC, incluyendo 0,5x SSC con SDS al 0,1% a 55ºC, o 2x SSC con SDS al 0,1% a 65ºC. El experto en la técnica puede planificar fácilmente las condiciones equivalentes, por ejemplo, sustituyendo SSC por SSPE en la solución de lavado.
\newpage
Las condiciones típicas de lavado altamente rigurosas incluyen lavado en una solución de 0,1x-0,2x SSC con dodecilsulfato sódico (SDS) al 0,1% a 50-65ºC. En otros términos, las moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido zcytor17lig variante se hibridan con una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEC ID NO: 1 (o su complemento) bajo condiciones altamente rigurosas, en las que la rigurosidad del lavado es equivalente a 0,1x-0,2x SSC con SDS al 0,1% a 50-65ºC, incluyendo 0,1x SSC con SDS al 0,1% a 50ºC, o 0,2x SSC con SDS al 0,1% a 65ºC.
La presente invención también provee polipéptidos zcytor17lig aislados que tienen una identidad de secuencia sustancialmente similar a los polipéptidos de la SEC ID NO:2, o sus ortólogos. La expresión "identidad de secuencia sustancialmente similar" se emplea en la presente memoria para indicar polipéptidos que comprenden por lo menos 70%, por lo menos 80%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, por lo menos 99% o más de 99% identidad de secuencia con las secuencias que se muestran en la SEC ID NO:2, o sus ortólogos. La presente invención incluye además polipéptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 70%, por lo menos 80%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, por lo menos 99% o más de 99% identidad de secuencia con los residuos aminoácido 1 a 162, o 33 a 162 de la SEC ID NO:2. La presente invención incluye además moléculas de ácido nucleico que codifican dichos polipéptidos. Los métodos para determinar el porcentaje de identidad se describen a
continuación.
La presente invención contempla también moléculas de ácido nucleico de zcytor17lig variante que pueden identificarse usando dos criterios: una determinación de la similitud entre el polipéptido codificado y la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:2, y/o un ensayo de hibridación, como se describió anteriormente. Dichas variantes de zcytor17lig incluyen moléculas de ácido nucleico: (i) que se hibridan con una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEC ID NO:1 (o su complemento) bajo condiciones de lavado rigurosas, en las que la rigurosidad del lavado es equivalente a 0,5x-2x SSC con SDS al 0,1% a 55-65ºC; o (2) que codifican un polipéptido que tiene por lo menos 70%, por lo menos 80%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, por lo menos 99% o más de 99% identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:2. Alternativamente, las variantes de zcytor17lig se pueden caracterizar como moléculas de ácido nucleico: (1) que se hibridan con una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEC ID NO:1 (o su complemento) bajo condiciones altamente rigurosas, en las que la rigurosidad del lavado es equivalente a 0,1x-0,2x SSC con SDS al 0,1% a 50-65ºC; y (2) que codifican un polipéptido que tiene por lo menos 70%, por lo menos 80%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, por lo menos 99% o más de 99% identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:2.
El porcentaje de identidad de secuencia se determina por métodos convencionales. Véanse, por ejemplo, Altschul et al., Bull. Math. Bio. 48: 603 (1986), y Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915 (1992). En síntesis, se alinean dos secuencias de aminoácidos para optimizar los puntajes de alineación usando una penalidad de apertura del espacio de 10, una penalidad de extensión del espacio de 1 y la matriz de puntaje "BLOSUM62" de Henikoff y Henikoff (ibid.) como se muestra en la Tabla 4 (los aminoácidos se indican con códigos convencionales de una sola letra).
\vskip1.000000\baselineskip
200
TABLA 4
5
Los expertos en la técnica apreciarán que hay disponibles muchos algoritmos establecidos para alinear dos secuencias de aminoácidos. El algoritmo de búsqueda de similitud "FASTA" de Pearson y Lipman es un método de alineación de proteínas adecuado para examinar el nivel de identidad compartida por una secuencia de aminoácidos descrita en la presente memoria y la secuencia de aminoácidos de un zcytor171ig variante putativo. El algoritmo FASTA es descrito por Pearson y Lipman, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988), y por Pearson, Meth. Enzymol, 183: 63 (1990).
En síntesis, FASTA caracteriza primero la similitud de secuencias identificando regiones compartidas por la secuencia interrogante (p. ej., SEC ID NO:2) y una secuencia de prueba que tiene o bien la densidad de identidades más alta (si la variable ktup es 1) o pares de identidades (si ktup=2), sin considerar sustituciones, inserciones o deleciones de aminoácidos conservadoras. A las diez regiones con la densidad más alta de identidades se les vuelve a asignar luego un puntaje comparando la similitud de todos los aminoácidos apareados, usando una matriz de sustitución de aminoácidos, y los extremos de de las regiones se "recortan" para incluir solamente aquellos residuos que contribuyen al puntaje más alto. Si hay varias regiones con puntajes superiores al "valor de corte" (calculado por una fórmula predeterminada basada en la longitud de la secuencia y el valor ktup), entonces se examinan las regiones iniciales recortadas para determinar si las regiones pueden unirse para formar una alineación aproximada con espacios. Finalmente, las regiones de puntaje más alto de las dos secuencias de aminoácidos se alinean usando una modificación del algoritmo Needleman-Wunsch-Sellers (Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 444 (1970); Sellers, SIAM J. Appl, Math. 26: 787 (1974)), que permite inserciones y deleciones de aminoácidos. Los parámetros preferidos para los analistas de FASTA son: ktup=i, penalidad de abertura de espacio =10, penalidad de extensión de espacio =1, y matriz de sustitución=BLOSUM62. Estos parámetros pueden introducirse en un programa FASTA, modificando el fichero de la matriz de puntaje ("SMATRIX"), como se explica en el Anexo 2 de Pearson, Meth. Enzymol. 183:63 (1990).
FASTA se puede emplear también para determinar la identidad de secuencia de las moléculas de ácido nucleico, usando una relación, como se describió precedentemente. Para comparaciones de secuencias de nucleótidos, el valor ktup puede oscilar entre uno y seis, preferiblemente entre tres y seis, lo más preferiblemente tres, con otros parámetros establecidos por defecto.
Los polipéptidos zcytor17lig variantes o polipéptidos con identidad de secuencia sustancialmente similar se caracterizan por tener una o más sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos. Estos cambios son preferiblemente de naturaleza menor, es decir, sustituciones de aminoácidos conservadoras (como se expone en la Tabla 5 a continuación) y otras sustituciones que no afectan en forma significativa el pliegue o la actividad del polipéptido; deleciones pequeñas, típicamente entre uno y aproximadamente 30 aminoácidos; y extensiones amino o carboxilterminales, como un residuo metionina amino-terminal, un péptido enlazador pequeño de hasta aproximadamente 20-25 residuos, o un marcador de afinidad. La presente invención incluye, por lo tanto, polipéptidos de aproximadamente 108 a 216 residuos aminoácido que comprenden una secuencia que es por lo menos 70%, por lo menos 80%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, por lo menos 99% o más de 99% idéntica a la región correspondiente de la SEC ID NO:2. Los polipéptidos que comprenden marcadores de afinidad pueden también comprender un sitio de escisión proteolítica entre el polipéptido zcytor17lig y el marcador de afinidad. Dichos sitios preferidos incluyen sitios de escisión de trombina y sitios de escisión de factor Xa.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 5 Sustituciones de aminoácidos conservadoras 
\vskip1.000000\baselineskip
6 
\vskip1.000000\baselineskip
La determinación de residuos aminoácido que comprenden regiones o dominios críticos para mantener la integridad estructural se puede determinar. Dentro de estas regiones, uno puede determinar residuos específicos que serán más o menos tolerantes al cambio y mantendrán la estructura terciaria general de la molécula. Los métodos para analizar la estructura de la secuencia incluyen, aunque sin limitarse a ellos, alineación de secuencias múltiples con alta identidad de nucleótidos o aminoácidos, propensiones de estructuras secundarias, patrones binarios, aglomeración complementaria e interacciones polares enterradas (Barton, Current Opin. Struct. Biol. 5: 372-376, 1995 y Cordes et al., Current Opin. Struct. Biol. 6: 3-10, 1996). En general, cuando se diseñan modificaciones a moléculas o se identifican fragmentos específicos, la determinación de la estructura estará acompañada de actividad evaluadora de las moléculas modificadas.
Los cambios en las secuencias de aminoácidos se realizan en los polipéptidos zcytor17lig como para minimizar la ruptura de la estructura de orden superior esencial para la actividad biológica. Por ejemplo, si el polipéptido zcytor17lig comprende una o más hélices, los cambios en los residuos aminoácido se realizarán como para no romper la geometría de la hélice y otros componentes de la molécula, si los cambios de conformación impiden alguna función crítica, por ejemplo, la unión de la molécula a sus parejas de unión, p. ej., las hélices A y D, los residuos 43 (Glu), 44 (Glu) y 136 (Phe) de la SEC ID NO:2. Los efectos de los cambios en las secuencias de aminoácidos se pueden pronosticar, por ejemplo, con un modelo de ordenador como se describió antes, o se pueden determinar por análisis de la estructura cristalina (véase, p. ej., Lapthorn et al., Nat. Struct-Biol. 2: 266-268, 1995). Otras técnicas conocidas en el campo comparan los pliegues de una proteína variante con una molécula estándar (p. ej., la proteína natural). Por ejemplo, se puede realizar la comparación del patrón de cisteína en moléculas estándar y variantes. La espectrometría de masas y la modificación química, usando reducción y alquilación, proporcionan métodos para determinar residuos cisteína que están asociados a enlaces disulfuro o exentos de dichas asociaciones (Bean et al., Anal. Biochem. 201: 216-226, 1992; Gray, Protein Sci. 2:1732-1748, 1993; y Patterson et al. Anal. Chem. 66: 3727-3732,1994). En general, se cree que si una molécula modificada no tiene el mismo patrón cisteína que la molécula estándar, el pliegue se vería afectado. Otro método muy conocido y aceptado para medir el pliegue es el dicroismo circular (CD). La medición y comparación de los espectros CD generados por una molécula modificada y una molécula estándar son una práctica de rutina (Johnson, Proteins 7:205-214, 1990). La cristalografía es otro método conocido para analizar el plegado y la estructura. La resonancia magnética nuclear (RMN), el mapeo peptídico digestivo y el mapeo de epítopos son también métodos conocidos para analizar el plegado y las similitudes estructurales entre proteínas y polipéptidos (Schaanan et al., Science 257: 961-964, 1992).
Se puede generar un perfil de hidrofilicidad Hopp/Woods de la secuencia de proteínas zcytor17lig, como se muestra en la SEC ID NO:2 (Hopp et al., Proc, Natl. Acad. Sci. 78: 3824-3828. 1981; Hopp, J. Immun. Meth. 88: 1-18, 1986 y Triquier et al., Protein Engineering 11: 153-169, 1998). El perfil se basa en una ventana de seis residuos desplazable. Los residuos enterrados G, S y T, y los residuos expuestos H, Y y W se ignoraron. Por ejemplo, en el zcytor17lig humano, las regiones hidrófilas incluyen los residuos aminoácido 54-59 de la SEC ID NO:2, los residuos aminoácido 129-134 de la SEC ID NO:2, los residuos aminoácido 53-58 de la SEC ID NO:2, los residuos aminoácido 35-40 de la SEC ID NO:2 y los residuos aminoácido 33-38 de la SEC ID NO:2. Por ejemplo, en zcytor17lig de ratón, las regiones hidrófilas incluyen los residuos aminoácido 34-39 de la SEC ID NO:11, los residuos aminoácido 46-51 de la SEC ID NO:11, los residuos aminoácido 131-136 de la SEC ID NO:11, los residuos aminoácido 158-163 de la SEC ID NO:11 y los residuos aminoácido 157-162 de la SEC ID NO:11.
Los expertos en la técnica reconocerán que la hidrofilicidad o hidrofobicidad se tomará en cuenta al diseñar modificaciones en la secuencia de aminoácidos de un polipéptido zcytor17lig, como para no perturbar el perfil estructural y biológico general. Son de particular interés para el reemplazo, los residuos hidrófobos seleccionados del grupo que consiste en Val, Leu y Ile, o del grupo que consiste en Met, Gly, Ser, Ala, Tyr y Trp. Por ejemplo, los residuos que toleran la sustitución podrían incluir Val, Leu y He, o el grupo que consiste en los residuos Met, Gly, Ser, Ala, Tyr y Trp, como se muestra en la SEC ID NO:2. Los residuos cisteína conservados en posiciones dentro de la SEC ID NO:2 y la SEC ID NO:11 serán relativamente intolerantes a la sustitución.
Las identidades de los aminoácidos esenciales también se pueden inferir a partir del análisis de similitud de secuencia entre IL-3, Lif, IL12, IL-15, IL-2, IL-4 y GM-CSF con zcytor17lig. Usando métodos tales como el análisis "FASTA" previamente descrito, se identifican regiones de gran similitud dentro de una familia de proteínas, y se usan para analizar la secuencia de aminoácidos para regiones conservadas. Un planteamiento alternativo para identificar un polinucleótido zcytor17lig variante en base a la estructura consiste en determinar si una molécula de ácido nucleico que codifica un gen zcytor17lig variante potencial puede hibridarse a una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEC ID NO:1, como se analizó anteriormente.
Otros métodos para identificar aminoácidos esenciales en los polipéptidos de la presente invención son procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis de barrido de alanina (Cunningham y Wells, Science 244: 1081 (1989), Bass et al, Proc. Natl Acad. Sci. USA 88: 4498 (1991), Coombs y Corey, "Site-Directed Mutagenesis and Protein Engineering", en Proteins: Analysis and Design, Angeletti (ed.), páginas 259-311 (Academic Press, Inc. 1998)). En esta última técnica, se introducen mutaciones sencillas de alanina en cada residuo de la molécula, y se ensaya la actividad biológica o bioquímica de las moléculas mutantes resultantes, como se describió antes para identificar residuos aminoácido críticos para la actividad de la molécula. Véase también, Hilton et al, J. Biol. Chem. 271:4699 (1996).
La presente invención incluye también fragmentos funcionales de los polipéptidos zcytor17lig y las moléculas de ácido nucleico que codifican dichos fragmentos funcionales. Un zcytor17lig "funcional" o su fragmento, según lo definido en esta memoria, se caracteriza por su actividad proliferativa o de diferenciación, por su capacidad de inducir o inhibir funciones celulares especializadas o por su capacidad de unirse específicamente a un anticuerpo anti-zcytor17lig o anticuerpo del receptor zcytor17 o zcytor17, WSX-1, o el receptor OSMRbeta o heterodímeros (p. ej., zcytor17/WSX-1 o zcytor17/OSMRbeta) o multímeros (p. ej., zcytor17/WSX-1/OSMRbeta) de estos receptores (o bien solubles o inmovilizados). Como se describió previamente en este documento, el zcytor17lig se caracteriza por una estructura de cuatro hélice que comprende la hélice A (residuos aminoácido 38-52), la hélice B (residuos aminoácido 83-98), la hélice C (residuos aminoácido 104-117) y la hélice D (residuos aminoácido 137-152), como se muestra en la SEC ID NO:2. Por lo tanto, la presente invención proporciona además proteínas de fusión que abarcan: (a) moléculas de polipéptidos que comprenden una o más de las hélices ya descritas; y (b) fragmentos funcionales que comprenden una o más de estas hélices. La otra porción del polipéptido de la proteína de fusión puede ser aportada por otra citocina de cuatro hélices, como por ejemplo IL-15, IL-2, IL-4 y GM-CSF, o por un péptido sintético y/o de señal secretora no relacionado que facilite la secreción de la proteína de fusión.
Por consiguiente, la presente invención provee proteínas de fusión que comprenden por lo menos cuatro polipéptidos, en donde el orden de los polipéptidos del término N al término C es: un primer polipéptido comprende aminoácidos seleccionados de un grupo que consiste en: (a) los residuos aminoácido 27-48 de hélice A de IL-2 de SEC ID NO:162; (b) los residuos aminoácido 35-45 de hélice A de IL-3 de SEC ID NO:102; (c) los residuos aminoácido 30-42 de hélice A de IL-4 de SEC ID NO:164; (d) los residuos aminoácido 30-44 de hélice A de GM-CSF de SEC ID NO:166; y (e) los residuos aminoácido 38 a 52 de la SEC ID NO:2; un primer espaciador de 6-27 aminoácidos; y un segundo polipéptido que comprende residuos aminoácido seleccionados del grupo que consiste en: (a) los residuos aminoácido de hélice B de IL-2 de la SEC ID NO: 168; (b) los residuos aminoácido 65-83 de hélice B de IL-4 de la SEC ID NO:164; (c) los residuos aminoácido 73-86 de hélice B de IL-3 de la SEC ID NO:102; (d) los residuos aminoácido 72-81 de hélice B de GM-CSF de la SEC ID NO:166; y (e) los residuos aminoácido 83-98 de la SEC ID NO:2; un espaciador de 5-11 residuos aminoácido; un tercer polipéptido que comprende una secuencia de residuos aminoácido seleccionada del grupo que consiste en: (a) residuos 102-116 de hélice C de IL-2 de la SEC ID NO:162; (b) residuos 94-118 de hélice C de IL-4 de la SEC ID NO:164; (c) residuos 91-103 de hélice C de IL-3 de la SEC ID NO:102; (d) residuos 85-103 de hélice C de GM-CSF de la SEC ID NO:166; y (e) residuos aminoácido 104-117 de la SEC ID NO:2; un tercer espaciador de 3-29 residuos aminoácido; y un cuarto polipéptido que comprende residuos aminoácido seleccionados del grupo que consiste en: (a) residuos aminoácido 134-149 de hélice D de IL-2 de la SEC ID NO:162; (b) residuos aminoácido 123-141 de hélice D de IL-3 de la SEC ID NO:102; (c) residuos aminoácido 133-151 de hélice D de IL-4 de la SEC ID NO:164; (d) residuos aminoácido 120-131 de hélice D de GM-CSF de la SEC ID NO:166; y (e) residuos aminoácido 137-152 de la SEC ID NO:2, en donde por lo menos uno de los cuatro polipéptidos está entre zcytor17lig. En otras realizaciones en las que se seleccionarán los péptidos espaciadores entre los bucles A/B, B/C y C/D de zcytor17lig, y IL-3, como se muestra en la Tabla 1.
Se pueden efectuar análisis de deleción de rutina de moléculas de ácido nucleico para obtener fragmentos funcionales de una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido zcytor17lig. Como ilustración, las moléculas de DNA que tienen la secuencia de nucleótidos de la SEC ID NO:1 o sus fragmentos, se pueden digerir con Bal31 nucleasa para obtener una serie de deleciones anidadas. Estos fragmentos de DNA se insertan luego en vectores de expresión en el marco de lectura apropiado, y los polipéptidos expresados se aíslan y ensayan para actividad del zcytor17lig, o para la capacidad de unirse a anticuerpos de anti-zcytor17lig o al receptor zcytor17. Una alternativa a la digestión de exonucleasa consiste en usar mutagénesis dirigida a oligonucleótidos para introducir las deleciones o codones de terminación para especificar la producción de un fragmento de zcytor17lig deseado. Alternativamente, se pueden sintetizar fragmentos particulares de un gen zcytor17lig, usando la reacción en cadena de la polimerasa.
Los métodos convencionales para identificar dominios funcionales se conocen en la técnica. Por ejemplo, los estudios sobre la truncación en alguno o ambos términos de los interferones han sido resumidos por Horisberger y Di Marco, Pharmac. Ther. 66: 507 (1995). Asimismo, las técnicas convencionales para análisis funcionales de proteínas son descritas, por ejemplo, por Treuter et al, Molec. Gen. Genet. 240: 113 (1993); Content et al., "Expression and preliminary deletion analysis of the 42 kDa 2-5A synthetase induced by human interferon", en Biological Interferon Systems. Proceedings of ISIR-TNO Meeting on Interferon Systems. Cantell (ed.), páginas 65-72 (Nijhoff 1987); Herschman, "The EGF Receptor", en Control of Animal Cell Proliferation 1, Boynton et al, (eds.) páginas 169-199 (Academic Press 1985); Cournailleau et al., J. Biol. Chem. 270: 29270 (1995); Fukunaga et al., J. Biol. Chem. 270: 25291 (1995); Yamaguchi et al., Biochem. Pharmacol. 50: 1295 (1995); y Meisel et al., Plant Molec. Biol. 30: 1 (1996).
Se pueden realizar y ensayar sustituciones de aminoácidos múltiples, usando métodos conocidos de mutagénesis y selección, como aquellos descritos por Reidhaar-Olson y Sauer (Science 241:53 (1988)) o por Bowie y Sauer (Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86: 2152 (1989)). En resumen, estos autores describen métodos para aleatorizar simultáneamente dos o más posiciones en un polipéptido, seleccionar un polipéptido funcional y luego secuenciar los polipéptidos mutagenizados para determinar el espectro de sustituciones permisibles en cada posición. Otros métodos que se pueden emplear incluyen visualización de fagos (p. ej., Lowman et al, Biochem. 30: 10832 (1991), Ladner et al., patente estadounidense No. 5.223.409, Huse, publicación internacional No. WO 92/06204), y mutagénesis dirigida a la región (Derbyshire et al., Gene 46: 145 (1986), y Ner et al., DNA 7: 127. (1988)).
Las variantes de las secuencias de nucleótidos y polipéptidos zcytor17lig descritos también se pueden generar entremezclando DNA, como lo describen Stemmer, Nature 370:389 (1994), Stemmer, Proc. Natl Acad. Sci. USA 91: 10747 (1994), y la publicación internacional No. WO 97/20078. En síntesis, las moléculas de DNA variantes se generan por recombinación homóloga in vitro, por fragmentación aleatoria de un DNA progenitor, seguida de re-ensamblaje usando PCR, lo que proporciona mutaciones de punto introducidas aleatoriamente. Esta técnica se puede modificar usando una familia de moléculas de DNA progenitor, como variantes alélicas o moléculas de DNA de distintas especies, para introducir variabilidad adicional al proceso. La selección o detección de la actividad deseada, seguida de iteraciones adicionales de mutagénesis y ensayos, proporciona una rápida "evolución" de las secuencias, seleccionando las mutaciones deseables, a la vez que se seleccionan simultáneamente contra cambios perjudiciales.
Los métodos de mutagénesis descritos en este documento se pueden combinar con métodos de selección automáticos de alto rendimiento, a fin de detectar la actividad de los polipéptidos clonados, mutagenizados en las células hospedantes. Las moléculas de DNA mutagenizadas que codifican polipéptidos biológicamente activos, o polipéptidos que se unen con anticuerpos anti-zcytor17lig o el receptor de zcytor17 soluble, o WSX-1 soluble o OSMR soluble o heterodímeros o multímeros de estos receptores solubles, como se describe en el presente documento, se pueden recuperar de las células hospedantes y secuenciarse rápidamente, usando equipos modernos. Estos métodos permiten la determinación rápida de la importancia de residuos aminoácido individuales en un polipéptido de interés, y pueden aplicarse a polipéptidos de estructura desconocida.
Además, las proteínas de la presente invención (o sus fragmentos de polipéptidos) se pueden unir a otras moléculas bioactivas, particularmente otras citocinas, para proporcionar moléculas multifuncionales. Por ejemplo, una o más hélices de zcytor17lig pueden unirse a otras citocinas para potenciar sus propiedades biológicas o la eficacia de producción.
La presente invención provee, por lo tanto, una serie de nuevas moléculas híbridas, en las que un segmento que comprende una o más hélices de zcytor17lig se condensa a otro polipéptido. La fusión se realiza preferiblemente empalmando al nivel del DNA para permitir la expresión de moléculas quiméricas en sistemas de producción recombinantes. Las moléculas resultantes se ensayan luego para estudiar propiedades tales como mejor solubilidad, mejor estabilidad, semivida de aclaramiento prolongada, mejores niveles de expresión y secreción, y farmacodinámica. Dichas moléculas híbridas pueden además comprender residuos aminoácido adicionales (p. ej., un enlazador de polipéptidos) entre las proteínas o polipéptidos componentes.
Los aminoácidos no naturales incluyen, sin limitación, trans-3-metilprolina, 2,4-metanoprolina, cis-4-hidroxiprolina, trans-4-hidroxiprolina, N-metilglicina, alo-treonina, metiltreonina, hidroxietilcisteína, hidroxietilhomocisteína, nitroglutamina, homoglutamina, ácido pipecólico, ácido tiazolidinacarboxílico, deshidroprolina, 3- y 4-metilprolina, 3,3-dimetilprolina, terc-leucina, norvalina, 2-azafenilalanina, 3-azafenilalanina, 4-azafenilalanina y 4-fluorofenilalanina. Se conocen en la técnica diversos métodos para incorporar residuos aminoácido no naturales a las proteínas. Por ejemplo, se puede emplear un sistema in vitro en el que se suprimen las mutaciones no sentido, usando tRNA supresores químicamente aminoacilados. Los métodos para sintetizar aminoácidos y aminoacilar tRNA se conocen en la técnica. La transcripción y traducción de plásmidos que contienen mutaciones no sentido típicamente se llevan a cabo en un sistema exento de células, que comprende un extracto de E. coli S30 y enzimas obtenibles en el mercado, y otros reactivos. Las proteínas se purifican por cromatografía. Véase, por ejemplo, Robertson et al., J. Am. Chem. Soc, 113:2722 (1991), Ellman et al., Methods Enzymol. 202: 301 (1991), Chung et al., Science 259: 806 (1993), y Chung et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 90:10145 (1993).
En un segundo método, la traducción se lleva a cabo en Xenopus oocytes por microinyección de mRNA mutado y tRNA supresores químicamente aminoacilados (Turcatti et al., J. Biol. Chem. 271: 19991 (1996)). Dentro de un tercer método, se cultivan células de E. coli en ausencia de un aminoácido natural que se ha de reemplazar (p. ej., fenilalanina) y en presencia del aminoácido(s) no natural deseado (p. ej., 2-azafenilalanina, 3-azafenilalanina, 4-azafenilalanina o 4-fluorofenilalanina). El aminoácido no natural se incorpora a la proteína, en lugar de su contrapartida natural. Véase, Koide et al., Biochem. 33: 7470 (1994). Los residuos aminoácido naturales pueden convertirse en especies no naturales por modificación química in vitro. La modificación química se puede combinar con mutagénesis dirigida al sitio para expandir más el intervalo de sustituciones (Wynn y Richards, Protein Sci. 2:395 (1993). Puede ser ventajoso estabilizar el zcytor17lig para extender la semivida de la molécula, particularmente para extender la persistencia metabólica en un estado activo. Para lograr la extensión de la semivida, las moléculas de zcytor17lig pueden modificarse químicamente, usando los métodos aquí descritos. La PEGilación es un método comúnmente utilizado que ha demostrado aumentar la semivida en plasma y la solubilidad, y disminuir la antigenicidad y la inmunogenicidad (Nucci et al., Advanced Drug Delivery Reviews 6: 133-155, 1991 y Lu et al., Int. J. Peptide Protein Res. 43: 127-138, 1994).
Los residuos aminoácido zcytor17lig pueden sustituirse por un número limitado de aminoácidos no conservadores, aminoácidos que no están codificados por el código genético, aminoácidos no naturales y aminoácidos sintéticos.
La presente invención proporciona también fragmentos de polipéptidos o péptidos que comprenden una porción que porta un epítopo de un polipéptido zcytor17lig descrito en este documento. Dichos fragmentos o péptidos pueden comprender un "epítopo inmunogénico", que es parte de una proteína que desencadena la respuesta de un anticuerpo cuando toda la proteína se usa como inmunógeno. Los péptidos que portan un epítopo inmunogénico se pueden identificar usando métodos convencionales (véase, por ejemplo, Geysen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 81: 3998 (1983)).
En contraste, los fragmentos de polipéptidos o los péptidos pueden comprender un "epítopo antigénico", que es una región de una molécula de proteína a la cual puede unirse específicamente un anticuerpo. Determinados epítopos consisten en una extensión lineal o contigua de aminoácidos, y la antigenicidad de dicho epítopo no es perturbada por agentes desnaturalizantes. Se conoce en la técnica que los péptidos sintéticos cortos que pueden imitar epítopos de una proteína pueden usarse para estimular la producción de anticuerpos contra la proteína (véase, por ejemplo, Sutcliffe et al., Science 219: 660 (1983)). Por consiguiente, los polipéptidos y péptidos que portan epítopos de la presente invención son útiles para promover anticuerpos (p. ej., anticuerpos neutralizadores) que se unen con los polipéptidos descritos en la presente memoria. Los perfiles de hidrofilicidad de Hopp/Woods se pueden usar para determinar regiones que tengan el potencial más antigénico (Hopp et al., 1981, ibid, y Hopp, 1986, ibid.). Por ejemplo, en el zcytor17lig humano, las regiones hidrófilas incluyen los residuos aminoácido 54-59 de la SEC ID NO:2, los residuos aminoácido 129-134 de la SEC ID NO:2, los residuos aminoácido 53-58 de la SEC ID NO:2, los residuos aminoácido 35-40 de la SEC ID NO:2 y los residuos aminoácido 33-38 de la SEC ID NO:2. Por ejemplo, en zcytor17lig de ratón, las regiones hidrófilas incluyen los residuos aminoácido 34-39 de la SEC ID NO:11, los residuos aminoácido 46-51 de la SEC ID NO:11, los residuos aminoácido 131-136 de la SEC ID NO:11, los residuos aminoácido 158-163 de la SEC ID NO:11 y los residuos aminoácido 157-162 de la SEC ID NO:11.
Los polipéptidos y péptidos que portan epítopos antigénicos preferiblemente contienen por lo menos cuatro a diez aminoácidos, por lo menos diez a catorce aminoácidos o aproximadamente catorce a aproximadamente treinta aminoácidos de la SEC ID NO:2 o de la SEC ID NO:11. Ducgis polipéptidos y péptidos que portan epítopos pueden producirse fragmentando un polipéptido zcytor17lig o por síntesis peptídica química, como se describe en este documento. A su vez, los epítopos pueden seleccionarse por visualización de fagos de colecciones de péptidos aleatorias (véanse, por ejemplo, Lane y Stephen, Curr. Opin. Immunol, 5: 268 (1993); y Cortese et al., Curr. Opin. Biotechnol. 7: 616 (1996)). Los métodos convencionales para identificar epítopos y producir anticuerpos a partir de péptidos pequeños que comprenden un epítopo son descritos, por ejemplo, por Mole, "Epitope Mapping", en Methods in Molecular Biology, Vol. 10, Manson (ed.), páginas 105-116 (The Humana Press, Inc. 1992); Price, "Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies", en Monoclonal Antibodies: Production, Engineering, and Clinical Application. Ritter y Ladyman (eds.), páginas 60-84 (Cambridge University Press 1995), y Coligan et al. (eds.), Current Protocols in Immunology, páginas 9.3.1-9.3.5 y páginas 9.4.1-9.4.11 (John Wiley &
Sons 1997).
Independientemente de la secuencia de nucleótidos particular de un polinucleótido zcytor17lig variante, el polinucleótido codifica un polipéptido que se caracteriza por su actividad proliferativa o diferenciadora, su capacidad de inducir o inhibir las funciones celulares, o por la capacidad de unirse específicamente a un anticuerpo anti-zcytor17lig o receptor de zcytor17. Más específicamente, los polinucleótidos zcytor17lig variantes codificarán polipéptidos que exhiben por lo menos 50% y preferiblemente por lo menos 70%, por lo menos 80%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, por lo menos 99% o más de 99%, de la actividad del polipéptido, como se muestra en la SEC ID NO:2.
Para cualquier polipéptido zcytor17lig, incluyendo variantes y proteínas de fusión, la persona con experiencia ordinaria en la técnica puede generar fácilmente una secuencia de polinucleótidos totalmente degenerada que codifique esa variante, usando la información expuesta en las Tablas 1 y 2 exhibidas anteriormente.
La presente invención provee además una diversidad de otras fusiones de polipéptidos (y proteínas multiméricas relacionadas que comprenden una o más fusiones de polipéptidos). Por ejemplo, se puede preparar un polipéptido zcytor17lig como una fusión a una proteína dimerizante, como se describe en las patentes estadounidenses No. 5.155.027 y 5.567.584. Las proteínas dimerizantes preferidas en este sentido incluyen dominios de regiones constantes de inmunoglobulina. Las fusiones de inmunoglobulina-polipéptido zcytor17lig se pueden expresar en células genéticamente manipuladas (para producir una diversidad de análogos de zcytor17lig multiméricos). Los dominios auxiliares se pueden condensar a polipéptidos zcytor17lig para dirigirlos hacia células, tejidos o macromoléculas específicos. Por ejemplo, una proteína o un polipéptido zcytor17lig podría direccionarse hacia un tipo de célula predeterminado, condensando un polipéptido zcytor17lig a un ligando que se una específicamente a un a receptor en la superficie de esa célula diana. De este modo, los polipéptidos y proteínas se pueden direccionar para propósitos terapéuticos o diagnósticos. Un polipéptido zcytor17lig se puede condensar a dos o más restos, como un marcador de afinidad para purificación y un dominio diana. Las fusiones de polipéptidos también pueden comprender uno o más sitios de escisión, particularmente entre dominios. Véase, Tuan et al, Connective Tissue Research 34: 1-9, 1996.
Usando los métodos analizados en esta memoria, la persona con experiencia ordinaria en la técnica puede identificar y/o preparar una diversidad de polipéptidos que tienen identidad de secuencia sustancialmente similar a los residuos 1-164 ó 24-164 de la SEC ID NO:2, o fragmentos funcionales y sus fusiones, como las hélices A-D (residuos 38-152 de la SEC ID NO:2), en donde dichos polipéptidos o fragmentos o fusiones retienen las propiedades de la proteína de tipo salvaje, por ejemplo, la capacidad de estimular la proliferación, diferenciación, inducir la función celular o unirse al receptor zcytor17 o a los anticuerpos de zcytor17lig.
Los polipéptidos zcytor17lig de la presente invención, incluyendo polipéptidos de longitud total, fragmentos funcionales y polipéptidos de fusión, se pueden producir en células hospedantes genomanipuladas de acuerdo con técnicas convencionales. Las células hospedantes adecuadas son aquellos tipos de células que pueden transformarse o transfectarse con DNA exógeno y desarrollarse en cultivo, e incluyen bacterias, células fúngicas y células eucarióticas superiores cultivadas. Se prefieren las células eucarióticas, particularmente las células cultivadas de organismos multicelulares. Las técnicas para manipular moléculas de DNA clonadas e introducir DNA exógeno a una diversidad de células hospedantes se describen en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, y en Ausubel et al., eds., Current Protocols in Motecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987.
En general, una secuencia de DNA que codifica un polipéptido zcytor17lig puede unirse operativamente a otros elementos genéticos requeridos para su expresión, incluyendo generalmente un promotor y terminador de transcripción, dentro de un vector de expresión. El vector también contendrá normalmente uno o más marcadores seleccionables y uno o más orígenes de replicación, aunque las personas experimentadas en la técnica reconocerán que dentro de ciertos sistemas, los marcadores seleccionables pueden ser provistos en vectores separados, y la replicación del DNA exógena puede ser provista por la integración en el genoma celular hospedante. La selección de promotores, terminadores, marcadores seleccionables, vectores y otros elementos es una cuestión de diseño de rutina dentro del nivel de experiencia ordinaria en la técnica. Muchos de dichos elementos se describen en la bibliografía y se obtienen en el mercado.
\newpage
Para dirigir un polipéptido zcytor17lig hacia la vía secretora de una célula hospedante, se provee una secuencia de señal secretora (también conocida como secuencia líder, secuencia prepro o secuencia pre) en el vector de expresión. La secuencia de la señal secretora puede ser aquella de zcytor17lig, o puede derivar de otra proteína secretada (p. ej., t-PA) o sintetizarse de novo. La secuencia de la señal secretora está operativamente unida a la secuencia del DNA de zcytor17lig, es decir, las dos secuencias se unen en el marco de lectura correcto y se posicionan para dirigir el polipéptido recién sintetizado hacia la vía secretora de la célula hospedante. Las secuencias de las señales secretoras comúnmente se posicionan en 5' hacia la secuencia de DNA que codifica el polipéptido de interés, aunque ciertas secuencias de señales secretoras pueden posicionarse en otros sitios de la secuencia del DNA de interés (véanse, p. ej., Welch et al, patente estadounidense 5.037.743; Holland et al., patente estadounidense No. 5.143.830).
Alternativamente, la secuencia de la señal secretora contenida en los polipéptidos de la presente invención se usa para dirigir otros polipéptidos hacia la vía secretora. La presente invención provee dichos polipéptidos de fusión. Se puede elaborar un polipéptido de fusión de señal, en el que una secuencia de señal secretora derivada de los residuos aminoácido 1-23 de la SEC ID NO:2 o de los residuos 1-23 de la SEC ID NO:11 está operativamente unida a una secuencia del DNA que codifica otro polipéptido, usando los métodos conocidos en la técnica y descritos en la presente memoria. La secuencia de la señal secretora contenida en los polipéptidos de fusión de la presente invención está preferiblemente condensada en forma aminoterminal a un péptido adicional para dirigir el péptido adicional hacia la vía secretora. Dichos constructos tienen numerosas aplicaciones conocidas en la técnica. Por ejemplo, estos nuevos constructos de fusión de secuencias de señales secretoras pueden dirigir la secreción de un componente activo de una proteína normalmente no segregada. Dichas fusiones se pueden utilizar in vivo o in vitro para dirigir péptidos a través de la vía secretora.
Las células mamíferas cultivadas son hospedantes adecuados dentro de la presente invención. Los métodos para introducir DNA exógeno a células hospedantes de mamífero incluyen transfección mediada por fosfato de calcio (Wigler et al., Cell 14-725, 1978; Corsaro y Pearson, Somatic Cell Genetics 7: 603, 1981: Graham y Van der Eb, Virology 52: 456, 1973), electroporación (Neumann et al, EMBO J. 1: 841-5, 1982), transfección mediada por dextrano-DEAE (Ausubel et al., ibid.) y transfección mediada por liposomas (Hawley-Nelson et al. Focus 15:73, 1993; Ciccarone et al, Focus 15: 80, 1993, y vectores víricos (Miller y Rosman, BioTechniques 7: 980-90, 1989; Wang y Finer, Nature Med. 2: 714-6, 1996). La producción de polipéptidos recombinantes en células mamíferas es descrita, por ejemplo, por Levinson et al., patente estadounidense No. 4.713.339; Hagen et al., patente estadounidense No. 4.784.950; Palmiter et al., patente estadounidense No. 4.579.821; y Ringold, patente estadounidense No. 4.656.134. Las células mamíferas cultivadas adecuadas incluyen las líneas celulares COS-1 (ATCC No. CRL 1650), COS-7 (ATCC No. CRL 1651), BHK (ATCC No. CRL 1632), BHK 570 (ATCC No. CRL 10314), 293 (ATCC No. CRL 1573; Graham et al., J. Gen. Virol. 36: 59-72, 1977) y las líneas celulares de ovario de hámster chino (p. ej., CHO-K1; ATCC No. CCL 61). Las líneas celulares adecuadas adicionales se conocen en la técnica y se obtienen de bancos públicos, como The American Type Culture Collection, Manassas, VA. En general, se prefieren los promotores de transcripción fuertes, como los promotores de SV-40 o citomegalovirus. Véase, p. ej., la patente estadounidense No. 4.956.288. Otros promotores adecuados incluyen aquellos de genes de metalotioneína (patentes estadounidenses No. 4.579.821 y 4.601.978) y el promotor principal tardío de adenovirus.
En general se utiliza la selección de fármacos para seleccionar células mamíferas cultivadas en las que se ha insertado DNA exógeno. Dichas células normalmente se denominan "transfectantes". Las células que han sido cultivadas en presencia del agente selectivo y son capaces de pasar el gen de interés a su descendencia se denominan "transfectantes estables". Un marcador seleccionable preferido es un gen que codifica resistencia al antibiótico neomicina. La selección se realiza en presencia de un fármaco de tipo neomicina, por ejemplo G-418 o similar. Los sistemas de selección también se pueden utilizar para aumentar el nivel de expresión del gen de interés, un procedimiento denominado "ampliación". La ampliación se lleva a cabo cultivando transfectantes en presencia de un nivel bajo de agente selectivo y luego aumentando la cantidad de agente selectivo para seleccionar células que produzcan altos niveles de los productos de los genes introducidos. Un marcador seleccionable ampliable preferido es la dihidrofolato reductasa, que confiere resistencia al metotrexato. También se pueden emplear otros genes de resistencia a fármacos (p. ej., resistencia a higromicina, resistencia a múltiples fármacos, puromicinacetil transferasa). Se pueden utilizar marcadores alternativos que introducen un fenotipo alterado, como proteína fluorescente verde, o proteínas de la superficie celular, como CD4, CD8, MHC de Clase I, para clasificar células transfectadas entre células no transfectadas, mediante clasificación FACS o tecnología de separación de esferas magnéticas.
También pueden utilizarse otras células eucarióticas superiores como hospedantes, incluyendo células vegetales, células de insectos y células aviares. El uso de Agrobacterium rhizogenes como vector para expresar genes en células vegetales ha sido revisado por Sinkar et al., J. Biosci. (Bangalore) 11: 47-58, 1987. La transformación de células de insectos y producción de polipéptidos exógenos allí se describe por Guarino et al., patente estadounidense No. 5.162.222 y publicación WIPO No. WO 94/06463. Las células de insectos se pueden infectar con baculovirus recombinante, comúnmente derivado de Autographa californica nuclear polyhedrosis virus (AcNPV). Véanse, King, L.A. y Possee, R.D., The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide, Londres, Chapman & Hall; O'Reilly, D.R. et al., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual. New York, Oxford University Press., 1994; y, Richardson, C. D., Ed., Baculovirus Expression Protocols. Methods in Molecular Biology, Totowa, NJ, Humana Press, 1995. El segundo método para elaborar baculovirus recombinante emplea un sistema basado en transposón descrito por Luckow (Luckow, V.A, et al., J Virol 67: 4566-79, 1993). Este sistema se vende en el kit Bac-to-Bac (Life Technologies, Rockville, MD). Este sistema utiliza un vector de transferencia, pFastBacl^{TM} (Life Technologies) que contiene un transposón Tn7 para mover el DNA que codifica el polipéptido zcytor17lig hacia un genoma de baculovirus mantenido en E. coli como un plásmido grande llamado "bácmido". El vector de transferencia pFastBac1^{TM} utiliza el promotor de polihedrina AcNPV para impulsar la expresión del gen de interés, en este caso zcytor17lig. No obstante, pFastBacl^{TM} puede modificarse hasta un grado considerable. El promotor de polihedrina puede eliminarse y sustituirse con el promotor de la proteína básica de baculovirus (se conoce también como Pcor, p6.9 o promotor MP), que se expresa antes en la infección por baculovirus, y se ha demostrado que es ventajoso para expresar proteínas segregadas. Véanse, Hill-Perkins, M.S. y Possee, R.D., J. Gen. Virol. 71: 971-6, 1990; Bonning, B.C. et al., J. Gen. Virol. 75: 1551-6, 1994; y, Chazenbalk, G.D., y Rapoport, B., J. Biol. Chem. 270: 1543-9, 1995. En dichos constructos de vectores de transferencia, se puede usar una versión corta o larga del promotor de la proteína básica. Además, pueden construirse vectores de transferencia que reemplacen las secuencias de la señal secretora de zcytor17lig natural con secuencias de señales secretoras derivadas de proteínas de insectos. Por ejemplo, se puede usar una secuencia de señal secretora de Ecdisteroide Glucosiltransferasa (EGT), miel de abeja Melittin (Invitrogen, Carlsbad, CA) o baculovirus gp67 (PharMingen, San Diego, GA) en constructos para reemplazar la secuencia de la señal secretora de zcytor17lig natural. Asimismo, los vectores de transferencia pueden incluir una fusión dentro del marco con DNA que codifica un marcador de epítopo en el término C o N del polipéptido zcytor17lig expresado, por ejemplo, un marcador de epítopo Glu-Glu (Grussenmeyer, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 7952-4, 1985). Usando las técnicas conocidas en el campo, un vector de transferencia que contiene zcytor17lig se transforma en E. Coli, y se seleccionan los bácmidos que contienen un gen lacZ interrumpido indicativo de baculovirus recombinante. El DNA bacmídico que contiene el genoma del baculovirus recombinante se aísla, usando técnicas comunes, y se usa para transfectar células de Spodoptera frugiperda, p. ej., células Sf9. El virus recombinante que expresa zcytor17lig se produce posteriormente. Los stocks víricos recombinantes se elaboran por métodos comúnmente utilizados en la técnica.
El virus recombinante se utiliza para infectar células hospedantes, típicamente una línea celular derivada de la oruga militar tardía, Spodoptera frugiperda. Véase, en general, Glick y Pasternak, Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA. ASM Press, Washington, D.C., 1994. Otra línea celular adecuada es la línea celular High FiveO^{TM} (Invitrogen) derivada de Trichoplusia ni (patente estadounidense No. 5.300.435).
Las células fúngicas, incluyendo las células de levadura, también se pueden utilizar dentro de la presente invención. Las especies de levadura de particular interés en este sentido incluyen Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris y Pichia methanolica. Los métodos para transformar células de S. cerevisiae con DNA exógeno y producir polipéptidos recombinantes a partir de allí son descritos, por ejemplo, por Kawasaki, patente estadounidense No. 4.599.311; Kawasaki et al., patente estadounidense No. 4.931.373; Brake, patente estadounidense No. 4.870.008; Welch et al, patente estadounidense No. 5.037.743; y Murray et al., patente estadounidense No. 4.845.075. Las células transformadas son seleccionadas por el fenotipo determinado por el marcador seleccionable, comúnmente resistencia al fármaco o capacidad de desarrollarse en ausencia de un nutriente particular (p. ej., leucina). Un sistema vector preferido para uso en Saccharomyces cerevisiae es el sistema vector POTI descrito por Kawasaki et al. (patente estadounidense No. 4.931.373), que posibilita que las células transformadas se seleccionen por desarrollo en medio que contiene glucosa. Los promotores y terminadores adecuados para uso en levadura incluyen aquellos de genes de enzimas glucolíticas (véanse, p. ej., Kawasaki, patente estadounidense No. 4.599.311; Kingsman et al., patente estadounidense No. 4.615.974; y Bitter, patente estadounidense No. 4.977.092), y genes de alcohol deshidrogenasa. Véanse también las patentes estadounidenses No. 4.990.446; 5.063.154; 5.139.936 y 4.661.454. Los sistemas de transformación para otras levaduras, incluyendo Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Ustilago maydis, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia guillermondii y Candida maltosa, se conocen en la técnica, véanse, por ejemplo, Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132: 3459-65, 1986 y Cregg, patente estadounidense No. 4.882.279. Se pueden utilizar células de Aspergillus de acuerdo con los métodos de McKnight et al., patente estadounidense No. 4.935.349. Los métodos para transformar Acremonium chrysogenum son descritos por Sumino et al., patente estadounidense No. 5.162.228. Los métodos para transformar Neurospora son descritos por Lambowitz, patente estadounidense No. 4.486.533.
El uso de Pichia methanolica como hospedante para la producción de proteínas recombinantes se describe en las publicaciones WEPO No. WO 97/17450, WO 97/17451, WO 98/02536 y WO 98/02565. Las moléculas de DNA para uso en la transformación de P. methanolica normalmente se preparan como plásmidos circulares bicatenarios, que preferiblemente se linealizan antes de la transformación. Para la producción de polipéptidos en P. methanolica, se prefiere que el promotor y el terminador en el plásmido sean aquellos de un gen de P. methanolica, como un gen de utilización de alcohol de P. methanolica (AUG1 o AUG2). Otros promotores útiles incluyen aquellos de los genes de dihidroxiacetona sintasa (DHAS), formiato deshidrogenasa (FMD) y catalasa (CAT). Para facilitar la integración del DNA al cromosoma hospedante, se prefiere tener todo el segmento de expresión del plásmido flanqueado en ambos extremos por las secuencias de DNA hospedantes. Un marcador seleccionable preferido para uso en Pichia methanolica es un gen de P. methanolica ADE2, que codifica fosforribosil-5-aminoimidazol carboxilasa (AIRC; EC 4.1.1.21), el cual permite que las células hospedantes ade2 se desarrollen en ausencia de adenina. Para procedimientos industriales a gran escala, en los que se desee minimizar el uso de metanol, se prefiere usar las células hospedantes en las que ambos genes de utilización de metanol (AUG1 y AUG2) estén eliminados. Para la producción de proteínas segregadas, se prefieren las células hospedantes deficientes de genes de proteasas vacuolares (PEP4 y PRB1). La electroporación se usa para facilitar la introducción de un plásmido que contiene DNA que codifica un polipéptido de interés a células de P. methanolica. Se prefiere transformar las células de P. methanolica por electroporación, usando un campo eléctrico pulsado exponencialmente decreciente, que tenga una intensidad de campo en el intervalo de 2,5 y 4,5 kV/cm, preferiblemente aproximadamente 3,75 kV/cm, y una constante de tiempo (\Omega) de 1 a 40 milisegundos, lo más preferiblemente aproximadamente 20 milisegundos.
Las células hospedantes procarióticas, incluyendo las cepas de las bacterias Escherichia coli, Bacillus y otros géneros, son también células hospedantes útiles dentro de la presente invención. Las técnicas para transformar estos hospedantes y expresar secuencias de DNA exógeno clonadas allí se conocen en la técnica (véase, p. ej., Sambrook et al., ibid.). Cuando se expresa un polipéptido zcytor17lig en bacterias tales como E. coli, el polipéptido puede estar retenido en el citoplasma, típicamente como gránulos insolubles, y puede ser dirigido al espacio periplásmico por una secuencia de secreción bacteriana. En el primer caso, las células se lisan, y los gránulos se recuperan y desnaturalizan usando, por ejemplo, isocianato de guanidina o urea. El polipéptido desnaturalizado se puede volver a plegar y dimerizar diluyendo el desnaturalizante, como por diálisis contra una solución de urea y una combinación de glutatión reducido y oxidado, seguida de diálisis contra una solución salina tamponada. En el segundo caso, el polipéptido se puede recuperar del espacio periplásmico en una forma soluble y funcional, perturbando las células (por ejemplo, por sonicación o choque osmótico) para liberar los contenidos del espacio periplásmico y recuperar la proteína, obviando así la necesidad de desnaturalización y repliegue.
Las células hospedantes transformadas o transfectadas se cultivan de acuerdo con procedimientos convencionales en un medio de cultivo que contiene nutrientes y otros componentes requeridos para el desarrollo de las células hospedantes elegidas. Se conoce en la técnica una diversidad de medios adecuados, que incluyen medios definidos y medios complejos y, en general, incluyen una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, aminoácidos esenciales, vitaminas y minerales. Los medios pueden también contener componentes tales como factores de crecimiento o suero, según sea necesario. El medio de desarrollo en general seleccionará células que contienen el DNA exógenamente añadido, por ejemplo, por selección de fármacos o deficiencia de un nutriente esencial que es complementado por el marcador seleccionable que porta el vector de expresión o contransfectado a la célula hospedante. Las células de P. methanolica se cultivan en un medio que comprende fuentes de carbono, nitrógeno y oligonutrientes adecuados, a una temperatura de aproximadamente 25ºC a 35ºC. Los cultivos líquidos se proveen de aireación suficiente por medios convencionales, como agitación de pequeños matraces o salpicadura de fermentadores. Un medio de cultivo preferido para P. methanolica es YEPD (D-glucosa al 2%, Peptona Bacto^{TM} al 2% (Difco Laboratories, Detroit, MI), extracto de levadura Bacto^{TM} al 1% (Difco Laboratories), adenina al 0,004% y L-leucina al 0,006%).
Se prefiere purificar los polipéptidos de la presente invención hasta > 80% pureza, más preferiblemente hasta >90% pureza, incluso más preferiblemente >95% pureza y, se prefiere particularmente un estado farmacéuticamente puro, superior a 99,9% puro con respecto a macromoléculas contaminantes, particularmente otras proteínas y ácidos nucleicos, y libre de agentes infecciosos y pirogénicos. Preferiblemente, un polipéptido purificado está sustancialmente libre de otros polipéptidos, particularmente otros polipéptidos de origen animal.
Los polipéptidos zcytor17lig recombinantes expresados (o los polipéptidos zcytor17lig quiméricos) pueden purificarse usando métodos y medios de fraccionamiento y/o purificación convencionales. Se puede usar precipitación con sulfato de amonio y extracción de ácido o caotropo para fraccionar las muestras. Las etapas de purificación ilustrativas pueden incluir hidroxiapatita, exclusión de tamaño, FPLC y cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa. Los medios cromatográficos adecuados incluyen dextranos derivatizados, agarosa, celulosa, poliacrilamida, sílices especiales y similares. Se prefieren los derivados de PEI, DEAE, QAE y Q. Los medios cromatográficos ilustrativos incluyen aquellos medios derivatizados con grupos fenilo, butilo u octilo, como Phenyl-Sepharose FF (Pharmacia), butilo Toyopearl 650 (Toso Haas, Montgomeryville, PA), Octyl-Sepharose (Pharmacia) y similares; o resinas poliacrílicas, como Amberchrom CG 71 (Toso Haas) y similares. Los soportes sólidos adecuados incluyen esferas de vidrio, resinas a base de sílice, resinas celulósicas, esferas de agarosa, esferas de agarosa reticuladas, esferas de poliestireno, resinas de poliacrilamida reticuladas y similares, que son insolubles bajo las condiciones en las que se utilizarán. Estos soportes pueden modificarse con grupos reactivos que permiten la unión de proteínas por grupos amino, grupos carboxilo, grupos sulfhidrilo, grupos hidroxilo y/o restos carbohidrato. Los ejemplos de químicas de acoplamiento incluyen activación de bromuro de cianógeno, activación de N-hidroxisuccinimida, activación de epóxido, activación de sulfhidrilo, activación de hidrazida y derivados de carboxilo y amino para químicas de acoplamiento de carbodiimida. Éstos y otros medios sólidos se conocen y utilizan ampliamente en la técnica, y están disponibles de proveedores comerciales. Los métodos para unir polipéptidos receptores a los medios de soporte se conocen en la técnica. La selección de un método particular es una cuestión de diseño de rutina y se determina, en parte, por las propiedades del soporte escogido. Véase,
por ejemplo, Affinity Chromatography: Principles & Methods, Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Suecia, 1988.
Los polipéptidos de la presente invención se pueden aislar por explotación de sus propiedades físicas o bioquímicas. Por ejemplo, se puede usar cromatografía de adsorción de iones metálicos inmovilizados (MAC) para purificar proteínas ricas en histidina, incluyendo aquellas que comprenden marcadores de polihistidina. En síntesis, se carga primero un gel con iones metálicos divalentes para formar un quelato (Sulkowski, Trends in Biochem. 3: 1-7, 1985) Las proteínas ricas en histidina se adsorberán en esta matriz con afinidades diferentes, dependiendo del ión metálico utilizado, y se eluirán por elución competitiva, disminuyendo el pH, o el uso de fuertes agentes quelantes. Otros métodos de purificación incluyen purificación de proteínas glucosiladas por cromatografía de afinidad de lectina y cromatografía de intercambio iónico (Methods in Enzymol., Vol. 182, "Guide to Protein Purification", M. Deutscher, (ed.), Acad. Press, San Diego, 1990, pp. 529-39) y uso del receptor de zcytor17 soluble. Dentro de las realizaciones adicionales de la invención, se puede construir una fusión del polipéptido de interés y un marcador de afinidad (p. ej., proteína de unión a maltosa, un dominio de inmunoglobulina) para facilitar la purificación.
Además, usando los métodos descritos en la técnica, se construyen las fusiones de polipéptidos o las proteínas de zcytor17lig híbrido, usando regiones o dominios del zcytor17lig inventivo en combinación con aquellos de otras proteínas de la familia de citocinas humana (p. ej., interleucinas o GM-CSF), o proteínas heterólogas (Sambrook et al, ibid., Altschul et al., ibid., Picard, Cur. Opin. Biology, 5: 511-5, 1994, y referencias allí citadas). Estos métodos permiten la determinación de la importancia biológica de dominios o regiones más grandes en un polipéptido de interés. Dichos híbridos pueden alterar la cinética de reacción, unir, estrechar o expandir la especificidad de sustrato, o alterar la localización de células y tejido de un polipéptido, y pueden aplicarse a polipéptidos de estructura desconocida.
Las proteínas de fusión se pueden preparar por métodos conocidos por el experto en la técnica, preparando cada componente de la proteína de fusión, y conjugándolos químicamente. Alternativamente, se puede generar un polinucleótido que codifica ambos componentes de la proteína de fusión en el marco de lectura correcto, usando técnicas conocidas, y se puede expresar a través de los métodos de la presente memoria. Por ejemplo, puede intercambiarse todo o parte de una hélice que confiere una función biológica entre zcytor17lig de la presente invención con hélices funcionalmente equivalentes de otro miembro de la familia, como IL-15, IL-2, IL-4 o GM-CSF. Dichos componentes incluyen, aunque sin limitarse a ellos, la secuencia de la señal secretora; las hélices A, B, C, D; los bucles A/B, B/C, C/D; de las citocinas de cuatro hélices. Sería esperable que dichas proteínas de fusión tengan un perfil de la función biológica igual o similar a los polipéptidos de la presente invención u otras proteínas de la familia de citocinas de cuatro hélices conocida, dependiendo de la fusión construida. Asimismo, dichas proteínas de fusión pueden exhibir otras propiedades, como se describe en la presente memoria.
Se pueden emplear técnicas convencionales de biología molecular y clonación para intercambiar los dominios equivalentes entre el polipéptido zcytor17lig y aquellos polipéptidos a los cuales se condensan. En general, un segmento de DNA que codifica un dominio de interés, p. ej., las hélices A a D de zcytor17lig, u otro dominio descrito en esta memoria, está operativamente unido dentro del marco a por lo menos otro segmento de DNA que codifica un polipéptido adicional (por ejemplo, un dominio o región de otra citocina, como IL-2 o similar), e insertado en un vector de expresión adecuado, como se describe aquí. En general, los constructos de DNA se elaboran de modo tal que diversos segmentos de DNA que codifican las correspondientes regiones de un polipéptido están operativamente unidos dentro del marco para elaborar un solo constructo que codifique toda la proteína de fusión, o su parte funcional. Por ejemplo, un constructo de DNA codificaría, desde el término N al término C, una proteína de fusión que comprende un polipéptido de señal seguido de una proteína de fusión de citocinas de cuatro hélices madura que contiene la hélice A, seguida de la hélice B, seguida de la hélice C, seguida de la hélice D. Se puede expresar, aislar y ensayar la actividad de dichas proteínas de fusión, como se describe en la presente memoria.
Los polipéptidos Zcytor17lig o sus fragmentos también se pueden preparar por síntesis química. Los polipéptidos zcytor17lig pueden ser monómeros o multímeros; glucosilados o no glucosilados; pegilados o no pegilados; y pueden o no incluir un residuo aminoácido de metionina inicial. Por ejemplo, los polipéptidos se pueden preparar por síntesis peptídica de fase sólida, por ejemplo, como lo describe Merrifield, J. Am. Chem. Soc 85:2149, 1963.
La actividad de las moléculas de la presente invención se puede medir utilizando una diversidad de ensayos que miden la proliferación y/o la unión a las células que expresan el receptor de zcytor17. Son de particular interés los cambios en las células dependientes de zcytor17lig. Las líneas celulares adecuadas para ser genomanipuladas para depender de zcytor17lig incluyen la línea celular BaF3 dependiente de IL-3 (Palacios y Steinmetz, Cell 41: 727-734, 1985; Mathey-Prevot et al., Mol. Cell. Biol. 6: 4133-4135, 1986), FDC-P1 (Hapel et al., Blood 64: 786-790, 1984) y MO7e (Kiss et al., Leukemia 7: 235-240, 1993). Las líneas celulares dependientes del factor de crecimiento se pueden establecer de acuerdo con métodos publicados (p. ej., Greenberger et al., Leukemia Res. 8: 363-375, 1984; Dexter et al., en
Baum et al. Eds., Experimental Hematology Today, 8th Ann. Mtg. Int. Soc. Exp. Hematol. 1979, 145-156, 1980).
Las proteínas de la presente invención son útiles para estimular la proliferación, activación, diferenciación y/o inducción de la función celular especializada de células de la homeostasis implicada en la hematopoyesis y la función inmunitaria. En particular, los polipéptidos zcytor17lig son útiles para estimular la proliferación, activación, diferenciación, inducción o inhibición de funciones celulares especializadas de los linajes hematopoyéticos, incluyendo, aunque sin limitarse a ello, células T, células B, monocitos/macrófagos, linfocitos citolíticos naturales, neutrófilos, células endoteliales, fibroblastos, eosinófilos, condrocitos, mastocitos, células de Langerhan, monocitos y macrófagos, como también células epiteliales. Las células epiteliales incluyen, por ejemplo, ameloblastos, células principales, cromatóforos, células enterocromafines, células de tipo enterocromafines, células caliciformes, células granulosas, queratinocitos, células dendríticas, células laberínticas de soporte, melanocitos, células de Merkel, células de Paneth, células parietales, células de Sertoli y similares. La proliferación y/o diferenciación de células hematopoyéticas se puede medir in vitro, usando células cultivadas, o in vivo, y administrando las moléculas de la presente invención al modelo animal adecuado. Los ensayos que miden la proliferación o diferenciación celular se conocen en la técnica. Por ejemplo, los ensayos que miden la proliferación incluyen ensayos tales como quimiosensibilidad al tinte rojo neutro (Cavanaugh et al., Investigational New Drugs 8: 347-354, 1990, incorporada a la presente memoria por referencia), incorporación de nucleótidos radiomarcados (Cook et al., Analytical Biochem, 179: 1-7, 1989, incorporada a la presente memoria por referencia), incorporación de 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU) en el DNA de células proliferantes (Porstmann et al., J. Immunol. Methods 82: 169-179, 1985, incorporada a la presente memoria por referencia), y uso de sales de tetrazolio (Mosmann, J. Immunol. Methods 65: 55-63, 1983; Alley et al., Cancer Res. 48: 589-601, 1988; Marshall et al., Growth Reg. 5: 69-84, 1995; y Scudiero et al., Cancer Res. 48: 4827-4833, 1988; todas incorporadas a la presente memoria por referencia). Los ensayos que miden la proliferación incluyen, por ejemplo, medir los marcadores de la superficie celular asociados a la expresión específica de una etapa de un tejido, actividad enzimática, actividad funcional o cambios morfológicos (Watt, FASEB, 5: 281-284, 1991; Francis, Differentiation 57: 63-75, 1994; Raes, Adv. Anim. Cell Biol. Technol. Bioprocesses, 161-171, 1989; todas incorporadas a la presente memoria por referencia).
Las moléculas de la presente invención se pueden ensayar in vivo, usando sistemas de administración vírica. Los virus ilustrativos para este propósito incluyen adenovirus, herpesvirus, retrovirus, vaccinia virus y virus adeno-asociados (AAV). El adenovirus, un virus de DNA bicatenario, es actualmente el vector de transferencia de genes mejor estudiado para administración de ácido nucleico heterólogo (para una revisión, véanse T.C. Becker et al., Meth. Cell Biol. 43: 161-89, 1994; y J.T. Douglas y D.T. Curiel, Science & Medicine 4: 44-53, 1997).
Como ligando, la actividad del polipéptido zcytor17lig se puede medir con un microfisiómetro biosensor a base de silicio, que mide el índice de acidificación extracelular o la excreción de protones asociada a la unión del receptor y las subsiguientes respuestas celulares fisiológicas. Un dispositivo ilustrativo es el microfisiómetro Cytosensor^{TM} fabricado por Molecular Devices, Sunnyvale, CA. Se puede medir, con este método, una diversidad de respuestas celulares, por ejemplo proliferación celular, transporte de iones, producción de energía, respuesta inflamatoria, activación reguladora y de receptores, y demás. Véanse, por ejemplo, McConnell, H.M. et al., Science 257: 1906-1912, 1992; Pitchford, S. et al., Meth. Enzymol. 228: 84-108, 1997; Arimilli, S. et al., J. Immunol. Meth. 212: 49-59, 1998; Van Liefde, I. et al., Eur. J. Pharmacol 346: 87-95, 1998.
Además, el zcytor17lig se puede utilizar para identificar células, tejidos o líneas celulares que responden a una vía estimulada por zcytor17lig. El microfisiómetro anteriormente descrito se puede utilizar para identificar rápidamente células sensibles a ligandos, como células sensibles al zcytor17lig de la presente invención. Las células se pueden cultivar en presencia o ausencia del polipéptido zcytor17lig. Aquellas células que provocan un cambio mesurable en la acidificación extracelular en presencia de zcytor17lig son sensibles a zcytor17lig. Dichas células o líneas celulares se pueden usar para identificar antagonistas y agonistas del polipéptido zcytor17lig, como se describió anteriormente.
En vista de la distribución de tejido observada para el receptor de zcytor17, los agonistas (incluyendo el zcytor17lig natural/sustrato/cofactor/etc.) y/o antagonistas tienen un potencial enorme en ambas aplicaciones, in vitro e in vivo. Los compuestos identificados como agonistas de zcytor17lig son útiles para expansión, proliferación, activación, diferenciación y/o inducción o inhibición de funciones celulares especializadas de las células implicadas en la homeostasis de hematopoyesis y la función inmunitaria. Por ejemplo, el zcytor17lig y los compuestos agonistas son útiles como componentes de medios de cultivos celulares definidos y se pueden utilizar solos o combinados con otras citocinas y hormonas para reemplazar el suero comúnmente utilizado en el cultivo de células. Los agonistas son, por ende, útiles en promover específicamente el crecimiento y/o desarrollo de células T, células B, monocitos/macrófagos, linfocitos citolíticos naturales, linfocitos citotóxicos y otras células de los linajes linfoides y mieloides en cultivo.
Los antagonistas son también útiles como reactivos de investigación para caracterizar sitios de interacción ligando-receptor. Los antagonistas son útiles para inhibir la expansión, proliferación, activación y/o diferenciación de células implicadas en la regulación de la hematopoyesis. Los inhibidores de la actividad de zcytor17lig (antagonistas de zcytor17lig) incluyen anticuerpos anti-zcytor17lig y receptores de zcytor17lig solubles, como también otros agentes peptídicos y no peptídicos (incluyendo ribozimas).
También se puede utilizar Zcytorl71ig para identificar inhibidores (antagonistas) de su actividad. Los compuestos de prueba se añaden a los ensayos descritos en la presente memoria para identificar compuestos que inhiben la actividad de zcytor17lig. Además de los ensayos descritos en este documento, se puede ensayar la inhibición de la actividad del zcytor17lig de las muestras dentro de una diversidad de ensayos diseñados para medir la unión al receptor, la estimulación/inhibición de respuestas celulares dependientes de zcytor17lig o la proliferación de células que expresan el receptor de zcytor17.
Se puede expresar un polipéptido zcytor17lig como una fusión con una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina, típicamente un fragmento F_{c}, que contiene dos dominios de regiones constantes y carece de región variable. Los métodos para preparar dichas fusiones se describen en las patentes estadounidenses No 5.155.027 y 5.567.584. Dichas fusiones se segregan típicamente como moléculas multiméricas en las que las porciones Fc son enlazadas unas con otras por disulfuro y dos polipéptidos no Ig se disponen próximos unos de otros. Las fusiones de este tipo se pueden usar, por ejemplo, para dimerización, aumento de estabilidad y semivida in vivo, para purificar el ligando por afinidad, como herramienta de ensayo in vitro o antagonista. Para uso en ensayos, las quimeras se unen a un soporte vía la región F_{c} y se usan en un formato ELISA.
Se puede usar también un polipéptido de unión a zcytor17lig para purificar el ligando. El polipéptido se inmoviliza en un soporte sólido, como esferas de agarosa, agarosa reticulada, vidrio, resinas celulósicas, resinas a base de sílice, poliestireno, poliacrilamida reticulada o materiales similares que son estables bajo las condiciones de uso. Los métodos para unir polipéptidos a un soporte sólido se conocen en la técnica e incluyen química de amina, activación de bromuro de cianógeno, activación de hidroxisuccinimida, activación de epóxido, activación de sulfhidrilo y activación de hidrazida. El medio resultante en general se configurará en la forma de una columna, y los fluidos que contienen el ligando se pasan a través de la columna una o más veces para permitir que el ligando se una al polipéptido receptor. El ligando se eluye entonces usando cambios en la concentración salina, agentes caotrópicos (guanidina HC1), o pH para alterar la unión ligando-receptor. Ventajosamente, se puede emplear un sistema de ensayo que use un receptor de unión al ligando (o un anticuerpo, un miembro de un par de complemento/anti-complemento) o su fragmento de unión, y un instrumento biosensor obtenible en el mercado (BIAcore, Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ). Dicho receptor, anticuerpo, miembro de un par de complemento/anti-complemento o fragmento se inmoviliza hacia la superficie de un chip receptor. El uso de este instrumento es descrito por Karlsson, J. Immunol. Methods 145: 229-40, 1991, y Cunningham y Wells, J. Mol. Biol. 234: 554-63, 1993. Se fija covalentemente un receptor, anticuerpo, miembro o fragmento, usando química de amina o sulfhidrilo, a fibras de dextrano que se fijan a una película de oro dentro del flujo celular. Se pasa una muestra de prueba por la célula. Si un ligando, epítopo o miembro opuesto del par de complemento/anti-complemento está presente en la muestra, se unirá al receptor, anticuerpo o miembro inmovilizado, respectivamente, causando un cambio en el índice de refracción del medio, que se detecta como un cambio en la resonancia de plasmón superficial de la película de oro. Este sistema posibilita la determinación de índices a intervalos, desde los cuales se puede calcular la afinidad de unión y evaluar la estequiometría de unión. Alternativamente, la unión ligando/receptor se puede analizar usando tecnología (TM) (Ciphergen, Inc., Palo Alto, CA).
Los polipéptidos receptores de la unión al ligando se pueden usar también dentro de otros sistemas de ensayo conocidos en la técnica. Dichos sistemas incluyen el análisis Scatchard para determinación de afinidad de unión (véase, Ann. NY Acad. Sci. 51: 660-72, 1949) y ensayos calorimétricos (Cunningham et al., Science 253: 545-48, 1991; Cunningham et al., Science 245: 821-25, 1991).
Los polipéptidos Zcytor17lig también se pueden emplear para preparar anticuerpos que se unen a los epítopos, péptidos o polipéptidos zcytor17lig. El polipéptido zcytor17lig, o su fragmento, sirve como antígeno (inmunógeno) para inocular un animal y provocar una respuesta inmunitaria. Dichos anticuerpos se pueden usar para bloquear la acción biológica de zcytor17lig proinflamatorio y son útiles como terapéuticos antinflamatorios en una diversidad de enfermedades descritas en la presente memoria. Las personas con experiencia en la técnica reconocerían que los polipéptidos antigénicos que portan epítopos contienen una secuencia de por lo menos 6, preferiblemente por lo menos 9 y más preferiblemente por lo menos 15 a aproximadamente 30 residuos aminoácido contiguos de un polipéptido zcytor17lig (p. ej., la SEC ID NO:2). Se incluyen los polipéptidos que comprenden una porción más grande de un polipéptido zcytor17lig, es decir, entre 30 y 100 residuos hasta la longitud total de la secuencia de aminoácidos. Los antígenos o epítopos inmunogénicos pueden también incluir marcadores adheridos, adyuvantes, vehículos y portadores, como se describe en esta memoria. Los antígenos adecuados incluyen el polipéptido zcytor17lig codificado por la SEC NO:2 del número de aminoácido 24 al número de aminoácido 164, o su fragmento de aminoácido contiguo 9 a 141. Otros antígenos adecuados incluyen el zcytor17lig maduro y de longitud total, las hélices A-D y las hélices A, B, C y D individuales o múltiples, de estructura de cuatro hélices de zcytor17lig, como se describe aquí. Los péptidos preferidos para uso como antígenos son péptidos hidrófilos tales como aquellos pronosticados por el experto en la técnica a partir de un trazado de hidrofobicidad, como se describe en la presente memoria, por ejemplo, los residuos aminoácido 114-119, 101-105, 126-131, 113-118 y 158-162 de la SEC ID NO:2; y los residuos aminoácido 34-39, 46-51, 131-136, 158-163 y 157-162 de la SEC ID NO:11. Además, los epítopos antigénicos zcytor17lig según lo pronosticado por un trazado Jameson-Wolf, p. ej., usando el programa DNASTAR Protean (DNASTAR, Inc., Madison, WI), sirven como antígenos preferidos, y se determinan fácilmente por el experto en
la técnica.
Los anticuerpos de una respuesta inmunitaria generada por inoculación de un animal con estos antígenos se pueden aislar y purificar como se describe en el presente documento. Los métodos para preparar y aislar anticuerpos policlonales y monoclonales se conocen en la técnica. Véanse, por ejemplo, Current Protocols in Immunology, Cooligan, et al. (eds.), National Institutes of Health, John Wiley and Sons, Inc., 1995; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbor, NY, 1989; y Hurrell, J. G. R., Ed., Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, 1982.
Como sería obvio para el experto en la técnica, los anticuerpos policlonales pueden generarse inoculando una diversidad de animales de sangre caliente, tales como caballos, vacas, cabras, ovejas, perros, pollos, conejos, ratones y ratas, con un polipéptido zcytor17lig o su fragmento. La inmunogenicidad de un polipéptido zcytor17lig se puede aumentar a través del uso de un adyuvante, como alum (hidróxido de aluminio) o adyuvante completo o incompleto de Freund. Los polipéptidos útiles para la inmunización también incluyen polipéptidos de fusión, como fusiones de zcytor17lig o de su proteína con un polipéptido de inmunoglobulina con proteína de unión a maltosa. El inmunógeno del polipéptido puede ser una molécula de longitud total o una porción de ésta. Si la porción del polipéptido es "de tipo hapteno", dicha porción puede estar ventajosamente unida o conectada a un vehículo macromolecular (como hemocianina de lapa californiana (KLH), albúmina de suero bovino (BSA) o toxoide tetánico) para inmunización.
Como se emplea en esta memoria, el término "anticuerpos" incluye anticuerpos policlonales, anticuerpos policlonales purificados por afinidad, anticuerpos monoclonales y fragmentos de unión a antígenos, como fragmentos F(ab')_{2} y fragmentos Fab proteolíticos. También se incluyen los anticuerpos o fragmentos intactos genomanipulados, como anticuerpos quiméricos, fragmentos Fv, anticuerpos monocatenarios y similares, como también péptidos y polipéptidos sintéticos de unión a antígenos. Los anticuerpos no humanos se pueden humanizar injertando CDR no humanos en regiones constantes y marco humanas, o incorporando los dominios variables no humanos enteros (opcionalmente "cubriéndolos" con una superficie de tipo humana con reemplazo de residuos expuestos, en donde el resultado es un anticuerpo "revestido"). En algunos casos, los anticuerpos humanizados pueden retener residuos no humanos dentro de los dominios marco de región variable humanos para potenciar las características de unión apropiadas. Humanizando los anticuerpos, se puede aumentar la semivida biológica, y se reduce el potencial de reacciones inmunitarias adversas tras la administración a seres humanos. Además, los anticuerpos humanos se pueden producir en animales transgénicos no humanos que han sido manipulados para contener genes de inmunoglobulina humana, como se describe en la publicación WIPO No. WO 98/24893. Se prefiere que los genes de inmunoglobulina endógenos en estos animales sean inactivados o eliminados, como por recombinación homóloga.
\newpage
Se considera que los anticuerpos son específicamente de unión si: 1) exhiben un nivel umbral de actividad de unión, y 2) no reaccionan significativamente en forma cruzada con moléculas de polipéptidos relacionadas. Se determina un nivel umbral de unión si los anticuerpos anti-zcytor17lig de esta memoria se unen a un polipéptido, péptido o epítopo zcytor17lig con una afinidad por lo menos 10 veces mayor que la afinidad de unión para el polipéptido control (no zcytor17lig). Se prefiere que los anticuerpos exhiban una afinidad de unión (Ka) de 10^{6} M^{-1} o más, preferiblemente 10^{7} M^{-1} o más, más preferiblemente 10^{8} M^{-1} o más y lo más preferiblemente 10^{9} M^{-1} o más. La afinidad de unión de un anticuerpo se puede determinar fácilmente por el experto en la técnica, por ejemplo, por análisis Scatchard (Scatchard, G., Ann. NY Acad. Sci. 51: 660-672, 1949).
Si los anticuerpos anti-zcytor17lig no reaccionan significativamente en forma cruzada con moléculas de polipéptidos relacionadas, se muestra, por ejemplo, por el anticuerpo que detecta el polipéptido zcytor17lig pero no polipéptidos relacionados conocidos, usando un análisis de transferencia Western convencional) (Ausubel et al., ibid.). Los ejemplos de polipéptidos relacionados conocidos se han descrito en la técnica anterior, por ejemplo ortólogos conocidos, y parálogos, y miembros conocidos similares de una familia de proteínas. La selección también se puede realizar usando zcytor17lig no humano y polipéptidos mutantes de zcytor17lig. Además, los anticuerpos se pueden "cribar contra" polipéptidos relacionados conocidos, para aislar una población que se una específicamente a los polipéptidos zcytor17lig. Por ejemplo, los anticuerpos generados contra zcytor17lig se adsorben en polipéptidos relacionados adheridos a una matriz insoluble; los anticuerpos específicos de zcytor17lig fluirán a través de la matriz bajo condiciones de tamponación adecuadas. El cribado permite el aislamiento de anticuerpos policlonales y monoclonales que no reaccionan en forma cruzada a polipéptidos relacionados conocidos (Antibodies: A Laboratory Manual. Harlow y Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988; Current Protocols in Immunology, Cooligan, et al. (eds.). National Institutes of Health, John Wiley and Sons, Inc., 1995). El cribado y aislamiento de anticuerpos específicos se conocen en la técnica. Véase, Fundamental Immunology, Paul (eds.), Raven Press, 1993; Getzoff et al., Adv. in Immunol. 43; 1-98, 1988; Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Goding, J.W. (eds.), Academic Press Ltd., 1996; Benjamin et al., Ann. Rev. Immunol. 2: 67-101, 1984. Los anticuerpos anti-zcytor17lig de unión específica se pueden detectar por una diversidad de métodos de la técnica, y se describen a continuación.
El experto en la técnica conoce una diversidad de métodos que se pueden utilizar para detectar anticuerpos que se unen a las proteínas o polipéptidos zcytor17lig. Los ensayos ilustrativos se describen en detalle en Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow y Lane (Eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988. Los ejemplos representativos de dichos ensayos incluyen: inmunoelectroforesis concurrente, radioinmunoensayo, radioinmunoprecipitación, enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA), transferencia Western, ensayo de inhibición o competición y ensayo sándwich. Además, los anticuerpos se pueden cribar para unión a una proteína o polipéptido zcytor17lig de tipo salvaje frente a uno mutante.
Los anticuerpos para zcytor17lig se pueden usar para marcar células que expresan zcytorl71ig; para aislar zcytor17lig por purificación por afinidad; para ensayos diagnósticos a fin de determinar niveles circulantes de polipéptidos zcytor17lig; para detectar o cuantificar zcytor17lig soluble como marcador de una patología o enfermedad subyacente; en métodos analíticos que emplean FACS; para cribar colecciones de expresión; para generar anticuerpos anti-idiotípicos; y como anticuerpos neutralizadores o como antagonistas para bloquear la actividad de zcytor17lig in vitro e in vivo. Las etiquetas o marcadores directos adecuados incluyen radionúcleos, enzimas, sustratos, cofactores, inhibidores, marcadores fluorescentes, marcadores quimiluminiscentes, partículas magnéticas y similares; las etiquetas o marcadores indirectos pueden usar biotina-avidina u otros pares de complemento/anticomplemento como intermediarios. Los anticuerpos de la presente memoria pueden también estar directa o indirectamente conjugados a fármacos, toxinas, radionúcleos y similares, y estos conjugados pueden utilizarse para aplicaciones diagnósticas o terapéuticas in vivo. A su vez, los anticuerpos para zcytor17lig o sus fragmentos pueden usarse in vitro para detectar zcytor17lig desnaturalizado o sus fragmentos en ensayos, por ejemplo transferencias Western u otros ensayos conocidos en la técnica.
Las moléculas detectables adecuadas pueden estar directa o indirectamente fijadas al polipéptido o anticuerpo, e incluyen radionúcleos, enzimas, sustratos, cofactores, inhibidores, marcadores fluorescentes, marcadores quimiluminiscentes, partículas magnéticas y similares. Las moléculas citotóxicas adecuadas pueden estar directa o indirectamente fijadas al polipéptido o anticuerpo, e incluyen toxinas bacterianas o vegetales (por ejemplo, difteria, toxina, saporina, exotoxina de Pseudomonas, ricina, abrina y demás); como también radionúcleos terapéuticos, por ejemplo yodo-131, renio-188 o itrio-90 (o bien directamente fijados al polipéptido o anticuerpo, o indirectamente fijados a través de un resto quelante, por ejemplo). Los polipéptidos o anticuerpos pueden también conjugarse a fármacos citotóxicos, como adriamicina. Para fijación indirecta de una molécula citotóxica detectable, la molécula detectable o citotóxica puede conjugarse con un miembro de un par complementario/anticomplementario, en el que el otro miembro está unido a la porción del polipéptido o anticuerpo. Para estos propósitos, biotina/estreptavidina es un par complementario/anticomplementario ilustrativo.
Los polipéptidos de unión también pueden actuar como "antagonistas" de zcytor17lig para bloquear la unión y transducción de señales de zcytor17lig in vitro e in vivo. Estos polipéptidos de unión anti-zcytor17lig serían útiles para inhibir la actividad de zcytor17lig o la unión de la proteína.
Las proteínas de fusión polipéptido-toxina o las proteínas de fusión anticuerpo-toxina se pueden usar para inhibición o ablación de célula o tejido diana (por ejemplo, para tratar células o tejidos cancerosos). Alternativamente, si el polipéptido tiene múltiples dominios funcionales (es decir, un dominio de activación o un dominio de unión al receptor, más un dominio diana), una proteína de fusión que incluya solamente el dominio diana puede ser adecuada para dirigir una molécula detectable, una molécula citotóxica o una molécula complementaria hacia una célula o tejido de interés. En casos en los que la única proteína de fusión del dominio incluya una molécula complementaria, la molécula anticomplementaria podrá conjugarse a una molécula detectable o citotóxica. Dichas proteínas de fusión dominio-molécula complementaria representan así un vehículo diana genérico para administración específica de células/tejidos de los conjugados genéricos de molécula detectable anticomplementaria/citotóxica.
En otra realización, las proteínas de fusión de citocinas zcytor17lig o las proteínas de fusión anticuerpo-citocina se pueden usar para destrucción de tejido diana in vivo (por ejemplo, leucemia, linfoma, cáncer de pulmón, cáncer de colon, melanoma, cáncer pancreático, cáncer de ovario, piel, cáncer de la sangre y la médula ósea, u otros tipos de cáncer en los que se expresan los receptores zcytor17lig) (Véase, en general, Homick et al., Blood 89: 4437-47, 1997). Las proteínas de fusión descritas permiten direccionar una citocina hacia un sitio deseado de acción, proporcionando así una concentración local elevada de citocina. Los polipéptidos zcytor17lig o anticuerpos anti-zcytor17lig adecuados direccionan una célula o tejido indeseable (es decir, un tumor o una leucemia), y la citocina condensada mediada mejora la lisis de células diana por células efectoras. Las citocinas adecuadas para este propósito incluyen interleucina 2 y factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), por ejemplo.
Incluso en otra realización, si el polipéptido zcytor17lig o el anticuerpo anti-zcytor17lig direcciona células o tejidos vasculares, dicho polipéptido o anticuerpo puede conjugarse con un radionúcleo, y particularmente con un radionúcleo beta-emisor, para reducir la restenosis. Dichos planteamientos terapéuticos conllevan menos peligro para los médicos que administran la terapia radiactiva. Por ejemplo, bandas impregnadas con iridio-192 dispuestas en vasos con endoprótesis de pacientes hasta que se suministraba la dosis de radiación requerida demostraron un menor crecimiento del tejido en el vaso y mayor diámetro luminal que el grupo control, que recibió bandas con placebo. A su vez, la revascularización y trombosis por endoprótesis se redujeron significativamente en el grupo de tratamiento. Se pronostican resultados similares por direccionar un conjugado bioactivo que contenga un radionúcleo, como se describe en esta memoria.
Los conjugados de anticuerpo o polipéptido bioactivo descritos en la presente memoria se pueden administrar por vía intravenosa, intrarterial o intraductal, o pueden introducirse localmente en el sitio intencionado de acción.
Las moléculas de la presente invención tienen uso particular en el brazo de monocitos/macrófagos del sistema inmunitario. Se conocen los métodos que pueden evaluar dicha actividad. Por ejemplo, el interferón gamma (IFN\gamma) es un activador potente de los fagocitos mononucleares. Por ejemplo, un incremento en la expresión de zcytor17, tras la activación de células THP-1 (ATCC No. TIB-202) con interferón gamma, podría indicar que este receptor está implicado en la activación de los monocitos. Los monocitos son células incompletamente diferenciadas que migran hacia diversos tejidos, en los que maduran y se convierten en macrófagos. Los macrófagos desempeñan una función central en la respuesta inmunitaria, presentando antígenos a los linfocitos, y cumplen un papel de soporte como células accesorias, segregando numerosas citocinas. Los macrófagos pueden internalizar moléculas extracelulares y, tras la activación, tienen mayor capacidad de destruir microorganismos intracelulares y células tumorales. Los macrófagos activados también están implicados en la estimulación de la inflamación aguda o local. Asimismo, se ha demostrado que la función monocito-macrófago es anormal en una diversidad de patologías. Por ejemplo, véase Johnston, RB, New Eng. J, Med. 318: 747-752, 1998.
El experto en la técnica reconocería que los agonistas del receptor zcytor17, como zcytor17lig, son útiles. Por ejemplo, se ha relatado la disminución de la migración de monocitos en poblaciones con una predisposición a infecciones, por ejemplo en neonatos, pacientes que reciben corticosteroides u otras terapias inmunosupresoras, y pacientes con diabetes mellitus, quemaduras o sida. Los agonistas de zcytor17, como zcytor17lig, podrían provocar un aumento en la capacidad de los monocitos de migrar y posiblemente prevenir infecciones en estas poblaciones. Existe también un serio defecto de destrucción fagocítica por parte de fagocitos mononucleares de pacientes que padecen enfermedad granulomatosa crónica. Esto provoca la formación de abscesos subcutáneos, como también abscesos en el hígado, los pulmones, el bazo y los ganglios linfáticos. Un agonista del receptor zcytor17, tal como zcytor17lig, podría corregir y mejorar este defecto fagocítico. A su vez, se ha relatado citotoxicidad de monocitos defectuosos en pacientes con cáncer y síndrome de Wiskott-Aldrich (eczema, trombocitopenia e infecciones recurrentes). La activación de monocitos por agonistas del receptor de zcytor17, como zcytor17lig, podría auxiliar en el tratamiento de estas afecciones. El sistema monocito-macrófago está predominantemente implicado en diversas enfermedades de almacenamiento de lípidos (esfingolipidosis), como la enfermedad de Gaucher. La resistencia a infecciones puede estar afectada debido a un defecto en la función de los macrófagos, lo que podría tratarse con los agonistas del receptor zcytor17, como zcytor17lig.
Además, la persona con experiencia en la técnica reconocería que son útiles los antagonistas de zcytor17lig. Por ejemplo, en lesiones ateroscleróticas, una de las primeras anomalías es la localización de monocitos/macrófagos en células endoteliales. Estas lesiones podrían prevenirse con el uso de antagonistas de zcytor17lig. Los anticuerpos anti-zcytor17lig (p. ej., el anticuerpo neutralizador de zcytor17lig), los receptores zcytor17 solubles, los heterodímeros y multímeros, y las parejas de unión de zcytor17lig pueden también emplearse como antagonistas de zcytor17lig. Además, la leucemia monoblástica se asocia a una diversidad de anomalías clínicas que reflejan la liberación de los productos biológicos del macrófago, por ejemplo, altos niveles de lisozima en el suero y la orina, y fiebre alta. Asimismo, dichas leucemias exhiben un incremento anormal de células monocíticas. Estos efectos posiblemente podrían prevenirse con los antagonistas de zcytorl71ig, como se describe en la presente memoria. A su vez, el anti-zcytor17lig se puede conjugar a moléculas tales como restos tóxicos y citocinas, como se describe en este documento para dirigir la destrucción de células monocíticas de leucemia.
Usando los métodos conocidos en la técnica y descritos en la presente memoria, la persona con experiencia en la técnica podría evaluar fácilmente la actividad de los agonistas y antagonistas de zcytor17lig en las patologías aquí descritas, inflamación, enfermedades inmunitarias (p. ej., autoinmunitarias), cáncer o infecciones, como también otras patologías que implican células monocíticas. Además, ya que el zcytor17lig se expresa en un modo específico de células T, macrófagos y monocitos, y dado que estas enfermedades implican anomalías en células monocíticas, como proliferación, función, localización y activación celular, los polinucleótidos, polipéptidos y anticuerpos de la presente invención se pueden usar como diagnósticos para detectar dichas anomalías de las células monocíticas, e indicar la presencia de la enfermedad. Dichos métodos comprenden tomar una muestra biológica de un paciente, como sangre, saliva o una biopsia, y compararla con una muestra control normal. Los métodos histológicos, citológicos, de citometría de flujo, bioquímicos y otros métodos se pueden usar para determinar los niveles relativos o la localización de zcytor17lig, o células que expresan zcytor17lig, es decir, monocitos, en la muestra del paciente comparada con el control normal. Un cambio en el nivel (aumento o disminución) de expresión de zcytor17lig, o un cambio en la cantidad o localización de monocitos (p. ej., aumento o infiltración de células monocíticas en tejidos en los que normalmente no están presentes), en comparación con un control, serían indicativos de enfermedad. Dichos métodos diagnósticos pueden incluir además el uso de marcadores radiométricos, fluorescentes y colorimétricos fijados a los polinucleótidos, polipéptidos o anticuerpos de la presente invención. Dichos métodos se conocen en la técnica y se describen en este documento.
Las secuencias de aminoácidos que tienen actividad de zcytor17lig se pueden usar para modular el sistema inmunitario, uniéndose al receptor de zcytor17 y previniendo así la unión de zcytor17lig al receptor zcytor17lig endógeno. Los antagonistas de zcytor17lig, como los anticuerpos anti-zcytor17lig, también se pueden usar para modular el sistema inmunitario, inhibiendo la unión de zcytor17lig al receptor zcytor17lig endógeno. Por consiguiente, la presente invención incluye el uso de proteínas, polipéptidos y péptidos que tienen actividad de zcytor17lig (por ejemplo, polipéptidos zcytor17lig, análogos de zcytor17lig (p. ej., anticuerpos anti-idiotipo anti-zcytor17lig) y proteínas de fusión a zcytor17lig) en sujetos que carecen de una cantidad adecuada de este polipéptido, o que producen un exceso de receptor o receptores que comprenden zcytor17. Los antagonistas de zcytor17 (p. ej., anticuerpos anti-Zcytor17) pueden también utilizarse para tratar a un sujeto que produce un exceso de zcytor17lig o de receptor o receptores que comprenden zcytor17. Los sujetos adecuados incluyen mamíferos, por ejemplo seres humanos. Se ha demostrado que el zcytor17lig se expresa en células mononucleares activadas, y puede estar implicado en la regulación de la inflamación. Como tales, los polipéptidos de la presente invención se pueden ensayar y usar por su capacidad de modificar la inflamación, o se pueden usar como marcadores de inflamación. Los métodos para determinar cualidades proinflamatorias y antinflamatorias de zcytor17lig se conocen en la técnica y se analizan en este documento. Además, pueden estar implicados en el aumento de la producción de reaccionantes de fase aguda, como amiloide A en suero (SAA), \alphal-antiquimiotripsina y haptoglobina, y la expresión del ligando receptor zcytor17 puede aumentar tras la inyección de lipopolisacáridos (LPS) in vivo, que están implicados en la respuesta inflamatoria (Dumoutier, L. et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. 97: 10144-10149, 2000). La producción de proteínas de fase aguda, como SAA, se considera un mecanismo de supervivencia de corto plazo en donde la inflamación es beneficiosa; no obstante, el mantenimiento de proteínas de fase aguda por periodos más largos contribuye a inflamación crónica y puede ser perjudicial para la salud humana. Para una revisión, véanse Uhlar, CM y Whitehead, AS. Eur. J. Biochem. 265: 501-523, 1999, y Baumann H. y Gauldie, J. Immunology Today 15: 74-80, 1994. A su vez, la proteína de fase aguda SAA está implicada en la patogenia de varias enfermedades inflamatorias crónicas, en la aterosclerosis y en la artritis reumatoidea, y es la precursora de la proteína amiloide A depositada en amiloidosis (Uhlar, CM y Whitehead, supra.). Por lo tanto, en un ligando tal como zcytor17lig, que actúa como molécula proinflamatoria e induce la producción de SAA, los antagonistas serían útiles para tratar enfermedades inflamatorias y otras enfermedades asociadas a las proteínas de respuesta de fase aguda inducidas por el ligando. Dichos antagonistas son provistos por la presente invención. Por ejemplo, un método para reducir las respuestas inflamatorias comprende administrar a un mamífero que padece inflamación, una cantidad de una composición de zcytor17lig, o un anticuerpo anti-zcytor17lig (p. ej., anticuerpo neutralizador) suficiente para reducir la inflamación. Además, un método para suprimir una respuesta inflamatoria en un mamífero que padece inflamación puede comprender: (1) determinar un nivel de proteína amiloide A en el suero; (2) administrar una composición que comprende un polipéptido zcytor17lig o un anticuerpo anti-zcytor17lig descrito en la presente memoria en un vehículo farmacéuticamente aceptable; (3) determinar un nivel pos-administración de la proteína amiloide A en suero; (4) comparar el nivel de proteína amiloide A en el suero de la etapa (1) con el nivel de proteína amiloide A en el suero de la etapa (3), en donde la falta de incremento o disminución del nivel de proteína amiloide A en el suero es indicativo de supresión de respuesta inflamatoria.
Los receptores que se unen a zcytor17lig de la presente invención incluyen por lo menos una subunidad del receptor zcytor17. Un segundo polipéptido receptor incluido en el receptor soluble heterodimérico pertenece a la subfamilia de receptores e incluye subunidades del receptor de citocina de clase 1 y, más específicamente OSMRbeta y WSX-1. Según la presente invención, además de un polipéptido receptor zcytor17 monomérico o heterodimérico, un receptor zcytor17 soluble heterodimérico, como se ejemplifica en la realización que comprende un receptor zcytor17 soluble + componente heterodimérico receptor soluble de Clase 1, como OSMRbeta o WSX-1, puede actuar como antagonista de zcytor17lig. Otras realizaciones incluyen receptores multiméricos solubles que comprenden zcytor17, como el receptor zcytor17 + componente multimérico receptor soluble de Clase I, como OSMRbeta y WSX-1.
\newpage
Como el zcytor17lig, el análisis de distribución de tejido del mRNA correspondiente a su cDNA del receptor zcytor17 demostró que el nivel de mRNA fue el más alto en monocitos y células de próstata, y se eleva en monocitos activados y células CD4+ activadas, CD84-activadas y CD3+ activadas. En consecuencia, el receptor zcytor17 está también implicado en la inducción de respuestas inflamatorias e inmunitarias. Por lo tanto, las realizaciones particulares de la presente invención se refieren al uso de anticuerpos zcytor17lig, y zcytor17lig, como también a heterodímeros del receptor soluble zcytor17, como antagonistas en enfermedades o afecciones inflamatorias e inmunitarias, por ejemplo pancreatitis, diabetes de tipo I (IDDM), cáncer de páncreas, pancreatitis, enfermedad de Graves, enfermedad inflamatoria de los intestinos (IBD), enfermedad de Crohn, cáncer de colon e intestino, diverticulosis, enfermedades autoinmunitarias, septicemia, trasplante de órganos o médula ósea; inflamación debida a traumatismo, cirugía o infección; amiloidosis; esplenomegalia; enfermedad injerto contra hospedante; y en aquellas enfermedades o afecciones en las que tiene lugar la inhibición de inflamación, supresión inmunitaria, reducción de proliferación de células hematopoyéticas, inmunitarias, inflamatorias o linfoides, macrófagos, células T (incluyendo células Th1 y Th2, células CD4+ y CD8+), supresión de respuesta inmunitaria a un patógeno o antígeno. Asimismo, la presencia del receptor zcytor17 y la expresión de zcytor17lig en células inmunitarias activadas, como CD3+ activada, monocitos, células CD4+ y CD19+, demostró que el receptor zcytor17 puede estar implicado en las reacciones defensivas inmunitarias del organismo contra invasores extraños: como microorganismos y residuos celulares, y podría desempeñar una función en las respuestas inmunitarias durante la inflamación y la formación de cáncer. Como tales, el zcytor17lig y los anticuerpos de zcytor17lig de la presente invención, que son agonistas o antagonistas de la función del receptor zcytor17, se pueden usar para modificar la respuesta inmunitaria y la inflamación.
Además, los polipéptidos zcytor17lig que se unen a los polipéptidos receptores de zcytor17, y a los anticuerpos allí contenidos, son útiles para:
1) Antagonizar o bloquear la señalización vía receptores que comprenden zcytor17 en el tratamiento de inflamación aguda, inflamación como consecuencia de un traumatismo, lesión de tejidos, cirugía, septicemia o infección, y enfermedades inflamatorias crónicas tales como asma, enfermedad inflamatoria de los intestinos (IBD), colitis crónicas, esplenomegalia, artritis reumatoidea, episodios inflamatorios agudos recurrentes (p. ej., tuberculosis) y tratamiento de amiloidosis, y aterosclerosis, enfermedad de Castleman, asma y otras enfermedades asociadas a la inducción de respuesta de fase aguda.
2) Antagonizar o bloquear la señalización vía el receptor de los receptores zcytor17 en el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias tales como IDDM, esclerosis múltiple (MS), lupus eritematoso sistémico (SLE), miastenia grave, artritis reumatoidea e IBD para prevenir o inhibir la señalización en células inmunitarias (p. ej., linfocitos, monocitos, leucocitos) vía el receptor zcytor17 (Hughes C et al., J. Immunol 153: 3319-3325, 1994). Alternativamente, los anticuerpos, tales como los anticuerpos monoclonales (MAb) para zcytor17lig, también se pueden emplear como antagonistas para reducir células inmunitarias no deseadas a fin de tratar enfermedades autoinmunitarias. El asma, la alergia y otras enfermedades atópicas pueden tratarse con un MAb contra, por ejemplo, anticuerpos anti-zcytor17lig, receptores del receptor soluble zcytor17 o heterodímeros zcytor17/CRF2-4, para inhibir la respuesta inmunitaria o reducir la cantidad de células ofensivas. El bloqueo o la inhibición de la señalización vía zcytor17, usando los polipéptidos y anticuerpos de la presente invención, también pueden beneficiar a enfermedades del páncreas, riñón, células neuronales y glándula pituitaria. Pueden beneficiarse la pancreatitis, IDDM, NIDDM y el carcinoma pancreático. El zcytor17 puede servir como diana para la terapia MAb del cáncer, en la que un MAb antagónico inhibe el desarrollo del cáncer y direcciona la destrucción mediada por células inmunitarias. (Holliger P y Hoogenboom, H: Nature Biotech. 16: 1015-1016, 1998). Los Mab para monómeros, homodímeros, heterodímeros y multímeros del receptor soluble zcytor17 pueden también ser útiles para tratar nefropatías tales como glomerulosclerosis, neuropatía membranosa, amiloidosis (que también afecta al riñón y otros tejidos), arteriosclerosis renal, glomerulonefritis de diversos orígenes, enfermedades fibroproliferativas del riñón, además de disfunción renal asociada a SLE, EDDM, diabetes de tipo II (NIDDM), tumores renales y otras enfermedades.
3) Agonizar o iniciar la señalización vía los receptores zcytor17 en el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias tales como IDDM, MS, SLE, miastenia grave, artritis reumatoidea e IBD. El zcytor17lig puede señalizar linfocitos u otras células inmunitarias para diferenciar, alterar la proliferación o cambiar la producción de citocinas o proteínas de la superficie celular que mejoran la autoinmunidad. Específicamente, la modulación de una respuesta de linfocitos T cooperadores a un patrón alterno de secreción de citocinas puede desviar una respuesta inmunitaria para mejorar la enfermedad (Smith JA et al., J. Immunol. 160: 4841-4849, 1998). De modo similar, el zcytor17lig se puede usar para señalizar, disminuir y desviar las células inmunitarias implicadas en asma, alergia y enfermedad atópica. La señalización vía el receptor zcytor17 puede además beneficiar a enfermedades del páncreas, el riñón, las células pituitarias y neuronales. Pueden beneficiarse la pancreatitis, IDDM, NIDDM y el carcinoma de páncreas. El zcytorl17 puede servir como una diana para la terapia con MAb del cáncer pancreático, en el que un MAb de señalización inhibe el desarrollo del cáncer y direcciona la destrucción mediada por células inmunitarias (Tutt, AL et al., J Immunol. 161: 3175-3185, 1998). De modo similar, las leucemias, linfomas, discrasias de células plasmáticas (p. ej., mieloma múltiple) y carcinoma específicos de células T se pueden tratar con anticuerpos monoclonales (p. ej., anticuerpo neutralizador) para los receptores solubles que comprenden zcytor17 de la presente invención.
Los anticuerpos anti-zcytor17lig, polipéptidos monoméricos, homodiméricos, heterodiméricos y multiméricos del receptor soluble zcytor17 descritos en la presente memoria se pueden usar para neutralizar/bloquear la actividad de ligando del receptor zcytor17 en el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias, enfermedad atópica, NIDDM, pancreatitis y disfunción renal, como se describió precedentemente. Se puede usar una forma soluble del receptor zcytor17 para promover una respuesta de anticuerpos mediada por células T y/o para promover la producción de IL-4 u otras citocinas por linfocitos u otras células inmunitarias.
Los anticuerpos anti-zcytor17lig, y los receptores solubles que comprenden zcytor17, son útiles como antagonistas de zcytor17lig. Dichos efectos antagónicos se pueden lograr por neutralización directa o unión de su ligando natural. Además de los usos antagónicos, los receptores solubles pueden unirse a zcytor17lig y actuar como portadores o proteínas portadoras, con el fin de transportar zcytor17lig hacia diferentes tejidos, órganos y células del organismo. Como tales, los receptores solubles se pueden condensar o acoplar a moléculas, polipéptidos o restos químicos que dirigen el complejo receptor soluble-ligando hacia un sitio específico, como un tejido, inmunocito específico, monocitos o tumores. Por ejemplo, en infección aguda o en algunos tipos de cáncer se pueden obtener beneficios de la inducción de las proteínas de respuesta de fase aguda local e inflamación. Por ende, los receptores solubles descritos aquí, o los anticuerpos de la presente invención, se pueden usar para dirigir específicamente la acción de un ligando de zcytor17lig proinflamatorio. Véanse, Cosman, D. Cytokine 5: 95-106, 1993; y Fernandez-Botran, R. Exp. Opin. Invest Drugs 9: 497-513, 2000.
Asimismo, los receptores solubles se pueden usar para estabilizar el zcytor17lig, aumentar la biodisponibilidad, longevidad terapéutica y/o eficacia del ligando, estabilizando el ligando de degradación o aclaramiento, o direccionando el ligando hacia un sitio de acción dentro del organismo. Por ejemplo, el complejo IL-6 natural/IL-6R soluble estabiliza la IL-6 y puede señalizarse a través del receptor gp130. Véase, Cosman, D. supra., y Fernandez-Botran, R. supra. Además, el Zcytor17 se puede combinar con un ligando análogo, como su ligando, para comprender un complejo ligando/receptor soluble. Dichos complejos pueden usarse para estimular respuestas de células que presentan una subunidad receptor acompañante. La especificidad celular de los complejos receptores zcytor17/zcytor17lig puede diferir de aquella observada en el ligando administrado solo. A su vez, los complejos pueden tener propiedades de farmacocinética diferentes, que pueden afectar la semivida, dosis/respuesta y especificidad de órganos y tejidos. Los complejos zcytor17/ligando pueden así tener actividad agonista para potenciar una respuesta inmunitaria o estimular células mesangiales, o estimular células hepáticas. Alternativamente, solamente los tejidos que expresan una subunidad de señalización que se heterodimeriza con el complejo pueden estar afectados en analogía a la respuesta a los complejos IL6/IL6R (Hirota H. et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. 92: 4862-4866, 1995; Hirano, T. en Thomason, A. (Ed.) "The Cytokine Handbook", 3^{a} Ed., p. 208-209). Los complejos receptor soluble/citocina para IL12 y CNTF exhiben actividades similares.
El zcyto17lig puede además usarse dentro de sistemas diagnósticos para detección de niveles circulantes de ligando, y en la detección de respuesta inflamatoria de fase aguda. Dentro de una realización relacionada, los anticuerpos u otros agentes que se unen específicamente a zcytor17lig se pueden usar para detectar polipéptidos zcytor17lig circulantes; de forma inversa, se puede emplear zcytor17lig propiamente dicho para detectar polipéptidos receptores circulantes o que actúen localmente. Los niveles elevados o disminuidos de ligando o polipéptidos receptores pueden indicar patologías que incluyen inflamación o cáncer. A su vez, la detección de proteínas de fase aguda o moléculas tales como zcytor17lig puede ser indicativa de una afección inflamatoria crónica en determinados estados de enfermedad (p. ej., artritis reumatoidea). La detección de dichas afecciones sirve para ayudar a diagnosticar la enfermedad, como también para ayudar al médico a elegir el tratamiento correcto.
Los polipéptidos y las proteínas de la presente invención se pueden usar ex vivo, como en cultivo autólogo de médula. En síntesis, se extrae médula ósea de un paciente, antes de la quimioterapia o trasplante de órganos, y se trata con zcytor17lig, opcionalmente combinado con una o más de otras citocinas. La médula tratada se retorna al paciente después de la quimioterapia y se acelera la recuperación de la médula, o después del trasplante para suprimir la enfermedad de injerto contra hospedante. Además, las proteínas de la presente invención también se pueden usar para la expansión ex vivo de células progenitoras de sangre periférica o de médula ósea de monocitos/macrófagos. Antes del tratamiento, puede estimularse la médula con factor de células madre (SCF) para liberar células progenitoras tempranas hacia la circulación periférica. Estos progenitores se pueden extraer y concentrar de sangre periférica y luego tratarse en cultivo con zcytor17lig, opcionalmente en combinación con una o más de otras citocinas que incluyen, aunque sin limitarse a ellas, SCF, IL-2, IL-4, IL-7, Lif, IL-3, IL-12, IL-21 o IL-15, para diferenciarse y proliferarse en cultivos linfoides de alta densidad, que pueden luego retornarse al paciente, tras la quimioterapia o el trasplante.
La presente invención proporciona un método de expansión de células hematopoyéticas y progenitores de células hematopoyéticas, que comprende cultivar células de médula o sangre periférica con una composición que comprende una cantidad de zcytor17lig suficiente para producir un incremento en el número de células linfoides de la médula ósea o de células de sangre periférica, en comparación con células de sangre periférica o médula ósea cultivadas en ausencia de zcytor17lig. En otras realizaciones, las células hematopoyéticas y las células progenitoras hematopoyéticas son células linfoides. En otra realización, las células linfoides son linfocitos citolíticos naturales o células T citotóxicas. Asimismo, la composición puede también comprender por lo menos una otra citocina seleccionada del grupo que consiste en IL-2, IL-15, IL-4, Lif, IL-3, IL-12, IL-21, GM-CSF, ligando FIt3 y factor de células madre.
Alternativamente, el zcytor17lig puede activar el sistema inmunitario, lo que sería importante para reforzar la inmunidad a enfermedades infecciosas, tratar a pacientes inmunocomprometidos, como pacientes HIV+-, pacientes de cáncer, o para mejorar las vacunas. En particular, la estimulación con zcytor17lig o la expansión de monocitos/macrófagos, células T, células B, linfocitos citolíticos naturales o sus progenitores aportaría valor terapéutico en el tratamiento de infecciones víricas y como factor antineoplásico. De forma similar, la estimulación con zcytor17lig de la respuesta inmunitaria contra agentes patógenos víricos y no víricos (por ejemplo bacterias, protozoos y hongos) aportaría valor terapéutico en el tratamiento de dichas infecciones, inhibiendo el desarrollo de tales agentes infecciosos. La determinación directa o indirecta de niveles de patógeno o antígeno, como células tumorales presentes en el organismo, se puede lograr mediante una serie de métodos conocidos en la técnica y descritos en esta memoria.
La presente invención incluye un método para estimular una respuesta inmunitaria en un mamífero expuesto a un antígeno o patógeno, que comprende las etapas de: (I) determinar directa o indirectamente el nivel de antígeno o patógeno presente en dicho mamífero; (2) administrar una composición que comprende un polipéptido zcytor17lig en un vehículo farmacéuticamente aceptable; (3) determinar directa o indirectamente el nivel de antígeno o patógeno en dicho mamífero; y (4) comparar el nivel de antígeno o patógeno de la etapa 1 con el nivel de antígeno o patógeno de la etapa 3, en donde un cambio en el nivel es indicativo de estimulación de una respuesta inmunitaria. En otra realización, la composición de zcytor17lig se vuelve a administrar. En otras realizaciones, el antígeno es un tumor de células B; un virus; un parásito o una bacteria.
En otro aspecto, la presente invención provee un método para estimular una respuesta inmunitaria en un mamífero expuesto a un antígeno o patógeno, que comprende: (1) determinar el nivel de anticuerpo específico del antígeno o patógeno; (2) administrar una composición que comprende un polipéptido zcytor17lig en un vehículo farmacéuticamente aceptable; (3) determinar un nivel pos-administración de anticuerpo específico del antígeno o patógeno; (4) comparar el nivel de anticuerpo de la etapa (1) con el nivel de anticuerpo de la etapa (3), en donde un incremento en el nivel de anticuerpo es indicativo de la estimulación de una respuesta inmunitaria.
Los polinucleótidos que codifican los polipéptidos zcytor17lig son útiles dentro de aplicaciones en terapia génica, en donde se desea aumentar o inhibir la actividad de zcytor17lig. Si un mamífero tiene un gen zcytor17lig mutado o ausente, el gen zcytor17lig puede introducirse en las células del mamífero. En una realización, un gen que codifica un polipéptido zcytor17lig se introduce in vivo en un vector vírico. Dichos vectores incluyen un virus de DNA atenuado o defectuoso, por ejemplo, aunque sin limitación, virus herpes simple (HSV), papillomavirus, virus de Epstein Barr (EBV), adenovirus, virus adenoasociado (AAV) y similares. Se prefieren los virus defectuosos, que carecen completamente o casi completamente de genes víricos. Un virus defectuoso no es infectivo después de la introducción a una célula. El uso de vectores víricos defectuosos permite la administración a células en un área específica localizada, sin preocupación de que el virus pueda infectar a otras células. Los ejemplos de vectores particulares incluyen, aunque sin limitarse a ellos, un vector del virus herpes simple I (HSVI) defectuoso (Kaplitt et al., Molec. Cell. Neurosci. 2: 320-30, 1991); un vector de adenovirus atenuado, como el vector descrito por Stratford-Perricaudet et al., J. Clin, invest. 90: 626-30, 1992; y un vector del virus adenoasociado defectuoso (Samulski et al., J. Virol. 61: 3096-101, 1987; Samulski et al., J. Virol. 63: 3822-8, 1989).
Se puede introducir un gen zcytor17lig en un vector retrovírico, p. ej., como se describe en Anderson et al., patente estadounidense No. 5.399.346; Mann et al. Cell 33: 153, 1983; Temin et al., patente estadounidense No. 4.650.764; Temin et al., patente estadounidense No. 4.980.289; Markowitz et al., J. Virol. 62: 1120, 1988; Temin et al., patente estadounidense No. 5.124.263; publicación de patente internacional No. WO 95/07358, publicada el 16 de marzo de 1995 por Dougherty et al.; y Kuo et al., Blood 82: 845, 1993. Alternativamente, el vector puede introducirse por lipofección in vivo, usando liposomas. Los lípidos catiónicos sintéticos pueden usarse para preparar liposomas para transfección in vivo de un gene que codifica un marcador (Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413-7, 1987; Mackey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8027-31, 1988). El uso de lipofección para introducir genes exógenos en órganos específicos in vivo tiene ciertas ventajas prácticas. El direccionamiento molecular de liposomas para células específicas representa un área de beneficio. Más particularmente, dirigir la transfección a células particulares representa un área de beneficio. Por ejemplo, dirigir la transfección a tipos de células particulares sería particularmente ventajoso en un tejido con heterogeneidad celular, como el sistema inmunitario, páncreas, hígado, riñón y cerebro. Los lípidos pueden acoplarse químicamente a otras moléculas para los fines de direccionamiento. Los péptidos direccionados (p. ej., hormonas o neurotransmisores), proteínas como anticuerpos, o moléculas no peptídicas pueden acoplarse químicamente a liposomas.
Es posible eliminar las células diana del organismo; introducir el vector como plásmido de DNA desnudo; y luego reimplantar las células transformadas en el organismo. Los vectores de DNA desnudos para terapia génica pueden introducirse en las células hospedantes deseadas por métodos conocidos en la técnica, p. ej., transfección, electroporación, microinyección, transducción, fusión celular, DEAE dextrano, precipitación de fosfato cálcico, uso de un gen gun o uso de un transportador del vector de DNA. Véanse, p. ej., Wu et al., J. Biol. Chem. 267: 963-7, 1992; Wu et al. J. Biol. Chem. 263: 14621-4, 1988.
Se puede emplear metodología antisentido para inhibir la transcripción del gen zcytor17lig, como para inhibir la proliferación celular in vivo. Los polinucleótidos que son complementarios a un segmento de un polinucleótido que codifica zcytor17lig (p. ej., un polinucleótido tal como se expone en la SEC ID NO:1) están diseñados para unirse a mRNA que codifica zcytor17lig y para inhibir la traducción de dicho mRNA. Dichos polinucleótidos antisentido se usan para inhibir la expresión de genes que codifican el polipéptido zcytor17lig en cultivo celular o en un sujeto.
Pueden también generarse ratones genomanipulados para expresar el gen zcytor17lig, denominados "ratones transgénicos", y los ratones que exhiben una ausencia completa de la función del gen zcytor17lig, denominados "ratones con genes inactivados" (Snouwaert et al., Science 257: 1083, 1992; Lowell et al., Nature 366: 740-42, 1993; Capecchi, M.R., Science 244: 1288-1292, 1989; Palmiter, R.D. et al. Annu Rev Genet. 20: 465-499, 1986). Por ejemplo, los ratones transgénicos que sobrexpresan zcytor17lig, o bien en forma ubicua o bajo un promotor específico de tejido o restringido a tejido, pueden usarse para averiguar si la sobrexpresión causa un fenotipo. Por ejemplo, la sobrexpresión del polipéptido zcytor17lig natural, el fragmento de polipéptido o su mutante, puede alterar los procesos celulares normales, dando como resultado un fenotipo que identifica un tejido en el que la expresión de zcytor17lig es funcionalmente relevante y puede indicar una diana terapéutica para el zcytor17lig, sus agonistas o antagonistas. Por ejemplo, un ratón transgénico preferido para genomanipular es uno que sobrexpresa el zcytor17lig (residuos aminoácido 23-164 de la SEC ID NO:2; o 24-163 de la SEC ID NO:11). Además, dicha sobrexpresión puede resultar en un fenotipo que muestre similitud con enfermedades humanas. De forma similar, los ratones con genes inactivados zcytor17lig se pueden usar para determinar si zcytor17lig es absolutamente necesario in vivo. El fenotipo de ratones con genes inactivados es predictivo de los efectos in vivo que puede tener ese antagonista de zcytor17lig, como los descritos en la presente memoria. El cDNA de zcytor17lig humano o de ratón descrito en el presente documento se puede usar para generar ratones con genes inactivados. Estos ratones pueden emplearse para estudiar el gen zcytor17lig y la proteína codificada allí en un sistema in vivo, y se pueden usar como modelos in vivo para las correspondientes enfermedades humanas. A su vez, la expresión en ratones transgénicos de polinucleótidos zcytor17lig antisentido o ribosomas dirigidos contra zcytor17lig, descritos aquí, se puede usar análogamente a los ratones transgénicos anteriormente descritos. Se pueden realizar estudios por administración de la proteína zcytor17lig purificada.
Los datos experimentales indican una función del zcytor17lig en la progresión de enfermedades que implican la piel o el epitelio de superficies internas, por ejemplo, intestino grueso, intestino delgado, páncreas, pulmón, próstata, útero y similares. Primero, como se describe en la presente invención, los receptores zcytor17, incluyendo el receptor OSM y beta, y zcytor17, se expresan en varios tipos de células ubicados en superficies epitelalies, incluyendo líneas celulares derivadas de epitelio pulmonar, fibroblasto pulmonar, próstata, colon, mama, epitelio de hígado, epitelio de hueso y piel, fibroblasto óseo y similares. A su vez, como se describe en esta memoria, los ejemplos de cada uno de estos tipos de células también respondieron a la activación de zcytor17lig de un constructo indicador STAT. Además, varias líneas celulares respondieron a la estimulación de zcytor17lig, produciendo niveles mayores de IL-6, IL-8, MCP-1 (un factor quimiotáctico), como se describe en la presente memoria. En total, estos datos indican una función de zcytor17lig en enfermedades que implican el epitelio, como por ejemplo dermatitis atópica; dermatitis; psoriasis; artritis psoriásica; eczema; gingivitis; enfermedad periodontal; enfermedad inflamatoria de los intestinos (IBD) (p. ej., colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn); trastornos reproductivos, como por ejemplo displasia cervical, cáncer cervical; otras enfermedades de la piel como cáncer: sarcomas; carcinomas; melanoma, etc. es decir, no solo enfermedades inflamatorias, ya que el sistema inmunitario está implicado en la activación/cura de distintos tipos de cáncer; enfermedades que implican la disfunción de barrera, como por ejemplo la enfermedad injerto contra hospedante (GVHD) y el síndrome de intestino irritable (IBS); y enfermedades que implican el epitelio pulmonar, como asma, enfisema y similares. Asimismo, la liberación de citocinas IL-6, IL-8 y MCP-1 por las células expuestas a zcytor17lig indica que zcytor17lig está implicado en la inflamación. Por lo tanto, la regulación de zcytor17lig puede ser útil en el tratamiento de enfermedades autoimunitarias, inflamatorias o cancerosas asociadas con los tejidos que expresan el receptor. Estas enfermedades incluyen, por ejemplo, prostatitis, hepatitis, artrosis y similares. El zcytor17lig puede regular positiva o negativamente, directa o indirectamente, estas enfermedades. En consecuencia, la administración de zcytor17lig se puede usar para tratar las enfermedades descritas aquí, directamente o con moléculas que inhiben la actividad de zcytor17lig, incluyendo, por ejemplo, anticuerpos monoclonales para zcytor17lig o anticuerpos monoclonales para zcytor17, o anticuerpos monoclonales que reconocen el beta complejo receptor de OSM y zcytor17.
Los datos indican que el zcytor17lig podría estar implicado en la regulación de enfermedades mediadas por células T TH2. Primero, el zcytor17lig está formado por el subconjunto TH2 de células T activadas. Las células TH2 expresan más zcytorl71ig que las células TH1. Además, se estimularon por lo menos dos líneas celulares del epitelio pulmonar (SK-LU-1, A549) para aumentar alfa-2 mRNA de IL-13 en respuesta a la estimulación del ligando de zcytor17, como se describe en esta memoria. Existe una asociación de la cadena de alfa2 del receptor de IL-13 y la tumorigenicidad de tumores pancreáticos y de mama humanos. Esto indica que el zcytor17lig puede desempeñar una función en la regulación de la tumorigenicidad de estos tipos de cáncer, como también otros tipos de cáncer. Por lo tanto, la administración de un antagonista de zcytor17lig o el uso directo de zcytor17lig pueden ser útiles en el tratamiento de estos tipos de cáncer, benignos o malignos y de diferentes grados (grados I-IV) y estadios (p. ej., métodos TNM o AJC) de desarrollo de tumores, en mamíferos, preferiblemente en seres humanos.
Se conoce en la técnica que la IL-13 está implicada en la generación de células TH2 activadas y en enfermedades mediadas por TH2, como asma, dermatitis atópica y similares. El zcytor17lig o los antagonistas de zcytor17lig pueden ser útiles en el tratamiento de enfermedades que implican células T TH2. Esto incluiría enfermedades tales como, por ejemplo, dermatitis atópica, asma, como también otras enfermedades exacerbadas por células TH2 activadas. La implicación de zcytor17lig en enfermedades, como por ejemplo la dermatitis atópica, está también soportada por el fenotipo de los ratones transgénicos que sobrexpresan zcytor17lig y presentan síntomas de dermatitis atópica, como se describe aquí.
A pesar de la expresión diferencial de zcytor17lig por las células TH2, existe incluso cierta expresión de zcytor17lig en células TH1 y en células T CD8+. Por lo tanto, el zcytor17lig o sus antagonistas pueden ser útiles para tratar enfermedades que implican inmunomodulación de células T activadas, por ejemplo, infección vírica, cáncer, rechazo de injertos y similares.
El zcytor17lig puede también estar implicado en el desarrollo del cáncer. Hay expresión del zcytor17 y de los beta-receptores del receptor OSM en osteosarcoma de fibroblastos óseos de seres humanos, melanoma de fibroblastos de piel de seres humanos, carcinoma epitelial de colon, adenocarcinoma, adenocarcinoma epitelial de mama, adenosarcoma epitelial de próstata y adenocarcinoma epitelial de pulmón, y carcinoma. Por ende, puede ser útil tratar tumores de origen epitelial con zcytor17lig, sus fragmentos, o con antagonistas de zcytor17lig que incluyen, aunque sin limitarse a ello, carcinoma, adenocarcinoma y melanoma. Sin perjuicio de ello, se puede usar zcytor17lig o un antagonista de zcytor17lig para tratar cáncer, o reducir uno o más de los síntomas de un cáncer, desde cáncer que incluye, aunque sin limitarse a ello, carcinoma de células escamosas o epidermoides, carcinoma de células basales, adenocarcinoma, carcinoma papilar, citadenocarcinoma, carcinoma broncogénico, melanoma, carcinoma de células renales, carcinoma hepatocelular, carcinoma de células transicionales, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionario, tumor maligno mixto de origen en las glándulas salivales, tumor de Wilms, teratoma inmaduro, teratocarcinoma y otros tumores que comprenden por lo menos algunas células de origen epitelial.
En general, la dosis del polipéptido zcytor17lig (o proteína de fusión o análogo de zcytor17) administrado variará dependiendo de factores tales como la edad, el peso, la estatura, el sexo y la condición médica general y la historia clínica del paciente. Típicamente, es conveniente proporcionar al receptor una dosis del polipéptido zcytor17lig que esté en el intervalo de aproximadamente 1 pg/kg a 10 mg/kg (cantidad de agente/peso corporal del paciente), aunque también se puede administrar una dosis inferior o superior, según lo impongan las circunstancias. El experto en la técnica puede determinar fácilmente dichas dosis y los ajustes a la misma, usando métodos conocidos en la técnica.
La administración de un polipéptido zcytor17lig a un sujeto puede ser tópica, por inhalación, intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intrapleural, intratecal, por perfusión a través de un catéter regional, o por inyección intralesional directa. Cuando se administren proteínas terapéuticas por inyección, la administración podrá ser por infusión continua o por una o varias inyecciones intravenosas rápidas.
Otras rutas de administración incluyen la vía oral, mucosa-membrana, pulmonar y transcutánea. La administración oral es adecuada para microesferas de poliéster, microesferas de zeína, microesferas proteinoides, microesferas de policianoacrilato y sistemas a base de lípidos (véanse, por ejemplo, DiBase y Morrel, "Oral Delivery of Microencapsulated Proteins", en Protein Delivery: Physical Systems, Sanders y Hendren (eds.), páginas 255-288 (Plenum Press 1997)). La factibilidad de una administración intranasal se ejemplifica por un modo de administración tal como el de la insulina (véase, por ejemplo, Hinchcliffe y Illum, Adv. Drug Deliv, Rev. 35: 199 (1999)). Las partículas secas o líquidas que comprenden Zcytor17lig se pueden preparar e inhalar con la ayuda de dispersadores de polvo, generadores de aerosol líquidos o nebulizadores (p. ej., Pettit y Gombotz, TIBTECH 76:343 (1998); Patton et al., Adv. Drug. Deliv. Rev. 35: 235 (1999)). Este planteamiento se ilustra mediante el sistema de administración para diabetes AERX, que es un inhalador electrónico manual que suministra insulina en aerosol a los pulmones. Los estudios han demostrado que las proteínas tan grandes como de 48.000 kDa se han administrado a través de la piel a concentraciones terapéuticas con la ayuda de ultrasonido de bajo frecuencia, que ilustra la factibilidad de la administración transcutánea (Mitragotri et al., Science 269: 850 (1995)). La administración transdérmica, que usa electroporación, provee otro medio para administrar una molécula que tenga actividad de unión a Zcytor17lig (Potts et al., Pharm. Biotechnol.
10: 213 (1997)).
Se puede formular una composición farmacéutica que comprenda una proteína, polipéptido o péptido que tenga actividad de unión a Zcytor17lig, según métodos conocidos para preparar composiciones farmacéuticamente útiles, en las que las proteínas terapéuticas se combinan con una mezcla con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Se dice que una composición es un "vehículo farmacéuticamente aceptable" si su administración puede ser tolerada por un paciente receptor. La solución salina estéril tamponada con fosfato es un ejemplo de un vehículo farmacéuticamente aceptable. Otros vehículos adecuados se conocen en la técnica. Véase, por ejemplo, Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 19a Edición (Mack Publishing Company 1995).
Para propósitos terapéuticos, las moléculas que tienen actividad de unión a Zcytor17lig y un vehículo farmacéuticamente aceptable se administran a un paciente en una cantidad terapéuticamente eficaz. Se dice que una combinación de una proteína, polipéptido o péptido que tiene actividad de unión a Zcytor17lig y un vehículo farmacéuticamente aceptable se administran en una "cantidad terapéuticamente eficaz", si la cantidad administrada es fisiológicamente significativa. Un agente es fisiológicamente significativo si su presencia da como resultado un cambio detectable en la fisiología de un paciente receptor. Por ejemplo, un agente utilizado para tratar la inflamación es fisiológicamente significativo si su presencia alivia por lo menos una porción de la respuesta inflamatoria.
Una composición farmacéutica que comprende Zcytor17lig (o una proteína de fusión o análogo de Zcytor17lig) se puede suministrar en forma líquida, en aerosol o en forma sólida. Las formas líquidas se ilustran mediante soluciones inyectables, aerosoles, gotitas, soluciones topológicas y suspensiones orales. Las formas sólidas ilustrativas incluyen cápsulas, comprimidos y formas de liberación controlada. Esta última forma se ilustra mediante bombas miniosmóticas e implantes (Bremer et al., Pharm. Biotechnol. 10: 239-(1997); Ranade, "Implants in Drug Delivery", en Drug Delivery Systems, Ranade y Hollinger (eds.), páginas 95-123 (CRC Press 1995); Bremer et al., "Protein Delivery with Infusion Pumps", en Protein Delivery: Physical Systems, Sanders y Hendren (eds.), páginas 239-254 (Plenum Press 1997); Yewey et al., "Delivery of Proteins from a Controlled Release Injectable Implant", en Protein Delivery: Physical Systems, Sanders y Hendren (eds.), páginas 93-117 (Plenum Press 1997)). Otras formas sólidas incluyen cremas, pastas, otras aplicaciones topológicas y similares.
Los liposomas proporcionan un medio para suministrar polipéptidos terapéuticos a un sujeto por vía intravenosa, intraperitoneal, intratecal, intramuscular, subcutánea o por administración oral, inhalación o administración intranasal. Los liposomas son vesículas microscópicas que consisten en una o más bicapas de lípidos que rodean compartimientos acuosos (véanse, en general, Bakker-Woudenberg et al., Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 12 (Supl. 1): S61 (1993), Kim, Drugs 46: 618 (1993), y Ranade, "Site-Specific Drug Delivery Using Liposomes as Carriers", en Drug Delivery Systems, Ranade y Hollinger (eds.), páginas 3-24 (CRC Press 1995)). Los liposomas son similares en composición a las membranas celulares y, como consecuencia, los liposomas se pueden administrar de modo seguro y son biodegradables. Dependiendo del método de preparación, los liposomas pueden ser unilamelares o multilamelares, y los liposomas pueden variar en tamaño con diámetros que oscilan entre 0,02 \mum a más de 10 \mum. Se puede encapsular en liposomas una diversidad de agentes: partición de agentes hidrófobos en las bicapas y agentes hidrófilos dentro del espacio(s) acuoso interno (véanse, por ejemplo, Machy et al., Liposomes In Cell Biology And Pharmacology (John Libbey 1987), y Ostro et al., American J. Hosp. Pharm. 46:1576 (1989)). Además, es posible controlar la disponibilidad terapéutica del agente encapsulado variando el tamaño de los liposomas, el número de bicapas, la composición de lípidos, como también las características de carga y superficie de los liposomas.
Los liposomas pueden adsorberse prácticamente por cualquier tipo de célula y luego liberar lentamente el agente encapsulado. Alternativamente, un liposoma absorbido puede ser endocitosado por las células que son fagocíticas. La endocitosis es seguida por degradación intralisosomal de lípodos liposomales y liberación de los agentes encapsulados (Scherphof et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 446:368 (1985)). Después de la administración intravenosa, los liposomas pequeños (0,1 a 1,0 \mum) típicamente son absorbidos por las células del sistema reticuloendotelial, ubicado principalmente en el hígado y el bazo, mientras que los liposomas más grandes que 3,0 \mum se depositan en el pulmón. Esta absorción preferencial de liposomas más pequeños por las células del sistema reticuloendotelial se ha utilizado para suministrar agentes quimioterapéuticos a macrófagos y a tumores del hígado.
El sistema reticuloendotelial se puede circunvenir por varios métodos, que incluyen saturación con grandes dosis de partículas de liposomas, o inactivación selectiva de macrófagos por medios farmacológicos (Claassen et al., Biochim. Biophys. Acta 802:428 (1984)). A su vez, la incorporación de fosfolípidos derivatizados con glucolípidos o polietilenglicol a las membranas de liposomas ha demostrado producir una reducción importante de la absorción por parte del sistema reticuloendotelial (Allen et al., Biochim. Biophys, Acta 1068:133 (1991); Allen et al., Biochim. Biophys. Acta 1150: 9 (1993)).
Los liposomas se pueden preparar también para direccionar células u órganos particulares, variando la composición de fosfolípidos o insertando receptores o ligandos a los liposomas. Por ejemplo, los liposomas, preparados con un alto contenido de un tensioactivo no iónico, se han utilizado para direccionar el hígado (Hayakawa et al., patente japonesa 04-244.018; Kato et al., Biol. Pharm. Bull 16:960 (1993)). Estas formulaciones se prepararon mezclando fosfatidilcolina de soja, \alpha-tocoferol y aceite de ricino hidrogenado y etoxilado (HCO-60) en metanol, concentrando la mezcla a vacío, y luego reconstituyendo la mezcla con agua. También se ha demostrado que una formulación liposomal de dipalmiloilfosfatidilcolina (DPPC) con una mezcla de esterilglucósido derivado de soja (SG) y colesterol (Ch) direcciona el hígado (Shimizu et al., Biol: Pharm. Bull 20:881 (1997)).
Alternativamente, se pueden unir diversos ligandos diana a la superficie del liposoma, como por ejemplo anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, carbohidratos, vitamina y proteínas de transporte. Por ejemplo, los liposomas se pueden modificar con derivados de galactosil-lípidos de tipo ramificado para direccionar receptores de asialoglucoproteína (galactosa), que se expresan exclusivamente en la superficie de las células hepáticas (Kato y Sugiyama, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst, 14: 287 (1997); Murahashi et al., Biol. Pharm. Bull. 20: 259 (1997)). De modo similar, Wu et al., Hepatology 27: 772 (1998), han demostrado que el marcado de liposomas con asialofetuina condujo a una semivida en plasma acortada y potenció en gran medida la absorción de los liposomas marcados con asialofetuina por los hepatocitos. Por otra parte, la acumulación hepática de liposomas que comprenden derivados de galactosil-lípidos de tipo ramificados se puede inhibir por preinyección de asialofetuina (Murahashi et al., Biol. Pharm. Bull. 20: 259 (1997)). Los liposomas de albúmina de suero humano poliaconitilado proveen otro planteamiento para direccionar liposomas hacia las células hepáticas (Kamps et al, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 94: 11681 (1997)). Además, Geho, et al. patente estadounidense No. 4.603.044, describen un sistema de administración de vesículas de liposomas dirigido a los hepatocitos, que tiene especificidad para receptores hepatobiliares asociados con las células metabólicas especializadas del hígado.
En un planteamiento más general para el direccionamiento de tejido, las células diana se premarcan con anticuerpos biotinilados específicos de un ligando expresado por la célula diana (Harasym et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 32: 99 (1998)). Después de la eliminación en el plasma del anticuerpo libre, se administran liposomas conjugados con estreptavidina. En otro planteamiento, los anticuerpos diana se dirigen directamente adheridos a los liposomas (Harasym et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 32: 99(1998)).
Los polipéptidos que tienen actividad de unión a Zcytor17lig se pueden encapsular dentro de liposomas usando técnicas convencionales de microencapsulación de proteínas (véanse, por ejemplo, Anderson et al., Infect. Immun. 31: 1099 (1981), Anderson et al., Cancer Res. 50: 1853 (1990), y Cohen et al., Biochim. Biophys. Acta 1063: 95 (1991), Alving et al. "Preparation and Use of Liposomes in Immunological Studies", en Liposome Technology, 2a Edición, Vol. m, Gregoriadis (ed.), página 317 (CRC Press 1993), Wassef et al., Meth, Enzymol 149: 124 (1987)). Como se observó anteriormente, los liposomas terapéuticamente útiles pueden contener una diversidad de componentes. Por ejemplo, los liposomas pueden comprender derivados de lípidos de polietilenglicol (Allen et al., Biochim. Biophys. Acta 1150: 9 (1993)).
\newpage
Las microesferas de polímeros degradables se han diseñado para mantener altos niveles sistémicos de proteínas terapéuticas. Las microesferas se preparan a partir de polímeros degradables tales como poli(láctido-co-glicólido) (PLG), polianhídridos, poli (ortoésteres), polímeros de etilvinilacetato no degradables, en los que las proteínas están atrapadas en el polímero (Gombotz y Pettit, Bioconjugate Chem. 6: 332 (1995); Ranade, "Role of Polymers in Drug Delivery", en Drug Delivery Systems, Ranade y Hollinger (eds.), páginas 51-93 (CRC Press 1995); Roskos y Maskiewicz, "Degradable Controlled Release Systems Useful for Protein Delivery", en Protein Delivery; Physical Systems, Sanders y Hendren (eds.), páginas 45-92 (Plenum Press 1997); Bartus et al., Science 281: 1161 (1998); Putney y Burke, Nature Biotechnology 16:153 (1998); Putney, Curr. Opin. Chem. Biol. 2: 548 (1998)). Las nanoesferas revestidas con polietilenglicol (PEG) también pueden proporcionar vehículos para la administración intravenosa de proteínas terapéuticas (véase, por ejemplo, Gref et al., Pharm. Biotechnol. 10: 167 (1997)).
La presente invención también contempla polipéptidos químicamente modificados que tienen actividad de zcytor17lig, como un polipéptido zcytor17lig, agonistas de zcytor17lig y antagonistas de Zcytor17lig, por ejemplo anticuerpos anti-zcytor17lig, en donde un polipéptido se une a un polímero, como se analizó anteriormente.
El experto en la técnica puede contemplar otras formas de dosificación, como se muestra, por ejemplo, por Ansel y Popovich, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 5^{ta} Edición (Lea & Febiger 1990), Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 19^{a} Edición (Mack Publishing Company 1995), y por Ranade y Hollinger, Drug Delivery Systems (CRC Press 1996).
Como ilustración, las composiciones farmacéuticas pueden ser provistas como un kit que comprende un envase que contiene un polipéptido zcytor17lig o un antagonista de zcytor17lig (p. ej., un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a un polipéptido Zcytor17lig).
Los polipéptidos terapéuticos pueden proporcionarse en la forma de una solución inyectable para una o múltiples dosis, o como un polvo estéril que se reconstituirá antes de la inyección. Alternativamente, dicho kit puede incluir un dispersador de polvo seco, un generador de aerosol líquido o un nebulizador para administración de un polipéptido terapéutico. Dicho kit puede además comprender información escrita sobre las indicaciones de uso de la composición farmacéutica. A su vez, dicha información puede incluir un enunciado de que la composición de Zcytor17lig está contraindicada en pacientes con hipersensibilidad conocida a Zcytor17lig.
Un aspecto de la presente invención provee un polipéptido aislado que comprende una secuencia de residuos aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a la secuencia de los residuos aminoácido seleccionados del grupo que consiste en: (a) el polipéptido que se muestra a partir de los residuos 38 (Val) a 152 (Leu), como se muestra en la SEC ID NO:2; (b) el polipéptido que se muestra a partir de los residuos 27 (Leu) a 164 (Thr), como se muestra en la SEC ID NO:2; (c) el polipéptido que se muestra a partir de los residuos 24 (Thr) a 164 (Thr), como se muestra en la SEC ID NO:2; y (d) el polipéptido que se muestra a partir de los residuos 1 (Met) a 164 (Thr), como se muestra en la SEC ID NO:2. En una realización, el polipéptido aislado es como se describió anteriormente, en donde los residuos aminoácido 73, 133 y 147 son cisteína. En otra realización, el polipéptido aislado es como se describió anteriormente, en donde el polipéptido se une al receptor de zcytor17, como se muestra en la SEC ID NO:5 o en la SEC ID NO:71. En otra realización, el polipéptido aislado comprende por lo menos 14 residuos aminoácido contiguos de la SEC NO:2 o de la SEC NO:11. En otra realización, el polipéptido aislado es como se describió anteriormente, en donde los residuos aminoácido se seleccionan del grupo que consiste en:(a) los residuos aminoácido 38-52 de la SEC ID NO:2; (b) los residuos aminoácido 83-98 de la SEC ID NO:2; (c) los residuos aminoácido 104-117 de la SEC ID NO:2; y (d) los residuos aminoácido 137-152 de la SEC ID NO:2.
Dentro de un segundo aspecto de la presente invención, se provee una proteína de fusión que comprende por lo menos cuatro polipéptidos, en donde el orden de los polipéptidos desde el término N hasta el término C es: un primer polipéptido que comprende una secuencia de 38-52 residuos aminoácido de la SEC ID NO:2; un primer espaciador de 6-27 residuos aminoácido; un segundo polipéptido que comprende una secuencia de residuos aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: (a) residuos aminoácido de hélice B de IL-2 de la SEC ID NO:168; (b) residuos 65-83 de hélice B de IL-4 de la SEC ID NO: 164; (c) residuos 73-86 de hélice B de IL-de la SEC ID NO:102; (d) residuos 72-81 de hélice B de GM-CSF de la SEC ID NO:166; y (e) residuos aminoácido 83-98 de la SEC ID NO:2; un segundo espaciador de 5-11 residuos aminoácido; un tercer polipéptido que comprende una secuencia de residuos aminoácido seleccionada del grupo que consiste en: (a) los residuos 102-116 de hélice C de IL-2 de la SEC ID NO:162; (b) los residuos 94-118 de hélice C de IL-4 de la SEC ID NO:164; (c) los residuos 91-103 de hélice C de IL-3 de la SEC ID NO:102; (d) los residuos 85-103 de hélice C de GM-CSF de la SEC ID NO: 166; y (e) los residuos aminoácido 104-117 de la SEC ID NO:2; un tercer espaciador de 3-29 residuos aminoácido; y un cuarto polipéptido que comprende una secuencia de residuos aminoácido seleccionada del grupo que consiste en: (a) los residuos 134-149 de hélice D de IL-2 de la SEC ID NO:162; (b) los residuos 123-141 de hélice D de IL-3 de la SEC ID NO:102; (c) los residuos 133-151 de hélice D de IL-4 de la SEC ID NO:164; (d) los residuos 120-131 de hélice D de GM-CSF de la SEC ID NO:166; y (e) los residuos aminoácido 137-152 de la SEC ID NO:2.
En un tercer aspecto de la presente invención se provee una proteína de fusión que comprende por lo menos cuatro polipéptidos, en donde el orden de los polipéptidos desde el término N hasta el término C son: un primer polipéptido que comprende una secuencia de residuos aminoácido seleccionada del grupo que consiste en: (a) los residuos 27-48 de hélice A de IL-2 de la SEC ID NO:162; (b) los residuos 30-42 de hélice A de IL-4 de la SEC ID NO:164; (c) los residuos 35-45 de hélice A de IL-3 de la SEC ID NO:102: (d) los residuos 30-44 de hélice A de GM-CSF de la SEC ID NO:166; y (e) los residuos aminoácido 38-52 de la SEC ID NO:2; un primer espaciador de 6-27 residuos aminoácido; un segundo polipéptido que comprende una secuencia de residuos aminoácido seleccionada del grupo que consiste en: (a) los residuos aminoácido de hélice B de IL-2 de la SEC NO:168; (b) los residuos 65-83 de hélice B de IL-4 de la SEC ID NO:164; (c) los residuos 73-86 de hélice B de IL-3 de la SEC ID NO:102; (d) los residuos 72-81 de hélice B de GM-CSF de la SEC ID NO:166; y (e) los residuos aminoácido 83-98 de la SEC ID NO:2; un segundo espaciador de 5-11 residuos aminoácido; un tercer polipéptido que comprende una secuencia de residuos aminoácido seleccionada del grupo que consiste en: (a) los residuos 102-116 de hélice C de IL-2 de la SEC ID NO:162; (b) los residuos 94-118 de hélice C de IL-4 de la SEC ID NO:164; (c) los residuos 91-103 de hélice C de IL-3 de la SEC ID NO:102; (d) los residuos 85-103 de hélice C de GM-CSF de la SEC ID NO:166; y (e) los residuos aminoácido 104-117 de la SEC ID NO:2; un tercer espaciador de 3-29 residuos aminoácido; y un cuarto polipéptido que comprende una secuencia de 137-152 residuos aminoácido de la SEC ID NO:2. En otra realización, la proteína de fusión es como se describió anteriormente, en donde el cuarto polipéptido comprende los residuos aminoácido 137-152 de la SEC ID NO:2.
En otro aspecto de la presente invención, se provee una molécula de polinucleótidos aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido ya descrito. En una realización, el polinucleótido aislado es como se describió anteriormente, en donde los nucleótidos se seleccionan del grupo que consiste en: (a) un polinucleótido como se muestra en la SEC ID NO: 1 del nucleótido 139 al nucleótido 483; (b) un polinucleótido como se muestra en la SEC ID NO: 1 del nucleótido 106 al nucleótido 519; (c) un polinucleótido como se muestra en la SEC ID NO: 1 del nucleótido 97 al nucleótido 519; y (d) un polinucleótido como se muestra en la SEC ID NO: 1 del nucleótido 28 al nucleótido 519.
En otro aspecto de la presente invención, se provee una molécula de polinucleótidos aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido descrito en esta memoria.
En otro aspecto de la presente invención, se provee un vector de expresión que comprende los siguientes elementos operativamente unidos: (a) un promotor de transcripción; (b) un segmento de DNA que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de residuos aminoácido seleccionada del grupo que consiste en: (i) los residuos aminoácido 38-52 de la SEC ID NO:2; (ii) los residuos aminoácido 83-98 de la SEC ID NO:2; (iii) los residuos aminoácido 104-117 de la SEC ID NO:2; (iv) los residuos aminoácido 137-152 de la SEC ID NO:2; y (v) sus combinaciones; y (c) un terminador de transcripción.
En otro aspecto de la presente invención, se provee un vector de expresión que comprende los siguientes elementos operativamente unidos: (a) un promotor de transcripción; (b) un segmento de DNA que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de residuos aminoácido que es por lo menos 90% idéntica a los residuos 38 (Val) a 152 (Leu), como se muestra en la SEC ID NO:2; y (c) un terminador de transcripción. En una realización, el vector de expresión es como se describió anteriormente, que comprende los siguientes elementos operativamente unidos: (a) un promotor de transcripción; (b) un segmento de DNA que codifica un polipéptido que comprende los residuos aminoácido 38 (Val) a 152 (Leu) de la SEC ID NO:2; y (c) un terminador de transcripción.
En otro aspecto de la presente invención, se provee una célula cultivada que comprende el vector de expresión anteriormente descrito.
En otro aspecto de la presente invención, se provee un método para producir una proteína, que comprende: cultivar una célula como la anteriormente descrita bajo condiciones en las que se exprese el segmento de DNA; y recuperar la proteína codificada por el segmento de DNA.
En otro aspecto de la presente invención, se provee un método para producir un anticuerpo para un polipéptido zcytor17lig, que comprende; inocular a un animal con un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en: (a) un polipéptido que consiste en 9 a 141 aminoácidos, en donde el polipéptido es idéntico a una secuencia contigua de residuos aminoácido en la SEC ID NO:2 del número de aminoácido 24 (Ser) al número de aminoácido 164 (Thr); un polipéptido como el anteriormente descrito; (c) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:2 de los aminoácidos número 38-52; (d) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:2 de los aminoácidos de número 83-98; (e) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:2 de los aminoácidos numero 104-117; (f) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:2 de los aminoácidos número 137-152; (g) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:2 de los aminoácidos número 38-152; (h) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:2 de los aminoácidos número 24-164; (c) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:11 de los aminoácidos número 38-52; (d) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:11 de los aminoácidos número 85-98; (e) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:11 de los aminoácidos número 104-118; (f) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:11 de los aminoácidos número 141-157; (g) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:11 de los aminoácidos número 38-157; (h) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:11 de los aminoácidos número 24-163; (i) un polipéptido que comprende un epítopo antigénico de acuerdo con un perfil de hidrofilicidad de Hopp/Woods de la SEC ID NO:2 o la SEC I NO 11, en donde el perfil se basa en una ventana deslizante de seis residuos. Los residuos G, S y T enterrados y los residuos H, Y y W expuestos se ignoraron; y en donde el polipéptido produce una respuesta inmunitaria en el animal para producir el anticuerpo; y aislar el anticuerpo del animal.
En otro aspecto de la presente invención, se provee un anticuerpo (p. ej, un anticuerpo neutralizador) producido por el método anteriormente descrito, en el que el anticuerpo se une a un polipéptido de la SEC ID NO:2 o la SEC ID NO:11. En una realización, el anticuerpo descrito anteriormente se une a un polipéptido que se muestra en la SEC ID NO:2 o en la SEC ID NO:11.
En otro aspecto de la presente invención, se provee un método para estimular una respuesta inmunitaria en un mamífero expuesto a un antígeno o patógeno, que comprende las etapas de: (I) determinar, directa o indirectamente, el nivel de antígeno o patógeno presente en dicho mamífero; (2) administrar una composición que comprende el polipéptido zcytor17lig en un vehículo farmacéuticamente aceptable; (3) determinar, directa o indirectamente, el nivel de antígeno o patógeno en dicho mamífero; y (4) comparar el nivel de antígeno o patógeno de la etapa 1 con el nivel de antígeno o patógeno de la etapa 3, en donde un cambio en el nivel es indicativo de la estimulación de una respuesta inmunitaria. En una realización, el método para estimular una respuesta inmunitaria en un mamífero ya descrito, comprende además: (5) re-administrar una composición que comprende el polipéptido zcytor17lig en un vehículo farmacéuticamente aceptable; (6) determinar, directa o indirectamente, el nivel de antígeno o patógeno en dicho mamífero; y; (7) comparar el nivel de antígeno o patógeno en la etapa 1 con el nivel de antígeno en la etapa 6, en donde un cambio en el nivel es indicativo de la estimulación de una respuesta inmunitaria.
En otro aspecto de la presente invención, se provee un método para expansión de células hematopoyéticas y progenitores de células hematopoyéticas, que comprende cultivar células de sangre periférica o médula ósea con una composición que comprende una cantidad de zcytor17lig suficiente para producir un incremento en el número de células linfoides en las células de sangre periférica o médula ósea, según lo comparado con las células de sangre periférica o médula ósea cultivadas en ausencia de zcytor17lig. En una realización, el método para expansión de células hematopoyéticas y progenitores de células hematopoyéticas es tal como se describió anteriormente, en donde las células hematopoyéticas y los progenitores de células hematopoyéticas son células linfoides. En otra realización, el método para expansión de células hematopoyéticas y progenitores de células hematopoyéticas es tal como se describió anteriormente, en donde las células linfoides son células monocíticas, macrófagos o células T.
En otro aspecto de la presente invención, se provee un método para estimular una respuesta inmunitaria en un mamífero expuesto a un antígeno o patógeno, que comprende: (1) determinar el nivel de un anticuerpo específico de antígenos o patógenos; (2) administrar una composición que comprende el polipéptido zcytor17lig en un vehículo farmacéuticamente aceptable; (3) determinar un nivel pos-administración del anticuerpo específico de antígenos o patógenos; (4) comparar el nivel de anticuerpo de la etapa (1) con el nivel de anticuerpo de la etapa (3), en donde un incremento en el nivel de anticuerpo es indicativo de estimulación de una respuesta inmunitaria.
En otro aspecto de la presente invención, se provee un método para detectar la presencia de ARN de zcytor17lig en una muestra biológica, que comprende las etapas de: (a) poner en contacto una sonda de ácido nucleico de zcytorl71ig bajo condiciones hibridantes con (i) moléculas de RNA de ensayo aisladas de la muestra biológica, o (ii) moléculas de ácido nucleico sintetizadas de las moléculas de RNA aisladas, en donde la sonda tiene una secuencia de nucleótidos que comprende o bien una porción de la secuencia de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico anteriormente descrita, o su complemento, y (b) detectar la formación de híbridos de la sonda de ácido nucleico y las moléculas de RNA de ensayo o las moléculas de ácido nucleico sintetizadas, en donde la presencia de híbridos indica la presencia de RNA de zcytor17lig en la muestra biológica.
En otro aspecto de la presente invención, se provee un método para detectar la presencia de zcytor17lig en una muestra biológica, que comprende las etapas de: (a) poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo como se describió anteriormente, en donde el contacto se realiza bajo condiciones que permiten la unión del anticuerpo o del fragmento de anticuerpo a la muestra biológica, y (b) detectar cualquiera del anticuerpo unido o el fragmento de anticuerpo unido.
En otro aspecto, la presente invención provee un método para destruir células cancerosas, que comprende obtener un tejido o muestra biológica ex vivo, que contiene las células cancerosas de un paciente, o identificar las células cancerosas in vivo; producir un polipéptido por el método descrito en la presente memoria; formular el polipéptido en un vehículo farmacéuticamente aceptable; y administrar al paciente o exponer las células cancerosas al polipéptido; en donde el polipéptido destruye las células. En una realización, el método para destruir las células cancerosas es como se describió anteriormente, en donde el polipéptido se conjuga además a una toxina. En una realización, el anticuerpo es como se describió anteriormente, en donde el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en: (a) anticuerpo policlonal, (b) anticuerpo monoclonal murino, (c) anticuerpo humanizado derivado de (b), (d) fragmento de anticuerpo, y (e) anticuerpo monoclonal humano.
En otro aspecto, la presente invención provee un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido que comprende una secuencia de residuos aminoácido seleccionada del grupo que consiste en: (a) el polipéptido que se muestra desde los residuos 38 (Val) a 152 (Leu), como se muestra en la SEC ID NO:2; (b) el polipéptido que se muestra desde los residuos 27 (Leu) a 164 (Thr), como se muestra en la SEC ID NO:2; (c) el polipéptido que se muestra desde los residuos 24 (Thr) a 164 (Thr), como se muestra en la SEC ID NO:2; y (d) el polipéptido que se muestra desde los residuos 1 (Met) a 164 (Thr), como se muestra en la SEC ID NO:2. En otra realización, el anticuerpo es como se describió anteriormente, en donde el anticuerpo comprende además un radionúcleo, enzima, sustrato, cofactor, marcador fluorescente, marcador quimiluminiscente, marcador peptídico, partícula magnética, fármaco o toxina.
En otro aspecto, la presente invención provee un método para inhibir la proliferación o diferenciación inducida por zcytor17lig de células hematopoyéticas y progenitores de células hematopoyéticas, que comprende cultivar células de sangre periférica o médula ósea con una composición que comprende una cantidad de un anticuerpo descrito precedentemente, suficiente para reducir la proliferación o diferenciación de las células hematopoyéticas en las células de sangre periférica o médula ósea, en comparación con células de sangre periférica o médula ósea cultivadas en ausencia del receptor soluble de citocina. En una realización, el método para inhibir la proliferación o diferenciación inducida por zcytor17lig de las células hematopoyéticas y progenitores de células hematopoyéticas es el anteriormente descrito, en donde las células hematopoyéticas y progenitores de células hematopoyéticas son células linfoides. En otra realización, el método para inhibir la proliferación o diferenciación inducida por zcytor17lig de células hematopoyéticas y progenitores de células hematopoyéticas es el anteriormente descrito, en donde las células linfoides son macrófagos o células T.
En otro aspecto, la presente invención provee un método para reducir la inflamación inducida por zcytor17lig, que comprende administrar a un mamífero que padece inflamación, una cantidad de una composición de un anticuerpo descrito en la presente memoria, suficiente para reducir la inflamación.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para suprimir una respuesta inflamatoria en un mamífero que padece inflamación, que comprende: (I) determinar el nivel de una molécula inflamatoria; (2) administrar una composición que comprende un anticuerpo como el que se describe en esta memoria en un vehículo farmacéuticamente aceptable; (3) determinar un nivel pos-administración de la molécula inflamatoria; (4) comparar el nivel de molécula inflamatoria de la etapa (1) con el nivel de la molécula inflamatoria de la etapa (3), en donde la falta de incremento o disminución del nivel de la molécula inflamatoria es indicativo de la supresión de una respuesta inflamatoria. En una realización, el anticuerpo es aquel descrito precedentemente, en donde el anticuerpo comprende además un radionúcleo, enzima, sustrato, cofactor, marcador fluorescente, marcador quimiluminiscente, marcador peptídico, partícula magnética, fármaco o toxina.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para inhibir la proliferación o diferenciación inducida por zcytor17lig de células hematopoyéticas y progenitores de células hematopoyéticas, que comprende cultivar células de sangre periférica o médula ósea con una composición que comprende una cantidad de un anticuerpo como el que se describe aquí, suficiente para reducir la proliferación o diferenciación de las células hematopoyéticas según lo comparado con células de sangre periférica o médula ósea cultivadas en ausencia del receptor soluble de citocinas. En una realización, el método para inhibir la proliferación o diferenciación inducida por zcytorl71ig de células hematopoyéticas y progenitores de células hematopoyéticas es el anteriormente descrito, en el que las células hematopoyéticas y progenitores de células hematopoyéticas son células linfoides. En otra realización, el método para inhibir la proliferación o diferenciación inducida por zcytor17lig de células hematopoyéticas y progenitores de células hematopoyéticas es aquel descrito previamente, en el que las células linfoides son macrófagos o células T.
En otro aspecto, la presente invención provee un método para reducir la inflamación inducida por zcytor17lig, que comprende administrar a un a mamífero que padece inflamación, una cantidad de una composición de un anticuerpo descrito en la presente memoria, suficiente para reducir la inflamación.
En otro aspecto de la presente invención, se provee un método para suprimir una respuesta inflamatoria en un mamífero que padece inflamación, que comprende: (1) determinar un nivel de una molécula inflamatoria; (2) administrar una composición que comprende un anticuerpo descrito en este documento, en un vehículo farmacéuticamente aceptable; (3) determinar un nivel pos-administración de la molécula inflamatoria; (4) comparar el nivel de la molécula inflamatoria de la etapa (1) con el nivel de la molécula inflamatoria de la etapa (3), en donde la falta de incremento o disminución del nivel de la molécula inflamatoria es indicativa de supresión de una respuesta inflamatoria.
En otro aspecto, la presente invención provee un método para tratar a un mamífero afectado por una enfermedad inflamatoria en la que el zcytor17lig desempeña una función, que comprende: administrar un antagonista de zcytor17lig al mamífero, de modo que la inflamación se reduzca, en donde el antagonista se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo o un polipéptido de unión que se une específicamente a un polipéptido o fragmento de polipéptido de zcytor17lig (SEC ID NO:2). En una realización, el método para tratar a un mamífero afectado por una enfermedad inflamatoria es aquel anteriormente descrito, en el que la enfermedad es una enfermedad inflamatoria crónica. En otra realización, el método para tratar a un mamífero afectado por una enfermedad inflamatoria es aquel descrito precedentemente, en el que la enfermedad es una enfermedad inflamatoria crónica seleccionada del grupo que consiste en: enfermedad inflamatoria de los intestinos; colitis ulcerosa; enfermedad de Crohn; dermatitis atópica; eczema; y psoriasis. En otra realización, el método para tratar a un mamífero afectado por una enfermedad inflamatoria es el descrito previamente, en el que la enfermedad es una enfermedad inflamatoria aguda. En otra realización, el método para tratar a un mamífero afectado por una enfermedad inflamatoria es el anteriormente descrito, en el que la enfermedad es una enfermedad inflamatoria aguda seleccionada del grupo que consiste en: endotoxemia; septicemia; síndrome de choque tóxico; y enfermedad infecciosa. En otra realización, el método para tratar a un mamífero afectado por una enfermedad inflamatoria es aquel ya descrito, en el que el anticuerpo comprende además un radionúcleo, enzima, sustrato, cofactor, marcador fluorescente, marcador quimiluminiscente, marcador peptídico, partícula magnética, fármaco o toxina.
En otro aspecto, la presente invención provee un método para detectar inflamación en un paciente, que comprende: obtener una muestra de tejido o biológica de un paciente; incubar la muestra de tejido o biológica con un anticuerpo descrito en la presente invención, bajo condiciones en las que el anticuerpo se una a su polipéptido complementario en la muestra de tejido o biológica; visualizar el anticuerpo unido en la muestra de tejido o biológica; y comparar los niveles de anticuerpo unido en la muestra de tejido o biológica del paciente con una muestra de tejido o biológica normal de control, en donde un incremento en el nivel de anticuerpo unido a la muestra de tejido o biológica del paciente, comparada con la muestra de tejido o biológica normal de control, es indicativo de inflamación en el paciente.
En otro aspecto, la presente invención provee un método para detectar inflamación en un paciente, que comprende: obtener una muestra biológica o de tejido de un paciente; marcar un polinucleótido que comprende por lo menos 14 nucleótidos contiguos de la SEC ID NO:1 o del complemento de la SEC ID NO:1; incubar la muestra de tejido o biológica bajo condiciones en las que el polinucleótido se hibride a la secuencia de polinucleótidos complementaria; visualizar el polinucleótido marcado en la muestra de tejido o biológica; y comparar el nivel de hibridación del polinucleótido marcado en la muestra de tejido o biológica del paciente con una muestra de tejido o biológica normal de control, en donde un incremento en la hibridación del polinucleótido marcada en la muestra de tejido o biológica del paciente, comparada con la muestra de tejido o biológica normal de control, es indicativo de inflamación en el paciente.
La invención se ilustra además mediante los siguientes ejemplos no limitativos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplos Ejemplo 1 Construcción de quimera del polipéptido MPL-zcytor17: Dominio TM y extracelular MPL condensado al dominio de señalización intracelular zcytor17
Se aisló el dominio extracelular 5' del receptor extracelular MPL de un plásmido que contenía el receptor MPL murino (plásmido PHZ1/MPL) por digestión con EcoRI y BamHI, generando un fragmento de 1164 bp. La digestión se realizó en un gel de agarosa al 1%, y el fragmento se aisló usando el kit de extracción de gel Qiaquick (Qiagen), según las instrucciones del fabricante. El resto del dominio extracelular MPL y el dominio transmembrana se generó usando PCR con los cebadores ZC6, 673 (SEC ID NO:13) y ZC29,082 (SEC ID NO:14). Las condiciones de reacción fueron las siguientes: 15 ciclos a 94ºC durante 1 min., 55ºC durante 1 min., 72ºC durante 2 min.; seguidos de 72ºC durante 7 min.; luego una impregnación a 4ºC. El producto PCR se pasó por gel de agarosa al 1% y se aisló el fragmento MPL de aproximadamente 4G0bp, usando el kit de extracción de gel Qiaquick^{TM} (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante.
Se aisló el dominio intracelular de zcytor17 humano de un plásmido que contenía cDNA del receptor zcytor17 (No 23/pCAP) usando PCR con los cebadores ZC29,083 (SEC ID NO:15) y ZC29,145 (SEC ID NO:16). La secuencia de polinucleótidos que corresponde a la secuencia codificante del receptor zcytor17 se muestra en la SEC ID NO:5. Las condiciones de reacción fueron las mismas que se mencionaron anteriormente. El producto PCR se pasó por gel de agarosa al 1% y se aisló el fragmento de zcytor17lig de aproximadamente 320 bp, usando el kit de extracción de gel Qiaquick, siguiendo las instrucciones del fabricante.
Cada uno de los fragmentos PCR aislados descritos anteriormente se mezcló en una relación volumétrica 1:1 y se usó en una reacción PCR, utilizando ZC6673 (SEC ID NO:13) y ZC29145 (SEC ID NO:16) para crear todo excepto la porción de MPL 5' de la quimera MPL-zcytor17. Las condiciones de reacción fueron las siguientes: 15 ciclos a 94ºC durante 1 min., 55ºC durante 1 min., 72ºC durante 2 min.; seguidos de 72ºC durante 7 min.; luego una impregnación a 4ºC. Todo el producto PCR se pasó por un gel de agarosa al 1%, y se aisló el fragmento de la quimera MPL-zcytor17 de aproximadamente 700bp, usando el kit de extracción de gel (Qiagen) según las instrucciones del fabricante. El fragmento de la quimera MPL-zcytor17 se digirió con BamHI (BRL) y XbaI (Boerhinger Mannheim), siguiendo las instrucciones del fabricante. Toda la digestión se pasó por un gel de agarosa al 1%, y la quimera MPL-zcytor17 escindida se aisló usando el kit de extracción de gel Qiaquick^{TM} (Qiagen) según las instrucciones del fabricante. La quimera MPL-zcytor17 escindida resultante, más el fragmento 5' MPL EcoRI/BamHI ya descrito, se insertaron en un vector de expresión para generar todo el receptor quimérico MPL-zcytor17, como se describe a continuación.
El vector de expresión receptor pZP-7 se digirió con EcoRI (BRL) y XbaI (BRL) según las instrucciones del fabricante, y gel purificado, como se describió antes. Este fragmento vector se combinó con la quimera de PCR MPL-zcytor17 escindida con EcoRI y XbaI anteriormente aislada, y el fragmento MPL 5' de EcoRI y BamHI anteriormente aislado en una reacción de ligadura. La ligadura se realizó usando Ligasa T4 (Epicentre Technologies), a temperatura ambiente durante 1 hora, según las instrucciones del fabricante. Se electroporó una muestra de la ligadura en células de E. coli electrocompetentes DH10B ElectroMAX^{TM} (25 \muF, 200\Omega, 1,8V). Los transformantes se dispusieron en placas de LB+Ampicilina y se cribaron colonias simples por miniprep (Qiagen) y digestión con EcoRI para controlar la quimera MPL-zcytor17. La digestión EcoRI de clones correctos proporciona un fragmento de aproximadamente 2kb. La confirmación de la secuencia de la quimera MPL-zcytor17 se realizó por análisis de secuencias. El inserto tuvo aproximadamente 3,1 kb, y fue de longitud total.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 2 Proliferación basada en la quimera MPL-zcytor17 en un ensayo BAF3 que utiliza Alamar Blue A. Construcción de células BaF3 que expresan la quimera MPL-zcytor17
Se mantuvo BaF3, una interleucina 3 (IL-3) dependiente de la línea celular prelinfoide derivada de médula ósea murina (Palacios y Steinmetz, Cell 41: 727-734, 1985; Mathey-Prevot et al., Mol. Cell. Biol. 6: 4133-4135, 1986), en medio completo (medio RPMI, JRH Bioscience Inc., Lenexa, KS) enriquecido con suero de ternero fetal inactivado por calor al 10%, 1-2 ng/ml IL-3 murina (mIL-3) (R & D, Minneapolis, MN), L-glutaMax-1^{TM} 2 mM (Gibco BRL), piruvato sódico 1 mM (Gibco BRL) y antibiótico PSN (GIBCO BRL)). Antes de la electroporación, se preparó el DNA plasmídico pZP-7/MPL-zcytor17 (Ejemplo 1) y se purificó usando un kit Qiagen Maxi Prep (Qiagen), según las instrucciones del fabricante. Las células BaF3 para electroporación se lavaron dos veces en medios RPMI y luego se resuspendieron en medios RPMI a una densidad celular de 10^{7} células/ml. Se mezcló 1 ml de células BaF3 resuspendidas con 30 \mug del DNA plasmídico pZP-7/MPL-zcytor17 y se transfirió a cámaras de electroporación separadas (GIBCO BRL). A temperatura ambiente, las células recibieron choques de 5x.1 mseg a 800 voltios y luego 5x2 ms choques a 600 voltios, suministrados por un aparato de electroporación (Cyto-Pulse). Alternativamente, las células se electroporaron con dos pulsos en serie (800 \muFAD/300 V; seguidos de 1180 \muFAD/300 V) suministrados por un aparato de electroporación Cell-Porator (GibcoBRL). Las células electroporadas se transfirieron a 50 ml de medio completo y se dispusieron en una incubadora durante 15-24 horas (37ºC, 5% CO_{2}). Luego se añadió selección de Geneticin^{TM} (Gibco) (1 mg/ml G418) a las células en un matraz T-162 para aislar la combinación resistente a G418. Las combinaciones de las células BaF3 transfectadas, en lo sucesivo denominadas células BaF3/MPL-zcytor17, se ensayaron para capacidad de señalización, como se describe a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
B. Prueba de la capacidad de señalización de las células BaB3/MPL-zcytorl7 usando un ensayo de proliferación Alamar Blue
Se centrifugaron células BaF3/MPL-zcytor17 y se lavaron en medio completo, descrito anteriormente, pero sin mIL-3 (en adelante denominado "medio libre de mIL-3"). Las células se centrifugaron y lavaron 3 veces para asegurar la eliminación de mIL-3. Las células se contaron luego en un hemacitómetro. Se dispusieron en placas con un formato de 96 pocillos a 5000 células por pocillo, en un volumen de 100 \mul por pocillo, usando el medio libre de mIL-3.
La proliferación de las células BaF3/MPL-zcytorl7 se evaluó usando trombopoyetina murina (mTPO) diluida con medio libre de mIL-3 hasta concentraciones de 200 ng/ml, 100 ng/ml, 50 ng/ml, 25 ng/ml, 12,5 ng/ml, 6,25 ng/ml, 3,1 ng/ml, 1,5 ng/ml. Se añadieron 100 microlitos del mTPO diluido a las células BaF3/MPL-zcytor17. El volumen de ensayo total fue 200 \mul. Los controles negativos se efectuaron en paralelo, usando solamente medio libre de mIL-3, sin la adición de mTPO. Las placas de ensayo se incubaron a 37ºC, 5% CO_{2} durante 3 días, momento en el cual se añadió Alamar Blue (Accumed, Chicago, IL) a 20 \mul/pocillo. Alamar Blue proporciona una lectura fluorométrica basada en la actividad metabólica de las células y, por lo tanto, es una medición directa de la proliferación celular en comparación con un control negativo. Las placas se incubaron nuevamente a 37ºC, 5% CO_{2} durante 24 horas. Se leyeron en la lectora de placas Fmax^{TM} (Molecular Devices Sunnyvale, CA), usando el programa SoftMax^{TM} Pro, a longitudes de onda de 544 (Excitación) y 590 (Emisión), o en la lectora de placas Wallac Victor 2 (PerkinElmer Life Sciences, Boston, MA).
Los resultados confirmaron la capacidad de señalización de la porción intracelular del receptor zcytor17, ya que la trombopoyetina indujo la proliferación a aproximadamente 9-13 veces sobre el fondo a concentraciones de mTPO de 50 ng/ml y más.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 3 Construcción del vector de expresión que expresa zcytor17: pZp7pX/zcytor17 de longitud total A. Clonación de cDNA de zcytor17 de longitud total para expresión
Para obtener cDNA de zcytor17 de longitud total, se aislaron los productos PCR 5' y 3' y se unieron usando un sitio PstI interno. Los cebadores PCR se diseñaron usando la secuencia de nucleótidos de SEC ID NO:4 e incluyen los sitios de restricción BamHI y XhoI para propósitos de clonación.
Se generó un producto PCR 5' usando una genoteca de DNA WI-38 como molde, y los oligonucleótidos ZC29,359 (SEC ID NO:18) y ZC27,899 (SEC ID NO:19) como cebadores. WI-38 es una genoteca de cDNA interna de una línea celular de pulmón embrionario humano (ATCC CRL-2221). Esta reacción PCR 5' se llevó a cabo de la siguiente manera: 30 ciclos a 94ºC durante 1 minuto, 65ºC durante 1 minuto, 72ºC durante 2 minutos, luego 72ºC durante 7 minutos; impregnación a 10ºC. La reacción PCR utilizó aproximadamente 3 \mug de plásmido preparado a partir de la genoteca cDNA, 20 pmoles de cada oligonucleótido y cinco unidades de DNA polimerasa PWO (Roche). Aproximadamente 90% del producto PCR 5' fue etanol precipitado, digerido con BamHI y PstI, y gel purificado en gel de agarosa al 1,0%. La banda de aproximadamente 600 bp se cortó y se usó para ligadura al vector de clonación pUC18 digerido con BamHI y PstI. Los transformantes resultantes se secuenciaron para confirmar la secuencia de cDNA de zcytor17. Para uno de estos transformantes, se preparó DNA plasmídico y se digirió con BamHI y PstI. La banda de aproximadamente 600 bp resultante se purificó con gel y se usó para una ligadura para formar un cDNA de longitud total.
Se generó un producto PCR 3' usando una genoteca de cDNA interna de testículos humanos como molde y los oligonucleótidos ZC27,895 (SEC ID NO:20) y ZC29,122 (SEC ID NO:21) como cebadores. Esta reacción PCR 3' se llevó a cabo de la siguiente manera: 30 ciclos a 94º C durante 45 segundos, 65ºC durante 45 segundos, 72ºC durante 2 minutos, luego 72ºC durante 7 minutos; 10ºC impregnación. La reacción PCR 3' completa se purificó con gel en un gel de agarosa al 1,0% y se cortó la banda principal de 1500 bp. Esta banda se clonó en el vector PCR Blunt II TOPO usando el kit Zeroblunt TOPO (Invitrogen). Los transformantes resultantes se secuenciaron para confirmar el cDNA de zcytor17. Para uno de estos transformantes, se preparó DNA plasmídico y se digirió con PstI y XhoI. La banda de aproximadamente 1500 bp resultante se purificó con gel. Se realizó una ligadura de tres partes con BamHI 5' hacia el fragmento PstI anterior, PstI 3' hacia el fragmento XhoI, y el vector de expresión pZp7pX se digirió con BamHI y XhoI. Este plásmido pZp7pX generado que contenía un cDNA de longitud total para zcytorI7 (SEC ID NO:4), se designó como pZp7p/zcytor17. El cDNA de zcytor17 de longitud total en pZp7p/zcytor17 tiene una mutación silenciosa que cambia T a G en la posición 1888 de la SEC ID NO:4 (que codifica un residuo Gly en el residuo 464 de la SEC ID NO:5). Ya que esta mutación fue silenciosa, el cDNA de zcytor17 en pZp7p/zcytor17 codifica el polipéptido, como se muestra en la SEC ID NO:5. El plásmido pZp7pX es un vector de expresión mamífero que contiene un casete de expresión que tiene el promotor de CMV, intrón A, sitios de restricción múltiples para inserción de secuencias codificantes, y un terminador de la hormona de crecimiento humana. El plásmido también tiene un origen de replicación de E. coli, una unidad de expresión de marcador seleccionable de mamífero que tiene un promotor SV40, potenciador y origen de replicación, un gen de resistencia a puromicina y el terminador
SV40.
\vskip1.000000\baselineskip
B. Construcción del vector de expresión que expresa WSX-1 de longitud total
Se aisló todo el receptor WSX (SEC ID NO:9) de un plásmido que contiene cDNA del receptor WSX-1 (SEC ID NO:8) (patente estadounidense No. 5.925.735). Se digirió DNA plasmídico de hWSX-1/pBluescript SK(+) (Stratagene, La Jolla, CA) con EcoRI y XhoI para generar un fragmento de 1075 bp, y también se digirió con XhoI y XbaI para generar un fragmento de 900 bp. Ambas digestiones se realizaron en un gel de agarosa al 1%, y se aislaron los fragmentos de WSX-1 escindidos.
El vector de expresión receptor pZp7Z se digirió con EcoRI y XbaI, y se purificó con gel, como se describió previamente. Este fragmento vector se combinó con dos fragmentos de zcytor17 escindidos aislados anteriormente en una reacción de ligadura, usando Ligasa T4 (BRL). La ligadura se incubó a temperatura ambiente durante una noche. Se electroporó una muestra de la ligadura en células de E. coli electrocompetentes DH10B electroMAX^{TM} (25 \muF, 200\Omega, 2.3V). Se desarrollaron seis colonias en cultivo y se preparó DNA y se digirió para confirmar el correcto inserto de longitud total WSX-1 de 2,0 kb. El plásmido resultante es pZPZ7Z/WSX-l.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 4 Proliferación basada en Zcytor17 en un ensayo de BAF3 usando Alamar Blue A. Construcción de células BaF3 que expresan el receptor zcytor17, el receptor WSX-1 y OSMR
Se construyeron células BaF3 que expresan el receptor zcytor17 de longitud total, según el Ejemplo 2A anterior, usando 30 \mug del vector de expresión de zcytor17 descrito en el Ejemplo 3A. Una excepción es que en lugar de selección de Geneticina, se añadieron 2 \mug/ml de Puromicina (ClonTech) a las células transfectadas en un matraz de T-162 para aislar la mezcla resistente a puromicina. Las células BaF3 que expresan mRNA del receptor zcytor17 se designaron BaF3/zcytor17. Para obtener clones, se contaron células Baf3/zcytorl7 en un hemacitómetro y se dispusieron en placas a 1 célula/pocillo, 0,5 célula/pocillo, 0,1 célula/pocillo y 0.01 célula/pocillo en placas de 96 pocillos. Se extrapolaron 15 clones a matraces T75, y se ensayaron cinco clones para expresión de zcytor17. Se aisló RNA total de los sedimentos celulares usando un kit de aislamiento de RNA total S.N.A.P.^{TM} (InVitrogen). Se sintetizó cDNA de la primera cadena, usando el kit de RT-PCR de primera cadena proSTAR^{TM}, y luego se realizó PCR con los cebadores específicos de zcytor17 ZC29,180 (SEC ID NO:22) y ZC29,122 (SEC ID NO:23) para cribar los clones para expresión de zcytor17. Se eligió un clon, BaF3/zcytorl7#15, para expandirse y transfectarse con el vector de expresión
WSX-1.
Se construyeron células BaF3 que expresan zcytor17 y WSX-1 de longitud total como en el Ejemplo 2A anterior, usando 30 \mug del vector de expresión de WSX-1, WSX-1/pZp7Z (Ejemplo 3B), para electroporar las células BaF3/zcytor17#15. Una excepción es que en lugar de selección de Geneticina, se añadieron 200 \mug/ml de Zeocina (InVitrogen) a las células transfectadas en un matraz T-162 para aislar la mezcla resistente a zeocina. Las células BaF3 que expresan zcytor17 y WSX-1 se designaron BaF3/zcytorl7/hWSX-l. Para obtener clones, se dispusieron en placas mezclas de Baf3/zcytor17/hWSX-1 a una dilución limitante en placas de 96 pocillos. Los clones resultantes se expandieron y se aisló RNA total, usando un kit de aislamiento de RNA total S.N.A.P.^{TM} (InVitrogen). El cDNA de la primera cadena se sintetizó usando el kit de RT-PCR de primera cadena proSTAR^{TM}, y luego se usó PCR con los cebadores específicos de WSX-1 ZC9791 (SEC ID NO:24) y ZC9793 (SEC ID NO:25) para cribar los clones para expresión de WSX-1. Se eligió un clon, BaF3/zcytorl7/hWSX-l#5, para expandirse más y transfectarse con el vector de expresión OSMRbeta.
Se construyeron células BaF3 que expresan zcytor17, WSX-1 y OSMRbeta de longitud total, según el Ejemplo 2A anterior, usando 30 ug del vector de expresión de OSMRbeta, OSMR/pZp7NX, como se describe en el Ejemplo 29, para electroporar las células BaF3/zcytor17/hWSX-1#5. Las células BaF3 que expresan zcytor17, WSX-1 y mRNA de OSMRbeta se designaron BaF3/zcytor17/WSX-l/OSMR. Para obtener clones, se dispusieron mezclas de células BaF3/zcytor17/WSX-1/OSMRbeta a una dilución limitante en placas de 96 pocillos. Se expandieron clones individuales y se aisló RNA total usando un kit de aislamiento de RNA total S.N.A.P.^{TM} (InVitrogen). Se sintetizó cDNA de la primera cadena, usando el kit de RT-PCR de primera cadena proSTAR^{TM}, y luego se usó PCR con los cebadores específicos de OSMRbeta, ZC40109 (SEC ID NO:26) y ZC40112 (SEC ID NO:27), para cribar los clones para expresión de zcytor17, WSX-1 y OSMR. Se seleccionó un clon, BaF3/zcytor17/WSX-l/OSMR#5, y estas células se usaron para cribar zcytor17lig, como se describe a continuación en los Ejemplos 5 y 6.
\vskip1.000000\baselineskip
B. Construcción de células BaF3 que expresan el receptor zcytor17 y OSMR
Se construyeron células BaF3 que expresan el receptor zcytor17 de longitud total, según el Ejemplo 2A anterior, usando 30 \mug del vector de expresión de zcytor17, descrito en el Ejemplo 3A. Una excepción es que en lugar de selección de Geneticina, se añadieron 2 \mug/ml de Puromicina (ClonTech) a las células transfectadas en un matraz T-162 para aislar la mezcla resistente a puromicina. Las células BaF3 que expresan mRNA del receptor zcytor17 se designaron BaF3/zcytor17. Para obtener clones, se dispusieron mezclas de células Baf3/zcytor17 en dilución limitante en placas de 96 pocillos. Estos clones se expandieron en cultivo y se aisló RNA total, usando un kit de aislamiento de RNA total S.N.A.P.^{TM} (InVitrogen). Se sintetizó cDNA de la primera cadena, usando el kit RT-PCR de primera cadena proSTAR^{TM}, y luego se usó PCR para cribar los clones de expresión de zcytor17. Se eligió un clon, BaF3/zcytor17 #15, para expandirse y transfectarse con el vector de expresión OSMRbeta.
Se construyeron células BaF3 que expresan zcytor17 y OSMRbeta de longitud total, según el Ejemplo 2A anterior, usando 30 ug del vector de expresión de OSMRbeta, OSMR/pZp7NX (Ejemplo 29) para electroporar las células BaF3/zcytor17#15. Las células BaF3 que expresan 2cytor17 y mRNA de OSMRbeta se designaron BaF3/zcytor17/
OSMR. Estas células se utilizaron para cribar zcytor17lig, como se describe a continuación en el Ejemplo 5.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 5 Cribado de zcytor17lig que utiliza células BaP3/Zcytorl7/WSX-l/OSMRbeta, usando un ensayo de proliferación con Alamar Blue A. Activación de células CCRF-CEM y CCRF-HSB2 para ensayar la presencia de zcytor17lig
Se obtuvieron células CCRF-CEM y CCRF-HSB2 de ATCC, y se estimularon en cultivo para producir medio condicionado para ensayar la presencia de la actividad de zcytor17lig, como se describe a continuación. Las células en suspensión se sembraron a 2 x 10^{5} células/ml o 5 x 10^{5} células/ml en medio RPMI-1640 enriquecido con PBS al 10%, L-glutamina 2 mM (GibcoBRL), IX PSN (GibcoBRL), y se activaron con 10 ng/ml de Forbol-12-miristato-l3-acetato (PMA) (Calbiochem, San Diego, CA) y 0,5 ug/ml de Ionomycin^{TM} (Calbiochem) durante 24 o 48 horas. El sobrenadante de las células estimuladas se usó para ensayar la proliferación de células BaF3/zcytor17/WSX-1/OSMRbeta o células BaF3/zcytor17/OSMRbeta, como se describe a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
B. Cribado de zcytor17lig que utiliza células BaF3/Zcytor17/WSX-l/Q5MRbeta o células BaF3/2cytor17/OSMRbeta, usando un ensayo de proliferación con Alamar Blue
Se centrifugaron células BaF3/zcytor17/WSX-l/OSMRbeta o células BaF3/zcytor17/OSMRbeta y se lavaron en medio libre de mIL-3. Las células se centrifugaron, se lavaron 3 veces para asegurar la eliminación de mIL-3 y se contaron en un hemacitómetro. Las células se dispusieron en una placa de 96 pocillos a 5000 células por pocillo en un volumen de 100 \mul por pocillo, usando el medio libre de mIL-3.
La proliferación de las células BaF3/zcytor17/WSX-1/OSMRbeta o las células BaF3/zcytor17/OSMRbeta se evaluó usando medio condicionado de células CCRFCEM y CCRF-HSB2 activadas (véase el Ejemplo 5A). El medio condicionado se diluyó con medio libre de mIL-3 hasta concentraciones de 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,125%, 1,5%, 0,75% y 0,375%. Se añadieron 100 microlitos del medio condicionado diluido a las células BaF3/zcytor17AVSX-1/OSMRbeta o a las células BaF3/zcytorl7/OSMRbeta. El volumen de ensayo total fue de 200 \mul. Las placas de ensayo se incubaron a 37ºC, 5% CO_{2} durante 3-5 días, tras lo cual se añadió Alamar Blue (Accumed, Chicago, EL) a placas a 20 \mul/pocillo. Las placas se incubaron nuevamente a 37ºC, 5% CO2 durante 24 horas. Se leyeron en la lectora de placas Fmax^{TM} (Molecular devices), como se describió precedentemente (Ejemplo 2).
Los resultados confirmaron la respuesta proliferativa de las células BaF3/zcytor17/WSX-1/OSMRbeta o las células BaF3/zcytor17/OSMRbeta a un factor presente en el medio condicionado de CCRF-CEM y CCRF-HSB2 activado. La respuesta, según lo medido, fue aproximadamente 10 veces sobre el fondo a la concentración de 25%. Las células BaF3 no transfectadas no proliferaron en respuesta a este factor, ni tampoco las células BaF3 transfectadas con zcytor17 y WSX-1 (células BaF3/zcytor17/WXS-1), lo que demuestra que este factor es específico de los receptores Zcytorl7/OSMRbeta o zcytor17/OSMRbeta/WSX-1. Además, el receptor soluble de zcytor17 disminuyó esta actividad proliferativa del zcytorl71ig en las células BaF3/zcytor17/WSX-1/OSMRbeta (véase, Ejemplo 11). Se esperan resultados similares en células BaF3/zcytor17/OSMRbeta.
\vskip1.000000\baselineskip
C. Fuente primaria humana utilizada para aislar zcytor17lig
Se extrajeron 100 ml de sangre de cada uno de seis donantes. La sangre se extrajo usando tubos Vacutainer de 10X 10 ml que contenían heparina. La sangre de los seis donantes se combinó (600 ml), se diluyó 1:1 en PBS y se separó usando Ficoll-Paque® PLUS (Pharmacia Biotech). El rendimiento de células humanas primarias aisladas, después de la separación en el gradiente ficoll, fue 1,2X10^{9} células.
Las células se suspendieron en 9,6 ml de tampón MACS (PBS, EDTA al 0,5%, EDTA 2 mM). Se eliminaron 1,6 ml de suspensión celular, y se añadieron 0,4 ml de microesferas de CD3 (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). La mezcla se incubó durante 15 min. a 4ºC. Estas células marcadas con esferas de CD3 se lavaron con 30 ml de tampón MACS y luego se resuspendieron en 2 ml de tampón MACS.
Se preparó una columna VS+ (Miltenyi) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La columna VS+ se dispuso luego en un campo magnético VarioMACS^{TM} (Miltenyi). La columna se equilibró con 5 ml de tampón MACS. Las células humanas primarias aisladas se aplicaron luego a la columna. Las células CD3 negativas se dejaron pasar. La columna se enjuagó con 9 ml (3 X 3 ml) de tampón MACS. La columna se quitó luego del imán y se dispuso sobre un tubo falcon de 15 ml. Se eluyeron células CD3+ añadiendo 5 ml de tampón MACS a la columna, y las células unidas se lavaron usando el pistón provisto por el fabricante. La incubación de las células con las esferas magnéticas CD3, los lavados y las etapas de la columna VS+ (desde incubación hasta elución) se repitieron cinco veces más. Se combinaron las fracciones de CD3+ resultantes de las seis separaciones de las columnas. El rendimiento de las células humanas seleccionadas de CD3+ fue 3X10^{8} células totales.
Se eliminó una muestra de las células humanas seleccionadas para CD3+ combinadas para tinte y clasificación en un clasificador celular de anticuerpos fluorescente (FACS) para evaluar su pureza. Las células seleccionadas humanas CD3+ fueron 91% células CD3+.
Las células seleccionadas para CD3+ humanas se activaron incubando en RPMI + FBS al 5%+ PMA 10 ng/ml y Ionomicina 0,5 \mug/ml (Calbiochem) durante 13 horas a 37ºC. El sobrenadante de estas células humanas seleccionadas para CD3+ se ensayó para actividad de zcytor17lig, como se describe a continuación. Además las células humanas seleccionadas para CD3+ activadas se usaron para preparar una genoteca de cDNA, como se describe en el Ejemplo 6 a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
D. Sobrenadante de ensayo de células humanas seleccionadas para CD3+ activadas para zcytor17lig, usando células BaF3/Zcytor17/WSX-1/OSMRbeta y un ensayo de proliferación de Alamar Blue
Se centrifugaron células BaF3/zcytor17/WSX-1/OSMRbeta o células BaF3/zcytor17/OSMRbeta y se lavaron en medio libre de mIL-3. Las células se centrifugaron y lavaron 3 veces para asegurar la eliminación de mIL-3. Las células se contaron en un hemacitómetro y se dispusieron en placas de 96 pocillos a 5000 células por pocillo, en un volumen de 100 \mul por pocillo, usando el medio libre de mIL-3.
La proliferación de las células BaF3/zxytor17/WSX-1/OSMRbeta o las células BaF3/zcytor17/OSMRbeta se evaluó usando medio condicionado de células humanas seleccionadas para CD3+ activadas (véase el Ejemplo 5C) diluidas con medio libre de mIL-3 hasta concentraciones de 25%, 12,5%, 6,25%, 3,125%, 1,5%, 0,75%, 0,375% y 0,187%. Se añadieron 100 microlitos del medio condicionado diluido a las células BaF3/zcytor17AVSX-1/OSMRbeta o a las células BaF3/zcytor17/OSMRbeta. El volumen de ensayo total fue 200 \mul. Las placas de ensayo se incubaron y ensayaron como se describe en el Ejemplo 5B.
Los resultados confirmaron la respuesta proliferativa de las células BaF3/zcytor17/WSX-1/OSMRbeta o las células BaF3/zcytor17/OSMRbeta a un factor presente en el medio condicionado de células humanas seleccionadas para CD3+ activadas. La respuesta, según lo medido, fue aproximadamente 15 veces sobre el fondo en la concentración de 25%. Las células BaF3 no transfectadas no proliferaron en respuesta a este factor, ni las células BaF3 transfectadas con zcytor17 y WSX-1 (células BaF3/zcytor17/WXS-1), lo que demuestra que este factor fue específico de los receptores Zcytor17/OSMRbeta o zcytor17/OSMRbeta/WSX-1.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 6 Clonación de zcytor17lig humano de una genoteca de células seleccionadas para CD+ humanas
El cribado de una genoteca de cDNA de células seleccionadas para CD3+ activadas humanas reveló un cDNA aislado que es un nuevo miembro de la familia de citocinas de cuatro hélices. Este cDNA codificó el zcytor17lig. El cDNA se identificó cribando la actividad del zcytor17lig, usando los receptores zcytor17/WSX-1/OSM.
\vskip1.000000\baselineskip
A. Vector para construcción de la genoteca seleccionada para CD3+
El vector para la construcción de la genoteca seleccionada para CD3+ fue pZP7NX. El vector p2P7NX se construyó de la siguiente manera: la región codificante para el marcador selectivo DHFR en el vector pZP7 se eliminó por digestión de DNA con las enzimas de restricción NcoI y PstI (Boehringer Mannheim). El DNA digerido se pasó por un gel de agarosa al 1%, se cortó y se purificó en gel, usando el kit de extracción de gel Qiagen (Qiagen) según las instrucciones del fabricante. Se amplió un fragmento de DNA que representa la región codificante del marcador selectivo de Zeocina, por el método PCR con los cebadores ZC13,946 (SEC ID NO:28) y ZCI3.945 (SEC ID NO:29), y pZeoSV2(+) como molde. Hay sitios de restricción adicionales PstI y Bell en el cebador ZC13,946 (SEC ID NO:28), y sitios adicionales NcoI y SfuI en el cebador ZC13,945 (SEC ID NO:29). El fragmento de PCR se cortó con las enzimas de restricción PstI y NcoI, y se clonó en el vector pZP7 preparado escindiendo con las mismas dos enzimas y posterior purificación con gel. A este vector se lo denominó pZP7Z. Luego, la región codificante de Zeocina se eliminó por digestión de DNA del vector pZP7Z con las enzimas de restricción BclI y SfuI. El DNA digerido se pasó por un gel de agarosa al 1%, se cortó y se purificó en gel, y luego se ligó con un fragmento de DNA de corte de la región codificante de Neomicina del vector pZem228 (depositado en The American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA; Depósito ATCC No. 69446) con las mismas enzimas de restricción (BelI y SfuI).
Este nuevo vector se denominó pZP7N, en el cual la región codificante para el marcador selectivo DHFR se reemplazó con la región codificante para un marcador selectivo de Neomicina del vector pZem228. Un fragmento rellenador que incluía un sitio XhoI se añadió a pZP7N para crear un vector adecuado para clonación de alta eficacia direccional de cDNA; a este nuevo vector se lo denominó pZP7NX. Para preparar el vector para cDNA, se digirieron 20 \mug de pZP7NX con 20 unidades de EcoRI (Life Technologies Gaithersberg, MD) y 20 unidades de XhoI (Boehringer Mannheim Indianapolis, IN) durante 5 horas a 37ºC, luego 68ºC durante 15 minutos. La digestión se pasó luego por un gel IXTAE de agarosa de baja fusión al 0,8% para separar el rellenador del vector. La banda del vector se cortó y digirió con "beta-Agarase" (New England Biolabs, Beverly, MA) siguiendo las recomendaciones del fabricante. Después de la precipitación de etanol, el vector digerido se resuspendió en agua hasta 45 ng/ml en preparación para ligadura de una genoteca de cDNA seleccionada con CD3+ descrita a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
B. Preparación de una genoteca de cDNA de células seleccionadas para CD3+ activadas humanas
Aproximadamente 1,5X10^{8} células seleccionadas para CD3+ primarias humanas estimuladas en ionomicina/PMA se aislaron por centrifugación después de cultivar a 37ºC durante 13 horas (Ejemplo 5C). Se aisló RNA total de sedimento celular, usando el kit "RNeasy Midi" de Qiagen, Inc. (Valencia, CA). Se aisló mRNA de 225 microgramos de RNA total, usando el "kit de purificación de mRNA MPG" de CPG Inc. (Lincoln Park, NJ). Se aislaron 3,4 microgramos de mRNA y se convirtieron a cDNA bicatenario, usando el seguimiento procedimiento.
Se sintetizó cDNA de la primera cadena de células seleccionadas para CD3+ humanas estimuladas, de la siguiente manera. Se mezclaron 9 \mul de oligo d(T)-seleccionado poly(A) CD3+ RNA a una concentración de 0,34 \mug/\mul y 1,0 \mul de 1 \mug/\mul de cebador de primera cadena ZC18,698 (SEC ID NO:30) que contenía un sitio de restricción XhoI, y se calentaron a 65ºC durante 4 minutos, y se enfriaron en hielo. La síntesis de cDNA de primera cadena se inició por adición de 9 \mul de tampón de primera cadena (5x tampón SUPERSCRIPT®; (Life Technologies), 4 \mul de 100 mM ditiotreitol y 2 \mul de una solución de trifosfato desoxinucleotídico que contenía 10 mM cada una de dATP, dGTP, dTTP y 5-metil-dCTP (Pharmacia Biotech Inc.) a la mezcla de RNA-cebador. La mezcla de reacción se incubó a 45ºC durante 4 minutos y se le añadieron 8 \mul de 200 U/\mul SuperscriptII®, RNase H-transcriptasa inversa (Life technologies). La reacción se incubó a 45ºC durante 45 minutos, seguida de una rampa de incubación de 1ºC cada 2 minutos hasta 50ºC, en donde la reacción se mantuvo durante 10 minutos. Para desnaturalizar cualquier estructura secundaria y permitir la extensión adicional del cDNA, la reacción se calentó luego hasta 70º C durante 2 minutos, luego se disminuyó hasta 55º C durante 4, tras lo cual se añadieron 2 \mul de SuperscriptII® RT y se incubó durante 15 minutos más, y luego se subió gradualmente hasta 70ºC 1 minuto/1ºC. Los nucleótidos no incorporados se eliminaron del cDNA precipitando dos veces en presencia de 2 \mug de vehículo de glucógeno, acetato de amonio 2,0 M y 2,5 volúmenes de etanol, seguidos de un lavado de 100 \mul con etanol al 70%. El cDNA se resuspendió en 98 \mul de agua en una síntesis de la segunda cadena. Se realizó la síntesis de la segunda cadena en el cDNA de la primera cadena que promocionó el cebador de la primera cadena de la síntesis de la segunda cadena, dando como resultado la formación de una horquilla de DNA. La reacción de la segunda cadena contenía 98 \mul del cDNA de la primera cadena, 30 \mul de 5x polimerasa, 1 tampón (Tris 100 mM: HCl, pH 7,5, KCl 500 mM, MgCl_{2} 25 mM, (NH_{4})_{2}SO_{4}) 50 mM, 2 \mul de ditiotreitol 100 mM, 6 \mul de una solución que contenía 10 mM de cada trifosfato desoxinucleotídico, 5 \mul de b-NAD 5 mM, 1 \mul de 3 U/\mul E. coli DNA ligasa (New England Biolabs Inc.) y 4 \mul de 10 U/\mul E. coli DNA polimerasa I (New England Biolabs Inc.). La reacción se ensambló a temperatura ambiente y se incubó a temperatura ambiente durante 2 minutos, seguida de adición de 4 \mul de 3,8 U/\mul RNase H (Life Technologies). La reacción se incubó a 15ºC durante dos horas seguida de una incubación de 15 minutos a temperatura ambiente. Se añadieron diez microlitos de TRIS 1M, pH7,4 a la reacción, y se extrajeron dos veces con fenol/cloroformo y una vez con cloroformo, las fases orgánicas se retroextrajeron con 50 \mul de TE (TRIS 10 mM, pH 7,4, EDTA 1 mM), se combinaron con otras acuosas, y precipitó etanol en presencia de acetato sódico 0,3 M. El sedimento se lavó con 100 \mul de etanol al 70%, se secó al aire y se resuspendió en 40 \mul de agua.
El DNA monocatenario de la estructura de horquillas se escindió usando nucleasa de poroto mung. La mezcla de reacción contenía 40 \mul de cDNA de la segunda cadena, 5 \mul de tampón de nucleasa de poroto mung 10x (Life technologies), 5 \mul de nucleasa de poroto mung (Pharmacia Biotech Corp.) diluida hasta 1 U/\mul en tampón de nucleasa de poroto mung 1X. La reacción se incubó a 37ºC durante 45 minutos. La reacción finalizó por adición de 10 \mul de Tris 1M: HCl, pH 7,4 seguida de extracciones secuenciales de fenol/cloroformo y cloroformo, como se describió anteriormente. Después de las extracciones, el cDNA precipitó con etanol en presencia de acetato sódico 0,3 M. El sedimento se lavó con 100 \mul de etanol al 70%, se secó al aire y se resuspendió en 38 \mul de agua.
El cDNA resuspendido se enromó en los extremos con DNA polimerasa T4. El cDNA, que se resuspendió en 38 \mul de agua, se mezcló con 12 \mul de tampón DNA polimerasa T4 5x (Tris 250 mM:HCl, pH 8,0, KCl 250 mM, MgCl_{2} 25 mM), 2 \mul de ditiotreitol 0,1 M, 6 \mul de una solución que contenía 10 mM de cada trifosfato desoxinucleotídico y 2 \mul de 1 U/\mul DNA polimerasa T4 (Boehringer Mannheim Corp.). Después de una incubación de 45 minutos a 15ºC, la reacción terminó por la adición de 30 \mul de TE seguida de extracciones secuenciales de fenol/cloroformo y cloroformo, y se retroextrajo con 20 \mul de TE, como se describió anteriormente. El DNA precipitó con etanol en presencia de 2 \mul de sedimento Paint^{TM} (Novagen) y acetato sódico 0,3 M, y se resuspendió en 11 \mul de agua.
Se ligaron adaptadores RI Eco RI a los extremos 5' del cDNA descrito anteriormente para permitir la clonación al vector de expresión. Se mezclaron 11 \mul de cDNA y 4 \mul de 65 pmol/\mul del adaptador RI hemifosforilado Eco (Pharmacia Biotech Corp), con 5 \mul de tampón de ligasa 5x (Life Technologies), 2 \mul de ATP 10 mM y 3 ul de 1 U/\mul DNA ligasa T4 (Life Technologies), 1 \mul de tampón de ligadura 10X (Promega Corp), 9 \mul de agua. La dilución extra con 1X tampón se realizó para prevenir que el sedimento Paint precipitara. La reacción se incubó 9 horas en un baño de agua, con una temperatura gradual de 10ºC a 22ºC durante 9 horas, seguida de 45 minutos a 25ºC. La reacción finalizó por incubación a 68ºC durante 15 minutos.
Para facilitar la clonación direccional del cDNA a un vector de expresión, el cDNA se digirió con XhoI, resultando en un cDNA que tenía un extremo 5' cohesivo de RI Eco y un extremo 3' cohesivo de XhoI. El sitio de restricción XhoI en el extremo 3' del cDNA se había introducido previamente usando el cebador ZC18698 (SEC ID NO:30). La digestión de la enzima de restricción se llevó a cabo en una mezcla de reacción que contenía 35 \mul de la mezcla de ligadura antes mencionada, 6 \mul de tampón H 10x (Boehringer Mannheim Corp.), 1 \mul de 2 mg/ml BSA (Biolabs Corp.), 17 \mul agua y 1,0 \mul de 40 U/\mul XhoI (Boehringer Mannheim). La digestión se llevó a cabo a 37ºC durante 1 hora. La reacción finalizó por incubación a 68ºC durante 15 minutos, seguida por precipitación de etanol, lavado y secado como se describió anteriormente y resuspensión en 30 \mul de agua.
El cDNA resuspendido se calentó hasta 65ºC durante 5 minutos y se enfrió en hielo, se añadieron 4 \mul de tinte con carga de gel 5X (Research Genetics Corp.), se cargó el cDNA a agarosa de baja fusión al 0,8% 1X TAE (agarosa de baja fusión SEA PLAQUE GTG^{TM}; FMC Corp.) y electroforesis. Los adaptadores contaminantes y el cDNA de menos de 0,6 Kb de longitud se cortaron del gel. Los electrodos se invirtieron, se añadió agarosa triturada para rellenar los pocillos, se cambió el tampón y se sometió el cDNA a electroforesis hasta que se concentró cerca de la senda de origen. El área del gel que contenía el cDNA concentrado se cortó y se dispuso en un tubo Microfuge, y la agarosa se fundió calentando hasta 65ºC durante 15 minutos. Tras equilibrar la muestra hasta 45ºC, se añadieron 2 \mul de 1 U/\mul Beta-agarosa I (Biolabs, Inc.), y la mezcla se incubó durante 90 min. a 45ºC para digerir la agarosa. Después de la incubación, se añadió a la muestra un volumen de un décimo de acetato de Na 3 M, y la mezcla se incubó en hielo durante 15 minutos. La muestra se centrifugó a 14.000 x g durante 15 minutos a temperatura ambiente para eliminar la agarosa no digerida, el cDNA se precipitó con etanol, se lavó en 70% etanol, se secó al aire y se resuspendió en 40 \mul de agua.
Para determinar la relación óptima de cDNA al vector, se ensamblaron varias ligaduras y se sometieron a electroporación. En síntesis, 2 \mul de tampón ligasa T4 5X (Life Technologies), 1 \mul de ATP 10 mM, 1 \mul pZP7NX digerido con EcoRI-XhoI, 1 \mul DNA ligasa T4 diluida hasta 0,25 u/\mul (Life Technologies) agua hasta 10 \mul y 0,5, 1, 2 ó 3 \mul de cDNA se mezclaron en 4 ligaduras separadas, se incubaron a 22ºC durante 4 horas, 68ºC durante 20 minutos, precipitó acetato de sodio-etanol, se lavó, secó y resuspendió en 10 \mul. Un solo microlitro de cada ligadura se electroporó en 40 \mul de bacterias electrocompetentes DH10b ElectroMax^{TM} (Life Technologies) usando una cubeta de 0,1 cm (Biorad) y un controlador de pulsos Genepulser, (Biorad) regulado a 2,5KV, 251F, 200 ohms. Estas células se resuspendieron inmediatamente en 1 ml de caldo SOC (Manniatis et al. supra.) seguidas de 500/\mul de glicerol-SOC al 50% como conservante. Estos "stocks de glicerol" se congelaron en varias alícuotas a -70ºC. Se descongeló una alícuota de cada uno y se dispuso en serie en placas LB-agar enriquecidas con ampicilina a 100 \mug/ml. Los números de colonias indicaron que la relación óptima de cDNA de CD3+ a vector pZP7NX era de 1 \mul hasta 45 ng; dicha ligadura proporcionó 4,5 millones de clones primarios.
Para los fines de cribar la genoteca usando un ensayo de proliferación basado en BaF3 (Ejemplo 5) se diluyeron los stocks de glicerol anteriormente mencionados en cultivos líquidos de 100 ó 250 clones por mezcla en placas de microvaloración con pocillos profundos, se desarrollaron durante 24 horas a 37ºC con agitación y se aisló el plásmido, usando un kit Qiagen, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Dicho DNA se transfectó posteriormente a células BHK, medio condicionado 72 horas, se cosechó y se conservó a -80ºC, y luego se dispuso en 5K de células BaF3/zcytor17/WSX-1/OSMRbeta o células BaF3/zcytor17/OSMRbeta durante 72 horas, tras lo cual se evaluó la proliferación usando un ensayo de fluorescencia "Alamar blue" (Ejemplo 5B y Ejemplo 2B).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 7 Clonación de expresión de zcytor17lig humano
Los stocks de glicerol de la genoteca de células seleccionadas para CD3+ activadas humanas (Ejemplo 6) se añadieron a Super Broth II^{TM} (Becton Dickinson, Cockeysville, MD) + 0,1 mg/ml ampicilina (amp) a una concentración de 250 células por 800 microlitros. Las E. coli se dejaron equilibrar durante 24 horas a temperatura ambiente. Al momento de la inoculación, se dispusieron 400 microlitros en placas de LB + amp para determinar la valoración real de la inoculación. Después de 24 horas, las placas se contaron y luego la concentración final del SuperBrothII^{TM} + E. coli se ajustó, de modo que la concentración final fue 250 células por 1,2 ml. Se inocularon 2 litros tres veces para un total de 6 litros. El medio se dispuso luego en placas de 96 pocillos profundos (Qiagen). La disposición en las placas se realizó con el dispensador de 8 canales Q-Fill2^{TM} (Genetix, Christchurch, Dorset, Reino Unido). Las E. coli se desarrollaron durante la noche a 37ºC, agitando a 250 rotaciones/min. en un agitador de ambiente multicapa New Brunswick Scientific Innova 4900. Las E. coli se centrifugaron fuera de la solución a 3000 rpm, usando una máquina centrífuga Beckman GS-6KR. Estos sedimentos de E. coli se congelaron a -20ºC o se usaron nuevos antes de minipreparar el DNA plasmídico. Cada sedimento contiene aproximadamente 250 clones de cDNA de la genoteca de células seleccionadas para CD3+ humanas.
Estas mezclas de 250 clones de cDNA se miniprepararon luego usando el kit QIAprep^{TM} 96 Turbo Miniprep (Qiagen). Se eluyó el DNA plasmídico, usando 125 \mul de TE (Tris 10 mM, pH 8, EDTA 1 mM). Este DNA plasmídico se usó luego para transfectar células BHK.
\vskip1.000000\baselineskip
Transfección de BHK
Se dispusieron células BHK en placas de 96 pocillos con cultivo de tejido a una densidad de 12.000 células por pocillo en un volumen de 100 \mul por pocillo. El medio de cultivo fue DMEM (GibcoBRL), suero bovino fetal inactivado por calor al 5%, L-glutamina 2 mM (GibcoBRL), 1X PSN (GibcoBRL), piruvato de Na 1 mM (GibcoBRL).
Al día siguiente, las células BHK se lavaron una vez con 100 \mul SFA. SFA es medio libre de suero que es DMEM/F12 o DMEM (Gibco/BRL), GlutaMax^{TM} 2 mM (Gibco/BRL), piruvato de Na 1 mM, 10 \mug/ml de transferrina, 5 \mug/ml insulina, 10 \mug/ml fetuina, 2 \mug/ml selenio, HEPES 25 mM (Gibco/BRL), 100 \muM aminoácidos no esenciales (Gibco/BRL).
Se elaboró una mezcla de DNA/Lipofectamine^{TM} de la siguiente manera: se combinaron 2,2 \mul de reactivo
Lipofectamine^{TM} (Gibco/BRL) con 102,8 \mul de SFA a temperatura ambiente; se añadieron luego aproximadamente 5 \mul del DNA plasmídico (200 ng/\mul) a la mezcla Lipofectamine^{TM}/SFA para formar la mezcla DNA/Lipofectamine^{TM}, que se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se eliminó el SFA de las células BHK, y las células se incubaron con 50 \mul de la mezcla DNA/Lipofectamine^{TM} durante 5 horas a 37ºC con 5% CO_{2}. Se añadieron 50 \mul de la mezcla DNA/Lipofectamine^{TM} a cada uno de los dos pocillos de células BHK, de modo que las transfecciones se realizaron por duplicado.
Después de incubar las células BHK con la mezcla DNA/Lipofectamine^{TM} durante 5 horas, la mezcla DNA/
Lipofectamine^{TM} se eliminó, y se añadieron 100 \mul de medio de cultivo. Las células se incubaron durante toda la noche, se eliminó el medio y se reemplazó con 100 \mul de medio de cultivo. Después de cultivar las células durante 48-72 horas, se separó el medio condicionado, se congeló a -80ºC durante un mínimo de 20 minutos, se descongeló y luego se ensayaron 50 \mul en el ensayo de proliferación de Baf3, descrito en el Ejemplo 5, para identificar combinaciones de 250 clones con actividad de ligandos.
Se cribaron 20 placas de 96 pocillos en un solo ensayo. Esto representaba aproximadamente 250 cDNA/pocillo o un total de 480.000 cDNA. De éstos, el medio condicionado de aproximadamente 60 pocillos (que representan 250 cDNA por pocillo) dio positivo en el ensayo de proliferación. Se eligió una de estas combinaciones positivas para descomponer y aislar un cDNA sencillo que codificaría el zcytor17lig. Ésta fue la combinación 62A12.
Par combinar 62A12, se usó 1 \mul de DNA para transformar células ElectroMax^{TM} DH10B (Gibco/BRL) por electroporación. Los transformantes se dispusieron en placas de LB + amp (100 \mug/ml) para dar colonias sencillas. De la combinación electroporada, se seleccionaron 672 colonias individuales por palillo en siete placas de 96 pocillos que contenían 1,2 ml de SuperBrothll^{TM} por pocillo. Estas placas se numeraron #62.1 a #62.7. Se cultivaron durante una noche y el DNA plasmídico se minipreparó como anteriormente. Para las siete placas, se transfectó DNA plasmídico de las placas de descomposición a células BHK, y se ensayó por proliferación como anteriormente, excepto que las transfecciones no se realizaron por duplicado.
Se identificaron dos clones positivos 62.6C7 y 62.6E9 por actividad de un total de 672 clones. Se secuenció el DNA plasmídico minipreparado a partir del clon 62.6E9 y se obtuvo una identificación tentativa, pero se obtuvo una secuencia mixta de estos clones positivos. Para aislar más el cDNA de zcytor17lig a un clon sencillo, se usó 1 \mul de DNA de la combinación de 62.6E9 para electroporar células DH10B, y los transformantes se dispusieron en placas LB + amp (100 \mug/ml) para dar colonias sencillas. Se secuenció DNA plasmídico minipreparado a partir de varias colonias para dar la secuencia de DNA exacta. La secuencia de polinucleótidos de zcytor17lig fue de longitud total (SEC ID NO:1) y se muestra su correspondiente secuencia de aminoácidos (SEC ID NO:2).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 8 Construcción de vectores de expresión mamífera que expresan receptores solubles zcytor17: zcytor17CEE. zcytor17CFLG, zcytor17CHIS y zcytor17-Fc4 A. Construcción del vector de expresión mamífera de zcytor17 que contiene zcytor17CEE, zcytor17CFLG y zcytor17CHIS
Se preparó un vector de expresión para la expresión del dominio soluble extracelular del péptido zcytor17,
pZp9zcytor17CEE, en donde el constructo se diseñó para expresar un polipéptido zcytor17 comprendido por la metionina iniciadora pronosticada, y se truncó adyacente al dominio de transmembrana pronosticado, y con un marcador C-terminal Glu-Glu (SEC ID NO:32).
Se generó un producto PCR de aproximadamente 1500 bp usando ZC29,451 (SEC ID NO:33) y ZC29,124 (SEC ID NO:34) como los cebadores PCR para añadir los sitios de restricción EcoRI y BamHI. Se usó una genoteca de cDNA interna de HPVS humano como molde, y se llevó a cabo la ampliación PCR de la siguiente manera: 30 ciclos a 94ºC durante 1 minuto, 65ºC durante 1 minuto, 72ºC durante 1,5 minutos, luego 72ºC durante 7 minutos; impregnación a 10ºC. La reacción PCR precipitó con etanol y se digirió con las enzimas de restricción EcoRI y BamHI. El producto PCR digerido se purificó con gel en un gel de agarosa al 1,0% y se cortó la banda de aproximadamente 1500 bp. Esta banda se volvió a ampliar luego usando cebadores idénticos con los siguientes ciclos: 30 ciclos a 94ºC durante 1 minuto, 65ºC durante 1 minuto, 72ºC durante 3 minutos, luego 72ºC durante 7 minutos; impregnación a 10ºC. La reacción PCR precipitó con etanol y se digirió con las enzimas de restricción EcoRI y BamHI. El producto PCR digerido se purificó con gel en un gel de agarosa al 1,0% y se cortó la banda de aproximadamente 1500 bp. El DNA cortado se subclonó en el plásmido CEEpZp9 que se había cortado con EcoRI y BamHI, para generar plásmido con un receptor soluble C-terminalmente marcado con GLU-GLU para zcytor17, zcytor17CEEpZp9. El dominio extracelular en el cDNA de zcytor17CEE en zcytor17CEEpZp9 tiene una mutación silenciosa que cambia de T a C en la posición 1705 de la SEC ID NO:4 (que codifica un residuo Pro en el residuo 403 de la SEC ID NO:5). Ya que esta mutación fue silenciosa, el cDNA de zcytor17 en zcytor17CEEpZp9 codifica el polipéptido como se muestra en la SEC ID NO:5. Además, debido al constructo utilizado, se insertó un par de residuos Gly-Ser C-terminal al extremo del dominio soluble extracelular de zcytor17 y antes del marcador C-terminal Glu-Glu (SEC ID NO:32). Como tal, el marcador en el término C del dominio extracelular de zcytor17 fue el marcador Glu-Glu, como se muestra en la SEC ID NO:17. El plásmido CEEpZp9 es un vector de expresión mamífera que contiene un casete de expresión que tiene el promotor de metalotioneina-1 de ratón, sitios de restricción múltiples para inserción de secuencias codificantes y un terminador de la hormona del crecimiento humana. El plásmido también tiene un origen de replicación de E. coli, unidad de expresión de marcador seleccionable de mamífero que tiene un promotor SV40, potenciador y origen de replicación, un gen DHFR y el terminador SV40. Usando técnicas de biología molecular convencionales, se electroporó zcytor17CEEpZp9 en células competentes DH10B (GEBCO BRL, Gaithersburg, MD) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y se dispuso en placas LB que contenían 100 \mug/ml ampicilina, y se incubó durante una noche. Las colonias se cribaron por análisis de restricción, o PCR de DNA preparado a partir de colonias individuales. La secuencia del inserto de clones positivos se verificó por análisis de secuencias. Se elaboró una preparación del plásmido a gran escala usando el kit QIAGEN® Maxi prep (Qiagen) según las instrucciones del fabricante.
Se empleó el mismo procedimiento para preparar receptores solubles zcytor17 con un marcador G-terminal His, compuesto de 6 residuos His en hilera; y un marcador C-terminal FLAG® (SEC ID NO:36), zcytor17CFLAG. Para construir estos constructos, el vector anteriormente mencionado tiene el marcador HIS o FLAG® en lugar del marcador glu-glu (p. ej., la SEC ID NO:17; SEC ID NO:32 o SEC ID NO:35).
\vskip1.000000\baselineskip
B. Construcción de expresión mamífera del receptor soluble zcytor17 humano: zcytor17-Fc4
Se preparó un vector de expresión, pEZE-2 hzcytor17/Fc4, para expresar una versión soluble marcada C-terminalmente con Fc4 de hzcytor17 (zcytor17-Fc4 humano) en células PF CHO. Las células PF CHO son una línea celular de CHO interna adaptada para desarrollo en medio libre de proteína (medio ExCell 325 PF; JRH Biosciences). La línea celular de CHO interna derivó originalmente de células CHO DG44 (G. Urlaub, J. Mitchell, E. Kas, L.A. Chasin, V.L. Funanage, T.T. Myoda y J.L. Hamlin, "The Effect Of Gamma Rays at the Dihydrofolate Reductase Locus: Deletions and Inversions", Somatic Cell and Molec. Genet., 12: 555-566 (1986). Un fragmento de cDNA de zcytor17 que incluye la secuencia de polinucleótidos del dominio extracelular del receptor zcytor17 se condensó dentro del marco a la secuencia de polinucleótidos Fc4 (SEC ID NO:37) para generar una fusión de zcytor17-Fc4 (SEC ED NO:38 y SEC ID NO:39). El vector pEZE-2 es un vector de expresión mamífera que contiene la secuencia de polinucleótidos Fc4 y un sitio de clonación que permite la construcción rápida de fusiones C-terminales Fc4, usando técnicas convencionales de biología molecular.
Se generó un fragmento de 1566 pares de bases por PCR, que contenía el dominio extracelular de zcytorI7 humano y los primeros dos aminoácidos de Fc4 (Glu y Pro) con sitios FseI y BglII codificados en los extremos 5' y 3', respectivamente. Este fragmento PCR se generó usando los cebadores ZC29,157 (SEC ID NO:40) y ZC29,150 (SEC ID NO:41) por ampliación de un plásmido que contiene el dominio extracelular de zcytor17 humano (pZp9zcytor17CEE) (Ejemplo 8A). Las condiciones de reacción PCR fueron las siguientes: 25 ciclos de 94ºC durante 1 minuto, 60ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 2 minutos; 1 ciclo a 72ºC durante 10 minutos; seguidos de impregnación a 4ºC. El fragmento se digirió con las endonucleasas de restricción FseI y BglII y posteriormente se purificó con electroforesis en gel al 1% y purificación de la banda, usando el kit de extracción de gel QiaQuick (Qiagen). El DNA purificado resultante se ligó durante 5 horas a temperatura ambiente en un vector pEZE-2 previamente digerido con FseI y BglII que contenía Fc4 3' de los sitios FseI y BglII.
Se electroporaron 2 \mul de la mezcla de ligadura en 37 \mul DH10B de E. coli electrocompetentes (Gibco) según las instrucciones del fabricante. Las células transformadas se diluyeron en 400 \mul de medio LB y se dispusieron en placas LB que contenían 100 \mug/ml ampicilina. Los clones se analizaron por digestos de restricción y los clones positivos se enviaron para secuenciación de DNA, para confirmar la secuencia del constructo de fusión. Se transformó 1 microlitro de un clon positivo en 37 \mul de DH10B E. coli electrocompetentes y se rayó en una placa de LB/amp. Se recogió una colonia sencilla de esta placa rayada para comenzar un cultivo de 250 ml LB/amp que luego se desarrolló durante una noche a 37ºC con agitación a 250 rpm. Este cultivo se usó para generar 750 \mug de DNA purificado usando un kit Qiagen Maxi (Qiagen).
Se disponen en placas células BHK 570 (ATCC No. CRL-10314), DG-44 CHO u otras células mamíferas, a aproximadamente 1,2X10^{6} células/pocillo (placas de 6 pocillos) en 800 \mul de medio libre de suero (SF) apropiado (p. ej., DMEM, Gibco/Alta Glucosa BRL) (Gibco BRL, Gaithersburg, MD). Las células se transfectan con plásmidos de expresión que contienen zcytor17CEE, zcytor17CFLG, zcytor17CHIS o zcytor17-Fc4 (Ejemplo 8), usando Lipofectin^{TM} (Gibco BRL), en un medio libre de suero (SF) según las instrucciones del fabricante. Se aíslan clones sencillos que expresan los receptores solubles, se criban y se desarrollan en medio de cultivo celular, y se purifican usando técnicas convencionales.
\vskip1.000000\baselineskip
A. Expresión mamífera de receptores solubles zcytor17CEE humanos
Se dispusieron células BHK 570 (ATCC NO: CRL-10314) en matraces de cultivo celular T-75 y se dejaron desarrollar hasta aproximadamente 50 a 70% confluencia a 37ºC, 5% CO_{2}, en medio DMEM/FBS (DMEM, Gibco/Alta Glucosa BRL, (Gibco BRL, Gaithersburg, MD), suero bovino fetal al 5%, L-glutamina 1 mM (JRH Biosciences, Lenea, KS), piruvato sódico 1 mM (Gibco BRL)). Las células se transfectaron luego con el plásmido que contenía zcytor17CEE (Ejemplo 8A), usando Lipofectamine^{TM} (Gibco BRL), en una formulación de medio libre de suero (SF) (DMEM, 10 mg/ml transferrina, 5 mg/ml insulina, 2 mg/ml fetuina, L-glutamina al 1% y piruvato sódico al 1%). Se diluyeron 10 microgramos del DNA plasmídico pZp9zcytor17CEE (Ejemplo 8A) en 15 ml de tubo hasta un volumen final total de 500 \mul con medio SF. Se mezclaron 50 microlitos de Lipofectamine con 450 \mul de medio SF. La mezcla de Lipofectamine se añadió a la mezcla de DNA y se dejó incubar aproximadamente 30 minutos a temperatura ambiente. Se añadieron 4 ml de medio SF a la mezcla DNA:Lipofectamine. Las células se enjuagaron una vez con 5 ml de medio SF, se aspiraron, y se añadió la mezcla DNA:Lipofectamine. Las células se incubaron a 37ºC durante cinco horas, y luego se añadieron 5 ml de medio DMEM/FBS al 10%. El matraz se incubó a 37ºC durante una noche, y luego las células se repartieron en el medio de selección (medio DMEM/FBS anteriormente mencionado con la adición 1 \muM metotrexato, 10 \muM Metotrexato (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) en placas de 150 a 1:2, 1:10 y 1:50. Aproximadamente 10 días después de la transfección, se tripsinizó una placa de 150 mm de colonias resistentes a 1 \muM metrotexato, las células se combinaron y una mitad de las células se volvió a disponer en placas con 10 \muM metotrexato, para ampliar más la expresión de la proteína zcytor17CEE. Una muestra de medio condicionado de esta combinación de células ampliadas se ensayó para niveles de expresión, usando análisis Western y SDS-PAGE.
\vskip1.000000\baselineskip
B. Expresión mamífera del receptor soluble zcytor17-Fc4 humano
Se linealizaron 5 réplicas de 200 \mug del DNA plasmídico pEZE-2hzcytor17Fc4 (Ejemplo 8B) por digestión de restricción con FspI, una enzima de restricción que se corta una vez dentro del vector y no perturba los genes necesarios para la expresión. Se añadieron 200 \mug de DNA genómico de células CHO a cada réplica como DNA portador, y luego el DNA precipitó por adición de 0,1 volúmenes de acetato sódico 3M, pH 5,2, y 2,2 volúmenes de etanol, seguidos de una incubación en hielo de 15 minutos y microcentrifugación a 4ºC. Los sedimentos de DNA resultantes se lavaron en metanol al 70% y se secaron al aire antes de resuspenderse en 100 \mul de medio de desarrollo sin selección de CHO libre de proteínas (PF) (21 g/L PF CHO Ex Cell 325/L-glutamina 200 mM (Gibco)/piruvato sódico 100 mM (Gibco)/1x HT Suplemento (Gibco). Se añadieron 61 células de pasaje PF CHO de diez millones al DNA en 600 \mul de medio de desarrollo sin selección de CHO PF y luego se electroporaron en un sistema de electroporación Gene Pulser II (BioRad) usando 950 \muF capacitancia y 300 Kv, empleando una cubeta de electroporación Gene Pulser (BioRad) con un espacio de 0,4 cm. Las 5 réplicas de las células electroporadas se combinaron y seleccionaron directamente en medio HT (21 g/L PF CHO Ex Cell 325/L-glutamina 200 mM (Gibco)/piruvato sódico 100 mM (Gibco). Las células se seleccionaron durante 15 días en medio HT antes de pasarse a 4 x 10^{5} ml a una selección MTX 50 nm. Ocho días después, las células se sembraron a 3,5X10^{5} células/ml en una selección MTX 200 mM. Al cabo de una semana, las células se sembraron a 4X10^{5} células/ml en una selección MTX 1 \muM. Después de dos semanas a 1 \muM MTX, las células se sembraron a 1X10^{6} células/ml en 50 ml para generar medio condicionado. El medio condicionado de 72 horas resultante se analizó sondeando transferencias Western con un anticuerpo contra Ig humana. Las células produjeron la proteína hzcytor17/Fc4 a aproximadamente 1 mg/L.
\vskip1.000000\baselineskip
C. Expresión mamífera a mayor escala del receptor soluble zcytor17-Fc4 humano
Se linealizaron 200 \mug de DNA plasmídico pEZE-2hzcytor17Fc4 (Ejemplo SB) por digestión de restricción con FspI, una enzima de restricción que se corta una vez dentro del vector pEZE-2 y no perturba los genes necesarios para la expresión. Se añadieron 200 microgramos de DNA genómico de CHO (preparado internamente) como DNA portador, y luego precipitó DNA por adición de 0,1 volúmenes de acetato sódico 3M, pH 5,2 y 2,5 volúmenes de etanol, seguidos de microcentrifugación a temperatura ambiente. Se elaboraron 5 réplicas de sedimentos de DNA y se transformaron. El sedimento de DNA resultante se lavó en etanol al 70% y se secó al aire antes de resuspenderse en 100 \mul de medio de desarrollo sin selección de PF CHO (21 g/L PF CHO Ex Cell 325/L-glutamina 200 mM (Gibco)/piruvato sódico 100 mM (Gibco)/1x HT (Gibco). Se añadieron 10 millones de células PF CHO al DNA en 600 \mul de medio de desarrollo sin selección de PF CHO y luego se electroporaron en un sistema de electroporación Gene Pulser (BioRad), usando 950 \muF capacitancia y 300 voltios, usando una cubeta de electroporación Gene Pulser con un espacio de 0,4 cm (BioRad). Las células electroporadas se combinaron y colocaron directamente en el medio HT de selección (21 g/L PF CHO Ex Cell 325/L-glutamina 200 mM (Gibco)/piruvato sódico 100 mM (Gibco). Las células se seleccionaron durante 14 días en medio HT antes de pasarse a 4 x 10^{5}/ml a una selección MTX 50 nm. Las células se ampliaron hasta MTX 200 nM y luego hasta MTX 1 uM. Las combinaciones de HT 50 nM, y 1 uM se sembraron a 1 x 10^{6} c/ml durante 48 horas, y luego el medio condicionado resultante se analizó sondeando las transferencias Western con un anticuerpo generado contra Ig humana.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 10 Purificación de receptores solubles zcytor17 de células BHK 570 y CHO A. Expresión mamífera transitoria y purificación del receptor soluble zcytor17-Fc4 humano
El DNA plasmídico pEZE-2hzcytor17Fc4 (Ejemplo 8B) se introdujo en 40 maxiplacas de células BHK usando Lipofectamine (Gibco BRL) como se describe en la presente memoria, y según las instrucciones del fabricante. Las células se dejaron recuperar durante la noche, luego se enjuagaron y realimentaron con medio libre de suero (SL7V4, elaborado internamente). Después de 72 horas, el medio se recogió y filtró, y las células se realimentaron con medio libre de suero. Después de 72 horas, el medio se recogió y filtró nuevamente.
El medio condicionado libre de suero (lotes de 2 x 1,5 L) de células BHK transitoriamente transfectadas se bombeó en una columna de 1,5 ml de proteína A-agarosa en Tris 20 mM, pH 7,5, NaCl 0,5 M. La columna se lavó ampliamente con este tampón y luego la proteína unida se eluyó con 1 ml de glicina 0,2 M, pH 2,5, NaCl 0,5 M. La proteína eluida se recogió en 0,1 ml de Tris 2 M, pH 8,5. Se recogieron alícuotas para electroforesis SDS-gel de poliacrilamida y el zcytor17-Fc se dializó durante la noche contra PBS. El receptor soluble se filtró estéril y se dispuso en alícuotas a -80ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
B. Purificación de zcytor17-Fc4
Se produjo zcytor17 marcado con Fc4 carboxiterminal recombinante (Ejemplo 8 y Ejemplo 9) a partir de células CHO transfectadas. La transfección de CHO se realizó usando métodos conocidos en la técnica. Se cosecharon aproximadamente cinco litros de medio condicionado y se filtraron estériles usando filtros Nalgene de 0,2 \mum.
La proteína se purificó a partir del medio filtrado por una combinación de cromatografía de afinidad de proteína A Poros 50 (PerSeptive Biosystems, 1-5559-01, Framingham, MA) y columna de cromatografía de exclusión de gel Superdex 200 (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). El medio de cultivo se cargó directamente a una columna de afinidad de proteína A 10x70 mm (volumen de lecho 5,5 ml) a un caudal de aproximadamente 3-10 mi/minuto. Después del lavado en la columna para diez volúmenes de columna de PBS, la proteína unida se eluyó con cinco volúmenes de columna de glicina 0,1 M, pH 3,0 a 10 ml/minuto). Las fracciones de 2 ml cada una se recogieron en tubos que contenían 100 \mul de Tris 2,0, pH 8,0, con el fin de neutralizar las proteínas eluidas. Las muestras de la columna de afinidad se analizaron por SDS-PAGE con tinte coomassie y transferencia Western para presencia de zcytor17-Fc4, usando Ig-HRP humano. Las fracciones que contenían zcytor17-Fc4 se combinaron y concentraron hasta 1-2 ml, usando el concentrador Biomax-30 (Millipore), y se cargaron a una columna de filtración de gel de 20x580 mm Superdex 200. Las fracciones que contenían zcytor17-Fc4 purificado se combinaron, se filtraron a través de un filtro de 0,2 \mum, se dividieron en alícuotas de 100 \mul cada una y se congelaron a -80ºC. La concentración de la proteína purificada final se determinó por el ensayo BCA (Pierce, Rockford, IL).
\vskip1.000000\baselineskip
C. Análisis SDS-PAGE y transferencia Western de zcvtor17/Fc4
Se analizó zcytor17-Fc4 recombinante por SDS-PAGE (Nupage 4-12%, Invitrogen, Carlsbad, CA) con el método de tinte coomassie y transferencia Western, usando Ig-HRP humano. O bien el medio condicionado o la proteína purificada se sometieron a electroforesis, usando una minicelda Xcell de Invitrogen Novex, y se transfirieron a nitrocelulosa (0,2 mm; Invitrogen, Carlsbad, CA) a temperatura ambiente usando un modulo de transferencia Xcell de Novex con agitación de acuerdo con las instrucciones del fabricante provistas en el manual del instrumento. La transferencia se realizó a 500 mA durante una hora en un tampón que contenía base de Tris 25 mM, glicina 200 mM y metanol al 20%. Los filtros luego se bloquearon con leche en polvo descremada al 10% en PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente. La nitrocelulosa se enjuagó rápidamente, luego se añadió el anticuerpo humano Ig-HRP (1:2000) en PBS que contenía leche en polvo descremada al 2,5%. Las transferencias se incubaron durante dos horas a temperatura ambiente, o durante una noche a 4ºC, con agitación moderada. Después de la incubación, las transferencias se lavaron tres veces durante 10 minutos cada una en PBS, luego se enjuagaron rápidamente H_{2}O. Las transferencias se revelaron usando reactivos de sustratos quimiluminiscentes (reactivos SuperSignal® ULTRA 1 y 2 mixtos 1:1; reactivos obtenidos de Pierce, Rockford, IL), y la señal se capturó usando el programa Lumi Analyst 3.0 de Lumi-Imager (Boehringer Mann-
heim GmbH, Alemania) para tiempos de exposición en el intervalo de 10 segundos a 5 minutos, o según fue necesario.
El zcytor17-Fc4 purificado apareció como una banda sola o bien con tinte coomassie o plata a aproximadamente 220 kDa bajo condiciones no reductoras, y a aproximadamente 120 kDa bajo condiciones reductoras, lo que indica la forma dimérica de zcytor17-Fc4 bajo condiciones no reductoras, según lo esperado.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 11 Ensayo que usa el receptor soluble zcytor17-Fc4 del receptor soluble zcytor17 en el ensayo de inhibición competitiva
Se centrifugaron células BaF3/zcytor17/WSX-1/OSMRbeta y células BaF3/zcytor17/OSMRbeta, y se lavaron en medio libre de mIL-3. Las células se centrifugaron y lavaron 3 veces para asegurar la eliminación de mIL-3. Las células se contaron luego en un hemacitómetro. Las células se dispusieron en placas de 96 pocillos a 5000 células por pocillo en un volumen de 100 \mul por pocillo, usando el medio libre de mIL-3.
Ambos medios condicionados de la activación de células CCRF-CEM y CCRF-HSB2, y las células seleccionadas para CD3+ humana, que se describen en el Ejemplo 5, se añadieron en experimentos separados a concentraciones 25%, 12,5%, 6,25%, 3,125%, 1,5%, 0,75%, 0,375% y 0,187%, con o sin receptores solubles de zcytor17 (Zcytor17-Fc4; véanse, Ejemplo 9 y Ejemplo 10) a 1-10 \mug/ml. El volumen de ensayo total fue 200 \mul.
Las placas de ensayo se incubaron a 37ºC, 5% CO_{2} durante 3-5 días, tras los cuales se añadió Alamar Blue (Accumed) a 20 \mul/pocillo. Las placas se incubaron nuevamente a 37ºC, 5% CO_{2} durante 16-24 horas. Las placas se leyeron en una lectora de placas Fmax^{TM} (Molecular Devices) como se describió en el Ejemplo 2. Los resultados demostraron la inhibición parcial del desarrollo celular con el receptor soluble zcytor17-Fc4 a 10 \mug/ml, confirmando que el factor en cada muestra fue específico del receptor zcytor17.
Las curvas de valoración, diluyendo el receptor soluble o los heterodímeros del receptor soluble que comprendían zcytor17/OSMR y zcytor17AVSX-1 también se realizaron usando el ensayo anteriormente mencionado para determinar si los receptores zcytor17 son capaces de inhibir el desarrollo celular, por ejemplo, a concentraciones bajas o fisiológicas.
Se realizaron ensayos de inhibición competitiva similares usando zcytor17lig purificado humano (Ejemplo 35) y receptores solubles en ensayos de luciferasa (Ejemplo 20). Los resultados muestran que tanto zcytor17 homodimérico como zcytor17/OSMR heterodimérico son capaces de inhibir la actividad de zcytor17lig.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 12 Ensayo de captura de secreción
Se usó un ensayo de captura de secreción para ensayar la unión del zcytor17lig a los receptores, que comprendían el receptor zcytor17, como por ejemplo el receptor zcytor17 o los heterodímeros del receptor que comprendían zcytor17/OSMR y zcytor17/WSX-1. Se transfectó el DNA plasmídico zcytor17lig a células COS, y se usó para evaluar la unión del zcytor17lig a los receptores que comprendían el receptor zcytor17 por captura de secreción, como se describe a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
A. Transfección de células COS
La transfección de células COS se realizó de la siguiente manera: 800 ng de cDNA de zcytor17lig y 4 \mul de Lipofectamine^{TM} se mezclaron en 80 \mul de medio DMEM libre de suero (55 mg de piruvato de sodio, 146 mg L-glutamina, 5 mg transferrina, 2,5 mg insulina, 1 \mug selenio y 5 mg fetuina en 500 ml DMEM), y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos. Luego se añadieron 320 \mul de medio DMEM libre de suero. Esta mezcla de 500 \mul se añadió a 2x10 células COS/pocillo dispuestas en placas de cultivo de tejido de 12 pocillos y se incubó durante 5 horas a 37ºC. Luego se añadieron 500 \mul de medio FBS DMEM al 20% (100 ml FBS, 55 mg piruvato sódico y 146 mg L-glutamina en 500 ml DMEM), y las células se incubaron durante una noche.
\vskip1.000000\baselineskip
B. Ensayo de captura de secreción
La captura de secreción se realizó de la siguiente manera: Se eliminaron las células del medio con PBS, luego se fijaron durante 15 minutos con formaldehído al 1,8% en PBS. Las células se lavaron luego con PBS/BSA al 0,1% y se permeabilizaron con Triton-X al 0,1% en PBS durante 15 minutos, y se lavaron nuevamente con PBS/BSA al 0,1%. Las células se bloquearon durante 1 hora con PBS/BSA al 0,1%. Dependiendo de qué receptor soluble se usó, las células se incubaron durante 1 hora en TNB con: (A) 1-3 \mug/ml proteína de fusión zcytor17-Fc4 receptor soluble zcytor17 (Ejemplo 10); o (B) 1-3 \mug/ml proteína de fusión del receptor soluble zcytor17/OSMRbeta. Las células se lavaron luego con TNT. Dependiendo de qué receptor soluble se usó (p. ej., si estaba marcado con un marcador Fc4 (SEC ID NO:37), marcador C-terminal FLAG (SEC ID NO:26) o marcador CEE (SEC ID NO:32; SEC ID NO:35)), las células se incubaron durante otra hora con: (A) Ig-HRP antihumano de cabra diluido 1:200 (específico de Fc); (B) M2-HRP diluido 1:1000; (C) anticuerpo anti-GluGlu-HRP diluido 1:1000; o (D) estreptavidina-HRP diluido 1:300 (kit NEN) en TNB, por ejemplo. Una vez más, las células se lavaron con TNT.
Para detectar unión positiva, se diluyó reactivo de fluoresceína tiramida 1:50 en tampón de dilución (kit NEN) y se incubó durante 4-6 minutos, y se lavó con TNT. La células se conservaron con medio Vectashield Mounting (Vector Labs Burlingame, CA) diluido 1:5 en TNT. Las células se visualizaron usando un filtro FITC en un microscopio fluorescente. Los resultados de este ensayo demostraron que el zcytor17lig humano no se une a ninguno de los receptores solubles. Estos datos indican que la estructura del zcytor17lig fue sensible a la etapa de fijación en este protocolo, ya que fue claramente capaz de unirse a los receptores de la superficie celular (véase, por ejemplo, datos de citometría de flujo presentados a continuación en el Ejemplo 39.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 13 Asignación y disposición cromosómica de la secuencia génica para zcytor17lig
La secuencia del gen zcytor17lig se mapeó al cromosoma humano 12 usando la versión disponible en el mercado del "Stanford G3 Radiation Hybrid Mapping Panel" (Research Genetics, Inc., Huntsville, AL). El "Stanford G3 RH Panel", contiene DNA de cada uno de los 83 clones híbridos de radiación del genoma humano completo, más dos DNA control (el donante RM y el receptor A3). Un servidor WWW públicamente disponible ubicado en Internet en www.stanford.edu permite la localización cromosómica de marcadores y genes.
Para el mapeo de la secuencia del gen zcytor17lig con el "Stanford G3 RH Panel", se establecieron 20 \mul de reacciones en una placa de microvaloración de 96 pocillos compatible para PCR (Stratagene, La Jolla, CA) y se usó en un ciclador térmico "RoboCycler Gradient 96" (Stratagene). Cada una de las 95 reacciones PCR consistió en 2 \mul tampón de reacción PCR 10X (Qiagen, Inc., Valencia, CA), 1,6 \mul mezcla dNTP (2,5 mM cada una, PERKIN-ELMER, Foster City, CA), 1 \mul cebador sentido, ZC41.458 (SEC ID NO:42), 1 \mul cebador antisentido, ZC41,457 (SEC ID NO:43), 2 \mul "RediLoad" (Research Genetics, Inc., Huntsville, AL), 0,1 \mul DNA polimerasa Qiagen HotStarTaq (5 unidades/\mul), 25 ng de DNA de un clon híbrido individual o control y agua destilada para un volumen total de 20 \mul. Las reacciones se cubrieron con una cantidad equivalente de aceite mineral y se sellaron. Las condiciones del ciclador PCR fueron las siguientes: 1 ciclo inicial de desnaturalización de 15 minutos a 95ºC, 35 ciclos de una desnaturalización de 45 segundos a 95ºC, una renaturalización de 1 minuto a 53ºC y una extensión de 15 segundos a 72ºC, seguida de una extensión de 1 ciclo final de 7 minutos a 72ºC. Las reacciones se separaron por electroforesis en un gel de agarosa al 2 (EM Science, Gibbstown, NJ) y se visualizaron por tinción con bromuro de etidio.
Los resultados mostraron el ligamiento de la secuencia del gen zcytor17lig al marcador del cromosoma 12 SHGC-83339 con un puntaje LOD de >11 y a una distancia de 17 cR_10000 desde el marcador. Este marcador posiciona al gen zcytor17lig en la región cromosómica 12q24.31.
\vskip1.000000\baselineskip
Identificación y clonación de zcytor17lig murino A. Identificación de zcytor17lig murino de longitud total
Usando la secuencia del péptido zcytorl71ig humano (SEC ID NO:2) para investigar una base de datos de DNA humana, se identificó cDNA murino, No de acceso en Genbank AK005939, como una secuencia parcial potencial para el zcytor17lig murino. La secuencia de cDNA AKO05939 se usó para investigar una base de datos cDNA que contenía fragmentos genómicos murinos. Se ensambló un cóntigo genómico del zcytor17lig murino (SEC ID NO:76). La predicción del potencial codificante en este fragmento genómico con el programa Genscan reveló una probable secuencia de cDNA, con la misma estructura génica que el zcytor17lig humano. Se representa una secuencia de cDNA de murino en la SEC ID NO:10, y la correspondiente secuencia de polipéptidos se muestra en la SEC ID NO:11.
\vskip1.000000\baselineskip
B. Clonación de zcytor17lig de ratón de una genoteca de cDNA de testículo de ratón por PCR
En base a la secuencia genómica (SEC ID NO:76), se diseñaron dos cebadores PCR y se usaron para identificar una fuente de cDNA de zcytor17lig de ratón por PCR. Estos cebadores ZC41498 (SEC ID NO:86) y ZC41496 (SEC ID NO:87) se diseñaron para las regiones no traducidas 5' y 3' putativas de las secuencias de ratón (SEC ID NO:76 y SEC ID NO:10). Se cribaron varias fuentes de cDNA por PCR, incluyendo cDNA Marthon-ready (Clontech) y alícuotas de genotecas de cDNA localmente elaboradas. Los productos se visualizaron en geles de agarosa al 1%. Las bandas del tamaño esperado se observaron en reacciones que utilizan un molde de genoteca de cDNA de testículo de ratón. Estas reacciones PCR se realizaron con éxito en volúmenes de aproximadamente 50 \mul con o sin DMSO al 10%, usando pfu turbo polimerasa (Stratagene) según las recomendaciones del fabricante; con una aplicación adicional de un arranque con exceso de temperatura de cera que emplea exceso de temperatura 50s (Molecular Bioproducts, Inc. San Diego, CA). El ciclado térmico de PCR se realizó con un solo ciclo de 94ºC durante 4 min; seguido de 40 ciclos de 94ºC: 30 segundos, 48ºC: 30 segundos, 72ºC: 50 segundos; con extensión final adicional a 72ºC durante 7 minutos. Las dos reacciones PCR se combinaron y purificaron usando agarosa de baja fusión y enzima de digestión de agarosa Gelase (Epicenter, Inc. Madison, WI) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
La determinación de la secuencia de DNA de estos productos PCR reveló una secuencia de cDNA de zcytor17 murino (SEC ID NO:90) que comprendía un ORF idéntico a la SEC ID NO:10, confirmando que la SEC ID NO:10 codifica el polipéptido zcytor17lig de ratón. Los cebadores PCR, ZC41583 (SEC ID NO:88) y ZC415S4 (SEC ID NO:89), se usaron luego para agregar los sitios de restricción FseI y AscI, y una secuencia parcial Kozak al marco de lectura abierto de mcytor17lig y al codón de terminación (SEC ID NO:92). Se usó un ciclador térmico Robocycler 40 (Stratagene) para lograr una temperatura en gradiente de temperatura de renaturalización y ciclado de la siguiente manera. Se aplicó Pfu turbo polimerasa (Stratagene) como se describió anteriormente, pero solamente en DMSO al 10%. El ciclado se realizó con un solo ciclo de 94ºC durante 4 min; seguido por 20 ciclos de 94ºC: 30 segundos, gradiente de 65ºC a 51ºC: 30 segundos, 72ºC: 1 minuto; y una sola extensión a 72ºC durante 7 minutos. El molde de esta segunda reacción de ciclado térmico fue 1 \mul del producto PCR inicial mcytor17lig purificado con gel anteriormente mencionado. El producto PCR resultante de las tres reacciones de temperatura más baja se combinaron y purificaron con gel, usando el método Gelase (Epicenter) anteriormente descrito. Este mzcytor17lig purificado se digirió con FseI y AscI, y se ligó al vector pZP7X modificado para tener sitios FseI y AscI en su sitio de clonación. El plásmido pZP7X es un vector de expresión mamífero que contenía un casete de expresión que tenía el promotor metalotioneina-1 (MT-1) de ratón, sitios de restricción múltiples para inserción de secuencias codificantes y un terminador de la hormona de crecimiento humana. El plásmido tiene también un origen de replicación de E. coli, una unidad de expresión del marcador selectivo de mamífero que tiene un promotor SV40, potenciador y origen de replicación, un gen DHF y el terminador SV40. La secuencia de cDNA murino clonada en la SEC ID NO:90, y la correspondiente secuencia de polipéptidos se muestran en la SEC ID NO:91 (que es idéntica a la SEC ID NO:11).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 15 Aislamiento del clon de cDNA de zcytor17lig de ratón de una colección de bazo de ratón activado A. Fuente primaria murina utilizada para aislar zcytor17lig de ratón
Se recogen los bazos de ratones Balb/C y se trituran entre extensiones de extremo escarchado para crear una suspensión celular. Se espera que el rendimiento de las células de ratón primarias aisladas sea aproximadamente 6,4X10^{8} células antes de la selección descrita a continuación.
Las células del bazo se suspenden en 9,6 ml de tampón MACS (PBS, EDTA al 0,5%, EDTA 2 mM). Se extraen 1,6 ml de suspensión celular y se añaden 0,4 ml de microesferas CD90 (Thy1.2) (Miltenyi Biotec). La mezcla se incuba durante 15 min. a 4ºC. Estas células marcadas con esferas CD90 se lavan con 30 ml de tampón MACS, y luego se resuspenden en 2 ml de tampón MACS.
Se prepara una columna VS+ (Miltenyi) según las instrucciones del fabricante. La columna VS+ se dispone luego en un campo magnético VarioMACS^{TM} (Miltenyi). La columna se equilibra con 5 ml de tampón MACS. Las células de ratón primarias aisladas se aplican luego a la columna. Se deja que pasen las células negativas CD90. La columna se enjuaga con 9 ml (3 X 3 ml) de tampón MACS. La columna se separa luego del imán y se dispone sobre un tubo falcon de 15 ml. Las células CD904 se eluyen añadiendo 5 ml de tampón MACS a la columna y las células unidas se lavan usando el pistón provisto por el fabricante. La incubación de las células con las esferas magnéticas CD90, los lavados y las etapas de la columna VS+ (desde incubación hasta elución) anteriormente mencionada se repiten una vez más. Se combinan las fracciones CD90+ resultantes de las 2 separaciones de columnas. Se espera que el rendimiento de las células de bazo de ratón seleccionadas para CD90+ sea aproximadamente 1X10^{8} células totales.
Se saca una muestra de las células de ratón seleccionadas para CD90+ combinadas para tinción y clasificación en un clasificador celular de anticuerpos fluorescente (FACS) a fin de evaluar su pureza. Se emplea un anticuerpo CD3\varepsilon antirratón de hámster conjugado con PE (PharMingen) para tinción y clasificación de las células seleccionadas para CD90+. Las células seleccionadas para CD90+ de ratón deben ser aproximadamente 93% células CD3+, indicando que las células son 93% células T.
Las células seleccionadas para CD90+ murinas se activan incubando 3X10^{6} células/ml en RPMI + FBS al 5% + PMA 10 ng/ml y Ionomicina 0,5 \mul/ml (Calbiochem) durante una noche a 37ºC. El sobrenadante de estas células de ratón seleccionadas para CD90+ activadas se ensaya para actividad de zcytor17lig, como se describe a continuación. Además, las células de ratón seleccionadas para CD90+ activadas se usan para preparar una genoteca de cDNA, como se describe en el Ejemplo 16 a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 16 Clonación de zcytor17lig de ratón de una genoteca de células seleccionadas para CD90+ de ratón
El cribado de una genoteca de cDNA de células de ratón seleccionadas para CD90+ activadas puede revelar cDNA aislado que es un nuevo miembro de la familia de citocinas de cuatro hélices que codificaría el ortólogo de ratón del zcytor17lig humano. El cDNA se identifica por cribado de la hibridación.
\vskip1.000000\baselineskip
A. Vector para construcción de genoteca seleccionada para CD90+
El vector, pZP7N, se usa para construcción de la genoteca seleccionada para CD3+ (Véase Ejemplo 6A).
\vskip1.000000\baselineskip
B. Preparación de genoteca de cDNA de células seleccionadas para CD90+ de ratón primarias
Se aíslan por centrifugación aproximadamente 1,5X10^{8} células seleccionadas para CD90+ de ratón primarias, estimuladas en ionomicina/PMA (Ejemplo 15). Se aísla RNA total del sedimento celular y se convierte al cDNA bicatenario en el Ejemplo 6B. Este DNA se transfecta posteriormente a células BHK, como se describe en el Ejemplo 6B, y se evalúa la proliferación usando un ensayo de fluorescencia "Alamar blue" (Ejemplo 2B).
Para cribar la genoteca por clonación de captura de secreción, se necesita un complejo, forma ampliada de la genoteca, para transfectar células COS-7. Se disponen 4,8 millones de clones en 110 placas LB-agar de 15cm enriquecidas con 100 \mug/ml de ampicilina, 10 \mug/ml de meticilina. Después de desarrollar las placas durante una noche a 37ºC, las bacterias se cosechan raspando y se sedimentan. Se extrae DNA plasmídico de las bacterias sedimentadas usando Nucleobond-giga^{TM} (Clonetech), siguiendo las instrucciones del fabricante. Este plásmido se usa luego para transfectar células COS-7 en portaobjetos y se criba usando la técnica de captura de secreción descrita a continuación (Ejemplo 17).
\vskip1.000000\baselineskip
C. Cribado de la genoteca de cDNA de ratón activada
Se disponen aproximadamente 5X10^{5} clones en 10 placas LB/Amp Maxi. Las colonias se recogen, desnaturalizan, neutralizan y entrecruzan usando el procedimiento convencional (Sambrook, J. et al. supra.). Se marcan 50 nanogramas del fragmento de PCR RACE de 300 bp 5' (Ejemplo 14) con ^{32}P, usando el kit de marcado de cebadores aleatorio Prime-Itr RmT (Stratagene). Los 10 filtros se hibridan con esta sonda marcada a 65ºC durante una noche, usando la solución de hibridación ExpressHyb^{TM} (Clontech). Los filtros se lavan luego secuencialmente a 60ºC durante 1 hora, tres veces con 0,2xSSC (NaCl 30 mM, citrato sódico 3 mM, pH 7,0), SDS al 0,1%; y luego a 65ºC durante 1 hora. Los filtros se exponen a -80ºC durante una noche, y se revela la película de rayos X. Se sacan los tapones de agar que contienen las colonias positivas, y los clones se disponen en placas LB/Amp de 10 cm. Las colonias luego se recogen por filtración y se hibridan nuevamente, siguiendo el mismo procedimiento ya descrito. Los clones de DNA sencillos se aíslan y secuencian usando métodos estándar, para identificar el cDNA de ratón.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 17 Zcytor17lig de ratón no se une al receptor soluble zcytor17 humano en el ensayo de captura de secreción
Se transfectó el DNA del clon de ratón mzcytor17lig/pZP7 en células COS, y la unión de zcytor17 que comprendía los receptores solubles (receptor soluble de zcytor17 humano, zcytor17-Fc4 (Ejemplo 10), o heterodímeros del receptor soluble (zcytor17/WSX-1 o BaF3/zcytor17/OSMRbeta), a las células COS transfectadas se ensayó por un ensayo de captura de secreción (Ejemplo 12). El ensayo confirmó que el zcytor17lig de ratón se une al receptor soluble de zcytor17 humano.
La transfección de células COS se realizó según el Ejemplo 12, usando aproximadamente 0,7 \mug de cDNA de zcytor17lig de ratón (Ejemplo 16) en 3 \mul.
La captura de secreción se llevó a cabo según el ejemplo 12 usando, por ejemplo, 1 \mug/ml de la proteína de fusión Fc4 del receptor soluble zcytor17 (Ejemplo 10) (o heterodímeros del receptor soluble que comprenden zcytor17 como se describe en esta memoria) en TNB, y Ig-HRP antihumano de cabra diluido 1:200 (específico de Fc) en TNB para el anticuerpo detectable. La unión positiva del receptor soluble zcytor17 humano a las células fijas preparadas no se detectó con el reactivo de fluoresceína tiramida como para el Ejemplo 12. Las células se conservaron y visualizaron según el Ejemplo 12.
Los resultados indicaron que el zcytor17lig de ratón no se une al receptor soluble zcytor17 humano (o a los heterodímeros del receptor soluble que comprenden zcytor17, como se describe en esta memoria).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 18 Expresión de zcytor17lig de ratón en células mamíferas Expresión mamífera de zcytor17lig de ratón
Las células BHK 570 (ATCC No: CRL-10314) se dispusieron en placas de 10 cm para cultivo de tejido y se dejaron desarrollar hasta aproximadamente 20% confluencia durante una noche a 37ºC, 5% CO_{2}, en medio DMEM/FBS (DMEM, Gibco/medio de Alta Glucosa BRL; Gibco BRL, Gaithersburg, MD), suero bovino fetal al 5% (Hyclone, Logan, UT), L-glutamina 1 mM (JRH Biosciences, Lenexa, KS), piruvato sódico 1 mM (Gibco BRL). Las células se transfectaron luego con el plásmido mzcytor17lig/pZP7X (Ejemplo 14), usando un kit de transfección estable de mamífero Lipofectamine (GibcoBRL) según las instrucciones del fabricante.
Un día después de la transfección, las células se dividieron 1:10 y 1:20 en el medio de selección (medio DMEM/FBS con la adición de metotrexato 1 mM (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)) en placas de 150 mm. El medio en las células se reemplazó con medio de selección nuevo en el día 5 pos-transfección. Aproximadamente 10 días pos-transfección, las colonias resistentes al metotrexato se tripsinizaron, y las células se combinaron y dispusieron en placas de matraces de cultivo a gran escala. Una vez que se desarrollaron las células hasta aproximadamente 90% de confluencia, se enjuagaron con PBS tres veces, y se cultivaron con medio ESTEP2 libre de suero (DMEM (Gibco BRL), 0,11 g/l piruvato de Na, 3,7 g/l NaHCO_{3}, 2,5 mg/l insulina, 5 mg/l transferrina, pH 7,0), medio condicionado. El medio condicionado se recogió tres días después, y se puso en un ensayo de proliferación BaF3, usando Alamar Blue, descrito en el Ejemplo 19 a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 19 Zcytor17lig de ratón no activa el receptor humano en el ensayo de BaF3 que usa Alamar Blue
Se evaluó la proliferación de células BaF3/zcytor17, BaF3/zcytor17/OSMRbeta y BaF3/zcytor17/WSX-1 (Ejemplo 4, y 5B) usando medio condicionado libre de suero de células BHK que expresan zcytor17lig de ratón (Ejemplo
18).
Se centrifugaron células BaF3/Zcytor17, BaF3/zcytor17/OSMRbeta y BaF3/zcytor17/WSX-1, se lavaron y se dispusieron en placas en medio libre de mIL-3, como se describe en el Ejemplo 5B. El medio condicionado de las células BHK que expresan zcytor17lig de ratón (Ejemplo 18) se diluyó con medio libre de mIL-3 hasta concentraciones de 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,125%, 1,5%, 0,75% y 0,375%. El ensayo de proliferación se realizó de acuerdo con el Ejemplo 5B. Los resultados de este ensayo fueron negativos, indicando que el zcytorl71ig de ratón no activa el zcytor17 humano o los complejos receptor zcytor17/OSMRbeta y zcytor17/WSX-1.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 20 Zcytor17lig humano activa el receptor zcytor17/OSMRbeta humano en ensayo de luciferasa A. Construcción de la línea celular BaF3/KZX34/zcytor17
Se construyó el plásmido KZ134 con los oligonucleótidos complementarios ZC12/749 (SEC ID NO:44) y ZC 12,748 (SEC ID NO:45) que contienen los elementos de unión al factor de transcripción STAT de 4 genes, que incluye un elemento inducible c-fos Sis modificado (m67SEE, o hSIE) (Sadowski, H. et al., Science 261: 1739-1744, 1993), el gen p21 SIE1 de p21 WAF1 (Chin, Y. et al., Science 272: 719-722, 1996), el elemento de respuesta de la glándula mamaria del gen de \beta-caseína (Schmitt-Ney, M. et al., Mol. Cell. Biol. 11: 3745-3755, 1991), y un elemento inducible STAT del gen Fcg RI, (Seidel, H. et al., Proc. Natl Acad. Sci. 92: 3041-3045, 1995). Estos oligonucleótidos contienen extremos compatibles Asp718-XhoI y se ligaron, usando métodos convencionales, a un vector indicador de luciferasa de luciérnaga receptor con un promotor c-fos (Poulsen, L.K. et al., J. Biol. Chem. 273: 6229-6232, 1998) digerido con las mismas enzimas y contienen un marcador seleccionable de neomicina. El plásmido KZ134 se usó para transfectar establemente células BaF3, usando métodos de transfección y selección convencionales, para elaborar la línea celular BaF3/KZ134.
Se construyó una línea celular indicadora estable BaF3/K2134, que expresa el receptor zcytor17 o el receptor zcytor17/OSMRbeta de longitud total, según el Ejemplo 4. Los clones se diluyeron, se dispusieron en placas y se seleccionaron usando técnicas convencionales. Los clones se cribaron por ensayo de luciferasa (véase Ejemplo 20B a continuación), usando el medio condicionado zcytor17lig humano o la proteína zcytor17lig purificada (véase el Ejemplo 35 a continuación) como inductor. Se seleccionaron los clones con la respuesta de luciferasa más alta (vía luciferasa STAT) y el fondo más bajo. Se seleccionaron las líneas celulares transfectantes estables. Las líneas celulares se denominaron BaF3/KZ134/zcytor17 o BaF3/KZ134/zcytor17/OSMRbeta, dependiendo de los receptores transfectados a la línea celular.
De modo similar, también se construyeron las líneas celulares BHK, usando el método descrito en esta memoria, y se usaron en los ensayos de luciferasa aquí descritos. Las líneas celulares se denominaron BHK/KZ134/zcytor17 o BHK7KZ134/zcytor17/OSMRbeta, dependiendo de los receptores transfectados a la línea celular.
\vskip1.000000\baselineskip
B. Zcytor17lig humano activa el receptor zcytor17 humano en el ensayo de luciferasa de BaF3/KZ134/zcytor17/QSMRbeta o BHK/KZ134/zcytor17/OSMRbeta
Se centrifugaron células BaF3/KZ134/zcytor17 y BaF3/KZ134/zcytor17/OSMRbeta, y se lavaron en medio libre de mIL-3. Las células se centrifugaron y lavaron 3 veces para asegurar la eliminación de mIL-3. Las células se contaron luego en un hematocímetro. Las células se dispusieron en placas de 96 pocillos a aproximadamente 30.000 células por pocillo en un volumen de 100 \mul por pocillo, usando el medio libre de mIL-3. Se empleó el mismo procedimiento para células BaF3/KZ134 no transfectadas, para uso como control en el ensayo subsiguiente. Las células BHK/KZ134/zcytor17 o BHK/KZ134/zcytor17/OSMRbeta se dispusieron en placas de 96 pocillos a 15.000 células por pocillo en 100 \mul de medio. Se utilizaron células BHK/KZ134 parentales como control.
La activación de STAT de las células BaF3/KZl34/Zcytor17, BaF3/KZ134/zcytor17/OSMRbeta, BHK/KZ134/
zcytor17 o BHJC/KZ134/zcytor17/OSMRbeta se evaluó usando (1) medio condicionado de células BHK570 transfectadas con zcytor17lig humano (Ejemplo 7), (2) medio condicionado de células BHK570 transfectadas con zcytor17lig de ratón (Ejemplo 18), (3) zcytor17lig humano purificado (Ejemplo 35) o (4) medio libre de mIL-3 para medir la respuesta del control del medio solamente. Se diluyó medio condicionado con medio libre de mIL-3 RPMI hasta concentraciones de 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,125%, 1,5%, 0,75% y 0,375%. Se diluyó zcytor17lig humano purificado hasta una concentración de 1200, 600, 300, 150, 75, 37,5, 18,75 ó 9,4 pM. Se añadieron 100 microlitros del medio condicionado diluido o proteína a las células BaF3/KZ134/Zcytor17, BaF3/KZ134/zcytor17/OSMRbeta, BHK/KZ134/zcytor17 o BHK/KZ134/zcytor17/OSMRbeta. El ensayo que usa el medio condicionado se realizó en paralelo a células BaF3/KZ134 o BHK/K2134 no transfectadas, como control. El volumen de ensayo total fue 200 \mul. Las placas de ensayo se incubaron a 37ºC, 5% CO_{2} durante 24 horas, momento en el cual las células BaF3 se sedimentaron por centrifugación a 2000 rpm durante 10 min., y luego el medio se aspiró, y se añadieron 25 \mul de tampón de lisis (Promega). Para las líneas celulares BHK, la etapa de centrifugación no fue necesaria, ya que las células son adherentes. Después de 10 minutos a temperatura ambiente, las placas se midieron para activación del constructo indicador STAT, leyéndolas en un luminómetro (Labsystems Luminoskan, modelo RS) que añadió 40 \mul de sustrato del ensayo de luciferasa (Promega) a una integración de cinco segundos.
Los resultados de este ensayo confirmaron que la respuesta del indicador STAT de las células BaF3/KZ134/
zcytor17/OSMRbeta y BHK/KZ134/zcytor17/OSMRbeta al zcytor17lig humano, en comparación con las células BaF3/KZ134/zcytor17, las células BHK/KZ134/zcytor17 o las células no transfectadas BaF3/KZ134 o BHK/KZ134 control, demostraron que la respuesta fue mediada por los receptores zcytor17/OSHRbeta. Los resultados también demostraron que el zcytor17lig de ratón no activa el ensayo indicador STAT a través del complejo receptor
humano.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 21 Zcytor17lig de ratón es activo en el ensayo de médula ósea de ratón A. Aislamiento de células de médula de baja densidad, no adherentes
Se obtiene una aspiración reciente de fémur de ratón (médula) de ratones macho Balb/C o C57BL/6 de 6-10 semanas de vida. La médula se lava con RPMI+10% FBS (JRH, Lenexa KS; Hyclone, Logan UT) y se suspende en RPMI+ FBS al 10% como suspensión celular de médula completa. La suspensión celular de médula completa se somete luego a un gradiente de densidad (Nycoprep, 1.077, Animal; Gibco BRL) para enriquecer las células de baja densidad, principalmente mononucleares, de la siguiente manera: la suspensión celular de médula completa (aproximadamente 8 ml) se introduce cautelosamente con pipeta a la parte superior de aproximadamente 5 ml de solución en gradiente Nycoprep en un tubo cónico de 15 ml, y luego se centrifuga a 600X g durante 20 minutos. La capa de la interface, que contiene las células mononucleares de baja densidad, se elimina luego, se lava con exceso de RPMI+ FBS al 10% y se sedimenta por centrifugación a 400X g durante 5-10 minutos. Este sedimento se resuspende en RPMI +FBS al 10% y se coloca en un matraz T-75 a aproximadamente 10^{6} células/ml, y se incuba a 37ºC 5% CO_{2} durante aproximadamente 2 horas. Las células resultantes en suspensión son células de médula de baja densidad no adherentes
(NA LD).
\vskip1.000000\baselineskip
B. Ensayo de 96 pocillos
Se disponen células de médula NA LD a 25.000 hasta 45.000 células/pocillo en placas de cultivo de tejido de 96 pocillos en RPMI + FBS al 10% + 1 ng/mL factor de células madre de ratón (mSCF) (R&D Systems, Minneapolis, MN), más medio condicionado al 5% de uno de los siguientes: (1) células BHK 570 que expresan zcytor17lig de ratón (Ejemplo 18), (2) células BHK 570 que expresan zcytor17lig humano (Ejemplo 7) o (3) células BHK 570 control que contienen vector y que no expresan ningún ligando. Estas células se someten luego a una diversidad de tratamientos de citocinas para ensayar la expansión o diferenciación de células hematopoyéticas de la médula. Para los ensayos, las células de médula de ratón NA LD dispuestas en placas se someten a Interleucina 15 humana (hIL-15) (R&D Systems), o a una de un panel de otras citocinas (R&D Systems). La dilución en serie de hIL-15, u otras citocinas, se ensaya con una dilución en serie doble de aproximadamente 50 ng/ml hasta aproximadamente 0,5 ng/ml concentración. Después de 8 a 12 días, se asignan los puntajes a los ensayos de 96 pocillos para proliferación celular por el ensayo Alamar blue, como se describe en el Ejemplo 5B.
\vskip1.000000\baselineskip
C. Resultados del ensayo de médula NA LD de 96 pocillos
El medio condicionado de células BHK que expresan zcytorl7lig de ratón y humano puede promover la expansión de una población de células hematopoyéticas, solo o en sinergia con otras citocinas de la médula de ratón NA LD, en comparación con el medio condicionado BHK control. La población de células hematopoyéticas expandidas por el zcytor17lig de ratón con o sin otras citocinas, y aquellas células hematopoyéticas expandidas por el zcytor17lig humano con o sin otras citocinas, se propagan más en cultivo celular. Estas células hematopoyéticas se tiñen con un anticuerpo de linfocitos citolíticos naturales anti-Pan marcados con Ficoeritritina (PharMingen) y se someten a análisis de citometría de flujo, que demostró que las células expandidas se tiñen positivamente para este marcador de linfocitos citolíticos naturales (NK). De modo similar, otros marcadores celulares hematopoyéticos se pueden usar para determinar la expansión, por ejemplo, de células T CD4+ o CD8+, otras poblaciones de células T, células B y otros marcadores celulares inmunitarios.
El mismo ensayo de 96 pocillos se lleva a cabo usando células de médula humana nuevas adquiridas de Poietic Technologies, Gaithersburg, MD. De nuevo, un resultado positivo muestra que el zcytor17lig solo o en sinergia con otras citocinas, el zcytor17lig de ratón o humano pueden expandir una población de células hematopoyéticas que se tiñen positivamente para marcadores celulares específicos, como se analizó anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 22 Constructos para generar ratones transgénicos zcytor17lig A. Constructo para expresar zcytor17lig humano del promotor MT-1
Se diseñaron oligonucleótidos para generar un fragmento PCR que contenía una secuencia Kozak de consenso y la región codificante de zcytor17lig humano. Estos oligonucleótidos se diseñaron con un sitio FseI en el extremo 5' y un sitio AscI en el extremo 3' para facilitar la clonación en (a) pMT12-8, un vector transgénico estándar, o (b) pKF051, un vector transgénico específico de linfoides (Ejemplo 22B).
Las reacciones PCR se llevan a cabo con aproximadamente 200 ng de molde zcytor17lig humano (SEC ID NO:1) y oligonucleótidos diseñados para ampliar la porción activa o de longitud total del zcytor17lig. Las condiciones de reacción PCR se determinan usando métodos conocidos en la técnica. Los productos PCR se separan por electroforesis de gel de agarosa y se purifican usando un kit de extracción de gel QiaQuick^{TM} (Qiagen). El fragmento de DNA aislado, de tamaño correcto, se digiere con FseI y AscI (Boerhinger-Mannheim), se precipita con etanol y se liga en pMT12-8 previamente digerido con FseI y AscI. El plásmido pMT12-8, diseñado para expresar un gen de interés en hígado y otros tejidos de ratón transgénico, contiene un casete de expresión flanqueado por 10 kb de DNA MT-1 5' y 7 kb de DNA MT-1 3'. El casete de expresión comprende el promotor MT-1, la insulina de rata intrón D, un polienlazador para la inserción del clon deseado y la secuencia poly A de la hormona de crecimiento humana (hGH).
Se electropora aproximadamente un microlitro de cada reacción de ligadura en células competentes DHIOB ElectroMax^{TM} (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y se coloca en placas LB que contienen 100 \mug/ml ampicilina, y se incuba durante una noche. Las colonias se recogen y se desarrollan en medio LB que contiene 100 \mug/ml ampicilina. Se prepara DNA miniprep a partir de los clones obtenidos y se criba el inserto de zcytor17lig humano o digestión de restricción con EcoRI solo, o FseI y AscI combinados, y se somete luego a electroforesis en gel de agarosa. Se llevan a cabo maxipreparaciones del pMT-zcytor17lig humano correcto. Un fragmento SalI que contiene las secuencias flanco 5' y 3', el promotor MT-1, la insulina de rata II intrón, cDNA zcytor17lig humano y la secuencia poly A hGH se prepara para microinyección a oocitos murinos fertilizados. La microinyección y la producción de ratones transgénicos se realiza como se describe en Hogan, B. et al. Manipulating the Mouse Embryo, 2^{a} ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1994.
\vskip1.000000\baselineskip
B. Constructo para expresión de zcytor17lig humano del promotor E\muLCK específico de linfoides
Se designan oligonucleótidos para generar un fragmento PCR que contiene una secuencia Kozak de consenso y la región codificante de zcytor17lig humano. Estos oligonucleótidos se diseñan con un sitio FseI en el extremo 5' y un sitio AscI en el extremo 3' para facilitar la clonación en pKFO51, un vector transgénico específico de linfoides.
Las reacciones PCR se llevan a cabo con aproximadamente 200 ng de molde zcytor17lig humano (SEC ID NO:l) y oligonucleótidos diseñados para ampliar la porción activa o de longitud total del zcytor17lig. Se lleva a cabo una reacción PCR usando métodos conocidos en la técnica. El fragmento de DNA aislado, de tamaño correcto, se digiere con FseI y AscI (Boerhinger-Mannheim), se precipita con etanol y se liga a pKF051 previamente digerido con FseI y AscI. El vector pKF051 transgénico deriva de p1026X (Iritani, B.M., et al., EMBO J. 16: 7019-31, 1997) y contiene el promotor proximal Ick específico de células T, la inmunoglobulina específica de células B/T, el potenciador de cadena pesada \mu de inmunoglobulina, un polienlazador para la inserción del clon deseado, y un gen hGH mutado que codifica la proteína de la hormona del crecimiento humana (que provee intrones 3' y una señal de poliadenilación).
Aproximadamente 1 microlitro de cada reacción de ligadura se electropora, se dispone en placas, se recogen los clones y se criba el inserto zcytor17lig humano por digestión de restricción como se describió anteriormente. Se verifica un clon correcto de pKF05I-zcytor17lig secuenciando, y se realiza una maxipreparación de este clon. Un fragmento NotI, que contiene el promotor lck proximal y el potenciador \mu de inmunoglobulina (E\muLCK), cDNA de zcytor17lig y el gen hGH mutado se prepara para microinyección a oocitos de murino fertilizados.
\vskip1.000000\baselineskip
C. Constructo para expresar zcytor17lig de ratón del promotor EF1alfa
Los cebadores ZC41,498 (SEC ID NO:86) y ZC41,496 (SEC ID NO:87) se usaron para PCR de un molde de la genoteca de cDNA de testículo de ratón. Estas reacciones PCR se llevaron a cabo exitosamente en volúmenes de aproximadamente 50 \mul con o sin DMSO al 10%, usando pfu turbo polimerasa (Stratagene) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante; con una aplicación adicional de arranque con exceso de temperatura de cera que emplea exceso de temperatura 50s (Molecular Bioproducts, Inc. San Diego, CA). El ciclado térmico de PCR se efectuó con un solo ciclo de 94ºC durante 4 min; seguido de 40 ciclos de 94ºC: 30 segundos, 48ºC: 30 segundos, 72ºC: 50 segundos; con extensión adicional final a 72ºC durante 7 minutos. Las dos reacciones PCR se combinaron y purificaron usando agarosa de baja fusión y enzima de digestión de agarosa Gelase (Epicenter, Inc. Madison, WI) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Los productos PCR con secuencias de DNA revelaron una secuencia de cDNA zcytor17 murina (SEC ID NO:90) que comprendía un ORF idéntico a la SEC ID NO: 10, confirmando que la SEC ID NO:10 codificaba el polipéptido zcytor17lig de ratón. Los cebadores PCR, ZC41583 (SEC ID NO:88) y ZC41584 (SEC ID NO:89), se emplearon luego para añadir los sitios de restricción FseI y AscI, y una secuencia Kozak parcial al marco de lectura abierto de mcytor17lig y al codón de terminación (SEC ID NO:92). Se usó un ciclador térmico Robocycler 40 (Stratagene) para pasar un gradiente de temperatura de temperaturas de renaturalización y ciclado de la siguiente manera. Se aplicó Pfu turbo polimerasa (Stratagene) como se describió anteriormente, pero solamente en DMSO al 10%. El ciclado se llevó a cabo con un solo ciclo de 94ºC durante 4 min; seguido de 20 ciclos de 94ºC: 30 segundos, gradiente de 65ºC a 51ºC: 30 segundos, 72ºC: 1 minuto; y una sola extensión a 72ºC durante 7 minutos. El molde de esta segunda reacción de ciclado térmico fue 1 \mul del producto PCR purificado con gel inicial mcytor17lig anterior. El producto PCR resultante de las tres reacciones más bajas se combinó y purificó en gel usando el método Gelase (Epicenter) ya descrito. Este fragmento purificado se digirió luego con FseI y AscI, y se ligó al vector pZP7X modificado para tener los sitios FseI y AscI en su sitio de clonación. Esto se envió a secuenciación para confirmar la secuencia correcta. La secuencia de cDNA murino clonado se representa en la SEC ID NO:90, y la correspondiente secuencia de polipéptidos se muestra en la SEC ID NO:91 (que es idéntica a la SEC ID NO:11).
El fragmento de DNA aislado, de tamaño correcto, digerido con FseI y AscI (Boerhinger-Mannheim) se subclonó en un plásmido que contenía el promotor EF1alfa previamente digerido con FseI y AscI. Se realizaron las maxipreparaciones del zcytor17lig de ratón EF1alfa. El casete de expresión contiene el promotor EF1alfa (con un sitio FseI eliminado), el intrón EF1alfa, el sitio tipo SUR IRES para facilitar la expresión, un polienlazador flanqueado con sitios de insulina II de rata en el extremo 5' que añade los sitios FseI, PmeI, AscI, para inserción del clon deseado y la secuencia poly A de la hormona del crecimiento humana (hGH). Un fragmento NotI de 7,5kb que contiene el casete de expresión del promotor EF1alfa y zcytor17lig de ratón se preparó para usarse para microinyección a oocitos murinos fertilizados. El plásmido EF1alfa se obtuvo de Louis-Marie del Laboratoire de Differenciation Cellulaire, como se describe en Taboit-Dameron et al., 1999, Transgenic Research 8: 223-235.
\vskip1.000000\baselineskip
D. Constructo para expresar zcytor17lig de ratón del promotor E\muLCK específico de linfoides
Se diseñaron oligonucleótidos para generar un fragmento PCR que contenía una secuencia Kozak de consenso y la región codificante zcytor17lig de ratón. Estos oligonucleótidos se diseñaron con un sitio FseI en el extremo 5' y un sitio AscI en el extremo 3' para facilitar la clonación a pKFO51 (véase el Ejemplo 22B anterior).
El fragmento de DNA de zcytor17lig aislado, del tamaño correcto, usado en los constructos EF1alfa, digerido con FseI y AscI (Boerhinger-Mannheim), se subclonó en un plásmido que contenía pKF051, un vector transgénico específico de linfoides. El vector transgénico pKFO51 deriva de p1026X (Iritani, B.M., et al., EMBO J, 16: 7019-31, 1997) y contiene el promotor proximal Ick específico de células T, el potenciador de cadena pesada de inmunoglobulina \mu específica de células B/T, un polienlazador para la inserción del clon deseado y un gen hGH mutado que codifica una proteína de la hormona del crecimiento humana inactiva (proporcionando intrones 3' y una señal de poliadenilación). Se preparó un fragmento NotI de 6,5kb, que contenía el promotor proximal lck y el potenciador de inmunoglobulina \mu (E\muLCK), cDNA de zcytor17lig de ratón y el gen hGH mutado, para usar para microinyección a oocitos murinos fertilizados (Ejemplo 41).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 23 Construcción de vectores de expresión mamífera que expresan zcytor17lig-CEE A. Construcción de zCytor17Lig-CEE/p2MP21
Se construyó un plásmido de expresión que contenía todo o parte de un polinucleótido que codifica el zCytor17lig humano, vía recombinación homóloga. El plásmido se denominó zCytor17Lig-CEE/pZMP2l.
La construcción de zCytor17Lig-CEE/pZMP21 se logra generando un fragmento zCytor17Lig-CEE (SEC ID NO:95) (su correspondiente secuencia de aminoácidos se muestra en la SEC ID IG:96), usando ampliación PCR. El molde de DNA utilizado para la producción del fragmento zCytorl7Lig-CEE fue zCytor17Lig/pZP7nx. Los cebadores utilizados para la producción del fragmento zCytor17Lig-CEE fueron: (1) ZC41607 (SEC ID NO:97) (secuencia sentido), que incluye desde el extremo 5' hasta el extremo 3': 28bp de la secuencia flanqueadora del vector (5' del inserto) y 21 bp correspondientes a la secuencia 5' de zCytor17Lig; y (2) ZC41605 (SEC ID NO:98) (secuencia antisentido), que incluye desde el extremo 5' al extremo 3': 37 bp de la secuencia flanqueadora del vector (3' del inserto), 3 bp del codón finalizador, 21 bp que codifican un marcador C-terminal EE y 21 bp correspondientes al extremo 3' de la secuencia zCytor17Lig. El fragmento resultante de la ampliación PCR anterior es una copia del molde zCytor17Lig con la adición de un marcador C-terminal EE, lo que proporciona un producto final zCytor17Lig-CEE.
Las reacciones PCR se realizaron de la siguiente manera: A un volumen final de 100 \mul se le añadieron: 10 \mul de tampón de reacción de polimerasa Taq 10x con MgCl 15 mM (Gibco), 1 \mul de DNA Polimerasa Taq (5 unidades/\mul, Gibco), 3 \mul de dNTP 10 mM, 78 \mul dH_{2}0, 3 \mul de un stock 20 pmol/\mul) del cebador ZC41607 (SEC ID NO:97) 3 \mul de un stock 20 pmol/\mul del cebador ZC43605 (SEC ID NO:98) y 2 \mul de un stock 0,13 \mug/\mul del DNA del molde zCytor17Lig. Se añadió a la mezcla un volumen equivalente a 50 \mul de aceite mineral. La reacción se calentó hasta 94ºC durante 5 minutos, seguida de 35 ciclos a 94ºC durante 1 minuto; 55ºC durante 2 minutos; 72ºC durante 3 minutos; seguidos de una extensión de 10 minutos a 72ºC, y se mantuvo a 4ºC hasta que se recogió la reacción.
El plásmido pZMP21 se digirió por restricción con la enzima BglII, se limpió con un kit de purificación PCR QiaQuick (Qiagen), usando un protocolo de microcentrifugación, y se usó para recombinación con el fragmento PCR. Se construyó el plásmido pZMP21 a partir de pZMP20, que se construyó a partir de pZP9 (depositado en The American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, y designado con el No. 98668) con elementos genéticos de levadura tomados de pRS316 (depositado en The American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, y designado con el No. 77145), un elemento IRES de poliovirus y el dominio extracelular de CD8, truncado en el extremo carboxiterminal del dominio de transmembrana. PZMP21 es un vector de expresión mamífera que contiene un casete de expresión que tiene el promotor MPSV, intrón del péptido de señal de inmunoglobulina, múltiples sitios de restricción de secuencias codificantes, un codón finalizador y un terminador de la hormona del crecimiento humana. El plásmido también tiene un origen de replicación de E. coli, una unidad de expresión de marcador seleccionable de mamífero que tiene un promotor SV40, potenciador y origen de replicación, un gen DHFR, el terminador SV40, como también las secuencias URA3 y CEN-ARS necesarias para la selección y replicación en S. cerevisiae.
Se combinaron independientemente 50 microlitros de células de levadura competentes (S. cerevisiae) con 100 ng de plásmido cortado, 5 \mul de la mezcla PCR previamente descrita, y se transfirieron a una cubeta de electroporación de 0,2 cm. La mezcla levadura/DNA se electropulsó a 0,75 kV (5 kV/cm), ohms infinito, 25 \muF. A cada cubeta se le habían añadido 600 \mul de sorbitol 1,2 M, y la levadura se dispuso en dos placas URA-D en una alícuota de 100 \mul y en una alícuota de 300 \mul y se incubó a 30ºC. Después de aproximadamente 72 horas, los transformantes de levadura Ura+ de una de las placas se resuspendieron en 1 ml de H_{2}O y se centrifugaron brevemente para sedimentar las células de levadura. El sedimento celular se resuspendió en 500 \mul de tampón de lisis (Triton X-100 al 2%, SDS al 1%, NaCl 100 mM, Tris 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM). Los 500 \mul de la mezcla de lisis se añadieron a un tubo Eppendorf que contenía 300 \mul esferas de vidrio lavadas con ácido, 600 \mum y 300 \mul fenol-cloroformo. Se agitó en vórtex durante dos o tres intervalos de 1 minuto, luego se centrifugó durante 5 minutos en una máquina centrífuga Eppendorf a velocidad máxima. Se transfirieron 300 microlitros de la fase acuosa a un tubo nuevo, y precipitó el DNA con 600 \mul de etanol al 100% (EtOH), seguido de centrifugación durante 10 minutos a 4ºC. El sedimento de DNA se lavó luego con 500 \mul de EtOH al 70%, luego se centrifugó durante 1 minuto a 4ºC. El sedimento de DNA se resuspendió en 30 \mul de H_{2}O.
Se realizó la transformación de células de E. coli competentes (MC1061) con 5 \mul de prep de DNA de levadura y 50 \mul de células MC1061. Las células se electropulsaron a 2,0 kV, 25 \muF y 400 ohms(\Omega). Tras la electroporación, se añadieron 600 \mul SOC (2% Bacto' Tryptone (Difco, Detroit, MI), extracto de levadura al 0,5% (Difco), NaCl 10 mM, KCl 2,5 mM, MgCl_{2} 10 mM, MgSO_{4} 10 mM, glucosa 20 mM). Las células de E. coli electroporadas se dispusieron en dos placas de caldo LB AMP LB (Lennox) en alícuotas de 200 \mul y 50 \mul (1,8% Bacto Agar (Difco), 100 mg/L Ampicilina). Las placas se incubaron boca abajo durante aproximadamente 24 horas a 37ºC. Se seleccionaron aleatoriamente tres colonias resistentes a Ampicilina y se tomaron para análisis de secuencias del inserto. Se aisló DNA plasmídico a gran escala de un clon con la secuencia confirmada, usando el kit Qiagen Maxi (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
\vskip1.000000\baselineskip
B. Expresión mamífera de zcytor17lig humano
Se produjo la proteína zCytor17Lig de longitud total en células BHK transfectadas con zCytor17Lig-CEE/pZMP21 (Ejemplo 23A). Las células BHK 570 (ATCC CRL-10314) se dispusieron en matraces para cultivo de tejido T75 y se dejaron desarrollar hasta aproximadamente 50 a 70% confluencia a 37ºC, 5% CO_{2}, en medio de desarrollo (SL7V4, FBS al 5%, pen/estrep al 1%). Las células luego se transfectaron con zCytor17Lig-CEE/pZMP21 por transfección mediada por liposomas (usando Lipofectamine^{TM}; Life Technologies), en medio libre de suero (SF) (SL7V4). El plásmido (16 \mug) se diluyó en tubos de 1,5 ml hasta un volumen final total de 640 \mul con medio SF. Se mezclaron 35 microlitros de la mezcla de lípidos con 605 \mul de medio, y la mezcla resultante se dejó incubar aproximadamente 15 minutos a temperatura ambiente. Se añadieron luego 5 ml de medio SF a la mezcla DNA:lípido. Las células se enjuagaron una vez con 10 ml de PBS, el PBS se decantó y se añadió la mezcla DNA:lípido. Las células se incubaron a 37ºC durante cinco horas, luego se añadieron 15 ml de medio (SL7V4, FBS al 5%, pen/estrep al 1%) a cada placa. Las placas se incubaron a 37ºC durante una noche y la mezcla DNA:lípido se reemplazó con medio de selección (SL7V4, FBS al 5%, pen/estrep al 1%, 1 \muM metotrexato) al día siguiente. Aproximadamente 10 días después de la transfección, las colonias resistentes al metotrexato del matraz de transfección de T75 se tripsinizaron, y las células se combinaron y colocaron en un matraz T-162, y se transfirieron para cultivo a gran escala.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 24 Expresión del receptor soluble zcytor17 en E. coli A. Construcción del vector de expresión pCMH01 que expresa el polipéptido de fusión huzcytor17/MBP-6H
Se construyó un plásmido de expresión que contenía un polinucleótido que codifica un receptor soluble zcytor17 condensado C-terminalmente a la proteína de unión de maltosa (MBP), vía recombinación homóloga. El polipéptido de fusión contiene una porción MBP de aproximadamente 388 aminoácidos N-terminal condensada a cualquiera de los receptores solubles zcytor17 descritos en la presente memoria. Se aisló un fragmento de cDNA de zcytor17 (SEC ID NO:4), usando PCR como se describe aquí. Se usaron dos cebadores en la producción del fragmento zcytor17 en una reacción PCR convencional: (1) uno contenía aproximadamente 40 bp de la secuencia flanqueadora del vector y aproximadamente 25 bp correspondientes al término amino del zcytor17, y (2) el otro contenía aproximadamente 40 bp del extremo 3' correspondientes a la secuencia flanqueadora del vector y aproximadamente 25 bp correspondientes al término carboxilo del zcytor17. Se prepararon 2 \mul de la reacción PCR de 100 \mul en un gel de agarosa al 1,0% con 1 x tampón TBE para análisis, y se observó el fragmento aproximadamente esperado. El resto de la reacción PCR se combinó con el segundo tubo PCR y precipitó con 400 \mul de etanol absoluto. El DNA precipitado se usó para recombinar en el vector receptor cortado con SmaI, pTAPHO, para producir el constructo que codifica la fusión MBP-zcytor17, como se describe a continuación.
El plásmido pTAPHO derivó de los plásmidos pRS316 y pMAL-c2. El plásmido pRS316 es un vector trasportador de Saccharomyces cerevisiae (Hieter P. y Sikorski, R. Genetics 122: 19-27, 1989). pMAL-C2 (NEB) es un plásmido de expresión de E. coli. Porta el promotor tac que conduce MalE (gen que codifica MBP) seguido por su marcador His, sitio n de escisión de trombina, un sitio de clonación y el terminador rrnB. El vector pTAPHO se construyó usando recombinación homóloga de levadura. Se recombinaron 100 ng de pMAL-c2 cortado con EcoR1 con 1 \mug de pRS316 cortado con Pvu1, 1 \mug enlazador y 1 \mug pRS315 cortado con ScaI/EcoR1. El enlazador consistía en los oligos zc19,372 (SEC ID NO:157) (100 pmol): zc19,351 (SEC ID NO:158) (1 pmol): zc19,352 (SEC ID NO:159) (1 pmol) y zc19,371 (SEC ID NO:160) (100 pmol) combinados en una reacción PCR. Las condiciones fueron las siguientes: 10 ciclos de 94ºC durante 30 segundos, 50ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 30 segundos; seguidos de impregnación a 4ºC. Los productos PCR se concentraron vía precipitación de etanol al 100%.
Se combinaron 100 microlitros de células de levadura competentes (S. cerevisiae) con 10 \mul de una mezcla que contenía aproximadamente 1 \mug del inserto zcytor17 humano, y 100 ng del vector pTAP170 digerido con SmaI, y se transfirieron a una cubeta de electroporación de 0,2 cm. La mezcla levadura/DNA se electropulsó a 0,75 kV (5 kV/cm), ohms infinito, 25 \muF. A cada cubeta se le añadieron 600 \mul de sorbitol 1,2 M. La levadura se dispuso luego en dos placas URA D en alícuotas de 300 \mul y se incubó a 30ºC.
Después de aproximadamente 48 horas, se recogieron los transformantes de levadura Ura+ de una de las placas, se aisló DNA y se transformó en células de E. coli electrocompetentes (p. ej., MC1061, Casadaban et al. J. Mol. Biol. 138, 179-207), y se dispuso en placas MM/CA +KAN de 25 \mug/L (Pryor y Leiting, Protein Expression and Purification 10: 309-319, 1997) usando procedimientos convencionales. Las células se desarrollaron en MM/CA con 25 \mug/ml Kanomiacina durante dos horas, agitando a 37ºC. Se indujo 1 ml del cultivo con IPTG 1 mM. Dos a cuatro horas después, los 250 \mul de cada cultivo se mezclaron con 250 \mul de esferas de vidrio lavadas con ácido y 250 \mul tampón Thorner con pME al 5% y tinte (8M urea, Tris 100 mM, pH7,0, glicerol al 10%, EDTA 2 mM, SDS al 5%). Las muestras se agitaron en vórtex durante un minuto y se calentaron hasta 65ºC durante10 minutos. Se cargaron 20 \mul por senda en un gel PAGE al 4%-12% (NOVEX). Los geles se prepararon en un tampón 1XMES. Los clones positivos se designaron pCMHOl y se sometieron a análisis de secuencias.
Se usó un microlitro de DNA de secuenciación para transformar la cepa BL21. Las células se electropulsaron a 2,0 kV, 25 \muF y 400 ohms. Después de la electroporación, se añadieron 0,6 ml MM/CA con 25 \mug/L Kanomiacina. Las células se desarrollaron en MM/CA y se indujeron con ITPG como se describió anteriormente. Los clones positivos se usaron para aumentar la purificación de proteína de la proteína de fusión huzcytor17/MBP-6H, usando técnicas convencionales.
\vskip1.000000\baselineskip
B. Purificación del receptor soluble huzcytorl7/MBP-6H a partir de fermentación de E. coli
A menos que se indique lo contrario, todas las operaciones se llevaron a cabo a 4ºC. Se usó el siguiente procedimiento para la purificación del polipéptido receptor soluble huzcytor17/MBP-6H recombinante. Se construyeron células de E. coli que contenían el constructo pCMHOl y que expresaban el polipéptido receptor soluble huzcytor17/MBP-6H, usando métodos de biología molecular convencionales, y se cultivaron en SuperBroth II (12 g/L Casien, 24 g/L extracto de levadura, 11,4 g/L fosfato de di-potasio, 1,7 g/L fosfato de monopotasio; Becton Dickenson, Cockeysville, MD). Las células resultantes se cosecharon y congelaron en glicerol al 0,5%. Se usaron 20 gramos de las células congeladas para purificación de proteínas.
Las células descongeladas se resuspendieron en 500 mL tampón de equilibrio Amylose (Tris 20 mM, NaCl 100 mM, pH 8,0). Se usó un sistema de ruptura de células de prensa francesa (Constant Systems Ltd., Warwick, Reino Unido) con una temperatura establecida de -7ºC a -10ºC y 30K PSI para lisar las células. Las células resuspendidas se controlaron para ruptura por lecturas A_{600} antes y después del ciclado a través de la prensa francesa. La suspensión celular lisada se sedimentó a 10.000G durante 30 minutos. Se cosechó el sobrenadante del residuo celular para purificación de proteínas.
Se vertieron 25 ml de resina Amylose (New England Biolabs, Beverly, MA) en Bio-Rad, columna de vidrio de 2,5 cm D x 10 cm H. La columna se rellenó y equilibró por gravedad con 10 volúmenes de columna (CV) de tampón de equilibrio Amylose. El sobrenadante celular cosechado se fue un lote que se cargó a la resina Amylose, sacudiendo durante una noche. La resina cargada se retornó a la columna de vidrio, se lavó con 10 CV de tampón de equilibrio Amylose y se eluyó por gravedad con -2 CV de tampón de elución Amylose (tampón de equilibrio Amylose, maltosa 10 mM, Fluka Biochemical, Suiza). Se recogieron diez fracciones de 5 ml durante el perfil de elución y se ensayaron para absorbancia a 280 y 320 nM. La resina Amylose se regeneró con 1 CV de H_{2}O destilada, 5 CV de SDS al 0,1% (p/v) (Sigma), 5 CV de H_{2}O destilada, 5 CV de tampón de equilibrio Amylose y, finalmente, 1 CV de tampón de almacenamiento Amylose (tampón de equilibrio Amylose, azida de sodio al 0,02% (p/v)). La resina regenerada se almacenó a 4ºC.
Las fracciones del perfil de elución de interés se combinaron y dializaron en una cámara de diálisis de 10K (Slide-A-Lyzer, Pierce Immunochemical) contra 4 cambios de 4L PBS pH 7,4 (Sigma) durante un periodo de tiempo de 8 horas. Después de la diálisis, el material cosechado representó el polipéptido huzcytor17/MBP-6H purificado. El polipéptido huzcytor17/MBF-6H purificado se esterilizó por filtración y se analizó mediante SDS-PAGE tinción Coomassie para un producto de peso molecular adecuado. El análisis BCA determinó que la concentración del polipéptido huzcytor17/MBP-6H era de 0,76 mg/ml.
El polipéptido huzcytor17/MBP-6H purificado se formuló adecuadamente para la inmunización de conejos y se envió a R & R Research and Development (Stanwood, WA) para producción de anticuerpos policlonales (Ejemplo 25 a continuación).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 25 Anticuerpo policlonal del receptor soluble zcytor17 humano A. Preparación y purificación
Se prepararon anticuerpos policlonales inmunizando dos conejos blancos hembra de Nueva Zelanda con la proteína recombinante purificada huzcytor17/MBP-6H (Ejemplo 24). Los conejos recibieron cada uno una inyección inicial intraperitoneal (IP) de 200 \mug de proteína purificada en Adyuvante de Freund Completo seguida de inyecciones IP de refuerzo de 100 \mug de proteína en Adyuvante de Freund Incompleto cada tres semanas. Siete a diez días después de la administración de la segunda inyección de refuerzo (3 inyecciones totales), se les realizaron extracciones de sangre a los animales y se recogió el suero. A los animales se les inyectó refuerzo y se les extrajo sangre cada tres semanas.
El suero de conejo específico de huzcytor17/MBP-6H se preadsorbió de anticuerpos anti-MBP, usando una columna de proteína CNBr-SEPHAROSE 4B (Pharmacia LKB) que se preparó usando 10 mg de proteína de fusión MBP recombinante, purificada, no específica por gramo de CKBr-SEPHAROSE. Los anticuerpos policlonales específicos de huzcytor17/MBP-6H se purificaron por afinidad a partir del suero de conejo pre-adsorbido usando una columna de proteínas CNBr-SEPHAROSE 4B (Pharmacia LKB) que se preparó utilizando 10 mg de la proteína recombinante, purificada específica de antígenos, huzcytor17/MBP-6H. Tras la purificación, los anticuerpos policlonales se dializaron con 4 cambios de 20 veces el volumen del anticuerpo de PBS durante un periodo de tiempo de por lo menos 8 horas. Los anticuerpos específicos de huzcytor17 se caracterizaron por ELISA, usando 500 ng/ml de la proteína recombinante purificada huzcytor17/MBP-6H, como diana de anticuerpos. El límite inferior de detección (LID) del anticuerpo purificado por afinidad anti-huzcytor17/MBP-6H de conejo fue 500 pg/ml en su antígeno recombinante purificado específico huzcytor17/MBP-6H.
\vskip1.000000\baselineskip
B. Análisis SDS-PAGE y transferencia Western del anticuerpo ZcytoR17 MBP-6H antihumano de conejo
Se ensayó el anticuerpo ZcytoR17 MBP-6H antihumano de conejo por SDS-PAGE (NuPage 4-12%, Invitrogen, Carlsbad, CA) con el método de tinción coomassie y transferencia Western, usando IgG-HRP anticonejo de cabra. Se sometió a electroforesis o bien la proteína purificada (200-25 ng) o medio condicionado que contenía zcytor17, usando una minicelda n Invitrogen Novex's Xcell, y se transfirió a nitrocelulosa (0,2 mm; Invitrogen, Carlsbad, CA) a temperatura ambiente, usando un módulo de transferencia Novex's Xcell con agitación de acuerdo a las instrucciones provistas en el manual del instrumento. La transferencia se llevó a cabo a 300 mA durante una hora en un tampón que contenía Tris 25 mM, glicina 200 mM y metanol al 20%. El filtro se bloqueó luego con tampón Western A (interno), Tris 50 mM, pH 7,4, EDTA 5 mM, pH 8,0, Igepal CA-630 al 0,05%, NaCl 150 mM y gelatina al 0,25%) durante una noche con oscilación moderada a 4ºC. La nitrocelulosa se enjuagó rápidamente, luego se añadió zcytoR17 MBP-6H antihumano de conejo (1:1000) en tampón Western A. La transferencia se incubó durante 1,5 horas a temperatura ambiente con oscilación moderada. La transferencia se enjuagó 3 veces durante 5 minutos cada una en Western A, luego se añadió anticuerpo IgG HRP anticonejo de cabra (1:1000) en tampón Western A. La transferencia se incubó durante 1,25 horas a temperatura ambiente con oscilación moderada. La transferencia se enjuagó 3 veces durante 5 minutos cada vez en Western A, luego se enjuagó rápidamente en H_{2}O. La transferencia se reveló usando reactivos de sustratos quimiluminiscentes disponibles en el mercado (reactivos de detección de transferencias Western ECL 1 y 2 en mezcla 1:1; los reactivos se obtuvieron de Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, Inglaterra) y la transferencia se expuso a película de rayos X para durante un máximo de 15 minutos.
El zcytoR17 MBP-6H antihumano de conejo pudo detectar el zcytor17 humano presente en medio condicionado, como también la proteína zcytoR17 purificada como una banda a 120 kDa bajo condiciones de reducción.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 26 Distribución de tejido de zcytor17 de ratón en paneles de tejido usando PCR
Se cribó un panel de cDNA de tejidos murinos para expresión de zcytor17 de ratón, usando PCR. El panel se elaboró internamente y contenía 94 muestras de cDNA y cDNA marathon de diversos tejidos y líneas celulares de murinos normales y cancerosos que se muestran en la Tabla 6 a continuación. Los cDNA provenían de genotecas internas o cDNA marathon de preparaciones de RNA internas, Clontech RNA, o Invitrogen RNA. Los cDNA marathon de ratón se realizaron usando el kit marathon-Ready^{TM} (Clontech, Palo Alto, CA) y se realizó el control de la calidad con los cebadores del receptor transferrina de ratón ZC10,651 (SEC ID NO:46) y ZC10,565 (SEC ID NO:47), y luego se diluyó en base a la intensidad de la banda de transferrina. Para asegurar la calidad de las muestras de la genoteca ampliada en el panel, se realizaron tres pruebas de control de calidad (QC): (1) para evaluar la calidad del RNA utilizado para las genotecas, los cDNA internos se ensayaron para tamaño del inserto promedio por PCR con oligos vectores que eran específicos de las secuencias del vector de una genoteca de cDNA individual: (2) la estandarización de la concentración del cDNA en las muestras del panel se logró usando métodos PCR convencionales para ampliar alfa tubulina o cDNA de G3PDH de longitud total, usando un oligo vector 5': ZC14.063 (SEC E> NO:48) y el cebador oligo específico de alfa tubulina 3' ZC17,574 (SEC ID NO:49) o el cebador oligo específico de G3PDH 3' ZC17,600 (SEC ID NO:50); y (3) se envió una muestra para secuenciación, para controlar la posible contaminación de DNA ribosómica o mitocondrial. El panel se estableció en un formato de 96 pocillos que incluía una muestra control positiva de DNA genómico de ratón (Clontech, Palo Alto, CA). Cada pocillo contenía aproximadamente 0,2-100 pg/\mul de cDNA. La PCR se estableció usando los oligos ZC38,065 (SEC ID NO:51) y ZC38,068 (SEC ID NO:52), TaKaRa Ex Taq^{TM} (TAKARA Shuzo Co LTD, Biomedicals Grupo, Japón) y el tinte Rediload (Research Genetics, Inc., Huntsville, AL). La ampliación se llevó a cabo de la siguiente manera: 1 ciclo a 94ºC durante 5 minutos; 5 ciclos de 94 durante 30 segundos, 68ºC durante 30 segundos; 35 ciclos de 94ºC durante 30 segundos, 56ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 30 segundos, seguidos de 1 ciclo a 72ºC durante 5 minutos. Se sometieron aproximadamente 10 \mul del producto de reacción PCR a electroforesis en gel de Agarosa estándar usando un gel de agarosa al 4%. Se observó el tamaño del fragmento de DNA pronosticado correcto en cerebro, células CD90+, células dendríticas, embriones MEWt#2, línea celular de próstata Tuvak, glándulas salivales y testículos.
El fragmento de DNA para piel y testículos se cortó y purificó usando un kit de extracción de gel (Qiagen, Chatsworth, CA) según las instrucciones del fabricante.
Los fragmentos se confirmaron por secuenciación para mostrar que realmente eran zcytor17 de ratón.
TABLA 6
7 
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 27 Expresión de zcytor17 humano en diversos tejidos, usando RT/PCR cuantitativa en tiempo real A. Cebadores y sondas para Zcytor17, OSMRbeta y Zcytor17lig humanos para análisis RT-PCR convencional y cuantitativo
Se había descrito previamente el análisis RT-PCR cuantitativo en tiempo real que usa el Sistema de Detección de Secuencias ABI PRISM 7900 (PE Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) (Véanse, Heid, C.A. et al., Genome Research 6: 986-994, 1996; Gibson, U.E.M. et al., Genome Research 6: 995-1001, 1996; Sundaresan, S. et al., Endocrinology 139: 4756-4764, 1998). Este método incorpora el uso de una sonda específica de genes que contiene tanto los tintes fluorescentes indicador como inactivador. Cuando la sonda está intacta, la emisión de tinte del indicador es negada debido a la proximidad del tinte inactivador. Durante la extensión PCR que usa cebadores adicionales directos e inversos específicos de genes, la sonda es escindida por la actividad nucleasa 5' de la polimerasa Taq que libera el tinte indicador de la sonda, lo que resulta en un incremento de emisión fluorescente.
\newpage
Los cebadores y las sondas para análisis RT-PCR cuantitativo en tiempo real de expresión de Zcytor17, OSMRbeta y Zcytor17lig humanos se diseñaron usando el programa de diseño de cebadores Primer Express^{TM} (PE Applied Biosystems, Foster City, CA). Los cebadores para el Zcytor17 humano se diseñaron abarcando una unión intrón-exón para eliminar la posible ampliación de DNA genómico. El cebador directo, 2C37.877 (SEC ID NO:53), y el cebador inverso, ZC37.876 (SEC ID NO:54), se usaron en una reacción PCR a una concentración de 200 nM para sintetizar el producto de 73 bp. La correspondiente sonda TaqMan® del Zcytor17, designada ZC37,776 (SEC ID NO:55), se sintetizó y marcó por PE Applied Biosystems, y se usó en cada reacción PCR a una concentración de 200 nM. La sonda ZC37,776 (SEC ID NO:55) se marcó en el extremo 5' con un tinte indicador fluorescente (6-carboxi-fluoresceína) (FAM) (PE Applied Biosystems) y en el extremo 3' con un tinte inactivador fluorescente (6-carboxi-tetrametil-rodamina) (TAMRA) (Epoch Biosciences, Bothell, WA).
Los cebadores para OSMRbeta humano se diseñaron abarcando una unión intrón-exón para eliminar la posible ampliación de DNA genómico. El cebador directo, ZC43,891 (SEC ID NO:122), y el cebador inverso, ZC43,900 (SEC ID NO:123), se usaron en una reacción PCR (a continuación) a una concentración de 200 nM. La correspondiente sonda TaqMan® de OSMRbet, designada ZC43,896 (SEC ID NO: 124), se sintetizó y marcó por PE Applied Biosystems y se usó en cada reacción PCR a una concentración de 200 nM. La sonda ZC43,896 (SEC ED NO:124) se marcó en el extremo 5' con un tinte fluorescente indicador (6-carboxi-fluoresceína) (FAM) (PE Applied Biosystems) y en el extremo 3' con un tinte inactivador no fluorescente (ECLIPSE) (Epoch Biosciences).
Los cebadores para Zcytor17lig humano se diseñaron abarcando una unión intrón-exón para eliminar la posible ampliación de DNA genómico. El cebador directo, ZC43,280 (SEC ID NO:125), y el cebador inverso, ZC43,281 (SEC ID NO:126), se usaron en una reacción PCR (a continuación) a una concentración de aproximadamente 200 nM. La correspondiente sonda TaqMan® de Zcytor17lig, designada ZC43,275 (SEC ID NO:127), se sintetizó y marco por PE Applied Biosystems y se usó en cada reacción PCR a una concentración de 200 nM. La sonda ZC43,275 (SEC ID NO:127)se marcó en el extremo 5' con un tinte fluorescente indicador (6-carboxi-fluoresceína) (FAM) (PE Applied Biosystems) y en el extremo 3' con un tinte inactivador no fluorescente (ECLIPSE) (Epoch Biosciences).
Como control para ensayar la integridad y calidad de las muestras de RNA ensayadas, todas las muestras de RNA se cribaron para rRNA o GUS, usando conjuntos de cebador y sonda de PE Applied Biosystems (kit de rRNA) o diseñados internamente (GUS). El kit de rRNA contenía el cebador directo (SEC ID NO:56), el cebador inverso de rRNA (SEC ID NO:57) y la sonda de rRNA TaqMan® (SEC ID NO:58). La sonda de rRNA se marcó en el extremo 5' con un tinte fluorescente indicador VIC (PE Applied Biosystems) y en el extremo 3' con el tinte fluorescente inactivador TAMRA (PE Applied Biosystems). Los cebadores y sondas GUS se generaron internamente y se usaron en cada reacción PCR a 200 nM y 100 nM, respectivamente. El cebador directo fue ZC40,574 (SEC ID NO:128) y el cebador inverso fue ZC40,575 (SEC ID NO:129). La sonda GUS ZC43,017 (SEC ID NO:130) se marcó en el extremo 5' con un tinte fluorescente indicador (Yakima-Yellow) (Epoch Biosciences) y en el extremo 3' con un tinte inactivador no fluorescente (ECLIPSE) (Epoch Biosciences). Los resultados de rRNA y GUS también sirven como control endógeno y permiten la normalización de los resultados de expresión de mRNA de Zcytor17 observados en las muestras de ensayo.
Para análisis RT-PCR no cuantitativo, convencional, los cebadores se diseñaron usando el software de diseño de cebadores Primer Express^{TM} (PE Applied Biosystems, Foster City, CA). Los cebadores de zcytor17 humano generan un producto de aproximadamente 1000 pares de bases y son los siguientes: cebador directo ZC28,917 (SEC ID NO:83) y cebador inverso ZC28.480 (SEC ID NO:131). Los cebadores de OSMRbeta humano generan un producto de 202 pares de bases y son los siguientes: cebador directo ZC41,653 (SEC ID NO:132) y cebador inverso ZC41,655 (SEC ID NO:133). Los cebadores de Zcytor17lig humano generan un producto de 305 pares de bases y son los siguientes: cebador directo ZC41,703 (SEC ID NO:134) y cebador inverso ZC41,704 (SEC ID NO:135).
\vskip1.000000\baselineskip
B. Cebadores y sondas para Zcytor17, OSMRbeta y Zcvtor17lig murinos para análisis RT-PCR convencional y cuantitativo
Los cebadores y sondas utilizados para análisis RT-PCR cuantitativo en tiempo real de expresión de Zcytor17, OSMRbeta y Zcytor17lig murinos se diseñaron usando el software de diseño de cebadores Primer Express^{TM} (PE Applied Biosystems, Foster City, CA). Los cebadores para Zcytor17 murino se diseñaron abarcando una unión intrón-exón para eliminar una posible ampliación de DNA genómico. El cebador directo, ZC43,272 (SEC ID NO:136) y el cebador inverso, ZC43,273 (SEC ID NO:137) se usaron en las reacciones PCR (a continuación) a una concentración de 300 nM. La correspondiente sonda TaqMan® de Zcytor17, designada ZC43,478 (SEC ID NO:138), se sintetizó y marcó por PE Applied Biosystems. La sonda ZC43,478 (SEC ID NO:138) se marcó en el extremo 5' con un tinte fluorescente indicador (6-carboxi-fluoresceína) (FAM) (PE Applied Biosystems) y en el extremo 3' con un tinte fluorescente inactivador (6-carboxi-tetrametil-rodamina) (TAMRA) (PE Applied Biosystems). La sonda ZC43,478 (SEC ID NO:138) se usó en las reacciones PCR a una concentración de 100 nM.
Los cebadores para Zcytor17lig murino se diseñaron abarcando una unión intrón-exón para eliminar la posible ampliación de DNA genómico. El cebador directo, ZC43,278 (SEC ID NO:139) y el cebador inverso, ZC43,279 (SEC ID NO:140) se usaron en las reacciones PCR a una concentración de 500 nM. La correspondiente sonda TaqMan® de Zcytor17lig, designada ZC43,276 (SEC ID NO:141), se sintetizó y marcó por PE Applied Biosystems. La sonda ZC43,478 (SEC ID NO:138) se marcó en el extremo 5' con un tinte fluorescente indicador (6-carboxi-fluoresceína) (FAM) (PE Applied Biosystems) y en el extremo 3' con un tinte inactivado no fluorescente (ECLIPSE) (Epoch Biosciences). La
sonda ZC43,276 (SEC ID NO:141) se usó en las reacciones PCR (a continuación) a una concentración de 200 nM.
Los cebadores para OSMRbeta murino se diseñaron abarcando una unión intrón-exón para eliminar la posible ampliación de DNA genómico. El cebador directo, ZC43,045 (SEC ID NO:142), y el cebador inverso, ZC43,046 (SEC ID NO:143), se usaron en las reacciones PCR a una concentración de 300 nM. La correspondiente sonda TaqMan® de OSMRbeta, designada ZC43,141 (SEC ID NO:144), se sintetizó y marcó por Epoch Biosciences. La sonda ZC43,141 (SEC ID NO:144) se marcó en el extremo 5' con un tinte fluorescente indicador (6-carboxi-fluoresceína) (FAM) (PE Applied Biosystems) y en el extremo 3' con un tinte inactivador no fluorescente (ECLIPSE) (Epoch Biosciences). La sonda ZC43.141 (SEC ID NO:144) se usó en las reacciones PCR (a continuación) a una concentración de 100 nM.
Como control para ensayar la integridad y calidad de las muestras de RNA ensayadas, todas las muestras de RNA se cribaron para el receptor GUS o transferrina de murino, usando los cebadores y las sondas diseñados usando el programa de diseño de cebadores Primer Express^{TM} (PE Applied Biosystems Inc., Foster City, CA). Los cebadores de GUS murino son los siguientes: cebador directo, ZC43,004 (SEC ID NO:145), cebador inverso, ZC43,005 (SEC ID NO:146) y sonda TaqMan® de ZC43,018 (SEC ID NO:147). La sonda de GUS murino ZC43,018 (SEC ID NO:147) se marcó en el extremo 5' con un tinte fluorescente indicador Yakima-Yellow (Epoch Biosciences) y en el extremo 3' con el tinte inactivador no fluorescente (Epoch Biosciences). Los cebadores de GUS murino se usaron en las reacciones PCR a 300 nM, y la sonda, ZC43,018 (SEC ID NO:147), se usó a 100 nM. En algunos casos, se usó el receptor de transferrina murino en lugar de GUS, como control endógeno. El cebador directo del receptor de transferrina, ZC40,269 (SEC ID NO:148), y el cebador inverso, ZC40,268 (SEC ID NO:149), se usaron a 300 nM. La sonda del receptor de transferrina, ZC40,298 (SEC ID NO:150), se usó en PCR a 100 nM y se marcó en el extremo 5' con un tinte fluorescente indicador VIC (PE Applied Biosystems) y en el extremo 3' con un tinte inactivador fluorescente (TAMRA) (PE Applied Biosystems). Los resultados del receptor de GUS y transferrrina de murino también sirven como control endógeno y permiten la normalización de los resultados de expresión del mRNA de Zcytor17, OSMRbeta y Zcytor17lig observados en las muestras de ensayo.
Para análisis RT-PCR semicuantitativo convencional, los cebadores se diseñaron usando el software para diseño de cebadores Primer Express^{TM} (PE Applied Biosystems). Los cebadores de Zcytor17 murino generan un producto de 276 pares de bases y son los siguientes: cebador directo ZC43,140 (SEC ID NO:151), y cebador inverso ZC43,139 (SEC ID NO:152). Los cebadores de OSMRbeta murino generan un producto de 575 pares de bases y son los siguientes: cebador directo ZC41,608 (SEC ID NO:153) y cebador inverso ZC41,609 (SEC ID NO:154). Los cebadores de Zcytor17lig murino generan un producto de 657 bp y son los siguientes: cebador directo ZC41,502 (SEC ID NO:155) y cebador inverso ZC41,500 (SEC ID NO:156).
\vskip1.000000\baselineskip
C. Protocolos para análisis RT-PCR cuantitativo en tiempo real y RT-PCR semicuantitativo convencional
Se determinar los niveles relativos de mRNA de Zcytor17, OSMRbeta y Zcytor17lig analizando muestras de RNA total, usando el método RT-PCR de una sola etapa (PE Applied Biosystems). Se aisló RNA total de células BAF transfectadas con Zcytor17 y OSMRbeta (humano) o células BHK (murino) por métodos convencionales, y se usó para generar una curva estándar para cuantificación de Zcytor17 y OSMRbeta. La curva consistía en diluciones en serie de 10 veces que oscilaban entre 100-0,01 ng/\mul con cada punto de la curva estándar analizado por triplicado. De forma similar, para Zcytor17lig, se usó RNA de células T CD4+ activadas (previamente expuesto para elaborar Zcytor17lig) a fin de generar una curva estándar en el mismo intervalo 100-0,01 ng/\mul. Se analizó el RNA total de células humanas o murinas por triplicado para niveles de transcripción de Zcytor17, OSMRbeta y Zcytor17lig humano o murino y para uno de los siguientes genes de control endógeno: receptor de transferrina, rRNA o GUS. En un volumen total de 10 \mul, cada muestra de RNA se sometió a una reacción RT-PCR de una sola etapa que contenía: aproximadamente 50-100 ng de RNA total en una mezcla maestra previamente formulada 2X que contenía un tinte de control interno (ROX)(carboxi-\chi-rodamina) y DNA Polimerasa Thermo-Start® (Abgene, Surrey, Reino Unido); cebadores apropiados para el gen de interés (véanse partes A y B del presente ejemplo); la sonda apropiada (véanse partes A y B para concentración); transcriptasa inversa Superscript® (50 U/\mul) (PE Applied Biosystems) y un volumen apropiado de agua libre de RNase. Las condiciones del ciclado térmico de PCR fueron las siguientes: una etapa de transcripción inversa inicial (RT) de un ciclo a 48ºC durante 30 minutos; seguida de una etapa de activación enzimática Thermo-Start® de un ciclo a 95ºC durante 10 minutos; seguida de 40 ciclos de ampliación a 95ºC durante 15 segundos y 60ºC durante 1 minuto. Los niveles relativos de RNA de Zcytor17, OSMRbeta y Zcytor17lig se determinaron usando el Método de Curva Estándar descrito por el fabricante, PE Biosystems (User Bulletin #2: ABI Prism 7700 Sequence Detection System, Relative Quantitation of Gene Expression, Diciembre 11, 1997). Las mediciones del receptor de Transferrina, rRNA o GUS se usaron para normalizar los niveles del gen de interés.
Las reacciones RT-PCR semicuantitativas emplearon el sistema "Superscript One-Step RT-PCR System with Platinum Taq" (Invitrogen, Carlsbad, CA). Cada reacción de 25 \mul consistía en lo siguiente: 12,5 \mul de tampón de reacción 2X, 0,5 \mul (20 pmol/\mul) de cebador directo, 0,5 \mul (20 pmol/\mul) de cebador inverso, 0,4 \mul mezcla de RT/polimerasa Taq, 5,0 \mul de tampón de carga de gel Rediload (Invitrogen), 5,1 \mul agua libre de RNase y 1,0 \mul de RNA total (100 ng/\mul). La ampliación se llevó a cabo de la siguiente manera: un ciclo a 45ºC durante 30 minutos seguido de 35-38 ciclos de 94ºC, 20 segundos; temp de renaturalización variable (véase Tabla 7 a continuación), 20 segundos; 72ºC, 45 segundos; luego finalizó con una extensión final a 72ºC durante 5 minutos. Se sometieron 8 a 10 microlitros del producto de la reacción PCR a electroforesis en gel de agarosa estándar, usando un gel de agarosa al 2%.
TABLA 7
8 
\vskip1.000000\baselineskip
D. Aislamiento de RNA de subconjuntos y líneas celulares PBMC de seres humanos y murinos
Se extrajo sangre de varios donantes anónimos y se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) usando la metodología en gradiente Ficoll convencional. Los monocitos se aislaron luego usando el kit de Aislamiento de Monocitos y el Sistema de Separación Celular Magnética (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Los monocitos se dispusieron luego en placas de 24 pocillos de adherencia ultra-baja en medio libre de endotoxina. O bien no fueron estimulados o fueron tratados con IFNg recombinante humano (R&D Systems Inc.) a 10 ng/ml.
Las células se recogieron después de 24 y 48 horas. De modo similar, se aislaron células T CD4+ y CD8+ de PBMC, usando esferas magnéticas anti-CD4 o anti-CD8 de Miltenyi Biotec. Las células luego se activaron durante 4 ó 16 horas en placas para cultivo de tejido recubiertas con 0,5 \mug/ml anticuerpos anti-CD3 en medio que contiene 5 \mug/ml anticuerpos anti-CD28. También se aislaron linfocitos citolíticos naturales de PBMC, usando esferas magnéticas recubiertas con anti-CD56. Algunos de los linfocitos citolíticos naturales se recogieron en tiempo cero para RNA, y otros se dispusieron en placas en medio que contenía Forbol Miristato Acetato (PMA) (5 ng/ml) y ionomicina (0,5 \mug/ml) durante 24 horas. Además, varias líneas celulares de tipo monocitos humanos, U937, THP-l y HL-60, se recogieron en sus estados en reposo o activado. Las células U937 se activaron durante una noche con PMA (10 ng/ml). Las células HL-60 se activaron durante una noche con PMA (10 ng/ml) o durante 72 y 96 horas con IFNg (10 ng/ml) para conducirlas hacia una vía monocítica. Las células THP-1 se activaron durante una noche con una combinación de LPS (10 ng/ml) e IFNg (10 ng/ml). Se preparó RNA a partir de todas las células primarias, usando el kit RNeasy Midiprep^{TM} (Qiagen, Valencia, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El DNA remanente se eliminó usando el kit DNA-Free^{TM} (Arnbion, Inc., Austin, TX). La concentración de RNA se determinó usando espectrofotometría estándar, y la calidad del RNA se determinó usando el Bionalizador 2100 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA).
Se obtuvo RNA de células T murinas, usando una diversidad de métodos conocidos en la técnica. Se aislaron células T primarias CD4+ y CD8+ de los bazos de ratones C57B1/6, usando esferas magnéticas recubiertas con anticuerpo y el Sistema de Separación Celular Magnética de Miltenyi Biotec. Las células T CD4+ y CD8+ se activaron luego cultivando las células en placas de 24 pocillos con anticuerpos anti-CD3 (500 ng/ml) en medio que contenía anticuerpos anti-CD28 a 5 \mug/ml. Las células se cosecharon para RNA a 0,4 y 16 horas. De manera similar, las células T CD4+ se aislaron y luego se inclinaron hacia un fenotipo Th1 o Th2, usando el siguiente protocolo. Ya que las células T C57B1/6 ya están inclinadas en dirección Th1, todo lo necesario era activarlas durante 6 horas con 0,5 \mug/ml PMA y 10 ng/ml ionomicina. La inclinación 'Th2' se obtuvo disponiendo células T CD4+ naturales con 2,5 \mug/ml anti-CD28, 10 ng/ml mIL-2 (R&D Systems Inc.) y 25 ng/ml mIL-4 (R&D Systems) en placas recubiertas con 0,5 \mug/ml anti-CD3. Después de 2 días en cultivo, las células se resuspendieron en medio que contenía 10 ng/ml mIL-2 (R&D Systems) y 25 ng/ml mIL-4. Las células se cultivaron durante tres días más, luego se activaron con PMA y ionomicina durante 6 horas.
Un conjunto adicional de células T inclinadas hacia Th1 y Th2 derivó usando la línea de células T DO11.10 Transgénicas del Receptor de Células T. Todas las células se dispusieron en placas recubiertas anti-CD3 y anti-CD28. Las células 'Th1' se dispusieron en placas en medio que contenía mIL-12 (1 ng/ml) y anti-DL-4 (10 \mug/ml). Las células 'Th2' se dispusieron en placas en medio que contenía mIL-4 (10 ng/ml) y anti-IFNg (10 \mug/ml). Después de 24 horas, a todos los cultivos se les suministró mIL-2 (10 ng/ml). Después de dos días más, el medio en las células se cambió y se añadió medio fresco que contenía las citocinas anteriormente mencionadas, y las células se cultivaron durante 4 días más antes de cosecharse.
Todo el RNA de las células T murinas se preparó usando el kit RNeasy Midiprep^{TM} (Qiagen) y el DNA contaminado se eliminó usando el kit DNA-free^{TM} de Ambion.
\vskip1.000000\baselineskip
E. Aislamiento de RNA de los modelos murinos de pancreatitis y enfermedad del intestino irritable
Para inducir una afección similar a la enfermedad del intestino irritable (IBD) humana, se usó la cepa de ratón híbrida C57B16/129S6F1. Los ratones se dividieron en 4 grupos con una cantidad promedio de seis ratones por grupo. Al Grupo 1 no se le suministró DSS, y los animales se sacrificaron en el día 14. El Grupo 2 recibió DSS al 2% durante dos días antes de ser sacrificado. El Grupo 3 recibió DSS al 2% durante siete días antes de ser sacrificado. El Grupo 4 recibió DSS al 2% durante siete días, luego se dejó recuperar durante siete días y se sacrificó en el día 14. El día del sacrificio, se extirparon las secciones distales del colon y se colocaron en RNAlater^{TM} (Ambion). Las secciones del colon se homogeneizaron usando técnicas convencionales, y se aisló el RNA usando el kit RNeasy Midiprep^{TM} (Qiagen). Se eliminó el DNA contaminante por tratamiento con DNA-free^{TM} (Ambion), según las instrucciones del fabricante.
En un estudio diferente, se indujo la pancreatitis aguda en ratones CD-1 macho por inyección de caeruleína. Los ratones se dividieron en tres grupos (n= 8 ratones/grupo). Los animales del Grupo 1 recibieron siete inyecciones i.p. (1 inyección por hora) de Vehículo (solución salina) y se sacrificaron 12 ó 24 horas después de la primera inyección. Los animales de los Grupos 2 y 3 recibieron siete inyecciones i.p. de caeruleína (Sigma) (Catálogo#C-9026) a una dosis de 50 \mug/kg/h durante seis horas (1 inyección por hora). El Grupo 2 fue sacrificado a las 12 horas de la primera inyección y el Grupo 3 a las 24 horas de la primera inyección. Se extirparon los páncreas al momento del sacrificio y se congelaron para aislamiento del RNA. Los tejidos se homogeneizaron y el RNA se aisló usando el kit Qiagen RNeasy Midiprep^{TM}.
Incluso en otro estudio, se generaron ratones transgénicos de Zcytor17lig murino y se observaron para detectar cambios genotípicos (véase Ejemplo 41). Se observaron piloerección y alopecia en muchos de los ratones transgénicos. Se sacrificaron cuatro ratones transgénicos y se tomaron muestras de piel tanto de las áreas sin pelo como de las áreas normales, que se congelaron para posterior aislamiento de RNA. También se tomaron secciones de piel de dos ratones control no transgénicos. Las muestras de piel se homogeneizaron y luego se digirieron con Proteinasa K (Qiagen) (Catálogo No 19133) durante 20 minutos a 60ºC. El RNA se aisló usando el kit Qiagen RNeasy Midiprep^{TM}, siguiendo las instrucciones del fabricante. El DNA remanente se eliminó usando el kit DNA-free^{TM} de Ambion.
\vskip1.000000\baselineskip
F. Resultados de los análisis RT-PCR cuantitativo y semicuantitativo para Zcytor17, OSMRbeta y Zcytor17lig humanos
La expresión de Zcytor17 y OSMRbeta se examinó por análisis RT-PCR cuantitativo en cuatro conjuntos de monocitos humanos primarios que estaban en estado de reposo o activado con IFNg durante 24 ó 48 horas. La expresión de Zcytor17 estaba de bajo del nivel de detección en las células no estimuladas, pero aumentó notablemente después de 24 horas de activación con IFNg, y fue la más alta después de 48 horas de activación. En todos los casos, OSMRbeta estuvo debajo del nivel de detección. No se ensayó Zcytor17lig en estas muestras.
En las células T primarias, el Zcytor17 estuvo por debajo del nivel detectable en ambos subconjuntos de CD4+ y CD8+ en reposo. Después de cuatro horas de activación, no obstante, la expresión de Zcytor17 se elevó en ambos subconjuntos y luego disminuyó hasta un nivel levemente inferior en el punto de tiempo de la hora 16. OSMRbeta estuvo debajo del nivel detectable en estas muestras. La expresión de Zcytor17lig se examinó usando un análisis RT-PCR semicuantitativo. No se detectó expresión en células T CD4+ y CD8+ no estimuladas. No obstante, después de cuatro horas de activación, se detectaron altos niveles de Zcytor17lig. Estos niveles descendieron un poco en el punto de tiempo de la hora 16.
La expresión de Zcytor17 no se examinó en linfocitos citolíticos naturales. OSMRb estuvo debajo del nivel detectable en estas muestras. La expresión de Zcytor17lig estuvo debajo del nivel detectable en los linfocitos citolíticos naturales en reposo, no obstante, hubo una señal tenue generada por los linfocitos citolíticos naturales, lo que indica que estos linfocitos pueden elaborar Zcytor17lig bajo determinadas circunstancias.
En las líneas celulares de tipo monocito humano, U937, THP-1 y HL-60, la expresión de OSMRbeta estuvo por debajo del nivel detectable en todas las muestras en reposo y activadas, excepto en las muestras de THP-1 activadas, en donde se detectó una señal tenue. La expresión de Zcytor17 fue alta en ambas líneas celulares U937 y THP-1 en reposo, y demostró un fuerte ascenso tras la activación. La expresión en U937 fue la más alta de cualquier tipo celular. En las HL-60, el Zcytor17 se expresó a niveles moderados en las células no estimuladas y disminuyó tras la estimulación con PMA. Sin embargo, la expresión de Zcytor17 ascendió notablemente en las HL-60, cuando se estimularon con IFNg durante 72 y 96 horas. Todos los datos de expresión humana se resumen a continuación en la Tabla 8.
TABLA 8
9 
\vskip1.000000\baselineskip
G. Resultados de los análisis RT-PCR cuantitativos y semicuantitativos para Zcytor17, OSMRbeta y Zcytor17lig murinos
Los niveles de expresión de Zcytor17, OSMRbeta y Zcytor17lig murinos se examinaron en varias poblaciones de células T de murinos y los resultados se resumen en la Tabla 9 a continuación. Se ensayó la expresión de Zcytor17 murino por análisis RT-PCR semicuantitativo, y demostró tener niveles bajos tanto en las células T CD4+ primarias en reposo como en las activadas. La expresión de Zcytor17 se detectó en células T CD8+ en reposo y luego pareció disminuir tras la activación con los anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 en los puntos de tiempo de la hora 4 y de la hora 16. La expresión de OSMRbeta se midió por análisis RT-PCR cuantitativo y demostró expresarse en células T CD4+ y CD8+ activadas y en reposo. La expresión de OSMRbeta se elevó después de 4 horas de activación y luego volvió a los niveles sin estimulación después de 16 horas tanto en las células T CD4+ como en las CD8+. Se detectó Zcytor17lig por RT-PCR cuantitativo y demostró expresarse a niveles bajos en células T CD4+ no estimuladas. Sin embargo, tras 4 horas de activación, la expresión de Zcytor17lig ascendió notablemente y luego disminuyó levemente alrededor del punto de tiempo de la hora 16. En células T CD8+, no se detectó Zcytor17lig en células no estimuladas. Hubo cierta expresión de Zcytor17lig en el punto de tiempo de la hora, pero para la hora 16, los niveles de expresión habían caído debajo del nivel detectable.
En las células T DO11.10, la expresión de Zcytor17 se detectó en las células naturales e inclinadas hacia Th2, pero no en las células inclinadas hacia Th1. La expresión de OSMRbeta estuvo a niveles bajos en las células DO11.10 naturales. Hubo un incremento marcado en los niveles de expresión de OSMRbeta en las células inclinadas hacia Th1 y un incremento moderado de la expresión en las células inclinadas hacia Th2. La expresión de Zcytor17lig en estas células demostró ser predominante por el subconjunto inclinado hacia Th2. Se detectaron niveles bajos en el subconjunto Th1 y no se detectó ninguna expresión en las células naturales. Estos resultados se resumen en la Tabla 9 a continuación.
En las células T CD44 primarias que se inclinaron hacia la dirección Th1 o Th2, no se examinó el Zcyto17. La expresión de OSMRbeta se detectó en las tres muestras con los niveles más altos hallados en la muestra de Th2. Similar a los resultados de DO11.10, la expresión de Zcytor17lig se detectó en altos niveles en el subconjunto inclinado hacia Th2, con una pequeña cantidad detectada en el subconjunto Th1, y los niveles estuvieron debajo de la detección en las células no estimuladas. Estos resultados se resumen en la Tabla 9 a continuación.
TABLA 9
10 
\vskip1.000000\baselineskip
En las muestras de piel transgénicas de Zcytor17lig, los niveles de expresión de Zcytor17, OSMRbeta y Zcytor17lig se determinaron usando RT-PCR cuantitativo. Se demostró que el Zcytor17 estaba presente en todas las muestras a niveles aproximadamente equivalentes. Hubo niveles marcadamente superiores de expresión de OSMRbeta en los animales control no transgénicos que en las muestras transgénicas. La expresión de Zcytor17lig estuvo debajo de los niveles detectables en los animales control no transgénicos con niveles moderados a altos en los animales transgénicos. Los resultados se resumen en la Tabla 10 a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 10
11 
\vskip1.000000\baselineskip
En un experimento diferente, se midieron los niveles de expresión de Zcytor17, OSMRbeta y Zcytor17lig por análisis RT-PCR cuantitativo en páncreas de ratones sometidos a pancreatitis aguda. La expresión de Zcytor17 estuvo por debajo del nivel detectable en todas las muestras. Se observaron bajos niveles de expresión de OSMRbeta en las muestras control normales (Grupo 1), pero se observó un fuerte ascenso en el punto de tiempo de la hora 12 (Grupo 2) y niveles levemente inferiores en el punto de tiempo de la hora 24 (Grupo 3). La expresión de Zcytor17lig estuvo debajo del nivel detectable en los animales control, pero demostró niveles altos en ambos grupos inyectados con caeruleína. Los datos se resumen en la Tabla 11 a continuación.
TABLA 11
12 
\vskip1.000000\baselineskip
En otro experimento, se examinaron los niveles de expresión de Zcytor17 y OSMRbeta en cólones distales de ratones sometidos a tratamiento con DSS. En este modelo murino de enfermedad inflamatoria de los intestinos, los niveles de expresión de ambos genes se determinaron por análisis RT-PCR cuantitativo y se resumen en la Tabla 12 a continuación. Los niveles de expresión de Zcytorl7 aumentaron con la gravedad de la enfermedad, con bajos niveles de expresión en los animales control normales del Grupo 1 y cantidades en aumento observadas en los Grupos 2 y 3. En los animales del Grupo 4, los niveles de Zcytorl7 habían vuelto a los niveles normales. A diferencia de la expresión de Zcytorl7, los niveles de OSMRbeta fueron los más altos en los animales control, y los niveles realmente disminuyeron en los tres grupos tratados con DSS.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 12
13 
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 28 Expresión de distribución de tejido en Zcytor17lig humano en base al análisis RT-PCR de cDNA de primera cadena de tejidos múltiples
La expresión génica del zcytor17lig se examinó usando paneles de cDNA de primera cadena de tejidos múltiples normalizados (OriGene Technologies, Inc. Rockville, MD; BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA). Éstos incluían el OriGene "Human Tissue Rapid-Scan^{TM} Panel" (Cat #CHSCA-101, que contiene 22 tejidos diferentes, médula ósea y leucocitos de plasma) y el BD Biosciences Clontech "Human Blood Fractions MTC^{TM} Panel" (Cat. #K1428-1, que contiene 9 fracciones sanguíneas diferentes).
Se realizaron las reacciones PCR usando los cebadores específicos de oligo de zcytor17lig ZC41.458 (SEC ID NO:60) y ZC41,457 (SEC ID NO:61), que generan un producto de 139 bp, y ZC41,459 (SEC ID NQ:62) y ZC41,460 (SEC ID NO:63), que generan un producto de 92 bp, DNA polimerasa Qiagen HotStarTaq y tampón (Qiagen, Inc., Valencia, CA), dH_{2}O y tinte RediLoad^{TM} (Research Genetics, Inc., Huntsville, AL). Las condiciones del ciclador de PCR fueron las siguientes: 1 ciclo inicial de desnaturalización de 15 minutos a 95ºC, 35 ciclos de una desnaturalización de 45 segundos a 95ºC, desnaturalización de 1 minuto a 53ºC o 56ºC y extensión de 1 minuto y 15 segundos a 72ºC, seguida de una extensión final de 1 ciclo de 7 minutos a 72ºC. Las reacciones se separaron por electroforesis en un gel de agarosa al 2% (EM Science, Gibbstown, NJ) y se visualizaron por tinción con bromuro de etidio.
Se observó un fragmento de DNA del tamaño correcto en los siguientes tejidos adultos humanos, usando OriGene "Human Tissue Rapid-Scan^{TM} Panel": testículo, leucocitos de plasma (PBL) y médula ósea.
Se observó un fragmento de DNA del tamaño correcto en las siguientes fracciones de sangre humana, usando BD Biosciences Clontech "Human Blood Fractions MTC^{TM} Panel": células mononucleares activadas (células B y T, y monocitos), células T CD8 activadas (T-supresor/citotóxico), células CD4+ activadas (linfocito T cooperador/inductor) y en forma muy tenue en células CD8+ en reposo.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 29 Clonación del receptor de oncostatinM humano
El receptor beta de OncostatinM (OSMRbeta) es un receptor de citocinas de tipo I con similitud estructural a IL12R-B2. El ZcytoR17 tiene similitud estructural con IL12R-B1. Se ensayaron OSMRbeta y zcytor17 para ver si podían interactuar como subunidades en un complejo de señalización de citocinas, y si podían actuar juntos como receptor de señalización, o antagonista del receptor soluble, para zcytor17lig.
Para aislar OSMRbeta, se diseñaron los cebadores PCR de oligonucleótidos ZC39982 (SEC ID NO:64) y ZC39983 (SEC ID NO:65) para ampliar la región codificante de longitud total de la secuencia de cDNA de OncostatinM beta humano (SEC ID NO:6) (Acceso en Genbank No. U60805; Mosley B, JBC Volumen 271, número 50, edición del 20 de diciembre de 1996 pp. 32635-32643).
Las reacciones PCR se llevaron a cabo en una hilera de moldes de la genoteca de cDNA, usando una polimerasa robusta, Advantage 0 (Clonetech, PaloAlto, CA), con el fin de identificar una fuente del cDNA. Se usó DNA de molde de genotecas de plásmido de cDNA ampliadas que contenían 5 millones de clones de cDNA independientes. Las reacciones se ensamblaron según las instrucciones del fabricante, usando 400 fmol/\mul de cada oligonucleótido y 2-20 ng/\mul de DNA de la genoteca del plásmido purificado como molde. Las genotecas de cDNA derivaron de los siguientes tejidos y líneas celulares humanos: cerebro fetal, músculo liso de próstata, médula ósea, RPMI1588, tiroides, WI-38, testículo, células mononucleares de sangre periférica, células CD3+ estimuladas, THP-1, amígdala activada, HACAT e hígado fetal. Las reacciones se llevaron a cabo en un ciclador térmico usando las siguientes condiciones: 30 ciclos de 95ºC durante 20 segundos, 68ºC durante 3 minutos. Al final de los 30 ciclos, se llevó a cabo un ciclo adicional de extensión de 8 minutos a 68ºC. Los productos PCR se visualizaron por agarosa TAE, electroforesis en gel en presencia de bromuro de etidio seguida de iluminación UV. Se halló que el producto más abundante provenía de una genoteca de cDNA de músculo liso de próstata. La reacción PCR, que usa el molde de músculo liso de próstata y los oligonucleótidos ZC39982 (SEC ID NO:64) y ZC39983 (SEC ID NO:65), se repitió usando una DNA polimerasa termoestable menos robusta pero de mayor fidelidad "turboPFu", (Stratagene, La Jolla, CA). Se realizaron 30 ciclos de ampliación con las siguientes condiciones: desnaturalización a 94ºC, 30 segundos, desnaturalización a 63ºC, 45 segundos, extensión a 72ºC 3,5 minutos. Un producto de una sola banda se purificó con gel, en un gel de agarosa TAE al 0,8%.
Este DNA se amplió luego nuevamente usando los cebadores ZC39980 (SEC ID NO:66) y ZC39981 (SEC ID NO:67) diseñados para incluir las secuencias de reconocimiento de la enzima de restricción para permitir la clonación de este cDNA a un vector de expresión mamífera.
La reacción PCR se realizó usando "TurboPfu", y el producto PCR se purificó durante 15 ciclos de: 95ºC 1 minuto, 64ºC 1 minuto 20 segundos, 72ºC 4,5 minutos. La reacción PCR se digirió luego con EcoR1 y Xho1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) y se purificó con gel, como se describió anteriormente. Se preparó un vector de expresión mamífera, pZ7NX, digiriendo con EcoR1 y Xho1, y el producto PCR se ligó a este vector y se electroporó a células de E. coli DH10b. Se aislaron varias colonias bacterianas y se secuenciaron. Un clon fue correcto con la excepción de una sola mutación no conservadora. Con el fin de cambiar esta base para emparejar la secuencia esperada, se usó una mutación que abarcaba oligonucleótidos y un sitio de restricción vecino Pst1 en una reacción PCR con "TurboPfu" que usaba pZP7Nx-h. Plásmido OncostatinM R previamente secuenciado como molde. El DNA ampliado por PCR se digirió con PstI y XhoI, y se volvió a clonar en el plásmido pZP7Nx-h OncostatinM R en lugar del fragmento Pst1/Xho1 que contenía la mutación ofensiva. Este nuevo plásmido se secuenció sobre la región PstI a XhoI recientemente ampliada para confirmar la corrección y asegurar que no se hubiesen creado errores en el proceso de ampliación. Este análisis confirmó la secuencia que emparejaba la secuencia esperada sobre la región codificante. La secuencia se muestra en la SEC ID NO:6, y la correspondiente secuencia de aminoácidos en la SEC ID NO:7.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 30 Constructos para generar un heterodímero de Zcytor17/receptor de OncostatinM (OSMRbeta) humano
Se conoce en la técnica un sistema para construcción, expresión y purificación de dichos receptores heterodiméricos solubles, y se ha adaptado al par de receptores, receptor de onconstatin M humano (OSMRbeta) y zcytor17 humano. Para este constructo, el polinucleótido para el receptor soluble de OSMRbeta se muestra en la SEC ID NO:68 y el correspondiente polipéptido se muestra en la SEC ID NO:69; y el polinucleótido del receptor soluble para zcytor17 humano se muestra en la SEC ID NO:70 y el correspondiente polipéptido se muestra en la SEC ID NO:71.
Para construir una línea celular que expresa un hzcytor17 soluble/heterodímero OSMRbeta humano secretado, se creó un constructo, de modo que el receptor soluble heterodimérico resultante comprende el dominio extracelular de OSMRbeta humano condensado a la cadena pesada de IgG gamma1 (Fc4) (SEC ID NO:37) con el marcador Glu-Glu (SEC ID NO:35) en el término C; mientras que el domino extracelular de zcytoR17 se condensó a Fc4 (SEC ID NO:37) con un marcador His (SEC ID NO:72) en el término C. Para ambos brazos de hzcytor17 y OSMRbeta humano del heterodímero se genomanipuló un espaciador Gly-Ser de 12 aminoácidos (SEC ID NO:73) entre la porción extracelular del receptor y el término N-de Fc4.
\vskip1.000000\baselineskip
A. Construcción de OSMRbeta soluble humano/Fc4-CEE
Para la construcción de la porción OSMRbeta/Fc4-CEE soluble humano del heterodímero, la porción extracelular de OSMRbeta humano se aisló usando PCR con los oligos ZC14063 (SEC ID NO:48) y ZC41557 (SEC ID NO:74) bajo las siguientes condiciones de reacción PCR: 30 ciclos de 95ºC durante 60 seg, 57ºC durante 30 seg y 72ºC durante 100 seg; y 72ºC durante 7 min. Los productos PCR se purificaron usando el kit de purificación PCR QIAquick (Qiagen), digerido con EcoR1 y BglII (Boerhinger-Mannheim), se separaron por electroforesis en gel y se purificaron usando un kit de extracción de gel QIAquick (Qiagen).
El casete de expresión, la cadena principal plasmídica y la porción del marcador Fc4-GluGlu de la quimera estuvieron contenidos dentro de un vector plasmídico previamente elaborado internamente. El vector plasmídico se digirió con EcoR1 y BamH1 (Boerhinger-Mannheim), se separó por electroforesis en gel y se purificó usando un kit de extracción de gel QIAquick (Qiagen). Los fragmentos digeridos y purificados de OSMRbeta humano y Fc4-cEE que contenían el plásmido se ligaron entre sí usando DNA Ligasa T4 (Life Technologies, Bethesda, MD) empleando métodos de ligadura convencionales. Las minipreparaciones de la ligadura resultante se cribaron para un inserto EcoRI/Sma1 del tamaño correcto (772bp) para el OSMRbeta soluble y las minipreparaciones positivas se secuenciaron para confirmar la precisión de la reacción PCR. Esta nueva construcción del plásmido se denomina pZP9-ONCOMR-Fc4CEE.
\vskip1.000000\baselineskip
B. Construcción de Zcytor17 soluble humano/Fc4-CHIS
Para la construcción de la porción hzcytor17/Fc4-CHIS del heterodímero, la porción extracelular de zcytor17 humano se aisló por digestión de un plásmido que previamente contenía el receptor soluble Zcytor17-Fc4. El plásmido se digirió primero con Sal1 (New England Biolabs, Beverly, MA) después de lo cual la reacción se extrajo en serie con fenol cloroformo y precipitó etanol. El DNA digerido se trató luego con DNA Polimerasa T4 (Boerhinger-Mannheim), para completar las proyecciones en 5' creadas por la digestión de Sal1, dejando romos los extremos del DNA, tras lo cual la reacción se extrajo en serie con fenol cloroformo y precipitó etanol. El DNA enromado se digirió luego con BglII para cortar en el extremo 3'), se separó por electroforesis en gel y se purificó usando el kit de extracción de gel QIAquick (Qiagen) según las instrucciones del fabricante. El fragmento de DNA resultante, que contenía la secuencia codificante para el dominio extracelular de zcytoR17, se ligó a un marcador Fc4-CHIS que contenía el vector de expresión mamífera preparado como se indica a continuación.
El casete de expresión, la cadena principal plasmídica y la porción del marcador Fc4-CHIS de la quimera se contuvieron dentro de un vector plasmídico previamente preparado internamente; este vector plasmídico se digirió con EcoR1 (Boerhinger-Mannheim) y luego la reacción se extrajo en serie con fenol cloroformo y precipitó etanol. El DNA digerido se trató entonces con DNA Polimerasa T4 (Boerhinger-Mannheim), para completar las proyecciones en 5' creadas por la digestión de EcoR1, dejando romos los extremos del DNA, tras lo cual la reacción se extrajo en serie con fenol cloroformo y precipitó etanol. El DNA enromado se digirió adicionalmente con BarnH1 (Boerhinger-Mannheim) para cortar el extremo 3', se separó por electroforesis en gel y se purificó usando un kit de extracción de gel QIAquick (Qiagen). Los fragmentos digeridos y purificados de zcytor17 humano y Fc4-CHIS que contenía el plásmido se ligaron entre sí usando DNA Ligasa T4 (Life Technologies, Bethesda, MD) usando métodos de ligadura convencionales.
Las minipreparaciones de la ligadura resultante se cribaron por PCR, usando el cebador sentido específico de zcytor17 ZC29180 (SEC ID NO:22) y el cebador antisentido específico de Pc4 ZC29232 (SEC ID NO:75) con las siguientes condiciones de reacción PCR: 30 ciclos de 94ºC durante 60 seg, 68ºC durante 150 seg; y 72ºC durante 7 min. Un tamaño de producto esperado de 848 bp confirmó el correcto ensamblado del plásmido denominado pZEM228 hzcytor17/Fc4HIS.
Se creó una segunda construcción de zcytor17-Fc4 para usar al generar la proteína del homodímero de células COS. En síntesis, la región codificante para toda la proteína de fusión se aisló por digestión de un plásmido que previamente contenía el receptor soluble Zcytor17-Fc4 con Sal1 (Boerhinger-Mannheim). La reacción se extrajo en serie con fenol cloroformo y precipitó etanol. El DNA digerido se trató luego con DNA Polimerasa T4 (Boerhinger-Mannheim), para completar las proyecciones 5' creadas por la digestión de EcoR1, dejando romos los extremos del DNA, tras lo cual la reacción se extrajo en serie con fenol cloroformo y precipitó etanol. El DNA enromado se digirió luego adicionalmente con NotI (Boerhinger-Mannheim) para cortar en el extremo 3', se separó por electroforesis en gel y se purificó usando un kit de extracción de gel QIAquick (Qiagen). Se digirió un vector de expresión mamífera que contenía un casete de expresión impulsado por CMV para generar extremos compatibles, y los 2 fragmentos se ligaron entre sí. Las minipreparaciones de la ligadura resultante se cribaron por PCR, usando el cebador sentido específico del vector ZC14063 (SEC ID NO:48) y el cebador antisentido específico de zcytor17 ZC27899 (SEC ID NO:19) con las siguientes condiciones de reacción PCR: 30 ciclos de 94ºC durante 30 seg, 64ºC durante 30 seg; 70ºC durante 90 seg; y 72ºC durante 7 min. Un tamaño de producto esperado de aproximadamente 1000 bp confirmó el ensamblado correcto del plásmido denominado pZP7NX-hzcytor17-Fc4. Este plásmido se transfectó posteriormente a células COS usando Lipofectamine (Gibco/BRL), según las instrucciones del fabricante. Las células se acondicionaron durante 60 horas en DMEM + FBS al 5% (Gibco/BRL), después de lo cual la proteína se purificó en una columna de cromatografía de proteínas G-sepharose 4B y se preparó para bioensayos in vitro, por ejemplo, aquellos descritos en esta memoria.
\vskip1.000000\baselineskip
C. Generación de un receptor Zcytor17/OncostatinM humano (OSMRbeta)
Se co-transfectaron aproximadamente 16 \mug de cada uno de pZP9-ONCOMR-Fc4CEE y pZEM228 hzcytor17/
Fc4HIS en células BHK-570 (ATCC No. CRL-10314), usando lipofectamina (Gibco/BRL), según las instrucciones del fabricante. Las células transfectadas se seleccionaron durante 10 días en DMEM + FBS al 5% (Gibco/BRL) que contenía 0,5 mg/ml G418 (Gibco/BRL) y metotrexato 250 nM (MTX)(Sigma, St. Louis, MO) durante 10 días.
La combinación resultante de células doblemente seleccionadas se usó para generar la proteína heterodimérica. Se usaron tres fábricas de células (Nunc, Dinamarca) de esta combinación para generar 10 L de medio condicionado libre de suero. Este medio condicionado se pasó por una columna de 1 ml de proteína A y se eluyó en (10) fracciones de 750 microlitros. Cuatro de estas fracciones que tenían las concentraciones más altas se combinaron y dializaron (valor de corte 10 kD MW) contra PBS. El complejo de proteínas zcytorl7/OSMRbeta heterodimérico soluble se aisló de los componentes del medio pasando la combinación por una columna de níquel y lavando la columna con diversas concentraciones de Imidazol. La proteína soluble zcytor17/OSMRbeta se eluyó a concentraciones intermedias de Imidazol, mientras que el homodímero hzcytorl7/Fc4HIS se eluyó a concentraciones más altas de Imidazol.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 31 Distribución de tejido de zcytor17 humano en paneles de tejido usando transferencia Northern y PCR A. Distribución de tejido de zcytor17 humano usando transferencia Northern
Se sondearon transferencias Northern de múltiples tejidos humanos (Transferencias I y II de MTN humano de senda 12, y Transferencia II de MTN del sistema inmunitario humano; MTN endocrino humano, transferencia II de MTN fetal humano, Matriz de Tejido Múltiple Humano) (Clontech) como también transferencias preparadas internamente que contenían diversos tejidos, para determinar la distribución de tejido de la expresión de zcytor17 humano. Las transferencias preparadas internamente incluían mRNA de los siguientes tejidos y líneas celulares: células SK-Hep-1, células THP1, glándula suprarrenal (Clontech); riñón (Clontech), hígado (Clontech e Invitrogen); médula espinal (Clontech), testículo (Clontech), células T CD4+ humanas, células T CD8+ humanas, células T CD19+ humanas, reacción de linfocitos mixta humana (MLR), línea celular THP1 (ATCC No. TIB-202), línea celular U937, línea celular de linfoblastos de ratón p388Dl (ATCC No. CCL-46) con o sin estimulación por Ionomicina; y línea celular de pulmón embrionario humano WI-38 (ATCC No. CRL-2221) con o sin estimulación por Ionomicina.
Se amplió una sonda derivada de PCR de aproximadamente 500 bp para zcytor17 (SEC ID NO:4) usando los oligonucleótidos ZC28,575 (SEC ID NO:77) y ZC27,899 (SEC IO NO:19) como cebadores. La ampliación PCR se llevó a cabo de la siguiente manera: 30 ciclos de 94ºC durante 1 minuto, 65ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 1 minuto; seguidos de 1 ciclo a 72ºC durante 7 minutos. El producto PCR se visualizó por electroforesis en gel de agarosa y el producto PCR de aproximadamente 500 bp se purificó como se describe en este documento. La sonda se marcó radiactivamente usando el kit de marcado de cebador aleatorio PRIME IT II^{TM} (Stratagene) según las instrucciones del fabricante. La sonda se purificó usando una columna NUCTRAP^{TM} (Stratagene). Se empleó la solución EXPRESSHYB^{TM} (Clontech) para la prehibridación y como solución de hibridación para las transferencias Northern. La prehibridación se llevó a cabo a 68ºC durante 2 horas. La hibridación tuvo lugar durante una noche a 68ºC con aproximadamente 1,5Xl0^{6} cpm/ml de sonda marcada. Las transferencias se lavaron tres veces a temperatura ambiente en 2X SSC, SDS al 0,05%, seguidas de 1 lavado durante 10 minutos en 2X SSC, SDS al 0,1% a 50ºC. Se observaron varias bandas tenues después de varios días de exposición. Se observó una transcripción de aproximadamente 9 kb en la tráquea, músculo esquelético y timo; se observó una transcripción de aproximadamente 2 kb en PBL, HPV, U937 y células THP-1; y se observó una transcripción de aproximadamente 1,2 kb en placenta, médula ósea y tiroides, y en células HPV y U937. En todos los tejidos anteriormente mencionados, la intensidad de señal fue tenue. Parecía haber poca expresión en la mayoría de los tejidos, indicando que la expresión de zcytor17 puede depender de la activación de células o tejidos en los que se expresa.
\vskip1.000000\baselineskip
B. Distribución de tejido en paneles de tejido usando PCR
Se cribó un panel de cDNA de tejidos humanos para expresión de zcytor17, usando PCR. El panel se elaboró internamente y contenía 94 muestras de cDNA marathon y cDNA de distintos tejidos y líneas celulares humanos normales y cancerosos que se exponen en la Tabla 13 a continuación. Los cDNA provenían de genotecas internas o los cDNA marathon de preparaciones de RNA internas, Clontech RNA o Invitrogen RNA. Los cDNA marathon se prepararon usando el kit marathon-Ready^{TM} (Clontech, Palo Alto, CA) y se les realizó el control de calidad con los cebadores de clatrina ZC21195 (SEC ID NO:78) y ZC21196 (SEC ID NO:79), y luego se diluyeron en base a la intensidad de la banda de clatrina. Para asegurar la calidad de las muestras del panel, se realizaron tres ensayos de control de la calidad (QC): (1) Para evaluar la calidad del RNA utilizado para las genotecas, los cDNA internos se ensayaron para tamaño promedio del inserto por PCR con oligos vectores que eran específicos para las secuencias del vector de una genoteca de cDNA individual; (2) la estandarización de la concentración del cDNA en las muestras del panel se logró empleando métodos PCR convencionales para ampliar alfa tubulina de longitud total o cDNA de G3PDH usando un cebador del oligo vector 5' ZC14,063 (SEC ID NO:48) y 3' un cebador oligo específico de alfa tubulina ZC17,574 (SEC ID NO:49) o un cebador oligo específico de 3' G3PDH ZC17,600 (SEC ID NO:50); y (3) se envió una muestra para secuenciación a fin de controlar la posible contaminación de DNA ribosómica o mitocondrial. El panel tuvo un formato de 96 pocillos que incluía una muestra de control positiva de DNA genómico humano (Clontech, Palo Alto, CA). Cada pocillo contenía aproximadamente 0,2-100 pg/\mul de cDNA. Las reacciones PCR se iniciaron usando los oligos ZC26,358 (SEC ID NO:80) y ZC26,359 (SEC ID NO:81), TaKaRa Ex Taq^{TM} (TAKARA Shuzo Co. LTD, Biomedicals Group, Japón) y tinte Rediload (Research Genetics, Inc., Huntsville, AL). La ampliación se realizó del siguiente modo: 1 ciclo a 94ºC durante 2 minutos, 35 ciclos de 94ºC durante 30 segundos, 66, 3ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 30 segundos, seguidos de 1 ciclo a 72ºC durante 5 minutos. Se sometieron aproximadamente 10 \mul del producto de la reacción PCR a electroforesis en gel de agarosa convencional usando un gel de agarosa al 4%. Se observó el tamaño correcto del fragmento de DNA pronosticado en ganglio linfático, próstata, tiroides, HPV (epitelio de próstata), HPVS (epitelio de próstata seleccionado), tumor de pulmón, reacciones tumorales de útero, junto con la reacción de DNA genómico.
El fragmento de DNA para tejido de próstata (2 muestras), HPV (epitelio de próstata), HPVS (epitelio de próstata seleccionado) y genómico se cortó y purificó usando un kit de extracción de gel (Qiagen, Chatsworth, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los fragmentos se confirmaron por secuenciación para mostrar que realmente eran de zcytor17.
TABLA 13
14
15 
\vskip1.000000\baselineskip
C. Análisis de expresión de zcytoR17 por PCR y Northern
La anotación de estos tipos de células y las condiciones de desarrollo que afectan la expresión del receptor son un medio útil de elucidar su función y pronosticar una fuente de ligandos. Con ese fin, se estudiaron por PCR una diversidad de tejidos y tipos celulares. La polimerasa termoestable Advantage II^{TM} (Clontech, La Jolla, CA) se usó con los cebadores de los oligonucleótidos ZC29,180 (SEC ID NO:22) y ZC29,179 (SEC ID NO:82) y 1-10 ng de diversos moldes de cDNA mencionados a continuación durante 30 ciclos de ampliación de (94ºC, 30 seg.; 66ºC, 20 seg.; 68ºC, 1 min. 30 seg). Después de esto, se pasó 20% de cada reacción por geles de agarosa al 0,8%, TAE/bromuro de etidio y se visualizó con luz UV. Se asignó luego un puntaje a las muestras en base a la intensidad de la banda. Véase la Tabla 14 a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 14
16
17 
\vskip1.000000\baselineskip
De las señales PCR positivas fuertes, dos fueron de las líneas celulares de monocitos humanos U937 y THP1.
Estas dos líneas celulares, junto con el epitelio de próstata, se seleccionaron para mayor análisis por transferencia Northern. Los intentos previos de visualizar una transcripción por análisis Northern usando mRNA de diversos tejidos, proporcionaron señales débiles y difusas en el intervalo sorprendentemente grande de 7-10kb, dificultando la interpretación de los datos. Se preparó un gel de formaldehído/MOPS/agarosa al 0,8% desnaturalizante (RNA Methodologies, Farrell, RE Academic Press), y se prepararon 2 \mug de polyA+ mRNA para cada muestra, junto con una escalera de RNA (Life Technologies, Bethesda, MD). El gel se transfirió luego a nylon Hybond (Amersham, Buckinghamshire, Reino Unido), se entrecruzó por UV y se hibridó en solución ExpressHyb (Clontech, La olla, CA) a 68ºC durante una noche, usando una sonda para zcytoR17 humano generada por PCR con los oligos ZC28,575 (SEC ID NO:77), y ZC27,899 (SEC ID NO:19), y se marcó con un kit Megaprime ^{32}P (Amersham). La transferencia Northern se lavó posteriormente con 0,2xSSC+SDS al 0,1% a 65ºC durante 15 minutos y se expuso a película durante 7 días con pantallas intensificadoras. Se observó una banda de 5 kb prominente tanto en el epitelio de próstata como en la senda U937, mientras que se observó una banda más tenue en la senda THP1.
Para optimizar el cDNA utilizado como sonda de hibridación, se ampliaron por PCR cuatro regiones diferentes de la secuencia humana zcytoR17 de longitud total, se marcaron y se hibridaron como se describió anteriormente para transferencia Southern que contenía DNA de genotecas de cDNA genómicas y ampliadas. Las cuatro sondas, aquí designadas sondas A-D, se ampliaron usando los siguientes pares de cebadores: (A) ZC28,575 (SEC ID NO:77), ZC27,899 (SEC ID NO:19); (B) ZC27,895 (SEC ID NO:20), ZC28,917 (SEC ID NO:83); (C) ZC28,916 (SEC ID NO:84), ZC28,918 (SEC ID NO:85); y (D) ZC28,916 (SEC ID NO:84), ZC29,122 (SEC ID NO:21). El DNA genómico humano, junto con las genotecas de cDNA ampliadas que demostraron contener zcytor17 por PCR, se digirieron con EcoR1 y Xho1i para liberar insertos, y se pasaron por duplicado por TAE/agarosa al 0,8%, se desnaturalizaron con NaOH 0,5M, NaCl 1,5 M, se transfirieron a Hybond, se entrecruzaron por UV y cada uno se hibridó con una sonda distinta. Se descubrió que la Sonda B tenía la unión menos específica y la señal más fuerte. Por ende, la Sonda B se utilizó para todas las hibridaciones subsiguientes.
Dado que las células THP1 son un excelente modelo de monocitos circulantes y expresaron zcytor17 a niveles bajos, se trataron con una diversidad de compuestos en un esfuerzo por aumentar la expresión de zcytoR17. Las células se desarrollaron hasta una intensidad de 2e5/ml, se lavaron y se resuspendieron en diversos medios estimulantes, se desarrollaron durante cuatro a treinta horas y se cosecharon para preparaciones de RNA. Cada medio se enriqueció con uno de los siguientes fármacos o pares de citocinas: LPS 2 ug/ml (Sigma Chemicals, St. Louis, MO), hTNF\alpha 2 ng/ml (R&D Systems, Minneapolis, MN), hGM-CSF 2 ng/ml (R&D Systems, Minneapolis, MN), hIFN-\gamma 50 ng/ml (R&D Systems, Minneapolis, MN), hMCSF 1 ng/ml (R&D Systems, Minneapolis, MN), hIL6 1 ng/ml (R&D Systems, Minneapolis, MN), hIL1\beta 2 ng/ml (R&D Systems, Minneapolis, MN), hIFN\gamma 50 ng/ml+hIL4 0,5 ng/ml (R&D Systems, Minneapolis, MN), hIFN\gamma 50 ng/ml+hIL10 1 ng/ml (R&D Systems, Minneapolis, MN), PMA 10 ng/ml (Calbiochem, SanDiego, CA) y un control no tratado. Al final del periodo de cultivo, se preparó RNA total usando un kit RNAeasy Midi (Qiagen, Valencia, CA). Se seleccionó Poly A+ RNA del RNA total, usando un kit MPG (CPG, Lincoln Park, NJ). Se pasaron 2 ug de polyA+ RNA de cada condición por geles de formaldehído/MOPS/agarosa, se transfirieron a nylon y se entrecruzaron por UV como se describió antes. Estas transferencias Northern luego se hibridaron, como anteriormente, a la sonda B a 68ºC durante una noche, se lavaron bajo condiciones de alta rigurosidad con 0,2XSSC, SDS al 0,1% a 65ºC, se expusieron a película durante una noche y luego se expusieron a pantallas de fósforo para cuantificación de señal. Un mRNA dominante de 8 kb, como también una banda relativamente más débil de 2,8 kb, se observaron en todas las sendas. Se observó un aumento de 20 veces en mRNA de zcytor17 en RNA de células tratadas con hIFN\gamma durante 30 horas. Este efecto mutó levemente con tratamiento de estimulaciones con IL4. Se observaron aumentos menores de 3 veces en mRNA, en RNA de células tratadas con LPS, TNF\alpha y GM-CSF, mientras que MCSF, IL6, y IL1\beta no tuvieron ningún efecto sobre los niveles de mRNA de zcytor17. Estos datos indican una función del receptor de zcytorl7 y su ligando en la biología de los macrófagos monocíticos y por extensión en cualquier número de procesos de enfermedad en los que participen estas células.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 32 Distribución de tejido de zcytor171ig humano en paneles de tejido usando transferencia Northern y PCR
Se obtuvo un fragmento de cDNA de zcytor17lig humano usando PCR con cebadores específicos de genes: cebador sentido ZC41438 (SEC ID NO:93) y cebador antisentido ZC41437 (SEC ID NO:94) y cDNA de zcytor17lig humano molde (SEC ID NO:90) Este fragmento se purificó usando métodos convencionales y aproximadamente 25 ng se marcaron con ^{32}P alfa dCTP usando el kit de marcado de cebadores aleatorio Prime-It RmT (Stratagene) y se hibridaron en Ultrahyb, (Ambion) y se utilizaron para exponer pantallas de película/intensificadoras Biomax según las recomendaciones del fabricante en cada caso. Se hibridaron transferencias nuevas, sin uso previo, incluyendo la senda MTN humana 12 de Clontech, MTN II de cerebro humano y MTN IV de cerebro humano, el sistema inmunitario MTN II y la matriz MTE humana II, de Clontech que se hibridaron durante una noche a 42ºC por el método Ambion ultrahyb. Los recuentos radiactivos no específicos se eliminaron usando 0,1 SSC/SDS al 0,5% a 55ºC. Las transferencias positivas incluían la senda MTN humana 22 (Clontech). De los 12 tejidos examinados, solamente la placenta fue positiva para una transcripción de aproximadamente 1,2 KB.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 33 Construcción de vectores de expresión mamífera que expresan zcytor17lig-CEE humano A. Construcción de zCytor17Lig-CEE/pZMP21
Se construyó un plásmido de expresión que contenía todo o parte de un polinucleótido que codifica zCytor17Lig-CEE (SEC ID NO:95) vía recombinación homóloga. El plásmido se denominó zCytor17Lig-CEE/pZMP21.
La construcción de zCytor17Lig-CEE/pZMP21 se logró generando un fragmento zCytor17Lig-CEE, usando ampliación PCR. El molde de DNA utilizado para la producción del fragmento zCytor17Lig-CEE fue zCytor17Lig/
pZP7nx. Los cebadores utilizados para la producción del fragmento zCytor17Lig-CEE fueron: (1) ZC41,607 (SEC ID NO:97) (secuencia sentido), que incluye desde el extremo 5' hasta el extremo 3': 28bp correspondientes a la secuencia flanqueadora del vector (5' del inserto) y 21 bp correspondientes a la secuencia 5' de zCytor17Lig; y (2) ZC41,605 (SEC ID NO:98) (secuencia antisentido), que incluye desde el extremo 5' hasta el extremo 3': 37 bp de la secuencia flanqueadora del vector (3' del inserto), 3 bp del codón finalizador, 21 bp que codifican un marcador C-terminal EE y 21 bp correspondientes al extremo 3' de la secuencia zCytor17Lig. El fragmento resultante de la ampliación PCR ya mencionada fue una copia del molde zCytor17Lig con la adición de un marcador C-terminal EE, proporcionando un producto final zCytor17Lig-CEE.
Las reacciones PCR se realizaron de la siguiente manera: A un volumen final de 100 \mul se le añadieron: 10 \mul de tampón de reacción de Polimerasa Taq 10x con MgCl 15 mM (Gibco), 1 \mul de DNA Polimerasa Taq (5 unidades/\mul, Gibco), 3 \mul de dNTP 10 mM, 78 \mul dH_{2}O, 3 \mul de un stock 20 pmol/\mul del cebador ZC41,607 (SEC ID NO:97) 3 \mul de un stock 20 pmol/\mul del cebador ZC41,605 (SEC ID NO:98) y 2 \mul de un stock 0,13 \mug/\mul del molde de DNA zCytor17lig. Se añadió a la mezcla un volumen equivalente a 50 \mul de aceite mineral. La reacción se calentó hasta 94ºC durante 5 minutos, seguida de 35 ciclos a 94ºC durante 1 minuto; 55ºC durante 2 minutos; 72ºC durante 3 minutos; seguidos de una extensión de 10 minutos a 72ºC, y se mantuvo a 4ºC hasta recoger la reacción.
El plásmido pZMP21 se digirió por restricción con la enzima BglII, se lavó con un kit de purificación PCR QiaQuick (Qiagen) usando un protocolo microcentrífugo, y se usó para recombinación con el fragmento PCR. El plásmido pZMP21 se construyó a partir de pZMP20, que se construyó a partir de pZP9 (depositado en American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, y designado con el No. 98668), con los elementos genéticos de levadura de pRS316 (depositado en American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209 y designado con el No. 77145), un elemento IRES de poliovirus, y el dominio extracelular de CDS, truncado en el extremo carboxiterminal del dominio de transmembrana. PZMP21 es un vector de expresión mamífera que contiene un casete de expresión que tiene el promotor MPSV, el intrón peptídico de señal de inmunoglobulina, múltiples sitios de restricción para inserción de secuencias codificantes y un codón finalizador y un terminador de la hormona del crecimiento humana. El plásmido también tiene un origen de replicación de E. coli, una unidad de expresión de marcador seleccionable de mamífero que tiene un promotor SV40, potenciador y origen de replicación, un gen DHFR, el terminador SV40, como también las secuencias URA3 y CEN-ARS necesarias para selección y replicación en S. cerevisiae.
\newpage
Se combinaron independientemente cincuenta microlitros de células de levadura competentes (S. cerevisiae) con 100 ng de plásmido cortado, 5 \mul de la mezcla PCR previamente descrita, y se transfirieron a una cubeta de electroporación de 0,2 cm. La mezcla de levadura/DNA se electropulsó a 0,75 kV (5 kV/cm), \infty ohms, 25 \muF. A cada cubeta se le habían añadido 600 \mul de sorbitol 1,2 M, y la levadura se dispuso en dos placas URA-D en una alícuota de 100 \mul y una alícuota de 300 \mul, y se incubó a 30ºC. Después de aproximadamente 72 horas, los transformantes de levadura Ura+ de una de las placas se resuspendieron en 1 ml H_{2}O y se centrifugaron brevemente para sedimentar las células de levadura. El sedimento celular se resuspendió en 500 \mul de tampón de lisis (Triton X-100 al 2%, SDS al 1%, NaCl 100 mM, Tris 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM). Los 500 \mul de la mezcla de lisis se añadieron a un tubo Eppendorf que contenía 300 \mul de 600 \mum de esferas de vidrio lavadas con ácido y 300 \mul fenol-cloroformo, se agitó en vórtex durante dos o tres intervalos de 1 minuto, seguidos de una centrifugación de 5 minutos en una máquina centrífuga Eppendorf a velocidad máxima. Se transfirieron 300 microlitros de la fase acuosa a un tubo nuevo, y el DNA precipitó con 600 \mul de etanol al 100% (EtOH), seguido de centrifugación durante 10 minutos a 4ºC. El sedimento de DNA se lavó luego con 500 \mul de EtOH al 70%, seguidos de centrifugación durante 1 minuto a 4ºC. Los sedimentos de DNA se resuspendieron en 30 \mul H_{2}O.
La transformación de células de E. coli electrocompetentes (MC1061) se realizó con 5 \mul de la preparación de DNA de levadura y 50 \mul de células MC1061. Las células se electropulsaron a 2,0 kV, 25 \muF y 400 ohms(\Omega). Después de la electroporación, se añadieron 600 \mul SOC (2% Bacto' Tryptone (Difco, Detroit, MI), extracto de levadura al 0,5% (Difco), NaCl 10 mM, KCl 2,5 mM, MgCl_{2} 10 mM, MgSG_{4} 10 mM, glucosa 20 mM). Las células de E. coli electroporadas se dispusieron en dos placas LB AMP (caldo LB (Lennox) en alícuotas de 200 \mul y a 50 \mul, Bacto Agar 1,8% (Difco), 100 mg/L Ampicillin). Las placas se incubaron boca abajo durante 24 horas a 37ºC. Se seleccionaron aleatoriamente tres colonias resistentes a ampicilina y se enviaron para análisis de secuencias del inserto. Se aisló DNA plasmídico a gran escala de un clon confirmado en la secuencia, usando el kit Qiagen Maxi (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
\vskip1.000000\baselineskip
B. Construcción de zCytor17Lig(m)-CEE/pZMP21 de ratón
Se construyó además un plásmido de expresión que contenía todo el polinucleótido que codifica el zCytor17Lig-CEE murino (SEC ID NO.104 y SEC ID NO:105) por recombinación homóloga, usando el método descrito en el Ejemplo 33A anterior. Los cebadores empleados fueron: (1) ZC41643 (SEC ID NO:106) (directo, sentido 5' a 3') con una superposición de 28bp 5' del punto de inserción; 21 bp del extremo 5' de zcytor17lig(m) y (2) ZC41641 (SEC ID NO:107) (inverso, antisentido 5' a 3') con una superposición del vector de 37bp 3' del punto de inserción; codón finalizador de 3 bp; marcador C-terminal EE de 21 bp; 24 bp del extremo 3' de zCytor17Lig(m)-CEE. El plásmido se denominó zcytor17lig(m)-CEE/pZMP21. La secuencia de polinucleótidos de zcytor17lig(m)-CEE se muestra en la SEC ID NO:104, y la correspondiente secuencia de polipéptidos se muestra en la SEC ID NO:105.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 34 Transfección y expresión de polipéptidos zcytor17lig-CEE A. Expresión de zcytor17lig-CEE/pZMP21 humano en células 293T
Se expresó ZCytor17Lig-CEE transitoriamente en células 293T (Stanford University School of Medicine, Stanford, CA, ATCC (SD-3515)) para generar la proteína purificada inicial. El día anterior a la transfección, se sembraron células 293T a 6,5xl0^{4} células/cm en 30 matraces de cultivo T162 con un volumen total de 30 ml de medio de cultivo (SL7V4 +FBS al 5% + Pen/Estrep al 1%) por matraz. Las células se dejaron incubar durante 24 horas a 37ºC.
Se preparó una mezcla de DNA/Liposoma de la siguiente manera: Se llenaron dos tubos cónicos de 50 ml con 25 mL de medio de transfección (SL7V4 +Pen/Estrep al 1%), y se añadieron 1,13 mg de zCytor17Lig-CEE/pZMP21 (Ejemplo 33) a cada uno. Se llenó un conjunto separado de dos tubos cónicos de 50 ml con 22 ml de medio de transfección (anteriormente mencionado), y se añadieron 3 ml de liposomas (Lipofectamine, Gibco) a cada uno. Para cada conjunto de tubos, se añadió un tubo de DNA a un tubo de liposomas y la mezcla de DNA/liposoma se incubó durante 30 minutos. Los dos tubos cónicos de 50 ml que contenían las mezclas de DNA/liposoma se combinaron (aproximadamente 100 ml) y se añadieron 300 ml de medio de transfección.
Los 30 matraces de las células 293T se decantaron, se lavaron 1x con aproximadamente 15 ml de PBS, y se les añadieron 12,5 ml de mezcla diluida de DNA/liposoma a cada matraz. Los matraces se incubaron durante 3 horas a 37ºC. Después del periodo de incubación, se añadieron 25 ml de medio de cultivo (ya mencionado) a cada matraz de T162. El medio de transfección se recogió después de aproximadamente 96 horas y se usó para purificación de proteínas (Ejemplo 35).
\vskip1.000000\baselineskip
B. Expresión de zcytor17lig-CEE/pZMPP21 humano en células BHK
La proteína zCytor17Lig de longitud total se produjo en células BHK transfectadas con zCytor17Lig-CEE/pZMP2l (véase el Ejemplo 33 anterior). Las células BHK 570 (ATCC CRL-10314) se dispusieron en matraces de cultivo de tejido T75 y se dejaron desarrollar hasta aproximadamente 50 a 70% confluencia a 37ºC, 5% CO_{2}, en medio de desarrollo (SL7V4, FBS al 5%, pen/estrep al 1%). Las células luego se transfectaron con zCytor17Lig-CEE/pZMP21 por transfección mediada por liposomas (usando Lipofectamine^{TM}; Life Technologies), en medio libre de suero (SF) (SL7V4). El plásmido (16 \mug) se diluyó en tubos de 1,5 ml hasta un volumen final total de 640 \mul con medio SF. Se mezclaron 35 microlitros de la mezcla de lípidos con 605 \mul de medio SF, y la mezcla resultante se incubó aproximadamente 15 minutos a temperatura ambiente. Se añadieron entonces 5 microlitros de medio SF a la mezcla de DNA/lípido. Las células se enjuagaron una vez con 10 ml de PBS, el PBS se decantó y se añadió la mezcla DNA:lípido. Las células se incubaron a 37ºC durante cinco horas, luego se añadieron 15 ml de medio (SL7V4, FBS al 5%, pen/estrep al 1%) a cada placa. Las placas se incubaron a 37ºC durante una noche, y al día siguiente la mezcla de DNA/lípido se reemplazó con medio de selección (SL7V4, FBS al 5%, pen/estrep al 1%, 1 \muM metotrexato). Aproximadamente 10 días después de la transfección, se tripsinizaron las colonias resistentes al metotrexato del matraz de transfección T75, y las células se combinaron, se dispusieron en matraces T-162 y se transfirieron a un cultivo a gran escala.
\vskip1.000000\baselineskip
C. Expresión de zcytor17lig-CEE(m)/pZMP21 de ratón en células 293T
Se expresó zcytor17lig(m)-CEE de ratón transitoriamente en células 293T, como se describió en el Ejemplo 34ª, y el medio de cultivo se usó para purificación de proteínas (Ejemplo 35).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 35 Purificación de Zcytor17lig-CEE en células 293T
A menos que se indique lo contrario, todas las operaciones se realizaron a 4ºC. Se usó el siguiente procedimiento para purificar Zcytor17lig tanto de ratón como humano que contenía marcadores C-terminales Glu-Glu (EE) (SEC ID NO:103). Se purificó el medio condicionado de células 293T que expresaban Zcytor17lig-CEE (Ejemplo 34). Se determinaron las concentraciones de la proteína diana del medio condicionado vía análisis SDS-PAGE y transferencia Western con el anticuerpo anti-EE.
Una columna de 5,5 ml de anti-EE Poros 50 A (PE BioSystems, Framingharn, MA) (preparada como se describió anteriormente) se vertió en una columna de vidrio Waters AP-1, de 1 cm x 7cm (Waters, Milford, MA). La columna se rellenó y equilibró con un BioCad Sprint (PE BioSystems, Framingharn., MA) con solución salina tamponada con fosfato (PBS) pH 7,4. El medio condicionado se ajustó con NaCl hasta, 0,3 M y el pH se ajustó hasta 7,2. El medio condicionado se cargó luego a la columna durante una noche con un caudal de aproximadamente 3 ml/minuto. La columna se lavó con 10 volúmenes de columna (CV) de PBS a pH 7,4, y nuevamente se lavó con 3 CV 5X Sigma PBS a pH 7,4. Se eluyó gradualmente con acetato 0,5 M, NaCl 0,5 M, pH 2,5 a 3 ml/minuto. Los tubos de la fracción contenían 1 ml base Tris (sin ajuste de pH) para neutralizar la elución inmediatamente. La columna se lavó nuevamente por 2 CV con 5X Sigma PBS, pH 7,4 para neutralizar la columna, y luego se equilibró en PBS (pH 7,4). Se recogieron fracciones de 2 ml durante toda la cromatografía de elución y se vigiló la absorbancia a 280 y 215 nM; el pasaje y los lavados combinados también se conservaron y analizaron. Las fracciones pico de la elución ácida y 5X PBS se analizaron para la proteína diana por tinción de Plata SDS-PAGE y transferencia Western con el anticuerpo primario anti-EE y el anticuerpo secundario, HRP antirratón conjugado. Las fracciones de elución ácida de interés se combinaron y concentraron de 38 ml a 0,8 ml usando un concentrador giratorio con un valor de corte del peso molecular de 5000 Dalton. (Millipore, Bedford, MA) según las instrucciones del fabricante.
Para separar Zcytor17lig-CEE del material agregado y de cualquier otra proteína co-purificadora contaminante, las fracciones concentradas combinadas se sometieron a cromatografía de exclusión de tamaño en una columna de 1,6 x 60 cm (120 ml) Superdex 75 (Pharmacia, Piscataway, NJ) equilibrada y cargada en PBS a un caudal de 1,0 ml/min usando un BioCad Sprint. Se recogieron fracciones de 3 ml en toda la cromatografía y se vigiló la absorbancia a 280 y 215 nM. Las fracciones pico se caracterizaron por tinción de plata SDS-PAGE, y se combinaron solamente las fracciones más puras. Este material representó la proteína Zeytor17lig-CEE purificada.
En geles SDS-PAGE teñidos con plata, azul Coomassie y transferencias Western, el Zcytor17lig-CEE fue una banda principal. La concentración de la proteína del material purificado se realizó por análisis BCA (Pierce, Rockford, IL) y la proteína se dividió en alícuotas y se conservó a -80ºC según procedimientos convencionales.
Para preparar PorosA50 anti-EE, se lavó un volumen de lecho de 65 ml de Poros A50 (PE Biosystems) con 100 ml de agua y luego trietanolamina 0,1 M, pH 8,2 (TEA, ICN, Aurora, Ohio), Na_{2}SO_{4} 1M, pH 8,8 que contenía azida de sodio al 0,02%, usando una unidad de filtro con matraces a vacío. La solución de anticuerpo monoclonal EE, a una concentración de 2 mg/ml en un volumen de 300 ml, se mezcló con la resina lavada en un volumen de 250 ml. Después de una incubación de una noche a temperatura ambiente, el anticuerpo no unido se eliminó lavando la resina con 5 volúmenes de TEA 200 mM, Na_{2}SO_{4} 1M, pH 8,8 que contenía azida de sodio al 0,02%, como se describió precedentemente. La resina se resuspendió en 2 volúmenes de TEA, Na_{2}SO_{4} 1 M, pH 8,8 que contenían azida de sodio al 0,02%, y se transfirió a un recipiente adecuado. Se añadieron 3 ml de 25 mg/ml (68 mM) Disuccinimidilsuberato (en DMSO provisto por Pierce, Rockford, IL) y la solución se incubó durante tres horas a temperatura ambiente. Los sitios no específicos en la resina se bloquearon luego incubando durante 10 min a temperatura ambiente con 5 volúmenes de etanolamina 20 mM (Sigma, St. Louis, MO) en TEA 200 mM, pH 8,8 usando la unidad de filtro de matraces a vacío. La resina se lavó con PBS, pH 7,4, seguido de Glicina 0,1 M, pH 3 y luego se neutralizó con 10X PBS. Después de lavar con agua destilada, la resina anti-EE Poros-A 50 acoplada final se conservó a 4ºC en etanol al 20%.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 36 Secuenciación N-terminal de Zcytor17lig de ratón y humano A. Secuenciación N-terminal de Zcytor17lig humano
Se llevó a cabo una secuenciación automática convencional de polipéptidos N-terminal (degradación Edman) usando reactivos de Applied Biosystems. El análisis de la secuencia N-terminal se realizó en un Sistema Secuenciador de Proteínas Modelo 494 (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). El análisis de los datos se efectuó con el Sistema de Análisis de Datos de Secuenciación de Proteínas, Modelo 610GA, versión 2.1a (Applied Biosystems).
Se proporcionó una muestra de zcytor17lig-CEE humano purificado (Ejemplo 35). La muestra se cargó a un filtro de fibra de vidrio preparado para secuenciación n-terminal. El filtro de fibra de vidrio se preparó pre-ciclándolo con Biobrene^{TM}.
El análisis de la secuencia N-terminal del polipéptido zcytor17lig humano segregado no verificó el sitio de escisión pronosticado de la secuencia de señal, pero resultó en un comienzo maduro en el residuo 27(Leu) de la SEC ID NO:2 de la secuencia del precursor zcytor17lig humano.
\vskip1.000000\baselineskip
B. Secuenciación N-terminal de Zcytor17lig de ratón
Se llevó a cabo una secuenciación automática convencional de polipéptidos N-terminal (degradación Edman) usando reactivos de Applied Biosystems. El análisis de la secuencia N-terminal se realizó en un Sistema Secuenciador de Proteínas Modelo 494 (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). El análisis de los datos se efectuó con el Sistema de Análisis de Datos de Secuenciación de Proteínas, Modelo 610GA, versión 2.1a (Applied Biosystems).
Se proporcionó una muestra de zcytor17lig-CEE de ratón purificado capturada en esferas de Proteína G Sepharose/anti-EE (Ejemplo 35). Las esferas se dispusieron en un tampón de muestra SDS PAGE reductor y en agua hirviendo antes de llevar a cabo el análisis SDS PAGE, usando un sistema SDS PAGE Novex (4-12% Bis-Tris MES NuPAGE; Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El gel se electrotransfirió a una membrana Novex PVDF (Invitrogen), y se tiñó con azul de Coomassie (Sigma, St. Louis, MO) usando métodos convencionales. Se efectuaron las correspondientes transferencias Western anti-EE para identificar la banda zcytor17lig para secuenciación de la proteína N-terminal. El anticuerpo conjugado con HRP de IgG anti-EE de ratón utilizado se produjo internamente.
El análisis de la secuencia N-terminal del polipéptido zcytor17lig de ratón segregado verificó el sitio de escisión pronosticado de la secuencia de señal, resultando en un comienzo maduro en 31 (Ala) en referencia a la SEC ID NO:11 y a la SEC ID NO:91 de la secuencia precursora de zcytor17lig de ratón.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 37 Ensayo de unión de células Cos
Se usó un ensayo de unión para ensayar la unión del zcytor17lig a receptores que comprenden el receptor zcytor17, como por ejemplo el receptor zcytor17 o los receptores heterodímeros y trímeros que comprenden el receptor zcytor17 (p. ej., zcytor17/OSMR, zcytorl7/WSX-1 o zcytor17/OSMR/WSX-1, u otras subunidades receptoras de citocinas de Clase I). El DNA plasmídico del receptor Zcytor17 se transfectó en células COS y las células COS transfectadas se emplearon para evaluar la unión del zcytor17lig a los receptores que comprenden el receptor zcytorl7, como se describe a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
A. Transfección de células COS
La transfección de células COS se realizó de la siguiente manera: Se mezclan 800 ng del DNA plasmídico del receptor en las siguientes combinaciones: pZp7pX/zcytor17 solo; pZp7Z/WSX-1 solo; pZp7NX/OSMR solo; pZp7pX/zcytor17 + pZp7NX/OSMR; pZp7pX/zcytor17 + pZp727WSX-1; pZp7NX/OSMR + pZpTZAVSX-1;
pZp7pX/zcytor17 + pZp7NX/OSMR + pZp7Z/WSX-1) y 4 ul Lipofectamine^{TM} en 80 ul medio DMEM libre de suero (55 mg piruvato de sodio, 146 mg L-glutamina, 5 mg transferrina, 2,5 mg insulina, 1 \mug selenio y 5 mg fetuina en 500 ml DMEM), se incuba a temperatura ambiente durante 30 minutos y luego se añaden 320 \mul de medio DMEM libre de suero. A esto se le añade una mezcla de 400 \mul a 2 x10^{5} células COS/pocillos de una placa de cultivo de 12 pocillos (recubiertos con fibronectina) y se incuba durante 5 horas a 37ºC. Se añaden 500 ul de medio DMEM FBS al 20% (100 ml FBS, 55 mg piruvato de sodio y 146 mg L-glutamina en 500 ml DMEM), y se incuba durante una noche.
\vskip1.000000\baselineskip
\global\parskip0.900000\baselineskip
B. Ensayo de unión
El ensayo de unión se realizó de la siguiente manera: se eliminan las células del medio con PBS + BSA al 0,1%, y luego las células se bloquean durante 60 minutos con la misma solución. Las células se incuban durante 1 hora en PBS + BSA al 0,1% con 1,0 ug/ml proteína purificada con zcytor17ligCEE. Las células luego se lavan con + BSA al 0,1% y se incuban durante otra hora con anticuerpo anti-GluGlu de ratón diluido 1:1000. Las células se vuelven a lavar con PBS + BSA al 0,1%, después se incuban durante 1 hora con anticuerpo conjugado con HRP antirratón de cabra diluido 1:200.
La unión positiva se detectó con reactivo de fluoresceína tiramida diluido 1:50 en tampón de dilución (kit NEN) y se incubó durante 4-6 minutos, y se lavó con PBS + BSA al 0,1%. Las células se fijaron durante 15 minutos con formaldehído al 1,8% en PBS, luego se lavaron con PBS + BSA al 0,1%. Las células se conservaron con medio Vectashield Mounting (Vector Labs Burlingarne, CA) diluido 1:5 en PBS. Las células se visualizaron usando un filtro FITC en un microscopio fluorescente.
Se detectó unión positiva para las células transfectadas con zcytor17 solamente, zcytor17+OSMRbeta,
zcytor17+WSX-1 y zcytor17+OSMRbeta+WSX-1. No se detectó unió para las células transfectadas con WSX-1 + OSMRbeta, con OSMRbeta solamente o con WSX-1 solamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 38 El zcytor17lig de ratón activa el receptor zcytor17/OSMRbeta de ratón en el ensayo de luciferasa A. Clonación de zcytor17 de ratón de longitud total y OSMRbeta de ratón para expresión
Se cribó una genoteca de cDNA de testículos de ratón para un clon de longitud total de zcytoR17 de ratón. La genoteca se dispuso a 65.500 cfu/placa en 24 placas LB + Amp. Las siembras del filtro se prepararon usando Hybond N. (Amersham-Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ) en un total de aproximadamente 1,6 millones de colonias. Los filtros se marcaron con una aguja caliente para orientación y luego se desnaturalizaron durante 6 minutos en NaOH 0,5 M y Tris-HCl 1,5 M, pH 7,2. Los filtros se neutralizaron luego en NaCl 1,5 M y Tris-HCl 0,5 M, pH 7,2 durante 6 minutos. El DNA se fijó a los filtros usando un entrecruzador de UV (Stratalinker®, Stratagene, La Jolla, CA) a 1200 julios. Se dejó secar los filtros durante una noche a temperatura ambiente.
Al día siguiente, los filtros se prelavaron a 65ºC en tampón de prelavado de 0,25X SSC, SDS al 0,25% y EDTA 1 mM. Los residuos celulares se eliminaron manualmente usando Kimwipes® (Kimberly-Clark), y la solución se cambió 3 veces durante un periodo de 1 hora. Los filtros se secaron al aire y se conservaron a temperatura ambiente hasta su uso. Los filtros luego se prehibridaron durante aproximadamente 3 horas a 63ºC en 20 ml de solución de hibridación ExpressHyb^{TM} (Clontech, Palo Alto, CA).
Se generó la Sonda B (Ejemplo 31) por PCR del molde de zcytoR17 humano, usando los cebadores de oligonucleótidos ZC27,895 (SEC ID NO:20) y ZC28,917 (SEC ID NO:83), y se marcó radiactivamente con ^{32}P, empleando un kit comercialmente disponible (Megaprime DNA Labeling System; Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) según las instrucciones del fabricante. La sonda se purificó usando una columna Stratagene^{TM} (columna NucTrap®; Stratagene, La Jolla, CA). La sonda se desnaturalizó a 100ºC durante 15 min y se añadió a ExpressHyb^{TM}. Los filtros se hibridaron en 15 ml de solución de hibridación que contenía 1,6 x 10^{6} cpm/ml de sonda a 63ºC durante una noche. Los filtros se lavaron a 55ºC en 2X SSC, SDS al 0,1% y EDTA 1 mM, y se expusieron a película de rayos X a -80ºC durante 4 1/2 días. Se escogieron trece positivos de las placas como tapones, y se dispuso 1 ml en tubos LB +amp de 1,7 ml. Los tubos se dejaron a 4ºC durante una noche. Estos 13 positivos se sometieron a otras dos tandas de purificación. Las placas terciarias se desarrollaron excesivamente a 37ºC después de tomar las siembras del filtro, y las colonias sencillas se recogieron y enviaron a secuenciación. Se determinó que tres de éstas contenían la secuencia del ortólogo de ratón de zcytoR17.
Además, se generó un producto PCR usando cDNA de CTLL-2 como molde y los oligonucleótidos ZC38,239 (SEC ID NO:108) y ZC38,245 (SEC ID NO:109) como cebadores. CTLL-2 es una línea celular de linfocitos T citotóxica de ratón (ATCC No. TIB-214). Esta reacción PCR se llevó a cabo de la siguiente forma: 1 ciclo a 95ºC durante 1 minuto, 30 ciclos a 95ºC durante 15 segundos, 68ºC durante 3 minutos, luego 68ºC durante 10 minutos; impregnación a 4ºC. La reacción PCR usó aproximadamente 0,5 ng de cDNA, 20 pmoles de cada oligonucleótido y 1 \mul de mezcla de polimerasa Advantage II (ClonTech). Aproximadamente 6% del producto PCR se usó como molde en una nueva reacción PCR, como anteriormente, excepto que con los oligonucleótidos ZC38,239 (SEC ID NO:108) y ZC38,238 (SEC ID NO:110). Esta reacción PCR se llevó a cabo del siguiente modo: 30 ciclos a 94ºC durante 45 segundos, 65ºC durante 45 segundos, 72ºC durante 1 minuto, luego 72ºC durante 7 minutos; impregnación a 10ºC. La mayor parte de la reacción PCR se cargó a un gel de agarosa al 1,0% y la banda predominante se cortó a aproximadamente 360 bp, el fragmento de DNA se eluyó y se realizó la secuenciación de DNA.
La secuencia del polinucleótido zcytor17 de ratón se muestra en la SEC ID NO:111, y la correspondiente secuencia de aminoácidos se muestra en la SEC ID NO:112. Además, se muestra una forma soluble truncada del polinucleótido zcytor17 de ratón en la SEC ID NO:113, y la correspondiente secuencia de aminoácidos se muestra en la SEC ID NO:114.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Para obtener cDNA de OSMRbeta de longitud total de ratón se aislaron los productos PCR 5' y 3' y se unieron usando un sitio BamHI interno. Los cebadores PCR se diseñaron usando la secuencia de nucleótidos de la SEC ID NO:119 e incluyen los sitios de restricción EcoRI y XbaI para fines de clonación. La secuencia de ácido nucleico de OSMRbeta de ratón genómico se muestra en la SEC ID NO:119, en donde la secuencia codificante abarca los residuos 780 a 3692 que codifican un polipéptido de 970 aminoácidos OSMRbeta de ratón, que se muestra en la SEC ID NO:120. Una secuencia de ácido nucleico degenerada, que codifica el polipéptido de la SEC ID NO:120, se muestra en la SEC ID NO:121.
Se generó un producto PCR 5' usando una genoteca de cDNA de 3T3-L1 (adipocitos de ratón diferenciados) interna como molde y los oligonucleótidos ZC41,764 (SEC ID NO:115) y ZC41,598 (SEC ID NO:116) como cebadores. Esta reacción PCR 5' se realiza de la siguiente manera: 30 ciclos a 95ºC durante 45 segundos, 55ºC durante 45 segundos, 72ºC durante 1 minuto 30 segundos, luego 72ºC durante 7 minutos; impregnación a 4ºC. La reacción PCR utilizó aproximadamente 3 \mug de plásmido preparado a partir de la genoteca de cDNA, 20 pmoles de cada oligonucleótido y cinco unidades de DNA polimerasa Pwo (Roche). Aproximadamente 90% del producto PCR 5' se digirió con EcoRI y BamHI y se purificó en gel en un gel de agarosa al 1,0%. La banda de aproximadamente 1446 bp se cortó y usó para ligadura (véase a continuación).
Se generó un producto PCR 3' usando una genoteca de cDNA interna de placenta de ratón como molde, y los oligonucleótidos ZC41,948 (SEC ID NO:117) y ZC41,766 (SEC ID NO:118) como cebadores. Esta reacción PCR 3' se realizó de la siguiente manera: 30 ciclos a 95ºC durante 45 segundos, 55ºC durante 45 segundos, 72ºC durante 1 minuto 30 segundos, luego 72ºC durante 7 minutos; impregnación a 4ºC. La reacción PCR usó aproximadamente 3 \mug de plásmido preparado a partir de la genoteca de cDNA, 20 pmoles de cada oligonucleótido y cinco unidades de DNA polimerasa (Roche). Aproximadamente 90% del producto PCR 3' se digirió con BamHI y XbaI, y se purificó en gel sobre un gel de agarosa al 1,0%. La banda de aproximadamente 2200 bp se cortó y usó para ligadura junto con el producto PCR 5' (ya descrito) al vector de expresión pZP-5Z digerido con EcoRI y XbaI. La ligadura de tres partes se efectuó con el fragmento anterior de 5' EcoRI a BamHI, el fragmento de 3' BamHI a XbaI y el vector de expresión pZP-5Z digerido con EcoRI y XbaI. Esto generó un plásmido pZP-5Z que contenía cDNA de longitud total para OSMRbeta de ratón (nucleótidos 780 a 3692 de la SEC ID NO:119), designado pZP-5Z/OSMRbeta. El cDNA OSMRbeta de ratón de longitud total en pZP5Z/OSMRbeta tiene dos inserciones de aminoácidos de la SEC ID NO:120. Hay una duplicación del aminoácido Glicina en la posición 370 y una duplicación del aminoácido Ácido Glutámico en la posición 526. El plásmido pZP-5Z es un vector de expresión mamífera que contiene un casete de expresión que tiene el promotor CMV, múltiples sitios de restricción para inserción de secuencias codificantes y un terminador de la hormona del crecimiento humana. El plásmido también tiene un origen de replicación de E. coli, una unidad de expresión de marcador seleccionable de mamífero que tiene un promotor SV40, potenciador y origen de replicación, un gen de resistencia a zeocina y el terminador SV40.
Los transformantes resultantes se secuenciaron para confirmar la secuencia de cDNA OSMRbeta de ratón.
\vskip1.000000\baselineskip
B. Construcción de líneas celulares BaF3/KZ134/zcytor17m, BaF3/KZ134/zcytor17m/OSMRbetam, BHK/KZ134/zcytor17m y BHK/KZ134/zcytor17m/OSMRbetam
Se transfectaron las líneas celulares estables BaF3/KZ134 y BHK/KZ134 (Ejemplo 20) con un plásmido de expresión que codifica zcytor17 de ratón de longitud total, pZP-7P/zcytor17m (Ejemplo 38A), para crear células BaF3/KZ134/zcytor17m y BHK/KZ134/zcytor17m, respectivamente. El plásmido de expresión de OSMRbeta de ratón, pZP-5Z/OSMRbetam (Ejemplo 38A), se transfectó luego a estas células para crear las líneas celulares BaF3/
KZ134/zcytor17m/OSMRbetam y BHK/KZ134/zcytor17m/OSMRbetam, respectivamente. Los métodos fueron los descritos en el Ejemplo 4, con la excepción de que Baf3/KZ134/zcytor17m y BHK/KZ134/zcytor17m se seleccionaron con, además de Geneticina, 2 ug/ml puromicina, mientras que Baf3/KZ134/zcytor17m/OSMRbetam y BHK/KZ134/
zcytor17m/OSMRbetam se seleccionaron con, además de Geneticina, 2 ug/ml puromicina y 200 ug/ml zeocina.
Los clones se diluyeron, se dispusieron en placas y se seleccionaron usando técnicas convencionales. Los clones se cribaron por el ensayo de luciferasa (véase Ejemplo 20) usando medio condicionado de zcytor17lig ratón o proteína zcytor17lig de ratón purificada (Ejemplo 35) como inductor. Se seleccionaron los clones con la respuesta de luciferasa más alta (vía luciferasa STAT) y el fondo más bajo. Se seleccionaron líneas celulares transfectantes estables.
\vskip1.000000\baselineskip
C. El zcytor171ig de ratón activa el receptor zcytor17 de ratón en el ensayo de luciferasa de BaF3/KZ134/zcytor17m/OSMRbetam o BHK/KZ134/zcytor17m/OSMRbetam
Las líneas celulares se colocaron en placas para los ensayos de luciferasa descritos en el Ejemplo 20 anterior. Se evaluó la activación STAT de las células BaF3/KZ134/Zcytor17m, BaF3/KZ134/zcytor17m/OSMRbetam, BHK/
KZ134/zcytor17m o BHK/KZ134/zcytor17m/OSMRbetam usando (1) medio condicionado de células BHK570 transfectadas con el zcytor17lig humano (Ejemplo 7), (2) medio condicionado de células BHK570 transfectadas con el zcytor17lig de ratón (Ejemplo 18), (3) zcytor17lig de ratón y humano purificado (Ejemplo 35), y (4) medio libre de mIL-3 para medir la respuesta control del medio únicamente. Los ensayos de luciferasa se realizaron como se describió en el Ejemplo 20.
Los resultados de este ensayo confirman la respuesta del indicador STAT de las células BaF3/KZ134/zcytor17m/
OSMRbetam y BHK/KZ134/zcytor17m/OSMRbetam al zcytor17lig de ratón, en comparación con las células BaF3/
KZ134/zcytor17m, las células BHK/KZ134/zcytor17m o las células no transfectadas BaF3/K2134 o control BHK/
KZ134, y demuestran que la respuesta es mediada por los receptores zcytorl7/OSMRbeta de ratón. Los resultados también muestran que el zcytor17lig humano no activa el ensayo del indicador STAT a través del complejo receptor de ratón.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 39 Unión de zcytor171ig humano a zcytor17 y zcytor17/OSMRbeta por citometría de flujo
La biotinilación de zcytor17L humano se realizó de la siguiente manera: se combinaron 100 \muL de zcytor17 a 5,2 6 mg/mL con 30 \muL de 10 mg/mL EZ-link Sulfo-NHS-LC-biotina (Pierce, Rockford, IL) disueltos en ddH_{2}O. Esta solución se incubó en un eje oscilante durante 30 minutos a temperatura ambiente. Tras la biotinilación, la solución se dializó en PBS usando un casete de diálisis Slide-A-Lyzer.
Para ensayar las propiedades de unión del zcytor17lig humano a diferentes combinaciones de receptores, ambas células BHK y BAF3 se transfectaron con plásmidos de expresión usando técnicas convencionales conocidas en el campo. Estos plásmidos se transfectaron a ambas líneas celulares en las siguientes combinaciones: zcytor17 solo, OSMRbeta solo, y zcytor17 y OSMRbeta. La transfección se realizó como se detalló anteriormente. Se usaron células BHK y BAF3 no transfectadas como controles. Las células se tiñeron por FACS de la siguiente manera: se tiñeron células 2E5 con: 2,0 \mug/mL, 100 ng/mL, 10 ng/mL, 1,0 ng/mL, 100 pg/mL, 10 pg/mL, 1,0 pg/mL de zcytor17L biotinilado o se dejaron sin teñir durante 30 minutos sobre hielo en tampón FACS (PBS + BSA al 2% + NHS al 2% (Gemini) + NGS al 2%). Las células se lavaron 1,5 veces y luego se tiñeron con SA-PE (Jackson Immuno Laboratories) a 1:250 durante 30 minutos sobre hielo. Las células se lavaron luego 1,5 veces con tampón FACS, se resuspendieron en tampón FACS y se analizaron por FACS en un BD FACSCaliber usando el software CellQuest (Becton Dickinson, Mountain View, CA).
Ambas células BHK y BAF3 demostraron que el zcytor17lig se unía tanto a zcytor17 solo como combinado con OSMRbeta, donde la unión al heterodímero zcytor17/OSMRbeta era levemente más fuerte. No se observó unión en ninguna de las líneas celulares que expresaban OSMRbeta solo. El zcytor17lig se unió en un modo dependiente de la concentración. Los valores de intensidad fluorescente media (MFI) para la unión de BHK se exponen en la Tabla 15.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 15
18 
\vskip1.000000\baselineskip
19 
\vskip1.000000\baselineskip
20 
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 40 Análisis de matriz de expresión génica de células tratadas con Zcytor17lig humano
Se aisló RNA de células A549 tratadas con zcytor17lig humano, células SK-LU-1 tratadas con zcytor17lig y células control no tratadas, usando el kit RNeasy Midi (Qiagen, Valencia, CA) según las instrucciones del fabricante.
El perfil de expresión génica de las células tratadas con zcytor17lig y de las células control respectivas se llevó a cabo usando matrices de expresión de cDNA de la serie GEArray Q (SuperArray Inc., Bethesda, MD). Las matrices de expresión de cDNA de la serie Q contienen hasta 96 fragmentos de cDNA asociados con una vía biológica específica, o genes con funciones o características estructurales similares. La comparación de matrices de células tratadas y células control permite una determinación del aumento y la disminución de genes específicos. El marcado, la hibridación y detección de sondas se llevó a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La detección de señal quimiluminiscente y los datos de adquisición se llevaron a cabo en una estación de trabajo Lumi-Imager (Roche, Indianapolis, IN). Los datos de imágenes resultantes se analizaron usando el software ImageQuant 5.2 (Amershara Biosciences, Inc., Piscataway, NJ) y GEArray Analyzer 1.2 (SuperArray Inc., Bethesda, MD).
El análisis de los resultados de las matrices de receptor e interleucina humana de la serie Q HS-014N demostró, después de la normalización, un incremento aproximado de 4,7 veces la señal de 2L13RA2 en las células SK-LU-1 humanas tratadas con zcytor17lig y un incremento aproximado de 2,2 veces en la señal de EL13RA2 en las células A549 humanas tratadas con 2cytor171ig.
Estos resultados indican que el zcytor17lig aumentó significativamente BU3RA2 en las células SK-LU-1 y A549. Ambas son líneas celulares consolidadas derivadas de carcinomas pulmonares humanos (Blobel et al., Virchows Arch B Cell Pathol Incl Mol Pathol., 1984; 45(4):407-29). Más específicamente, A549 se caracteriza como una línea celular epitelial de pulmón humano (Lin, et al., J Pharm Pharmacol, 2002 Sep; 54(9):1271-8; Martinez et al., Toxicol Sci., 2002 Oct; 69(2):409-23).
Se ha demostrado que la interleucina 13 (IL13), una citocina segregada por linfocitos T activados, es necesaria y suficiente para la expresión de asma alérgica y para uso en modelos experimentales de asma, que incluyen hipersensibilidad de las vías respiratorias, incorporación de eosinófilos y superproducción mucosa (Wills-Karp et al., Science, 1998; 282: 2258-2261). Se ha demostrado que la neutralización selectiva de IL13 alivia el fenotipo del asma (Grunig et al., Science, 1998; 282: 2261-2263). También se ha publicado que la IL13 está implicada en el incremento de la expresión del gen de mucina MUC8 en el epitelio de pólipos nasales humanos y en el epitelio nasal cultivado (Kimm et al., Acta Otolaryngol., 2002; Sep; 122(6): 638-643; Seong et al., Acta Otolaryngol., 2002; Jun; 122(4): 401-407). MUC8, una importante mucina glucoproteína de las vías respiratorias, desempeña una función en la patogenia de la hipersecreción mucosa en sinusitis crónica con pólipos (Seong et al., Acta Otolaryngol., 2002; Jun; 122(4): 401-407).
Funcionalmente, la IL-13 se señaliza a través de un complejo receptor que consiste en la cadena alfa-1 del receptor de interleucina 13 (ILI3RA1) y el receptor IL-4 alfa (IL4RA) (Daines y Hershey, J Biol Chem., 2002; 22(12): 10387-10393). También se ha demostrado que el receptor de interleucina 13 alfa-2 (IL13RA2) se une a IL-13 con gran afinidad, pero por sí mismo (Daines y Hershey, J Biol Chem., 2002; 22(12):10387-10393). Este receptor carece, no obstante, del dominio citoplásmico necesario para la señalización y, en consecuencia, se considera un receptor engañoso. Se ha demostrado que IL13RA2 es predominantemente una molécula intracelular que puede movilizarse rápidamente desde almacenamientos intracelulares y expresarse superficialmente después del tratamiento celular con interferón (IFN)-gamma. La expresión superficial de ILI3RA2 después del tratamiento con IFN-gamma no implica la síntesis de proteínas y produce señalización IL13 disminuida (Daines y Hershey, J Biol Chem., 2002; 22(12): 10387-10393).
Los resultados de los análisis de matrices de expresión génica para zcytor17lig indican que la acción de zcytor17lig es nueva para aquella de IFN-gamma en el sentido que el tratamiento con zcytor17lig de las líneas celulares derivadas del epitelio pulmonar produjeron un aumento significativo de la expresión del gen IL13RA2. Por lo tanto, el tratamiento de zcytor17lig puede ser beneficioso en casos en los que se desee un incremento a largo plazo de la expresión de IL13RA2 y una disminución de IL13, como en asma, hiperactividad de las vías respiratorias (AHR) y regulación de mucina, incluyendo sinusitis crónicas con pólipos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 41 Ratones transgénicos con zcytor17lig murino
Para evaluar los efectos in vivo de la sobrexpresión de zcytor17lig, se generaron múltiples fundadores de ratones transgénicos que expresan la forma murina del gen, impulsados por dos promotores diferentes: el promotor específico de linfocitos E\mu/lck, y el promotor ubicuo, EFl\alpha (Ejemplo 22). Los niveles de proteína en el suero oscilan entre aproximadamente 20-300 ng/ml. El promotor E\mu/lck generó ratones con niveles más altos de proteína en suero que aquellos de los ratones transgénicos de EFla-zcytor17lig.
\newpage
Los ratones transgénicos con zcytor17lig desarrollaron un fenotipo de piel alrededor de las 4-8 semanas de vida. La piel de los ratones transgénicos se tornó "encrespada", con piloerección evidente y alopecia leve a extensa, usualmente en el lomo, los laterales del torso y alrededor de los ojos. Este fenotipo se encontró coherentemente en ratones con niveles detectables de la proteína zcytor17lig en el suero. Entre los fundadores, se observó un índice de 100% incidencia entre ratones que expresaban el gen promovido por E\mu/lck, y 50% incidencia en ratones transgénicos EFl\alpha-zcytor17lig, lo que se correlacionó bien con los niveles relativos de zcytor17lig detectados en el suero. La piel transgénica pareció ser prurítica, según lo evidenciado por la conducta de rascado de los ratones, algunas veces lo suficientemente excesiva como para inducir excoriación y lesiones de la piel, que por lo general se infectaba (con por lo menos Staphylococcus aureus). Los ratones se identificaron originalmente con marcadores metálicos en la oreja, pero en la mayoría de los casos, los propios ratones se quitaron los marcadores de la oreja a la fuerza. Esto por lo general provocó daño extenso al oído externo. Estas orejas lastimadas no cicatrizaron correctamente, según lo reflejado en presencia de pústulas y costra de larga duración, y una herida penetrante, extensa, que se manifestó en muchos de los animales, detrás y entre las orejas. Algunos de los ratones transgénicos también presentaron heridas con escaras en los hombros y en el cuello. Las lesiones de la piel se observaron en un subconjunto de los animales y, en general, se desarrollaron en áreas de piel en las que ya se había manifestado alopecia, y a menudo se exacerbaron por la conducta de rascado de los animales.
Se usó análisis RT-PCR cuantitativo en tiempo real para detectar transcripciones de RNA de zcytor17lig en muestras de piel transgénicas (pero no en muestras no transgénicas), donde la piel transgénica con E\mu/lck expresó más RNA de zcytor17lig que la piel de ratones transgénicos con EFl\alpha-zcytor17lig. Los genes que codifican las subunidades receptoras de zcytor17, zcytor17 y OSM-Rbeta se expresaron en la piel de ratones no transgénicos y transgénicos con zcytor17lig.
Un examen de los tejidos linfoides de un subconjunto de los fundadores transgénicos de E\mu/lck por citometría de flujo reveló un incremento significativo en la proporción de células T activadas en el bazo y los ganglios linfáticos de estos ratones. Dos de los cuatro ratones analizados tenían ganglios linfáticos cervicales extensamente agrandados, posiblemente debido a la presencia de lesiones en el cuello. Se observó un aumento sutil en el peso del bazo y un aumento leve de los monocitos y neutrófilos circulantes en la sangre de los ratones transgénicos. No hubo ningún aumento en una diversidad de citocinas ensayadas, ni hubo cambios en los niveles de amiloide A en el suero circulante de estos ratones. Los efectos sobre las células inmunitarias en los ratones transgénicos pueden ser un resultado directo o indirecto del zcytor17lig, o son efectos secundarios de las lesiones en la piel.
Se realizó la histopatología de muchos tejidos distintos de la piel, incluyendo hígado, timo, bazo, riñón y testículos, y no se observaron anomalías significativas en estos órganos. El análisis de la piel transgénica, no obstante, reveló una serie de alteraciones, que variaban en gran medida dependiendo de la fuente y ubicación de la piel (p. ej., normal, sin pelo o con lesiones). En muchos casos, las orejas de los ratones transgénicos presentaban epidermis engrosada en comparación con los controles no transgénicos (p. ej., aproximadamente 4 capas frente a 2 capas), y los tejidos subyacentes contenían cantidades bajas a moderadas de células inflamatorias, que eran principalmente mononucleares con neutrófilos ocasionales. La epidermis del abdomen pareció levemente engrosada multifocalmente en los ratones transgénicos, pero no hubo un incremento obvio de células inflamatorias en el subcutis o la dermis subyacente. En las porciones sin pelo de la piel de estos ratones, se observaron folículos de pelo dilatados que contenían algunos sedimentos pero sin el tallo del pelo (p. ej., pelos desprendidos de las raíces). En las áreas lesionadas, hubo un engrosamiento extenso de la epidermis (acantosis), aumento de queratina en la superficie de la piel (hiperqueratosis), úlceras diseminadas de distintos tamaños y cantidades significativas de células inflamatorias en la dermis (principalmente neutrófilos, con cantidades variables de macrófagos y linfocitos). La dermis también contenía numerosos mastocitos que rodeaban las lesiones. Algunos de los tallos de pelo en las áreas lesionadas de la piel transgénica estaban en la etapa activa (anágeno), en contraste con muchos de los tallos de pelo en áreas "normales" que estaban en la etapa de involución (catágeno) a inactiva (telógeno).
El fenotipo de los ratones transgénicos con zcytor17lig se asemeja en alto grado a aquel de pacientes con dermatitis atópica (AD), y de modelos de ratones de AD. La AD es una enfermedad inflamatoria crónica común que se caracteriza por citocinas hiperactivadas del subconjunto de linfocitos T cooperadores 2 (Th2). Zcytor17lig es expresado preferencialmente por células Th2 versus Th1, lo que sustenta incluso más esta comparación. Si bien se desconoce la etiología exacta de la AD, se han implicado múltiples factores, incluyendo respuestas inmunitarias de Th2 hiperactiva, autoinmunidad, infecciones, alergenos y predisposición genética. Las características clave de la enfermedad incluyen xerosis (sequedad de la piel), prurito (comezón de la piel), conjuntivitis, lesiones inflamatorias de la piel, infección por Staphylococcus aureus, eosinofilia sanguínea elevada, elevación de IgE e IgGI en suero, y dermatitis crónica con infiltración de células T, mastocitos, macrófagos y eosinófilos. Se ha reconocido que la colonización o infección con S. aureus exacerba la AD y perpetúa la cronicidad de esta enfermedad de la piel.
La AD por lo general se observa en pacientes con asma y rinitis alérgica, y es frecuentemente la manifestación inicial de enfermedad alérgica. Aproximadamente 20% de la población de países occidentales sufre de estas enfermedades alérgicas, y la incidencia de la AD en países desarrollados está ascendiendo por razones desconocidas. La AD típicamente comienza en la infancia y con frecuencia puede persistir en la adolescencia y la adultez. Los tratamientos actuales contra la AD incluyen corticosteroides tópicos, ciclosporina A oral, inmunosupresores sin corticosteroides tales como tacrolimus (FK506 en forma de ungüento) e interferón-gamma. A pesar de la diversidad de tratamientos para la AD, los síntomas de muchos pacientes no mejora, o tienen reacciones adversas a los medicamentos, lo que requiere la búsqueda de otros agentes terapéuticos más eficaces.
Las células epiteliales, que expresan el receptor heterodimérico para zcytor17lig (zcytoR17 y OSM-Rbeta), están ubicadas en los sitios (p. ej., piel, intestino, pulmón, etc.) de entrada de alergenos al organismo e interactúan junto con las células dendríticas (células que presentan antígenos profesionales) in situ. Las células dendríticas cumplen una función importante en la patogenia de las enfermedades alérgicas, y el zcytor17lig puede interactuar con su receptor en las células epiteliales de piel y pulmón e influenciar las respuestas inmunitarias de estos órganos. El Zcytor171ig y su receptor o receptores pueden, por lo tanto, contribuir a la patogenia de enfermedades alérgicas tales como la AD y el asma. Asimismo, el fenotipo de ratones transgénicos con zcytor17lig indica que este ligando puede desempeñar una función en la cicatrización de heridas, ya que los ratones parecen incapaces de reparar el daño de las orejas, y a menudo presentan lesiones a largo plazo en el lomo y los laterales. Un antagonista de zcytor17lig podría, en consecuencia, representar un agente terapéutico viable para éstas y otras indicaciones.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 42 Ensayo de luciferasa en líneas celulares epiteliales transformadas humanas vía infección transitoria con un gen indicador STAT/SRE adenovírico
Se sembró una gran variedad de líneas celulares epiteliales transformadas humanas (véase Tabla 16 a continuación) en placas de 96 pocillos con fondo plano a 10.000 célula/pocillo en medio de desarrollo regular, según lo especificado para cada tipo de célula. Al día siguiente, las células se infectaron con un constructo indicador de adenovirus, KZ136, a una multiplicidad de infección de 5000. El indicador KZ136 contiene los elementos STAT, además de un elemento de respuesta sérico. El volumen total fue 100 ul/pocillo, usando DMEM enriquecido con L-glutamina 2 mM (GibcoBRL), piruvato de sodio 1 mM (GibcoBRL) y 1x complemento de Insulina-Transferrina-Selenio (GibcoBRL) (en lo sucesivo denominado medio libre de suero). Las células se cultivaron durante toda la noche.
Al día siguiente, el medio se eliminó y se reemplazó con 100 \mul de medio de inducción. El medio de inducción fue zcytor17lig humano diluido en medio libre de suero a 100 ng/ml, 50 ng/ml, 25 ng/ml, 12,5 ng/ml, 6,25 ng/ml, 3,125 ng/ml y 1,56 ng/ml. Se usó un control positivo de FBS al 20% para validar el ensayo y asegurar que la infección por adenovirus fuese exitosa. Las células se indujeron durante 5 horas, tras las cuales se aspiró el medio. Las células s lavaron luego en 50 \mul/pocillo de PBS, y posteriormente se lisaron en 30 \mul/pocillo de 1X tampón de lisis celular (Promega). Después de una incubación de 10 minutos a temperatura ambiente, 25 \mul/pocillo del lisado se transfirieron a placas de 96 pocillos de color blanco opaco. Las placas se leyeron luego en el luminómetro, usando una integración de 5 segundos con 40 \mul/pocillo inyección de sustrato de luciferasa (Promega).
Los resultados revelaron la capacidad de múltiples líneas celulares epiteliales de responder a zcytor17lig, como se muestra en la Tabla 16 a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página siguiente)
21
22
Ejemplo 43 Producción de citocinas por líneas celulares epiteliales humanas cultivadas con zcytor17lig humano
Se cribaron líneas celulares epiteliales de enfermedades humanas (A549, carcinoma epitelial pulmonar humano; SkLu1, adenocarcinoma epitelial pulmonar humano; DU145, carcinoma epitelial de próstata humano; PZ-HPV-7, epitelio de próstata humano transformado por HPV; U20S, osteosarcoma epitelial óseo humano) para producción de citocinas en respuesta a zcytor17lig in vitro. Estas líneas celulares tienen tanto zcytor17 como OSMR-beta, identificados por RT-PCR, y responden al zcytor17lig humano cuando se ensayan con el constructo indicador de luciferasa de adenovirus, KZ136 (Ejemplo 42). La producción de citocinas de estas líneas celulares se determinó en respuesta a zcytor17lig humano en una serie de tres experimentos.
\vskip1.000000\baselineskip
A. Producción de citocinas por líneas celulares epiteliales de enfermedades humanas cultivadas con zcytor17lig humano
Se dispusieron células a una densidad de 4,5 x 10^{5} células por pocillo en una placa de 6 pocillos (Costar) y se cultivaron en medio de crecimiento respectivo. Las células se cultivaron con reactivos de ensayo; 100 ng/mL zcytor17lig, 10 ng/mL Interferón gamma (IFN gamma) (R&D Systems, Minneapolis, MN), 10 ng/mL Factor de Necrosis Tumoral alfa (TNF alfa) (R&D Systems, Minneapolis, MN), 10 ng/mL IL-1beta (R&D Systems, Minneapolis, MN) o 100 ug/mL Lipopolisacárido (LPS) (Sigma). Se cosecharon los sobrenadantes a 24 y 48 horas y se ensayaron para citocinas; GM-CSF (Factor Estimulante de Colonias de Granulocitos-Macrófagos), IL-1b, IL-6, IL-8, MCP-1 (Proteína 1 Quimioatrayaente de Macrófagos) y TNFa. Se usaron los kits Multiplex Antibody Bead de BioSource International (Camarillo, CA) para medir las citocinas en las muestras. Los ensayos se leyeron en un instrumento Luminex-100 (Luminex, Austin, TX) y los datos se analizaron usando el software MasterPlex (MiraiBio, Alameda, CA). La producción de citocinas (pg/mL) para cada línea celular en las muestras de 24 horas se muestra en la Tabla 17 a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 17
23
24
Todas las líneas celulares ensayadas produjeron GM-CSF e IL-8 en respuesta a la estimulación con las citocinas control IL-1b y TNFa. La mayoría de las líneas celulares produjo IL-6 y MCP-1 en respuesta a la estimulación con IL-1b y TNFa. Zcytor17lig estimuló la producción de IL-6 en la línea celular DU145, en comparación con el control (193 pg/mL versus 71 pg/mL). Zcytor17lig estimuló 3 de 5 líneas celulares para producir IL-8 con el mayor efecto observado en las células A549 (quíntuple), y menor producción de IL-5 en células U2OS por 2 veces. Hubo un leve efecto sobre la producción de MCP-1 por parte de las células DU145 y U2OS cuando se cultivaron con zcytor17lig.
\vskip1.000000\baselineskip
B. Producción de citocinas por líneas celulares epiteliales normales cultivadas con zcytor17lig humano
Además de líneas celulares epiteliales humanas, se ensayaron células epiteliales humanas normales (NHBE, Clonetics). Las células se dispusieron a una densidad de 1 x 10^{5} células por pocillo en una placa de 24 pocillos, y se cultivaron con reactivos de ensayo; 1000 ng/mL, 100 ng/mL y 10 ng/mL zcytorl71ig (A760F), 10 ng/mL TNFa, 10 ng/mL OSM, 10 ng/mL IFNa, 10 ng/mL TGFb o 10 ng/mL Linfotactina. Se cosecharon los sobrenadantes a 24 y 48 horas, y se ensayaron para citocinas; IL-6, IL-8, MCP-1, MlP-1a, RANTES y Eotaxina. Las citocinas se ensayaron como se describió previamente. La producción de citocinas (pg/mL) para cada línea celular en las muestras de 48 horas se muestra a continuación en la Tabla 18.
TABLA 18
25
26 
\vskip1.000000\baselineskip
Las células DU145 produjeron IL-6 en respuesta a zcytor17lig, repitiendo los resultados previos del Ejemplo 43A. No obstante, solamente A549 y U2OS tuvieron respuestas de IL-8 similares a las observadas en el Ejemplo 43A. Las células SkLu1 y U2OS produjeron ambas MCP-1 en respuesta a zcytor17lig. La producción de citocinas por células NHBE fue marginal comparada con los controles.
\vskip1.000000\baselineskip
C. Producción de citocinas por líneas celulares epiteliales de enfermedades humanas co-cultivadas con zcytor17lig humano y IFN gamma
Las células se dispusieron a una densidad de 2 x 10^{5} células por pocillo en una placa de 24 pocillos y se co-cultivaron con 10 ng/mL IFN gamma +/- zcytor17lig a 100 ng/mL, 10 ng/mL o 1 ng/mL. Los sobrenadantes se recogieron a 24 y 48 horas y se ensayaron para IL-8 y MCP-1, como se describió anteriormente. La producción de citocinas (pg/mL) para cada línea celular en las muestras de 24 horas se muestra en la Tabla 19 a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 19 
\vskip1.000000\baselineskip
27 
\vskip1.000000\baselineskip
Las células A549 produjeron IL-8 en respuesta a zcytor17lig, no obstante, no hubo efecto de las células co-cultivadas con la adición de IFN gamma. Las células U2OS produjeron 20 veces más MCP-1 cuando se cultivaron con IFNg y 50 veces más MCP-1 cuando se cultivaron con IFK gamma + zcytor17lig.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 44 Efectos de Zcytor17lig sobre la incorporación de ^{3}H-TdR a células DU145 de carcinoma epitelial de próstata
Se sembraron células en grupos de tejido de 96 pocillos (Falcon) a una densidad de 25.000/pocillo en medio de desarrollo MEM (Life Technologies) enriquecido con glutamina, piruvato, aminoácidos no esenciales (Life Technologies) y suero bovino fetal al 10% (Hyclone). A confluencia (24 horas después), las células se transfirieron a un medio de detención del desarrollo, sustituyendo suero por BSA al 0,1% (Life Technologies). Después de 48 horas para lograr la sincronización celular, el medio se reemplazó con medio nuevo. Luego, se añadió zcytor17lig recombinante humano (reactivo de ensayo) a distintas concentraciones (entre 0,24 y 60 ng/mL) (véase Tabla 16 a continuación), para ensayar el efecto de la proteína sobre la replicación de DNA basal. Algunos pocillos recibieron FBS al 2,5% (Hyclone) además de zcytor17lig, con el fin de ensayar el efecto de la proteína en niveles elevados de incorporación de TdR. Se usaron FBS al 10% y 20 ng/ml Factor de Crecimiento Derivado de Plaquetas-BB (PDGF-BB) (R&D) como control
positivo.
\newpage
Dieciocho horas después de la adición de zcytor17lig y el resto de los reactivos de ensayo, las células se pulsaron con 250 nCi/mL [^{3}H]-timidina (NEN) durante 4 horas. Después del pulso de 4 horas, se desechó el medio y se añadieron 100 \muL de solución de tripsina (Life Technologies) a cada pocillo para desalojar las células. La radiactividad incorporada por DU145 se determinó cosechando las células con un cosechador de células Packard Filtermate 196 y contando la etiqueta incorporada, usando un contador de centelleos para microplacas Packard TopCount NXT.
Como se puede observar en la Tabla 20 a continuación, zcytor17lig indujo la incorporación de timidina en células quiescentes (en BSA al 0,1%) en un modo dependiente de la concentración. Este efecto alcanzó 2,5 veces el control BSA a la concentración más alta utilizada, 60 ng/mL. Además, este efecto de zcytor17lig también fue detectable cuando la incorporación inicial se elevó por adición de FBS al 2,5% (en esta serie como mitógeno tan potente como FBS al 10%). Estos resultados, por ende, indican que bajo condiciones basales y estimuladas, el zcytor17lig puede actuar como factor mitogénico para las células de carcinoma DU145.
La Tabla 16 muestra los efectos de zcytor17lig en la incorporación de timidina por células DU145. Los resultados se expresan en cpm/pocillo, y los números son la desviación estándar de la media de pocillos triplicados.
TABLA 20
28
Ejemplo 45 Expresión de huzcytor17lig en E. coli A. Construcción del vector de expresión pRFS01 que expresa el polipéptido de fusión huzcytor17Lig/MBP-6H
Se construyó un plásmido de expresión que contenía un polinucleótido que codifica un huzcytor17lig condensado C-terminalmente a la Proteína de Unión a Maltosa (MBP), vía recombinación homóloga. El polipéptido de fusión contiene una porción MBP de aproximadamente 388 aminoácidos N-terminal condensada al huzcytor17Lig descrito en la presente memoria. Se aisló un fragmento de cDNA de huzcytor17lig usando el método PCR como se describe en esta memoria. Se usaron dos cebadores en la producción del fragmento zcytor17lig en una reacción PCR convencional: (1) uno contenía 40 bp de la secuencia flanqueadora del vector y 20 bp correspondientes al término amino del huzcytor17lig, y (2) el otro contenía 40 bp del extremo 3' correspondientes a la secuencia flanqueadora del vector y 20 bp correspondientes al término carboxilo del huzcytor17lig. Se pasaron 2 microlitros de la reacción PCR de 100 \mul por un gel de agarosa al 1,0% con 1 x tampón TBE para análisis, y se observó el fragmento de peso molecular esperado. La reacción PCR restante se combinó con el segundo tubo de PCR y precipitó con 400 \mul de etanol absoluto. El DNA precipitado se usó para recombinación en el vector receptor cortado SmaI pTAP98 para producir el constructo que codifica la fusión MBP-huzcytor17lig, como se describe a continuación.
El vector pTAP98 se construyó usando recombinación homóloga de levadura. Se recombinaron 100 nanogramos de pMAL-c2 cortado con EcoR1, con 1 \mug pRS316 cortado con Pvu1, 1 \mug enlazador, y se combinó 1 ug pRS316 cortado con ScaI/EcoR1 en una reacción PCR. Los productos PCR se concentraron vía precipitación de etanol al 100%. La cepa de células de levadura competentes (S. cerevisiae), SF838-9D\alpha, se combinó con 10 \mul de una mezcla que contenía aproximadamente 1 \mug del producto PCR de huzcytor17lig (anterior) y 100 ng de vector pTAP98 digerido con SmaI, y se electroporó a 0,75 kV, 25 \muF y ºo ohms. La mezcla de reacción resultante se dispuso en placas URA-D y se incubó a 30ºC.
Después de 48 horas, se seleccionaron los transformantes de levadura Ura+ de una de las placas. Se aisló DNA y se transformó en células de E. coli electrocompetentes (p. ej., MC1061, Casadaban et al. J. Mol Biol. 138, 179-207). Las células de E. coli resultantes se dispusieron en placas MM/CA +AMP, 100 mg/L placas (Pryor y Leiting, Protein Expression and Purification 10: 309-319, 1997) usando procedimientos convencionales. Se cosecharon cuatro clones individuales de las placas y se inocularon en MM/CA con 100 \mug/ml Ampicilina durante dos horas a 37ºC. Se indujo un mililitro de cada cultivo con TPTG 1 mM. Aproximadamente 2-4 horas después, se mezclaron 250 \mul de cada cultivo inducido con 250 \mul esferas de vidrio lavadas con ácido y 250 \mul tampón Thorner con 5% \betaME y tinte (8M urea, Tris 100 mM pH7,0, glicerol al 10%, EDTA 2 mM, SDS al 5%). Las muestras se agitaron en vórtex durante un minuto y se calentaron hasta 65ºC durante 10 minutos. Se cargaron 20 microlitros de cada muestra por senda en un gel PAGE 4%-12% PAGE (NOVEX). Los geles se pasaron por tampón IXMES. Los clones positivos se designaron pRPSOl y se sometieron a análisis de secuencias.
Se usó un microlitro de DNA de secuenciación para transformar la cepa de células de E. coli electrocompetentes MC1061. Las células se electropulsaron a 2,0 kV, 25 uF y 400 ohms. Después de la electroporación, las células se rescataron en 0,6 ml SOC y se desarrollaron en placas LB+Amp a 37ºC durante una noche, con 100 mg/L Ampicilina. Se indujeron cuatro cultivos con ITPG y se cribaron para positivos como se describió anteriormente. Los clones positivos se expandieron para purificación de proteína de la proteína de fusión huzcytor17lig/MBP-6H, usando técnicas convencionales.
\vskip1.000000\baselineskip
B. Purificación de huzcytor17Lig/MBF-6H por fermentación de E. coli
A menos que se indique otra cosa, todas las operaciones se llevaron a cabo a 4ºC. El siguiente procedimiento se usó para purificar el polipéptido huzcytorl7Lig/MBP-6H recombinante. Se construyeron células de E. coli que contenían el constructo pRPSO 1 y que expresaban huzcytor17Lig/MBP-6H, usando métodos de biología molecular convencionales, y se cultivaron en 50,0 g/L SuperBroth II (12 g/L Casien, 24 g/L extracto de levadura, 11,4 g/L fosfato de di-potasio, 1,7 g/L fosfato de mono-potasio; Becton Dickenson, Cockeysville, MD), 5 g/L glicerol y 5 mL/L sulfato de magnesio 1M. Se cosecharon 20 gramos de células y se congelaron para purificación de proteínas.
Las células descongeladas se resuspendieron en 500 mL tampón de equilibro Amylose (Tris 20 mM, NaCl 100 mM, pH 8,0). Se usó un sistema de ruptura de células de prensa francesa (Constant Systems Ltd., Warwick, Reino Unido) con una temperatura regulada a -7ºC hasta -10ºC y 30K PSI para lisar las células. Las células resuspendidas se ensayaron para ruptura por lecturas A_{600} antes y después de los ciclos en la prensa francesa. La suspensión celular procesada se sedimentó a 10.000G durante 30 minutos para eliminar los residuos celulares, y el sobrenadante se cosechó para purificación de proteínas.
Se vertieron 25 ml de columna de resina Amylose (New England Biolabs, Beverly, MA) (preparada como se describe a continuación) a una columna de vidrio Bio-Rad, 2,5 cm D x 10 cm H. La columna se rellenó y equilibró por gravedad con 10 volúmenes de columna (CV) de tampón de equilibrio Amylose. El sobrenadante celular procesado se cargó en lotes a la resina Amylose durante una noche con oscilación. La resina se retornó a la columna Bio-Rad y se lavó con 10 CV de tampón de equilibrio Amylose por gravedad. La columna se eluyó con -2 CV de tampón de elución Amylose (tampón de equilibrio Amylose + maltosa 10 mM, Fluka Biochemical, Suiza) por gravedad. Se recogieron diez fracciones de 5 mL durante el perfil de elución y se ensayaron para Absorbancia a 280 y 320 nM. La resina Amylose se regeneró con 1 CV de H_{2}O destilada, 5 CV de SDS al 0,1% (p/v)), 5 CV de H_{2}O destilada, 5 CV de tampón de equilibrio Amylose y finalmente 1 CV de tampón de almacenamiento Amylose (tampón de equilibrio Amylose + azida de sodio al 0,02%). La columna regenerada se conservó a 4ºC.
Las fracciones del perfil de elución de interés se combinaron y dializaron en una cámara de diálisis de 10K (Slide-A-Lyzer, Pierce Immunochemicals) contra 4 x 4L PBS pH 7,4 (Sigma) durante un periodo de tiempo de 8 horas para eliminar los contaminantes de bajo peso molecular, intercambio de tampones y desalación. Después de la diálisis, el material cosechado representó el polipéptido huzcytor17Lig/MBP-6H purificado. El polipéptido huzcytor17Lig/MBP-6H purificado se esterilizó en filtro y se analizó por tinción Coomassie de SDS-PAGE para un producto de peso molecular adecuado. La concentración del polipéptido huzcytor17Lig/MBP-6H se determinó por análisis BCA en 1,28 mg/mL.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 46 Anticuerpo policlonal de zcytor17lig humano A. Preparación y purificación
Los anticuerpos policlonales se prepararon inmunizando 2 conejos blancos hembra de Nueva Zelanda con la proteína recombinante purificada hzcytorl7L/MBP-6H (Ejemplo 45). Los conejos recibieron cada uno una inyección intraperitoneal (IP) inicial de 200 \mug de proteína purificada en Adyuvante de Freund Completo seguida por inyecciones IP de refuerzo de 100 \mug de proteína en Adyuvante de Freund Incompleto cada tres semanas. Siete a diez días después de la administración de la segunda inyección de refuerzo (3 inyecciones totales), se extrajo sangre de los animales y se recogió el suero. Los animales luego recibieron refuerzos y se les extrajo sangre cada tres semanas.
El suero de conejo específico de hzcytor17L/MBP-6H se pre-adsorbió de anticuerpos anti-MBP usando una columna de proteína CNBr-SEPHAROSE 4B (Pharmacia LKB), que se preparó utilizando 10 mg de proteína de fusión MBP recombinante purificada no específica por gramo de CNBr-SEPHAROSE. Los anticuerpos policlonales específicos de hzcytor17L/MBP-6H-se purificaron por afinidad a partir de suero de conejo pre-adsorbido usando una columna de proteína CNBr-SEPHAROSE 4B (Pharmacia LKB), que se preparó utilizando 10 mg de la proteína recombinante purificada de antígenos específica hzcytor17L/MBP-6H. Tras la purificación, los anticuerpos policlonales se dializaron con 4 cambios de 20 veces el volumen de PBS del anticuerpo durante un periodo de tiempo de por lo menos 8 horas. Los anticuerpos específicos de Hzcytor17-Ligando se caracterizaron por ELISA, usando 500 ng/ml de las proteínas recombinantes purificadas hzcytor17L/MBP-6H o hzcytor17L-CEE producidas en un sistema de expresión de baculovirus como dianas de anticuerpo. El límite inferior de detección (LLD) del anticuerpo de afinidad anti-hzcytor17L/MBP-6H de conejo fue 100 pg/ml en su antígeno recombinante purificado hzcytor17L/MBP-6H y 500 pg/ml en hzcytor17L-CEE recombinante purificado producido en un sistema de expresión de baculovirus.
\vskip1.000000\baselineskip
B. Análisis SDS-PAGE y transferencia Western del anticuerpo ZcytoR17lig MBF-6H antihumano de conejo
Se ensayó anticuerpo ZcytoR17lig MBP-6H antihumano de conejo por análisis SDS-PAGE (NuPage 4-12%, Invitrogen, Carlsbad, CA) con el método de tinción coomassie y transferencia Western, usando IgG-HRP anticonejo de cabra. Se sometió la proteína purificada zcytor17lig humana y de ratón (200-25 ng) a electroforesis, usando una minicelda Invitrogen Novex's Xcell II, y se transfirió a nitrocelulosa (0,2 mm; Invitrogen, Carlsbad, CA) a temperatura ambiente, usando un módulo de transferencia Novex's Xcell agitando de acuerdo con las instrucciones provistas en el manual del instrumento. La transferencia se realizó a 300 mA durante una hora en un tampón que contenía base Tris 25 mM, glicina 200 mM y metanol al 20%. El filtro se bloqueó luego con tampón Western A (preparado internamente, Tris 50 mM, pH 7,4, EDTA 5 mM, pH 8,0, Igepal CA-630 al 0,05%, NaCl 150 mM y gelatina al 0,25%) durante una noche con oscilación moderada a 4ºC. La nitrocelulosa se enjuagó rápidamente, luego el zcytoR17lig MBP-6H antihumano de conejo (1:1000) se añadió al tampón Western A. La transferencia se incubó durante 1,5 horas a temperatura ambiente con oscilación moderada. La transferencia se enjuagó 3 veces durante 5 minutos cada vez en Western A, luego se añadió anticuerpo IgG HRP anticonejo de cabra (1:5000) en un tampón Western A. La transferencia se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente con oscilación moderada. La transferencia se enjuagó 3 veces durante 5 minutos cada vez en Western A, luego se enjuagó rápidamente en H_{2}O. La transferencia se reveló usando reactivos de sustrato quimiluminiscentes disponibles en el mercado (reactivos de transferencia Western ECL 1 y 2 mezclados con reactivos 1:1; obtenidos de Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, Inglaterra) y la transferencia se expuso a película de rayos x durante un máximo de 5 minutos.
El zcytor17lig humano purificado pareció ser una banda tan grande como de aproximadamente 30 kDa y una banda más pequeña de aproximadamente 20 kDa bajo condiciones reducidas. El zcytor17lig de ratón no fue detectado por el anticuerpo zcytor17lig antihumano de conejo.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 47 Efectos de Zcytor17lig sobre la adhesión de monocitos U937 a una monocapa de células endoteliales de médula ósea transformadas (TRBMEC)
Se sembraron células endoteliales de médula ósea transformadas (TRBMEC) en grupos de tejido de 96 pocillos (Falcon) a una densidad de 25.000/pocillo en medio M131 (Cascade Biologies) enriquecido con Complemento de Desarrollo Microvascular (MVGS) (Cascade Biologies). A confluencia (24 horas después), las células se transfirieron a M199 (Gibco-Life Technologies) enriquecido con suero bovino fetal al 1% (Hyclone). Se añadió zcytor17lig recombinante humano (reactivo de ensayo) a diversas concentraciones (entre 0,4 y 10 ng/mL) (véase Tabla 21 a continuación), para ensayar el efecto de la proteína sobre las interacciones de células endoteliales-células inmunitarias que resultaban en adhesión. Algunos pocillos recibieron 0,3 ng/ml Factor de Necrosis Tumoral (TNFalfa R&D Systems), una conocida citocina antinflamatoria, además de zcytor17lig, para ensayar un efecto de la proteína sobre las células endoteliales bajo condiciones inflamatorias. Se usó TNFalfa a 0,3 ng/ml solo como control positivo y la concentración usada representa aproximadamente 70% del efecto de TNFalfa máximo en este sistema, es decir, no induce adherencia máxima de células U937 (una línea celular de tipo monocito humano) al endotelio. Por esta razón, esta estructura puede detectar tanto el aumento como la disminución de los efectos del TNFalfa. Los niveles basales de adhesión, tanto con como sin TNFalfa, se usaron como línea basal para evaluar el efecto de los reactivos de ensayo.
Después de incubar durante una noche las células endoteliales con los reactivos de ensayo (ligando zcytor17 \pm TNFalfa), las células U937, teñidas con 5 \muM marcador fluorescente Calcein-AM (Molecular Probes), se suspendieron en RPMI 1640 (sin rojo fenol) enriquecido con FBS al 1% y se dispusieron en placas a 100.000 células/pocillo en una monocapa TRBMEC enjuagada. Los niveles de fluorescencia en longitudes de onda de excitación/emisión de 485/538 nm (lectora de microplacas Molecular Devices, aplicación CytoFluor) se midieron 30 minutos más tarde, antes y después de enjuagar el pocillo tres veces con RPMI 1640 tibio (sin rojo fenol), para eliminar U937 no adherentes. Se usaron niveles de fluorescencia pre-enjuague (total) y pos-enjuague (específicos de adherencia) para determinar el porcentaje de adherencia (adherencia neta/total neto x 100 = % adherencia).
\newpage
Como se puede observar en la Tabla 21 a continuación, zcytor17lig, cuando se añadió solo, afectó la adherencia basal de las células U937 a las monocapas endoteliales en el intervalo de concentración utilizado (un incremento de menos de 2 veces, p<0,01 por prueba ANOVA). Por sí mismo, el control positivo, 0,3 ng/mL TNFalfa, aumento la adherencia de células U937 desde 5,8% basal a 35% (6 veces). En presencia de TNFalfa, el zcytor17lig se sinergizó con el TNFalfa y potenció más la adhesión de las células U937 en un modo dependiente de la concentración entre 0,4 y 10 ng/mL (p<0,01 por prueba ANOVA). A 10 ng/mL, el zcytor17lig potenció el efecto del TNFalfa por 62%. Estos resultados indican que el zcytor17lig puede ser, por sí mismo, un agente proinflamatorio. El Zcytor17lig fue capaz de sinergizarse con concentraciones sub-máximas de TNFalfa para aumentar la adherencia de monocitos a las células endoteliales. Estos resultados también muestran que las células endoteliales, especialmente cuando se exponen a citocinas proinflamatorias como el TNFalfa, son un probable tejido diana de acción de zcytor17lig. La consecuencia del ligando zcytor17 en las células endoteliales puede ser la elevación de la adhesión de monocitos o macrófagos a un sitio de actividad proinflamatoria. Los monocitos y macrófagos activados son importantes en muchas enfermedades inflamatorias. Por lo tanto, la inhibición de adhesiones de monocitos/macrófagos puede proporcionar un fundamento terapéutico para antagonistas del ligando zcytor17. Estos datos respaldarían el uso de antagonistas del ligando zcytor17 para el tratamiento de enfermedades pulmonares, enfermedades vasculares, autoinmunidad, metástasis tumorales, enfermedades que implican reacciones alérgicas, cicatrización de heridas y enfermedades de la piel que incluyen contacto, dermatitis alérgica o no alérgica y psoriasis, y enfermedad inflamatoria de los intestinos. La Tabla 21 muestra los efectos de zcytor17lig sobre la adhesión de monocitos U937 a monocapas endoteliales TRBMEC. Los resultados se expresan en porcentaje de adhesión y los números son la desviación estándar de la media de pocillos triplicados.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 21
29 
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> ZymoGenetics, Inc.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> NUEVO LIGANDO DE CITOQUINA ZCYTOR17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 02-01PC
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> EP 03729693.6
\vskip0.400000\baselineskip
<141> 21-01-2003
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/350.325
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 18-01-2002
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/3753323
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 25-04-2002
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/4350315
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 19-12-2002
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 168
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para Windows Versión 3.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 904
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (28)...(519)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
30
31 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 164
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
32 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 492
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Polinucleótido degenerado de SEQ ID NO:2 de zcytor17lig humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(492)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
33 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2903
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (497)...(2482)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
34
35
36
37 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 662
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
38
39 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2964
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (13)...(2949)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
40
41
42
43
44 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 979
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
45
46
47 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2657
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (133)...(2040)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
48
49
50
51 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 636
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
52
53 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 755
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(489)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
54 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 163
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
55 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 489
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Polinucleótido degenerado de SEQ ID NO:11 de zcytor17lig de ratón
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(489)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
56 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótido ZC6673
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcgcaaggtg ccgttcacag c 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótido ZC29082
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
caatttgttg ggttttttta gcagcagtag gcccag 
\hfill
36 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótido ZC29083
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctgggcctac tgctgctaaa aaaacccaac aaattg 
\hfill
36 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótido ZC29145
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcgtctagag ggttatattg aagttgggca gaga 
\hfill
36 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Etiqueta peptídica Glu-Glu (CEE) modificada con Gly-Ser
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
57 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótido ZC29359
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcgggatcca tgaagctctc tccccagcct tca 
\hfill
33 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótido ZC27899
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccagaacttt gactccttga ccg 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótido ZC27895
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gaagtcaact tcgctaagaa ccg 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótido ZC29122
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccgctcgagt tatattgaag ttgggcagga agac 
\hfill
34 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótido ZC29180
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cctggagtcc ctgaaacgaa ag 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótido ZC29122
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccgctcgagt tatattgaag ttgggcagga agac 
\hfill
34 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótido ZC9791
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgttccaaca aaacccagac 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótido ZC9793
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tggcgttgac agcggacac 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótido ZC40109
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccattccagc accagccaac 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótido ZC40112
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tacaacttca atagcatctg gg 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótido ZC13496
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccctgcagtg atcaacatgg ccaagttgac cagtgccgtt 
\hfill
40 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótido ZC13945
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcccatggac tagtttcgaa aggtcgagtg tcagtcctgc tcctc 
\hfill
45 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótido ZC18698
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tttttttctc gagacttttt tttttttttt tttt 
\hfill
34 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia omitida
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
000 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Etiqueta peptídica Glu-Glu (CEE) con par de residuos Gly-Ser
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
58 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótido ZC29451
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccggaattcc cctgatacat gaagctctct ccc 
\hfill
33 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótido ZC29124
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgcggatccc tcaaagacac tgaatgacaa tgt 
\hfill
33 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Etiqueta peptídica Glu-Glu (CEE) sin el par de residuos Gly-Ser
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\hskip1cm
59 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia peptídica C-terminal FLAG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
60 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 684
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
61 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2295
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Polinucleótido de fusión zcytor17-Fc4 humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(2295)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
62
63
64
65 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 764
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Polinucleótido de fusion zcytor17-Fc4 humano
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
66
67 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótido ZC29157
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctagtatggc cggccatgaa gctctctccc cagc 
\hfill
34 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótido ZC29150
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtctgaagat ctgggctcct caaagacactgaatgacaat g 
\hfill
41 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótido ZC41458
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tggacctcgc actaaaatca t 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótido ZC41457
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aatcacggca gagttcccac ac 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 100
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótido ZC12749
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\hskip1cm
68 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 100
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótido ZC12748
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\hskip1cm
69 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótido ZC10651
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agcttttctg cagcagctct 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótido ZC10565
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tttgcagaaa aggttgcaaa tgc 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótido ZC14063
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
caccagacat aatagctgac agact 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótido ZC17574
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggtrttgctc agcatgcaca c 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótido ZC17600
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
catgtaggcc atgaggtcca ccac 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótido ZC38065
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctttcctggg aatctgtgtc t 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótido ZC38068
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cctccagctc tggtgctg 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótido ZC37877
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 53
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
caaaaaaccc aacaaattga ctca 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótido ZC37876
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 54
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
catgtggcta tactactttc agcag 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sonda TaqMan(r) del receptor zcytor17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 55
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctgtgttggc ccaccgttcc ca 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador directo de rRNA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 56
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cggctaccac atccaaggaa 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador inverso de rRNA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 57
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gctggaatta ccgcggct 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sonda TaqMan(r) de rRNA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 58
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tgctggcacc agacttgccc tc 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia omitida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 59
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
000 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótido ZC41458
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 60
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tggacctcgc actaaaatca t 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótido ZC41457
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 61
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aatcacggca gagttcccac ac 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótido ZC41459
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 62
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agaagggcgt gctcgtgtc 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótido ZC41460
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 63
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccggatggct gggctgtg 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótido ZC39982
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 64
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aatgtctgtg tagcataagg tatga 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 65
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótido ZC39983
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 65
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cctgcctacc tgaaaaccag aa 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótido ZC39980
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 66
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tttgaattcg ccaccatggc tctatttgca gtcttt 
\hfill
36 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 67
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótido ZC39981
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 67
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctgtctcgag tgctggttag cagtgttc 
\hfill
28 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 68
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2217
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(2217)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 68
70
72
73 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 739
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 69
74
75 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1557
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(1557)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 70
76
77
78 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 71
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 519
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 71
79
80 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 72
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Etiqueta peptídica C-Terminal His
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 72
\hskip1cm
81 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 73
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Espaciador Gly-Ser de 12 aminoácidos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 73
\hskip1cm
82 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 74
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótido ZC41557
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 74
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttatagatct cgaggagtgt tcatccggag t 
\hfill
31 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 75
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 65
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótido ZC29232
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 75
\hskip1cm
83 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 76
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3196
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 76
\vskip1.000000\baselineskip
84 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 77
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótido ZC28575
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 77
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccaggaaagg aaaccagtta tacc 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 78
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótido ZC21195
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 78
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gaggagacca taacccccga cag 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 79
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótido ZC21196
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 79
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
catagctccc accacacgat ttt 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 80
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótido ZC26358
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 80
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aaaaccaaac gtacaacctc acggg 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 81
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótido ZC26359
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 81
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gagcagccat acaccagagc agaca 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 82
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótido ZC29179
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 82
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcagggttgg gaacggtgg 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 83
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótido ZC28917
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 83
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tgcaagatgc tggaattgac 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 84
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótido ZC28916
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 84
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agtcaattcc agcatcttgc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 85
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótido ZC28918
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 85
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcacagagtc atcagactcc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 86
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótido ZC41498
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 86
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggctccagag accacagg 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 87
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótido ZC41496
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 87
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atgactagta atgaccgcac ag 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 88
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótido ZC41583
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 88
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgtacgggcc ggccaccatg atcttccaca caggaacaa 
\hfill
39 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 89
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótido ZC41584
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 89
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tgacgaggcg cgcctcagca tgtagtattg tcctta 
\hfill
36 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 90
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 650
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (53)...(592)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 90
\vskip1.000000\baselineskip
85 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 91
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 163
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 91
86 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 92
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 511
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de cDNA murino clonada (SEQ ID NO:90) con sitios de restricción FseI y AscI, y una secuencia Kozak parcial al marco de lectura abierto de mcytor17lig y al codón de terminación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 92
87 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 93
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótido ZC41438
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 93
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gccatggcct ctcactcagg c 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 94
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótido ZC41437
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 94
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccagggagca ttgacaactc ttag 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 95
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 516
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Polinucleótido zCytor17Lig-CEE humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(516)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 95
\vskip1.000000\baselineskip
88
89 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 96
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 171
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Polipéptido zCytor17Lig-CEE humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 96
\vskip1.000000\baselineskip
90 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 97
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótido ZCZC41607
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 97
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccagggaat tcatataggc cggccaccat ggcctctcac tcaggcccc 
\hfill
49 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 98
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 82
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótido ZCZC41605
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 98
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
91 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 99
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 629
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (28)...(528)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 99
\vskip1.000000\baselineskip
92 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 100
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 166
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 100
\vskip1.000000\baselineskip
93 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 101
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 674
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (10)...(469)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 101
\vskip1.000000\baselineskip
94
95 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 102
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 151
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 102
\vskip1.000000\baselineskip
96 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 103
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Etiqueta peptídica Glu-Glu (CEE) alternativa sin par de residuos Gly-Ser
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 103
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
97 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 104
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 513
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Polinucleótido zCytor17Lig(m)-CEE de ratón
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(513)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 104
\vskip1.000000\baselineskip
98 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 105
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 170
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Polipéptido zCytor17Lig(m)-CEE de ratón
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 105
99 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 106
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótido ZC41643
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 106
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccagggaat tcatataggc cggccaccat gatcttccac acaggaaca 
\hfill
49 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 107
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 85
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótido ZC41641
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 107
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
100 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 108
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótido ZC38,239
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 108
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gccgactaag ccagagaac 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 109
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótido ZC38,245
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 109
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctgttgacag ttctgaaccg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 110
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de oligonucleótido ZC38,238
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 110
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgcggtttcc attgtatctg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 111
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2748
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (237)...(2222)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 111
\vskip1.000000\baselineskip
101
102
103
104 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 112
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 662
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 112
\vskip1.000000\baselineskip
105
106 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 113
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2728
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (237)...(1877)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 113
107
108
109
110 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 114
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 547
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 114
111
112 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 115
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador ZC41,764
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 115
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atcgaattca gaccaatggc tttctctgtg 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 116
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador ZC41,598
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 116
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
acagtagtgt tctgactcag ttgg 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 117
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador ZC41,948
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 117
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggtactgttc tctttgtctc g 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 118
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador ZC41,766
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 118
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atctctagat gtttactgtt caccttg 
\hfill
27 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 119
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4026
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (780)...(3692)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 119
\vskip1.000000\baselineskip
113
114
115
116
117 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 120
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 970
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 120
118
119
120 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 121
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2910
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Polinucleótido degenerado que codifica el polipéptido de SEQ ID NO:120.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(2910)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> N = A, T, G, o C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(2910)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 121
\vskip1.000000\baselineskip
121 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 122
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador ZC43891
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 122
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gggcagtagg atatgaatca gcat 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 123
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador ZC43900
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 123
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gaaggcccca gtgctacgt 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 124
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sonda ZC43896 de OSMRbeta
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 124
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcatccggag tcgtgacctt cgtg 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 125
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador ZC43280
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 125
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gagcacgccc ttctcttcct 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 126
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador ZC43281
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 126
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgttgcccgt ccgtttacta 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 127
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sonda ZC43275 de zcytor17lig
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 127
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctgtaattcc tcgactattt tctgtacatcatcacttggt 
\hfill
40 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 128
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador ZC40574
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 128
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctcatttgga attttgccga tt 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 129
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador ZC40575
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 129
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccgagtgaag atcccctttt ta 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 130
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sonda ZC43017 de GUS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 130
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tgaacagtca ccgacgagag tgctgg 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 131
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador ZC28480
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 131
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgattcagga cagtcaacag tacc 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 132
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador ZC41653
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 132
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccttcgtgaa cgtagcactg g 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 133
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador ZC41655
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 133
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctgaaatcca aggcgaggc 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 134
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador ZC41703
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 134
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tgaagctggc cttgctctct 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 135
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador ZC41704
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 135
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gagatatgcc cggatggct 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 136
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador ZC43272
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 136
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gctggtatca ttggtttcct tctc 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 137
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador ZC43273
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 137
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cattctcttt cctctgcaaa ttca 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 138
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sonda ZC43478 de zcytor17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 138
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tagagaacat ttcctgcgtc ttttacttcg acag 
\hfill
34 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 139
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador ZC43278
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 139
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aaacaagagt ctcaggatct ttataacaac 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 140
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador ZC43279
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 140
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
acggcagctg tattgattcg t 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 141
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sonda ZC43276 de zcytor17lig
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 141
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
taaagcaggc atctgggatg tcagca 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 142
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador ZC43045
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 142
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aaacatgata tttcagatag agatcagtag act 
\hfill
33 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 143
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador ZC43046
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 143
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cttatgaaat gtttgacaca ctccaa 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 144
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sonda ZC43141 de OSMRbeta
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 144
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctgtgcgttg gaactggacg tctgatatc 
\hfill
29 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 145
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador ZC43004
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 145
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gaaacccgcc gcatattact t 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 146
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador ZC43005
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 146
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tggcgttgct cacaaaggt 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 147
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sonda ZC43018 de GUS murino
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 147
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
acccacacca aagccctgga cctc 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 148
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador ZC40269
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 148
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gccagtttca cacactcctc ttt 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 149
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador ZC40268
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 149
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcagctattg cactagtcat tttctt 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 150
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sonda ZC40298 de receptor de transferrina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 150
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cccaggtagc cactcatgaa tccaatcaa 
\hfill
29 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 151
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador ZC43140
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 151
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttcttccaca gcaatcgcac 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 152
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador ZC43139.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 152
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atgcatgctt cggttcagaa c 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 153
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador ZC41608
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 153
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcagacaatg atgctgagca agac 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 154
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador ZC41609
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 154
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
caacgctgtg atttgcagtg gaga 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 155
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador ZC41502
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 155
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agcgggcctt cctcactc 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 156
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador ZC41500
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 156
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggacaaaata aaaacataaa taac 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 157
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Enlazador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 157
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tgtcgatgaa gccctgaaag acgcgcagac taattcgagc 
\hfill
40 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 158
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Enlazador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 158
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
acgcgcagac taattcgagc tcccaccatc accatcacca cgcgaattcg gtaccgctgg 
\hfill
60 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 159
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Enlazador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 159
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
actcactata gggcgaattg cccgggggat ccacgcggaa ccagcggtac cgaattcgcg 
\hfill
60 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 160
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Enlazador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 160
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
acggccagtg aattgtaata cgactcacta tagggcgaat tg 
\hfill
42 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 161
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 825
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (48)...(518)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 161
\vskip1.000000\baselineskip
122 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 162
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 156
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 162
\vskip1.000000\baselineskip
123 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 163
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 614
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (64)...(525)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 163
\vskip1.000000\baselineskip
124
125 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 164
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 153
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 164
126 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 165
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 756
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (9)...(443)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 165
\vskip1.000000\baselineskip
127 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 166
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 144
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 166
\vskip1.000000\baselineskip
128 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 167
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(60)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> variación
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (25)...(30)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, G, C, o T
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(60)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 167
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
129 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 168
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (9)...(10)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 168
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
130

Claims (9)

1. Uso de un polipéptido para la fabricación de un medicamento para tratar el asma en un mamífero, donde el polipéptido comprende una secuencia de residuos aminoácido que es por lo menos 90% idéntica a la secuencia de residuos aminoácido de un polipéptido seleccionado entre:
(a) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos desde los residuos 38 (Val) hasta 152 (Leu), como se muestra en la SEC ID NO:2;
(b) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos desde los residuos 27 (Leu) hasta 164 (Thr), como se muestra en la SEC ID NO:2;
(c) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos desde los residuos 24 (Ser) hasta 164 (Thr), como se muestra en la SEC ID NO:2; y
(d) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos desde los residuos 1 (Met) hasta 164 (Thr), como se muestra en la SEC ID NO:2.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Uso según la reivindicación 1, en el que el asma es asma alérgico.
3. Uso de un polipéptido para la fabricación de un medicamento para tratar la hiper-sensibilidad de las vías respiratorias en un mamífero, donde el polipéptido comprende una secuencia de residuos aminoácido que es por lo menos 90% idéntica a la secuencia de residuos aminoácido de un polipéptido seleccionado entre:
(a) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos desde los residuos 38 (Val) hasta 152 (Leu), como se muestra en la SEC ID NO:2;
(b) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos desde los residuos 27 (Leu) hasta 164 (Thr), como se muestra en la SEC ID NO:2;
(c) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos desde los residuos 24 (Ser) hasta 164 (Thr), como se muestra en la SEC ID NO:2; y
(d) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos desde los residuos 1 (Met) hasta 164 (Thr), como se muestra en la SEC ID NO:2.
\vskip1.000000\baselineskip
4. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que dicho medicamento disminuye la incorporación de eosinófilos mediada por IL13 o la producción mucosa.
5. Uso según cualquier reivindicación anterior, en el que el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos desde los residuos 27 (Leu) hasta 164 (Thr), como se muestra en la SEC ID NO:2.
6. Un polipéptido para tratar el asma en un mamífero, donde el polipéptido comprende una secuencia de residuos aminoácido que es por lo menos 90% idéntica a la secuencia de residuos aminoácido de un polipéptido seleccionado entre:
(a) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos desde los residuos 38 (Val) hasta 152 (Leu), como se muestra en la SEC ID NO:2;
(b) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos desde los residuos 27 (Leu) hasta 164 (Thr), como se muestra en la SEC ID NO:2;
(c) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos desde los residuos 24 (Ser) hasta 164 (Thr), como se muestra en la SEC ID NO:2; y
(d) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos desde los residuos 1 (Met) hasta 164 (Thr), como se muestra en la SEC ID NO:2.
\vskip1.000000\baselineskip
7. Un polipéptido para tratar la hiper-sensibilidad de las vías respiratorias en un mamífero, donde el polipéptido comprende una secuencia de residuos aminoácido que es por lo menos 90% idéntica a la secuencia de residuos aminoácido de un polipéptido seleccionado entre:
(a) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos desde los residuos 38 (Val) hasta 152 (Leu), como se muestra en la SEC ID NO:2;
(b) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos desde los residuos 27 (Leu) hasta 164 (Thr), como se muestra en la SEC ID NO:2;
(c) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos desde los residuos 24 (Ser) hasta 164 (Thr), como se muestra en la SEC ID NO:2; y
(d) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos desde los residuos 1 (Met) hasta 164 (Thr), como se muestra en la SEC ID NO:2.
\vskip1.000000\baselineskip
8. Un método in vitro para el incremento a largo plazo de la expresión del gen IL-13RA2 en una línea celular epitelial de pulmón humano, que comprende administrar un polipéptido a dicha línea celular; donde el polipéptido comprende una secuencia de residuos aminoácido que es por lo menos 90% idéntica a la secuencia de residuos aminoácido de un polipéptido seleccionado entre:
(a) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos desde los residuos 38 (Val) hasta 152 (Leu), como se muestra en la SEC ID NO:2;
(b) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos desde los residuos 27 (Leu) hasta 164 (Thr), como se muestra en la SEC ID NO:2;
(c) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos desde los residuos 24 (Ser) hasta 164 (Thr), como se muestra en la SEC ID NO:2; y
(d) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos desde los residuos 1 (Met) hasta 164 (Thr), como se muestra en la SEC ID NO:2;
donde dicha línea celular se selecciona entre una línea celular A549 y una línea celular SK-LU-1.
\vskip1.000000\baselineskip
9. Un método in vitro para la disminución de la actividad de señalización de IL-13 en una línea celular epitelial de pulmón humano, que comprende administrar un polipéptido a dicha línea celular; donde el polipéptido comprende una secuencia de residuos aminoácido que es por lo menos 90% idéntica a la secuencia de residuos aminoácido de un polipéptido seleccionado entre:
(a) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos desde los residuos 38 (Val) hasta 152 (Leu), como se muestra en la SEC ID NO:2;
(b) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos desde los residuos 27 (Leu) hasta 164 (Thr), como se muestra en la SEC ID NO:2;
(c) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos desde los residuos 24 (Ser) hasta 164 (Thr), como se muestra en la SEC ID NO:2; y
(d) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos desde los residuos 1 (Met) hasta 164 (Thr), como se muestra en la SEC ID NO:2;
donde dicha línea celular se selecciona entre una línea celular A549 y una línea celular SK-LU-1.
ES08102636T 2002-01-18 2003-01-21 Ligando de citocina para el tratamiento de asma e hiper-sensibilidad de las vías respiratorias . Expired - Lifetime ES2351678T3 (es)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US35032502P 2002-01-18 2002-01-18
US350325P 2002-01-18
US37532302P 2002-04-25 2002-04-25
US375323P 2002-04-25
US43531502P 2002-12-19 2002-12-19
US435315P 2002-12-19
EP03729693A EP1476541B1 (en) 2002-01-18 2003-01-21 Cytokine (zcytor17 ligand)

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2351678T3 true ES2351678T3 (es) 2011-02-09

Family

ID=27407940

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES08102636T Expired - Lifetime ES2351678T3 (es) 2002-01-18 2003-01-21 Ligando de citocina para el tratamiento de asma e hiper-sensibilidad de las vías respiratorias .
ES10168189T Expired - Lifetime ES2377188T3 (es) 2002-01-18 2003-01-21 Nuevo ligando de citocina ZCYTOR17
ES03729693T Expired - Lifetime ES2310660T3 (es) 2002-01-18 2003-01-21 Citoquina (ligando zcytor17).

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES10168189T Expired - Lifetime ES2377188T3 (es) 2002-01-18 2003-01-21 Nuevo ligando de citocina ZCYTOR17
ES03729693T Expired - Lifetime ES2310660T3 (es) 2002-01-18 2003-01-21 Citoquina (ligando zcytor17).

Country Status (21)

Country Link
US (12) US7064186B2 (es)
EP (3) EP2230299B1 (es)
JP (1) JP4795641B2 (es)
KR (1) KR101013401B1 (es)
CN (2) CN100575482C (es)
AT (3) ATE536406T1 (es)
AU (2) AU2003225525B2 (es)
BR (1) BR0306979A (es)
CA (1) CA2473686C (es)
CY (1) CY1112833T1 (es)
DE (2) DE60322188D1 (es)
DK (3) DK2230299T3 (es)
ES (3) ES2351678T3 (es)
IL (3) IL163066A (es)
NO (1) NO332266B1 (es)
PL (1) PL211833B1 (es)
PT (1) PT2230299E (es)
RU (2) RU2360923C2 (es)
SI (1) SI2230299T1 (es)
WO (1) WO2003060090A2 (es)
ZA (1) ZA200405695B (es)

Families Citing this family (52)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT1188830E (pt) 1999-06-02 2010-04-09 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Nova proteína nr10 receptora da hemopoietina
WO2001023556A1 (fr) 1999-09-27 2001-04-05 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Nouvelle proteine receptrice d'hemopoietine (nr12)
US20030096339A1 (en) * 2000-06-26 2003-05-22 Sprecher Cindy A. Cytokine receptor zcytor17
CA2473686C (en) 2002-01-18 2011-09-20 Zymogenetics, Inc. Novel cytokine zcytor17 ligand
US9738700B2 (en) 2002-01-18 2017-08-22 Zymogenetics Inc. ZCYTOR17 heterodimeric cytokine receptor
ES2546797T3 (es) * 2002-01-18 2015-09-28 Zymogenetics, Inc. Multímeros Zcytor17 receptores de citocinas
WO2005040380A1 (ja) * 2003-10-29 2005-05-06 Bml, Inc. げっ歯類動物の免疫応答調節蛋白質
JP2007068402A (ja) * 2003-12-26 2007-03-22 Bml Inc 免疫応答調節蛋白質
US20060269991A1 (en) * 2004-11-03 2006-11-30 Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc. T cell protein and nucleotides encoding the same
US20060228329A1 (en) * 2005-01-28 2006-10-12 Brady Lowell J Homogeneous preparations of IL-31
MX2007009718A (es) * 2005-02-14 2007-09-26 Zymogenetics Inc Metodos para tratar trastornos cutaneos utilizando un antagonista il-31ra.
EP1856539B1 (en) * 2005-02-14 2015-10-21 ZymoGenetics, Inc. Methods of predicting therapeutic response in atopic dermatitis to il-31 antagonists
AU2012202218B2 (en) * 2005-02-14 2014-05-22 National Jewish Medical And Research Center Methods Of Treating Diseases Which Are Mediated By Cutaneous Lymphocyte Antigen Positive Cells
EP1869222A4 (en) * 2005-04-15 2010-01-20 Oncomethylome Sciences S A METHYLATION MARKERS FOR THE DIAGNOSIS AND TREATMENT OF CANCER
US20130216542A1 (en) 2005-05-06 2013-08-22 Zymogenetics, Inc. Variable region sequences of il-31 monoclonal antibodies and methods of use
US8101183B2 (en) * 2005-05-06 2012-01-24 Zymogentics, Inc. Variable region sequences of IL-31 monoclonal antibodies
CN102321174B (zh) * 2005-05-06 2013-10-16 津莫吉尼蒂克斯公司 Il-31单克隆抗体及使用方法
EP2001906A2 (en) * 2006-01-10 2008-12-17 Zymogenetics, Inc. Methods of treating pain and inflammation in neuronal tissue using il-31ra and osmrb antagonists
WO2007114319A1 (ja) * 2006-03-31 2007-10-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 抗体の血中動態を制御する方法
BRPI0712426B1 (pt) 2006-06-08 2021-10-26 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Usos de um anticorpo anti-nr10/il-31ra com atividade neutralizante de nr10/il-31ra, de um fragmento e/ou um fragmento quimicamente modificado do anticorpo e de um agente
DK2594586T3 (en) * 2006-09-01 2014-11-17 Zymogenetics Inc Monoclonal il-31 antibodies and methods of use thereof
US20100003704A1 (en) 2008-06-13 2010-01-07 Shuling Cheng IN SITU detection of early stages and late stages HPV infection
JP2010515755A (ja) 2007-01-10 2010-05-13 ザイモジェネティクス， インコーポレイテッド 気道過敏および喘息を処置するためのｉｌ−３１の使用法
TWI464262B (zh) * 2007-09-26 2014-12-11 中外製藥股份有限公司 抗體固定區的變異
JP5334319B2 (ja) * 2007-09-26 2013-11-06 中外製薬株式会社 Ｃｄｒのアミノ酸置換により抗体の等電点を改変する方法
WO2009052487A2 (en) * 2007-10-18 2009-04-23 University Of South Florida Method of detecting oncogenesis of hematopoietic cells
EP2241332A4 (en) 2007-12-05 2011-01-26 Chugai Pharmaceutical Co Ltd THERAPEUTIC AGENT AGAINST PRITURE
EP2236604B1 (en) * 2007-12-05 2016-07-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-nr10 antibody and use thereof
WO2009071696A2 (en) 2007-12-07 2009-06-11 Zymogenetics, Inc. Humanized antibody molecules specific for il-31
PL2708558T3 (pl) 2008-04-11 2018-09-28 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cząsteczka wiążąca antygen zdolna do wiązania dwóch lub więcej cząsteczek antygenu w sposób powtarzalny
CN107254513B (zh) * 2008-05-27 2021-04-20 安捷伦科技有限公司 使用新的杂交缓冲液用于检测染色体畸变的组合物和方法
US9303287B2 (en) 2009-02-26 2016-04-05 Dako Denmark A/S Compositions and methods for RNA hybridization applications
JP2010210772A (ja) 2009-03-13 2010-09-24 Dainippon Screen Mfg Co Ltd 液晶表示装置の製造方法
JP5717624B2 (ja) 2009-03-19 2015-05-13 中外製薬株式会社 抗体定常領域改変体
TWI682995B (zh) 2009-03-19 2020-01-21 日商中外製藥股份有限公司 抗體恆定區域改變體
US8892184B2 (en) 2010-10-18 2014-11-18 Siemens Medical Solutions Usa, Inc. Systems and methods for reducing interference in a dual modality imaging system
WO2012073992A1 (ja) 2010-11-30 2012-06-07 中外製薬株式会社 複数分子の抗原に繰り返し結合する抗原結合分子
US8790651B2 (en) 2011-07-21 2014-07-29 Zoetis Llc Interleukin-31 monoclonal antibody
JP6185468B2 (ja) * 2011-08-12 2017-08-23 メロ バイオテクノロジー インコーポレイテッドＭｅｌｌｏ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ． 原核細胞内においてヘアピン様ｒｎａを発現させる方法及び組成物
EP2761028A1 (en) 2011-09-30 2014-08-06 Dako Denmark A/S Hybridization compositions and methods using formamide
EP3252173A1 (en) 2011-10-21 2017-12-06 Dako Denmark A/S Hybridization compositions and methods
US10196662B2 (en) * 2012-08-10 2019-02-05 Mello Biotechnology, Inc. Composition for producing microRNA precursors as drugs for enhancing wound healing and production method of the microRNA precursors
NZ713636A (en) 2013-05-30 2022-07-01 Kiniksa Pharmaceuticals Ltd Oncostatin m receptor antigen binding proteins
US10464982B2 (en) 2014-04-23 2019-11-05 Emory University Compositions of GM-CSF and interleukin fusions for immune modulation and uses related thereto
US20170072019A1 (en) 2014-05-12 2017-03-16 Rappaport Family Institute For Research In The Medical Sciences Compositions comprising il-31 and uses thereof
WO2016167263A1 (ja) 2015-04-14 2016-10-20 中外製薬株式会社 Ｉｌ－３１アンタゴニストを有効成分として含有する、アトピー性皮膚炎の予防用及び／又は治療用医薬組成物
CN104826100A (zh) * 2015-04-16 2015-08-12 浙江海隆生物科技有限公司 一种猪瘟病毒重组亚单位疫苗的制备方法与应用
DE102015215840B4 (de) * 2015-08-19 2017-03-23 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Multiaperturabbildungsvorrichtung, Abbildungssystem und Verfahren zum Bereitstellen einer Multiaperturabbildungsvorrichtung
WO2018156180A1 (en) 2017-02-24 2018-08-30 Kindred Biosciences, Inc. Anti-il31 antibodies for veterinary use
AU2020387034A1 (en) 2019-11-20 2022-06-02 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody-containing preparation
CN111337666B (zh) * 2020-02-12 2021-04-02 山东大学 I-motif重组介导的FRET探针及其原位成像癌细胞表面蛋白质同源二聚化的应用
TWI765431B (zh) * 2020-11-25 2022-05-21 長庚大學 核酸放大系統及其方法

Family Cites Families (76)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4054646A (en) * 1973-07-30 1977-10-18 General Electric Method and apparatus for detection of antibodies and antigens
IE54046B1 (en) 1981-08-25 1989-05-24 Celltech Ltd Expression vectors
US4579821A (en) 1981-11-23 1986-04-01 University Patents, Inc. Control of DNA sequence transcription
US4656134A (en) 1982-01-11 1987-04-07 Board Of Trustees Of Leland Stanford Jr. University Gene amplification in eukaryotic cells
US4486533A (en) 1982-09-02 1984-12-04 St. Louis University Filamentous fungi functional replicating extrachromosomal element
US4599311A (en) 1982-08-13 1986-07-08 Kawasaki Glenn H Glycolytic promotersfor regulated protein expression: protease inhibitor
US4977092A (en) 1985-06-26 1990-12-11 Amgen Expression of exogenous polypeptides and polypeptide products including hepatitis B surface antigen in yeast cells
US4601978A (en) 1982-11-24 1986-07-22 The Regents Of The University Of California Mammalian metallothionein promoter system
US4603044A (en) 1983-01-06 1986-07-29 Technology Unlimited, Inc. Hepatocyte Directed Vesicle delivery system
US4713339A (en) 1983-01-19 1987-12-15 Genentech, Inc. Polycistronic expression vector construction
US5139936A (en) 1983-02-28 1992-08-18 Collaborative Research, Inc. Use of the GAL1 yeast promoter
US4661454A (en) 1983-02-28 1987-04-28 Collaborative Research, Inc. GAL1 yeast promoter linked to non galactokinase gene
US4650764A (en) 1983-04-12 1987-03-17 Wisconsin Alumni Research Foundation Helper cell
US4870008A (en) 1983-08-12 1989-09-26 Chiron Corporation Secretory expression in eukaryotes
US4931373A (en) 1984-05-25 1990-06-05 Zymogenetics, Inc. Stable DNA constructs for expression of α-1 antitrypsin
US4766073A (en) 1985-02-25 1988-08-23 Zymogenetics Inc. Expression of biologically active PDGF analogs in eucaryotic cells
DE3578435D1 (de) 1984-12-06 1990-08-02 Labofina Sa Promotoren fuer die expression von fremden genen in hefe, plasmide, die diese promotoren enthalten, sowie deren verwendung zur herstellung von polypeptiden.
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
GR860984B (en) 1985-04-17 1986-08-18 Zymogenetics Inc Expression of factor vii and ix activities in mammalian cells
US4882279A (en) 1985-10-25 1989-11-21 Phillips Petroleum Company Site selective genomic modification of yeast of the genus pichia
US4935349A (en) 1986-01-17 1990-06-19 Zymogenetics, Inc. Expression of higher eucaryotic genes in aspergillus
GB8611832D0 (en) 1986-05-15 1986-06-25 Holland I B Polypeptide
US4980289A (en) 1987-04-27 1990-12-25 Wisconsin Alumni Research Foundation Promoter deficient retroviral vector
US5063154A (en) 1987-06-24 1991-11-05 Whitehead Institute For Biomedical Research Pheromone - inducible yeast promoter
EP1762623A1 (en) 1988-01-22 2007-03-14 ZymoGenetics, Inc. Methods for producing biologically active peptide dimers
US5567584A (en) 1988-01-22 1996-10-22 Zymogenetics, Inc. Methods of using biologically active dimerized polypeptide fusions to detect PDGF
US4956288A (en) 1988-04-22 1990-09-11 Biogen, Inc. Method for producing cells containing stably integrated foreign DNA at a high copy number, the cells produced by this method, and the use of these cells to produce the polypeptides coded for by the foreign DNA
US5037743A (en) 1988-08-05 1991-08-06 Zymogenetics, Inc. BAR1 secretion signal
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US5162228A (en) 1988-12-28 1992-11-10 Takeda Chemical Industries, Ltd. Gylceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene and promoter
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5124263A (en) 1989-01-12 1992-06-23 Wisconsin Alumni Research Foundation Recombination resistant retroviral helper cell and products produced thereby
US5116964A (en) 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
US5399346A (en) 1989-06-14 1995-03-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Gene therapy
US5162222A (en) 1989-07-07 1992-11-10 Guarino Linda A Use of baculovirus early promoters for expression of foreign genes in stably transformed insect cells or recombinant baculoviruses
IL99552A0 (en) 1990-09-28 1992-08-18 Ixsys Inc Compositions containing procaryotic cells,a kit for the preparation of vectors useful for the coexpression of two or more dna sequences and methods for the use thereof
JP3202999B2 (ja) 1991-01-31 2001-08-27 協和醗酵工業株式会社 肝移行性リポソーム製剤
US5298418A (en) 1991-09-16 1994-03-29 Boyce Thompson Institute For Plant Research, Inc. Cell line isolated from larval midgut tissue of Trichoplusia ni
US5641670A (en) 1991-11-05 1997-06-24 Transkaryotic Therapies, Inc. Protein production and protein delivery
AU5103293A (en) 1992-09-14 1994-04-12 Oklahoma State University Immortalized cells and uses therefor
CA2168202A1 (en) 1993-07-30 1995-03-16 Joseph Dougherty Efficient gene transfer into primary lymphocytes
US6117679A (en) 1994-02-17 2000-09-12 Maxygen, Inc. Methods for generating polynucleotides having desired characteristics by iterative selection and recombination
US5492841A (en) * 1994-02-18 1996-02-20 E. I. Du Pont De Nemours And Company Quaternary ammonium immunogenic conjugates and immunoassay reagents
US5783672A (en) 1994-05-26 1998-07-21 Immunex Corporation Receptor for oncostatin M
RU2102988C1 (ru) * 1995-02-10 1998-01-27 Зинченко Елена Вениаминовна Препарат с иммуномодулирующими свойствами
US6074849A (en) 1995-07-19 2000-06-13 Genetics Institute, Inc. Polynucleotides encoding human CTLA-8 related proteins
US5965389A (en) 1995-11-09 1999-10-12 Zymogenetics, Inc. Production of GAD65 in methylotrophic yeast
US6265184B1 (en) * 1995-12-20 2001-07-24 Icos Corporation Polynucleotides encoding chemokine receptor 88C
US5792850A (en) * 1996-05-23 1998-08-11 Zymogenetics, Inc. Hematopoietic cytokine receptor
AU708572B2 (en) 1996-07-17 1999-08-05 Zymogenetics Inc. Preparation of (pichia methanolica) auxotrophic mutants
WO1998002565A1 (en) 1996-07-17 1998-01-22 Zymogenetics, Inc. TRANSFORMATION OF $i(PICHIA METHANOLICA)
WO2002008288A2 (en) 2000-07-20 2002-01-31 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
WO1998024893A2 (en) 1996-12-03 1998-06-11 Abgenix, Inc. TRANSGENIC MAMMALS HAVING HUMAN IG LOCI INCLUDING PLURAL VH AND Vλ REGIONS AND ANTIBODIES PRODUCED THEREFROM
GB9819420D0 (en) 1998-09-07 1998-10-28 Glaxo Group Ltd Novel receptor
AU4711800A (en) * 1999-05-11 2000-11-21 Zymogenetics Inc. Cytokine receptor mouse zcytor10
PT1188830E (pt) 1999-06-02 2010-04-09 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Nova proteína nr10 receptora da hemopoietina
AU6531101A (en) 2000-06-02 2001-12-17 Genentech Inc Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
AU2001278852A1 (en) 2000-06-23 2002-01-08 Genentech Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of disorders involving angiogenesis
US20030096339A1 (en) 2000-06-26 2003-05-22 Sprecher Cindy A. Cytokine receptor zcytor17
AU2001273032A1 (en) 2000-06-26 2002-01-08 Zymogenetics Inc. Cytokine receptor zcytor17
US20030059871A1 (en) 2000-10-06 2003-03-27 Cosman David J. Hematopoietin receptors HPR1 and HPR2
WO2002077230A1 (fr) 2001-03-26 2002-10-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Variants d'epissage nr10
CA2473686C (en) 2002-01-18 2011-09-20 Zymogenetics, Inc. Novel cytokine zcytor17 ligand
ES2546797T3 (es) 2002-01-18 2015-09-28 Zymogenetics, Inc. Multímeros Zcytor17 receptores de citocinas
EP2110434A1 (en) 2002-02-25 2009-10-21 Genentech, Inc. Type-1 cytokine receptor GLM-R
US20060188409A1 (en) * 2005-01-19 2006-08-24 Irm Llc Multi-well container positioning devices, systems, computer program products, and methods
US20060228329A1 (en) 2005-01-28 2006-10-12 Brady Lowell J Homogeneous preparations of IL-31
EP1856539B1 (en) 2005-02-14 2015-10-21 ZymoGenetics, Inc. Methods of predicting therapeutic response in atopic dermatitis to il-31 antagonists
MX2007009718A (es) 2005-02-14 2007-09-26 Zymogenetics Inc Metodos para tratar trastornos cutaneos utilizando un antagonista il-31ra.
CN102321174B (zh) 2005-05-06 2013-10-16 津莫吉尼蒂克斯公司 Il-31单克隆抗体及使用方法
US8101183B2 (en) 2005-05-06 2012-01-24 Zymogentics, Inc. Variable region sequences of IL-31 monoclonal antibodies
US20130216542A1 (en) 2005-05-06 2013-08-22 Zymogenetics, Inc. Variable region sequences of il-31 monoclonal antibodies and methods of use
EP2001906A2 (en) 2006-01-10 2008-12-17 Zymogenetics, Inc. Methods of treating pain and inflammation in neuronal tissue using il-31ra and osmrb antagonists
DK2594586T3 (en) 2006-09-01 2014-11-17 Zymogenetics Inc Monoclonal il-31 antibodies and methods of use thereof
JP2010515755A (ja) 2007-01-10 2010-05-13 ザイモジェネティクス， インコーポレイテッド 気道過敏および喘息を処置するためのｉｌ−３１の使用法
WO2009071696A2 (en) * 2007-12-07 2009-06-11 Zymogenetics, Inc. Humanized antibody molecules specific for il-31

Also Published As

Publication number Publication date
US7740834B2 (en) 2010-06-22
WO2003060090A3 (en) 2004-04-01
US20090192292A1 (en) 2009-07-30
US7507795B2 (en) 2009-03-24
KR20040082394A (ko) 2004-09-24
BR0306979A (pt) 2004-11-23
CA2473686C (en) 2011-09-20
PL371586A1 (en) 2005-06-27
US20090149635A1 (en) 2009-06-11
RU2490276C2 (ru) 2013-08-20
US20110196128A1 (en) 2011-08-11
SI2230299T1 (sl) 2012-07-31
CN101843895A (zh) 2010-09-29
RU2360923C2 (ru) 2009-07-10
US8013124B2 (en) 2011-09-06
CY1112833T1 (el) 2016-02-10
DE60322188D1 (de) 2008-08-28
CA2473686A1 (en) 2003-07-24
IL210454A0 (en) 2011-03-31
JP2005526494A (ja) 2005-09-08
KR101013401B1 (ko) 2011-02-14
US8124378B2 (en) 2012-02-28
US20070077627A1 (en) 2007-04-05
NO332266B1 (no) 2012-08-13
PL211833B1 (pl) 2012-06-29
EP1961811B1 (en) 2010-08-25
AU2008230054A1 (en) 2008-11-13
AU2008230054B2 (en) 2012-01-19
US20130156695A1 (en) 2013-06-20
IL163066A (en) 2011-08-31
EP2230299A1 (en) 2010-09-22
DK2230299T3 (da) 2012-03-26
ATE536406T1 (de) 2011-12-15
US20150010946A1 (en) 2015-01-08
IL210455A (en) 2014-02-27
US20070111266A1 (en) 2007-05-17
US9605062B2 (en) 2017-03-28
NO20043419L (no) 2004-10-18
US20190338020A1 (en) 2019-11-07
IL210454A (en) 2014-02-27
US7459293B2 (en) 2008-12-02
US8778344B2 (en) 2014-07-15
US7531636B2 (en) 2009-05-12
ES2310660T3 (es) 2009-01-16
AU2003225525B2 (en) 2008-07-24
AU2003225525A1 (en) 2003-07-30
EP1476541A2 (en) 2004-11-17
US20070249020A1 (en) 2007-10-25
WO2003060090A2 (en) 2003-07-24
US20030224487A1 (en) 2003-12-04
ATE478944T1 (de) 2010-09-15
DK1476541T3 (da) 2008-11-03
CN1643138A (zh) 2005-07-20
RU2008118227A (ru) 2009-11-20
EP1476541A4 (en) 2006-01-11
EP2230299B1 (en) 2011-12-07
ES2377188T3 (es) 2012-03-23
DK1961811T3 (da) 2010-11-08
EP1961811A1 (en) 2008-08-27
CN100575482C (zh) 2009-12-30
RU2004125165A (ru) 2005-04-20
ATE401390T1 (de) 2008-08-15
JP4795641B2 (ja) 2011-10-19
EP1476541B1 (en) 2008-07-16
US7064186B2 (en) 2006-06-20
ZA200405695B (en) 2005-03-30
US20060141579A1 (en) 2006-06-29
PT2230299E (pt) 2012-03-02
US7425325B2 (en) 2008-09-16
DE60333963D1 (de) 2010-10-07
US20180155418A1 (en) 2018-06-07
IL210455A0 (en) 2011-03-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2351678T3 (es) Ligando de citocina para el tratamiento de asma e hiper-sensibilidad de las vías respiratorias .
ES2382800T3 (es) Multímeros Zcytor17 receptores de citocinas
KR20010103794A (ko) 신규한 사이토킨 ｚａｌｐｈａ 11 리간드
AU2012202219A1 (en) Novel Cytokine Zcytor17 Ligand