JP2018521015A - 免疫チェックポイント阻害薬の治療活性の増強 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、米国特許法第119条(e)の下、2015年6月1日に出願された米国仮出願第62/169,463号に基づく優先権を主張するものであり、その内容全体が引用により本明細書に組み込まれる。
本研究は、助成金番号CA91645、HL65301、HL083151、P20RR15555、5P30GM103392およびP20 RR181789の下、米国国立衛生研究所からの助成を受けてなされたものである。米国政府は、本発明に関し一定の権利を保有する。
特に記載がない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語はいずれも、本発明が属する技術分野において当業者に一般に理解される意味を有する。当業者であれば、以下の文献から、本発明で使用される用語の一般的な定義の多くを理解することができるであろう:Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994);The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988);The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991);およびHale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。本明細書において、以下の用語は特に記載がない限り、それぞれの用語について以下で説明された意味を有するものとする。
これらの概念は、数学的には以下の式で表される。
感度=真陽性数/(真陽性数+偽陰性数)
特異度=真陰性数/(真陰性数+偽陽性数)
試薬、キット、化学物質および抗体
エタノール、メタノール、アセトン、ウシ血清アルブミン(BSA)、クリスタルバイオレット、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、精製ヒトIV型コラーゲンおよび精製I型コラーゲン、AMPA、3,3,5,5’−テトラメチルベンジジン(TMB)、ホスファターゼ阻害剤カクテル、ならびに酢酸コルチゾン(CA)は、シグマ社(ミズーリ州セントルイス)から入手した。MMP2はChemicon/ミリポア社(マサチューセッツ州ビレリカ)から入手した。FBSはScience Cell社(カリフォルニア州カールスバッド)から入手した。線維芽細胞増殖因子−2(FGF-2)はR&Dシステムズ社(ミネソタ州ミネアポリス)から入手した。核/細胞質分画キットはThermo Scientific社(マサチューセッツ州ウォルサム)から入手した。P38 MAPK阻害薬であるSB202190はCalbiochem社(カリフォルニア州サンディエゴ)から入手した。RIPAバッファー、プロテアーゼ阻害薬、およびSrc阻害薬(PP2)は、Santa Cruz社(カリフォルニア州サンタクルーズ)から入手した。抗vWf抗体はBD Pharmingen社(カリフォルニア州サンディエゴ)から入手した。抗P38MAPK抗体、抗ホスホP38MAPK(Thr180/Tyr182)抗体、抗Src抗体、および抗ホスホSrc(Tyr416)抗体は、Cell Signaling Technology社(マサチューセッツ州ダンバース)から入手した。抗チューブリン抗体、抗トータル結合タンパク質(TBP)抗体、抗YAP抗体、抗β3抗体、および抗ホスホ133(Tyr747)抗体は、Santa Cruz社(カリフォルニア州サンタクルーズ)から入手した。抗Igfbp4抗体および抗MMP9抗体はAbcam社(マサチューセッツ州ケンブリッジ)から入手した。機能遮断抗体であるP4C10(抗β1抗体)、LM609(抗αvβ3抗体)およびP1F6(抗αvβ5抗体)は、R&Dシステムズ社(ミネソタ州ミネアポリス)から入手した。HRP標識二次抗体はプロメガ社(ウイスコンシン州マディソン)から入手した。抗I型コラーゲン抗体はRockland社(ペンシルバニア州リムリック)から入手し、抗IV型コラーゲン抗体はミリポア社(マサチューセッツ州ビレリカ)から入手した。マウスモノクローナルXL313抗体およびマウスモノクローナルXL166抗体は構築した。Alexa-488標識抗体、Alexa-594標識抗体、ストレプトアビジンAlexa-594標識抗体、およびファロイジンAlexa-594標識抗体は、インビトロジェン社(カリフォルニア州カールスバッド)から入手した。RGDを含む合成コラーゲンペプチド(P-1;CKGDRGDAPGC(配列番号5)、P-2;CQGPRGDKGEC(配列番号6)、P-3;CAGSRGDGGPC(配列番号7)、P-4;CQGIRGDKGE(配列番号8)、P-5;CRGPRGDQGPC(配列番号9))およびペプチドコントロール(P-C;CQGPSGAPGEC;配列番号10)は、QED Biosciences社(カリフォルニア州サンディエゴ)から入手した。
RAW264.7細胞およびTHP-1細胞はATCC(バージニア州マナサス)から入手した。10%FBS、1.0%ペニシリン−ストレプトマイシンおよび1.0%ピルビン酸ナトリウムの存在下において、RAW264.7細胞はDMEM中で培養し、THP-1細胞はRPMI中で培養した。不死化BV-2細胞は、10%FBS、1.0%ペニシリン−ストレプトマイシンおよび1.0%ピルビン酸ナトリウムを添加したDMEM中で培養した。ヒト皮膚線維芽細胞(HDF)は、Science Cell社(カリフォルニア州カールスバッド)から入手し、2.0%FBSを添加した線維芽細胞増殖培地中で培養し、第4継代細胞〜第9継代細胞を使用した。ヒト網膜毛細血管内皮細胞(HRMVEC)は、Applied Cell Biology Institute(ワシントン州カークランド)から入手し、増殖因子としてEGM-2を添加したEBM2中で培養した。ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)およびヒト毛細血管内皮細胞(HMVEC)は、ATCC(バージニア州マナサス)から入手し、HUVECは、増殖因子としてEGM-2を添加したEBM2中で培養し、HMVECは、増殖因子としてEGM-2MVを添加したEBM2中で培養した。内皮細胞増殖培地はいずれも、2%FBS、1.0%ペニシリン−ストレプトマイシンおよび1.0%ピルビン酸ナトリウムを含み、第3継代細胞〜第9継代細胞を実験に使用した。馴化培地を回収するため、血清を含まない基礎培地中で細胞を24時間培養した。馴化培地を回収し、3kDaの遠心式限外濾過カートリッジを備えたアミコンウルトラセルを用いて10倍に濃縮した。
RGDペプチド(P-1、P-2、P-3、P-4、P-5およびP-C)をそれぞれウェルに固相化した(100μg/ml)。HUVEC細胞、HMVEC細胞、HRMVEC細胞およびHDF細胞をそれぞれ接着バッファー(1mM MgCl2、0.2mM MnCl2および0.5%BSAを含有するRPMI)に懸濁し、P4C10抗体、LM609抗体、P1F6抗体またはコントロール抗体(100μg/ml)の存在下または非存在下で1×105個の細胞をウェルに播種した。37℃で25分間かけてウェルに細胞を接着させた。非接着細胞を含む培地を吸引除去し、接着細胞をPBSで洗浄し、クリスタルバイオレットで染色した。溶出させた色素の光学密度を測定することによって細胞接着を定量した。接着アッセイは、三連ウェルで少なくとも3回行った。
I型コラーゲンまたはIV型コラーゲンを15分間かけて熱変性させ、APMAで活性化させたMMP2を加えて37℃で0.5時間、1時間、4時間、8時間または20時間インキュベートした後、5分間煮沸して残存するMMPを不活性化した。固相ELISAを行うため、RGD含有合成コラーゲンペプチド(P-1、P-2、P-3、P-4、P-5またはP-C)をウェルに固相化(100μg/ml)するか、あるいは10μg/mlの天然I型コラーゲンもしくは天然IV型コラーゲン、またはMMP2で加水分解した10μg/mlのI型コラーゲンもしくはMMP2で加水分解した10μg/mlのIV型コラーゲンでウェルをコーティングした。1%BSAを含むPBSを用いてウェルを1時間ブロッキングし、1μg/mlのMab XL313またはMab XL166と1時間インキュベートし、洗浄し、抗マウスHRP標識抗体(1:5000)とインキュベートした。製造業者の使用説明書に従って、結合したモノクローナル抗体をTMB基質で検出し、分光計で測定することによって定量した。いずれのアッセイも三連ウェルで少なくとも4回行った。
鶏胚漿尿膜(CAM)アッセイをいくつかの変更を加えて行った(19)。いずれの実験においても、チャールス・リバー社(コネチカット州ノースフランクリン)から10日齢の鶏胚を入手し、漿尿膜から卵殻膜を取り除いて使用した。フィルターディスクは、炎症アッセイでは処理を加えずに使用し、血管新生アッセイでは、酢酸コルチゾン(3.0mg/ml)を含むRPMIまたは酢酸コルチゾン(3.0mg/ml)とFGF-2(40ng)を含むRPMIで前処理した。CAMは、処理を行わなかったか、あるいはMab XL313、Mab XL166または非特異的コントロール抗体で局所的に処理した(1個の鶏胚あたり10μgの抗体を使用して、24時間ごとに3回連続して処理した)。ペプチドを用いた誘導実験では、P38MAPK阻害薬であるSB202190(10μM)の存在下または非存在下において、100ng/mlのRGDペプチド(P-1、P-2、P-C)でCAMを刺激した。インキュベーション終了後、鶏胚を致死させ、CAM組織を分析した。血管新生は、フィルターディスクを置いた部分に新たに生じた血管分枝の本数をカウントすることによって定量した。血管新生指数は、各実験条件から得た血管分岐点数の平均値を非処理CAMから差し引くことによって求めた。1条件につき8〜12個の鶏胚を使用し、少なくとも3回実験を繰り返した。
肉芽組織の蓄積の調査では、CAMを採取し、4%PFAで固定し、パラフィン包埋し、薄切(4μm)してギムザ染色した。免疫蛍光法による分析では、CAM組織を採取し、OCTで包埋し、急速凍結し、薄切(4μm)した。凍結切片を50%メタノール/50%アセトンで固定し、風乾し、2.5%BSAを用いて37℃で1時間ブロッキングした。XL313エピトープおよびXL166エピトープの発現ならびに単球/マクロファージの発現を調べるため、FGF-2で刺激したCAM組織をMab XL313、Mab XL166(50μg/ml)またはKUL1(1:250)で染色し、Alexa-488標識二次抗体(1:2000希釈)とインキュベートした。FGF-2で刺激したCAMにおける単球/マクロファージとMab XL313反応性エピトープとの共染色は連続染色法により実施した。最初にKUL1(1:250)で染色し、次いでビオチン標識Mab XL313(50μg/ml)で染色し、各抗体をAlexa-488二次抗体およびストレプトアビジンAlexa-594(1:2000)でそれぞれ検出した。同様の方法を用いて、RGDペプチドで処理したCAM組織の薄切切片を使用し、抗ホスホP38MAPK抗体(1:50)と抗vWf抗体(1:500)とで共インキュベートすることによって、新生血管におけるリン酸化P38MAPKの発現を分析した。YAPの細胞内局在は、P-2またはP-1でコーティングしたガラス製カバースリップに接着させたHUVECにおいて観察した。血清の非存在下において15分間、30分間または60分間かけて細胞をカバースリップに接着させ、4%PFAで固定した。固定した細胞を洗浄し、2.5%BSAでブロッキングし、抗YAP抗体(1:200)およびファロイジン(1:500)で染色した。薄切切片およびスライドはいずれもDAPIで対比染色した。
HUVEC(WTまたはshYAP1もしくはコントロールをトランスフェクトしたもの)またはHRMVECを、2.0%FBSを含む完全EGM-2培地中に2,000個/ウェルの密度で播種し、P-1、P-2またはP-C(100ng/ml)の非存在下または存在下において24時間増殖させた。製造業者の使用説明書に従って、BrdUアッセイキットまたはMMTアッセイキットを使用することによって細胞の増殖をモニターした。いずれのアッセイも三連ウェルで少なくとも3回行った。
1mM MgCl2および0.2mM MnCl2を添加した無血清培地に内皮細胞(HUVECまたはHRMVEC)を播種し、Src阻害薬であるPP2(10μM)、P38MAPK阻害薬であるSB202190(10μM)またはビヒクルのみ(DMSO)の存在下において37℃で10分間インキュベートした。次いで、P-1またはP-2を固相化したウェルに処理細胞を播種し、15分後に溶解物を回収した。
全細胞溶解物およびCAM組織溶解物を、1×プロテアーゼ阻害薬および1×ホスファターゼ阻害薬を添加したRIPAバッファー中に回収し、ポリアクリルアミドゲルにロードして変性条件下で泳動を行った。ゲルにロードする前に、各溶解物に6×サンプルバッファーを加えて(最終濃度:1×)5分間煮沸した。各レーンには、20〜50μgの全タンパク質をロードした。50kDよりも大きいタンパク質の検出には10%のゲルを使用し、50kDよりも小さいタンパク質の検出では15%のゲルを使用した。ゲルに60ボルト(v)の電圧をかけて泳動を開始し、色素の先端が濃縮ゲルを通過した時点で電圧を100Vに上昇させ、分離を行った。プレシジョンPlusプロテインスタンダード(バイオ・ラッド)を用いて、移動度を可視化した。ウェット式タンクシステムを用いてタンパク質をニトロセルロース膜に転写し、0.01%Tween20を含むトリス緩衝生理食塩水(TBS-T)に溶解した10%脱脂粉乳を用いて1時間ブロッキングした。5%BSA含有TBS-Tで希釈した一次抗体(抗coll-I抗体(1:250)、抗coll-IV抗体(1:250)、Mab XL313(2μg/ml)、Mab XL166(2μg/ml)、抗β−アクチン抗体(1:5000)、抗ホスホβ3抗体(1:7000)、抗β3抗体(1:1000)、抗ホスホSrc抗体(1:500)、抗Src抗体(1:500)、抗ホスホP38MAPK抗体(1:500)、抗P38MAPK抗体(1:2000)、抗YAP抗体(1:500)、抗チューブリン抗体(1:2000)、抗TBP抗体(1:1000))と膜を4℃でゆるやかに振盪しながら一晩インキュベートした。TBS-Tに膜を浸して5分間の洗浄を3回行った。1%脱脂粉乳を含むTBS-TでHRP標識二次抗体を希釈し(1:15000)、希釈した二次抗体と膜を1時間インキュベートした。上述と同様にして膜を再度洗浄し、化学発光基質に3分間接触させ、暗室でオートラジオグラフィーフィルムに露出させた。Image Jソフトウェアを用いて画素強度を分析することによって、ウエスタンブロットバンドを定量した。
Amaxa cell line nucleofector kit V(プログラム#T024)を使用して、I型コラーゲンα2鎖の発現を抑制するためのHuSH shRNAプラスミド1μgでRaw細胞の形質導入を行った。また、ヒトYAPを標的とする21塩基のショートヘアピンRNA(shRNA)(shYAP)または非標的コントロール(shNT、シグマ アルドリッチ、SHC002)を発現する構築物を使用した。ヒト標的shYAP1レンチウイルスshRNAは、サーモサイエンティフィックRNAiコンソーシアム(TRCN0000107625)から入手した。水疱性口内炎ウイルスの糖タンパク質を付加したシュードタイピングレンチウイルスに構築物をパッケージングした。このレンチウイルスと細胞をインキュベートして形質導入を行い、安定に形質導入された細胞を試験に使用した。細胞株への形質導入は、いずれの場合も、形態変化を確認し、さらにマウスまたはヒトYAP特異的PCRを行うことによって確認した。YAPノックダウンの効率は70%〜80%であった。内皮細胞は、PCR(ロンザ)によってマイコプラズマ陰性であると判定されたものであり、初代細胞は記載の継代数まで培養したものを使用した。形質導入した細胞はピューロマイシンで選択した。
統計解析は、Macintoshコンピュータ用のInStat統計プログラムを用いて行った。データの統計的有意性は、スチューデントのt検定を用いて解析した。p値<0.05である場合に統計的有意性があるとみなした。
短鎖アミノ酸配列RGDを含む細胞外マトリックス(ECM)タンパク質は、インテグリン受容体を介した相互作用を補助する能力を有することが過去の研究で報告されている(33)。大きな糖タンパク質に内在するRGD部位と細胞との間で起こる相互作用は様々な要因に左右され、たとえば、コアとなるRGDトリペプチドの両側に隣接するフランキング配列だけでなく、インタクトな糖タンパク質分子の立体配置や、その他のECMタンパク質が関与する相互関連ネットワークにおいてこの糖タンパク質分子がどのように配向されるのかということにも左右される(24,25,33)。インテグリンの選択的結合は、RGD部位のC末端側直後に位置するフランキング配列によって決まる(24,25,33)。RGDモチーフは、三重らせんコラーゲンで見られるような、細胞表面受容体がアクセスできない潜在性モチーフである場合もある(34)。これに関連して、ヒトI型コラーゲンには、フランキング配列が異なる5種の潜在性RGD含有部位が存在する(表1)。
RGDトリペプチドモチーフが重要であることを踏まえ、I型コラーゲンにおいて、コアとなるRGD部位の両側に隣接するフランキング配列のうち、細胞認識に影響を与えうるフランキング配列を特定した。さらに、これらの潜在性RGDコラーゲンモチーフが冗長な部位であるのかどうか、また、フランキング配列が特徴的な特性の付与に寄与しているのかどうかを評価するため、それぞれのフランキング配列が含まれるようにI型コラーゲン由来の各RGDエピトープを合成した。これら5種のRGDペプチドを固相化し、それぞれの細胞接着促進能を評価した。図1Aに示したように、5種のコラーゲンRGDペプチド(P1〜P5)はいずれも、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)の接着を補助する能力を有し、ペプチド5(P-5)が最も高い接着促進能を有する。これに対して、P-2のRGDモチーフがSGAと置換されたペプチドコントロール(P-C)では、接着の補助は見られなかった。接着促進能がHUVECのみに特異的なものではなかったことを確認するため、ヒト毛細血管内皮細胞(HMVEC)、ヒト網膜毛細血管内皮細胞(HRMVEC)およびヒト皮膚線維芽細胞を使用して同様のアッセイを実施した。これらの内皮細胞および線維芽細胞はいずれも、RGDを含む5種のコラーゲンペプチドと結合したが、コントロールペプチドでは相互作用の補助は見られなかった(図1B〜図1D)。これらのデータから、ある程度の差は観察されたものの、5種のRGDペプチドはいずれも細胞接着を補助する能力を有していたことが示された。
上述の潜在性RGDコラーゲンエピトープを試験するため、モノクローナル抗体を作製した。別々のRGD含有エピトープを特異的に認識できる抗体として、2種の抗体を単離した。図1Eに示したように、Mab XL313は、RGDKGE(配列番号1)保存モチーフ(表1)を含むコラーゲンペプチドP-2およびP-4に特異的に結合したが、P-1、P-3、P-5などの他のRGDペプチドとは有意な反応性を示さなかった。XL166と名付けた第2の抗体は、RGD含有コラーゲンペプチドP-1、P-3およびP-5を認識したが、RGDKGE(配列番号1)含有ペプチドP-2およびP-4とは結合しなかった(図1F)。Mab XL313もMab XL166も、コントロールペプチド(P-C)との相互作用は示さなかった。
完全長コラーゲン分子中のRGDモチーフに対するMab XL313の結合能を測定した。実験を容易に行うため、変性させたI型コラーゲンまたはIV型コラーゲンをMMP-2とともに12時間インキュベートして、加水分解コラーゲンを作製した。I型コラーゲン(図2Aの左パネル)またはIV型コラーゲン(図2Aの右パネル)に特異的に結合する抗体を用いてウエスタンブロット分析を行ったところ、MMP-2でI型コラーゲンおよびIV型コラーゲンを加水分解したことによって複数種の断片が生成されたことが示された。RGDKGE(配列番号1)コラーゲン配列に特異的に結合するMab XL313は、変性および還元条件下(図2B)またはELISAでの非変性および非還元条件下(図2C)において、インタクトなI型コラーゲンまたはIV型コラーゲンにごくわずかな反応性しか示さなかった。これに対して、I型コラーゲンの低分子量断片はMab XL313によって容易に検出されたが、加水分解後のIV型コラーゲンは検出されなかった(図2B)。また、Mab XL313は、ビトロネクチンやフィブロネクチンなどの、他のRGD含有ECMタンパク質を認識できなかった。
血管基底膜におけるコラーゲンのリモデリングによって、様々なRGD非含有潜在性コラーゲン部位が露出することがあり、その中でも、血管新生において積極的な役割を果たしている可能性のあるHUIV26エピトープおよびHU177エピトープが露出することが過去の研究で示されている(21,23)。この知見を踏まえ、特徴的なRGD含有エピトープがインビボで露出するかどうかを調査した。まず、特徴的なRGDエピトープが血管新生中に生成されるかどうかを調べるため、鶏胚漿尿膜(CAM)モデル(19)を使用した。鶏胚漿尿膜(CAM)をFGF-2で刺激し、Mab XL313およびMab XL166を使用してRGD含有コラーゲンエピトープの生成を調べた。図3Aに示したように、刺激しなかったCAMでは、Mab XL313またはMab XL166に反応性を示すエピトープはほとんど検出されなかった。これに対して、FGF-2で刺激したCAM組織では、RGDを含むコラーゲンエピトープ(緑色)が容易に検出され、これらの抗体によって認識されるRGD含有エピトープの生成に違いがあることが確認された。Mab XL313またはMab XL166に反応性を示すRGDエピトープは、典型的な細胞外コラーゲン原線維パターンを示さず、点状の分布を示し、細胞内での局在および細胞外での散在が認められた。細胞内分布は、マクロファージの細胞内小胞で見られることが報告されているコラーゲン分解産物の染色パターンと類似している(35)。
鶏胚漿尿膜(CAM)は、炎症や肉芽組織の形成を評価するために日常的に使用されているが、炎症や肉芽組織の形成は、鶏胚のヘテロフィル(鳥類の好中球に相当する細胞)、マクロファージおよび活性化線維芽細胞の浸潤に大きく依存する(36,37)。RGDエピトープの潜在的な生物学的インパクトに違いがあるかどうかを調べるため、酢酸コルチゾンを使用せずに同様の実験を行い、CAMの肥厚を定量することによってFGF-2誘導性炎症を試験した。図3Cに示したように、FGF-2で処理したことによって、CAMの炎症を示す漿尿膜の顕著な肥厚が誘導され(上のパネル)、ギムザ染色では炎症性細胞の広範な浸潤が見られ(中央のパネル)、鳥類に特異的な単球およびマクロファージに結合する抗体を用いた染色では、単球およびマクロファージの蓄積の増加が見られた(下のパネル)。FGF-2で刺激したCAMへのマクロファージの浸潤は、コントロールの2倍以上に増加したことから(p<0.05)(図3D)、このモデルにおけるFGF-2誘導性炎症は、肉芽組織を形成するマクロファージの動員および蓄積を伴うことが示された。
FGF-2刺激によって誘導された炎症反応において、RGD含有コラーゲンエピトープが一定の役割を果たしているのかどうかを調査するため、抗RGD特異的抗体であるXL313抗体およびXL166抗体の存在下または非存在下において、FGF-2誘導性炎症反応を試験した。酢酸コルチゾンの非存在下においてFGF-2による刺激を行い、炎症反応を定量したところ、肥厚した肉芽組織の顕著な形成がCAMの約50%に見られた(図3E)。酢酸コルチゾン(研究でよく使用されている抗炎症剤)でCAMを処理することによって、肥厚を示すCAMのパーセンテージが有意に低下し(p<0.05)、非処理またはコントロール抗体で処理したものと比べて80%を上回る低下が認められた。興味深いことに、Mab XL313でCAMを処理することによっても、炎症を起こしたCAMの数がコントロールと比べて約75%減少した(p<0.05)。これに対して、Mab XL166で処理したCAMでは有意な効果は見られなかった(p>0.05)。これらのデータは、潜在性RGDエピトープの種類によってインビボでの役割が異なることが示された血管新生試験の知見と一致している。
血管新生および炎症においては、内皮細胞、線維芽細胞、マクロファージなどの様々な種類の細胞が、加水分解を介して細胞外コラーゲンをリモデリングする。このコラーゲンのリモデリングの結果、間質細胞の浸潤および新生血管の成長を許容し、これらを促進する微小環境が形成される。コラーゲンは、線維芽細胞や内皮細胞などの様々な細胞から発現され、部分的に分解されたコラーゲンは、活性化M2様マクロファージにより内在化されて、さらなるプロセシングを受けることがあり、これによって低分子量断片が生成される(35,38)。インビボにおいてMab XL313のユニークな免疫反応パターンが観察されたことから、血管新生および炎症に関連する間質細胞が、RGDKGE(配列番号1)含有エピトープを生成することができるかどうかを調査した。線維芽細胞と内皮細胞のそれぞれから全細胞溶解物を調製し、ウエスタンブロットを実施した。内皮細胞と線維芽細胞のそれぞれから調製した溶解物において、Mab XL313に反応性を示す反応種がいくつか検出されたが、免疫反応性を示す反応種は主として28Kd〜75Kd付近のバンドとして検出され、これらの反応種は恐らくインタクトなコラーゲンではないことが示された。さらに、MMP-2による加水分解を行ったところ、主として14Kd〜16Kdのコラーゲン断片として分子量の小さい反応種がごく微量に検出された。HUVECから回収された無血清馴化培地(CM)では、XL313に反応性を示す約20Kdの反応種が少量検出されたが、線維芽細胞から回収された馴化培地(CM)では有意な量の免疫反応性断片は検出されなかった。
RGDKGE(配列番号1)含有エピトープは、血管新生が誘導されたCAM組織において差次的に発現され、差次的に生体内分布していること、およびマクロファージの馴化培地においてこのエピトープが発現されることが示されたことから、可溶性かつ体内循環型のRGDKGE(配列番号1)含有エピトープが生成されうるかどうかを検討した。この可能性を調査するため、鶏胚にFGF-2および血清で刺激を与えるか、あるいは刺激を与えずに、3日後に回収した。図5Aに示したように、非刺激コントロール鶏胚の血清から、循環型のMab XL313免疫反応性エピトープが低レベルで検出された。これに対して、FGF-2で刺激した鶏胚では、2倍量の循環型XL313免疫反応性エピトープが検出された(p<0.05)。これらの知見から、このRGDKGE(配列番号1)含有コラーゲンエピトープの可溶性形態の放出には差があることが示された。
RGDKGE(配列番号1)含有エピトープの可溶性形態がインビボで検出されたことから、XL313エピトープを含む可溶性ペプチドが血管新生および炎症を積極的に制御するかどうかを検討した。この可能性を調査するため、鶏胚CAMの血管新生および炎症に対するRGDKGE(配列番号1)含有コラーゲンペプチドの効果を評価した。図5Bに示したように、RGDKGE(配列番号1)含有コラーゲンペプチドXL313(P-2)は、用量依存的に血管新生を増強し、CAM1個あたり100ngの用量において血管新生の誘導が最大となった。RGDKGE(配列番号1)を含むコラーゲンペプチドP-2でCAMを刺激することによって、非処理の場合と比べて血管新生が有意に誘導されたが、これに関連するRGDAPG(配列番号11)を含むコラーゲンペプチドP-1やペプチドコントロール(P-C)では血管新生は有意に誘導されなかった(p>0.05)(図5C)。
鶏胚漿尿膜(CAM)における血管新生および炎症は、P38MAPKなどのMAPキナーゼシグナル伝達の変化に関連していることが、過去の研究で報告されている(40,41)。RGDKGE(配列番号1)含有コラーゲンペプチドP-2による刺激によって誘導された血管新生を制御する機構を調査するため、処理を行っていない鶏胚またはRGDペプチドで処理した鶏胚からCAM組織を得て実験を行った。図6Aに示したように、RGDKGE(配列番号1)含有ペプチドP-2で処理したCAMから得た溶解物において、非処理CAMやRGDAPG(配列番号11)含有ペプチドP-1で処理したCAMよりも高レベルのリン酸化P38MAPKが検出された。CAM組織(N=12)におけるリン酸化P38MAPKを定量したところ、コントロールと比べて4倍高かった(p<0.05)(図6B)。これらの実験結果と一致して、活性化P38MAPKは鶏胚CAMの複数種の細胞で検出されたが、共染色分析では、vWf陽性血管においてリン酸化P38MAPKの発現が見られた(図6C)。
ECMタンパク質中のRGDアミノ酸モチーフが、複数のインテグリンによって認識されることは十分に立証されている。しかし、特徴的なRGDエピトープに対するインテグリンの結合能は、親分子内でのRGDエピトープの配向や、RGDモチーフに隣接するC末端アミノ酸配列によっても変わってくる(25〜27)。RGDKGE(配列番号1)含有コラーゲンペプチドP-2との相互作用を媒介していると見られる細胞表面受容体が同定された。抗インテグリン機能遮断抗体の存在下または非存在下において、RGDコラーゲンペプチドP-1およびP-2に対する内皮細胞の結合能を調査した。図7Aに示したように、抗β1特異的抗体は、ペプチドP-2へのHUVECの接着に対してごくわずかな効果しか示さなかったが、抗αvβ3抗体は、コントロールと比べて相互作用を約90%抑制した(p<0.05)。抗αvβ5抗体ではわずかな抑制効果が見られた。RGDAPG(配列番号11)配列を含むP-1でも同様の結果が観察された(図7B)。これらのデータから、αvβ3は、内皮細胞において、これらのRGD含有ペプチドの受容体として機能していることが示された。
上記2種のRGD含有ペプチドはいずれもαvβ3と結合するが、血管新生および炎症に対し異なる効果を発揮したことから、RGDペプチドの種類によって、αvβ3を介したシグナル伝達の変化に差が見られるかどうかを検討した。P-1またはP-2に内皮細胞を結合させ、β3インテグリンのリン酸化の相対量を調べた。図7Cに示したように、増殖因子の非存在下において、β3のリン酸化は、RGDKGE(配列番号1)ペプチドP-2と結合させたことによって、RGDAPG(配列番号11)ペプチドP-1を使用した場合と比べて3倍以上高くなった(p<0.05)。β3インテグリンにリガンドが結合したことによって、受容体のクラスタリングが誘導され、FakやSrcなどのプロテインキナーゼの活性化を含む下流のシグナル伝達事象が開始された。これを踏まえ、シグナル伝達の上流においてRGD含有コラーゲンペプチドとの物理的な相互作用が発生した後の、これらのプロテインキナーゼのリン酸化の差異を評価した。無血清条件においてP-1またはP-2と結合させたところ、ごくわずかな量のFakのリン酸化が検出された。これに対して、P-2と相互作用させた後のSrcのリン酸化は、P-1を使用した場合のほぼ2倍となった(図7D)。さらに、コラーゲンペプチドP-2と結合させた後、Src阻害薬を加えて内皮細胞をインキュベートしたところ、β3のリン酸化とP38MAPKのリン酸化が低下したことから(図7Eおよび図7F)、P-2を結合させた内皮細胞におけるβ3インテグリンおよびP38MAPKの活性化はSrcに依存することがわかった。SrcおよびP38MAPKの活性化は、アクチンの重合およびストレスファイバーの形成を促進することから(43〜45)、RGDコラーゲンペプチドを結合させた内皮細胞のアクチン細胞骨格を評価した。RGDKGE(配列番号1)コラーゲンペプチドP-2と相互作用させた内皮細胞では、RGDAPG(配列番号11)コラーゲンペプチドP-1と相互作用させた場合と比べて、アクチンストレスファイバーの形成が促進された(図7G)。以上の知見から、保存配列RGDKGE(配列番号1)を含むコラーゲンエピトープは、β3インテグリンに依存するメカノトランスダクション経路の開始を誘導する能力を持つことが示された。
上記実験の結果、RGD含有コラーゲンペプチドP-1およびP-2はいずれも、上流におけるβ3インテグリンを介した内皮細胞の接着相互作用を補助するが、コラーゲンペプチドP-2はβ3インテグリンのリン酸化を選択的に増強し、この結果、P38MAPKの活性化が増強され、アクチンストレスファイバーの形成が促進されることが示された。アクチンストレスファイバーの形成および機械的張力の増加によって、転写コアクチベーターであるYes-associated protein(YAP)が核内に再局在化される(46)。さらに、YAPは、血管新生の制御と内皮細胞の増殖の制御に関与している(47,48)。増殖因子による刺激を与えずに、先の実験で使用した特徴的なコラーゲンRGD含有ペプチドを内皮細胞に結合させ、YAPの局在を評価した。図8Aに示したように、コラーゲンペプチドP-2を内皮細胞に結合させて15分後にYAPを検出したところ、P-1を使用した場合よりも多くのYAPが核内に局在していた。このようなYAPの核局在の差は、これ以降の時間点では検出されなかった。この増強されたYAPの核内蓄積を確認するため、ウエスタンブロット分析を行った。図8Bに示したように、ペプチドP-2を結合させた内皮細胞における核内YAPの量は、ペプチドP-1を使用した場合の約2倍となった。
YAPの核内局在は、内皮細胞の増殖の制御に関与している。これを踏まえ、HUVECおよびHRMVECの増殖に対するRGD含有コラーゲンペプチドの効果を調査した。可溶性P-2を添加したことによって、内皮細胞の増殖が有意に(p<0.05)増強されたが、RGDAPG(配列番号11)ペプチドP-1で刺激してもごくわずかな効果しか示されなかった(図8Cおよび図8D)。P-2が、Src依存的にP-38MAPKの活性化を選択的に増強する能力を有していたことから、RGDKGE(配列番号1)ペプチドP-2による刺激を行い、YAPの核内蓄積を増強する能力がSrcに依存するのか、P38MAPKに依存するのか、あるいはこれらの両方に依存するのかを評価した。図8Eおよび図8Fに示したように、P-2で内皮細胞を刺激した後のYAPの核内蓄積は、Src阻害薬またはP38MAPK阻害薬で処理したことによって、コントロールと比べて約50%低下した。これらのデータから、RGDKGE(配列番号1)P-2で刺激したときのYAPの核内蓄積において、SrcおよびP38MAPKが介在していることが示された。
YAPは、様々な血管新生因子および炎症因子の発現を制御している。これを踏まえ、P-2の刺激による内皮細胞の増殖がYAPに依存しているかどうかを調査した。YAP特異的shRNAまたはYAP非特異的shRNAで内皮細胞の形質導入を行った。コントロール形質導入内皮細胞において、RGDKGE(配列番号1)を含む可溶性コラーゲンペプチドP-2を添加すると増殖が増強されたが(p<0.05)、この配列に関連するRGDAPG(配列番号11)を含むペプチドP-1を添加しても増殖は増強されなかった(図8G)。これに対して、YAPがノックダウンされた内皮細胞では、RGDKGE(配列番号1)ペプチドP-2を添加しても増殖は誘導されなかった(図8H)。YAPノックダウン細胞をVEGFまたは高濃度血清で刺激すると増殖が増強されたことから、YAPノックダウン細胞は増殖能を有していることが示された(図8I)。これらの知見から、RGDKGE(配列番号1)含有コラーゲンペプチドP-2が、ユニークなメカノシグナル伝達カスケードを開始させ、Src依存的経路においてP38MAPKを活性化し、これによってYAPの核内蓄積と内皮細胞の増殖の増強とを引き起こすという機構の存在が示された。
ヌードマウスにM21(αvβ3+)悪性黒色腫細胞またはML21(αvβ3−)悪性黒色腫細胞を注射して、処置前にあらかじめ腫瘍を樹立させた。腫瘍の切片を免疫蛍光染色し、免疫チェックポイント制御タンパク質PDL-1の発現を分析した(図10)。
インテグリンαvβ3を発現するM21悪性黒色腫細胞に、非特異的コントロールshRNA(M21 Cont)またはβ3特異的shRNA(M21β3Kd)をトランスフェクトした(図11)。ヌードマウスにM21 Cont(αvβ3+)悪性黒色腫細胞またはM21β3Kd(αvβ3−)悪性黒色腫細胞を注射して、処置前にあらかじめ腫瘍を樹立させた。腫瘍の切片を免疫蛍光染色し、免疫チェックポイント制御タンパク質PDL-1の発現を分析した。
マウスにB16F10悪性黒色腫細胞を注射し、処置を行う5日前にあらかじめ腫瘍を樹立させた(図9)。図9のデータは、1条件につき8匹のマウスを使用して得た14日目の平均腫瘍体積±SEを表す。
マウスに悪性黒色腫細胞を注射し、処置を行う5日前にあらかじめ腫瘍を樹立させた。RGDKGE(配列番号1)を含むαvβ3結合性コラーゲンエピトープを標的とする抗体を用いて、週3回、14日間にわたってマウスを処置した。腫瘍の切片を免疫蛍光染色し、免疫チェックポイント制御タンパク質PDL-1の発現を分析した(図12)。
マウスに悪性黒色腫細胞を注射し、処置を行う5日前にあらかじめ腫瘍を樹立させた。RGDKGE(配列番号1)を含むαvβ3結合性コラーゲンエピトープを標的とする抗体を用いて、週3回、14日間にわたってマウスを処置した(図13)。腫瘍の切片における免疫チェックポイント制御タンパク質PDL-1の発現を分析した。
インテグリンαvβ3発現悪性黒色腫細胞M21(図14A)、CCL-49細胞(図14B)および内皮細胞(HUVEC)(図14C)を、αvβ3非結合性リガンド(天然IV型コラーゲン)またはαvβ3結合性リガンド(変性IV型コラーゲン)でコーティングしたウェルに接着させた。全細胞溶解物を調製し、PDL-1の相対量またはローディングコントロールとしてのβ−アクチンの相対量を評価した。
コーティングしていないコントロールウェルまたは潜在性コラーゲンエピトープXL313(RGDKGE(配列番号1))を固相化したウェルに、インテグリンαvβ3発現悪性黒色腫細胞(M21)を播種した(図15)。インキュベーション後、細胞溶解物を調製し、PDL-1の相対量を評価した。
インテグリンαvβ3発現悪性黒色腫細胞(M21)を、コントロール非特異的抗体(正常マウスIg)またはαvβ3特異的抗体(Mab LM609)と混合し、αvβ3結合性リガンド(変性IV型コラーゲン)でコーティングしたウェルに加えた(図16)。24時間インキュベーションした後、全細胞溶解物を調製し、PDL-1の相対量またはローディングコントロールの相対量を評価した。
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本発明の詳細な説明とともに本発明について述べたが、上述の説明は本発明を例示することを目的として記載されたものであり、本発明の範囲を限定するものではなく、本発明は添付の請求項の範囲によって定義される。その他の態様、利点および変更も後述の請求項の範囲に含まれる。
Claims (35)
- 対象のがんを治療する方法であって、
がんであると診断された対象を特定すること;
免疫チェックポイント阻害薬を投与すること;および
コラーゲンのアンタゴニストまたはコラーゲン断片のアンタゴニストを投与すること
を含み、それによって、前記対象のがんを治療する方法。 - 前記免疫チェックポイント阻害薬が、CTLA-4阻害薬、PD-1阻害薬、PDL-1阻害薬、Lag3阻害薬、LAIR1阻害薬またはLAIR2阻害薬を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記PDL-1阻害薬がPDL-1抗体を含む、請求項1または2に記載の方法。
- 前記コラーゲンアンタゴニストまたはコラーゲン断片のアンタゴニストが、前記免疫チェックポイント阻害薬の抗腫瘍活性を増強する、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 皮膚炎、肺臓炎または大腸炎を含む炎症状態を抑制することをさらに含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記コラーゲンが、I型コラーゲン、II型コラーゲン、III型コラーゲンまたはIV型コラーゲンを含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記IV型コラーゲンアンタゴニストまたはIV型コラーゲン断片のアンタゴニストが、潜在性コラーゲンエピトープXL313のアンタゴニストを含む、請求項6に記載の方法。
- 前記アンタゴニストが、RGDKGE(配列番号1)を含む潜在性コラーゲンエピトープに結合する抗体を含む、請求項7に記載の方法。
- 前記抗体がモノクローナル抗体を含む、請求項8に記載の方法。
- 前記モノクローナル抗体がXL313モノクローナル抗体を含む、請求項9に記載の方法。
- 前記対象がヒトである、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 化学療法剤を投与することをさらに含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記がんが、悪性黒色腫、中枢神経系(CNS)癌、CNS胚細胞腫、肺癌、白血病、多発性骨髄腫、腎臓癌、悪性神経膠腫、髄芽腫、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、線維肉腫、膵臓癌、胃癌、頭頸部癌および結腸直腸癌を含む群から選択され;
がん細胞が固形癌に由来するものであってもよく、血液がんに由来するものであってもよく;
前記血液がんが白血病であってもよく、リンパ腫であってもよく;
前記白血病が、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、急性骨髄性白血病(AML)、慢性リンパ性白血病(CLL)、小リンパ球性リンパ腫(SLL)、慢性骨髄性白血病(CML)、急性単球性白血病(AMoL)のいずれであってもよく;
前記リンパ腫が、濾胞性リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫のいずれであってもよく;
前記ホジキンリンパ腫が、結節硬化型、混合細胞型、リンパ球豊富型、リンパ球減少型のいずれであってもよく;
前記がんが、悪性黒色腫(切除不能転移性悪性黒色腫であってもよい)、腎臓癌(腎細胞癌であってもよい)、前立腺癌(転移性去勢抵抗性前立腺癌であってもよい)、卵巣癌(上皮性卵巣癌であってもよく、転移性上皮性卵巣癌であってもよい)、乳癌(トリプルネガティブ乳癌であってもよい)、および/または肺癌(非小細胞肺癌であってもよい)を含む固形癌であってもよい、
前記請求項のいずれかに記載の方法。 - 前記免疫チェックポイント阻害薬が0.01〜10mg/kg体重の用量で投与され、前記コラーゲンアンタゴニストが、0.01〜25mg/kg体重の用量で投与される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記組成物を1時間に1回投与すること、または前記組成物を2週間に1回、4〜6週間にわたって投与することを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 対象の、異常な免疫抑制を特徴とする疾患を治療する方法であって、
異常な免疫抑制を特徴とする疾患であると診断された対象を特定すること;
免疫チェックポイント阻害薬を投与すること;および
インテグリンのアンタゴニストを投与すること
を含み、それによって、前記対象を治療する方法。 - 前記免疫チェックポイント阻害薬が、CTLA-4阻害薬、PD-1阻害薬、PDL-1阻害薬、Lag3阻害薬、LAIR1阻害薬またはLAIR2阻害薬を含む、請求項16に記載の方法。
- 前記免疫チェックポイント阻害薬が、CTLA-4抗体、PD-1抗体、PDL-1抗体、Lag3抗体、LAIR1抗体またはLAIR2抗体を含む、請求項16または17に記載の方法。
- 前記インテグリンがインテグリンαvβ3を含む、請求項18に記載の方法。
- 前記インテグリンαvβ3アンタゴニストが、RGDKGE(配列番号1)を含むαvβ3結合性コラーゲンエピトープを標的とする抗体を含む、請求項19に記載の方法。
- 前記対象がヒトである、請求項16〜20のいずれかに記載の方法。
- 化学療法剤を投与することをさらに含む、請求項16〜21のいずれかに記載の方法。
- 異常な免疫抑制を特徴とする前記疾患が、1型糖尿病、全身性エリテマトーデス、乾癬、強皮症、溶血性貧血、脈管炎、グレーブス病、関節リウマチ、多発性硬化症、橋本甲状腺炎、重症筋無力症および脈管炎を含む、請求項16〜22のいずれかに記載の方法。
- 前記免疫チェックポイント阻害薬が0.01〜10mg/kg体重の用量で投与され、前記インテグリンアンタゴニストが0.01〜25mg/kg体重の用量で投与される、請求項16〜23のいずれかに記載の方法。
- 前記組成物を1時間に1回投与すること、または前記組成物を2週間に1回、4〜6週間にわたって投与することを特徴とする、請求項16〜24のいずれかに記載の方法。
- 対象の、過剰な免疫反応を特徴とする疾患を治療する方法であって、
過剰な免疫反応を起こしていると診断された対象を特定すること;および
コラーゲンまたはその断片を含むペプチドを投与すること
を含み、それによって、前記対象の過剰な免疫反応を治療する方法。 - 前記過剰な免疫反応が自己免疫疾患を含む、請求項26に記載の方法。
- 前記コラーゲンが、I型コラーゲン、II型コラーゲン、III型コラーゲンまたはIV型コラーゲンを含む、請求項26または27に記載の方法。
- 前記ペプチドがRGDKGE(配列番号1)を含む、請求項26〜28のいずれかに記載の方法。
- 前記対象がヒトである、請求項26〜29のいずれかに記載の方法。
- 前記自己免疫疾患が、グレーブス病、橋本甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、1型糖尿病、多発性硬化症または関節リウマチを含む、請求項26〜30のいずれかに記載の方法。
- 対象の創傷を治癒する方法であって、
創傷を有する対象を特定すること;および
コラーゲンまたはその断片を含むペプチドを前記創傷に投与すること
を含み、それによって、前記対象の前記創傷を治癒する方法。 - 前記コラーゲンが、I型コラーゲン、II型コラーゲン、III型コラーゲンまたはIV型コラーゲンを含む、請求項32に記載の方法。
- 前記ペプチドがRGDKGE(配列番号1)を含む、請求項32または33に記載の方法。
- 前記対象がヒトである、請求項32〜34のいずれかに記載の方法。
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