JP2852192B2 - ｕＰＡＲのドメイン２＋３のｕＰＡ結合部位および抗体 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明はＷＯ９０／１２０９１
およびＷＯ９２／０７８３において開示された発明を発
展させ、改良および改善したものである。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】文献
によれば、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン・アクチベ
ーター（ｕ−ＰＡ）はこれまで知られているすべての哺
乳動物に見られる。プラスミンおよび他の蛋白分解酵素
によって生じる、恐らく細胞外基質の分解による組織分
解および／または細胞移動に対するｕ−ＰＡに関する知
見はすでに存在する（ダネー（Danφ）ら、１９８８、
１９９０、グレンダル−ハンセン(Grφndal-Hansen)
ら、１９８８、アンドリーセン(Andreasen)ら、１９９
０参照）。

【０００３】腫瘍の浸潤領域の膜に、ｕ−ＰＡが存在し
ているとの免疫化学的研究報告があり（スクライヴァー
(Scriver)ら、１９８４）、最近の研究では、細胞表面
において、ｕ−ＰＡは一般に特定のレセプターに結合
し、この局在性が時と場所でｕ−ＰＡ触媒的プラスミノ
ーゲン活性化にきわめて重大であり得るとのことである
（ブラシ(Blasi)ら、１９８７、ダネーら、１９９０参
照）。

【０００４】ｕ−ＰＡのための表面レセプター ｕ−ＰＡの細胞レセプターはもともと血液単核細胞およ
び単核様Ｕ９３７細胞系（ヴァザーリ(Vassalli)ら、１
９８５）中に確認されており、その存在は、数種の悪性
細胞、ひと繊維芽細胞を含む種々の培養細胞およびまた
ひと胸部悪性腫瘍中に明示されている。レセプターは活
性５４ｋＤ ｕ−ＰＡに結合し、その一本鎖ポリペプチ
ドのプロ酵素、ｐｒｏ−ｕ−ＰＡ、および５４ｋＤ ｕ
−ＰＡはその活性部位試薬ＤＦＰによって妨害される
が、低分子量（３３ｋＤ）型の活性ｕ−ＰＡとの結合は
示さない（ヴァザーリら、１９８５；キュベリス(Cubel
lis)ら、１９８６）。すなわち、レセプターとの結合は
ｕ−ＰＡの触媒的部位を必要とせず、これらの知見と一
致して、ｕ−ＰＡの結合決定因子は、一次構造において
触媒的部位から離れている領域の酵素のアミノ−末端で
確認されている。レセプター結合ドメインは、ｕ−ＰＡ
分子の１５ｋＤアミノ末端フラグメント（ＡＴＦ、１−
１３５残基）に、より具体的には、ＥＧＦレセプターに
対する結合を生じさせる表皮成長因子（epidermal grow
th factor：ＥＧＦ）の部分と相同性を示すので成長因
子領域と称されるシステイン−豊富領域内に存在するこ
とが立証されている。結合に決定的に重要であると思わ
れるアミノ酸残基は配列１２−３２内に存在する（アッ
ペラ(Appella)ら、１９８７）。非常に低濃度（１００
ｎＭ）の結合を阻害する合成ペプチドがすでに構築され
ている。マウスとひとペプチド間に交差−反応性がない
ことはｕ−ＰＡとｕ−ＰＡＲ間の結合が著しく種間特異
的であることを示している。

【０００５】ひとｕ−ＰＡレセプターはすでに精製さ
れ、特徴付けられ（ベーレンツ(Behrendt)ら、１９９
０）、その全長のｃＤＮＡがクローン化されている（ロ
ルダン(Roldan)ら、１９９０）。このｕ−ＰＡＲのｃＤ
ＮＡは、シグナル配列除去後、糖脂質膜アンカーの付加
の原因となっているＣＯＯＨ−末端シグナルペプチドの
翻訳後除去中にさらに切断される３３５残基ポリペプチ
ドをコードする（プロウ(Ploug)ら、１９９１ａ）。成
熟ｕ−ＰＡＲ配列（１−２８３残基）は、全配列を含む
約９０個のアミノ酸の３個のシステイン−豊富反復配列
に分割され、それゆえに、ｕ−ＰＡＲは３個の相同性ド
メインから構成されているといわれている（ベーレンツ
ら、１９９１、プロウら、１９９１ｂ）。

【０００６】ｕ−ＰＡＲのこれらの内部反復配列は、一
群の単一ドメインである、反応性細胞分解の膜インヒビ
ター（ＭＩＲＬ／ＣＤ５９）およびマウスＬｙ−６抗体
類を含む糖脂質−固定膜糖蛋白質に関連していると思わ
れる（パルフリー(Palfree)、１９９１、プロウら、１
９９１ｂ）。最近、ｕ−ＰＡＲのＮＨ₂−末端ドメイン
の結合連結性が解明され（プロウら、１９９３）、非グ
リコシル化へび毒α−神経毒のそれと相同性であること
が判明し、各ｕ−ＰＡＲドメインがこれらの毒素と同じ
総体的構造を取っていると示唆されている。

【０００７】ｕ−ＰＡとｕ−ＰＡＲの相互作用は、ｕ−
ＰＡの小さな表皮成長因子様モジュールの高レセプター
−結合親和性によって完全に支配されている。ｕ−ＰＡ
ＲのＮＨ₂−末端ドメイン（１−８７残基；ドメイン
１）はｕ−ＰＡと連結していることがすでに示されてお
り、それゆえに、最初に、このドメインとｕ−ＰＡ間の
共有結合的架橋結合付加物がスベリン酸二スクシンイミ
ドを用いて選択的に形成され得（ベーレンツら、１９９
１）、次ぎにこのドメインと反応するモノクローナル抗
体が細胞へのｕ−ＰＡ結合を妨害する（レネ(Roenne)
ら、１９９１）。

【０００８】ＷＯ９２／０７０８３には細胞表面プラス
ミノーゲン活性化を著しく阻害するモノクローナル抗体
（および医薬としてのその使用および医薬を目的とする
ための方法におけるその使用）が開示されており、一
方、この活性化は３個の他の抗体によって影響されない
かされてもほんのわずかである。このモノクローナル抗
体（３Ｒ）はまたＵ９３７細胞の表面の放射性標識ＤＦ
Ｐ処理ｕ−ＰＡの結合を効果的に阻害するが、上記の３
個の抗体には阻害が見られない。３Ｒ抗体の結合はｕ−
ＰＡでの前処理により完全に阻害されるから、ｕ−ＰＡ
Ｒのｕ−ＰＡ結合ドメイン中のエピトープにこの抗体が
結合しているとの結論される。

【０００９】これらの知見に基づいて、ＷＯ９２／０７
０８３は、ｕ−ＰＡのレセプター結合の阻害が、局在化
蛋白分解活性、例えば腫瘍細胞の浸潤および転移、炎症
性腸疾患、前悪性結腸腺腫、敗血性関節炎、変形性関節
炎、リューマチ性関節炎（これらについては、過剰のｕ
−ＰＡ産生の直接関与が立証されている）、骨粗しょう
症、コレステリン腫および多数の皮膚および角膜疾患、
これらについては過剰のプラスミノーゲン活性化が、例
えば、角膜潰瘍、角膜炎、表皮剥離性水疱、乾癬および
天疱瘡などの病因であることが示されているのである
が、これらの治療的妨害に関連するなんらかの生理学的
機能を妨害する手段であると結論付けている。ｕ−ＰＡ
レセプターはいくつかの血球細胞（好中球顆粒球および
単球）および内皮細胞に存在するから、それらの規制
は、生理学的、病理学的および薬理学的条件における脈
管内の繊維素溶解活性にもまた著しく影響するかもしれ
ない。上記の疾患類は、細胞表面プラスミノーゲン活性
化を遮断または減少させる物質の投与に基づく治療のた
めの第一の標的である。受精卵の移植におけるｕ−ＰＡ
の役割ゆえに、避妊効果がレセプター結合阻害の物差し
として期待される。治療および予防はレセプター結合プ
ラスミノーゲン・アクチベーター活性を遮断または減少
させる薬剤での全身および局所的処置を含む。

【００１０】ＷＯ９２／０７０８３もまたｕ−ＰＡＲの
ｕ−ＰＡ結合部位が最初の８７個のＮ−末端アミノ酸内
に存在し、ＷＯ９２／０７０８３のモノクローナル抗体
はｕ−ＰＡＲのリガンド結合部に結合することが示され
ている。

【００１１】発明の要約 従来の知見とは異なり、単にｕ−ＰＡＲのドメイン１
（結合部位が存在すると考えられていた）ではなく、レ
セプターの全長がｕ−ＰＡへの高親和性を得るために必
要であると思われるのは驚くべきことであった。

【００１２】この明細書には、外因性発蛍光色団８−ア
ニリノ−１−ナフタレンスルホネート（ＡＮＳ）が無傷
のｕ−ＰＡＲ上に露出した単一の疎水性部位に結合する
こと、および結合ＡＮＳの蛍光の増強がｕ−ＰＡへの高
親和性結合部位の表面出現を立証するものであることを
開示した。さらに、ｕ−ＰＡＲ中のＴｙｒ⁸⁷の後のキモ
トリプシン切断がｕ−ＰＡに対する親和性を著しく減少
させ、ｕ−ＰＡＲのドメインＩとドメインII間の結合領
域のこの切断がＡＮＳ結合の付随的減少を伴うことを示
すものである。最後に、ドメイン２＋３に対する抗体は
同様の効果、すなわち、ｕ−ＰＡとｕ−ＰＡＲ間の結合
の阻害を示すことを明らかにした。

【００１３】さらなる非常に驚くべき事実は本発明のモ
ノクローナル抗体が９０％以上もの程度にｕ−ＰＡとｕ
−ＰＡＲ間の相互作用を阻害し得ることである。このよ
うな効果はかって知られていなかったものである。

【００１４】これらの知見はレセプターに対するｕ−Ｐ
Ａの高親和性結合がドメイン１の推定結合部位のアベイ
ラビリティによって変化するのみならず、別の重大な相
互作用があるかどうかによっても変化することと関係す
るものである。

【００１５】すなわち、このような別の重大な相互作用
を阻害し、それによって、これまで明らかに結合に関与
しているとは考えられていなかったドメイン２および／
またはドメイン３に選択的に影響を与えることによっ
て、ｕ−ＰＡＲへのｕ−ＰＡの結合を効果的に妨害し得
ることは驚くべき知見であった。

【００１６】上記の知見は、ｕ−ＰＡＲへのｕ−ＰＡの
結合が、ドメイン２および／またはドメイン３が重大な
役割を果たしている結合であり、事実、選択的にドメイ
ン２および／またはドメイン３に選択的に結合する抗体
のあるものを用いる実験はｕ−ＰＡＲへのこれらの抗体
の結合が、ｕ−ＰＡのｕ−ＰＡＲ結合形に結合するｕ−
ＰＡＲの能力を廃止することをはっきりと示している。

【００１７】これらの現象の最も尤もらしい説明は、完
全なｕ−ＰＡＲ分子の重大な立体配置に変化が生じ、ｕ
−ＰＡとｕ−ＰＡＲ間の結合能力に実際に完全な減少を
もたらすというようにした、ドメイン２および／または
３と、またはそれについてのドメイン２および／または
３のどこかの部分または亜属と相互作用する可能性があ
るというものである。

【００１８】このような重大な立体配置の変化の論理的
な結論は、 １）ｕ−ＰＡはｕ−ＰＡＲ分子と結合することができな
い、そして ２）変化後の立体配置において固定されたままである可
能性がないから、既にｕ−ＰＡＲ分子に結合しているか
もしれないｕ−ＰＡさえが置換されるであろうというも
のである。

【００１９】ｕ−ＰＡが積極的に置換される場合のこの
ような立体配置または別の変化はｕ−ＰＡへのｕ−ＰＡ
Ｒの結合を最も強く妨害し得る方法であり、すなわち、
局在化した蛋白分解作用の妨害を含む、結合作用を妨害
するものであると言える。抗体または他の試剤が結合部
位への接近をｕ−ＰＡと争わねばならない、より伝統的
なレセプターからのｕ−ＰＡの置換と違って、ｕ−ＰＡ
の置換は、置換の効果に対するなんらかの作用を有する
ｕ−ＰＡ濃度そのものとは関係なく、ｕ−ＰＡの置換が
生じる。もし、その置換試剤が、例えば、薬物である場
合、ｕ−ＰＡとの競合による効果を示す薬物よりずっと
少ない投与量で上記薬物を投与できるであろう。言い換
えれば、ｕ−ＰＡは置換試剤とｕ−ＰＡＲ間の結合を滴
定することができない。

【００２０】すなわち、本発明は比較的簡単な方法でｕ
−ＰＡのレセプター−結合を妨害する非常に効果的な方
法を提供するものである。すなわち、ドメイン１への推
定的ｕ−ＰＡ結合の増幅に決定的である要素を直接的に
妨害し、それによって、実際的な重要性を有し得る大き
さのなんらかのｕ−ＰＡ結合の可能性をなくする。

【００２１】従って、広い態様では、本発明は、ひとを
含む哺乳動物の局在化蛋白分解活性を妨害するための方
法であって、抗体（２０μｇ／ｍｌ）の１００μｌとと
もに０.１％ＢＳＡとＰＢＳ中１００μｌの細胞濃度
で、実質的にｕ−ＰＡ無含有のＵ９３７細胞を、３０分
４℃にてインキュベートし；¹²⁵Ｉ−標識０.９ｎＭＡｔ
Ｆ１００μｌを添加し、撹拌しながら１時間インキュベ
ートし；ＰＢＳ中０.１％ＢＳＡにて３回洗浄し、ガン
マ計数器で結合ＡｔＦを測定することからなる検定法に
よって、少なくとも９０％程度までｕ−ＰＡとｕ−ＰＡ
Ｒ間の結合を阻害する少なくとも１個の抗体の有効量を
動物に投与し、それによって、ｕ−ＰＡＲへのｕ−ＰＡ
のレセプター結合型の結合を妨害するか、またはに対抗
することを特徴とする方法である。

【００２２】また別の広い態様では、本発明はこれらの
新規な抗体に関する。

【００２３】すなわち、本発明はｕ−ＰＡのｕ−ＰＡＲ
結合を妨害またはに対抗し、それによってこれらと関係
する局在化蛋白分解活性を抑制する非常に効果的な方法
を提供し、本発明が基礎とする作用の機構は将来好まし
いものの１つになるであろう。

【００２４】発明の詳細な開示 上記に説明したように、本発明は、抗体（２０μｇ／ｍ
ｌ）の１００μｌとともに０.１％ＢＳＡとＰＢＳ中１
００μｌの細胞濃度で、実質的にｕ−ＰＡ無含有のＵ９
３７細胞を、３０分４℃にてインキュベートし；¹²⁵Ｉ
−標識０.９ｎＭ ＡｔＦ１００μｌを添加し、撹拌し
ながら１時間インキュベートし；ＰＢＳ中０.１％ＢＳ
Ａにて３回洗浄し、ガンマ計数器で結合ＡｔＦを測定す
ることからなる検定法によって、本発明はｕ−ＰＡとｕ
−ＰＡＲ間の結合を９０％程度まで阻害する抗体、また
は上記抗体の活性フラグメントまたは免疫学的等価物に
関する。

【００２５】本発明は少なくとも部分的に精製された形
態である抗体に関することは明らかである。

【００２６】これらの条件下における阻害は、例えば、
少なくとも、９２％、９３％、９４％、９５％、９６
％、９７％、９８％およびそれ以上であることがより注
目されるべきである。

【００２７】「抗体」とは、この明細書において、ａ）
免疫刺激剤に（ある場合には、高い特異性でもって）結
合する能力を有する分子であり、免疫学的刺激に対する
応答としてのＢ−リンパ球によって、またはｂ）抗体を
発現するのに必要な遺伝学的情報を含む形質転換細胞に
よって産生される分子をいう。これに関連して、「活性
フラグメント」なる語は、ある場合には抗体より高濃度
ではあるが、標的分子に抗体そのものと同様の生物学的
作用を誘発し得る分子の結合フラグメントを指す。「免
疫学的等価物」とは、実質的に抗体と同様の結合特異性
を示し、ある場合には抗体そのものより高濃度ではある
が、標的分子に実質的に抗体と同様の作用を及ぼす新規
物質をいう。

【００２８】活性フラグメントおよび免疫学的等価物は
上記の抗体濃度ではｕ−ＰＡ／ｕ−ＰＡＲ結合を阻害し
得ない可能性があることが理解される。しかしながら、
これは活性フラグメントおよび免疫学的等価物が抗体そ
のものよりも小さいことによる結果であるからかも知れ
ず、活性フラグメントおよび免疫学的等価物なる語はま
た抗体そのものと同様の結合部位に結合し、それによっ
て、ｕ−ＰＡのｕ−ＰＡＲに対するレセプター結合型の
結合を抑制、またはに対抗し、それによって、それがひ
とを含む哺乳動物に投与されれば、哺乳動物に局所的な
蛋白分解活性を抑制、またはに対抗し得る分子をいう。

【００２９】一般に、「抗体」なる語が本明細書および
請求の範囲において用いられる場合は、抗体、活性フラ
グメントおよび免疫学的等価物を含むものとする。

【００３０】より好ましい具体例において、本発明の抗
体は、免疫沈降検定法（実施例２およびRoenneら、１９
９１に記載）においてｕ−ＰＡＲのフラグメントへの実
質的な結合を示し、上記フラグメントは、１Ｍ ＮＨ₄
ＨＣＯ₃中３７℃にて４時間、α−キモトリプシン１０
０ｎｇとともに精製可溶性ｕ−ＰＡＲ７５０μｇをイン
キュベートし、１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオ
リドを添加し、ついでサイズ排除クロマトグラフィーお
よびイムノアフィニティ・クロマトグラフィーによって
フラグメントの精製を行うことによって得られるｕ−Ｐ
ＡＲのＣ−末端フラグメントである。このサイズ排除段
階はドメイン１を除去するものであり、イムノアフィニ
ティ段階はさらにサイズ排除の重鎖フラグメントを精製
するものである。

【００３１】このＣ−末端フラグメントは、文献によれ
ば、ｕ−ＰＡＲ分子の非ｕ−ＰＡ結合部位であり、完全
なｕ−ＰＡＲのアミノ酸残基８８から開始する（ドメイ
ン２＋３に相当）。従って、Ｃ−末端部分を含み、完全
なｕ−ＰＡＲ分子のアミノ酸残基８８から開始するｕ−
ＰＡＲの非ｕ−ＰＡ結合部位と反応する抗体が本発明の
興味ある態様である。

【００３２】「フラグメント」とは成熟ｕ−ＰＡＲ分子
の１部をいう。事実、可溶性ｕ−ＰＡＲもまた、糖脂質
アンカーが分子から廃棄されたときのｕ−ＰＡＲのフラ
グメントである。

【００３３】「実質的な結合」とは、抗体と別の分子間
の非特異的相互作用とは明らかに区別される抗体と抗原
間の結合をいう。正常な環境下、当業者は非特異的相互
作用と実質的な結合を区別するのは困難ではないが、経
験に基づけば、免疫沈降法におけるシグナルは陰性の対
照とは明確に区別され得るべきであると言い得る。

【００３４】ここに述べられているように、ハイブリド
ーマ細胞系１.Ｃ８.２６Ａ３および１.Ｈ２.１０Ａ３に
よって産生された抗体は上記の結合特性を示す。ｕ−Ｐ
ＡＲとｕ−ＰＡ間の結合阻害におけるそれらの高い能力
の理由は、免疫原性試剤として完全なｕ−ＰＡＲを用い
て産生されるこれまでの抗体産生とは異なり、それらが
とりわけ可溶化ｕ−ＰＡＲが免疫原性試剤である免疫手
法を用いて産生されるからであると考えられる。ドメイ
ン２＋３と反応する抗体はすでに文献に記載されている
が（ＷＯ９２／０７８３参照）、これらのいずれもここ
に開示されているような効果を有していないことに注目
すべきである。

【００３５】従って、本発明の非常に興味ある態様は、
実験動物を、ｕ−ＰＡＲの糖脂質アンカーを欠き、可溶
性ｕ−ＰＡＲの回収および精製した可溶性ｕ−ＰＡＲで
免疫して得られる請求項１または２記載の抗体である。

【００３６】従って、ハイブリドーマ細胞系１.Ｈ２.１
０Ａ３および１.Ｃ８.２６Ａ３によって産生されたモノ
クローナル抗体と同じｕ−ＰＡＲ上のエピトープに結合
する抗体はｕ−ＰＡ／ｕ−ＰＡＲ相互作用に、この２つ
の抗体と同じ効果を及ぼす多くの機会がある。すなわ
ち、このような抗体は本発明の非常に興味ある態様であ
る。

【００３７】ｕ−ＰＡＲの結合部位がもっぱらドメイン
１に存在するのでなく、むしろ、マルチドメイン結合部
位が存在し、本発明の抗体の結合によって影響を受け
る。実施例１からも理解されるように、ドメイン２およ
び３の除去はドメイン１の結合能力をかなり減少させ
る。従って、ドメイン１（および／または２および／ま
たは３）に結合し、それによって、可能性のあるマルチ
ドメイン結合部位の機能的な特徴に影響を与える抗体
は、本発明の抗体によって示される効果に似た効果を有
するものと考えられる。

【００３８】しかしながら、今日までの多くの実験的証
拠が結合部位の位置としてドメイン１を指示しており、
そして本発明の抗体がたとえドメイン２＋３と結合して
も、本発明の抗体によって示される効果が非常に注目す
べきであるから、この抗体の強力な阻害効果は、ドメイ
ン２＋３に結合しており、ドメイン１でないという事実
に帰されるべきであると考えられる。従って、ｕ−ＰＡ
Ｒのドメイン１のｕ−ＰＡ結合部位への実質的な結合を
示さない本発明の抗体は本発明の好ましい具体例であ
り、好ましくは抗体がｕ−ＰＡＲのドメイン１への結合
を示さないことである。当然、ｕ−ＰＡＲのドメイン２
および／または３に結合する抗体が特に好ましい。

【００３９】この抗体はまたｕ−ＰＡＲへの８−アニリ
ノ−１−ナフタレンスルホナート（ＡＮＳ）の結合（ｕ
−ＰＡによって測定し得る結合）を阻害し得る。その影
響は実施例に記載と同様にして、ｕ−ＰＡＲに結合した
ＡＮＳによって生じる蛍光の減少を測定することによっ
て判定することができる。この効果は、抗体が単にその
結合部位に到達するｕ−ＰＡの単純な立体障害によって
それらの効果を示していない証拠であると考えられる。
ＡＮＳが低分子量化合物であって、すなわち、このよう
な立体障害に対して非常に敏感でないからである。従っ
て、ｕ−ＰＡＲへのＡＮＳ結合を阻害し得る（そして既
述のようにドメイン２＋３と反応し得る）抗体はｕ−Ｐ
Ａ／ｕ−ＰＡＲ相互作用に対して強力な阻害を確実なも
のとする方法で結合する可能性は非常に強い。

【００４０】ｕ−ＰＡＲに結合しているときの抗体は、
実施例１定義したＡＮＳ検定（蛍光バックグラウンドの
補正を伴って）において、少なくとも５０％、例えば、
少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％および９５
％などの蛍光の減少に相当するｕ−ＰＡＲへの８−アニ
リノ−１−ナフタレンスルホナート（ＡＮＳ）の結合の
減少を生ぜしめ、ゆえに本発明の非常に重要な態様であ
る。

【００４１】本発明の抗体によるドメイン２＋３に及ぼ
す効果はｕ−ＰＡＲにすでに結合しているｕ−ＰＡの置
換を可能とし、既述のように、このことは治療的効果を
得るために患者に投与したとき、本発明の抗体が非常に
少量しか必要でないことにつながる。

【００４２】従って、本発明の抗体が実質的にｕ−ＰＡ
Ｒからｕ−ＰＡＲ結合ｕ−ＰＡを置換するならば、特に
興味がある。

【００４３】「実質的に置換」とは、ｕ−ＰＡＲに結合
したｕ−ＰＡを含み、実質的にｕ−ＰＡを含まないｕ−
ＰＡＲを含む系への抗体の付加が、分子０から出発する
抗体による滴定がある点でｕ−ＰＡＲからのｕ−ＰＡの
放出を導く効果を有することをいう。この系の分子の合
理的な高濃度（１ｍｇ／ｍｌ）において、ｕ−ＰＡＲお
よびｕ−ＰＡが等モル量で存在するとき効果が見られる
が、分子の濃度が高ければ、抗体の濃度も高くする必要
がある。

【００４４】上記から、本発明の抗体は、 １）ｕ−ＰＡＲとそれに結合するｕ−ＰＡが存在し、 ２）それに抗体を添加し、そして ３）抗体の付加の効果として、ｕ−ＰＡが置換される程
度が検定される 試験において、実質的にｕ−ＰＡを追放する抗体であ
り、最も関心を引く。

【００４５】さらに興味ある態様は、本発明の抗体の本
来のドメイン２＋３への上記の好ましい結合がｕ−ＰＡ
Ｒに対する抗体の非競合的結合をもたらすという事実に
基づくことである。従って、本発明の好ましい抗体は実
質的にｕ−ＰＡＲ結合ｕ−ＰＡをｕ−ＰＡＲから置換す
る抗体であり、ｕ−ＰＡが添加されたとき、ｕ−ＰＡＲ
から置換されない抗体である。従って、本発明の好まし
い態様の抗体は １）ｕ−ＰＡＲとそれに結合するｕ−ＰＡが存在し、 ２）それに抗体を添加し、そして ３）抗体の添加の効果として、ｕ−ＰＡが置換される程
度が検定される 試験において、実質的にｕ−ＰＡを置換し、 １）ｕ−ＰＡＲとそれに結合する抗体が存在し、 ２）それにｕ−ＰＡを添加し、そして ３）ｕ−ＰＡの添加の効果として、抗体が置換される程
度が検定される 試験において、実質的にｕ−ＰＡによって置換されない
抗体である。

【００４６】当然、ｕ−ＰＡに対するｕ−ＰＡＲの結合
の際の本発明の抗体の効果の評価における重要なパラメ
ーターはｕ−ＰＡ／ｕ−ＰＡＲ複合体の解離定数（この
定数は約１ ｎＭ以下の生理学的条件下での値である）
であり、ｕ−ＰＡおよびｕ−ＰＡＲの等モル濃度で、遊
離のｕ−ＰＡはほとんど観察されないことを意味する。
大巾にこの解離定数を変化させ得る本発明の抗体は、ｕ
−ＰＡＲへの抗体の結合が、完全なｕ−ＰＡＲの能力か
ら、生理学的条件において、同様にして、少なくとも５
０ｎＭ、好ましくは、少なくとも、２００ｎＭ、５００
ｎＭおよび１０００ｎＭ以上の少なくとも１００ｎＭの
解離定数に相当する能力まで、ｕ−ＰＡのｕ−ＰＡＲ結
合形態に結合するためのｕ−ＰＡＲの能力を変化させる
という点で、本発明の非常に興味ある態様である。

【００４７】ｕ−ＰＡ／ｕ−ＰＡＲ相互作用に対して有
効な阻害を及ぼす２個の抗体がここに開示されている
が、ドメイン２＋３上に他の結合部位が存在し、それに
抗体が結合したとき、それが、開示された抗体によって
影響されるのと似た方法でｕ−ＰＡＲ分子全体に作用す
るという可能性は高い。

【００４８】すなわち、ｕ−ＰＡＲへのｕ−ＰＡのｕ−
ＰＡＲ結合型の結合の阻害または対抗作用に関して、ｕ
−ＰＡＲに結合したとき、細胞系１.Ｈ２.１０Ａ３によ
って産生されるモノクローナル抗体または１.Ｃ８.２６
Ａ３によって産生されるモノクローナル抗体の結合と同
じか、または実質的に同じ効果を及ぼす抗体は、本発明
の抗体のうちでも特に興味のある態様である。当然なが
ら、本発明の抗体は、細胞系１.Ｈ２.１０Ａ３によって
産生されるモノクローナル抗体または細胞系１.Ｃ８.２
６Ａ３によって産生されるモノクローナル抗体が結合す
る部位に結合するか、またはその部位への結合がｕ−Ｐ
ＡＲへのｕ−ＰＡのｕ−ＰＡＲ結合型の結合を阻害に関
して、実質的に同じ効果を及ぼす部位に結合する抗体が
狭い意味の態様である。

【００４９】ＷＯ ９２／０７８３に開示したように、
ｕ−ＰＡＲに対するある種の抗体はｕ−ＰＡＲのある種
のグリコシル化変異体を認識することができ、それによ
って、明確なグリコシル化パターンでｕ−ＰＡＲを示す
ような、例えば、癌細胞を認識することが可能となる。
ｕ−ＰＡＲは重量のあるグリコシル化蛋白質であるか
ら、本発明の抗体のあるものはｕ−ＰＡＲ上のグリコシ
ル化パターンを識別するのと同じ能力を示す。従って、
本発明の重要な態様はｕ−ＰＡＲの特定のグリコシル化
変異体に選択的に結合する能力を有する抗体である。

【００５０】「選択的に結合」とは、抗体がグリコシル
化ｕ−ＰＡＲを表す少なくとも２群の細胞間で、好まし
くは１群を病的細胞であることを識別し得ることをい
う。

【００５１】本発明の抗体は、好ましくはハイブリドー
マ細胞系１.Ｃ８.２６Ａ３によって産生されるモノクロ
ーナル抗体またはハイブリドーマ細胞系１.Ｈ２.１０Ａ
３によって産生されるモノクローナル抗体と機能的に均
等であり、そして、抗体がｕ−ＰＡＲのドメイン２およ
び／または３と反応し、それによってａ）プロ−ｕ−Ｐ
Ａの結合と活性ｕ−ＰＡの結合、およびｂ）細胞表面プ
ラスミノーゲン活性化を阻害する。最後の効果は当然な
がら、プラスミンによる局所的組織分解を妨げなければ
ならない臨床的状態における重要な効果である。

【００５２】本発明の別の抗体を分離するために、スク
リーニングをして本発明に開示された抗体と同じ効果を
もたらす抗体を検索するのが実用的である。本発明の抗
体はより好ましい態様では、ｕ−ＰＡＲとハイブリドー
マ細胞系１.Ｃ８.２６Ａ３またはハイブリドーマ細胞系
１.Ｈ２.１０Ａ３によって産生されたモノクローナル抗
体との結合を競争し得る抗体、例えば、開示された２つ
の抗体が結合するのと同じエピトープと最も結合しそう
な抗体である。

【００５３】本発明の抗体のあるものはｕ−ＰＡＲのド
メイン２＋３に結合し得るので、これらの抗体が遊離の
ｕ−ＰＡＲおよびｕ−ＰＡとｕ−ＰＡＲとの複合体のい
ずれとも反応し得るのはあり得ることである；この効果
は、本発明の抗体がｕ−ＰＡＲから結合ｕ−ＰＡを置換
し得るかどうかを判定する場合の有効であることが理解
されるであろう。本発明の抗体が患者に投与されたと
き、免疫学的反応などの不利な作用を示さないのは言う
までもない；従って、このような抗体が好ましいもので
ある（弱免疫原に関する下記の考察参照）。

【００５４】好ましくは、モノクローナル抗体（ケラー
(Kohler)およびミルスタイン(Milstein)(１９７５)、ネ
イチャー１５６、４９５−４９７）またはそれらの誘導
体は本発明の診断および治療の目的に用いられ、従っ
て、モノクローナル抗体は特に好ましい。本発明におい
て、ｕ−ＰＡＲのドメイン２＋３上のエピトープに対す
るモノクローナル抗体が提供される。

【００５５】上記したように、この２つの抗体は本発明
の発明者によって調製され、またこれらは本発明の非常
に重要な部分である。このモノクローナル抗体は：ハイ
ブリドーマ細胞系１.Ｃ８.２６Ａ３によって産生され、
ブタペスト条約の条項および条件のもとに受託番号ＤＳ
Ｍ ＡＣＣ２１７９として、１９９４年７月７日付でＤ
ＳＭに寄託され、ハイブリドーマ細胞系１.Ｈ２.１０Ａ
３によって産生されたモノクローナル抗体は、ブタペス
ト条約の条項および条件のもとに受託番号ＤＳＭ ＡＣ
Ｃ２１７８として、１９９４年７月７日付でＤＳＭに寄
託された。

【００５６】当然、これらの抗体の免疫学的均等物の活
性フラグメントも興味あるものである。

【００５７】ポリクローナル抗体は本発明のモノクロー
ナル抗体が結合するエピトープで免疫化することによっ
て調製し得るから、ポクローナル抗体もまた本発明に含
まれることが理解されるであろう。

【００５８】開示された本発明のモノクローナル抗体は
上記のように、ｕ−ＰＡＲへのｕ−ＰＡ結合に対する効
果によって、治療剤として非常に有効である。しかしな
がら、従来から知られているように、モノクローナル抗
体でさえ、多分、他の分子へのなんらかの非特異的結合
を示し、非特異性の程度は、ｕ−ＰＡＲ以外の蛋白質へ
本発明の抗体の結合能力によって定義される。この非特
異的結合は、本発明の抗体が腫瘍治療またはインビボの
診断に用いられたとき、正常細胞に大きな損傷を生じさ
せないことを保証する程度に小さいものでなければなら
ない。これと同じ理由から、抗体（または均等なｕ−Ｐ
ＡＲへ結合およびｕ−ＰＡＲへのｕ−ＰＡ結合に対する
効果を示す免疫学的均等物）は、例えば、罹病していな
い細胞ではなく、罹病している細胞に存在するｕ−ＰＡ
Ｒの変化（例えば、２種類のｕ−ＰＡＲのグリコシル化
の態様における違い；ＷＯ ９２／０７０８３参照）に
対して選択的であるかの観点から選ぶべきであることを
強調すべきである。

【００５９】抗体は、適切な方法で蛋白質と結合してい
る限り、完全な抗体、そのフラグメント（例えば、Ｆ
Ｖ、(ＦＶ)₂、Ｆab、Ｆab'、Ｆ(ab)₂）、キメラ、ひと
化またはひと抗体として用いることができる。ペプチド
との特異的結合を行うＣＤＲ領域またはそれらの部分の
みを含む短鎖抗体フラグメントもまた、特に抗体が標識
されたものであるときは、好ましい。

【００６０】ここで、抗体は悪性疾病の治療のために全
体として用いられ得る（ヘイル（Hale）ら、Lancet ２
（１９８８）１９３４−１３９９；コボルト(Cobbold)
ら、Prog. Clin．Biol. Res.(１９９０)３３３，１３９
−１５１）。別の取り上げ方として、抗体およびその部
分は毒素分子（免疫毒）と結合または翻訳的に融合さ
れ、腫瘍細胞の特異的致死をもたらす（ブリンクマン(B
rinkmann)ら、１９９１、Proc. Natl. Acad. Sci. USA
８８, ８６１６−８６２０；パスタン（Pastan）ら、
(１９９１)、Cancer Res. ５１，３７８１−３７８７；
フィッツジェラルト（FitzGerald）およびパスタン（Pa
stan)(１９８９)、J. Natl. Cancer Inst.８１，１４５
５−１４６１）。本発明の他の好ましい具体例は、二特
異的抗体を腫瘍治療に用いるものであり（ボニノ(Bonin
o)ら、（１９９２）、ＢＦＥ９，７１９−７２３）、こ
れはポリペプチド鎖のインビトロ再結合、雑種ハイブリ
ドーマの調製または二抗体（diabodies）の構築（ホリ
ンガー(Hollinger)ら、１９３３、Proc. Natl. Acad. U
SA ９０，６４４４−６４４８；ホリンガーおよびウイ
ンター(Winter)（１９９３）、Current Opin. Biotechn
ol. ４，４４６−４４９）によって構築することができ
る。

【００６１】さらに、放射性また蛍光物質と結合した抗
体は、呼吸器系、胃腸および腎臓系の腫瘍および眼また
は皮膚の癌の検出および処置のために好ましいものであ
る。（プロフィオ(Profio)１９８９、Proc. Soc. Photo
opt. Instr. Eng. ９０７，１５０−１５６；イヤング
(Jiang)ら、（１９９１）、J. Natl. Cancer Inst.８
３，１２１８−１２２５ ）。

【００６２】免疫応答阻止のために、ひと由来の抗体に
できるだけ良くにている抗体を用いることが好ましい
（GlassyおよびDillman, Mol. Biother. １,７−１３
（１９８９））。例えば、このような抗体はキメラまた
はひと化（ＣＤＲ−グラフトされた）抗体である。この
ような抗体は通常、ねずみモノクローナル抗体から製造
される（例えば、概説としては、Morrison (１９９２),
Annu. Rev. Immunol. １０， ２３９−２６５； Wint
erおよびMilstone (１９９１)，Nature ３４９，２９３
−２９９参照）。本発明の特に好ましい具体例では、腫
瘍特異的ひと抗体（Borrebaeckら、(１９８８), Proc.
Natl. Acad. Sci. USA ８５，３９９５−３９９９;Borr
ebaeckら、Immunol. Today ９，３５５−３５９)が治療
目的に使用される。さらに、Griffithら、EMBO J. １２
（１９９３）７２５−７３４に記載されているように、
ファージ・ディスプレイ・ライブラリーを経てひとＭａ
ｂを産生させるのが好ましい。

【００６３】ＵＳ４１３２７６８に開示されているぶた
抗体もまたひとには非免疫原性かまたは非常に弱い免疫
原性である。

【００６４】治療目的のためにエフェクター機能を有す
る抗体を用いることが特に好ましい（ＡＤＣＣ，ＣＤ
Ｃ）（Bruggemannら、J. Exp. Med. １６６（１９８
７）１３５７−１３６１）。特に好ましくは、ひと同位
体ＩｇＧ１抗体を用いられる。免疫毒に関して、本発明
の抗体を、好ましくは、例えば、シュードモナス属菌外
毒素、ジフテリア毒素または他の毒素に結合させる（Fi
tzGerald and Pastan(1989)）。また、この抗体を、好
ましくは、例えば、ドキソルビシンなどの化学療法剤、
または、細胞毒作用を有する放射性標識物質に結合させ
る。従って、この抗体は放射活性化合物に結合させるこ
とができ、それによって標的放射線治療を行うことがで
きる。放射活性の結合相手の１つの例は適当なテクネチ
ウム同位体である。

【００６５】本発明の抗体、特にひと抗体のコンジュゲ
ートは、例えば、放射活性または蛍光物質を用いるイン
ビボ画像のためにも好ましいものである。

【００６６】本発明の治療化合物は、製薬技術として公
知の剤型を用いて、脈管内、腹腔内、皮下、筋肉内投与
ができる。本発明の活性医薬成分は、液体、粉末または
凍結乾燥の剤型で使用することができ、水、塩類溶液、
水性デキストロース、水性緩衝液などの適当な希釈剤ま
たは担体とともに組み合わせることができる。保存剤も
また添加できる。

【００６７】選択される投与経路に関係なく、本発明の
化合物は当業者に公知の通常の方法を用いて製薬学的に
許容され得る投与形態に処方し得る。この化合物はまた
薬理学的に許容され得る酸または塩の付加塩を用いて処
方し得る。さらに、これらの塩化合物は適当な水和形態
でも用いられる。

【００６８】選択される投与経路に関係なく、１種また
はそれ以上の本発明の化合物は、いずれの処置にも、毒
性はないが治療的有効量を用いる。処置のための投与法
は患者の病型、年令、体重、性別および医学的症状、腫
瘍の類型、投与経路および処置に用いられる具体的な化
合物を含む種々の要素によって選択される。平均的知識
を有する医師は、公知の抗体治療法として必要とされる
薬物の有効量を容易に決定し、処方することができる
（Hale(１９８８)、Cobbold(１９９０)）。そのような
処置において、医師は最初は比較的少量の投与量で、つ
いで最高の効果が得られるまで投与量を増加させること
ができる。

【００６９】本発明のモノクローナル抗体（およびｕ−
ＰＡＲに対する結合およびｕ−ＰＡ／ｕ−ＰＡＲ相互作
用に対する影響に関して同様の効果を示す免疫学的均等
物）の重要な利用の１つは、ｕ−ＰＡ／ｕ−ＰＡＲ相互
作用の強力な阻害、すなわち、癌における強力な抗−侵
潤、抗−転移効果およびｕ−ＰＡ／ｕ−ＰＡＲ相互作用
が関与する他の疾患ついて、他の抗体またはフラグメン
トまたはそれらの免疫学的均等物のスクリーニングのた
めの手段としてである。

【００７０】上記のように、本発明の抗体と同じ特徴を
もつ抗体のためのスクリーニングは本発明の重要な部分
である。事実、本発明の抗体のスクリーニング法はま
た、下記の疾患および病気の処置法の非常に重要な部分
である。

【００７１】このスクリーニングは２段階で行われる。
第１に、当該抗体、フラグメントまたは免疫学的均等物
が上記の結合、すなわち、好ましくはドメイン２および
／または３への選択的結合を示すことを立証することで
ある。第２に、抗体がｕ−ＰＡ／ｕ−ＰＡＲ相互作用に
対して効果を有することを立証することである。

【００７２】すなわち、本発明の抗体は次のような工程
を行うことによって得られる抗体である： ａ）抗体（Ｂ）を供給し、 ｂ）抗体（Ｂ）がｕ−ＰＡＲに結合することを立証し、 ｃ）抗体（Ｂ）がｕ−ＰＡＲのドメインＩのｕ−ＰＡ結
合部位に結合しないことを立証し、 ｄ）抗体（Ｂ）が少なくとも１分子、多くてもｕ−ＰＡ
とｕ−ＰＡＲ分子の総数の１０⁵倍の抗体（Ｂ）分子の
数にて、ｕ−ＰＡＲからｕ−ＰＡを実質的に置換させ得
ることを立証する。

【００７３】実施例２に詳細に記載されている操作がこ
の操作であることが理解されるであろう。

【００７４】上記の検討から、本発明の抗体は好ましく
は、非競合的方法でｕ−ＰＡと結合し、従って、ｕ−Ｐ
Ａは、ｕ−ＰＡＲから少なくとも１分子、多くてもｕ−
ＰＡとｕ−ＰＡＲ分子の総数の１０⁵倍の抗体（Ｂ）分
子の数にて、抗体からｕ−ＰＡＲを移動させることがで
きない。

【００７５】開示された抗体の有益な効果の原因に関す
る上記の検討によれば、本発明の抗体は、ｕ−ＰＡＲの
可溶性形態、好ましくは、実施例に用いられている組換
え体に対して得られた抗体である。しかしながら、完全
なｕ−ＰＡＲに対して得られた抗体のある種のものが同
じ効果をもつことは信じられないことではなく、これら
は当然、本発明の一部である。

【００７６】ｕ−ＰＡＲのグリコシル化のパターンが重
要であることが予想できるので、検定（および免疫化計
画）に用いられるｕ−ＰＡＲは真核細胞、好ましくは可
溶性形態が得られる組換え細胞中で産生するｕ−ＰＡＲ
分子であることが好ましい。しかしながら、もし、特に
ｕ−ＰＡＲのグリコシル化があまり重要でないことが証
明され、またもし適切な再おりたたみが行われ得るなら
ば（原核細胞産生蛋白質は、適当な立体構造に再おりた
たみが非常に困難な封入体として存在することが知られ
いる）、原核細胞中での産生が可能であり得る。従っ
て、ｕ−ＰＡＲは原核細胞でもまた産生され得る。

【００７７】所望の効果が既に知られている（例えば、
ここに開示のモノクローナル抗体の１種）場合に、人は
単に公知の抗体と候補の抗体、フラグメントまたは免疫
学的均等物の間でのｕ−ＰＡＲへの結合の競合を検討す
るものである。

【００７８】本発明の抗体（Ｂ）は、つぎのような工程
を行うことによって得られ得る： ａ）抗体（Ｂ）を供給し、 ｂ）抗体（Ｂ）が少なくとも１分子、多くてもｕ−ＰＡ
とｕ−ＰＡＲ分子の総数の１０⁵倍の数にて、ｕ−ＰＡ
Ｒからｕ−ＰＡを実質的に置換させ得ることを立証し、 ｃ）抗体（Ｂ）が少なくとも１分子、多くても抗体
（Ａ）分子とｕ−ＰＡＲ分子の総数の１０⁵倍の数に
て、ｕ−ＰＡＲから請求項のいずれか１項記載の抗体
（Ａ）を実質的に置換させ得ることを立証する。

【００７９】同じエピトープに結合する抗体を見付ける
方法に関する上記の考察によれば、上記の検定は、少な
くとも１分子、多くても抗体（Ｂ）とｕ−ＰＡＲ分子の
総数の１０⁵倍の数にて、ｕ−ＰＡＲから本発明の抗体
（Ａ）によって、置換され得るかどうかを立証すること
によって補足され得、さらに、抗体が、少なくとも１分
子、多くても抗体（Ｂ）分子とｕ−ＰＡＲ分子の総数の
１０⁵倍のｕ−ＰＡの分子の数にて、ｕ−ＰＡによって
ｕ−ＰＡＲから置換され得ないことを立証することによ
って、抗体（Ｂ）とｕ−ＰＡとの相互作用は非競合的で
あることを証明し得る。

【００８０】この検定における抗体（Ａ）は本発明のモ
ノクローナル抗体であり、好ましくは細胞系１.Ｃ８.２
６Ａ３および１.Ｈ２.１０Ａ３の１種によって産生され
るモノクローナル抗体である。

【００８１】抗体／ｕ−ＰＡＲの相互作用の上記の特徴
が立証されたとき、さらに厳密にｕ−ＰＡ／ｕ−ＰＡＲ
相互作用に対する候補の抗体の効果を検討する必要があ
る。

【００８２】これは、固定化ｕ−ＰＡＲおよび可溶化ｕ
−ＰＡからなる系にこの抗体を添加し、ｕ−ＰＡＲに結
合したｕ−ＰＡを、標識されるか、または標識された抗
−ｕ−ＰＡｎ抗体によって検出するか、または、固定化
ｕ−ＰＡおよび可溶化ｕ−ＰＡＲからなる系にこの抗体
を添加し、ｕ−ＰＡに結合したｕ−ＰＡＲを、標識され
るか、または標識抗−ｕ−ＰＡＲ抗体によって検出する
ことによって、この抗体によるｕ−ＰＡ／ｕ−ＰＡＲ相
互作用の阻害の可能性を測定するというスクリーニング
法によって行われ得る。

【００８３】この検定法の１例として、ｕ−ＰＡＲを捕
捉するためのｕ−ＰＡＲに対する固定化モノクローナル
抗体を用い、ついで、ｕ−ＰＡＲ結合ｕ−ＰＡおよびそ
れらに対する当該抗体の妨害の可能性を測定し、受容体
結合ｕ−ＰＡを例えば、ビオチンで標識された、標識抗
ｕ−ＰＡｎ抗体によって検出するという非常に実際的な
ＥＬＩＳＡスクリーニング法を用いる。

【００８４】抗体が上記の簡単なかつ迅速なスクリーニ
ング中で陽性である場合、抗体によるｕ−ＰＡ／ｕ−Ｐ
ＡＲ相互作用の阻害の可能性を、ｕ−ＰＡＲおよび放射
性標識ｕ−ＰＡまたはそれらの誘導体を含む系に抗体を
添加し、ｕ−ＰＡに結合したｕ−ＰＡＲを架橋反応さ
せ、架橋生成物をＳＤＳ ＰＡＧＥおよびオートラジオ
グラフィーによって検出して測定するより実験室的な検
定でさらに適切に試験する。この検定での陽性の結果は
この抗体がまさにｕ−ＰＡ／ｕ−ＰＡＲ結合を阻害する
ことを確認するものである。

【００８５】通常、次の段階は、上記の検定において陽
性にｕ−ＰＡ／ｕ−ＰＡＲ相互作用を阻害することが判
明した抗体を、放射性標識ｕ−ＰＡまたはその誘導体お
よびｕ−ＰＡＲを担持している細胞の系に添加し、ｕ−
ＰＡＲに結合するｕ−ＰＡまたはその誘導体を細胞のガ
ンマ線計数によって検出することによる、培養細胞の表
面上でｕ−ＰＡ／ｕ−ＰＡＲの結合の阻害の可能性を判
断する検定にかける。上記の検定での陽性の結果は、前
の検定で判明したｕ−ＰＡ／ｕ−ＰＡＲ結合の阻害は、
可溶性ｕ−ＰＡＲの使用に関連させると人工品ではない
が、臨床的状態でもそうであるように、ｕ−ＰＡＲが細
胞表面に結合したときに得られることを示すものであ
る。

【００８６】ｕ−ＰＡ／ｕ−ＰＡＲ相互作用を阻害する
目的は生物学的環境におけるｕ−ＰＡ酵素活性を阻害す
ることである。これは、ｕ−ＰＡＲ担持細胞に抗体を添
加し、その後ｐｒｏ−ｕ−ＰＡを添加、細胞表面のプラ
スミン生成の測定を行うことによって、受容体結合外来
性ｐｒｏ−ｕ−ＰＡによる細胞表面プラスミノーゲン活
性化の阻害の可能性を測定する検定で直接試験すること
ができる。外来性添加ｕ−ＰＡを伴う状態は、例えば、
結腸腺癌などのある種の癌の状態に類似しており、この
状態での癌細胞はｕ−ＰＡＲを産生、含有しているが、
ｕ−ＰＡは腫瘍支質中の隣接する非罹患細胞によって産
生される。

【００８７】しかしながら、例えば、鱗状上皮腫瘍のよ
うなある種の癌においては、癌細胞自体がｕ−ＰＡおよ
びｕ−ＰＡＲの両方を産生する。この状態では、ｕ−Ｐ
Ａ／ｕ−ＰＡＲ相互作用の阻害は２つの要素が異なる細
胞によって細胞されるときよりもっと困難である。所与
の抗体がこれらの環境においてｕ−ＰＡ／ｕ−ＰＡＲ相
互作用を阻害し得るかどうかを試験するために、ｕ−Ｐ
ＡＲ担持し、ｐｒｏ−ｕ−ＰＡを産生する細胞を抗体と
ともにインキュベートし、ついで細胞表面上のプラスミ
ン生成を測定することによって、受容体−結合内因性ｐ
ｒｏ−ｕ−ＰＡによる細胞表面プラスミノーゲンの阻害
の可能性を測定する検定を用いる。

【００８８】動物実験における侵入および転移に対する
ｕ−ＰＡ／ｕ−ＰＡＲ相互作用を阻害する抗体の効果の
研究における固有の問題は、ｕ−ＰＡ／ｕ−ＰＡＲ相互
作用における種−特異性である。従って、ひとにおい
て、ｕ−ＰＡ／ｕ−ＰＡＲ相互作用を阻害する抗体は、
マウスのような実験動物において必ずしもｕ−ＰＡ／ｕ
−ＰＡＲ相互作用を阻害しない。この問題は、モノクロ
ーナル抗体がｕ−ＰＡ／ｕ−ＰＡＲ相互作用を阻害する
抗体として用いられるときにさらに厄介である。なぜな
ら、ひとｕ−ＰＡＲに対するマウスモノクローナル抗体
はマウスｕ−ＰＡＲとは反応しないからである。従っ
て、ヌードマウスに接種されたひと癌細胞の侵入および
転移が容易に検出され得る本発明の方法が開発されたの
である。従来のヌードマウスに接種されたひと癌細胞は
規則正しく侵入および転移しない。本発明では、数種の
癌細胞系が実質的にすべての細胞で侵入し、転移してい
る、ｎｕ／ｎｕＭＥＴＡ／Ｂｏｍと称されるヌードマウ
スの亜株が確認された。さらに、本発明では、マウスに
接種されたひと癌細胞は、接種前に、β−ガラクトシダ
ーゼ酵素をコードするｌａｃＺ遺伝子で形質導入されて
いた。この酵素は、基質Ｘ−ｇａｌで処理したとき、青
色に発色する。すなわち、この方法はひと癌細胞とマウ
ス自体の細胞間に明らかな色の違いを生じさせ、それに
よって、侵入細胞および転移の検出および定量を著しく
容易にする方法である。ＷＯ９２／０７８３の実施例９
記載の実験では、このマウスモデルにおいて癌細胞の侵
入および転移がｕ−ＰＡおよびｕ−ＰＡＲの両方を産生
させることが判明した。さらに、ｕ−ＰＡに対するモノ
クローナル抗体の投与によって、細胞表面プラスミン生
成を阻害し、それらの侵入および転移がほぼ完全に阻害
され得ることが判明した。ｐｒｏ−ｕ−ＰＡの受容体結
合の阻害がまたプラスミン生成を阻害するという上記の
知見とともに、これは、ｕ−ＰＡおよびｕ−ＰＡＲの両
方を産生する細胞上のｕ−ＰＡ／ｕ−ＰＡＲ相互作用を
効果的に阻害する抗体は同時にヌードマウスモデルにお
いて、侵入および転移を阻害し得ることを示すものであ
る。

【００８９】マウスがｕ−ＰＡおよびｕ−ＰＡＲの両方
を産生するひと癌細胞で接種されるモデルに加えて、多
数の他のモデルも興味あるものである。例えば、１種は
ｕ−ＰＡを産生し、他はｕ−ＰＡＲを産生する２種類の
癌細胞が接種されるモデルは、２つの成分が２種の異な
る種類の細胞中に生じる臨床的状態をシミュレートする
ものである。第３の興味ある態様は、ｕ−ＰＡＲを産生
するひと癌細胞をｕ−ＰＡを産生するひと腫瘍−侵潤線
維芽細胞とともに接種されるものである。

【００９０】これらのヌードマウスモデルにおいて侵入
および転移を阻害することが判明したｕ−ＰＡ／ｕ−Ｐ
ＡＲ相互作用阻害抗体は、ｕ−ＰＡ／ｕ−ＰＡＲ相互作
用が侵入および転移にとって決定的であると考えられて
いるひと癌の種類、例えば、結腸上皮腫瘍、乳腺管癌お
よび鱗状上皮腫瘍において、抗−侵入性、抗−転移性で
ある可能性がある。従って、このような化合物は、有効
な抗−侵入および抗−転移薬物の有力候補なのだから、
動物での適当な毒性試験の後、さらに、第１相および第
２相臨床試験で検討されるべきである。

【００９１】これまで知られていなかったｕ−ＰＡ置換
作用を有する抗体のためのスクリーニングの上記の方法
はまた本発明の抗体の重要な用途を構成することが理解
されるであろう。さらに、このような抗体の同定のため
のスクリーニング検定法は、ｕ−ＰＡ／ｕ−ＰＡＲ相互
作用に影響を与え得る抗体の同定および／または選択の
ための本発明の重要な方法である。

【００９２】本発明の最も重要な態様は、当然、ひとを
含む哺乳類における局在化蛋白分解活性を阻害または対
抗するための方法であって、上記の活性フラグメントま
たは上記抗体の免疫学的均等物を含む本発明の抗体の少
なくとも１種の有効量を動物に投与し、それによって、
ｕ−ＰＡＲへのｕ−ＰＡの受容体結合様式の結合を阻害
またはに対抗する方法である。

【００９３】上記の考察を背景として、この方法がプラ
スミン活性による局所組織破壊を含む疾患および症状、
例えば、腫瘍性悪性疾患の制圧に最も有効に寄与するこ
とが理解されるであろう。

【００９４】ｕ−ＰＡＲへのｕ−ＰＡの受容体結合様式
の結合を阻害またはに対抗することによって、ひとを含
む哺乳類における局在化蛋白分解活性を阻害または対抗
する原理の治療的または予防的利用のより詳細な考察
は、上記のＷＯ９０／１２０９１およびＷＯ９２／０７
８３に記載されており、そこにはまた、この原理の非−
悪性疾患の処置にも利用する方法も検討されている。プ
ラスミノーゲンのプラスミンへの変換に関連する良性疾
患または症状として、リューマチ性関節炎、潰瘍性大腸
炎、乾癬、創傷治療、アテローム性動脈硬化または外傷
後動脈狭窄などの血栓崩壊障害または疾患を上げること
ができる。

【００９５】本発明の別の態様は試料中のｕ−ＰＡＲを
検出または定量のための方法である。この検出または定
量はｕ−ＰＡＲがｕ−ＰＡに結合するかどうかとは実質
的には関係のないものであり、その活性フラグメントを
含む本発明の抗体を捕捉抗体または検出抗体、またはそ
の両方に用いるものである。この方法において、その原
理はＷＯ９２／０７８３で詳細に開示されているが、捕
捉抗体はポリクローナル抗体であり、検出抗体はモノク
ローナル抗体であってもよいか、または捕捉抗体はモノ
クローナル抗体であり、検出抗体はポリクローナル抗体
であってもよいか、または捕捉抗体および検出抗体の両
方がポリクローナル抗体であり、捕捉抗体および検出抗
体の両方がモノクローナル抗体である。本発明のこの態
様の他の詳細は下記から明らかである：

【００９６】本発明の具体例の１つは、試料中のｕ−Ｐ
ＡＲとｕ−ＰＡの複合体を検出および定量する方法であ
り、捕捉または検出抗体として本発明の抗体とともに、
検出または捕捉抗体としてそれぞれ結合ｕ−ＰＡまたは
ｐｒｏ−ｕ−ＰＡを検出する抗体を用いる方法である。
捕捉または検出抗体はポリクローナルまたはモノクロー
ナル抗体であってもよい。検出抗体は検出標識を有して
いることが好ましい。特に、本発明は組織切片中のｕ−
ＰＡＲの免疫学的検出法に関する。

【００９７】本発明のさらなる具体例は、試料中のｕ−
ＰＡＲのグリコシル化誘導体の検出または定量法であっ
て、検出抗体としてこの誘導体に専らまたは優先的に結
合する本発明の抗体を用いる方法、特にｕ−ＰＡＲのグ
リコシル化誘導体が特定の型の腫瘍細胞に特有の誘導体
である方法に関する。

【００９８】本発明の方法に用いられる試料は、癌患者
または癌の疑いのある患者からの血清、血漿または尿で
あってもよく、特に癌の組織または癌の疑いのある組織
からの抽出物である。試料はまた、リューマチ性関節
炎、潰瘍性大腸炎または乾癬などの組織破壊が関連する
良性疾患の患者またはその疑いのある患者から採取して
もよい。本発明はまた、表面にｕ−ＰＡＲを含む細胞の
診断を目的とし得る診断薬の製造方法であって、診断薬
を本発明の抗体に結合させるものである。この診断薬は
さらに、例えば、テクネチウムなどの放射活性物質また
は免疫毒性物質を含んでいてもよく、癌にかかっている
かまたは癌の疑いのある哺乳類の診断に有効である。

【００９９】本発明の別の態様は、哺乳類、特にひとの
蛋白分解活性を阻害またはに対抗するための組成物の製
造のための本発明の抗体の使用であり、哺乳類における
ｕ−ＰＡのｕ−ＰＡＲへの受容体結合様式での結合の阻
害によるプラスミンへのプラスミノーゲンの活性化を阻
害すことによるものである。

【０１００】本発明の別の態様は、患者の単核細胞およ
び顆粒球上のｕ−ＰＡＲ濃度減少の検出による発作性夜
行性ヘモグロビン尿の診断または予後観察のための活性
フラグメントまたはその免疫学的均等物を含むここに記
載の抗体の使用である。

【０１０１】最後に、本発明の抗体は癌の診断または予
後観察に非常に有用である。この使用では、抗体はＷＯ
９０／１２０１およびＷＯ９２／０７８３に記載の方法
と同じかまたは類似の方法で用いられ、これに関して
は、ＷＯ９０／１２０１およびＷＯ９２／０７８３の当
該使用の詳細な開示を参照。

【０１０２】Ｆｉｇ.１：完全なｕ−ＰＡＲ、キモトリ
プシンの種々の濃度で処理されたｕ−ＰＡＲの量的変化
によるＵ９３７細胞への¹²⁵Ｉ標識ＡＴＦの結合阻害。
Ｕ９３７細胞は、種々の濃度の完全なｕ−ＰＡＲ（■）
または、第２図の説明に記載のモル比１：１００００
（◆）、１：１０００（▲）、１：１００（▼）のキモ
トリプシン処理ｕ−ＰＡＲとともにインキュベートされ
た。ついで、この細胞は¹²⁵Ｉ−標識ＡＴＦとともにイ
ンキュベートされ、過剰量のｕ−ＰＡＲによる非競合的
でないカウントを引き算した後の特異的ＡＴＦ結合を測
定した（この非−特異的結合は総ＡＴＦ結合の１０％を
決して超えない）。３連の測定値の平均値を添加ｕ−Ｐ
ＡＲの不存在下のＡＴＦ結合の百分率として示した。

【０１０３】Ｆｉｇ.２：ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルおよび
化学的架橋により測定された完全およびキモトリプシン
処理ｕ−ＰＡＲの分子分析。Ａ図は、ＰＢＳ単独（レー
ン１）または、酵素：基質＝１：１００００（レーン
２）、１：１０００（レーン３）または１：１００（レ
ーン４）のいずれかの比でキモトリプシンの存在下、ｕ
−ＰＡＲを２５℃にて１時間にてインキュベートしたｕ
−ＰＡＲのクーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（１２
％Ｔおよび２.５％Ｃ）を示す。反応は２ｍＭフェニル
メチルスルホニルフルオリドを添加して終了させた。試
料を還元し、アルキル化し、それぞれ約４μｇを用い
た。ｕ−ＰＡＲＩおよびｕ−ＰＡＲＩ’で示されるバン
ドの同定は、レーザー脱着質量分析により、それぞれ１
−８７および１−５７の残基であることが判明した。Ｂ
およびＣ図は、Ａ図に記載の試料と同じであるが、ｕ−
ＰＡＲの２種の異なる濃度−０.１ｎＭ（Ｂ図）および
１０ｎＭ（Ｃ図）で２ｎＭ¹²⁵Ｉ−標識ＡＴＦに化学的
架橋反応させたもののＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのオートラ
ジオグラムを示す。

【０１０４】Ｆｉｇ.３：キモトリプシン対完全ｕ−Ｐ
ＡＲの紫外線吸収差スペクトル。この紫外線差スペクト
ルは、３０分間、１：１０００のモル比のキモトリプシ
ンの処理により得られたものを示す。

【０１０５】Ｆｉｇ.４：キモトリプシンによりＴｒｙ
⁸⁷以後が開裂し、それによりドメインIIおよびIIIから
ドメインＩが分離した後のｕ−ＰＡＲのＡＮＳ蛍光特性
の変化。２μＭ ｕ−ＰＡＲについて最初のスペクトル
を記録（曲線１）後、試料を０.４ｎＭキモトリプシン
で３時間３７℃にて処理し、開裂ｕ−ＰＡＲの第２スペ
クトルを記録（曲線２）した。対照の緩衝液は、１０μ
Ｍ ＡＮＳを含むＰＢＳ（曲線３）である。挿入図、キ
モトリプシン開裂の前（レーン１）および後（レーン
２）のｕ−ＰＡＲ５μｇのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％Ｔ
および２.５％Ｃ）であり、試料は還元されアルキル化
された。少量の「自己分解」が模擬処理対照試料で観察
された（Ａｒｇ⁵⁸およびＡｒｇ⁸⁹の後の開裂−レーザー
脱着質量分析により測定した）。

【０１０６】Ｆｉｇ.５：ＡＮＳによるｕ−ＰＡＲの蛍
光分析。ＡＮＳによる種々の濃度のｕ−ＰＡＲ（▲２.
５μＭ、●５.３μＭ、■１０.１μＭ、□６８μＭ）の
分析を主図に示した。蛍光強度は、「材料および方法」
に記載したように希釈、非結合ＡＮＳからのバックグラ
ウンドおよび内部フィルター効果について補正した。挿
入図はこれらのデータのスキャッチャード変換を示し、
これから、ＡＮＳ結合の化学量論および親和性が計算さ
れた。

【０１０７】Ｆｉｇ.６：ＡＮＳ蛍光度により観察され
たｕ−ＰＡおよびｕ−ＰＡ間の相互作用。ＡＮＳの発光
スペクトルはいずれも２μＭｕ−ＰＡＲ単独（曲線
１）、または２μＭのｐｒｏ−ＰＡ、ＡＴＦまたはＧＦ
Ｄ（曲線２）および４μＭ ＧＦＤ（曲線２ｂ）、およ
び８μＭ ＧＦＤ（曲線２ｃ）の存在下で記録した。ま
た、いずれも２μＭリガンド単独（曲線３）および緩衝
液対照（曲線４）のスペクトルを示す。追加のリガンド
の容量は１０μｌ（総量の２.５％）を超えることはな
かった。

【０１０８】Ｆｉｇ.７：モノクローナル抗体によるＡ
ＮＳ−蛍光度依存性ｕ−ＰＡＲの滴定。ＡＮＳ−蛍光度
を漸増濃度の３種のモノクローナル抗体、Ｒ２（▼）、
Ｒ３（■）およびＲ５（●）を含む２μＭのｕ−ＰＡＲ
について、３８６ｎｍおよび４７０ｎｍに設定した励起
および発光波長をそれぞれ測定した。抗体２μＭの最高
濃度で、ｐｒｏ−ｕ−ＰＡを添加した（それぞれ中抜き
記号で示す）。提示のＡＮＳ−像は緩衝液希釈および各
モノクローナル抗体の固有の蛍光度からの寄与について
補正した。

【０１０９】Ｆｉｇ.８：グアニジン塩酸塩がｕ−ＰＡ
ＲへのＡＮＳおよびｐｒｏ−ｕ−ＰＡの結合を妨害す
る。ＡＮＳ蛍光発光を４７０ｎｍにて（３８６ｎｍにて
励起）、５０ｍＭトリスｐＨ７.５、０.１Ｍ ＮａＣｌ
中に溶解させた漸増濃度のグアニジン塩酸塩を含む２μ
Ｍ ｕ−ＰＡＲの存在下で観察した（△−△）。２μＭ
ｐｒｏ−ｕ−ＰＡを添加後、蛍光度を再び測定し
（▲）、ついで、各グアニジン塩酸塩溶液を用いて５０
０μｌ／分で操作するSuperdex^TM２００ ＨＲ１０／３
０のカラム（ファルマシア）を用いて、試料をＨＰＬＣ
ゲル排除クロマトグラフィーにかけた。２分子複合体に
おけるｕ−ＰＡおよびｕ−ＰＡＲ関与を単量体および二
量体分子に相当するピークの高さから計算した（●）。
単量体ｕ−ＰＡおよびｕ−ＰＡＲは殆どおなじ流体力学
的容積であるから、それらはゲル濾過分析では共溶出さ
れる。

【０１１０】

【実施例】

実施例１ ｕ−ＰＡとｕ−ＰＡＲおよびその蛋白質分解誘導体の間
の相互作用。 材料および方法 化学物質および試薬。８−アニリノ−１−ナフタレンス
ルホン酸(ＡＮＳ)はシグマ(ミズーリ州、セントルイス)
からであり、水中１００mg／mlの保存溶液として貯蔵
し、そのモル濃度をε₃₈₆＝３９８５Ｍ^-1cm^-1を使用し
て分光光度により測定した。グアニジン塩酸塩はブリテ
ィッシュ・ドラッグ・ハウス(British Drug House)(イ
ギリス、プーレ)のアリスター(ARISTAR)(商標)グレード
であった。リン酸緩衝化食塩水(ＰＢＳ)は１０mMリン酸
ナトリウム、ｐＨ７.４、０.１５ＭＮａＣｌからなる。

【０１１１】精製蛋白質。エシェリキア・コリ中で発現
される組換ｐｒｏ−ｕ−ＰＡ(EC 3.4.21.31)は、Ｄ.サ
ンダース博士(ドイツ、グリュネンサール)からの好意に
より贈られたものであった。以下の精製ｕ−ＰＡ誘導体
は、Ａ.マツァールおよびＪ.ヘンキン(イリノイ州、ア
ボット)からの好意により提供された：ｕ−ＰＡのアミ
ノ−末端断片(ＡＴＦ)(６−１３５残基)、ｕ−ＰＡの上
皮成育因子様モジュール(ＧＦＤ)(４−４３残基)、ウロ
キナーゼクリングル(４７−１３５残基)およびセリンプ
ロテアーゼドメイン(更なる詳細は、マーツァーら、１
９９２参照)を含有する低分子量ｕ−ＰＡ(１３６−４１
１残基)。可溶性、不完全ｕ−ＰＡＲ−誘導体(１−２７
７残基)は、トランスフェクションしたチャイニーズ・
ハムスター卵巣細胞の条件培地から免疫親和性クロマト
グラフィーにより精製し(プロウら、１９９３)、Ｅ
₂₈₀(１％)nm＝９.２を使用して分光光度により(レネ
ら、１９９４)に定量した。ヒトｕ−ＰＡＲ(Ｒ２、Ｒ３
およびＲ５)に対する抗体を、前述のように産生し、特
徴付けした(レネら、１９９１)。

【０１１２】Ｎ−トシル−Ｌ−フェニルアラニンクロロ
メチルケトンで処理したトリプシン(EC 3.4.21.4)およ
びα−キモトリプシン(EC 3.4.21.1)を、市販のウォル
シントン(ニュージャージー州、フリーホールド)社製で
あった。ヒト好中球エラスターゼ(E.C.3.4.24.27)はカ
ルビオケム(カリフォルニア州、ラジョラ)およびサーモ
リジンは大和化成(Daiwa kasie)(日本、大阪)からであ
った。

【０１１３】ｕ−ＰＡＲドメイン１およびドメイン２＋
３の産生および精製。精製ｕ−ＰＡＲ(７５０μg)をα
−キモトリプリン(１００ng)と共に４時間、０.１Ｍ
ＮＨ₄ＨＣＯ₃中でインキュベーションし、その後１mM
フェニルメチルスルホニルフロリドを添加することによ
り消化を停止した。前述(プラウグら、１９９３)のよう
にスーパーデックス(Superdex)(商標)75 HR10/30カラム
(ファルマシア)を使用したサイズ排除クロマトグラフィ
ーにより、ドメイン１を未変化の無傷ｕ−ＰＡＲおよび
ドメイン２＋３から分離した。ｕ−ＰＡＲドメイン１の
調整物をトリフルオロ酢酸を添加することにより酸性化
し、水中の０.１％(ｖ／ｖ)トリフルオロ酢酸から０.０
８５％(ｖ／ｖ)トリフルオロ酢酸含有７０％(ｖ／ｖ)２
−プロパノールまでの直線勾配(１時間)により、流速３
００μl／分でProRPC(商標)HR5/2上の逆層クロマトグラ
フィーにかけた。この工程はｕ−ＰＡＲドメイン１を少
量の更なる不完全誘導体(図２Ａ中に、ｕ−ＰＡＲドメ
イン１'として示した)から分離するものである。

【０１１４】ｕ−ＰＡＲドメイン２＋３を含有するサイ
ズ除外クロマトグラフィーからの分画は、Ｎ−ヒドロキ
シサクシンイミド活性化スーパーロース(Superose)(商
標)HR10/2(ファルマシア)上で固定化した抗−ｕ−ＰＡ
Ｒモノクローナル抗体(Ｒ３−ドメイン１のエピトープ
を認識、ＷＯ９２／０７０８３参照)を使用した免疫親
和性クロマトグラフィーにかけ、無傷ｕ−ＰＡＲおよび
ドメイン１を除去した。ドメイン２＋３を含む部分を最
後に、スーパーデックス(商標)７５上第２のサイズ排除
クロマトグラフィーにかけ、その後、溶出ピークの下降
部分を回収した。

【０１１５】細胞結合実験。ｕ−ＰＡのｕ−ＰＡＲおよ
びその蛋白質分解誘導体に対する親和性は、¹²⁵Ｉ−標
識ＡＴＦのＵ９３７細胞に対する結合を種々のｕ−ＰＡ
Ｒ調製物と競合させるアッセイで測定した。Ｕ９３７細
胞は、標準条件下で成育させ、酸性緩衝液で洗浄し、前
述(エリスら、１９９３)のような内因性のｕ−ＰＡ結合
を除去した。細胞の１００μlのアリコート(１×１０⁷
細胞／ml)を０.１％ウシ血清アルブミン含有ＰＢＳに再
懸濁し、その後種々の希釈のｕ−ＰＡＲ調製物の１０μ
lのアリコート、続いて¹²⁵Ｉ−標識ＡＴＦ(５０ng／ml
および２.６μCi／ml)を加えた。これらを２時間４℃で
振盪しながらインキュベーションした。１００μlのア
リコートを、次いで、ポリプロピレン微小遠心管中の油
混合物(８５：１５、ジメチルジフェニルポリシロキサ
ンおよびρ＝０.８８ｇ／ml鉱物油のv／v)２００μl上
に重層し、その後１４,０００Ｇで３分間遠心し、管チ
ップの切断およびγ−放射活性計測を行った。次いで、
特異的ＡＴＦ結合等温線を作った。

【０１１６】蛍光測定。ＡＮＳの蛍光発光スペクトル
を、３８６nmの励起スペクトルを使用し、４００−６０
０nmの範囲の発光を記録し、５nmバンド通過励起および
発光スリットおよび５mm通過長石英キュベットを使用し
て、パーキン−エルマーＬＳ−５分光蛍光測定器で得
た。ｕ−ＰＡＲ依存性ＡＮＳ蛍光の応答をある処置(例
えば蛋白質分解、モノクローナル抗体またはｕ−ＰＡ誘
導体による力価測定)の関数として測定した場合、励起
は３８６nmおよび発光は４７０nmの固定波長で記録し
た。全ての蛍光測定は、特記しない限り、ＰＢＳ中の２
μM ｕ−ＰＡＲおよび１０μM ＡＮＳを使用して、２
５℃で行った。

【０１１７】ＡＮＳ力価測定。ｕ−ＰＡＲに対するＡＮ
Ｓ結合の化学量論および親和性は、ｕ−ＰＡＲの固定濃
度で、１００μMまで濃度のＡＮＳで力価測定した。観
察された蛍光強度は、添加ＡＮＳの希釈効果、緩衝液中
のＡＮＳの低バックグラウンド蛍光およびＡＮＳの濃度
変化による内部濾過作用について補正した。後者は、関
係式 Ｆ_corr＝Ｆ_obs［(２.３０３ε₃₈₆ＡＮＳ₀)／１−１０
^-ε386ANS0)］ (式中、ε₃₈₆は蛍光キュベットの通過長の半分のＡＮＳ
モル励起係数、ＡＮＳ₀は全ＡＮＳ濃度およびＦ_obsおよ
びＦ_corrは実測および補正蛍光強度である）を使用して
行った。結合ＡＮＳの濃度は、関係式 ＡＮＳ_Ｂ＝Ｆ_corr／Ｆ_max (式中、Ｆ_maxは、全てがｕ−ＰＡＲに結合したと仮定し
た場合の、１モル溶液の理論的蛍光度である)から得
た。本パラメーターは、本質的に全ての添加ＡＮＳが、
結合曲線の最初の直線部分で結合するのを確実にするの
に充分に高い蛋白質濃度の力価により計算した。本方法
で得たデータは、スキャチャードの方法で分析した。

【０１１８】ＵＶ吸収差スペクトル。制限キモトリプシ
ン消化前および後の紫外線吸収スペクトルの違いを、ベ
ックマンＤＵ−７０分光蛍光測定器を使用して測定し
た。ＵＶスペクトルは、１／１０００量のキモトリプシ
ン保存溶液(６０μM)を加える前に、ＰＢＳ中６０μMの
濃度で、２５℃で、ｕ−ＰＡＲに対して０.０５nmの間
隔でデジタルで記録した。更にスペクトルを、更なるス
ペクトル変化がないことから判断される、蛋白質分解が
終了するまで記録した。差スペクトルは、個々に記録し
たスペクトルの引算により得られた。キモトリプシンを
ＰＭＳＦ−処理キモトリプシンに代えて、他は同一の条
件で行った対照実験において、吸収差スペクトルは生じ
なかった。

【０１１９】多方面の分析。ｕ−ＰＡＲおよびその機能
的誘導体の検出は、本質的には記載されたような(ニー
ルセンら、１９８８)、Ｎ,Ｎ'−ジサクシンイミジルス
ベレートを使用した化学交差架橋により行った。還元お
よびアルキル化サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥは、レミ
リ、１９７０に従い、バイオラッド・ミニプロテイン(B
io-Rad Mini-Protean)II装置中で行った。

【０１２０】結果 ｕ−ＰＡＲのリンカー領域のキモトリプシン開裂は、ｕ
−ＰＡに対するその親和性を減少させる。ｕ−ＰＡＲの
制限キモトリプシン開裂が、Ｔｙｒ⁸⁷後の単一開裂によ
り、未変化のドメイン２＋３由来のＮＨ₂−末端領域(１
−８７残基)を遊離することは先に証明されている(ベー
レンツら、１９９１)。¹²⁵Ｉ−標識ＡＴＦへの化学交差
架橋により、ＮＨ₂−末端ドメインのみが配位子に結合
する能力を保持していることが更に示された。組換え可
溶性ｕ−ＰＡＲ(１−２７７残基)の形の大量のｕ−ＰＡ
Ｒ蛋白質が入手可能であることは、我々がこの結合特性
を更に研究することを可能にした。配位子結合の親和性
が、キモトリプシン処置により変わるか否かを測定する
ために、精製組換可溶性ｕ−ＰＡＲ(以下単にｕ−ＰＡ
Ｒと呼ぶ)を種々のキモトリプシン濃度で処理し、続い
て、分解混合物を¹²⁵Ｉ−標識ＡＴＦのＵ９３７細胞に
対する結合をこれらのｕ−ＰＡＲ調製物と競合させる競
合的放射標識配位子結合アッセイで試験した。図１に示
されるように、無傷ｕ−ＰＡＲは０.１nMのＩＣ₅₀と競
合し、それは使用した実験条件下ではｕ−ＰＡＲおよび
ＡＴＦ相互作用のＫ_dに近付いている。しかしながら、
増加したキモトリプシン濃度では、１５００倍の１５０
nMまで上昇したＫ_dで相互作用の親和性が非常に減少し
た。

【０１２１】ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマーシー染色に
明らかなように(図２Ａ)、高いキモトリプシン濃度は、
無傷ｕ−ＰＡＲの完全な転換を導き、ｕ−ＰＡＲドメイ
ン１と一緒にｕ−ＰＡＲドメイン２＋３および更に、図
中ではｕ−ＰＡＲＩ'と記載されて不完全誘導体(それぞ
れＴｙｒ⁸⁷およびＴｙｒ⁵⁷の後で開裂)を産生した。こ
れらのサンプルを¹²⁵Ｉ−標識ＡＴＦとの化学交差架橋
の対象にした場合(図２Ｂ)、それらはキントリプシン処
理をした後、細胞結合実験(図１)で見られた結合活性と
比較すると、減少した結合活性を示した。ＡＴＦのｕ−
ＰＡＲドメイン１への交差架橋は、ｕ−ＰＡＲの１００
倍高い濃度(１０nM)を使用してのみ検出でき、かなり減
少された親和性と一致する(図２Ｃ、３列)。これらの高
いｕ−ＰＡＲ濃度において、残った無傷蛋白質の痕跡量
は、本方法の感度により検出可能であり、それはおそら
く上記で観察されたキモトリプシン分解混合物の競合効
果に寄与した。

【０１２２】別の実験において(データは示していな
い)、逆相ＨＰＬＣ精製ｕ−ＰＡＲドメイン１(１−８７
残基)は、分解混合物と区別不可能な効率で、交差架橋
実験において特異的共有結合複合体を形成し得るにもか
かわらず、１μMほど高い濃度でさえ、Ｕ９３７細胞へ
のＡＴＦ結合と競合できなかった。ｕ−ＰＡＲドメイン
２＋３の精製調製物は、Ｕ９３７細胞に対する¹²⁵Ｉ−
標識ＡＴＦ結合を、Ｋ_d２５０nMで競合できたが、これ
は調製物の高濃度を使用した交差架橋で検出できた(定
量はできなかった)無傷ｕ−ＰＡＲによる微量不純物(＜
０.１％)によるものであるということを全く許さないわ
けではない。

【０１２３】ＵＶ−吸収差スペクトル。ｕ−ＰＡＲドメ
イン１の蛋白質分解分離の際の配位子結合親和性のこの
非常に大きい減少の根拠を研究するために、無傷および
部分的分解ｕ−ＰＡＲの間の相違を反映するスペクトル
プローブを探した。キモトリプシン処置により産生した
ＵＶ吸収差スペクトルは、図３に示す。ｕ−ＰＡＲのＵ
Ｖ吸収スペクトルは、この制限蛋白質分解では、芳香族
残基の溶媒への暴露が増加するため、青色にシフトす
る；２９２nmおよび２８５nmの最低値は、正味のトリプ
トファン暴露を示すが、２８５nmの最低値の相対的な大
きさは、２７８nmでの小さい最低値が示すように、また
更なるチロシン残基暴露の関与を示唆する(ヘルスコビ
ッツ、１９６７)。しかしながら、これらの変化は相対
的に小さく、単一トリプトファンおよびチロシン残基の
溶媒中での暴露の約３０％であることを説明する。

【０１２４】ｕ−ＰＡＲは８−アニリノ−１−ナフタレ
ンスルホン酸(ＡＮＳ)に結合する。疎水性相互作用は、
蛋白質−蛋白質相互作用においてしばしば重要な役割を
担い、外部からの発蛍光団ＡＮＳのこのような暴露され
た蛋白質の疎水性部分への結合は、産生される蛍光の量
に伴う上昇により追跡できた(ストリャー、１９６５)。
無傷ｕ−ＰＡＲへのＡＮＳ結合特性は、したがって研究
できた。図４に示されるように、ｕ−ＰＡＲは、実際、
ＡＮＳに結合し、発光スペクトルの５１５nmから４７０
nmへの青色へのシフト；ＡＮＳのｕ−ＰＡＲへの蛋白質
の疎水性部位での結合からなる変化とともにその蛍光強
度において大きく増強され(＞１０倍)ることが判明し
た。この結合の特性の更なる分析により、ＡＮＳがｕ−
ＰＡＲ上の単一部位(１.０９±０.１７モル／ｕ−ＰＡ
Ｒモル)に、解離定数３３.８±３.２μMで結合すること
が明らかになった(図５)。これらのパラメーターは、特
異的にＡＮＳに結合する他の蛋白質のものと有利に比較
し、例えば補体成分Ｃ３ｂはＡＮＳ２モルとＫ_d＝４０
μM(イセンマン、１９８３)で結合し、アポヘモグロビ
ンはサブユニット当たり１モルのＡＮＳと、Ｋ_d＝５５
μMで結合する(ストライヤー、１９６５)。

【０１２５】無傷ｕ−ＰＡＲのキモトリプシン開裂は、
ＡＮＳ蛍光の７５％減少を導くことが続いて証明され
(図４、曲線２)、ＡＮＳの特異的結合部位が失われた
か、結合ＡＮＳの微細環境が疎水性が少なくなることの
いずれかが、低い蛍光量生成をもたらこすことを示唆す
る。前者の可能性は、蛍光発光最大値がキモトリプシン
開裂により変化しなかったという事実により支持され
る。ｕ−ＰＡＲのドメインＩおよびIIの間のリンカー領
域を開裂するトリプシン、好中球エラスターゼ、サーモ
リジンおよびｕ−ＰＡを含む他のプロテアーゼは、同様
にＡＮＳ蛍光強度を減少させる原因となった(データは
示していない)。

【０１２６】ｕ−ＰＡ、ＡＴＦおよびＧＦＤによる受容
体結合ＡＮＳの力価測定。増強ＡＮＳ蛍光およびｕ−Ｐ
Ａに対する高親和性の両方がｕ−ＰＡＲのキモトリプシ
ン開裂により減少したため、ＡＮＳの結合がｕ−ＰＡＲ
のｕ−ＰＡ結合部位の全部を直接伝達するか否か決定す
ることを試みた。ｕ−ＰＡＲ溶液への等モル量のｐｒｏ
−ｕ−ＰＡＲの添加は、キモトリプシン開裂で観察され
たのと同等なＡＮＳ蛍光の減少をもたらした(図６)。本
作用のｕ−ＰＡとｕ−ＰＡＲの間の直接相互作用への依
存性は、ｕ−ＰＡの小さな誘導体を使用して証明され
た。ＡＴＦおよびＧＦＤ(それぞれ、６−１３５および
４−４３残基)の両方は、ｐｒｏ−ｕ−ＰＡで見られた
と同等な蛍光減少をもたらした(図６)。一方、単離セリ
ンプロテアーゼドメインおよびクリングルドメイン(そ
れぞれ、１３６−４１１および４７−１３５残基)は、
等モル濃度で添加した場合、ＡＮＳ蛍光に影響を与えな
かった(データは示していない)。従って、ｕ−ＰＡＲに
結合した時のＡＮＳ蛍光の増強は、機能的、すなわち、
高親和性ｕ−ＰＡＲ部位が利用できることを反映するも
のである。

【０１２７】受容体結合ＡＮＳのモノクローナル抗体に
よる力価測定。ｕ−ＰＡ以外の巨大分子量配位子が、ｕ
−ＰＡＲへのＡＮＳ結合特性に影響をまた与えるか否か
を調べるために、増強ＡＮＳ蛍光を３種の異なった増加
する濃度の抗−ｕ−ＰＡＲモノクローナル抗体の関数と
して測定した。図７は、これらの抗体中の僅か１つ、Ｒ
３が蛍光に影響を与え、ｕ−ＰＡによる力価測定後に見
られたものと同等にそのレベルを減少させたことを示
す。Ｒ３抗体は、そのエピトープをｕ−ＰＡＲドメイン
１に有し、すでにｕ−ＰＡの結合を妨げることが示され
ている；これと矛盾せず、等モル量のｕ−ＰＡをこのｕ
−ＰＡＲ／Ｒ３混合物に添加しても、蛍光を更に減少さ
せない。従って、本抗体は、ＡＮＳとｕ−ＰＡＲの間の
相互作用に対して、ｕ−ＰＡの効果と似た効果を示す。
一方、ＡＮＳ蛍光はＲ２(ドメイン２＋３上のエピトー
プを認識)存在下では影響を受けない。続いてｕ−ＰＡ
を添加すると、蛍光は抗体不存在下で得られたのと同レ
ベルまで減少した。第３の抗体、ドメイン１上のエピト
ープを認識するＲ５の添加は、Ｒ３のものと異なり、ｕ
−ＰＡの細胞への結合を妨げず(Ｅ.レーネら、未公開デ
ータ)、ＡＮＳ蛍光にまた影響しなかった。この抗体を
伴うｕ−ＰＡへの添加は、恐らくＲ５存在下でのｕ−Ｐ
Ａ結合の僅かな立体障害により、Ｒ２存在下で観察され
たもののＡＮＳ蛍光の約５０％の減少をもたらす。

【０１２８】変性物は、ｕ−ＰＡＲのＡＮＳおよびｐｒ
ｏ−ｕ−ＰＡの結合部位の損失を誘発した。増加濃度の
グアニジン塩酸塩へのｕ−ＰＡＲの暴露は、０.８Ｍグ
アニジン塩酸塩で中点を有するほとんど重ねることが可
能な変化曲線のＡＮＳ蛍光およびｕ−ＰＡ−ｕ−ＰＡＲ
複合体形成の両方の減少をもたらした(図８)。ＡＮＳ蛍
光発光最大値の波長の変化は、グアニジン誘発変性中に
観察されず、４７０nmでのＡＮＳ蛍光強度で観察される
変化は、本来の構造が保持されている分子と、ＡＮＳに
結合する能力をなくした分子との間の平衡を反映するこ
とを示唆する。同様の平衡がまた、サイズ排除クロマト
グラフィーで測定されたモノマーおよび生体分子ｕ−Ｐ
Ａ−ｕ−ＰＡＲ複合体にもまた存在する。等モル量のｐ
ｒｏ−ｕ−ＰＡのこれらのサンプルへの添加は、ＡＮＳ
蛍光をグアニジン塩酸塩の濃度に関係なく、同じ最終レ
ベルまで減少させた。

【０１２９】ｕ−ＰＡＲのＡＮＳおよびｕ−ＰＡ結合部
位の変性は、中点が２Ｍグアニジン塩酸塩である固有の
トリプトファン蛍光の変化と比較して、むしろ低い濃度
(即ち、前変性条件で)発生する(データは示していな
い)。

【０１３０】実施例２ ｕｐａｒドメイン２＋３に対するモノクローナル抗体に
よるｕｐａ：ｕｐａｒ相互作用の阻害 材料および方法：ｕ−ＰＡＲと反応するモノクローナル
抗体を、標準免疫化プロトコールを使用して調製した。
このために、ＣＨＯ培養上清由来の可溶性、組換ｕ−Ｐ
ＡＲを、親和性クロマトグラフィーで精製し、直接免疫
化に使用した(可溶性、組換ｕ−ＰＡＲの調製および精
製に関する詳細は、プロウら(１９９３)、J.Biol.Che
m.、２６８、１７５３９−５４６頁、特に１７５４０
頁、第３パラグラフまたはレーネら(１９９４)、J.Immu
n.Meth.、１６７、９１−１０１頁参照；両方の文献
は、引用して本明細書に包含する)。免疫化のために、
ヒツジ、ウサギまたはマウスを使用した。

【０１３１】ｕ−ＰＡＲ ５０−１００μgをフロイン
ド完全アジュバント０.５ml中で、最初の免疫化段階と
して腹腔内で与えた。この後フロインド不完全アジュバ
ント０.５ml中のｕ−ＰＡＲ５０−１００μgで更に７回
の免疫化(１月に１回)した。血清または脾臓細胞を回収
する３日前に、ｕ−ＰＡＲ５０から１００μgを１００
μl食塩水中で、i.v.で投与した。免疫化動物の脾臓細
胞を、ケーラーおよびミルシュタイン(Nature ２５６
(１９７５、４９５−４９７)に従って、不滅(immortal)
細胞と融合させた。ｕ−ＰＡＲに対するモノクローナル
抗体を産生する不滅細胞を本方法で得られたハイブリド
ーマ細胞から選択し、細胞をクローン化した。抗−ｕ−
ＰＡＲモノクローナル抗体は、前記のように(レーネ
ら、１９９１)キモトリプシン処理組換ｕ−ＰＡＲの免
疫沈降により特徴付された。

【０１３２】簡単には、ｕ−ＰＡＲを、(ベーレンツ
ら、１９９０)に従って、ヨードジェン(Iodogen)(ピー
ルセ・ケミカル)を使用して、Ｎａ¹²⁵Ｉで放射能標識し
た。次いで、¹²⁵Ｉ−標識ｕ−ＰＡＲを、キモトリプシ
ンで分解し、ドメイン１およびドメイン２＋３に対応す
るフラグメントを産生させた(ベーレンツら、１９９
１)。最終濃度１０μg／mlのモノクローナル抗体を¹²⁵
Ｉ−標識ｕ−ＰＡＲフラグメント(約２×１０⁴cpm)と共
に０.１Ｍ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８.１、０.３Ｍ Ｎ
ａＣｌ、０.１％ＢＳＡ、０.１％ＣＨＡＰＳ ２００μ
l中で１時間、４℃でインキュベートした。プロテイン
Ａ−セファロースＣＬ４Ｂ(ファルマシア)の５０％懸濁
液５０μlを加え、更に１時間、４℃で撹拌しながらイ
ンキュベートした。プロテインＡ−セファロースは遠心
分離により回収し、緩衝液、次いでＢＳＡなしの緩衝液
中で洗浄した。セファロースビーズは、ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅサンプル緩衝液５０μl中に再懸濁し、５分間沸騰さ
せ、次いで非還元条件下で６−１６％勾配ゲルにかけ
た。免疫沈降した¹²⁵Ｉ−標識ｕ−ＰＡＲフラグメント
を、オートラジオグラフィーにより検出した。

【０１３３】ｕ−ＰＡ：ｕ−ＰＡＲ相互作用を阻害する
モノクローナル抗体の能力を、２つの系で評価した。最
初は、¹²⁵Ｉ−標識ＡＴＦのＵ９３７細胞に対する結合
の阻害を測定し、第２に、ｕ−ＰＡの固定精製組換ｕ−
ＰＡＲに対する結合の阻害を測定した。

【０１３４】Ｕ９３７細胞は、酸性緩衝液中で処理し、
内因性結合ｕ−ＰＡを除去した(ストペリーら、１９８
６)。ＰＢＳ、０.１％ＢＳＡ中の細胞１００μlを、モ
ノクローナル抗体(２０μg／ml)１００μlと、３０分、
４℃でインキュベートした。¹²⁵Ｉ−標識ＡＴＦ(約０.
９nM)１００μlを加え、更に１時間撹拌しながらインキ
ュベートした。細胞を３回ＰＢＳ、０.１％ＢＳＡで洗
浄し、結合放射活性をガンマ計数により測定した。

【０１３５】更なる実験において、抗体の種々の濃度
(０.１から２０μg／ml)を、細胞と予備インキュベート
し、¹²⁵Ｉ−標識ＡＴＦ結合の５０％阻害に必要な濃度
を測定した。

【０１３６】低分子量発蛍光団８−アニリノ−１−ナフ
タレンスルホン酸(ＡＮＳ)の組換ｕ−ＰＡＲへの結合に
おけるモノクローナル抗体の効果は、抗−ｕ−ＰＡＲモ
ノクローナル抗体Ｒ３について評価した。簡単には、Ｐ
ＢＳ中２μMの濃度での組換ｕ−ＰＡＲを、ＡＮＳと室
温で５平方mm石英キュベット中でインキュベートし、Ａ
ＮＳの蛍光をパーキン−エルマーＬＳ５分光蛍光測定器
で、それぞれ励起および発光波長３８６および４７０で
記録した。次いで、ｕ−ＰＡＲ溶液を、モノクローナル
抗体で力価測定し、ＡＮＳ蛍光を各々の添加の後に記録
した。抗体の各々の濃度におけるＡＮＳ結合の阻害は、
ＡＮＳ蛍光が緩衝液希釈および抗体単独由来のＡＮＳ蛍
光への僅かな寄与を補正した後に計算した。これらの補
正は、ｕ−ＰＡＲ溶液中のＡＮＳ蛍光の、緩衝液単独に
よる力価測定および、ｕ−ＰＡＲ不存在下におけるＡＮ
Ｓ溶液のモノクローナル抗体による力価測定により行っ
た。

【０１３７】結果：モノクローナル抗体１.Ｃ８.２６Ａ
３および１.Ｈ２.１０Ａ３(上記のようにして製造)は、
特に、ｕ−ＰＡＲドメイン２＋３を免疫沈降させた。先
に特徴付された抗−ｕ−ＰＡＲモノクローナル抗体Ｒ２
およびＲ３(レネら、１９９１)を、それぞれ、対照およ
び免疫沈降ドメイン２＋３およびドメイン１として使用
した。抗体アイソトープ対照(１.Ｆ１１.２１Ａ１)は、
ｕ−ＰＡＲフラグメントのいずれの免疫沈降もできなか
った。

【０１３８】モノクローナル抗体１.Ｃ８.２６Ａ３およ
び１.Ｈ２.１０Ａ３は、両方とも¹²⁵Ｉ−標識ＡＴＦの
Ｕ９３７細胞への結合を、先に記載した、ｕ−ＰＡＲの
ドメイン１を認識し、免疫沈降する抗−ｕ−ＰＡＲモノ
クローナル抗体Ｒ３(レーネら、１９９１)と同様の程度
で阻害した(表１に示す)。イソタイプ対照抗体１.Ｆ１
１.２１Ａ１および先に記載した、ｕ−ＰＡＲのドメイ
ン２＋３を認識する抗体Ｒ２(レーネら、１９９１)は、
結合に顕著な阻害作用は有さなかった。

【０１３９】更なる実験は、結合の５０％阻害を達成す
る抗体の濃度は、１.Ｃ８.２６Ａ３および１.Ｈ２.１０
Ａ３並びにＲ３(それぞれ、０.６、０.３および０.４５
μg／ml)と同様であることを示した。

【０１４０】モノクローナル抗体１.Ｃ８.２６Ａ３およ
び１.Ｈ２.１０Ａ３はまたｕ−ＰＡ：ｕ−ＰＡＲ相互作
用を、ｕ−ＰＡ／ｕ−ＰＡＲ ＥＬＩＳＡ系で測定した
ように、上記放射−配位子細胞結合検定(表２参照)で示
したのと同様の濃度依存性で阻害する。モノクローナル
抗体１.Ｃ８.２６Ａ３および１.Ｈ２.１０Ａ３は、両方
ともそのｕ−ＰＡＲへの結合で観察されるＡＮＳ蛍光の
増強を阻害することができた。このＡＮＳ蛍光の増強
は、抗−ｕ−ＰＡＲモノクローナル抗体Ｒ３およびまた
そのｕ−ＰＡおよびｕ−ＰＡＲ−結合誘導体、すなわち
ＡＴＦおよびＧＦＤにより阻害されるが、モノクローナ
ル抗体Ｒ２ではされない。ｕ−ＰＡＲへの結合の際のＡ
ＮＳ蛍光の増強は、ｕ−ＰＡＲのキモトリプシン開裂、
ドメイン２＋３からのドメイン１の遊離(実施例１参照)
により消滅させることができた。この蛋白質分解開裂
は、またｕ−ＰＡのｕ−ＰＡＲに対する親和性の１５０
０倍の減少をもたらすことが示された。従って、蛍光の
増加として観察されたＡＮＳのｕ−ＰＡＲへの結合は、
ｕ−ＰＡＲのｕ−ＰＡ結合部位の機能的状態を示す。

【０１４１】上記のデータは、２種のモノクローナル抗
体１.Ｃ８.２６Ａ３および１.Ｈ２.１０Ａ３が、ｕ−Ｐ
ＡＲの２＋３ドメインへ結合し、ｕ−ＰＡＲ分子の一部
がｕ−ＰＡＲの結合において役割を担うことは予め予期
されず、抗体はそれによってｕ−ＰＡまたはＡＴＦのｕ
−ＰＡＲへの結合を阻害することを示すものである。そ
れらはまた低分子量化合物ＡＮＳのｕ−ＰＡＲへの結合
を阻害し、これらの抗体の効果は、ｕ−ＰＡＲおよびｕ
−ＰＡまたはＡＴＦの間の巨大分子相互作用における単
純な立体障害によるものではないことはほとんど確実で
ある。ＡＮＳのｕ−ＰＡＲへの結合は、ドメイン１の蛋
白質分解遊離により損失する、高親和性ｕ−ＰＡ結合部
位の利用性を反映する。これは、ドメイン１の高親和性
構造の安定化に働き得る、ｕ−ＰＡＲ内のドメイン間相
互作用の崩壊によるものであることは最もありそうであ
る。従って、２種のモノクローナル抗体１.Ｃ８.２６Ａ
３および１.Ｈ２.１０Ａ３は、既知のｕ−ＰＡＲのｕ−
ＰＡ結合ドメイン１に結合なしにｕ−ＰＡとｕ−ＰＡＲ
の相互作用を阻害し、ＡＮＳによる観察は、その高親和
性ｕ−ＰＡ結合部位の損失のようなｕ−ＰＡＲ分子の構
造の変化の結果として生じることを示唆する。

【０１４２】

【表１】 Ｕ９３７細胞への¹²⁵Ｉ−標識ＡＴＦの結合の阻害 ────────────────────────────────── c.p.m.(２連の平均) 結合の阻害％ ────────────────────────────────── 結合対照 ６３０１ ０％ １.Ｃ８.２６Ａ３ １８７ ９７％ １.Ｈ２.１０Ａ３ １９０ ９７％ １.Ｆ１１.２１Ａ１ ５９１０ ６％ Ｒ３ ４７９ ９２％ Ｒ２ ９００４ ２％ ｕ−ＰＡ(ウキダン(Ukidan)) １０６ ９８％ ──────────────────────────────────

【０１４３】

【表２】 ｕ−ＰＡ／ｕ−ＰＡＲ ＥＬＩＳＡにより測定した ｕ−ＰＡ：ｕ−ＰＡＲ相互作用の阻害 ─────────────────────────────────── 阻害％ ────────────────────────── 抗体、μg／ml １.Ｈ２.１０Ａ３ １.Ｃ８.２６Ａ３ Ｒ３ ─────────────────────────────────── ０.００１ ０ ２ ０.０１ ２２ １０ ０.０２５ ３５ １４ ０.１ ５１ ３５ ０.２５ ５８ ５３ １.０ ６７ ６５ ５.０ ８１ ７５ ５０ １０.０ ８４ ８３ ６１ ───────────────────────────────────

【０１４４】実施例３ ドメイン２＋３への結合およびｕ−ＰＡおよびｕ−ＰＡ
Ｒの相互作用の阻害が可能な抗体のスクリーニング 多くの可能なスクリーニングアッセイが、ドメイン２＋
３へ結合でき、同時にｕ−ＰＡおよびｕ−ＰＡＲの相互
作用の阻害ができる抗体の同定のために考えられる。本
明細書で記載の抗体と同様の方法でｕ−ＰＡＲに結合す
る抗体は、試験されるべき抗体を、例えば固定化ｕ−Ｐ
ＡＲに対する沈降抗体の一つの標識変形と競合させる競
合的免疫測定を使用して同定および選択できる。本方法
において、他の蛋白質または非蛋白質抗体が、ｕ−ＰＡ
Ｒに対する沈降抗体と同様の方法でまた結合するか否
か、試験できる。

【０１４５】同様の方法は、試験されるべき抗体が、も
し、２種の抗体を同時にｕ−ＰＡＲを含む系に加えた場
合、ｕ−ＰＡＲと標識抗体の結合を比較する場合、試験
すべき抗体が存在しない場合、少なくとも沈降(標識)抗
体の５０％から１０⁵倍高い濃度で標識抗体のｕ−ＰＡ
Ｒへの結合を減少させることを意味する。結合標識抗体
の量は、文献に記載の方法、例えば標識の蛍光または標
識により触媒される酵素反応により測定できる。

【０１４６】抗体が、上記のアッセイで陽性であること
が分かった場合、ｕ−ＰＡＲに負う生理的作用のための
以下のスクリーニングが使用できる：

【０１４７】物質スクリーニングスキーム ＷＯ９２／０７８３の実施例９に記載されているスクリ
ーニングスキームは、ｕ−ＰＡとｕ−ＰＡＲの間の相互
作用の阻害に使用できる、従って侵潤および転移過程を
阻害する医薬として使用される物質の同定のために確立
された種々の連続した工程を含む。これらのアッセイに
記載されている一般的な方法は(ドメイン２＋３への結
合は、本発明の興味深い態様であることを考慮に入れ
て)、本発明にまた使用できる。

【０１４８】文献 ベーレンツ，エヌ、プロウ，エム、パティ，エル、ホウ
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【図面の簡単な説明】

【図１】 完全なｕ−ＰＡＲ、キモトリプシンの種々の
濃度で処理されたｕ−ＰＡＲの量的変化によるＵ９３７
細胞への¹²⁵Ｉ標識ＡＴＦの結合阻害を示すグラフであ
る。

【図２】 ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルおよび化学的架橋によ
り測定された完全およびキモトリプシン処理ｕ−ＰＡＲ
の分子分析を示す電気泳動図である。

【図３】 キモトリプシン対完全ｕ−ＰＡＲの紫外線吸
収差スペクトルを示すグラフである。

【図４】 キモトリプシンによりＴｒｙ⁸⁷以後が開裂さ
れ、それによりドメインIIおよびIIIからドメインＩが
分離した後のｕ−ＰＡＲのＡＮＳ蛍光特性の変化を示す
グラフである。

【図５】 ＡＮＳによるｕ−ＰＡＲの蛍光分析を示すグ
ラフである。

【図６】 ＡＮＳ蛍光度により観察されたｕ−ＰＡおよ
びｕ−ＰＡ間の相互作用を示すグラフである。

【図７】 モノクローナル抗体によるＡＮＳ−蛍光度依
存性ｕ−ＰＡＲの力価測定を示すグラフである。

【図８】 グアニジン塩酸塩がｕ−ＰＡＲへのＡＮＳお
よびｐｒｏ−ｕ−ＰＡの結合を妨害することを示すグラ
フである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ // Ａ６１Ｋ 39/395 ＡＢＥ Ａ６１Ｋ 39/395 ＡＢＥ ＡＢＸ ＡＢＸ ＡＣＢ ＡＣＢ ＡＤＳ ＡＤＳ ＡＤＵ ＡＤＵ ＡＥＤ ＡＥＤＰ Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） 微生物の受託番号 ＤＳＭ ＡＣＣ２１７９ 前置審査 (73)特許権者 591005589 ベーリンガー・マンハイム・ゲゼルシャ フト・ミット・ベシュレンクテル・ハフ ツング ＢＯＥＨＲＩＮＧＥＲ ＭＡＮＮＨＥＩ Ｍ ＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ ＭＩＴ ＢＥＳＣＨＲＡＮＫＴＥＲ ＨＡＦＴ ＵＮＧ ドイツ連邦共和国、68305 マンハイム、 ザントホーファー シュトラーセ 116 (72)発明者 ケル・ダネー デンマーク、デーコー−2920シャーロッ テンルン、エル・エー・ブルーンス・ヴ ァイ20番 (72)発明者 ミカエル・プロウ デンマーク、デーコー−2200コペンハー ゲン・エン、エイエギャーゼ16番 フィ アーゼ・チル・ヘイア (72)発明者 ビンセント・エリス イギリス、イングランド、エセックス、 ウッドフォード・グリーン、カベンディ ッシュ・アベニュー18番 (72)発明者 ウルリッヒ・ペサラ ドイツ連邦共和国デー−82377ペンツベ ルク、ビルケンシュトラーセ31番 (72)発明者 ウルリッヒ・ヴァイドレ ドイツ連邦共和国デー−80336ミュンヘ ン、ラントヴェーアシュトラーセ56番 (72)発明者 ベルンハルト・ケーニヒ ドイツ連邦共和国デー−82335ベルク、 デュルベルクシュトラーセ28番 (72)発明者 ウルリッヒ・コーネルト ドイツ連邦共和国デー−82392ハバッハ、 ホイバッハヴェーク６番 (72)発明者 イルゼ・バルトケ ドイツ連邦共和国デー−82347ベルンリ ート、アイヒェンシュトラーセ25アー番 (56)参考文献 ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ 288［１ −２］（1991）ｐ．233−236 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ 265［11 ］（1990）ｐ．6453−6460 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (11)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ｕ−ＰＡＲのドメイン２＋３（アミノ酸
   残基８８〜Ｃ−末端まで）に結合し、抗体（２０μｇ／
   ｍｌ）の１００μｌとともにＰＢＳ、０.１％ＢＳＡ
   中、細胞濃度（１×１０⁷細胞／ｍｌ）１００μｌに
   て、実質的にｕ−ＰＡ無含有のＵ９３７細胞を、３０分
   間４℃にてインキュベートし；¹²⁵ Ｉ−標識０.９ｎＭ ＡｔＦ１００μｌを添加し、撹
   拌しながら１時間インキュベートし； ＰＢＳ、０.１％ＢＳＡ中にて３回洗浄し、ガンマ計数
   器で結合ＡｔＦを測定する、 ことからなる検定において、ｕ−ＰＡとｕ−ＰＡＲ間の
   結合を少なくとも９０％程度まで阻害する抗体、または
   上記抗体の活性フラグメント。
2. 【請求項２】 さらに免疫沈降検定においてｕ−ＰＡＲ
   のフラグメントへの実質的な結合を示し、上記フラグメ
   ントが、精製可溶性ｕ−ＰＡＲをα−キモトリプシン１
   ００ｎｇとともに、１Ｍ ＮＨ₄ＨＣＯ₃中３７℃にて４
   時間インキュベートし、１ｍＭフェニルメチルスルホニ
   ルフルオリドを添加し、ついでサイズ排除クロマトグラ
   フィーおよびイムノアフィニティ・クロマトグラフィー
   によってフラグメントの精製を行うことにより得られる
   ｕ−ＰＡＲのＣ−末端フラグメントである、請求項１記
   載の抗体。
3. 【請求項３】 ブタペスト条約の条項および条件のもと
   に受託番号ＤＳＭＡＣＣ２１７８として、１９９４年７
   月７日付でドイッチュ・ザムルング・フォン・ミクロオ
   ーガニズム・ウント・ツェルクルチュレン（ＤＳＭ）に
   寄託されたハイブリドーマ細胞系１.Ｈ２.１０Ａ３によ
   って産生されたモノクローナル抗体、またはブタペスト
   条約の条項および条件のもとに受託番号ＤＳＭ ＡＣＣ
   ２１７９として、１９９４年７月７日付でドイッチュ・
   ザムルング・フォン・ミクロオーガニズム・ウント・ツ
   ェルクルチュレン（ＤＳＭ）に寄託されたハイブリドー
   マ細胞系１.Ｃ８.２６Ａ３によって産生されたモノクロ
   ーナル抗体と、ｕ−ＰＡＲ上の同じ抗原決定基に結合す
   る、請求項１または２記載の抗体。
4. 【請求項４】 ｕ−ＰＡＲへのｕ−ＰＡのｕ−ＰＡＲ結
   合型の結合の非競合的インヒビターである、請求項１〜
   ３のいずれか１項記載の抗体。
5. 【請求項５】 ｕ−ＰＡＲへのその結合が、完全なｕ−
   ＰＡＲの能力に由来する、ｕ−ＰＡのｕ−ＰＡＲ−結合
   型の結合を結合するｕ−ＰＡＲの能力（生理学的条件で
   約１ｎＭより小さい初めの解離定数に相当する）を、同
   じ方法で測定される次の解離定数、少なくとも５０ｎＭ
   に相当する能力に変化させる、請求項１〜４のいずれか
   １項記載の抗体。
6. 【請求項６】 Ｃ−末端部分を含み、完全なｕ−ＰＡＲ
   分子のアミノ酸残基８８から開始する、ｕ−ＰＡＲ分子
   の非ｕ−ＰＡ結合部位と反応する、請求項１〜５のいず
   れか１項記載の抗体。
7. 【請求項７】 モノクローナル抗体である、請求項１〜
   ６のいずれか１項記載の抗体。
8. 【請求項８】 ブタペスト条約の条項および条件のもと
   に受託番号ＤＳＭＡＣＣ２１７９として、１９９４年７
   月７日付でＤＳＭに寄託されたハイブリドーマ細胞系
   １.Ｃ８.２６Ａ３により産生された、請求項１〜７のい
   ずれか１項記載のモノクローナル抗体、またはその活性
   フラグメント。
9. 【請求項９】 ブタペスト条約の条項および条件のもと
   に受託番号ＤＳＭＡＣＣ２１７８として、１９９４年７
   月７日付でＤＳＭに寄託されたハイブリドーマ細胞系
   １.Ｈ２.１０Ａ３により産生された、請求項１〜７のい
   ずれか１項記載のモノクローナル抗体、またはその活性
   フラグメント。
10. 【請求項１０】 活性フラグメントが、ＦＶ、(Ｆ
    Ｖ)₂、Ｆab、Ｆab'、Ｆ(ab)₂などの抗体のフラグメント
    およびディアボディなどの二特異的抗体からなる群から
    選ばれるものである、請求項８〜９のいずれか１項記載
    の抗体。
11. 【請求項１１】 試料中のｕ−ＰＡＲまたはｕ−ＰＡＲ
    のグリコシル化誘導体の検出または定量方法であって、
    上記検出または定量は実質的にｕ−ＰＡＲがｕ−ＰＡに
    結合しているかいないかに関係がなく、捕捉抗体または
    検出抗体、またはその両方として請求項１〜１０のいず
    れか１項記載の抗体を用いることを特徴とする方法。