JP2002539076A

JP2002539076A - 新脈管形成抑制のための方法および組成物

Info

Publication number: JP2002539076A
Application number: JP2000592305A
Authority: JP
Inventors: シー．ブルックス，ピーター; ペティットクラーク，エリック; シュージンソン，エリック
Original assignee: University of Southern California USC
Current assignee: University of Southern California USC
Priority date: 1999-01-06
Filing date: 2000-01-06
Publication date: 2002-11-19
Also published as: US7122635B2; US20090028867A1; DE60042731D1; EP1149111A1; WO2000040597A1; WO2000040597A9; ES2333845T3; PT1149111E; AU2603200A; CA2358517A1; US20060067932A1; CY1109616T1; US20030113331A1; EP1149111A4; US7588760B2; US20060088540A1; ATE439369T1; JP2011084566A; US8025883B2; CN1345331A

Abstract

(57)【要約】本発明は、タンパク質分解化または変性コラーゲンと特異的に結合するが、ネイティブ三重らせん形態のコラーゲンと結合しないアンタゴニストを投与することによる組織における新脈管形成の抑制方法を記載する。本発明のアンタゴニストは、例えばＩ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型変性コラーゲンおよびそれらの組合せを標的にし得る。腫瘍増殖、腫瘍転移の、または再狭窄の療法的処置のためのこのようなアンタゴニストを利用する方法は、ｉｎｖｉｖｏおよびｅｘｖｉｖｏの両方の正常または罹患組織における新脈管形成の診断マーカーとしてこのようなアンタゴニストを用いるための方法であるので、これも記載する。アンタゴニストとしては、ＨＵＩ７７、ＨＵＩＶ２６およびＸＬ３１３と呼ばれるモノクローナル抗体が挙げられる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】関連出願データ本出願は、米国特許仮出願番号第60/114,877号（1999年1月6日提出）、第60/1
14,878号（1999年1月6日提出）、第60/152,496号（1999年9月2日提出）、第60/1
43,534号（1999年7月13日提出）（これらの記載内容はともに、参照により本明
細書中に含まれる）に対する優先権を主張する。

【０００２】連邦政府後援本発明は、米国国立衛生研修所により契約番号R29CA74132-01下で連邦政府後
援により成された。

【０００３】技術分野本発明は、一般的に薬剤の分野に関し、ならびに特に、組織における新脈管形
成を抑制し、変性またはタンパク質分解形態のコラーゲン、例えばＩ、ＩＩ、Ｉ
ＩＩ、ＩＶおよびＶ型コラーゲンのアンタゴニストを用いて新脈管形成を検出す
るための方法および組成物に関する。

【０００４】背景腫瘍増殖および転移は、毎年多数の人々に強い影響を及ぼしている。実際、優
に600,000を超える癌の新規症例が、米国だけで毎年診断されている（Varner, J
.A., Brooks, P.C., and Cheresh, D.A.（1995）Cell Adh. Commun. 3, 367-374
）。固形腫瘍はすべて、最小サイズ以上に腫瘍を継続的に拡張するためには新規
の血管増殖を要する、ということを多数の研究が示唆してきたことは重要である
（Varner et al. 1995; Blood, C.H. and Zetter, B.R.（1990）Biochim. Bioph
ys. Acta. 1032:89-118; Weidner N. et al.（1992）J. Natl. Cancer Inst. 84
:1875-1887; Weidner, N. et al.（1991）, N. Engl. J. Med. 324:1-7; Brooks
, P.C. et al.（1995）J. Clin. Invest. 96:1815-1822; Brooks, P.C. et al.
（1994）Cell 79:1157-1164, Brooks, P.C. et al.（1996）.Cell 85, 683-693;
Brooks, P.C. et al.（1998）Cell 92:391-400）。有意には、広範な種々のそ
の他のヒト疾患は、黄斑変性および糖尿病性網膜症のような眼疾患を含めた非調
節化血管発生により特性化される。さらに、多数の炎症性疾患も、非制御化新生
血管形成、例えば関節炎および乾癬に関連がある（Varner et al.1995）。新脈
管形成は、新しい血管が先在する血管から発生する生理学的過程である（Varner
et al.1995; Blood and Zetter 1990; Weidner et al. 1992）。この複雑な過
程は、増殖因子、細胞接着受容体、マトリックス分解酵素および細胞外マトリッ
クス構成成分を含めた種々の分子の共働を必要とする（Varner et al. 1995; Bl
ood and Zetter 1990; Weidner et al.1992）。したがって、新脈管形成を遮断
するよう意図された療法は、固形腫瘍の増殖を有意にもたらし得る。実際、腫瘍
新生血管形成の遮断は、種々の動物モデルにおいて腫瘍増殖を有意に抑制し得る
という明らかな証拠が提供されており、ヒト臨床データは、この主張を同様に支
持し始めている（Varner, J.A., Brooks, P.C., and Cheresh, D.A.（1995）Cel
l Adh. Commun. 3, 367-374）。すべての固形腫瘍の増殖は、最小サイズ以上に
腫瘍を継続的に拡張するためには新規の血管増殖を要する、ということを多数の
研究が示唆してきたことは重要である（Varner et al. 1995; Blood and Zetter
1990; Weidner et al.1992; Weidner et al.1991; Brooks et al.1995; Brook
s et al.1994; Brooks et al.1997）。

【０００５】このために、多数の研究者が、新脈管形成を開始する増殖因子およびサイトカ
インに対するそれらの抗脈管形成アプローチに焦点を合わせた（Varner et al.
1995; Blood and Zetter 1990; Weidner et al.1992; Weidner et al.1991; Br
ooks et al.1995; Brooks et al.1994; Brooks et al.1997）。しかしながら、
新脈管形成を刺激する能力を有する多数の異なる増殖因子およびサイトカインが
存在する。単一サイトカインを遮断することの療法的利点は、この重複性による
限定利点のみを有し得る。しかしながら、その他の抗脈管形成標的には注意がほ
とんど向けられていなかった。新脈管形成は、新規の血管発生を促すミクロ環境
を提供するためには、血管周囲の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）のタンパク質分
解的改造を要する、ということを近年の研究は示唆している（Varner et al. 19
95; Blood and Zetter 1990; Weidner et al.1992; Weidner et al.1991; Broo
ks et al.1995; Brooks et al.1994; Brooks et al.1997）。細胞外マトリック
スタンパク質コラーゲンは、動物における総タンパク質質量の25％以上およびＥ
ＣＭ内の大多数のタンパク質を構成する。コラーゲンは、多数の形態で存在する
繊維状多鎖三重らせんタンパク質である（Olsen, B.R.（1995）Curr. Opin. Cel
l Biol.7,720-727; Van der Rest, M.,and Garrone, R.（1991）FASEB 5,2814-2
823）。少なくとも18の遺伝的に異なる種類のコラーゲンが同定されており、そ
の多くが別個の組織分布および機能を有する（Olsen 1995; Van der Rest and G
arrone 1991）。Ｉ型コラーゲンは、細胞外マトリックス中で最もたくさんある
コラーゲン型である。Ｉ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型およびＶ型コラーゲンは、in viv
oでのすべての先在する血管と関連があることが示されている。Ｉ型およびＩＶ
型コラーゲンは、それぞれα１（Ｉ）およびα２（Ｉ）およびα１（ＩＶ）およ
びα２（ＩＶ）と呼ばれる主鎖から成る。成熟コラーゲン分子は、三重らせん中
に撚り合わされた２つのα１鎖および１つのα２鎖から成る。in vivoでは、コ
ラーゲンは普通は成熟三重らせん形態で見出される。成熟三重らせんコラーゲン
のネイティブ三次元構造の変性は、新脈管形成を制御する潜在調節領域を露呈し
得る。これらの潜在調節領域の拮抗作用は、新脈管形成の診断および抑制のため
の認識されていない手段を提供し得る。

【０００６】新脈管形成の抑制は腫瘍増殖を制限するための有用な療法であり得る、という
ことが提唱されている。新脈管形成の抑制は、（１）βＦＧＦ（繊維芽細胞増殖
因子）のような「脈管形成分子」の放出の抑制、（２）例えば抗βＦＧＦ抗体の
使用による脈管形成分子の中和、および（３）抗原性刺激に対する内皮細胞応答
の抑制により提唱された。この後者の戦略は注目を受け、Folkman et al., Canc
er Biology, 3:89-96（1992）は、新脈管形成を抑制するために用いられ得るコ
ラゲナーゼ阻害剤、基底膜代謝回転阻害剤、脈管形成抑制ステロイド、真菌由来
新脈管形成阻害剤、第４血小板因子、トロンボスポンジン、関節炎薬、例えばＤ
−ペニシラミンおよび金チオマレート、ビタミンＤ、類似体、α−インターフェ
ロン等を含めたいくつかの内皮細胞応答阻害剤を記載している。新脈管形成のさ
らに別の提唱阻害剤に関しては、Blood and Zetter 1990; Moses et al.（1990
）Science 248:1408-1410; Ingber et al.（1988）Lab. Invest., 59:44-51;お
よび米国特許第5,092,885号、第5,112,946号、第5,192,744号および第5,202,352
号を参照されたい。前記の参考文献中に記載された新脈管形成の阻害剤はどれも
、変性またはタンパク質分解化コラーゲンを標的にしていない。

【０００７】発明の要約本発明は、新脈管形成を抑制する変性またはタンパク質分解化コラーゲンのア
ンタゴニストを提供する。アンタゴニストは、変性またはタンパク質分解化コラ
ーゲンと特異的に結合するが、しかしネイティブ形態の同一コラーゲンとは実質
的低減化親和性で結合する。アンタゴニストは、変性Ｉ型コラーゲン、変性ＩＩ
型コラーゲン、変性ＩＩＩ型コラーゲン、変性ＩＶ型コラーゲンまたは変性Ｖ型
コラーゲンを含めたあらゆる変性コラーゲンに、あるいはそれらの組合せに特異
的であり得る。例えば、一実施態様では、アンタゴニストは、ネイティブ三重ら
せんＩ型コラーゲンと比較して変性Ｉ型コラーゲンに特異的であるが、しかし実
質的低減化親和性でその他の変性コラーゲン、例えばＩＶ型コラーゲンと結合す
る。別の実施態様では、アンタゴニストは変性ＩＶ型コラーゲンに特異的である
。アンタゴニストは、変性Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶおよびＶ型コラーゲンに対し
ても特異的である。

【０００８】アンタゴニストは、変性コラーゲンとは免疫反応するが、ネイティブ形態のコ
ラーゲンとは実質的により低い程度に免疫反応する抗体またはその機能的断片で
あり得る。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであり得る。アンタゴ
ニストは、変性コラーゲンに対する特異性を有するが、しかし天然（ネイティブ
）形態のコラーゲンに対しては特異性を有さないポリペプチドまたはペプチドで
もあり得る。アンタゴニストは、小型有機分子またはオリゴヌクレオチドのよう
な非ペプチドでもあり得る。

【０００９】したがって本発明は、組織における新脈管形成を抑制するための方法であって
、新脈管形成抑制量の変性／タンパク質分解コラーゲンのアンタゴニストを含有
する組成物を組織に投与することを包含する方法を記載する。

【００１０】処置される組織は、新血管形成が生じている罹患組織のような新脈管形成の抑
制が望ましいあらゆる組織であり得る。組織例としては、炎症組織、固形腫瘍、
転移、再狭窄を受けている組織等が挙げられる。

【００１１】本発明は、本発明のアンタゴニストを組織と接触させることによる組織におけ
る新脈管形成の検出方法も提供する。このような方法は、ex vivoおよびin vivo
の両方に用いるのに適している。

【００１２】本発明のアンタゴニストをex vivoまたはin vivoで組織と接触させることによ
り腫瘍組織、転移および組織中への腫瘍浸潤を検出するための方法も提供される
。

【００１３】本発明は、単数または複数の変性コラーゲンと特異的に結合するが、しかしネ
イティブ形態の単数または複数のコラーゲンとは実質的低減親和性で結合し、新
脈管形成を抑制し得るアンタゴニストのスクリーニング方法も提供する。

【００１４】発明の説明コラーゲン本発明の方法は、あらゆる動物からのものを含めた多数のコラーゲン分子とと
もに用いるのに適している。一実施態様では、コラーゲンはヒトコラーゲンであ
る。コラーゲンは、哺乳類、例えばラット、マウス、ブタ、ウサギなどから、あ
るいは鳥類、例えばニワトリからでもあり得る。一般に、コラーゲンは［Ｇｌｙ
−Ｘａａ−Ｘａａ］_ｎ配列を含有する細胞外マトリックスタンパク質である。コ
ラーゲンの種類は、当業界で周知である（例えば、Olsen, B.R.（1995）Curr. O
pin. Cell Biol.7,720-727; Kucharz, E.J. The Collagens:Biochemistry and P
athophysiology, Springer-Verlag, Berlin, 1992; Kunn, K. in Structure and
Function of Collagen Types, eds. R. Mayne and R.E. Burgeson, Academic P
ress, Orlando参照）。ヒトコラーゲンは、好ましいコラーゲンである。変性コ
ラーゲンは、それがもはやネイティブ三重らせん形態を主として想定しないよう
処理されたコラーゲンを指す。変性は、コラーゲンを加熱することにより成し遂
げられ得る。一実施態様では、コラーゲンは、約100℃に約15分間加熱すること
によっても成し遂げられ得る。適切なカオトロープ剤としては、例えばグアニジ
ニウム塩が挙げられる。コラーゲンの変性は、例えばタンパク質の吸光度、円二
色性または蛍光のような光学的特性における分光学的変化により、核磁気共鳴に
より、ラマン分光法により、または任意のその他の適切な技法によりモニタリン
グし得る。変性コラーゲンは、変性全長コラーゲンを、ならびにコラーゲンの断
片を指す。コラーゲンの断片は、ネイティブコラーゲン配列より短い任意のコラ
ーゲン配列であり得る。実質的ネイティブ構造を有するコラーゲンの断片に関し
ては、変性は、ネイティブ全長コラーゲンに関するのと同様に実行され得る。断
片は、それらが有意のネイティブ構造を有さないかまたはネイティブ三重らせん
形態の有意のネイティブ構造を伴わない領域を保有するようなサイズのものであ
り得る。このような断片は、熱またはカオトロープ剤の使用を必要とせずに、全
部または一部を変性される。変性コラーゲンという用語は、タンパク質分解化コ
ラーゲンを包含する。タンパク質分解化コラーゲンは、タンパク質分解酵素の作
用により断片化されたコラーゲンを指す。特に、タンパク質分解化コラーゲンは
、メタロプロテイナーゼ、例えばＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２またはＭＭＰ−９でコ
ラーゲンを処理することにより、あるいはコラーゲン分解活性を含有する細胞抽
出物でコラーゲンを処理することにより調製され得るし、あるいは組織中の新生
血管形成の部位に天然に生じるものである。

【００１５】コラーゲン内の潜在エピトープは、ネイティブコラーゲン内での認識に関して
曝露されないが、しかし変性コラーゲンのアンタゴニストにより認識され得る配
列である。潜在エピトープの配列は、アンタゴニストの特異性を確定することに
より同定され得る。候補潜在エピトープは、例えばネイティブ三重らせんコラー
ゲンの三次元構造を調べることによっても同定され得る。曝露される溶媒でない
か、または一部だけネイティブ構造中で曝露されるペプチド配列は、有力な潜在
エピトープである。

【００１６】エピトープは、本発明のアンタゴニストにより認識される単数または複数のア
ミノ酸配列である。エピトープは、線状ペプチド配列であり得るか、または非連
続アミノ酸配列で構成され得る。アンタゴニストは、１つ又はそれ以上の配列を
認識し、したがってエピトープは１つより多くの別個のアミノ酸配列標的を限定
し得る。アンタゴニストにより認識されるエピトープは、当業者に周知のペプチ
ドマッピングおよび配列分析技法により確定され得る。

【００１７】アンタゴニスト本発明のアンタゴニストは、変性コラーゲンと結合するが、しかしネイティブ
形態のコラーゲンとは実質的低減化親和性で結合する。「実質的低減化親和性」
とは、変性コラーゲンに関する値の約３分の１の、さらに好ましくは約５分の１
の、さらに好ましくは約10分の１以下の親和性である。同様に、「実質的に低い
」とは、相対的親和性を示す場合に少なくとも約３倍の差を示す。アンタゴニス
トは、好ましくは、変性Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶまたはＶ型コラーゲンおよびそ
れらの混合物のいずれかに特異的である。一実施態様では、アンタゴニストは変
性Ｉ型コラーゲンと結合するが、しかし婦負ｔんぶＩ型コラーゲンならびに変性
ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶおよびＶ型コラーゲンとは実質的低減化親和性で結合する。
別の実施態様では、アンタゴニストは変性ＩＶ型コラーゲンと結合するが、しか
しネイティブＩＶ型コラーゲンとは実質的低減化親和性で結合する。別の実施態
様では、アンタゴニストは、変性Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型およびＶ型コ
ラーゲンと結合するが亜、しかしネイティブＩ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型お
よびＶ型コラーゲンとは実質的低減化親和性で結合する。

【００１８】見掛けの親和性は、酵素結合イムノソルベント検定（ＥＬＩＳＡ）のような方
法、または当業者によく知られた任意のその他の技法により確定され得る。真の
親和性は、当業者に既知の技法により測定され得る。

【００１９】一実施態様では、アンタゴニストにより認識されるエピトープを含有するペプ
チドは、それ自体用いられ得る。一実施態様では、モノクローナル抗体ＨＵＩ７
７、ＨＵＩＶ２６およびＸＬ３１３により限定されるエピトープは、抗脈管形成
組成物としてそれ自体用いられ得る。

【００２０】本発明は、本発明の方法にしたがって用いるための候補変性コラーゲンアンタ
ゴニストを同定するための検定方法も提供する。これらの検定方法では、候補ア
ンタゴニストは、変性コラーゲンおよびネイティブコラーゲンの両方と結合する
それらの能力に関して評価され、さらに組織中の新脈管形成を抑制する場合のそ
れらの効力に関して評価され得る。

【００２１】ＥＬＩＳＡ第一検定は、ＥＬＩＳＡにより固相中の変性またはネイティブコラーゲンとの
アンタゴニストの結合を測定する。本検定は、種々の種類のコラーゲンに関して
有用であり、例えば、本検定は、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶおよびＶ型コラーゲン
に関して、ならびにその他の細胞外マトリックス構成成分のために用いられ得る
。

【００２２】本検定は、変性形態のコラーゲンに対する特異性を示すがネイティブ形態のコ
ラーゲンに対しては特異性を示さない化合物を同定するためにも用いられ得る。
特異性検定は、可能性のあるアンタゴニストが、変性およびネイティブコラーゲ
ンを結合する能力に関して別々の検定小室で同時にスクリーニングされる平行Ｅ
ＬＩＳＡを実行することにより実施される。

【００２３】変性コラーゲンのアンタゴニストは、本発明のアンタゴニストと結合に関して
競合するそれらの能力によっても同定され得る。例えば、推定アンタゴニストは
、結合検定、例えばＥＬＩＳＡにおいて、既知のアンタゴニスト、例えばＨＵＩ
７７、ＨＵＩＶ２６またはＸＬ３１３の親和性に及ぼすそれらの作用をモニタリ
ングすることによりスクリーニングされ得る。このようなアンタゴニストは、Ｈ
ＵＩ７７と同一の特異性を有し、同一潜在エピトープを認識すると思われる。ア
ンタゴニストは、慣用的結合検定により推定アンタゴニストから選択されて、変
性コラーゲンエピトープと結合するが既知のアンタゴニストとは結合しないもの
を確定し得る。

【００２４】アンタゴニストは、変性コラーゲンを含有する固体マトリックスと結合するそ
れらの能力によっても同定され得る。このような推定アンタゴニストは、溶液条
件、例えば塩濃度、ｐＨ、温度などを変えた後に、収集される。推定アンタゴニ
ストはさらに、適切な溶液条件下で、ネイティブコラーゲンが添付された固体マ
トリックスを通過するそれらの能力により同定される。

【００２５】本発明のアンタゴニストは、組織中の新脈管形成を変調するそれらの能力に関
して検定され得る。当業者に既知の任意の適切な検定を用いて、このような作用
をモニタリングし得る。いくつかのこのような技法は、本明細書中に記載されて
いる。

【００２６】第二検定は、漿尿膜（ＣＡＭ）中の新脈管形成を測定し、ＣＡＭ検定と呼ばれ
る。ＣＡＭ検定は、他の者により詳細に記載されており、さらに腫瘍組織の新脈
管形成および新生血管形成の両方を測定するために用いられてきた（Ausprunk e
t al., Am. J. Pathol., 79:597-618（1975）およびOssonski et al., Cancer R
es., 40:2300-2309（1980）参照）。

【００２７】ＣＡＭ検定は、全組織の新生血管形成が起こり、そして実際のヒヨコ胚血管が
ＣＡＭ中にまたはＣＡＭ上で増殖する組織中に増殖しつつあるために、in vivo
新脈管形成に関する十分認識された検定である。

【００２８】本明細書中で実証されるように、ＣＡＭ検定は、新規の血管増殖の量および程
度の両方に基づいた新生血管形成の抑制を説明する。さらに、腫瘍組織のような
ＣＡＭ上に移植される任意の組織の増殖をモニタリングすることは容易である。
最後に、本検定は、検定系中に毒性に関する内部対照が存在するために、特に有
用である。ヒヨコ胚は任意の試験試薬に曝露され、したがって胚の健康は毒性の
指標である。

【００２９】第三検定は、in vivoウサギ眼モデルにおける新脈管形成を測定し、ウサギ眼
検定と呼ばれている。ウサギ眼検定は、他の者により詳細に記載されており、さ
らに、サリドマイドのような脈管形成阻害剤の存在下で新脈管形成および新生血
管形成の両方を祖ｋていするために用いられてきた（D'Amato et al.（1994）Pr
oc. Natl. Acad. Sci. 91:4082-4085参照）。

【００３０】ウサギ眼検定は、角膜の縁から角膜中に増殖するウサギ血管により例示される
新生血管形成が眼の天然透明角膜を通して容易に可視化されるため、in vivo新
脈管形成に関する十分認識された検定モデルである。さらに、新生血管形成の刺
激または抑制、あるいは新生血管形成の退行の程度および量は、長期間容易にモ
ニタリングされ得る。

【００３１】最後に、ウサギは、任意の試験試薬に曝露され、したがってウサギの健康は試
験試薬の毒性の指標である。

【００３２】第四検定は、キメラマウス：ヒトマウスモデルにおける新脈管形成を測定し、
キメラマウス検定と呼ばれる。本検定は、他の者により詳細に記載されており、
さらに、新脈管形成、新生血管形成および腫瘍組織の退行を測定するために本明
細書中に記載されている（Yan, et al.（1993）J. Clin. Invest. 91:986-996参
照）。

【００３３】キメラマウス検定は、移植皮膚片が組織学的に正常ヒト皮膚に非常によく似て
おり、実際のヒト血管が移植ヒト皮膚の表面で移植ヒト皮膚からヒト腫瘍組織に
増殖中の場所で全組織の新生血管形成が生じているため、in vivo新脈管形成に
関する有用な検定モデルである。ヒト移植片への新生血管形成の起源は、ヒト特
異的内皮細胞マーカーを用いた新生血管系の免疫組織化学的染色により実証され
得る。

【００３４】キメラマウス検定は、新生血管増殖の退行の量および程度の両方に基づいて新
生血管形成の退行を実証する。さらに、腫瘍組織のような移植皮膚上に移植され
る任意の組織の増殖に及ぼす作用をモニタリングすることは容易である。最後に
、本検定は、検定傾注に毒性に関する内部対照が存在するために有用である。キ
メラマウスは任意の試験試薬に曝露され、したがってマウスの健康は毒性の指標
である。

【００３５】抗体本発明は、一実施態様において、変性コラーゲンと結合するが、しかしネイテ
ィブコラーゲンとは実質的低減化親和性で結合する抗体の形態の変性コラーゲン
アンタゴニストを記載する。抗体アンタゴニストは、新脈管形成を抑制し得る。
本発明は、抗体を産生する細胞株、細胞株の生成方法、およびモノクローナル抗
体の産生方法も記載する。

【００３６】本発明の抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであり得る。一実施態
様では、用いられる抗体は、モノクローナルである。本発明のモノクローナル抗
体は、単離変性コラーゲンと免疫反応するが、しかしネイティブ形態のコラーゲ
ンとは実質的低減化親和性で免疫反応する抗体分子を包含する。一実施態様では
、本発明の抗体は、変性Ｉ型コラーゲンに関する親和性より少なくとも約３倍、
さらに好ましくは少なくとも約５倍、最も好ましくは少なくとも約10倍の親和性
で変性Ｉ型を認識する。本発明の抗体は、好ましくは変性ＩＶ型コラーゲンも結
合し得るし、ネイティブＩＶ型コラーゲンとは実質的低減化親和性で結合する。
本発明の抗体は、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶおよびＶ型コラーゲンの各々とも結合
し、ネイティブ形態の各々のコラーゲンとは実質的低減化親和性で結合する。

【００３７】変性コラーゲンと優先的に結合する好ましいモノクローナル抗体としては、ｍ
ＡｂＨＵＩ７７、ｍＡｂＨＵＩＶ２６またはｍＡｂＸＬ３１３の免疫反応特徴を
有するモノクローナル抗体が挙げられる。

【００３８】本発明の抗体アンタゴニストは、当業者に既知の多数の方法により生成され得
る。例えば、動物は変性コラーゲンまたはその断片で免疫感作され得る。このよ
うにして生成される抗体は、変性タンパク質分解化コラーゲンと結合するそれら
の能力に関して、およびネイティブ形態の同一コラーゲンに対する実質的低減化
親和性に関して選択され得る。抗体は、例えば「差引き免疫感作」の方法により
生成され得る（例えば、Brooks, P.C. et al.（1993）J. Cell. Biol. 122:1351
-1359参照）。

【００３９】「抗体または抗体分子」という用語は、種々の文法的形態において、免疫グロ
ブリン分子および／または免疫グロブリン分子の免疫学的活性部分、即ち抗体結
合部位またはパラトープを含有する分子の集団を指す集合名詞として本明細書中
で用いられる。

【００４０】「抗体結合部位」とは、抗原を特異的に結合する重および軽鎖可変部および超
可変部から成る抗体分子の構造的部分である。

【００４１】本発明に用いるための抗体の例は、無傷免疫グロブリン分子、実質的無傷免疫
グロブリン分子およびパラトープを含有する免疫グロブリン分子の一部、例えば
Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２およびＦ（ｖ）であり、抗体断片とも呼ばれ
る。

【００４２】別の好ましい実施態様では、本発明は、本発明のモノクローナル抗体に由来す
るＦａｂ断片を包含する切頭化免疫グロブリン分子を意図する。Ｆｃ受容体を欠
くＦａｂ断片は可溶性であり、血清半減期に療法的利点を、そして可溶性Ｆａｂ
断片の使用様式に診断的利点をもたらす。可溶性Ｆａｂ断片の調製は免疫学業界
で一般的に既知であり、種々の方法により成し遂げられ得る。

【００４３】例えば、抗体のＦａｂおよびＦ（ａｂ’）_２部分（断片）は、周知の方法によ
り実質的に無傷の抗体上でそれぞれパパインおよび／プシンのタンパク質分解反
応により調製される（例えば、米国特許第4,342,566号（Theofilopolous and Di
xon）参照）。Ｆａｂ’抗体部分も周知であり、（Ｆａｂ’）サブ２部分から産
生され、その後、メルカプトエタノールとの場合には２つの重鎖部分を連結する
ジスルフィド結合を還元し、そしてヨードアセトアミドのような試薬で結果的に
生じるタンパク質メルカプタンをアルキル化する。無傷免疫グロブリン分子を含
有する抗体が好ましく、本明細書中での説明のように利用される。

【００４４】「モノクローナル抗体」という語句は、その種々の文法形態で、特定のエピト
ープと免疫反応し得る１つの種のみの抗体結合部位を含有する抗体分子の集団を
指す。したがってモノクローナル抗体は、各々が異なるエピトープに対して免疫
特異的である複数の抗体結合部位を有する抗体分子、例えば二特異的モノクロー
ナル抗体を含有する。

【００４５】モノクローナル抗体は、典型的には、１種類の抗体分子だけを分泌（産生）す
るハイブリドーマと呼ばれる単一細胞のクローン二より産生される抗体から成る
。ハイブリドーマ細胞は、抗体産生細胞および骨髄腫またはその他の自己不朽性
細胞株を融合することにより生成される。このような抗体の調製は、Kohler and
Milstein, Nature 256:495-497（1975）（この記載内容は、参照により本明細
書中に含まれる）により最初に記載された。さらに別の方法は、Zola, Monoclon
al Antibodies:A Manual of Techniques, CRC Press, Inc.（1987）により記載
されている。そのようにして調製されるハイブリドーマ上清は、変性コラーゲン
と免疫反応する抗体分子の存在に関してスクリーニングされ得る。

【００４６】要するに、モノクローナル抗体組成物が生成されるハイブリドーマを生成する
ために、骨髄腫またはその他の自己不朽性細胞株を、変性コラーゲンの供給源で
超免疫感作された哺乳類の脾臓から得られるリンパ球と融合させる。

【００４７】ハイブリドーマを調製するために用いられる骨髄腫細胞株はリンパ球と同一種
からであるのが好ましい。典型的には、129GIX.sup.+系統のマウスが好ましい哺
乳類である。本発明に用いるための適切なマウス骨髄腫としては、アメリカ培養
細胞コレクション（Rockville, Md.）からそれぞれCRL 1580およびCRL 1581の名
称で入手可能なヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン感受性（ＨＡＴ）細
胞株P3X63-Ag8.653およびSp2/0-Ag14が挙げられる。

【００４８】脾臓細胞は、典型的には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）1500を用いて骨
髄腫細胞と融合される。融合ハイブリッドは、選択的増殖培地、例えばＨＡＴ（
ヒポキサンチンアミノプテリンチミジン）培地に対するそれらの感受性により選
択される。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、実施例に
記載される酵素結合イムノソルベント検定（ＥＬＩＳＡ）を用いて同定される。

【００４９】本発明のモノクローナル抗体は、適切な特異性を有する抗体分子を分泌するハ
イブリドーマを含有する栄養培地を包含するモノクローナルハイブリドーマ培養
を開始することによっても産生され得る。培養は、ハイブリドーマが培地中に抗
体分子を分泌するのに十分な条件下および期間中保持される。次に抗体含有培地
が収集される。抗体分子は次に、周知の技法によりさらに単離される。

【００５０】これらの組成物の調製に有用な培地は、当業界で周知であり且つ市販されてお
り、合成培地、近交系マウスなどを含む。合成培地の例は、4.5 g/Lグルコース
、20nMグルタミンおよび20％ウシ胎仔血清を補足したダルベッコの最小必須培地
（ＤＭＥＭ；Dulbecco et al., Virol. 8:396, 1959）である。近交系マウス系
統の例は、Balb/cである。

【００５１】モノクローナル抗体、ハイブリドーマ細胞またはハイブリドーマ細胞培養のそ
の他の産生方法も周知である。例えば、Sastry et al.（1989）Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA 86:5728-5732；およびHuse et al.（1989）Science, 246:1275-128
1により記載されているような免疫学的範囲からのモノクローナル抗体の単離方
法を参照されたい。

【００５２】ハイブリドーマ細胞、ならびに本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブ
リドーマ細胞を含有する培養も本発明により意図される。特に好ましいのは、モ
ノクローナル抗体ｍＡｂＨＵＩ７７、ｍＡｂＨＵＩＶ２６またはｍＡｂＸＬ３１
３を分泌するハイブリドーマ細胞株である。

【００５３】本発明は、一実施態様において、ＭａｂＨＵＩ７７、ＭａｂＨＵＩＶ２６また
はＭａｂＸＬ３１３の免疫反応特徴を有するモノクローナル抗体を意図する。

【００５４】不適当な実験を伴わずに、モノクローナル抗体が本発明のモノクローナル抗体
が予備選定標的分子と結合するのを妨げるか否かを確証することにより、あるモ
ノクローナル抗体が本発明のモノクローナルと等価の特異性を有するか否かを確
定することもできる。固相中に存在する場合の標的分子との結合に関する標準競
合検定における本発明のモノクローナル抗体による結合の低減により示されるよ
うに、試験されるモノクローナル抗体が本発明のモノクローナル抗体と競合する
場合には、２つのモノクローナル抗体は同一のまたは密接に関連するエピトープ
と結合すると思われる。

【００５５】モノクローナル抗体が本発明のモノクローナル抗体の特異性を有するか否かを
確定するためのさらに別の方法は、当該抗体のＣＤＲ領域のアミノ酸残基配列を
決定することである。それらのＣＤＲ領域内に同一のまたは機能的に等価のアミ
ノ酸残基配列を有する抗体分子は、同一結合特異性を有する。ポリペプチドのシ
ーケンシング方法は、当業界で周知である。これは、別個のＣＤＲ領域を有する
抗体が同一エピトープと結合し得ないことを示唆しない。

【００５６】抗体の免疫特異性、その標的分子結合能力および抗体がエピトープに対して示
す付随的親和性は、抗体が免疫反応するエピトープにより限定される。エピトー
プ特異性は、少なくとも一部は、抗体の免疫グロブリンの重鎖の可変部のアミノ
酸残基配列により、そして一部は軽鎖可変部アミノ酸残基配列により限定される
。

【００５７】「〜の結合特異性を有する」という用語の使用は、等価モノクローナル抗体が
同一または類似の免疫反応（結合）特徴を示し、予備選定標的エピトープとの結
合に関して競合することを示す。

【００５８】ヒト化モノクローナル抗体は、特にそれらがヒトにおいて療法的に用いられ得
る限りにおいて、ネズミモノクローナル抗体を上回る特定の利点を提供する。特
に、ヒト抗体は、「外来」抗原ほど迅速に循環から掃去されず、外来抗原および
外来抗体と同一方法で免疫系を活性化しない。「ヒト化」抗体の調製方法は、一
般に当業界で周知であり、本発明の抗体に容易に適用され得る。

【００５９】したがって、本発明は、一実施態様において、抗原を結合する抗体の能力を実
質的に妨げずに、ヒト免疫系の構成成分を導入するために移植することによりヒ
ト化される本発明のモノクローナル抗体を意図する。

【００６０】本発明の抗体は、完全ヒト抗体、例えばHaard, H.J. et al.（1999）J. Biol.
Chem. 274:18218-30にそしてWinter, G. et al.（1994）Annu. Rev. Immunol.
12:433-55に記載されているもののような、例えばヒト一本鎖または二本鎖抗体
を表示する抗体ファージ表示ライブラリーからの選択により生成されるものであ
り得る。

【００６１】ポリペプチド変性コラーゲンのアンタゴニストは、ポリペプチドまたはペプチドでもあり得
る。ポリペプチドという用語は、連続アミノ酸残基のαアミノ基とカルボキシ基
との間のペプチド結合により互いに連結される３またはそれ以上のアミノ酸の配
列を指す。ペプチドという用語は、本明細書中で用いられる場合、一連の線状の
、ポリペプチドの場合と同様に互いに連結された２またはそれ以上のものを指す
。

【００６２】一実施態様では、本発明は、ポリペプチドの形態の変性コラーゲンアンタゴニ
ストを意図する。変性コラーゲンのポリペプチドアンタゴニストは、変性コラー
ゲンと結合し得るが、しかしネイティブ形態のコラーゲンとは実質的低減化親和
性で結合する任意のペプチドまたはポリペプチドであり得る。

【００６３】変性コラーゲンに関する選択性を有する好ましい変性コラーゲンアンタゴニス
トペプチドの同定は、実施例に記載されるＥＬＩＳＡのような結合検定の典型的
抑制において容易に同定され得る。

【００６４】ペプチドおよびポリペプチドアンタゴニストは、当業者に既知の多数の技法に
より生成され得る。例えば、二ハイブリッド系（例えば、Fields, S.（1989）Na
ture 340:245-6）は、コラーゲンペプチドと結合するライブラリーからタンパク
質アンタゴニストを選択するための「餌」としてコラーゲンの断片を用い得る。
考え得るアンタゴニストのライブラリーは、例えばｃＤＮＡライブラリーから得
られ得る。別の実施態様では、考え得るアンタゴニストは、既知のコラーゲン結
合タンパク質の変異体であり得る。このようなタンパク質は、無作為に突然変異
原化されるか、あるいは遺伝子シャッフリングまたは配列分散性を生成するため
のその他の利用可能な技法を施され得る。

【００６５】本発明のペプチドおよびポリペプチドアンタゴニストは、分子進化の技法によ
っても生成され得る。タンパク質のライブラリーは、突然変異誘発、遺伝子シャ
ッフリングまたは分子構造分散性を生成するためのその他の利用可能な技法によ
り生成され得る。多数の変異体を示すタンパク質プールは、例えばこのようなタ
ンパク質プールを、変性コラーゲンが付着された固体マトリックス全体を通すこ
とにより、変性コラーゲンと結合するそれらの能力に関して選択され得る。例え
ば、塩の勾配を用いた溶離は、変性コラーゲンに関する親和性を有する変異体の
精製を提供する。ネガティブ選択工程も含まれ、それによりこのようなプールが
、ネイティブコラーゲンが付着された固体マトリックス全体を通される。炉液は
、ネイティブ形態のコラーゲンに対して親和性低減を示すプール内の変異体を含
有する。

【００６６】本発明のペプチドおよびポリペプチドアンタゴニストは、ファージ表示によっ
ても生成され得る。無作為化ペプチドまたはタンパク質は、ファージコートタン
パク質との融合体のようなファジミド粒子の表面に発現され得る。一価ファージ
表示の技法は、広範に利用可能である（例えば、Lowman H.B. et al.（1991）Bi
ochemistry 30:10832-8参照）。無作為化ペプチドまたはタンパク質ライブラリ
ーを発現するファージは、ネイティブコラーゲン分子が付着された固体マトリッ
クスを用いて選別される。残りのファージは、ネイティブコラーゲンと結合しな
いか、または実質的低減化親和性でネイティブコラーゲンと結合する。次にファ
ージは、変性コラーゲンが付着されていた固体マトリックスに対して選別される
。結合ファージは、溶液条件の変更により、または、適切に意図された構築物に
関しては、ファージコートタンパク質を無作為化ペプチドまたはタンパク質ライ
ブラリーと連結するリンカー領域のタンパク質分解的切断により、単離され、固
体マトリックスから分離される。単離ファージは、選定アンタゴニストの同一性
を確定するためにシーケンシングされ得る。

【００６７】別の実施態様では、ポリペプチドは、ポリペプチドが変性コラーゲンのアンタ
ゴニストであるが、しかしネイティブコラーゲンのアンタゴニストではない限り
は、そのアミノ酸残基配列が本明細書中に示されるポリペプチドのあらゆる類似
体、断片または化学的誘導体を含む。したがって、本発明のポリペプチドは、種
々の変更、置換、挿入および欠失を施され得るが、この場合、このような変化は
、その使用においてある種の利点を提供する。この点に関しては、本発明の変性
コラーゲンアンタゴニストポリペプチドは、１つ又はそれ以上の変更が成され、
そしてそれが本明細書中に記載したような１つ又はそれ以上の検定において変性
コラーゲンアンタゴニストとして機能する能力を保持する詳述されるペプチドの
配列と同一であるというよりむしろ、それに対応する。

【００６８】したがって、ポリペプチドは、ペプチド誘導体の種々の形態のいずれかで、ア
ミド、タンパク質との複合体、環化ペプチド、重合ペプチド、類似体、断片、化
学的修飾ペプチド、および誘導体を含むものであり得る。

【００６９】その他のアンタゴニスト本発明のアンタゴニストは、天然物質、あるいは慣用的有機合成または組合せ
有機合成により合成される化合物のような小型有機分子であり得る。化合物は、
例えば、前記のカラム結合技法を用いることにより、変性コラーゲンと結合する
それらの能力に関して試験され得る。化合物は、同様のカラム結合技法により、
ネイティブ形態のコラーゲンに対する低減化親和性に関しても選択される。

【００７０】本発明のアンタゴニストは、非ペプチド化合物でもあり得る。適切な非ペプチ
ド化合物としては、例えばオリゴヌクレオチドが挙げられる。オリゴヌクレオチ
ドは、本明細書中で用いられる場合、プリン、ピリミジンおよびその他の芳香族
塩基を含有する任意のヘテロ高分子物質を指す。ＤＮＡおよびＲＮＡオリゴヌク
レオチドは、糖（例えば、２’アルキル化リボース）および主鎖修飾（例えば、
ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド）を有するオリゴヌクレオチドであるの
で、本発明とともに用いるのに適している。オリゴヌクレオチドは、一般に見出
されるプリンおよびピリミジン塩基、例えばアデニン、チミン、グアニン、シチ
ジンおよびウリジン、ならびに複素環式環部分（例えば、７−デアザグアニン）
内で、または環外位置で修飾される塩基を呈示し得る。オリゴヌクレオチドは、
ポリアミド核酸などを含めた芳香族塩基も呈示し得る別個の構造を有するヘテロ
ポリマーも包含する。

【００７１】本発明のオリゴヌクレオチドアンタゴニストは、当業者に既知の多数の方法に
より生成され得る。一実施態様では、多数の配列を含有するオリゴヌクレオチド
のプールが生成される。プールは、例えば伸長工程でモノマーの混合物を用いる
固相合成により生成され得る。オリゴヌクレオチドのプールは、変性コラーゲン
またはその断片が添付された固体マトリックス上にプールを含有する溶液を通す
ことにより分類される。変性コラーゲンと結合するプール内の配列は、固体マト
リックス上に保持される。これらの配列は、異なる塩濃度またはｐＨの溶液で溶
離される。選択された配列を、二次選択工程に付す。選択されたプールを、ネイ
ティブコラーゲンが添付されていた二次固体マトリックス上を通す。カラムは、
ネイティブコラーゲンと結合する配列を保持し、したがって変性コラーゲンに特
異的な配列に関してプールを濃縮する。プールは増幅され、必要な場合には突然
変異原化され、そしてプールが本発明のアンタゴニストの特徴を示すまで、工程
が反復される。個々のアンタゴニストは、通常は前記の配列を宿主生物、例えば
大腸菌中にクローニング後に、オリゴヌクレオチドプールの成員をシーケンシン
グすることにより同定され得る。

【００７２】疾患治療本発明は一般的に、ネイティブコラーゲンでなく、変性コラーゲン中のある種
のエピトープの結紮が新脈管形成を抑制する、という発見に関する。この発見は
、新脈管形成が種々の疾患過程で演じる役割のために、重要である。新脈管形成
を抑制することにより、疾患に介入し、症状を改善し、そしていくつかの場合に
は疾患を治癒することができる。

【００７３】新規の血管の増殖が疾患に関連した病理の原因であるかまたはそれに関与する
場合、新脈管形成の抑制は疾患の有害作用を低減する。例としては、乾癬、慢性
関節リウマチ、糖尿病性網膜症、炎症性疾患、再狭窄、黄斑変性等が挙げられる
。新規血管の増殖が有害組織の増殖を支持するために必要とされる場合、新脈管
形成の抑制は組織への血液供給を低減し、それにより血液供給要件を基礎にした
組織塊の低減に寄与する。例としては、腫瘍が２〜３ミリ厚を超えて増殖するた
めに、ならびに固形腫瘍転移の確立のために、新生血管形成が連続的要件である
腫瘍の増殖が挙げられる。

【００７４】本発明の方法は、一部は、療法が新脈管形成に対して非常に選択的であるが、
他の生物学的過程に対してはそうではないために、有効である。実施例に示され
るように、新規の血管増殖のみが変性コラーゲンのアンタゴニストにより抑制さ
れ、したがって療法は成熟血管に悪影響を及ぼさない。これも実施例に示される
ように、アンタゴニストは腫瘍中の血管形成部位と結合するが、しかし正常周囲
組織とは結合しない。

【００７５】変性コラーゲン単独の結紮が新脈管形成を効率的に抑制し得るという発見は、
おそらくは高特異性を有し、したがって相対的に低毒性である治療組成物の開発
を可能にする。したがって、本発明は、１つ又はそれ以上の変性コラーゲンと結
紮する能力を有する抗体ベースの新脈管形成の使用を開示するが、しかし変性コ
ラーゲンとは特異的に結紮するが、ネイティブコラーゲンとはそうしないその他
のアンタゴニストを設計し得る。本発明の発見の前には、新脈管形成ならびに新
脈管形成に依存する任意の過程が、コラーゲン中の潜在エピトープを拮抗する試
薬、即ちタンパク質分解化または変性コラーゲン中には見出されるが、ネイティ
ブ形態の同一コラーゲン中には見出されないものの使用により、in vivoで抑制
され得るということは知られていなかった。

【００７６】新脈管形成の抑制方法本発明は、組織中の新脈管形成の抑制方法、ならびにそれにより、新生脈管形
成に依存する組織中の事象を抑制するための方法を提供する。一般に、本方法は
、新脈管形成抑制量の変性コラーゲンアンタゴニストを包含する組成物を組織に
投与することを包含する。

【００７７】前記と同様に、新脈管形成は、「出芽」、脈管形成、または脈管伸長を含めた
組織の新生血管形成を包含する種々の過程を含み、新脈管形成過程はすべて、血
管中の細胞外マトリックスコラーゲンの崩壊を包含する。外傷性創傷治癒、黄体
形成および胚形成を除いて、大多数の新脈管形成過程は疾患過程に関連しており
、したがって本発明の治療法の使用は疾患に対して選択的である、と考えられる
。

【００７８】新脈管形成が重要であると考えられ、血管由来疾患と呼ばれる種々の疾患が存
在するが、それらの例としては、炎症性障害、例えば免疫性および非免疫性炎症
、慢性関節リウマチおよび乾癬、脈管の不適切なまたは時機を失した浸潤、例え
ば糖尿病性網膜症、新生血管性緑内障、再狭窄、アテローム硬化性斑および骨粗
鬆症における毛管増殖、癌関連障害、例えば固形腫瘍、固形腫瘍転移、血管繊維
腫、水晶体後繊維増殖症、血管腫、カポジ肉腫、ならびに腫瘍増殖を支持するた
めに新生血管形成を必要とするような癌が挙げられるが、これらに限定されない
。その他の適切な腫瘍としては、黒色腫、癌腫、肉腫、繊維肉腫、神経膠腫およ
び星状細胞腫が挙げられる。したがって、罹患組織における新脈管形成を抑制す
る方法は、疾患の症状を改善し、疾患によっては、疾患の治癒に寄与し得る。一
実施態様では、本発明は組織における新脈管形成それ自体の抑制を意図する。組
織中の新脈管形成の程度、したがって本発明の方法により達成される抑制の程度
は、例えば免疫組織化学によりタンパク質分解かまたは変性コラーゲン−免疫陽
性未熟および発生期の脈管構造を検出するための、実施例に記載されているよう
な種々の方法により評価され得る。

【００７９】本明細書中に前記したように、種々の組織または組織化された組織から成る器
官のいずれか、例えば皮膚、筋肉、腸、結合組織、関節、骨、ならびに脈管形成
性刺激時に血管が浸潤し得るような組織は、疾患状態における新脈管形成を支持
し得る。本明細書中で用いられる組織は、すべての体液、分泌物など、例えば血
清、血液、脳脊髄液、血漿、尿、滑液、硝子体液も包含する。

【００８０】したがって、一関連実施態様では、治療される組織は炎症組織であり、抑制さ
れる新脈管形成は、炎症組織の新生血管形成が認められる炎症組織新脈管形成で
ある。この種類においては、本方法は、関節炎組織における、例えば慢性関節リ
ウマチ患者における、免疫または非免疫性炎症組織における、乾癬組織等におけ
る新脈管形成の抑制を意図する。

【００８１】その多数の実施態様において本発明において治療される患者は、望ましくはヒ
ト患者であるが、しかし、本発明の原理は、本発明はすべての哺乳類に関して有
効であり、これらは「患者」という用語に含まれるよう意図されるということを
示すと理解されるべきである。この情況では、哺乳類は、新脈管形成に関連した
疾患の治療が望ましいあらゆる哺乳類種、特に農業用および家畜哺乳類種を含む
と理解される。このような患者は、例えばブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ラ
バ、ロバ、イヌ、ネコ、ウサギ、マウスおよびラットであり得る。

【００８２】別の関連実施態様では、治療される組織は、糖尿病性網膜症、黄斑変性または
新生血管性緑内障であり、そして抑制される新脈管形成は、網膜組織の新生血管
形成が認められる網膜組織新脈管形成である。

【００８３】さらに別の関連実施態様では、治療される組織は、固形腫瘍、転移、皮膚癌、
乳癌、血管腫または血管繊維腫、および同様の癌であり、抑制される新脈管形成
は、腫瘍組織の新生血管形成が認められる腫瘍組織新脈管形成である。本発明の
方法により治療可能な典型的固形腫瘍組織としては、肺、膵臓、乳房、結腸、喉
頭、卵巣、カポジ肉腫および同様の組織が挙げられる。腫瘍組織新脈管形成およ
びその抑制の例は、実施例に記載される。

【００８４】腫瘍組織新脈管形成の抑制は、腫瘍増殖において新生血管形成が演じる重要な
役割のために、特に好ましい実施態様である。腫瘍組織の新生血管形成の非存在
下では、腫瘍組織は必要な栄養を獲得せず、増殖が遅く、さらなる増殖を終結し
、退行し、結局は壊死性となって腫瘍は殺害される。

【００８５】言い換えれば、本発明は、本発明の方法にしたがって腫瘍新脈管形成を抑制す
ることにより、腫瘍新生血管形成を抑制する方法を提供する。同様に、本発明は
、脈管形成抑制方法を実施することによる腫瘍増殖の抑制方法を提供する。

【００８６】本方法は、転移の形成に対しても、（１）それらの形成は、転移癌細胞が原発
性腫瘍を出ることができるよう原発性腫瘍の血管形成を必要とし、そして（２）
二次部位におけるそれらの確立が転移の増殖を支持するための新生血管形成を必
要とするために、特に有効である。

【００８７】関連実施態様では、本発明は、固形腫瘍に対して向けられる、そして転移の確
立の制御のための慣用的化学療法のような他の療法を伴った本方法の実施を意図
する。新脈管形成阻害剤の投与は、典型的には化学療法中またはその後に実行さ
れるが、しかし、腫瘍組織への血管供給および栄養の準備により回復するために
新脈管形成を誘導することにより腫瘍組織が毒性襲撃に応答中である化学療法の
レジメン後に新脈管形成を抑制するのが好ましい。さらに、固形腫瘍が転移に対
する予防処置として除去された外科手術後に新脈管形成抑制方法を施すのが好ま
しい。

【００８８】本発明が腫瘍新生血管形成の抑制に適用される限り、本方法は、腫瘍組織増殖
の抑制に、腫瘍転移形成の抑制に、そして確立された腫瘍の退行に適用され得る
。

【００８９】再狭窄は、血管形成術の成功を妨げる経皮経管的冠状動脈形成術の部位での平
滑筋細胞（ＳＭＣ）移動および増殖の過程である。再狭窄中の血管に関連したＳ
ＭＣの移動および増殖は、本発明の方法により抑制される新脈管形成の過程に関
連がある。したがって、本発明は、血管系性術後の患者において本発明の方法に
より脈管形成関連過程を抑制することによる再狭窄の抑制も意図する。再狭窄の
抑制のためには、変性コラーゲンアンタゴニストは、典型的には血管形成術後に
、約２〜約28日間、さらに典型的には術後最初の約14日間、投与される。組織中
の新脈管形成を抑制するための、したがって新脈管形成関連疾患の治療のための
方法を実施するための本発明の方法は、新脈管形成が起きている、または起きる
おそれがある組織を、変性またはタンパク質分解化コラーゲンとは結合し得るが
、ネイティブ形態のコラーゲンとは結合しない治療的有効量の変性コラーゲンア
ンタゴニストと接触させることを含む。したがって、本方法は、本発明の変性コ
ラーゲンアンタゴニストを含有する治療的有効量の生理学的耐容性組成物を患者
に投与することを包含する。

【００９０】変性コラーゲンアンタゴニストの投与のための用量範囲は、本明細書中でさら
に説明するようなアンタゴニストの形態およびその効力によっており、新脈管形
成および新脈管形成により媒介される疾患症状が改善される所望の作用を生じる
のに十分多い量である。用量は、高粘稠度症候群、肺水腫、うっ血性心不全等の
ような副作用を引き起こすほど多量ではない。一般に、用量は、患者の年齢、症
状、性別および疾患の程度に伴って変わり、当業者により確定され得る。用量は
、任意の合併症の事象において、個々の医師により調整され得る。

【００９１】治療的有効量は、治療中の組織において新脈管形成の測定可能な抑制を生じる
のに十分な変性コラーゲンアンタゴニストの量であり、即ち、新脈管形成抑制量
である。新脈管形成の抑制は、本明細書中に記載したような免疫組織化学により
、または当業者に既知のその他の方法によりin-situに測定され得る。

【００９２】変性コラーゲンアンタゴニストの効力は、種々の手段により、例えばＣＡＭ検
定における新脈管形成の抑制、in vivoウサギ眼検定、in vivoキメラマウス：ヒ
ト検定等により測定され得る。

【００９３】モノクローナル抗体の形態での本発明の変性コラーゲンアンタゴニストの治療
的有効量は、典型的には、生理学的耐容可能組成物中に投与される場合、約0.01
マイクログラム（ug）／ミリリットル（mL）〜約100 ug/mL、好ましくは約1 ug/
mL〜約5 ug/mL、そして通常は約5 ug/mLの血漿濃度を達成するのに十分な量であ
る。言い換えれば、用量は、１日または数日間、１日１回またはそれ以上の回数
投与で、約0.1 mg/kg〜約300 mg/kg、好ましくは約0.2 mg/kg〜約200 mg/kg、最
も好ましくは約0.5 mg/kg〜約20 mg/kgで変わり得る。

【００９４】アンタゴニストがモノクローナル抗体の断片である場合、その量は、全抗体の
質量と比較した断片の質量を基礎にして容易に調整され得る。好ましい血漿モル
濃度は、約2マイクロモル（uM）〜約5ミリモル（mM）、好ましくは約100 uM〜1
mM抗体アンタゴニストである。

【００９５】ポリペプチドまたは小型分子の形態の本発明の変性コラーゲンアンタゴニスト
の治療的有効量は、典型的には、生理学的耐容可能組成物中に投与される場合、
約0.1マイクログラム（ug）／ミリリットル（mL）〜約200 ug/mL、好ましくは約
1 ug/mL〜約150 ug/mLの血漿濃度を達成するのに十分なポリペプチドの量である
。約500 g/moleの質量を有するポリペプチドを基礎にして、好ましい血漿モル濃
度は、約2マイクロモル（uM）〜約5ミリモル（mM）、好ましくは約100 uM〜1 mM
ポリペプチドアンタゴニストである。言い換えれば、体重当たりの用量は、１日
または数日間、１日１回またはそれ以上の回数投与で、約0.1 mg/kg〜約300 mg/
kg、好ましくは約0.2 mg/kg〜約200 mg/kgである。

【００９６】本発明のモノクローナル抗体またはポリペプチドは、注射により、または長時
間の漸進的注入により、非経口的に投与され得る。治療される組織は典型的には
全身投与により身体中でアクセスされ、したがって治療組成物の静脈内投与によ
り最も高頻度に治療され、そして、標的化される組織が標的分子を含有する可能
性がある送達手段が意図される。したがって、モノクローナル抗体、ポリペプチ
ドおよびそれらの誘導体を含めたアンタゴニストは、静脈内に、腹腔内に、筋内
に、皮下に、腔内に、経皮的に、局所的に、眼内に、経口的に、鼻腔内に投与さ
れ得るし、蠕動的手段により送達され得る。

【００９７】本発明のモノクローナル抗体またはポリペプチドを含有する治療組成物は、例
えば単位投与量の注射により、慣用的には静脈内に投与される。「単位投与量」
とは、本発明の治療組成物に関して用いられる場合、被験者のための単一用量と
して適した物理的に別個の単位を指し、各単位は、必要な希釈剤、即ち担体また
はビヒクルと共同して所望の治療効果を生じるよう算出された予定量の活性物質
を含有する。

【００９８】実施例に示すような一実施態様では、変性コラーゲンアンタゴニストは１回用
量で静脈内に投与される。

【００９９】組成物は、用量処方物に適合する方法で、治療的有効量で投与される。投与さ
れる量および時期は、治療される患者、活性成分を利用する患者の系の能力、お
よび望ましい治療効果の程度によっている。投与に必要な活性成分の的確な量は
、従事者の判断によっており、各個体に固有である。しかしながら、全身的適用
のための適切な用量範囲は、本明細書中に開示されており、投与経路によってい
る。適切な投与レジメンも変動し得るが、しかし初期投与とその後の注射または
その他の投与による１時間またはそれ以上の間隔での反復投薬により典型化され
る。あるいは、in vivo療法のために特定化された範囲の血中濃度を保持するの
に十分な連続静脈内注入が意図される。

【０１００】本発明の実施例により実証されるように、新脈管形成の抑制および腫瘍退行は
、アンタゴニストとの初期接触後７日という早い時期に起こる。アンタゴニスト
への付加的または長期曝露は、７日〜６週間、好ましくは約14〜28日が選択され
る。

【０１０１】本発明は、本明細書中に記載した治療方法を実施するのに有用な治療組成物を
意図する。本発明の治療組成物は、生理学的耐容可能担体を、活性成分としてそ
の中に溶解または分散される本明細書中に記載したような変性コラーゲンアンタ
ゴニストとともに含有する。好ましい実施態様では、治療用変性コラーゲンアン
タゴニスト組成物は、治療目的で哺乳類またはヒト患者に投与される場合には、
免疫原性でない。

【０１０２】本明細書中で用いる場合、「製薬上許容可能な」、「生理学的に耐容可能な」
という用語、ならびに文法上のその変型は、それらが組成物、担体、希釈剤およ
び試薬を指す場合、相互交換可能的に用いられ、その物質が哺乳類にまたは哺乳
類に関して投与可能であることを表す。

【０１０３】その中に溶解または分散された活性成分を含有する薬理学的組成物の調製は、
当業界で十分理解されており、処方物を基礎にして限定される必要はない。典型
的には、このような組成物は、液体の溶液または懸濁液として注射剤として調製
されるが、しかしながら溶液または懸濁液に適し、使用前には液体である固体形
態も調製され得る。調製物は、乳化もされ得る。

【０１０４】活性成分は、製薬上許容可能で、活性成分と相溶性であり、本明細書中に記載
した治療方法に用いるのに適した量である賦形剤と混合され得る。適切な賦形剤
は、例えば水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等、ならび
にそれらの組合せである。さらに、所望により、組成物は、活性成分の効力を増
強する少量の補助物質、例えば湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝剤等を含有し得る。

【０１０５】本発明の治療組成物は、その中の構成成分の製薬上許容可能な塩を含み得る。
製薬上許容可能な塩としては、無機酸、塩酸またはリン酸、あるいは有機酸、例
えば酢酸、酒石酸、マンデル酸等を用いて生成される酸付加塩（ポリペプチドの
遊離アミノ基を用いて生成される）が挙げられる。遊離カルボキシル基を用いて
生成される塩も、無機塩基、例えば水酸化ナトリウム、カリウム、アンモニウム
、カルシウムまたは鉄、ならびに有機塩基、例えばイソプロピルアミン、トリメ
チルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等から誘導
され得る。特に好ましいのは、ＴＦＡおよびＨＣｌの塩である。

【０１０６】生理学的耐容可能担体は、当業界で周知である。液体担体の例は、活性成分の
他に物質を含有しないか、または生理学的ｐＨ値での緩衝剤、例えばリン酸ナト
リウム、生理学的塩またはその両方、例えばリン酸塩緩衝化食塩水を含有する滅
菌水性溶液である。さらに別の水性担体は、１つより多い緩衝剤塩、ならびに塩
化ナトリウムおよびカリウムのような塩、デキストロース、ポリエチレングリコ
ールおよびその他の溶質を含有し得る。

【０１０７】液体組成物は、水の他に、そして水を除いて、液相も含有し得る。このような
付加的液相の例は、グリセリン、植物油、例えば綿実油、および水−油エマルシ
ョンである。

【０１０８】治療組成物は、典型的には総治療組成物の重量当たり少なくとも0.1重量％の
量のアンタゴニストを含有するよう処方された、新脈管形成抑制量の本発明の変
性コラーゲンアンタゴニストを含有する。したがって、例えば0.1重量％は、総
組成物100グラム当たり0.1グラムの阻害剤である。

【０１０９】抗体は、サイトトキシン、細胞傷害剤と共役され得る。このような共役体は、
細胞溶解素または外毒素、例えばリシンＡ、ジフテリア毒素Ａまたはシュードモ
ナス外毒素およびそれらの断片を用いて作られ得る。細胞傷害剤は、毒性用量の
放射能を脈管生成組織に局所的にデリバリーするために、同位元素で放射能標識
され得る。

【０１１０】本発明のアンタゴニストは、酵素を標的に送達するためにも用いられ得るが、
この場合、酵素はプロドラッグを活性形態のドラッグに転換し得る−抗体特異的
酵素活性化プロドラッグ療法（ＡＤＥＰＴ）（例えば、Syrigos, K.N.（1999）A
nticancer Res. 19:605-13参照）。要するに、本発明のアンタゴニストは、非毒
性または不活性プロドラッグを毒性または活性薬に転換し得る酵素、例えばラク
タマーゼ、プロテアーゼまたはエステラーゼと共役する。本発明のアンタゴニス
トは新脈管形成の部位に、特に腫瘍または転移の部位に局在するため、毒性薬は
、に向けられ得る。

【０１１１】検出方法本発明のアンタゴニストは、組織中の新脈管形成の検出にも適している。

【０１１２】例えば、アンタゴニストが抗体である場合、アンタゴニストは組織をex vivo
で染めるために免疫組織化学的技法に用いられ得る。免疫染色およびＥＬＩＳＡ
のような免疫学的技法は、例えば、Receptor Binding Techniques, Methods in
Molecular Biology, 106, ed. M. Keen, Human Press, 1999；Brook et al.（19
98）Cell 92:391-400；Brooks et al.（1996）Cell 85:683-693およびBrooks et
al.（1993）J. Cell. Biol. 122:1351-1359に記載されている。

【０１１３】本発明のアンタゴニストは、標的組織と一旦結合すると、直接的にまたは間接
的に検出され得る。直接検出は、検出可能標識、例えば蛍光色素、放射性タグ、
常磁性重金属または診断染料を包含するアンタゴニストで実施され得る。

【０１１４】あるいは、検出は、二次相互作用により生じ得る。例えば、アンタゴニストを
認識する検出可能的標識化抗体は、アンタゴニストの位置を可視化するために用
いられ得る。例えば、アンタゴニストがマウス起源のモノクローナル抗体である
場合、適切に標識されるヤギ抗マウス抗体が用いられ得る。実施例は、例えばヤ
ギ抗マウスペルオキシダーゼ共役化抗体の使用を説明する。当業者は、種々のア
ンタゴニストとともに用いるための適切な第二抗体を確定し得る。

【０１１５】 in vivo検出のためには、検出可能的標識化アンタゴニストを用いるのが好ま
しい。標識化アンタゴニストは、静脈内的に、筋内的に等で患者に投与される。
患者内の検出に適した標識が特に好ましい。例えば、常磁性的標識化は、磁気共
鳴造影により検出され得る。放射性タグ化アンタゴニストも検出され得る。

【０１１６】実施例実施例１モノクローナル抗体ＨＵＩ７７本実施例は、変性コラーゲン特異的モノクローナル抗体ＭａｂＨＵＩ７７の
生成を説明する。

【０１１７】差引き免疫感作（ＳＩ）と呼ばれる免疫学的技法により、ＭａｂＨＵＩ７７
を生成し、単離した。差引き免疫感作法は、共通高抗原性エピトープの混合物内
の稀少なおよび／またはあまり多くないエピトープに対する免疫応答を選択的に
増強するために、マウス内の免疫応答を実験的に操作可能にする。要するに、Ｂ
ＡＬＢ／ｃマウスにネイティブヒト三重らせんＩ型またはＩＶ型コラーゲンを腹
腔内注射した。三重らせんコラーゲンの注射後24および48時間目に、マウスに寛
容剤であるシクロホスファミドを注射して、ネイティブ三重らせんＩ型およびＩ
Ｖ型コラーゲン内の共通免疫優性エピトープに向けられる抗体を産生する活性化
Ｂ細胞を殺害する。寛容化プロトコール後、次にマウスに熱変性ヒトＩ型または
ＩＶ型コラーゲンを注射して、熱変性後に曝露されるエピトープに対する免疫応
答を刺激した。15分間沸騰させることにより、コラーゲンを変性させた。熱変性
Ｉ型およびＩＶ型コラーゲンの注射は、３週間毎に、全体で４〜５回の注射を施
した。各マウスからの血清を、ネイティブ三重らせんおよび変性コラーゲンとの
免疫反応性に関して試験した。三重らせんコラーゲンと比較した場合の変性コラ
ーゲンに対する反応性に関して最高力価を実証するマウスを、ハイブリドーマの
産生のために用いた。選択されたマウスからの脾臓細胞を、標準技法により骨髄
腫細胞と融合させた。個々のハイブリドーマクローンを、三重らせんまたは変性
Ｉ型およびＩＶ型コラーゲンに対する抗体の産生に関して調べた。ネイティブ三
重らせんＩ型およびＩＶ型コラーゲンと比較した場合の変性Ｉ型またはＩＶ型コ
ラーゲンに対する選択的反応性を実証する抗体を産生したハイブリドーマクロー
ンを選別した。標準技法により、Ｍａｂを精製した。

【０１１８】図１に示すように、ＨＵＩ７７は、変性Ｉ型およびＩＶ型コラーゲンを特異的
に認識するが、しかしネイティブ三重らせんＩ型およびＩＶ型コラーゲンとは、
実質的低減化親和性で結合することが示された。特にＨＵＩ７７は、ＥＬＩＳＡ
により測定した場合、ネイティブＩ型コラーゲンの場合より少なくとも約10倍よ
り高い見掛けの反応性で変性Ｉ型コラーゲンと結合する。ＨＵＩ７７は、変性Ｉ
Ｖ型コラーゲンとも、ネイティブＩＶ型コラーゲンに関する値より約10倍高い親
和性で結合する。さらに、ＭａｂＨＵＩ７７は、他のマトリックス構成成分、
例えばラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチンまたはフィブリノーゲンと
は実質的に結合せず、したがってＩ型およびＩＶ型コラーゲン内の潜在エピトー
プとのその特異性を実証する。

【０１１９】ＭａｂＨＵＩ７７は他の変性コラーゲンに対しても特異的であり、ネイティ
ブ形態のこれらのコラーゲンとは実質的低減化親和性で結合する。図２に示すよ
うに、ＨＵＩ７７は、変性ＩＩＩ型、ＩＶ型および部位型コラーゲンとも、これ
らのコラーゲンのそれぞれのネイティブ形態より約７倍、約８倍および約10倍高
い親和性で結合する。

【０１２０】実施例２固形腫瘍の検出本実施例は、本発明のアンタゴニストが腫瘍性組織中の変性コラーゲンを検出
するために用いられ得ることを示す。実施例１に記載されたモノクローナル抗体
ＨＵＩ７７を用いて、正常および腫瘍性組織を間接的免疫染色した。図３に示す
ように、ヒト黒色腫生検の、ならびに全厚ヒト皮膚中で増殖させたＭ２１黒色腫
のＭａｂＨＵＩ７７を用いた間接免疫蛍光分析は、in vivoでヒト黒色腫と関
連した変性形態のコラーゲンの生成を示す。腫瘍の非存在下で、正常組織中で、
変性コラーゲンの、あるとしてもほんの少しの証拠が検出されたことは重要であ
り、このことは、変性コラーゲンが固形ヒト腫瘍の特異的マーカーであり得るこ
とを示唆する。

【０１２１】実施例３ヒト腫瘍中の新脈管形成の検出本実施例は、本発明のアンタゴニストがヒト腫瘍中の新脈管形成を検出するた
めに用いられ得ることを実証する。変性コラーゲンの、あるとしてもほんの少し
の証拠が、腫瘍の非存在下で、正常血管周囲のＭａｂＨＵＩ７７を用いて検出
されたことは重要であり、このことは、変性コラーゲンが血管形成性腫瘍関連血
管の特異的マーカーであり得ることを示唆する。

【０１２２】実施例４アンタゴニストは内皮細胞接着および移動を抑制する本実施例は、本発明のある種のアンタゴニストが変性コラーゲンとのヒト内皮
細胞接着を抑制し得ることを実証する。

【０１２３】ＭａｂＨＵＩ７７は、対照抗体と比較して約40％、変性Ｉ型コラーゲンとの
ヒト内皮細胞接着を抑制する能力を示した。図５に要約したこれらの知見は、Ｍ
ａｂＨＵＩ７７が、変性Ｉ型コラーゲンとの内皮細胞接着に少なくとも部分的
に関与するＩ型コラーゲン内の潜在エピトープと結合することを示唆する。内皮
細胞接着過程は腫瘍増殖および新脈管形成において一役を演じると考えられるた
め、この機能遮断抗体はin vivoでの新脈管形成および腫瘍増殖に影響を及ぼし
得る。

【０１２４】ＭａｂＨＵＩ７７は、図６に示すように、対照抗体または無処置と比較して
約80％、変性Ｉ型コラーゲンに関するヒト内皮細胞移動を抑制する能力も示した
。これらの知見は、ＭａｂＨＵＩ７７が、変性Ｉ型コラーゲンに関する細胞移
動に有意の役割を演じるＩ型コラーゲン内の潜在エピトープと結合することを示
唆する。細胞移動が腫瘍転移および新脈管形成において重要な役割を演じると考
えられ、そして変性コラーゲンが悪性腫瘍細胞および脈管形成性血管と関連して
検出される場合、この機能遮断抗体はin vivoでの新脈管形成および腫瘍増殖お
よび転移に有意の影響を及ぼし得る。

【０１２５】実施例６モノクローナル抗体ＨＵＩ７７による新脈管形成の抑制本実施例は、本発明のアンタゴニストがヒヨコＣＡＭ検定において新脈管形成
を有効に抑制することを示す。

【０１２６】さらに、ＭａｂＨＵＩ７７の全身投与は、対照と比較した場合、βＦＧＦ誘
導性新脈管形成を約90％抑制した（図７および８）。ヒヨコＣＡＭ検定における
血管分枝点の数を計数することにより、脈管形成指数を測定した（図８）。検定
期間中に胚において毒性副作用が認められなかったことは重要である。さらに、
あるとしても非常に少ないこのＭａｂからの作用は、正常静止血管で認められた
。非常に低濃度のＭａｂが用いられ、同様の作用を生じ得るということは可能で
ある。これらの知見は、ＭａｂＨＵＩ７７が有意の臨床用途を有し得る有効な
抗脈管形成試薬であることを示す。

【０１２７】実施例７ＭａｂＨＵＩ７７による腫瘍増殖の抑制本実施例は、本発明のアンタゴニストがin vivoで黒色腫における腫瘍増殖を
有効に抑制することを示す。

【０１２８】ＭａｂＨＵＩ７７の全身投与は、図９および１０に示すように、対照と比較
した場合、黒色腫腫瘍増殖を約53％抑制した。検定期間中に胚において毒性副作
用が認められなかったことは重要である。さらに、あるとしても非常に少ないこ
のＭａｂからの作用は、隣接組織で認められた。非常に低濃度のＭａｂが用いら
れ、同様の作用を生じ得るということは可能である。これらの知見は、Ｍａｂ
ＨＵＩ７７が有意の臨床用途を有し得る有効な抗腫瘍試薬であることを示す。

【０１２９】実施例８モノクローナル抗体ＨＵＩＶ２６実施例１に略記したような差引き免疫感作（ＳＩ）と呼ばれる免疫学的技法に
より、ＭａｂＨＵＩＶ２６を生成した。図１１に示すように、ＨＵＩＶ２６は
、変性ＩＶ型コラーゲンを特異的に認識するが、しかしネイティブ三重らせんＩ
型またはＩＶ型コラーゲンとは結合しないことが示された。さらにＨＵＩＶ２６
は、他のマトリックス構成成分、例えばラミニン、フィブロネクチン、ビトロネ
クチンまたはフィブリノーゲンとは結合せず、したがってＩＶ型コラーゲン内の
潜在エピトープとのその特異性を実証する。

【０１３０】図１１Ｂに示すように、ＭａｂＨＵＩＶ２６により認識されるＩＶ型コラー
ゲン中の潜在部位（単数または複数）は、ＨＵＶＥＣ状態調節培地に曝露後に明
示される。ＭａｂＨＵＩＶ２６との反応性の量は、試験した24時間の期間中、
増大した。これは、これらの婦負非細胞が、ＭａｂＨＵＩＶ２６により認識さ
れるＩＶ型コラーゲン中の潜在部位を曝露し得るプロテアーゼを分泌するという
ことを示す。ＩＶ型コラーゲン中の潜在部位を曝露するＨＵＶＥＣにより産生さ
れるプロテアーゼは、キレート化剤、ＥＤＴＡにより抑制される（図１１Ｂ）。
これは、メタロプロテアーゼがＩＶ型コラーゲン中の潜在部位（単数または複数
）の曝露の開始に関与することを示唆する。図１２に示すように、メタロプロテ
アーゼ、ＭＭＰ−２は、ＩＶ型コラーゲン中の潜在部位（単数または複数）と同
時局在化して、ＣＡＭ組織中の脈管形成部位でＭａｂＨＵＩＶ２６と反応する
。セリンプロテアーゼ阻害剤、アプロチニンは、ＨＵＶＥＣ条件調節培地を用い
て１時間インキュベーション後に、ＩＶ型コラーゲン中の潜在部位（単数または
複数）の曝露にほとんど影響を及ぼさなかった（図１１Ｂ）。6および24時間時
点では、アプロチニンの存在は、プロテアーゼ阻害剤の非存在下で観察された反
応性の、それぞれ40および70％を遮断した。これは、後者時点（6および24時間
）では、セリンプロテアーゼがＩＶ型コラーゲン中の潜在部位（単数または複数
）の曝露を継続することを示唆する。

【０１３１】実施例９ＨＵＩＶ２６による新脈管形成および腫瘍の検出本実施例は、アンタゴニストが組織内の脈管形成過程を検出するために用いら
れ得ることを示す。

【０１３２】図１２に示すように、ヒヨコＣＡＭ組織の間接免疫蛍光分析は、in vivoでの
βＦＧＦまたは腫瘍誘導性脈管形成性血管と関連した変性ＩＶ型コラーゲンの生
成および局在化を示す。ｂＦＧＦまたは腫瘍の非存在下で、正常ＣＡＭ組織中で
、変性ＩＶ型コラーゲンの、あるとしてもほんの少しの証拠が検出されたことは
重要であり、このことは、変性ＩＶ型コラーゲンがin vivoでの脈管形成性血管
の特異的マーカーであり得ることを示唆する。

【０１３３】ヒト黒色腫生検の、図１３に示すような間接免疫蛍光分析は、in vivoでのヒ
ト腫瘍関連血管周囲の変性ＩＶ型コラーゲンの生成および局在化を実証する。変
性ＩＶ型コラーゲンの、あるとしてもほんの少しの証拠が、腫瘍の非存在下で、
正常血管周囲で検出されたことは重要であり、このことは、変性コラーゲンが血
管形成性腫瘍関連血管の特異的マーカーであり得ることを示唆する。

【０１３４】実施例１０ＭａｂＨＵＩＶ２６による細胞移動および接着の抑制本実施例は、Ｍａｂが内皮細胞移動および接着を抑制し得ることを示す。

【０１３５】ＭａｂＨＵＩＶ２６は、対照抗体と比較して、変性ＩＶ型コラーゲンとのヒ
ト内皮細胞接着を約70％抑制する能力を示した（図１４）。これらの知見は、Ｍ
ａｂＨＵＩＶ２６が、変性ＩＶ型コラーゲンとの内皮細胞接着に少なくとも部
分的に関与するＩＶ型コラーゲン内の潜在エピトープと結合することを示唆する
。ＩＶ型コラーゲンの組織分布、ならびに細胞接着過程は腫瘍増殖および新脈管
形成において一役を演じるという事実にかんがみて、この機能遮断抗体はin viv
oでの新脈管形成および腫瘍増殖に有意の影響を及ぼし得る。

【０１３６】ＭａｂＨＵＩＶ２６は、対照抗体または無処置と比較して、変性ＩＶ型コラ
ーゲンに関するヒト内皮細胞移動を70％抑制する能力を示した。これらの知見は
、ＭａｂＨＵＩＶ２６が、変性ＩＶ型コラーゲンに関する細胞移動に有意の役
割を演じるＩＶ型コラーゲン内の潜在エピトープと結合することを示唆する。細
胞移動が腫瘍転移および新脈管形成において重要な役割を演じると考えられ、そ
して変性コラーゲンが脈管形成性血管と関連して検出される場合、この機能遮断
抗体はin vivoでの新脈管形成および腫瘍増殖および転移に有意の影響を及ぼし
得る。

【０１３７】実施例１１ＨＵＩＶ２６の全身投与による新脈管形成の抑制ＭａｂＨＵＩＶ２６の全身投与は、図１６および１７に示すように、対照と
比較した場合、ｂＦＧＦ誘導性新脈管形成を約90％抑制した。検定期間中に胚に
おいて毒性副作用が認められなかったことは重要である。さらに、あるとしても
非常に少ないこのＭａｂからの作用は、正常静止血管で認められた。非常に低濃
度のＭａｂが用いられ、同様の作用を生じ得るということは可能である。これら
の知見は、ＭａｂＨＵＩＶ２６が有意の臨床用途を有し得る有効な抗脈管形成
試薬であることを示す。

【０１３８】実施例１２腫瘍増殖の抑制ＭａｂＨＵＩＶ２６の全身投与は、対照と比較した場合、黒色腫腫瘍増殖を
約80％抑制した（図１８）。検定期間中に胚において毒性副作用が認められなか
ったことは重要である。さらに、あるとしても非常に少ないこのＭａｂからの作
用は、隣接組織で認められた。非常に低濃度のＭａｂが用いられ、同様の作用を
生じ得るという可能性があるため、ＩＣ50値を確定するためにさらなる実験が目
下進行中である。これらの知見は、ＭａｂＨＵＩＶ２６が有意の臨床用途を有
し得る有効な抗腫瘍試薬であることを示す。

【０１３９】ＭａｂＨＵＩＶ２６の全身投与は、ＳＣＩＤマウスにおける黒色腫増殖を抑
制した。処置の24日後に、ＭａｂＨＵＩＶ２６処置マウスは、対照Ｍａｂで処
置したマウスにおいて、または処置を施さなかったマウスにおいて観察された値
の5％未満の平均腫瘍容積を有した。

【０１４０】実施例１３ＨＵＩＶ２６のエピトープ特異性本実施例は、ＨＵＩＶ２６が変性コラーゲン内のＲＧＤ配列と結合しないこと
を示す。

【０１４１】図２２に示すように、ＭａｂＨＵＩＶ２６は、ＩＶ型コラーゲン中に見出さ
れるペプチドを含有する固定化ＲＧＤ（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸
）のいずれかと反応できない（表１）。コラーゲン中に見出されるペプチドを含
有する６つの異なる可溶性ＲＧＤは、ＭａｂＨＵＩＶ２６による固定化変性Ｉ
Ｖ型コラーゲンの認識を遮断できなかった（図２２）。これらのデータは、Ｍａ
ｂＨＵＩＶ２６がＩＶ型コラーゲンに見出されるＲＧＤ配列を認識しないこと
を示唆する。

【０１４２】表１．ヒトＩＶ型コラーゲンのＲＧＤドメイン

【０１４３】

【表１】実施例１４モノクローナル抗体ＸＬ３１３その配列がヒトＩ型コラーゲンから得られる合成ペプチドで免疫感作すること
により、ＭａｂＸＬ３１３を生成した。その配列は、Ｉ型コラーゲンの三次元
構造内に埋もれるために、それを選択した。用いた１１アミノ酸残基合成ペプチ
ドの配列を以下に示す：配列番号１２：CysGlnGlyProArgGlyAspLysGlyGluCys ＫＧＥ（LysGlyGlu）配列は、ＸＬ３１３認識に非常に重要であることが判明し
た。ＭａｂＸＬ３１３は、配列番号１のペプチドと特異的に結合するが、しか
しＫＧＥ配列が突然変異化されたペプチドに関しては、実質的低減化結合親和性
を有する：配列番号１３： CysGlnGlyProArgGlyAspAlaAlaAlaCys ＸＬ３１３と呼ばれるＭａｂは、タンパク質分解化／変性Ｉ型コラーゲンと反
応する高特異的抗体である。ＸＬ３１３がネイティブ三重らせん形態のＩ型コラ
ーゲンと反応しないということは、重要である。図２７に示すように、Ｍａｂ
ＸＬ３１３は、ヒトＩ型コラーゲンの潜在ドメインを認識するが、しかし他の同
様のペプチドは認識しない。これらのデータは、ＭａｂＸＬ３１３が、新脈管
形成および腫瘍増殖においてヒトコラーゲンペプチドにより限定される潜在コラ
ーゲンドメインの役割を査定するための有用な試薬であり得る、ということを示
唆する。図２８に示すように、ＭａｂＸＬ３１３は、成熟三重らせん配座内で
曝露されないヒトＩ型コラーゲン内の潜在ドメインを特異的に認識する。さらに
、この潜在ドメインは、ＸＬ３１３がネイティブ三重らせんＩＶ型コラーゲンと
交差反応しないので、Ｉ型コラーゲンに特異的であると思われる。

【０１４４】実施例１５ＭａｂＸＬ３１３は細胞接着および移動を抑制する図２３に示すように、５時間インキュベーションの終了時に、ネイティブＩ型
コラーゲンに付着させたＨＵＶＥＣは集密的細胞単層を生成した。これに対比し
て、変性コラーゲンに付着したＨＵＶＥＣは、移動し始め、形態学的に再組織化
されて、索様構造を形成した。これらのデータは、そのネイティブ三重らせん状
態ではアクセスできないヒトＩ型コラーゲンの三次元構造内に隠された潜在ドメ
インが、内皮形態形成および索形成に一役を演じ得る、ということを示唆する。

【０１４５】実施例１６変性コラーゲンはアポトーシスを抑制する図２４に示すように、タンパク質分解かコラーゲンとのヒト内皮細胞相互作用
は、ネイティブＩ型コラーゲンまたは懸濁液中に保持された内皮細胞と比較して
、アポトーシスを抑制する。これらのデータは、そのネイティブ三重らせん状態
ではアクセスできないヒトＩ型コラーゲンの三次元構造内に隠された潜在ドメイ
ンが、内皮形態生存に一役を演じ得る、ということを示唆する。

【０１４６】実施例１７ＸＬ３１３により認識されるエピトープ図２５に示すように、ヒトコラーゲン潜在ペプチド−２は、内皮細胞生存およ
び索形成を支持すると思われるが、しかしヒトＩ型コラーゲン内の同様の潜在ペ
プチドは、あるとしてもほんの少ししか作用を示さない。これらのデータは、ペ
プチド−２により限定されるＩ型コラーゲンの潜在領域がin vivoでの新脈管形
成および腫瘍増殖に重要な役割を演じ得る、ということを示唆する。

【０１４７】実施例１８インテグリンの役割図２６に示すように、インテグリンαｖβ３は、試験したＩ型コラーゲンのす
べての潜在ペプチドドメインとの細胞相互作用の媒介に重要な役割を演じると思
われる。興味深いことに、ペプチド−２もβ１インテグリン相互作用によってい
た。これらのデータは、ペプチド−２が２つの別個のインテグリンにより細胞相
互作用を支持することを示唆する。

【０１４８】実施例１９ＭａｂＸＬ３１３は新脈管形成および腫瘍増殖を抑制する図２９および３０に示すように、ＭａｂＸＬ３１３の全身投与は、対照と比
較した場合、ヒヨコＣＡＭモデルにおける新脈管形成を95％以上抑制した。これ
らのデータは、ＭａｂＸＬ３１３により限定されるＩ型コラーゲンの潜在ドメ
インが新脈管形成において重要な役割を演じることを示唆する。

【０１４９】図３１に示すように、ＭａｂＸＬ３１３は、おそらくは、in vivoでＨＴ108
0繊維肉腫腫瘍増殖を抑制する。これらの知見は、ＭａｂＸＬ３１３により限
定される潜在ドメインがin vivoでの腫瘍増殖の調節において有意の役割を演じ
得ることを示す。

【０１５０】実施例２０コラーゲンのタンパク質分解は、腫瘍増殖にとって重要である図３２に示すように、突然変異がＩ型コラーゲン分子のＭＭＰ切断部位内に導
入されたトランスジェニックマウスを、これらのマウスがそれらのＩ型コラーゲ
ンをタンパク質分解する能力を損傷していたため、本実験に用いた。Ｂ１６黒色
腫細胞が、野生型対照マウスと比較した場合、Ｉ型コラーゲンタンパク質分解損
傷を示すマウスにおいて腫瘍を形成する能力を、あるとしても極少ししか示さな
かった、ということは重要である。これらのデータは、Ｉ型コラーゲンのタンパ
ク質分解が、in vivoでの細胞増殖において重要な役割を演じるということを示
唆する。

【０１５１】Ｂ１６黒色腫（メラノーマ）細胞を用いて実証されたように、ルイス肺癌細胞
も、それらのＩ型コラーゲンをタンパク質分解する能力を損傷していたCol a1Ｂ
６トランスジェニックマウスに注射した場合、腫瘍を形成する能力を、あるとし
ても極少ししか示さなかったが、しかしルイス肺癌細胞は、対照Ｂ６マウスにお
いて大型で急速に増殖する腫瘍を形成する（図３３）。タンパク質分解後に曝露
されるだけであるＩ型コラーゲン内の潜在ドメインに特異的に向けられるＭａｂ
ＸＬ３１３は、野生型Ｂ６マウスにおけるルイス肺癌腫瘍増殖を約80％抑制し
た。本知見は、in vivoでのＩ型コラーゲンの潜在ドメインのタンパク質分解性
曝露が腫瘍増殖に重要な役割を演じ得る、ということを示唆する。さらに、これ
らのデータは、ＭａｂＸＬ３１３がin vivoでの新脈管形成および腫瘍増殖の
特異的阻害剤である、ということを示唆する。

【０１５２】当明細書の本文中に引用された以下の出版物はすべて、それらの記載内容は、
参照により本明細書中に含まれる本発明の前記の記載内容は説明および解釈の目的で提示されたものであり、本
発明は、本明細書中の厳密な方式または実施に限定されるものではない、と理解
される。したがって、本発明の精神を逸脱しない限り当業者により変更が成され
得るし、本発明の範囲は特許請求の範囲に関して解釈されるべきである、と理解
される。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、固相ＥＬＩＳＡにおける細胞外マトリックス構成成分とのＭａｂＨＵ
Ｉ７７反応性を説明する。微小滴定プレート（96ウエル）を、各々10マイクログ
ラム（μg）／ミリリットル（mL）の濃度で、ネイティブＩ型およびＩＶ型コラ
ーゲン、変性Ｉ型およびＩＶ型コラーゲン、ビトロネクチン、フィブロネクチン
およびフィブリノーゲンを含む細胞外マトリックス構成成分で被覆した。微小滴
定プレートのウエルを、37℃で1時間、ＰＢＳ中の1％ＢＳＡで遮断した。Ｍａｂ
ＨＵＩ７７を1 ug/mLの濃度でウエルに付加し、37℃で2時間インキュベートさせ
た。インキュベーション後、ヤギ抗マウスペルオキシダーゼ標識化第二抗体を用
いたインキュベーションにより、免疫反応性を検出した。基質としてｏ−フェニ
レンジアミンを用いて490 nmでＥＬＩＳＡプレート読取機により、免疫反応性を
測定した。Ｃｏｌｌ−Ｉ（ネイティブ三重らせんＩ型コラーゲン）、変性Ｃｏｌ
ｌ−Ｉ（変性Ｉ型コラーゲン）、Ｃｏｌｌ−ＩＶ（ネイティブ三重らせんＩＶ型
コラーゲン）、変性Ｃｏｌｌ−ＩＶ（変性ＩＶ型コラーゲン）、ＶＮ（ビトロネ
クチン）、ＦＮ（フィブロネクチン）、ＦＢ（フィブリノーゲン）。棒グラフデ
ータは、３回のウエルからの平均光学濃度（Ｏ．Ｄ．）±標準偏差を表す。

【図２】図２は、遺伝的に異なる形態のコラーゲンとのＭａｂＨＵＩ７７反応性を実証
する。微小滴定プレートを10μg/mlの濃度で異なる形態のコラーゲンで被覆した
。微小滴定プレートのウエルを、37℃で1時間、ＰＢＳ中の1％ＢＳＡで遮断した
。ヤギ抗マウスペルオキシダーゼ標識化第二抗体を用いたインキュベーションに
より、免疫反応性を検出した。490 nmでＥＬＩＳＡプレート読取機を用いて光学
濃度を確定することにより、免疫反応性を測定した。Ｃｏｌｌ−Ｉ；三重らせん
Ｉ型コラーゲン、ＤｅｎＣｏｌｌ−Ｉ；変性Ｉ型コラーゲン、Ｃｏｌｌ−ＩＩ；
三重らせんＩＩ型コラーゲン、ＤｅｎＣｏｌｌ−ＩＩ；変性ＩＩ型コラーゲン、
Ｃｏｌｌ−ＩＩＩ；三重らせんＩＩＩ型コラーゲン、ＤｅｎＣｏｌｌ−ＩＩＩ；
変性ＩＩＩ型コラーゲン、Ｃｏｌｌ−ＩＶ；三重らせんＩＶ型コラーゲン、Ｄｅ
ｎＣｏｌｌ−ＩＶ；変性ＩＶ型コラーゲン、Ｃｏｌｌ−Ｖ；三重らせんＶ型コラ
ーゲン；ＤｅｎＣｏｌｌ−Ｖ；変性Ｖ型コラーゲン。棒グラフデータは、３回
のウエルからの平均光学濃度（Ｏ．Ｄ．）±標準偏差を表す。

【図３】図３は、ＭａｂＨＵＩ７７が、in vivoでヒト黒色腫周囲の変性コラーゲンを
同定することを示す。ヒトマウスキメラモデルおよびヒト腫瘍生検の両方からの
ヒト黒色腫の凍結組織切片に関する間接免疫蛍光法により、in vivoでの変性コ
ラーゲンの生成および局在化を調べた。ヒト黒色腫からの凍結組織切片をアセト
ン中で固定し、１％ＢＳＡで遮断して、ヒト黒色腫細胞上に発現されたα_ｖイン
テグリンに向けられるＭａｂＨＵＩ７７およびポリクローナル抗体で同時染色し
た。ヤギ抗マウスＦＩＴＣ共役化およびヤギ抗ウサギローダミン共役化第二抗体
を用いたインキュベーションにより、抗体結合を検出した。左パネルは、ヒト黒
色腫生検を示す（630X）。右パネルは、全厚ヒト皮膚内で増殖したＭ21ヒト黒色
腫細胞株を示す（200X）。赤色はα_ｖインテグリンを示し、緑色は変性コラーゲ
ン発現を示す。黄色はα_ｖインテグリンおよび変性コラーゲンの同時局在化を示
す。

【図４】図４は、ＭａｂＨＵＩ７７がヒト黒色腫関連血管周囲の変性コラーゲンを同定
することを示す。ヒト黒色腫生検の凍結組織切片に関する間接免疫蛍光法により
、in vivoでの変性コラーゲンの生成および局在化を調べた。ヒト黒色腫からの
凍結組織切片をアセトン中で固定し、１％ＢＳＡで遮断して、血管の既知のマー
カーであるＶＩＩＩ因子に向けられるＭａｂＨＵＩ７７およびポリクローナル抗
体で同時染色した。ヤギ抗マウスフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ
）共役化およびヤギ抗ウサギローダミン共役化第二抗体を用いたインキュベーシ
ョンにより、抗体結合を検出した。左パネルは、腫瘍血管の輪郭を描くＶＩＩＩ
因子に関して染色した（赤色）ヒト黒色腫生検を示す。右パネルは、ヒト腫瘍関
連血管周囲の変性コラーゲン（緑色）を示す。

【図５】図５は、ヒト内皮細胞接着に及ぼすＭａｂＨＵＩ７７の作用を実証する。微小
滴定プレート（96ウエル）を、10μg/mLの濃度でネイティブまたは変性Ｉ型また
はＩＶ型コラーゲンで被覆した。微小滴定プレートのウエルを37℃で1時間、Ｐ
ＢＳ中の1％ＢＳＡでブロックした。次に、50 ug/mLの濃度で30分間、精製Ｍａ
ｂＨＵＩ７７（50μg/mL）またはアイソタイプ適合化対照抗体の存在下または非
存在下で、ヒト内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を被覆化ウエルに付着させた。洗浄によ
り非付着細胞を除去し、付着細胞をクリスタルバイオレットで染色した。600 nm
での溶離染料の光学濃度（Ｏ．Ｄ．）を測定することにより、細胞接着を定量化
した。棒グラフデータは、３回ウエルからの平均Ｏ．Ｄ．±標準偏差を表す。デ
ータは、対照の％として表される。

【図６】図６は、ヒト内皮細胞移動に及ぼすＭａｂＨＵＩ７７の作用を実証する。ウエ
ル横断移動小室からの膜を、25μg/mLの濃度で変性Ｉ型またはＩＶ型コラーゲン
で被覆した。全体で6時間、精製ＭａｂＨＵＩ７７またはアイソタイプ適合化対
照抗体（100μg/mL）の存在下または非存在下で、ヒト内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）
を移動させた。膜の上側面に残存する細胞を除去し、膜の下側面に移動した細胞
をクリスタルバイオレットで染色した。600 nmでの溶離染料の光学濃度（Ｏ．Ｄ
．）を測定することにより、細胞移動を定量化した。棒グラフデータは、３回ウ
エルからの平均Ｏ．Ｄ．±標準偏差を表す。データは、対照の％として表される
。

【図７】図７は、in vivoでの新脈管形成に及ぼす精製ＭａｂＨＵＩ７７の全身投与の
作用を実証する。βＦＧＦをしみ込ませたフィルター円板を10日齢ヒヨコ胚の漿
尿膜（ＣＡＭ）上に載せた。24時間後、胚に20 ugのＭａｂＨＵＩ７７または対
照を１回静注した。3日間のインキュベーション期間終了時に、フィルター円板
および周囲ＣＡＭ組織を取り出し、フィルター円板面積内の血管分枝点の数を計
数することにより、新脈管形成を定量化した。典型的実験からのＣＡＭ組織の例
を示す。

【図８】図８は、ＭａｂＨＵＩ７７による新脈管形成実験の定量を示す。棒グラフデー
タは、5〜10胚／条件の平均±標準誤差を表す。新脈管形成指数は、実験的処置
胚からの分枝点の数−βＦＧＦの不存在下でのＣＡＭからの分枝点の数に等しい
。

【図９】図９は、in vivoでの腫瘍増殖に及ぼす精製ＭａｂＨＵＩ７７の全身投与の作
用を示す。ＣＳ−１黒色腫細胞（5 x 10⁶）を10日齢ヒヨコ胚のＣＡＭ上に接種
した。24時間後、胚に100 ugの精製ＭａｂＨＵＩ７７または対照を１回静注した
。胚を、全体で7日間、インキュベートさせた。7日間のインキュベーション期間
終了時に、その結果生じた腫瘍を切り取って、湿重量を測定した。写真は、Ｍａ
ｂＨＵＩ７７を用いてまたは用いずに処置した胚から得られた代表的腫瘍を示す
。

【図１０】図１０は、腫瘍の湿重量の定量を示す。棒グラフデータは、5〜12胚／条件か
らの腫瘍重量の平均±標準誤差を表す。

【図１１Ａ】図１１は、固相ＥＬＩＳＡにおける細胞外マトリックス構成成分とのＭａｂＨ
ＵＩＶ２６反応性を実証する。微小滴定プレートを、各々25 ug/mlの濃度で、細
胞外マトリックス構成成分で被覆した。Ａ）ＭａｂＨＵＩＶ２６を1 ug/mlの濃
度で付加し、1時間後、ヤギ抗マウスペルオキシダーゼ標識化ＩｇＧを付加した
。プレートを被覆する前に15分間沸騰させることにより、変性Ｉ型コラーゲンお
よびＩＶ型コラーゲンを調製した。データはすべて、第二抗体の任意の非特異的
結合のために補正した。棒グラフデータは、３回のウエルからの平均光学濃度（
Ｏ．Ｄ．）±標準偏差を表す。Ｂ）微小滴定プレートを、25 ug/mlで、三重らせ
んＩＶ型コラーゲンで被覆した。濃縮（20x）ＨＵＶＥＣ状態調節培地を、ＥＤ
ＴＡ、アプロチニンまたはその両方の存在下または非存在下でウエルに付加し、
1、6および24時間インキュベートさせた。次にプレートを洗浄し、遮断し、Ｍａ
ｂＨＵＩＶ２６または対照抗体とともにインキュベートした。データはすべて、
非特異的第二抗体結合のために補正した。棒グラフデータは、３回のウエルから
の平均光学濃度（Ｏ．Ｄ．）±標準偏差を表す。図中では、以下の略語を用いる
：Ｃｏｌｌ−Ｉ、Ｉ型コラーゲン；Ｃｏｌｌ−ＩＶ、ＩＶ型コラーゲン。

【図１１Ｂ】図１１は、固相ＥＬＩＳＡにおける細胞外マトリックス構成成分とのＭａｂＨ
ＵＩＶ２６反応性を実証する。微小滴定プレートを、各々25 ug/mlの濃度で、細
胞外マトリックス構成成分で被覆した。Ａ）ＭａｂＨＵＩＶ２６を1 ug/mlの濃
度で付加し、1時間後、ヤギ抗マウスペルオキシダーゼ標識化ＩｇＧを付加した
。プレートを被覆する前に15分間沸騰させることにより、変性Ｉ型コラーゲンお
よびＩＶ型コラーゲンを調製した。データはすべて、第二抗体の任意の非特異的
結合のために補正した。棒グラフデータは、３回のウエルからの平均光学濃度（
Ｏ．Ｄ．）±標準偏差を表す。Ｂ）微小滴定プレートを、25 ug/mlで、三重らせ
んＩＶ型コラーゲンで被覆した。濃縮（20x）ＨＵＶＥＣ状態調節培地を、ＥＤ
ＴＡ、アプロチニンまたはその両方の存在下または非存在下でウエルに付加し、
1、6および24時間インキュベートさせた。次にプレートを洗浄し、遮断し、Ｍａ
ｂＨＵＩＶ２６または対照抗体とともにインキュベートした。データはすべて、
非特異的第二抗体結合のために補正した。棒グラフデータは、３回のウエルから
の平均光学濃度（Ｏ．Ｄ．）±標準偏差を表す。図中では、以下の略語を用いる
：Ｃｏｌｌ−Ｉ、Ｉ型コラーゲン；Ｃｏｌｌ−ＩＶ、ＩＶ型コラーゲン。

【図１２】図１２は、ＭａｂＨＵＩＶ２６が、ヒヨコ漿尿膜（ＣＡＭ）内の血管周囲の変
性ＩＶ型コラーゲンを同定することを実証する。ｂＦＧＦ誘導性および腫瘍誘導
性新脈管形成からのＣＡＭの凍結組織切片に関する間接免疫蛍光法により、in v
ivoでの変性ＩＶ型コラーゲンの生成および局在化を調べた。凍結ＣＡＭ組織切
片をアセトン中で固定し、１％ＢＳＡで遮断して、ＩＶ型コラーゲン分解酵素Ｍ
ＭＰ−２またはＶＩＩＩ因子に向けられるＭａｂＨＵＩＶ２６およびポリクロー
ナル抗体で同時染色した。ヤギ抗マウスＦＩＴＣ共役化およびヤギ抗ウサギロー
ダミン共役化第二抗体を用いたインキュベーションにより、抗体結合を検出した
。上パネルは、脈管形成性血管周囲の変性ＩＶ型コラーゲンおよびＭＭＰ−２の
同時局在化を示す。下パネルは、脈管形成性血管周囲の変性ＩＶ型コラーゲンお
よびＶＩＩＩ因子の同時局在化を示す。左パネルは、ｂＦＧＦにより刺激された
ＣＡＭ組織を示す。右パネルは、その中で増殖するＣＳ１黒色腫を伴うＣＡＭ組
織を示す。上パネル中の赤色はＭＭＰ−２発現を示し、下パネル中では、ＶＩＩ
Ｉ発現を示す。上および下の両方のパネル中の緑色は変性ＩＶ型コラーゲン発現
を示す。黄色は同時局在化を示す。

【図１３】図１３は、ＭａｂＨＵＩＶ２６がヒト黒色腫関連血管周囲の変性ＩＶ型コラー
ゲンを同定することを示す。ヒト黒色腫生検の凍結組織切片に関する間接免疫蛍
光法により、in vivoでの変性ＩＶ型コラーゲンの生成および局在化を調べた。
ヒト黒色腫からの凍結組織切片をアセトン中で固定し、１％ＢＳＡで遮断して、
血管の既知のマーカーであるＶＩＩＩ因子に向けられるＭａｂＨＵＩＶ２６およ
びポリクローナル抗体で同時染色した。ヤギ抗マウスＦＩＴＣ共役化およびヤギ
抗ウサギローダミン共役化第二抗体を用いたインキュベーションにより、抗体結
合を検出した。赤色はＶＩＩＩ因子を示し、ヒト血管をマークする。緑色は、腫
瘍関連脈管形成性血管と特異的に関連した変性ＩＶ型コラーゲンを示す。

【図１４】図１４は、ヒト内皮細胞接着に及ぼすＭａｂＨＵＩＶ２６の作用を実証する。
微小滴定プレート（96ウエル）を、ネイティブまたは変性ＩＶ型コラーゲンで被
覆した。微小滴定プレートのウエルを37℃で1時間、ＰＢＳ中の1％ＢＳＡでブロ
ックした。次に、100 ug/mlの濃度で30分間、精製ＭａｂＨＵＩＶ２６またはア
イソタイプ適合化対照抗体の存在下または非存在下で、ヒト内皮細胞を被覆化ウ
エルに付着させた。洗浄により非付着細胞を除去し、付着細胞をクリスタルバイ
オレットで染色した。次に、細胞を10％酢酸とともにインキュベートし、600 nm
での溶離染料の光学濃度（Ｏ．Ｄ．）を測定することにより、細胞接着を定量化
した。棒グラフデータは、３回のウエルからの平均Ｏ．Ｄ．±標準偏差を表す。

【図１５】図１５は、ヒト内皮細胞移動に及ぼすＭａｂＨＵＩＶ２６の作用を示す。ウエ
ル横断移動小室からの膜を、ネイティブまたは変性ＩＶ型コラーゲンで被覆した
。全体で6時間、精製ＭａｂＨＵＩＶ２６またはアイソタイプ適合化対照抗体（1
00μg/mL）の存在下または非存在下で、ヒト内皮細胞を被覆化膜の下側面に移動
させた。膜の上側面に残存する細胞を除去し、膜の下側面に移動した細胞をクリ
スタルバイオレットで染色した。次に、膜を10％酢酸とともにインキュベートし
、600 nmでの溶離染料の光学濃度（Ｏ．Ｄ．）を測定することにより、細胞移動
を定量化した。棒グラフデータは、３回のウエルからの平均Ｏ．Ｄ．±標準偏差
を表す。

【図１６】図１６は、in vivoでの新脈管形成に及ぼす精製ＭａｂＨＵＩＶ２６の全身投
与の作用を実証する。ｂＦＧＦをしみ込ませたフィルター円板を10日齢ヒヨコ胚
の漿尿膜（ＣＡＭ）上に載せた。24時間後、胚に20 ugのＭａｂＨＵＩＶ２６ま
たは対照を１回静注した。3日間のインキュベーション期間終了時に、フィルタ
ー円板および周囲ＣＡＭ組織を取り出し、フィルター円板面積内の血管分枝点の
数を計数することにより、新脈管形成を定量した。図６は、典型的実験からのＣ
ＡＭ組織の例を示す。

【図１７】図１７は、ＭａｂＨＵＩＶ２６による新脈管形成実験の定量を示す。棒グラフ
データは、5〜10胚／条件の平均±標準誤差を表す。新脈管形成指数は、実験的
処置胚からの分枝点の数−ｂＦＧＦの非存在下でのＣＡＭからの分枝点の数に等
しい。

【図１８】図１８は、in vivoでの腫瘍増殖に及ぼす精製ＭａｂＨＵＩＶ２６の全身投与
の作用を示す。ＣＳ−１黒色腫細胞（5 x 10⁶）を10日齢ヒヨコ胚のＣＡＭ上に
接種した。24時間後、胚に20 ugの精製ＭａｂＨＵＩＶ２６または対照を１回静
注した。胚を、全体で7日間、インキュベートさせた。写真は、ＣＡＭ組織内の
対照またはＨＵＩＶ２６処置胚からの腫瘍の例を表す。

【図１９】図１９は、切り取った腫瘍のサイズ比較を示す。７日間のインキュベーション
期間の終了時に、その結果生じた腫瘍を切り取って、全体サイズおよび湿重量に
関して分析した。写真は、対照またはＭａｂＨＵＩＶ２６処置胚から切り取った
腫瘍のサイズの比較を表す。

【図２０】図２０は、腫瘍の湿重量の定量を示す。棒グラフデータは、5〜10胚／条件か
らの腫瘍重量の平均±標準誤差を表す。

【図２１】図２１は、ＳＣＩＤマウス腫瘍モデル系で査定された腫瘍増殖に及ぼすＭａｂ
ＨＵＩＶ２６の作用を示す。ＳＣＩＤマウスに2 x 10⁶Ｍ21ヒト黒色腫細胞を皮
下注射した。３日後、100 ugのＭａｂＨＵＩＶ２６、アイソタイプ適合化対照抗
体を毎日腹腔内注射するか、または処置を用いずに、24日処置を開始した。カリ
パス測定により腫瘍容積をモニタリングし、腫瘍容積を確定した。各群にはマウ
ス５匹が含まれた。データは、各実験条件に関する腫瘍容積の平均±標準誤差を
表す。各実験条件に5または10匹のマウスが含まれる２つの別々の実験で、同様
の結果を得た。

【図２２Ａ】図２２は、コラーゲンペプチドを含有するＲＧＤとのＭａｂＨＵＩＶ２６反応
性の分析を示す。コラーゲンペプチド（100 ug/ml）を含有するＲＧＤ（Ａ）ま
たは変性ヒトＩＶ型コラーゲン（Ｂ）50 ulで、微小滴定プレートを被覆した。
プレートをＰＢＳ中の1％ＢＳＡで遮断して、非特異的結合を阻止した。Ｍａｂ
ＨＵＩＶ２６（1.0 ug/ml、50ul／ウエル）を37℃で1時間、被覆プレートと結合
させた。ペルオキシダーゼ標識化第二抗体を用いたインキュベーションにより、
ＭａｂＨＵＩＶ２６結合を検出した。微小滴定プレート読取機を用いて光学濃度
（Ｏ．Ｄ．）を測定することにより、免疫反応性を定量した。Ａ）コラーゲンペ
プチドを含有するＲＧＤに対する精製ＭａｂＨＵＩＶ２６の免疫反応性。Ｂ）コ
ラーゲンペプチドまたは変性ＩＶ型コラーゲンを含有する可溶性ＲＧＤの存在下
または非存在下での、固定化変性ＩＶ型コラーゲンに対するＨＵＩＶ２６結合の
免疫反応性。棒グラフデータは、３回のウエルからの平均Ｏ．Ｄ．±標準偏差を
表す。

【図２２Ｂ】図２２は、コラーゲンペプチドを含有するＲＧＤとのＭａｂＨＵＩＶ２６反応
性の分析を示す。コラーゲンペプチド（100 ug/ml）を含有するＲＧＤ（Ａ）ま
たは変性ヒトＩＶ型コラーゲン（Ｂ）50 ulで、微小滴定プレートを被覆した。
プレートをＰＢＳ中の1％ＢＳＡで遮断して、非特異的結合を阻止した。Ｍａｂ
ＨＵＩＶ２６（1.0 ug/ml、50ul／ウエル）を37℃で1時間、被覆プレートと結合
させた。ペルオキシダーゼ標識化第二抗体を用いたインキュベーションにより、
ＭａｂＨＵＩＶ２６結合を検出した。微小滴定プレート読取機を用いて光学濃度
（Ｏ．Ｄ．）を測定することにより、免疫反応性を定量した。Ａ）コラーゲンペ
プチドを含有するＲＧＤに対する精製ＭａｂＨＵＩＶ２６の免疫反応性。Ｂ）コ
ラーゲンペプチドまたは変性ＩＶ型コラーゲンを含有する可溶性ＲＧＤの存在下
または非存在下での、固定化変性ＩＶ型コラーゲンに対するＨＵＩＶ２６結合の
免疫反応性。棒グラフデータは、３回のウエルからの平均Ｏ．Ｄ．±標準偏差を
表す。

【図２３】図２３は、変性Ｉ型コラーゲンにおけるヒト内皮索形成を示す。柔軟性ミリポ
ア膜を、ネイティブまたは変性ヒトＩ型コラーゲンで被覆した。付加増殖因子ま
たは血清の非存在下で5時間、ヒト内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）をコラーゲンと相互
作用させた。

【図２４】図２４は、Ｉ型コラーゲンに関する内皮細胞生存の分析を示す。ネイティブま
たはタンパク質分解化／変性ヒトＩ型コラーゲンで、微小滴定ウエルを被覆した
。次に、付加増殖因子または血清の非存在下で5時間、ＨＵＶＥＣをウエルに付
着させた。５時間のインキュベーションの終了時に、付着細胞を取り出し、固定
し、Apop Tagキットでアポトーシスに関して染色し、フローサイトメトリーで分
析した。データは、アポトーシスを受け始めていたヒト内皮細胞のパーセンテー
ジの平均±標準偏差を示した。データは、３回のウエルから得た。

【図２５】図２５は、内皮索形成に及ぼす潜在的Ｉ型コラーゲンドメインの作用を示す。
ヒトＩ型コラーゲンアミノ酸配列および三次元構造の分析は、成熟三重らせんＩ
型コラーゲン内で接近できない考え得る潜在的ドメインを明示した。ヒトＩ型コ
ラーゲンの５つのこれらの考え得る潜在ドメインに対応して、合成ペプチドを生
成した。これらの潜在ドメインを微小滴定ウエル上で固定し、前記と同様に内皮
索形成検定を実行した。図に示したように、５つのコラーゲンペプチドはすべて
、プレート化後１時間までに内皮細胞接着を支持した。しかしながら、ヒトコラ
ーゲンペプチド−２は内皮索形成を促進し、18時間後の内皮細胞生存を増強する
ことが示されたが、一方、他のペプチドは、18時間時点で、活性を、あるとして
もほとんど示さなかった。

【図２６Ａ】図２６は、Ｉ型コラーゲンの潜在ドメインが別個のインテグリン受容体により
内皮細胞を支持したことを示す。ヒトＩ型コラーゲンの潜在ドメインを表すペプ
チドを、微小滴定ウエル上に固定した。特定のインテグリンに向けられる機能遮
断抗体の存在下または非存在下で、内皮細胞をペプチドに付着させた。ペプチド
はすべて、種々のレベルに細胞接着を支持した。５つのペプチドすべてとの細胞
接着は、αｖβ３に向けられるＭａｂＬＭ６０９が細胞接着を遮断したため、イ
ンテグリンαｖβ３の結紮によっていた。意外にも、ペプチド−２との細胞接着
も、このペプチドとの細胞接着もβ１インテグリンに向けられるＰ４Ｃ１０によ
り遮断されたため、β１インテグリンによっていた。

【図２６Ｂ】図２６は、Ｉ型コラーゲンの潜在ドメインが別個のインテグリン受容体により
内皮細胞を支持したことを示す。ヒトＩ型コラーゲンの潜在ドメインを表すペプ
チドを、微小滴定ウエル上に固定した。特定のインテグリンに向けられる機能遮
断抗体の存在下または非存在下で、内皮細胞をペプチドに付着させた。ペプチド
はすべて、種々のレベルに細胞接着を支持した。５つのペプチドすべてとの細胞
接着は、αｖβ３に向けられるＭａｂＬＭ６０９が細胞接着を遮断したため、イ
ンテグリンαｖβ３の結紮によっていた。意外にも、ペプチド−２との細胞接着
も、このペプチドとの細胞接着もβ１インテグリンに向けられるＰ４Ｃ１０によ
り遮断されたため、β１インテグリンによっていた。

【図２７】図２７は、Ｉ型コラーゲンの潜在ドメインと反応性のＭａｂの生成を実証する
。Ｉ型コラーゲンの潜在ドメインを用いて、Ｍａｂヲ生成した。ＸＬ３１３と呼
ばれるこれらのＭａｂのうちの１つを、さらなる研究のために用いた。ヒトＩ型
コラーゲンペプチドを微小滴定ウエル上で固定し、精製ＭａｂＸＬ３１３結合を
査定した。以下に示すように、ＭａｂＸＬ３１３は、ヒトコラーゲンペプチド−
２を特異的に認識した。さらに、ＭａｂＸＬ３１３は、コラーゲンペプチド−４
も認識したが、しかしながら、コラーゲンペプチド−４は成熟Ｉ型コラーゲン中
には存在せず、ＸＬ３１３はその他の同様のＩ型コラーゲンペプチドと反応しな
かった。

【図２８】図２８は、ＭａｂＸＬ３１３が変性ヒトＩ型コラーゲンを特異的に認識するこ
とを示す。微小滴定ウエルを、ネイティブまたは変性ヒトＩ型またはＩＶ型コラ
ーゲンで被覆した。ネイティブまたは変性ヒトＩ型コラーゲンおよび変性ＩＶ型
コラーゲンと結合するＭａｂＸＬ３１３の能力を、固相ＥＬＩＳＡにより査定し
た。ＭａｂＸＬ３１３は変性ヒトＩ型コラーゲンを特異的に認識するが、しかし
ネイティブＩ型コラーゲンは認識しなかった。さらに、ＭａｂＸＬ３１３は、ネ
イティブまたは変性ヒトＩＶ型コラーゲンと結合できなかった。

【図２９】図２９は、ＭａｂＸＬ３１３がヒヨコにおける新脈管形成を阻害することを示
す。ｂＦＧＦを用いて、10日齢ヒヨコ胚のＣＡＭで新脈管形成を誘導した。24時
間後、胚に50 ugのＭａｂＸＬ３１３またはアイソタイプ適合化対照を１回注射
した3日後、フィルター円板の面積内の血管分枝点の数を計数することにより、
新脈管形成を定量した。Ａ；典型的実験からのＣＡＭ組織の代表例。

【図３０】図３０は、図２９の新脈管形成実験の定量を示す。棒グラフデータは、5〜10
胚／条件の平均±標準誤差を表す。

【図３１】図３１は、ヒト繊維肉腫増殖に及ぼす精製ＭａｂＸＬ３１３の全身投与の作用
を示す。ヒト繊維肉腫細胞（5 x 10⁶）を10日齢ヒヨコ胚のＣＡＭ上に接種した
。24時間後、胚に50 ug／胚の濃度で精製ＭａｂＸＬ３１３を１回静注した。7日
後、腫瘍を切り取って、湿重量を確定した。腫瘍重量の定量。データは、5〜10
胚／条件の平均±標準誤差を表す。

【図３２】図３２は、Ｉ型コラーゲンのＭＭＰ切断部位における突然変異がin vivoで黒
色腫増殖を抑制することを示す。Ｉ型コラーゲン内のＭＭＰ切断部位に突然変異
を保有するトランスジェニックマウスを用いて、Ｉ型コラーゲンのタンパク質分
解が腫瘍増殖および新脈管形成に一役を演じ得るか否かを確定した。Col alトラ
ンスジェニックマウスは、ＭＭＰの結合およびＩ型コラーゲンの切断を抑制する
突然変異を有する。Col al B6トランスジェニックマウスまたは野生型対照B6マ
ウスに、B16トランスジェニック黒色腫細胞を皮下注射した。腫瘍を11日間発達
させて、カリパスを用いて腫瘍サイズをモニタリングした。以下で示すように、
B16黒色腫細胞は、Ｉ型コラーゲンを容易にタンパク質分解し得るマウス内に大
型増殖腫瘍を生成した。これに対比して、B16黒色腫細胞は、Ｉ型コラーゲンタ
ンパク質分解が抑制されるB6 Col a1トランスジェニックマウスにおいては、腫
瘍を生成する能力を、あるとしてもほとんど示さなかった。データは、5匹のマ
ウス／条件からの腫瘍容積の平均±標準誤差を表す。

【図３３Ａ】図３３は、ＭａｂＸＬ３１３がB6マウスにおける腫瘍増殖を抑制することを示
す。ルイス胚癌腫の増殖を、野生型B6マウスまたはCol a1トランスジェニックマ
ウスで調べた。Ａ；ルイス肺癌細胞を、野生型B6マウスまたはB6 col a1トラン
スジェニックマウスに皮下注射した。Ｂ；野生型B6またはcol a1 B6トランスジ
ェニックマウス内のルイス肺癌腫増殖の比較。Ｃ；野生型B6対照マウスに類す肺
癌細胞を注射した。24時間後、マウスを、ＭａｂＸＬ３１３またはアイソタイプ
適合化対照抗体（100μg／注射）で全身処置した。腫瘍を11日間発達させて、カ
リパスにより腫瘍サイズをモニタリングした。データは、5匹のマウス／条件か
らの腫瘍容積の平均±標準誤差を表す。

【図３３Ｂ】図３３は、ＭａｂＸＬ３１３がB6マウスにおける腫瘍増殖を抑制することを示
す。ルイス胚癌腫の増殖を、野生型B6マウスまたはCol a1トランスジェニックマ
ウスで調べた。Ａ；ルイス肺癌細胞を、野生型B6マウスまたはB6 col a1トラン
スジェニックマウスに皮下注射した。Ｂ；野生型B6またはcol a1 B6トランスジ
ェニックマウス内のルイス肺癌腫増殖の比較。Ｃ；野生型B6対照マウスに類す肺
癌細胞を注射した。24時間後、マウスを、ＭａｂＸＬ３１３またはアイソタイプ
適合化対照抗体（100μg／注射）で全身処置した。腫瘍を11日間発達させて、カ
リパスにより腫瘍サイズをモニタリングした。データは、5匹のマウス／条件か
らの腫瘍容積の平均±標準誤差を表す。

【手続補正書】

【提出日】平成１３年７月１８日（２００１．７．１８）

【手続補正２】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】全図

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１Ａ】

【図１１Ｂ】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【図２１】

【図２２Ａ】

【図２２Ｂ】

【図２３】

【図２４】

【図２５】

【図２６Ａ】

【図２６Ｂ】

【図２７】

【図２８】

【図２９】

【図３０】

【図３１】

【図３２】

【図３３Ａ】

【図３３Ｂ】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 45/06 Ａ６１Ｋ 49/00 Ａ４Ｈ０４５ 49/00 ＣＡ６１Ｐ 3/10 51/00 9/00 Ａ６１Ｐ 3/10 9/10 9/00 １０１ 9/10 17/02 １０１ 19/02 17/02 19/10 19/02 27/02 19/10 29/00 27/02 １０１ 29/00 31/00 １０１ 35/00 31/00 35/04 35/00 37/06 35/04 41/00 37/06 43/00 １２１ 41/00 Ｃ０７Ｋ 7/06 ＺＮＡ 43/00 １２１Ｇ０１Ｎ 33/15 ＺＣ０７Ｋ 7/06 ＺＮＡ 33/50 ＺＧ０１Ｎ 33/15 33/53 Ｄ 33/50 Ｃ１２Ｐ 21/08 33/53 Ａ６１Ｋ 37/02 // Ｃ１２Ｐ 21/08 49/02 Ａ (31)優先権主張番号６０／１４３，５３４ (32)優先日平成11年７月13日(1999．7．13) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号６０／１５２，４９６ (32)優先日平成11年９月２日(1999．9．2) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ジンソン，エリックシューアメリカ合衆国，カリフォルニア 90801，アルハンブラ，アパートメントジー，サウスフィフスストリート 101 Ｆターム(参考） 2G045 AA26 AA40 DA36 FB03 FB07 4B064 AG27 CA10 CA20 CC24 DA05 DA14 4C084 AA02 AA17 AA20 BA03 BA23 BA24 CA59 DA58 MA02 MA52 MA56 MA58 MA59 MA63 MA66 NA14 ZA33 ZA36 ZA45 ZA89 ZA96 ZA97 ZB08 ZB11 ZB15 ZB26 ZB31 ZC35 ZC42 4C085 AA13 AA14 BB11 CC21 EE01 EE03 GG02 GG08 HH03 HH05 HH07 HH11 HH13 KA03 KA04 KA26 KA27 KA28 KA29 LL01 LL07 LL18 4C086 AA01 AA02 EA16 MA01 MA02 MA04 MA52 MA56 MA58 MA59 MA63 MA66 NA14 ZA33 ZA36 ZA89 ZA96 ZA97 ZB08 ZB11 ZB15 ZB26 ZC35 ZC42 4H045 AA11 AA20 AA30 BA16 CA40 DA75 DA76 EA28 EA51 FA72

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】単数または複数の変性コラーゲンと特異的に結合するが、し
かし実質的低減化親和性でネイティブ三重らせん形態の前記単数または複数のコ
ラーゲンの各々と結合するアンタゴニスト。
【請求項２】前記低減化親和性が前記変性コラーゲンに関する値の約３分
の１である請求項１のアンタゴニスト。
【請求項３】前記低減化親和性が前記変性コラーゲンに関する値の約５分
の１である請求項１のアンタゴニスト。
【請求項４】前記低減化親和性が前記変性コラーゲンに関する値の約10分
の１である請求項１のアンタゴニスト。
【請求項５】前記アンタゴニストが新脈管形成を抑制する請求項１のアン
タゴニスト。
【請求項６】前記変性コラーゲンがＩ型変性コラーゲン、ＩＩ型変性コラ
ーゲン、ＩＩＩ型変性コラーゲン、ＩＶ型変性コラーゲンまたはＶ型変性コラー
ゲンである請求項１のアンタゴニスト。
【請求項７】前記変性コラーゲンが変性Ｉ型コラーゲンである請求項６の
アンタゴニスト。
【請求項８】前記変性コラーゲンが変性Ｉ型コラーゲンおよび変性ＩＶ型
コラーゲンである請求項６のアンタゴニスト。
【請求項９】前記変性コラーゲンが変性ＩＩ型コラーゲン、変性ＩＩＩ型
コラーゲンおよび変性Ｖ型コラーゲンである請求項７のアンタゴニスト。
【請求項１０】前記アンタゴニストがモノクローナル抗体である請求項６
のアンタゴニスト。
【請求項１１】前記モノクローナル抗体がモノクローナル抗体ＨＵＩ７７
、ＨＵＩＶ２６またはＸＬ３１３の結合特異性を有するモノクローナル抗体であ
る請求項８のアンタゴニスト。
【請求項１２】ポリクローナル抗体である請求項６のアンタゴニスト。
【請求項１３】ポリペプチド、線状ペプチドまたは環状ペプチドである請
求項６のアンタゴニスト。
【請求項１４】非ペプチド化合物である請求項６のアンタゴニスト。
【請求項１５】オリゴヌクレオチドである請求項６のアンタゴニスト。
【請求項１６】ヒト化または化学的修飾化モノクローナル抗体である請求
項６のアンタゴニスト。
【請求項１７】モノクローナル抗体の断片である請求項６のアンタゴニス
ト。
【請求項１８】細胞傷害剤または細胞分裂抑制剤と共役される請求項６の
アンタゴニスト。
【請求項１９】請求項１〜１７のいずれかのアンタゴニストを投与するこ
とを含む組織中の新脈管形成の抑制方法。
【請求項２０】前記アンタゴニストが静脈内に、経皮的に、滑液包内に、
筋肉内に、腫瘍内に、眼内に、鼻腔内に、腱鞘内に、局所的にまたは経口的に投
与される請求項１９の方法。
【請求項２１】前記アンタゴニストが化学療法とともに投与される請求項
１９の方法。
【請求項２２】前記アンタゴニストが放射線とともに投与される請求項１
９の方法。
【請求項２３】組織が炎症を起こされ、新脈管形成が発生しつつある請求
項１９の方法。
【請求項２４】組織が哺乳類中に存在する請求項２３の方法。
【請求項２５】組織が関節、眼、網膜または血管腫である請求項２４の方
法。
【請求項２６】組織における腫瘍増殖または転移の抑制方法であって、請
求項１〜１７のいずれかのアンタゴニストを投与することを包含する方法。
【請求項２７】前記アンタゴニストが静脈内に、経皮的に、滑液包内に、
筋肉内に、腫瘍内に、眼内に、鼻腔内に、局所的にまたは経口的に投与される請
求項２６の方法。
【請求項２８】前記アンタゴニストが化学療法とともに投与される請求項
２６の方法。
【請求項２９】前記アンタゴニストが放射線とともに投与される請求項２
６の方法。
【請求項３０】腫瘍または転移が黒色腫、癌腫、肉腫、繊維肉腫、神経膠
腫または星状細胞腫である請求項２６の方法。
【請求項３１】請求項１〜１７のいずれかのアンタゴニストを投与するこ
とによる組織における感染、黄斑変性または再狭窄の抑制方法。
【請求項３２】前記アンタゴニストが静脈内に、経皮的に、滑液包内に、
筋肉内に、腫瘍内に、眼内に、鼻腔内に、腱鞘内に、局所的にまたは経口的に投
与される請求項３１の方法。
【請求項３３】前記アンタゴニストが化学療法とともに投与される請求項
３１の方法。
【請求項３４】前記アンタゴニストが放射線とともに投与される請求項３
１の方法。
【請求項３５】請求項１〜１７のいずれかのアンタゴニストを前記組織と
接触させることによる組織における新脈管形成の検出方法。
【請求項３６】前記組織がex vivoで存在する請求項３５の方法。
【請求項３７】前記組織がin vivoで存在し、前記アンタゴニストが静脈
内に、経皮的に、滑液包内に、筋肉内に、腫瘍内に、眼内に、鼻腔内に、腱鞘内
に、局所的にまたは経口的に投与される請求項３５の方法。
【請求項３８】前記アンタゴニストが蛍光色素、放射性タグ、常磁性重金
属、診断用染料または酵素と共役される請求項３５の方法。
【請求項３９】請求項１〜１７のいずれかのアンタゴニストを投与するこ
とによる組織における腫瘍または腫瘍浸潤の検出方法。
【請求項４０】前記組織がex vivoで存在する請求項３９の方法。
【請求項４１】前記組織がin vivoで存在し、前記アンタゴニストが静脈
内に、経皮的に、滑液包内に、筋肉内に、腫瘍内に、眼内に、鼻腔内に、腱鞘内
に、局所的にまたは経口的に投与される請求項３９の方法。
【請求項４２】前記アンタゴニストが蛍光色素、放射性タグ、常磁性重金
属または診断用染料と共役される請求項３９の方法。
【請求項４３】変性コラーゲンアンタゴニストに関するスクリーニング方
法であって、以下の：ａ）推定アンタゴニストを提供し、ｂ）Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶおよびＶ型コラーゲンから成る群から選択される
変性コラーゲンに対する前記推定アンタゴニストの一次親和性を測定し、ｃ）Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶおよびＶ型コラーゲンから成る群から選択される
ネイティブコラーゲンであって、選択される前記ネイティブコラーゲンが選択さ
れる変性コラーゲンのネイティブ形態であるネイティブコラーゲンに対する前記
推定アンタゴニストの二次親和性を測定し、ｄ）前記二次親和性が前記一次親和性より実質的に低い場合には、変性コラー
ゲンアンタゴニストとして前記推定アンタゴニストを選択することを包含する方法。
【請求項４４】前記推定アンタゴニストが非ペプチド化合物である請求項
４３の方法。
【請求項４５】前記非ペプチド化合物が小型有機化合物である請求項４４
の方法。
【請求項４６】前記非ペプチド化合物がオリゴヌクレオチドである請求項
４４の方法。
【請求項４７】前記推定アンタゴニストがポリペプチド、線状ペプチドま
たは環状ペプチドである請求項４３の方法。
【請求項４８】前記推定アンタゴニストが抗体である請求項４３の方法。
【請求項４９】前記抗体がモノクローナルである請求項４８の方法。
【請求項５０】前記抗体がポリクローナルである請求項４８の方法。
【請求項５１】前記一次および前記二次親和性が酵素結合イムノソルベン
ト検定により測定される請求項４３の方法。
【請求項５２】前記二次親和性が前記一次親和性の約３分の１である請求
項４３の方法。
【請求項５３】前記二次親和性が前記一次親和性の約５分の１である請求
項４３の方法。
【請求項５４】前記二次親和性が前記一次親和性の約10分の１である請求
項４３の方法。
【請求項５５】変性コラーゲン中のエピトープを結合するための請求項１
１のアンタゴニストと競合する能力に関してアンタゴニストを選択することを包
含する変性コラーゲンアンタゴニストに関するスクリーニング方法。
【請求項５６】請求項１のアンタゴニストにより認識されるエピトープを
コードする配列を含有するペプチド。
【請求項５７】前記アンタゴニストがモノクローナル抗体である請求項５
６のペプチド。
【請求項５８】前記抗体がＨＵＩ７７，ＨＵＩＶ２６またはＸＬ３１３で
ある請求項５７のペプチド。
【請求項５９】配列番号１２である請求項５８のペプチド。