JP5816220B2 - 癌細胞増殖抑制に用いられるリン脂質輸送タンパク質（ｐｌｓｃｒ）阻害方法 - Google Patents

Description

本発明は、癌細胞成長予防や抑制に適用されるリン脂質輸送タンパク質（ＰＬＳＣＲ）阻害剤とその組成物に関し、特に、そのＰＬＳＣＲタンパクが過剰発現される癌に適用されるものに関する。本発明のＰＬＳＣＲ−阻害剤は、細胞中のＰＬＳＣＲタンパクの含有量及び／或いは生理活性の化合物を低減する効果が得られ、例えば、限定的なモノクローナル抗体や拮抗薬及び核酸である。

癌は、人類の死亡や病気になる要因の一つである。癌治療の方法は、手術で腫瘍を切り取ることや化学療法などがある。上記らの治療方法は、成功的に、一部の癌患者を治療できるが、その一部の治療された患者には、癌再発現象があり、そのため、更に、治療を受けることが必要になる。
化学治療は、一般として、細胞（例えば、増殖細胞）に対して毒性を有する非選択性薬剤であり、このような薬剤は、有効に、癌細胞を殺すことができるが、健康細胞も殺し、そのため、有害の副作用が発生する。

一部の癌細胞は、所定の細胞組成が発現されるか、過剰に発現され、例えば、細胞表面タンパクが発現されるか、正常細胞の細胞組成と異なるように発現される。また、癌治療には、癌細胞を標的とする方法があり、例えば、発現された、或いは、過剰に癌細胞表面に発現されたタンパク質と結合できる抗体や抗体断片を利用する方法がある。既に、沢山の上記のような特異タンパクが、検証された。

上記のようなタンパク質において、リン脂質輸送タンパク質は、細胞膜の脂質二重層のリン脂質を、転座（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）させるタンパク質である。人類リン脂質輸送タンパク質（ＰＬＳＣＲ）は、ｈＰＬＳＣＲ１−ｈＰＬＳＣＲ４に名付けられた相同タンパク質家族から構成される。
スクランブラーゼ（Ｓｃｒａｍｂｌａｓｅｓ）は、一群の、知られた、フリッパーゼ（ｆｌｉｐｐａｓｅｓ）と称された膜透過脂質トランスポーター家族の一つである。リン脂質輸送タンパク質において、よく研究された一つは、リン脂質輸送タンパク質１（ＰＬＳＣＲ１；ＵｎｉＰｒｏｔ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｏ１５１６２）（タンパク質分子量が、３７ ｋＤａである）は、細胞膜リン脂質を、快速的にＣａ²⁺トランス二分子層再分配（ｔｒａｎｓｂｉｌａｙｅｒ ｒｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）させるものである。
最近、ＰＬＳＣＲ１の機能について、上記のリン脂質転置タンパクの機能の他に、ＰＬＳＣＲ１を信号分子とすることが、検証された。上記のように、ＰＬＳＣＲ１が、タンパク質リン酸化反応に関し、また、インターフェロンが他のサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ）と作用する時、遺伝子の発現が活性化される（ＳａｎｔｏｓｈやＫＳ等、Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ ４６２：１０３−１１４、２００７）。
ウイルス感染によるインターフェロン反応により、ＰＬＳＣＲ１が刺激されて発現量が高くなり、細胞免疫反応に関することを証明する。また、刺激されたＰＬＳＣＲ１の発現が、細胞核に分布し、そして、それが、ＩＰ３Ｒ１遺伝子の促進因子と結合して、その発現が誘発され、それにより、ＰＬＳＣＲ１タンパクが、細胞分化作用において、必要とする機能を持つことを証明できる。

組織マイクロアレイで、ＰＬＳＣＲ１が、多種類の腫瘍組織や正常組織においての発現を分析すると、ＰＬＳＣＲ１タンパクが、多い腫瘍組織において、例えば、膵臓腺細胞癌、甲状腺髄質癌、食道扁平細胞癌、食道腺細胞癌、結腸腺癌、子宮頚部扁平細胞癌、膀胱移行上皮癌及び正常肝臓や正常腎上体組織において、高度的な発現する（図７を参照する）。そのため、本発明は、ＰＬＳＣＲ１−阻害方法（例えば、抗体や拮抗薬及びｓｉＲＮＡ）を開発し、また、その癌細胞成長抑制の有効性を研究する。

本発明らは、上記欠点を解消するため、慎重に研究し、また、学理を活用して、有効に上記欠点を解消でき、設計が合理である本発明を提案する。

本発明は、前記の、ＰＬＳＣＲ１が、大腸直腸癌腫瘍組織において、高度な発現であること（Ｈａｎ、Ｃ．Ｌ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ＆Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．１０：１０．１０７４／ｍｃｐ．Ｍ１１０．００３０８７、１−１５、２０１１；Ｋｕｏ、Ｙ．Ｂ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．１７（１−２）：４１−４７、２０１１）と、最新の研究に見つけられたＰＬＳＣＲ−阻害方法（例えば、人類ＰＬＳＣＲに対抗するモノクローナル抗体）が、癌細胞増殖や悪性腫瘍形成（ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を抑制することに基づく。

本発明は、癌細胞成長を予防及び／或いは抑制するリン脂質輸送タンパク質（ＰＬＳＣＲ）阻害方法に関する。
本発明の具体的な実施形態によれば、上記方法に適用されるＰＬＳＣＲ−阻害剤により、ＰＬＳＣＲの生理活性が低減される。上記のような阻害剤には、ＰＬＳＣＲ−特異性配位子が含まれ、例えば、モノクローナル抗体や拮抗薬が含まれる。

本発明に係る具体的な実施形態によれば、上記のＰＬＳＣＲ−阻害剤は、全てのＰＬＳＣＲ家族タンパクやＰＬＳＣＲ変異型の活性を抑制できる。ＰＬＳＣＲタンパクの家族メンバーには、ＰＬＳＣＲ１やＰＬＳＣＲ２、ＰＬＳＣＲ３及びＰＬＳＣＲ４が含まれる。

本発明の抗−ＰＬＳＣＲ抗体は、人類ＰＬＳＣＲ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１アミノ酸シークエンスを有するポリペプチド）に対抗するモノクローナル抗体であっても良い。
他の具体的な実施形態によれば、上記モノクローナル抗体には、一部の人類ＰＬＳＣＲ１のアミノ酸１−１６０と、限定的に結合できる結合部位が含まれる。また、他の具体的な実施形態によれば、抗−ＰＬＳＣＲ１モノクローナル抗体には、一部の人類ＰＬＳＣＲ１のＣ−端と、限定的に結合できる結合部位が含まれる。

具体的な実施形態によれば、上記の抗−ＰＬＳＣＲ抗体は、ＤＫＱＮＳＱＭＮＡＳＨＰＥＴＮＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）やＦＥＴＮＮＫＹＥＩＫＮＳＦＧＱＲＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３）及びＴＧＳＱＥＱＫＳＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４）のペプチド類を、免疫原として、小鼠において、対応する抗体が得られる。

具体的な実施形態によれば、本発明は、ＰＬＳＣＲ−阻害剤で、癌細胞成長を予防及び／或いは抑制する方法により、癌細胞のＰＬＳＣＲの含有量も低減される。上記のＰＬＳＣＲタンパク含有量を低減することは、既知の方法により達成される。例えば、エンコードＰＬＳＣＲのヌクレオチドシークエンスのｓｉＲＮＡ（モルホリノの一つである）、或いは、リボザイム（ｒｉｂｏｚｙｍｅ）を、上記癌細胞を標的とさせる。

一方、本発明は、ＰＬＳＣＲ−阻害剤や医薬に使用可能の担体、希釈剤或いは賦形剤が含まれた医薬組成物が、供給される。

また、抗ＰＬＳＣＲ１に限定的な抗体から構成された医薬組成物で、その抗ＰＬＳＣＲ１に限定的な抗体の有効量範囲が、１ｍｇ／ｋｇ乃至１０ｍｇ／ｋｇにある。

本発明にも、毒性を、選択的に高発現量のＰＬＳＣＲの癌細胞を標的とする方法であり、それに、上記癌細胞を、有効量である本発明のＰＬＳＣＲ−阻害剤組成物に露出することが含まれる。“有効量”は、化合物で、有効に、癌の症状を、予防や低減或いは改善することや、或延長接受治療を受ける個体の生存期間が延長されるための用量を指し、本発明の有効量範囲は、１ｍｇ／ｋｇ乃至１０ｍｇ／ｋｇにある。

ある具体的な実施形態によれば、上記の癌細胞が、過度発現になったＰＬＳＣＲの細胞から選ばれたもので、例えば、乳癌細胞や肝癌細胞、大腸直腸癌細胞、膵臓癌細胞、食道癌細胞、膀胱癌細胞、卵巣癌細胞、皮膚癌細胞、胃癌細胞、前立腺癌細胞、肺癌細胞、腎細胞癌細胞、甲状腺癌細胞、腦腫瘍細胞、黒色腫、肉腫、白血病、骨肉腫細胞及び子宮内膜癌細胞である。

ある具体的な実施形態によれば、本発明に係る方法は、更に、癌細胞を、少なくとも一つの抗癌剤（ａｎｔｉ−ｃａｎｃｅｒ ａｇｅｎｔ）や抗ウイルス剤（ａｎｔｉｖｉｒａｌ ａｇｅｎｔ）、消炎剤（ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ａｇｅｎｔ）及び免疫阻害剤（ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ ａｇｅｎｔ）の格別治療剤に露出させることが含まれる。

本発明は、必要とする個体内の癌細胞成長抑制や癌予防の方法を供給し、治療有効量の本発明のＰＬＳＣＲ−阻害剤を、上記個体に投薬することが含まれる。ある具体的な実施形態によれば、本発明のＰＬＳＣＲ−阻害剤は、毒性を、選択的に、高発現量を有するＰＬＳＣＲの癌細胞を標的とさせる。

ある具体的な実施形態によれば、上記の癌は、乳癌や肝癌、大腸直腸癌、膵臓癌、食道癌、膀胱癌、卵巣癌、皮膚癌、胃癌、前立腺癌、肺癌、腎細胞癌、甲状腺癌、脳腫瘍、黒色腫、肉腫、白血病、骨肉腫及び子宮内膜癌から選ばれた一つである。

ある具体的な実施形態によれば、投薬したＰＬＳＣＲ−阻害剤は、脱リン酸化反応により、ＳｒｃやＳｈｃ或いはＥｒｋｓの活性が低減されて癌が抑制される。また、ＰＬＳＣＲ−阻害剤は、サイクリンＤ１の発現を低減することにより、癌細胞を抑制する。
また、ＰＬＳＣＲ−阻害剤は、脱リン酸化反応により、腫瘍抑制因子のｐＲｂタンパク（ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ ｐｒｏｔｅｉｎ）を活性化させて、癌細胞を抑制する。

本発明の他の特徴や利点は、下記の実施例の詳細説明や図式により、分かるが、上記らの実施例は、ただ、補助説明するためのもので、本発明の範囲は、それによって制限されることがない。

以下、図面を参照しながら、本発明の特徴や技術内容について、詳しく説明するが、それらの図面等は、参考や説明のためであり、本発明は、それによって制限されることが無い。

抗−ＰＬＳＣＲ１抗体により、ＨＴ２９大腸直腸癌細胞系の増殖能が圧制されることを示す図。（Ａ）は、ＨＴ２９細胞が、抗−ＰＬＳＣＲ１抗体によって処理された時と処理されない時の成長曲線の比較で、結果によれば、抗ＰＬＳＣＲ１のＮ−端やＣ−端に対して、抗原表位の抗−ＰＬＳＣＲ１抗体で処理したＨＴ２９細胞系の成長が抑制される。（Ｂ）は、ＨＴ２９細胞の増殖能は、容量依存性型式で、抗ＰＬＳＣＲ１のＮ−端やＣ−端に対して抗原表位の抗−ＰＬＳＣＲ１抗体で処理されることにより、抑制される。（Ｃ）は、ＨＴ２９細胞系が、抗−ＰＬＳＣＲ１抗体によって処理された時と非アンカー関連の細胞群体形成能の比較である。 抗−ＰＬＳＣＲ１抗体が、ＨＴ２９細胞とＨＣＴ１１６細胞移動能に対する影響を示す図。移動分析結果によれば、上記に種類の細胞が、抗−ＰＬＳＣＲ１によって処理された後の移動能で、ＰＢＳやＩｇＧによって処理されたものに比較すると、その細胞の移行能力が、抑制される。 抗−ＰＬＳＣＲ１抗体が、ＨＣＴ１１６の侵入能に対する影響を示す図。ＨＴ２９とＨＣＴ１１６細胞の侵入分析を検視する。細胞がろ過膜の下方に侵入した時の代表顕微写真（上図）とＨＣＴ１１６細胞の侵入試驗定量分析結果（下図）である。各バー図は、三組の独自実験計算による平均値±ＳＤである。 正常の血清と抗−ＰＬＳＣＲ１抗体を注入して、同時に、ＨＴ２９細胞を処理し、補体−依頼性細胞毒性を評価する結果を示す図。細胞に対して、抗−ＰＬＳＣＲ１抗体と補体を含有する正常血清とで、処理する時、正常血清により派生された補体により、細胞生存抑制作用が強化される。 ＰＬＳＣＲ１タンパクと抗−ＰＬＳＣＲ１抗体との結合が組換えられることにより、抗−ＰＬＳＣＲ１抗体の細胞増殖の抑制特性を低減できることを示す図。 各組の小鼠の実験７日目と３０日目の図。抗−ＰＬＳＣＲ１抗体が、生体内悪性腫瘍形成を抑制できる。 アイソタイプＩｇＧや抗−ＰＬＳＣＲ１抗体によって処理された小鼠から採集した腫瘍の図。 アイソタイプＩｇＧや抗−ＰＬＳＣＲ１抗体によって処理された小鼠の腫瘍成長曲線を示す図。 アイソタイプＩｇＧや抗−ＰＬＳＣＲ１抗体によって処理された小鼠の最終平均腫瘍重量を示す図。 市販のバイオメックス（Ｂｉｏｍａｘ）の、免疫組織化学分析ＰＬＳＣＲ１における、多種類の正常と腫瘍組織においての発現を示す図。 ＰＬＳＣＲ１タンパクが、甲状腺髄質癌や結腸腺癌及び膀胱移行上皮癌に高度に、発現されることを表す図。ＰＬＳＣＲ１は、正常の腎上体組織や正常の肝臓組織、膵臓腺細胞癌、食道腺細胞癌、直腸腺細胞癌及び子宮頚部扁平細胞癌の多種類の組織において、低い量で発現されることが分かる。 ＰＬＳＣＲ１タンパクの大腸や膀胱、直腸及び子宮頚部鱗状細胞組織の代表性実例の相対発現量を示す図（１）。 ＰＬＳＣＲ１タンパクの大腸や膀胱、直腸及び子宮頚部鱗状細胞組織の代表性実例の相対発現量を示す図（２）。 大腸直腸組織において、サンプルのＰＬＳＣＲ１やＳｈｃ、Ｓｒｃ、Ｅｒｋ、Ｒａｓ及びサイクリンＤ１に対するウエスタンプロット分析結果を示す図。対応ｔ検定（ｐ＜０．０５）で、腫瘍と正常組織の符合標本の各タンパクの発現差異を評価する。 各点が各組織のタンパクの発現量を示す図。標示された横線は、全ての点の平均値である。 ＨＴ２９細胞系の抗−ＰＬＳＣＲ１は、Ｒｂタンパクの再活性化を抑制することにより、細胞増殖を抑制することを示す図。（Ａ）は、抗−ＰＬＳＣＲ１がサイクリンＤ１を抑制する発現である。（Ｂ）は、抗−ＰＬＳＣＲ１処理により、ＨＴ２９細胞のＳｒｃやＳｈｃ、ＥｒｋとＲｂのリン酸化反応が低減される。 ＰＢＳやアイソタイプ抗体と抗−ＰＬＳＣＲ１抗体によって処理された時の細胞成長曲線を表す図。抗−ＰＬＳＣＲ１抗体は、異なる人類癌細胞系の細胞増殖を抑制できる。ＨＴ２９大腸直腸癌細胞やＣＧ１甲状腺癌細胞、ＯＥＣ−Ｍ１口腔癌細胞、ＡＧＳ胃癌細胞、ＭＧＨ−Ｕ１膀胱癌細胞、Ａ５４９肺癌細胞及びＨｅＬａ子宮頚部癌細胞の細胞系において、成長抑制効果が明白である。 ウエスタンプロット分析法で、異なる細胞のＰＬＳＣＲ１タンパク発現を測定した図。アクチンが、照合組とされる。ウエスタンプロット実験の定量結果によれば、アクチンを添加するサンプル量の標準とし、ＰＬＳＣＲ１を数値正常化する。柱状図と誤差線段は、正常化された後のＰＬＳＣＲ１の数値の３組の独自実験において、計算による平均値±ＳＤである。 抗−ＰＬＳＣＲ１抗体が、人類周辺血液リンパ単球（ＰＢＭＣ）と赤血球（ＲＢＣ）の結合分析結果図。濃度が１０μｇ／ｍＬである抗−ＰＬＳＣＲ１抗体や陽性照合組の第一類ＨＬＡ抗体が、ＰＢＭＣ細胞と反応する。更に、下位抗体のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８山羊抗−小鼠ＩｇＧが添加される。フローサイトメトリー計により、異なる処理条件下で、細胞の蛍光信号を分析する。破線下面積は、単独に下位抗体（左図、陰性照合組）や抗−ＰＬＳＣＲ１（中央図）を使用して、抗−第一類ＨＬＡ抗体（右図）と反応する時のＰＢＭＣである。上記の分析は、異なる個体のサンプルからの分析結果である。 図１１Ａのフローサイトメトリーで、５や１０及び２０ μｇ／ｍＬの抗−ＰＬＳＣＲ１抗体によって処理されたＰＢＭＣを評価した図。 濃度が１０μｇ／ｍＬである抗−人類ＣＤ４７ 抗体（陽性照合組）や抗−ＰＬＳＣＲ１抗体により処理されたＲＢＣｓの蛍光測定結果を示す図。 ５や１０及び２０μｇ／ｍＬの抗−ＰＬＳＣＲ１抗体により処理されたＲＢＣｓの蛍光測定結果を示す図。

本発明は、癌細胞成長を抑制するリン脂質輸送タンパク質（ＰＬＳＣＲ）に適用できる阻害方法である。

本発明に使用された“薬剤（ａｇｅｎｔ）”は、ある化合物や化合物の混合物、高分子（例えば、核酸や抗体、タンパク質或いはその一部、例えば、ペプチド類である）、或いは、細菌や植物、真菌或いは動物（特に、哺乳動物）細胞や組織等の生物材料から作製された萃取物を指す。このような薬剤は、その活性が、個体中において、局部や全身に作用する“治療剤（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｇｅｎｔ）”とすることに適合し、生物や生理或いは薬理学上において、活性を有する物質である。

“ＰＬＳＣＲ−阻害剤”は、ＰＬＳＣＲタンパク質の含有量を低減でき、及び／或いはＰＬＳＣＲタンパク質の少なくとも一つの活性を低減できる化合物を指す。明示された具体的な実施形態によれば、上記のＰＬＳＣＲ−阻害性化合物により、ＰＬＳＣＲタンパク質の少なくとも一つの生理活性が、少なくとも、約１０％や２５％、５０％、７５％或いは１００％低減される。

ある具体的な実施形態によれば、ＰＬＳＣＲ機能を調節できる化合物を利用して、病気や不快適症状を低減や予防或いは治療する方法で、それにも、ＰＬＳＣＲ（或いはその同系物）のタンパク質含有量を低減できるものが含まれる。ＰＬＳＣＲタンパク質含有量の低減には、既知の方法によって実現されてもよい。
例えば、上記細胞において、ＰＬＳＣＲのｓｉＲＮＡ（一種類のモルホリノ）やリボザイム（ｒｉｂｏｚｙｍｅ）を標的とするか、それを、上記細胞に染め付ける。また、機能領域に活性を有しないＰＬＳＣＲ突変型を使用してもよく、例えば、リン酸化反応を行わない突変型である。
或いは、転写作用を抑制できる試薬を使用しても良い。ＰＬＳＣＲタンパク質濃度を調節する方法には、エンコードＰＬＳＣＲの遺伝子転写作用を調節する方法や対応するｍＲＮＡを非安定化させる方法及び他の既知の方法が含まれる。

用語“予防”や“治療”は、上記技術と同じで、宿主に対して投薬することである。また、その臨床において、希望しない病症（例えば、宿主の病気や他の希望しない状態）の前に、投薬すれば、上記の治療が予防性であり、即ち、上記希望しない病症にならないように、宿主を保護し、逆に、臨床において、上記希望しない病症になってから、投薬し始めると、上記治療が、治療性（即ち、一意に、既存の希望しない病症やそれによる副作用を低減や改善或いは維持する）である。

本発明は、癌細胞成長を抑制するために利用されて、リン脂質輸送タンパク質（ＰＬＳＣＲ）と結合する抗体である。用語“抗体”は、本明細書において、広く定義されて使用され、特に、全長モノクローナル抗体や多株抗体、多重特異性抗体（例えば、双特異性抗体）及び抗体断片であり、希望する生理活性を有するものである。抗体製造に関する技術は、例えば、Ｈａｒｌｏｗらの抗体：実験室手引き、冷泉港実験室出版、冷泉港、Ｎ．Ｙ．（１９８８）を参照できる。

本明細書において、用語“抗体”は、免疫グロブリン分子や所定の抗原と限定的な結合能力を有する免疫グロブリン分子断片を指す。“抗体断片”は、全長抗体の一部を含み、その抗原結合領域や可変領域であることが多い。
抗体断片の実例は、ＦａｂやＦａｂ’、Ｆ（ａｂ）₂、Ｆ（ａｂ’）₂、Ｆ（ａｂ）₃、Ｆｖ（代表として、抗体単腕のＶＬとＶＨ機能領域）、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｄｓＦｖ、Ｆｄ断片（代表として、ＶＨとＣＨ１機能領域）及びｄＡｂ（代表として、ＶＨ機能領域）断片や、ＶＨ、ＶＬとＶｈＨ機能領域、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｉｅｓ）、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、トリボディ（ｔｒｉａｂｏｄｉｅｓ）、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｉｅｓ）及びｋａｐｐａ抗体断片（例えば、Ｉｌｌら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ １９９７；１０：９４９−５７）、駱駝ＩｇＧ（ｃａｍｅｌ ＩｇＧ）、ＩｇＮＡＲ及び、抗体断片と、一つや多種類の経単離ＣＤＲｓや機能性抗原と互いに補完することにより形成された多重特異性抗体断片で、経単離ＣＤＲｓや抗原結合残基やポリペプチドを、一緒になるように吸着や連鎖させて、機能性抗体断片が形成される。

本発明の具体的な実施形態によれば、ＰＬＳＣＲ−阻害方法は、ＰＬＳＣＲ１のポリペプチドシークエンス（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）と結合できるモノクローナル抗体や修正された後、依然として、限定的な結合特性を有する抗体或いはその抗体断片である。ある具体的な実施形態によれば、ＰＬＳＣＲ−阻害方法は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のペプチド類と限定的に結合できるモノクローナル抗体や修正された後、依然として、限定的な結合特性を有する抗体或いはその抗体断片である。
他の具体的な実施形態によれば、ＰＬＳＣＲ−阻害方法は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のペプチド類と限定的に結合できるモノクローナル抗体や修正された後、依然として、限定的な結合特性を有する抗体或いはその抗体断片である。更に他の具体的な実施形態によれば、ＰＬＳＣＲ−阻害方法は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のペプチド類と限定的に結合できるモノクローナル抗体や修正された後、限定的な結合特性を有する抗体或いはその抗体断片である。

本発明のある具体的な実施形態によれば、モノクローナル抗体は、ヒト化抗体の一つである。

一方、本発明に係る医薬組成物は、前記のＰＬＳＣＲ阻害剤や医薬として使用可能の担体が備えられる。また、抗ＰＬＳＣＲに限定的な抗体から構成される医薬組成物で、そのＰＬＳＣＲ阻害剤の有効量が、１ｍｇ／ｋｇ乃至１０ｍｇ／ｋｇの範囲にある。

ＰＬＳＣＲ−阻害剤は、各種類の投薬に調製でき、全身や局部或いは区域性投薬が含まれる。技術や調製物について、レミントン製薬科学、（Ｍｅａｄｅ出版会社、イーストン、ＰＡ、米国）を参照する。腸管を経由して投薬しない場合、注射の方が良く、例えば、筋肉内や静脈内、腹膜内及び皮下である。
注射する場合、化合物を液態溶液に調製し、好ましいのは、生理学に使用可能の緩衝液に調製し、例えば、ハンク（Ｈａｎｋ’ｓ）溶液やリンゲル（Ｒｉｎｇｅｒ’ｓ）溶液に調製する。また、化合物を固体に調製してもよいが、使用する前に、再溶解や懸濁させればよい。また、冷凍乾燥形式も含まれる。

また、一方、本発明は、必要とする個体内の癌細胞成長抑制や癌予防の方法を提供する。上記の方法は、有効量の本発明に係るＰＬＳＣＲ−阻害剤組成物を、独自に、或いは格別の療法、例えば、放射線療法や化学療法或いは免疫調節療法と組み合わせて上記個体に対して投薬することもできる。

本発明に使用される医薬組成物は、従来の方法で、一つや多種類の活性化合物を加工して、生理に引く受けられる担体（賦形剤や補助剤）を使用して、製薬に利用可能の薬剤に調製されてもよい。投薬経路により、適当な調製物が決められる。

注射投薬の場合、本発明に係る組成物を、水溶液に調製し、好ましいのは、生理学に互換可能の緩衝液に調製し、例えば、ハンク（Ｈａｎｋ’ｓ）溶液やリンゲル（Ｒｉｎｇｅｒ’ｓ）溶液或いはノーマルセーライン緩衝液に調製する。黏膜を経由して投薬する場合、上記調合物に、浸透するための浸透剤を添加できる。上記のような浸透剤は、既知のものでよい。

口服で投薬する場合、活性化合物と医薬使用可能の担体と混合して、上記の組成物を調製できる。上記のような担体は、本発明の組成物を、患者が、口服する錠剤や丸剤、菱形錠剤、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、泥状物、懸濁液等の形式に調製できる。

また、固体賦形剤を利用して口服の医薬製剤に作製でき、必要に応じて、他の適当な補助剤を添加した後、得られた混合物を研磨し、また、粒状混合物を加工処理して、錠剤や糖衣錠剤コアが得られる。
使用された賦形剤は、（特に）充填剤は、例えば、乳糖や蔗糖、マンニトール或いはソルビトールである糖質や、セルロース製剤、コーンスターチや小麦澱粉、米澱粉及び馬鈴薯澱粉である粘着剤及び、ゲラチンやトラガント、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム及び／或いはポリビニルピロリドン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ−ｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ；ＰＶＰ）である他の材料である。
必要とすれば、拡散剤を添加でき、例えば、架橋結合ポリビニルピロリドン（ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｄ ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ ｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ）や寒天或いはアルギン酸（ａｌｇｉｎｉｃ ａｃｉｄ）である。また、例えば、アルギン酸ナトリウム等の塩

下記の実施例は、ただ、説明のためであり、本発明は、それによって制限されることがない。余計に実験しなくても、上記技術の熟練者であれば、本明細書の記述によれば、本発明を最大に利用できるはずである。また、本文に引用された公開文献は、本明細書において、参考として、完全な内容が含まれる。また、下記の何れかの作用メカニズムにより、本発明の請求範囲が制限されることがない。

＜実施例＞
＜実施例一：抗−ＰＬＳＣＲ１モノクローナル抗体の準備＞
＜人類ＰＬＳＣＲ１−特異性モノクローナル抗体を生成＞
人類ＰＬＳＣＲ１（ＵｎｉＰｒｏｔ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｏ１５１６２）の残基２−１７に相当するペプチドＤＫＱＮＳＱＭＮＡＳＨＰＥＴＮＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）を使用して、小鼠において、抗ＰＬＳＣＲ１抗体を作製する。上記ペプチドは、Ｙａｏ−Ｈｏｎｇ生物科技有限会社（新北市、台湾、Ｒ．Ｏ．Ｃ．）によって合成される。前記のプロセス（Ｙｕ、Ｊ．Ｓ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３３４：１２１-１３１、１９９８）に従って、抗−ＰＬＳＣＲ１モノクローナル抗体を作製して親和性純化を行う。
即ち、４００μｇペプチドを、完全なフロインドアジュバント（Ｗａｋｏ化学会社）において、乳化させ、得られた乳液を、小鼠（ＢＡＬＢ／ｃＪ）に対して、皮下注射を行う。そして、二週間置きに、２００μｇを、不完全なフロインドアジュバントにあるペプチドに乳化させ、三回注射を追加する。上記のペプチド免疫された小鼠の赤血球を有しない脾臓細胞と骨髄腫細胞（Ｆｏ細胞系、Ｓｐ２／ｏ−Ａｇ１４）とを融合させる。
融合させた後、細胞を、ＨＡＴ（ヒポキサンチン（Ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ）やアミノプテリン（Ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎ）及びチミジン（Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ））の培地に懸濁させる。懸濁細胞を９６−穴組織培養浅皿に移入させる。約１０日の後、抗体が存在する槽穴を選別する。限界希釈（ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）により、希望する抗体を分泌できるハイブリドーマ純株を用意して、２４−穴培養浅皿において、増殖させる。７−９日後、純株のある槽穴を選別する。その後、選別した純株を、再び、選別増殖させる。二回選別増殖の段階の後において、高力価の抗体を分泌可能の細胞株を、液体窒素で冷凍させ、大量に、抗体を含有する細胞培養物上清液を作製する。

従来のハイブリドーマ技術で、抗−人類ＰＬＳＣＲ１モノクローナル抗体 （Ｎ−端）（ＰＮ１）を分離する。モノクローナル抗体アイソ タイピングキット（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ Ｋｉｔ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）で、ＰＮ１抗体のアイソタイプ（ｉｓｏｔｙｐｅ）を測定する。結果として、テスト抗体は、亜基準標本ＩｇＧ₁に属する。

＜実施例二：抗−ＰＬＳＣＲ１モノクローナル抗体で、癌細胞の増殖や悪性腫瘍の形成を抑制する＞
＜細胞培養と成長分析＞
大腸直腸癌細胞（ＨＴ２９やＨＣＴ１１６及びＣｏｌｏ２０５）や甲状腺癌細胞（ＣＧ１）、口腔癌細胞（ＯＥＣ−Ｍ１）、胃癌細胞（ＡＧＳ）、膀胱癌細胞（ＭＧＨ−Ｕ１）、肺癌細胞（Ａ５４９）及び子宮頚部癌細胞（ＨｅＬａ）等の細胞系を、３７℃、５％ ＣＯ₂培養箱に保持し、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）と抗生物質が補充された培地において、培養させる。
癌細胞成長抑制の実験では、細胞に対して、抗ＰＬＳＣＲ１モノクローナル抗体で処理する前の日に、皿分配を行い、各皿にあるそれぞれの槽穴に、固定の細胞数がある。成長曲線を観察するために、異なる細胞系について、各穴に１ｘ１０³個細胞の密度で、９６−穴組織培養浅皿にセットし、また、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を添加して、現れた色変化により、細胞数が評価される。

＜抗体と試薬＞
小鼠抗−人類ＰＬＳＣＲ１モノクローナル抗体（Ｎ−端）（ＩＥ９）は、ＬｉｆｅＳｐａｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ（ＬＳ−Ｃ３９０２５、シアトル、ＷＡ）から手にした。小鼠ＩｇＧは、Ｊａｃｋｓｏｎ免疫研究実験室有限会社（台北、台湾、Ｒ．Ｏ．Ｃ．）から購入した。第一類ＨＬＡ抗体（Ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ Ｃｌａｓｓ Ｉ）（Ｗ６／３２）は、ＮＯＶＵＳ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬＳ（ＣＯ、ＵＳＡ）から購入した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ(登録商標)４８８山羊抗−小鼠ＩｇＧは、台湾Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ有限会社（台湾）から購入した。

＜細胞増殖分析＞
細胞増殖は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を利用して評価する。上記テストは、活細胞の糸粒体の脱水素酵素が、ＭＴＴ試薬を、可溶性青色ホルマザン（ｆｏｒｍａｚａｎ）染料に変換可能であることに基づく。
細胞を、各穴に、１ｘ１０³個細胞の密度で、９６−穴組織培養浅皿にセットし、また、指定された時間間隔で、抗体を処理する。使用された抗−人類ＰＬＳＣＲ１モノクローナル抗体の最終濃度は、０や０．６５、１、２．５、５、７．５及び１０μｇ／ｍＬである。各培養が終了された時、各穴の培地を、２０μｌ ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ試薬を含有する新規の培地に取替え、また、培養浅皿を、１時間に放置する。その後、ＥＬＩＳＡ ＲＥＡＤＥＲ（Ｆｕｓｉｏｎ、Ｐａｃｋａｒｄ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ会社、ＣＴ）で、４９０ｎｍ下の吸光度を測定して、相対的な細胞数が評価される。

＜非アンカー（Ａｎｃｈｏｒａｇｅ）関連の転形分析＞
６−穴培養浅皿で、細胞培養を行い、その方法は、細胞（６０００個細胞／穴）を、１ｍＬに１０％ ＦＢＳが含有された０．５％寒天（ａｇａｒ）に懸濁させ、また、抗−ＰＬＳＣＲ１モノクローナル抗体（２０μｇ／ｍＬ、ＬＳ−Ｃ３９０２５、ＬｉｆｅＳｐａｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）を添加して、１ｍＬに１０％ＦＢＳが含有された０．３５％寒天（ａｇａｒｏｓｅ）を被覆する。
その培養浅皿を、３７℃、５％ ＣＯ₂培養箱に１４日に保持する。その期間において、培養浅皿の細胞を、週に二回、細胞培地に対して供給する。観察する時点で、６−穴培養浅皿に対して、０．５ｍＬの０．００５％クリスタルバイオレットで、１時間以上に、色染めさせる。解剖顕微鏡で、細胞群体を検査する。

＜傷口癒合分析＞
メーカーの操作プロセス（ｉｂｉｄｉ、Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ、ドイツ）に基づいて、傷口癒合分析を行う。簡略に、培養挿入中隔（ｉｂｉｄｉ）を、６−穴培養浅皿の穴に設置する。３．５ｘ１０⁴個ＨＴ２９やＨＣＴ１１６大腸直腸癌細胞を、培養挿入中隔の各穴にセットし、３７℃、５％ ＣＯ₂下において、２４時間、培養する。細胞が付着した後、ピンセットで、気をつけて培養挿入中隔を取り出し、約５００μｍの無細胞隙間が形成される。
上記の細胞を、牛胎児血清を含有する培地で培養させ、また、抗−ＰＬＳＣＲ１モノクローナル抗体（２０μｇ／ｍＬ）で処理する。倒立顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ ＥＣＬＩＰＳＥ(登録商標) ＴＳ１００、Ｎｉｋｏｎ計器有限会社、 Ｍｅｌｖｉｌｌｅ、ＮＹ）で、細胞培養浅皿において、同じ位置にある細胞隙間のイメージを撮影する。
［ｈｔｔｐｓ：／／ｍｙｗｉｍ．ｗｉｍａｓｉｓ．ｃｏｍ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ？ｐａｇｅ＝Ｌａｕｎｃｈ＆ｓｅｌｅｃｔ＝Ｗｏｕｎｄ＿Ｈｅａｌｉｎｇ＆ｇｒ＝ｉｂｉｄｉ］であるＷｅｂアドレスのＷｉｍａｓｉｓイメージ分析平台（ミュンヘン、ドイツ）にて、各時点の細胞被覆面積を定量化させる。

＜Ｍａｔｒｉｇｅｌ侵入分析＞
細胞侵入作用分析は、ＱＣＭ ＥＣＭａｔｒｉｘ細胞侵入分析（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）により、穴径８μＭのポリカーボネート膜と一層の人工的なベース膜基質を有して、分析する。３００μＬの血清無しの培地に懸濁した細胞（３ｘ１０⁵）を、慎重に前記装置の上層空間に移転し、下層空間に、５００μＬの１０％牛胎児血清が含有されて誘引剤とする培地が充填され、装置を、３７℃、湿潤の５％ ＣＯ₂空気に４８時間放置する。
４８時間培養された後、綿棒で、侵入していない細胞を、上層空間から除去する。ポリカーボネート膜を経由して下表面まで侵入した細胞を固定し、クリスタルバイオレットで色染め、その後、顕微鏡で観察し、ランダムに、５箇所を選択して顕微鏡視野で、細胞数を計上する。

図１のように、抗−ＰＬＳＣＲ１抗体無しで処理すると、ＨＴ２９細胞系の成長が、速く、また、異なる抗体剤量でＨＴ２９細胞を処理すると、細胞の増殖能が、抗体の剤量とともに、高くなり、抑制現象が、より明白的になる。非アンカー（Ａｎｃｈｏｒａｇｅ）関連の転形分析において、得たデータによると、ＨＴ２９細胞によって形成された群体が、抗−ＰＬＳＣＲ１抗体によって処理されたＨＴ２９細胞により形成された群体より、遥かに大きく、ＨＴ２９細胞の、非アンカー（Ａｎｃｈｏｒａｇｅ）に関連する群体形成能が、抗−ＰＬＳＣＲ１抗体によって抑制される。上記の結果から分かるように、抗−ＰＬＳＣＲ１−阻害剤が、生体外悪性細胞の転形を強く圧制できる。

傷口癒合分析結果によれば、上記の二つの抗−ＰＬＳＣＲ１モノクローナル抗体によって処理された大腸直腸癌細胞は、ＰＢＳやアイソタイプＩｇＧによって処理された細胞よりも、上記細胞移行能（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）が抑制される（図２）。

細胞遊走侵入分析（Ｔｒａｎｓ−ｗｅｌｌ ｉｎｖａｓｉｏｎ ａｓｓａｙ）によれば、抗−ＰＬＳＣＲ１モノクローナル抗体によって処理されたＨＣＴ１１６大腸直腸癌細胞（Ｄｕｋｅｓ第Ｄ期患者から派生されたもの）は、ＰＢＳやアイソタイプＩｇＧによって処理された細胞よりも、その侵入能が厳重に失い（図３）、抗−ＰＬＳＣＲ１抗体によって処理された細胞の侵入能が、５５％までに低減される。

図４の結果によれば、抗−ＰＬＳＣＲ１抗体を添加すると、補体仲介と非補体仲介のメカニズムが形成され、ともに、ＨＴ２９細胞の増殖能が低減される。図５のように、ＨＴ２９大腸直腸癌細胞において、抗−ＰＬＳＣＲ１抗体の活性を遮断すれば、抗体の細胞生長の抑制特性が低減される。

＜実施例三：抗−ＰＬＳＣＲ１抗体で、生体内悪性腫瘍形成を抑制可能＞
＜異種間移植腫瘍細胞＞
胸腺が除去されたＢａｌｂ／ｃヌード小鼠（ＮＵ／ＮＵ小鼠、雌性、５−週齢）は、台湾のＢｉｏＬＡＳＣＯ会社（宜蘭、台湾）から購入したものである。ＨＴ２９細胞（２ｘ１０⁶を２００μＬリン酸塩緩衝食塩水に懸濁させる）を、胸腺が除去されたＢａｌｂ／ｃヌード小鼠の背部左側に、皮下注射して、その腫瘍成長を監視する。腫瘍の長さ（ｌ）や幅（ｗ）及び高さ（ｈ）を利用して、下記の式で、腫瘍体積（Ｖ）：Ｖ＝０．５２（ｌ ｘ ｗ ｘ ｈ）を推算する（Ｔｏｍａｙｋｏ ＭＭ、Ｒｅｙｎｏｌｄｓ ＣＰ．、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ２４：１４８-１５４、１９８９）。

腫瘍細胞が、移植された後の七日目（この時、腫瘍小結を触ることができる）において、各処理をし始める。全部の小鼠を、ランダムに、三組（各組に３−４匹の小鼠）に分け、抗−ＰＬＳＣＲ１モノクローナル抗体（２０μｇ／剤量）を投薬し、照合組に対してＩｇＧ（２０μｇ／剤量）やＰＢＳを投薬し、二日に一回投薬になり、それぞれ、体積が２００μＬで、合計、三回投薬を行う。
実験の小鼠に対して、腫瘍小結の近くに注射治療を行う。小鼠を、接種した後の３０日目までに監視し、この時、小鼠を犠牲する。腫瘍を切り出して重量を測る。すべての動物実験は、ともに、長庚大学実験動物照護と使用委員会（ＩＡＣＵＣ）の認可プロセス下で行い、また、上記委員会により認可された動物実験は、中華民国行政院農業委員会によって公開された実験動物設備と養護規範の条例に基づくものである。

図６は、アイソタイプＩｇＧによって処理され、や抗−ＰＬＳＣＲ１モノクローナル抗体によって処理された小鼠の腫瘍成長曲線と最終平均腫瘍重量である。抗−ＰＬＳＣＲ１モノクローナル抗体によって処理された小鼠の腫瘍は、明白に縮小した。

＜実施例四：組織アレイからＰＬＳＣＲ１の正常と腫瘍組織においての発現を分析する＞
＜組織アレイの免疫組織化学分析＞
正常と腫瘍器官組織の組織アレイサンプルは、Ｂｉｏｍａｘ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から購入したものである。メーカーの操作ステップによれば、ＤＡＢ検知セット（ＤＡＫＯ、ＡＲ１５５、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、デンマーク）で、組織アレイサンプル上において、免疫組織化学分析を行う。上記の免疫組織化学分析においては、ＰＬＳＣＲ１抗体（１：１００）を使用する。
簡略化のＨ評価システム（Ｒａｖｎ Ｖら、Ｐａｔｈｏｌ Ｒｅｓ Ｐｒａｃｔ １８９：１０１５−２２、１９９３）で、ＰＬＳＣＲ１の発現が、陽性か陰性であることを評価し、上記評価は、色染められた細胞百分率値（３、≧９０％、２、５０−８９％、１、１０−４９％、或いは０、０−９％）と細胞色染め強度（３、強、２、中、１、弱、或いは０、細胞色染め無し）に基づく。上記二つの数値を相乗して３で割って、最後の評価点が得られる。陽性色染めについて、最後評価点≧１に定義する。

結果は、図７のように、ＰＬＳＣＲ１タンパクが、甲状腺髄質癌や結腸腺癌及び膀胱移行上皮癌において、高度な発現が表す。また、ＰＬＳＣＲ１は、正常の腎上体組織や正常の肝臓組織、膵臓腺細胞癌、食道腺細胞癌、直腸腺細胞癌及び子宮頚部扁平細胞癌の多種類の組織において、低い量で発現される。

図１０Ａの結果によれば、抗−ＰＬＳＣＲ１抗体は、明白に、大腸癌（ＨＴ２９）や甲状腺癌（ＣＧ１）、口腔癌（ＯＥＣ−Ｍ１）、胃癌（ＡＧＳ）、膀胱癌（ＭＧＨ−Ｕ１）、肺癌（Ａ５４９）及子宮頚部癌（ＨｅＬａ）の細胞成長を抑制できる。図１０Ｂは、上記異なる癌細胞株においてのＰＬＳＣＲ１の発現状態である。バー図は、ＰＬＳＣＲ１タンパクの発現と同一サンプルのアクチンの発現を、常態化校正した後、得られた量化数値である。

＜実施例五：ＰＬＳＣＲ１の伝令経路においての可能作用を観察する＞
＜ウエスタンプロット分析＞
分離されたばかりの手術切除部分から臨床組織サンプルを採集し、液体窒素で急速冷却させてから、−８０℃下に、使用するまでに保管する。ＰＬＳＣＲ１タンパクが、大直腸癌（ＣＲＣ）組織においての発現を分析することは、冷凍組織を、研磨してから、溶解溶液（０．２５ｍｏｌ／Ｌ蔗糖や１０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ７．６、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ₂、１％ドデシルスルホン酸ナトリウム［ＳＤＳ］）、そして、タンパク質分解酵素阻害剤（２０μｇ／μＬ ａｐｒｏｔｉｎｉｎ、２０μｇ／μＬ ｌｅｕｐｅｐｔｉｎと１ｍｍｏｌ／Ｌフェニル基メタンスルホニルフッ化物）が含有され、タンパク質：タンパク質分解酵素阻害剤が、１００：１、ｖ／ｖ）に懸濁する。サンプルを、超音波で振盪させ、１４、０００ｒｐｍの下で、１０分、遠心させる。ＤＣタンパク質分析方法（ＢＩＯ−ＲＡＤ(登録商標)、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．、ＣＡ）で、タンパク質の量を測定する。

サンプル（５０μｇタンパク質）と、２％ ＳＤＳと５％ ２−メルカプトエタノールを含有する電気泳動サンプル緩衝液とを混合し、５分間煮沸する。１２％変性ポリアクリルアミドゲル上において、異なるタンパク質を、電気泳動によって分離させて、ＰＶＤＦ膜上（Ｐａｌｌ Ｅｕｒｏｐｅ Ｌｔｄ．、Ｐｏｒｔｓｍｏｕｔｈ、ＵＫ）に移転する。ブロット膜に、５％脱脂粉乳で、封鎖し、その後、抗−人類ＰＬＳＣＲ１モノクローナル抗体（希釈度が、１：１０００）と、室温下で、２時間、反応させ、その後、更に、ペルオキシダーゼと共軛結合する下位抗体と、室温下で、１時間、反応させる。
ブロット膜に対して、化学発光（ＥＣＬ）が増強されたウエスタンプロット試薬で現像し、Ｋｏｄａｋ Ｂｉｏｍａｘフィルムに露光させる。また、Ｉｍａｇｅｍａｓｔｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）分析で、ブロットイメージが得られる。
光学密度測定法で、Ｍｕｌｔｉ Ｇａｕｇｅ ２．０版ソフト（Ｆｕｊｉ ＰｈｏｔｏＦｉｌｍ、東京、日本）により分析し、各バーのタンパク質含有量を定量化する。ＳＰＳＳ／Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標） １２．０統計パッケージソフト（ＳＰＳＳ、Ｉｎｃ．、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ）を使用して、得られたデータを、対応ｔ検定（ｐａｉｒｅｄ ｔ−ｔｅｓｔ）で分析する。Ｐ＜０．０５は、統計上、明白的なことと認められる。

ウエスタンプロットの結果によれば、ＰＬＳＣＲ１やＳｈｃ、Ｓｒｃ及びサイクリンＤ１は、腫瘍組織と周辺正常組織との間に、明白に、差異発現が表す（図８）。一方、結果によれば、抗−ＰＬＳＣＲ１抗体は、ＨＴ２９細胞が、サイクリンＤ１においての発現と、ＳｒｃやＳｈｃ、Ｅｒｋ及びＲｂのリン酸化反応を抑制する（図９）。
特に、Ｒｂのリン酸化反応が低減されても、その発現が抗−ＰＬＳＣＲ１による処理によって抑制されない。既知のように、Ｒｂの未リン酸化形式は、多種類のサイクリンを操作するＥ２Ｆ転写因子家族のメンバーと結合する。ＲｂとＥ２Ｆによって形成された複合物は、抑制物として作用でき、サイクリンがＧ１段階に通過することを抑制できる（Ｒｅｓｎｉｔｚｋｙ ＤとＲｅｅｄ ＳＩ、１９９５）。

＜実施例六：抗−ＰＬＳＣＲ１が人類周辺血液リンパ単球（ＰＢＭＣ）と赤血球（ＲＢＣ）との結合分析＞
＜ＰＢＭＣとＲＢＣ細胞の免疫蛍光色染め＞
ＰＢＭＣ細胞を採集してＰＢＳで、三回清浄する。細胞を、２％牛血清白タンパク（ＢＳＡ）を有するＰＢＳで、４℃下にで、１時間、封鎖する。封鎖試薬を除去して、１０μｇ／ｍＬの抗−ＰＬＳＣＲ１や第一類ＨＬＡ抗体（Ｗ６／３２、ＮＯＶＵＳ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬＳ、ＵＳＡ）（陽性反応制御組とする）を、５％ ＢＳＡを含有するＰＢＳに溶け、採集した細胞に、注入して、１時間、反応させる。結合されていない抗体を除去して、細胞を、ＰＢＳにおいて、三回清浄する。
また、下位抗体であるＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８山羊抗−小鼠ＩｇＧ（１：５０；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｔａｉｗａｎ Ｌｔｄ．、Ｔａｉｗａｎ）を注入して、１時間、反応させる。細胞を、ＰＢＳにおいて、三回清浄し、また、フローサイトメトリー計（ＥＰＩＣＳ ＸＬ−ＭＣＬ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、ＵＳＡ）で、各分析サンプルに対して、１０、０００個細胞を計量する。
また、容量依存性分析（ｄｏｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｓｓａｙｓ）は、５や１０及び２０μｇ／ｍＬの抗−ＰＬＳＣＲ１抗体によって処理されたＰＢＭＣについて、上記の実験条件とフローサイトメトリー計で、評価する。

人類赤血球（ＲＢＣ）結合分析は、人類血液を、１：５００のように、ＰＢＳに希釈する。希釈したＲＢＣと、１０μｇ／ｍＬの抗−ＰＬＳＣＲ１抗体や小鼠抗−人類ＣＤ４７ 抗体（陽性反応制御組とする）を、室温下で、３０分、反応させる。ＲＢＣ細胞を、ＰＢＳにおいて、三回清浄する。
下位抗体であるＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８山羊抗−小鼠ＩｇＧ（１：５０；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｔａｉｗａｎ Ｌｔｄ．、Ｔａｉｗａｎ）を注入して、３０分、反応させる。細胞を、ＰＢＳにおいて、三回清浄し、また、フローサイトメトリー計（ＥＰＩＣＳ ＸＬ−ＭＣＬ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、ＵＳＡ）で、細胞数を計量する。

＜図１＞抗−ＰＬＳＣＲ１抗体により、ＨＴ２９大腸直腸癌細胞系の増殖能が圧制される。（Ａ）は、ＨＴ２９細胞が、抗−ＰＬＳＣＲ１抗体によって処理された時と処理されない時の成長曲線の比較で、結果によれば、抗ＰＬＳＣＲ１のＮ−端やＣ−端に対して、抗原表位の抗−ＰＬＳＣＲ１抗体で処理したＨＴ２９細胞系の成長が抑制される。（Ｂ）は、ＨＴ２９細胞の増殖能は、容量依存性型式で、抗ＰＬＳＣＲ１のＮ−端やＣ−端に対して抗原表位の抗−ＰＬＳＣＲ１抗体で処理されることにより、抑制される。（Ｃ）は、ＨＴ２９細胞系が、抗−ＰＬＳＣＲ１抗体によって処理された時と非アンカー関連の細胞群体形成能の比較である。

＜他の具体的な形態＞
本明細書に披露された全ての特徴は、任意に組立てられることができる。そのため、本明細書に掲示された各特徴は、同じや等価或いは類似した目的の代替特徴によって取り替えられることができる。そのため、明白に言明されない限りに、掲示された各特徴は、ただ、シリーズの等価や類似する特徴を有する実例である。

前記の説明から分かるように、上記技術の熟練者であれば、容易に、本発明の基本特徴を確認でき、また、その範囲から背離しない限り、本発明に対して、異なる用途と状況に応じて、いろいろの変化や修正することができる。そのため、他の具体的な形態も、特許請求範囲に含まれる。

＜図１＞抗−ＰＬＳＣＲ１抗体により、ＨＴ２９大腸直腸癌細胞系の増殖能が圧制される。（Ａ）は、ＨＴ２９細胞が、抗−ＰＬＳＣＲ１抗体によって処理された時と処理されない時の生長曲線の比較で、結果によれば、抗ＰＬＳＣＲ１のＮ−端やＣ−端に対して、抗原表位の抗−ＰＬＳＣＲ１抗体で処理したＨＴ２９細胞系の生長が抑制される。（Ｂ）は、ＨＴ２９細胞の増殖能は、容量依存性型式で、抗ＰＬＳＣＲ１のＮ−端やＣ−端に対して抗原表位の抗−ＰＬＳＣＲ１抗体で処理されることにより、抑制される。（Ｃ）は、ＨＴ２９細胞系が、抗−ＰＬＳＣＲ１抗体によって処理された時と非アンカー関連の細胞群体形成能の比較である。

＜図２＞抗−ＰＬＳＣＲ１抗体が、ＨＴ２９細胞とＨＣＴ１１６細胞移動能に対する影響である。移動分析結果によれば、上記に種類の細胞が、抗−ＰＬＳＣＲ１によって処理された後の移動能で、ＰＢＳやＩｇＧによって処理されたものに比較すると、その細胞の移行能力が、抑制される。

＜図３＞抗−ＰＬＳＣＲ１抗体が、ＨＣＴ１１６の侵入能に対する影響である。ＨＴ２９とＨＣＴ１１６細胞の侵入分析を検視する。細胞がろ過膜の下方に侵入した時の代表顕微写真（上図）とＨＣＴ１１６細胞の侵入試驗定量分析結果（下図）である。各バー図は、三組の独自実験計算による平均値±ＳＤである。

＜図４＞正常の血清と抗−ＰＬＳＣＲ１抗体を注入して、同時に、ＨＴ２９細胞を処理し、補体−依頼性細胞毒性を評価する結果である。細胞に対して、抗−ＰＬＳＣＲ１抗体と補体を含有する正常血清とで、処理する時、正常血清により派生された補体により、細胞生存抑制作用が強化される。

＜図５＞ＰＬＳＣＲ１タンパクと抗−ＰＬＳＣＲ１抗体との結合が組換えられることにより、抗−ＰＬＳＣＲ１抗体の細胞増殖の抑制特性を低減できる。

＜図６＞抗−ＰＬＳＣＲ１抗体が、生体内悪性腫瘍形成を抑制できる。（Ａ）は、各組の小鼠の実験７日目と３０日目の図である。（Ｂ）は、アイソタイプＩｇＧや抗−ＰＬＳＣＲ１抗体によって処理された小鼠から採集した腫瘍である。（Ｃ）と（Ｄ）は、それぞれ、アイソタイプＩｇＧや抗−ＰＬＳＣＲ１抗体によって処理された小鼠の腫瘍成長曲線（Ｃ）と最終平均腫瘍重量（Ｄ）である。

＜図７＞市販のバイオメックス（Ｂｉｏｍａｘ；図７Ａ）が、免疫組織化学分析ＰＬＳＣＲ１によって、多種類の正常と腫瘍組織においての発現である。（Ｂ）は、結果によれば、ＰＬＳＣＲ１タンパクが、甲状腺髄質癌や結腸腺癌及び膀胱移行上皮癌に高度に、発現される。また、ＰＬＳＣＲ１は、正常の腎上体組織や正常の肝臓組織、膵臓腺細胞癌、食道腺細胞癌、直腸腺細胞癌及び子宮頚部扁平細胞癌の多種類の組織において、低い量で発現されることが分かる。（Ｃ）は、ＰＬＳＣＲ１タンパクの大腸や膀胱、直腸及び子宮頚部鱗状細胞組織の代表性実例の相対発現量である。

＜図８＞大腸直腸組織において、サンプルのＰＬＳＣＲ１やＳｈｃ、Ｓｒｃ、Ｅｒｋ、Ｒａｓ及びサイクリンＤ１に対するウエスタンプロット分析結果である。対応ｔ検定（ｐ＜０．０５）で、腫瘍と正常組織の符合標本の各タンパクの発現差異を評価する。下図の各点は、各組織のタンパクの発現量で、標示された横線は、全ての点の平均値である。

＜図９＞
ＨＴ２９細胞系の抗−ＰＬＳＣＲ１は、Ｒｂタンパクの再活性化を抑制することにより、細胞増殖を抑制する。（Ａ）は、抗−ＰＬＳＣＲ１がサイクリンＤ１を抑制する発現である。（Ｂ）は、抗−ＰＬＳＣＲ１処理により、ＨＴ２９細胞のＳｒｃやＳｈｃ、ＥｒｋとＲｂのリン酸化反応が低減される。

＜図１０＞抗−ＰＬＳＣＲ１抗体は、異なる人類癌細胞系の細胞増殖を抑制できる。（Ａ）は、ＰＢＳやアイソタイプ抗体と抗−ＰＬＳＣＲ１抗体によって処理された時の細胞成長曲線である。ＨＴ２９大腸直腸癌細胞やＣＧ１甲状腺癌細胞、ＯＥＣ−Ｍ１口腔癌細胞、ＡＧＳ胃癌細胞、ＭＧＨ−Ｕ１膀胱癌細胞、Ａ５４９肺癌細胞及びＨｅＬａ子宮頚部癌細胞の細胞系において、成長抑制効果が明白である。（Ｂ）は、ウエスタンプロット分析法で、異なる細胞のＰＬＳＣＲ１タンパク発現を測定する。アクチンが、照合組とされる。ウエスタンプロット実験の定量結果によれば、アクチンを添加するサンプル量の標準とし、ＰＬＳＣＲ１を数値正常化する。柱状図と誤差線段は、正常化された後のＰＬＳＣＲ１の数値の３組の独自実験において、計算による平均値±ＳＤである。

＜図１１＞抗−ＰＬＳＣＲ１抗体が、人類周辺血液リンパ単球（ＰＢＭＣ）と赤血球（ＲＢＣ）の結合分析結果である。（Ａ）は、濃度が１０μｇ／ｍＬである抗−ＰＬＳＣＲ１抗体や陽性照合組の第一類ＨＬＡ抗体が、ＰＢＭＣ細胞と反応する。更に、下位抗体のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８山羊抗−小鼠ＩｇＧが添加される。フローサイトメトリー計により、異なる処理条件下で、細胞の蛍光信号を分析する。破線下面積は、単独に下位抗体（左図、陰性照合組）や抗−ＰＬＳＣＲ１（中央図）を使用して、抗−第一類ＨＬＡ抗体（右図）と反応する時のＰＢＭＣである。上記の分析は、異なる個体のサンプルからの分析結果である。（Ｂ）は、前記のフローサイトメトリーで、５や１０及び２０μｇ／ｍＬの抗−ＰＬＳＣＲ１抗体によって処理されたＰＢＭＣを評価する。（Ｃ）は、濃度が１０μｇ／ｍＬである抗−人類ＣＤ４７ 抗体（陽性照合組）や抗−ＰＬＳＣＲ１抗体により処理されたＲＢＣｓの蛍光測定結果である。（Ｄ）は、５や１０及び２０μｇ／ｍＬの抗−ＰＬＳＣＲ１抗体により処理されたＲＢＣｓの蛍光測定結果である。

Claims (19)

1. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４からなる群から選ばれる何れか一つのペプチドと結合するＰＬＳＣＲ１モノクローナル抗体または当該抗体の結合断片たるＰＬＳＣＲ１−阻害剤と、
   医薬使用可能の担体、希釈剤、または賦形剤と、
   を含むことを特徴とする癌治療または予防用医薬組成物。
2. 前記ＰＬＳＣＲ１−阻害剤は、ＰＬＳＣＲ１の生理活性を低減可能であることを特徴とする請求項１に記載の癌治療または予防用医薬組成物。
3. 前記ＰＬＳＣＲ１モノクローナル抗体または当該抗体の結合断片は、ヒト化モノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１に記載の癌治療または予防用医薬組成物。
4. 前記ＰＬＳＣＲ１−阻害剤は、ＰＬＳＣＲ１タンパクの発現を低減することを特徴とする請求項１に記載の癌治療または予防用医薬組成物。
5. 少なくとも一つの抗癌剤をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の癌治療または予防用医薬組成物。
6. 前記ＰＬＳＣＲ１−阻害剤は、ＰＬＳＣＲ１の生理活性を低減することにより、癌細胞の増殖、移動、及び侵入が抑制することを特徴とする請求項２に記載の癌治療または予防用医薬組成物。
7. 前記ＰＬＳＣＲ１−阻害剤は、脱リン酸化反応で、Ｓｒｃの活性を低減することにより、癌細胞を抑制することを特徴とする請求項６に記載の癌治療または予防用医薬組成物。
8. 前記ＰＬＳＣＲ１−阻害剤は、脱リン酸化反応で、Ｓｈｃの活性を低減することにより、癌細胞を抑制することを特徴とする請求項６に記載の癌治療または予防用医薬組成物。
9. 前記ＰＬＳＣＲ１−阻害剤は、脱リン酸化反応で、Ｅｒｋの活性を低減することにより、癌細胞を抑制することを特徴とする請求項６に記載の癌治療または予防用医薬組成物。
10. 前記ＰＬＳＣＲ１−阻害剤は、サイクリンＤ１の発現を低減することにより、癌細胞を抑制することを特徴とする請求項６に記載の癌治療または予防用医薬組成物。
11. 前記ＰＬＳＣＲ１−阻害剤は、脱リン酸化反応で、抑制因子であるＲｂタンパク（ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ）を活性化させて、癌細胞を抑制することを特徴とする請求項６に記載の癌治療または予防用医薬組成物。
12. 前記ＰＬＳＣＲ１−阻害剤の有効量範囲は、１ｍｇ／ｋｇ乃至１０ｍｇ／ｋｇにあることを特徴とする請求項１に記載の癌治療または予防用医薬組成物。
13. 癌を治療または予防するために投与する医薬組成物の製造方法における、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４からなる群から選ばれる何れか一つのペプチドと結合するＰＬＳＣＲ１モノクローナル抗体または当該抗体の結合断片たる、治療または予防上有効量のＰＬＳＣＲ１−阻害剤の使用。
14. 前記癌のＰＬＳＣＲ１は、過剰発現になることを特徴とする請求項１３に記載のＰＬＳＣＲ１−阻害剤の使用。
15. 前記癌は、乳癌、肝癌、大腸直腸癌、膵臓癌、食道癌、膀胱癌、卵巣癌、皮膚癌、胃癌、前立腺癌、肺癌、腎細胞癌、甲状腺癌、脳腫瘍、黒色腫、肉腫、白血病、骨肉腫、及び子宮内膜癌からなる群から選ばれる何れか一つであることを特徴とする請求項１３に記載のＰＬＳＣＲ１−阻害剤の使用。
16. 前記医薬組成物は、高発現量のＰＬＳＣＲ１の癌細胞に対する毒性を選択的に標的とすることを特徴とする請求項１３に記載のＰＬＳＣＲ１−阻害剤の使用。
17. 前記癌を治療または予防するために、当該癌細胞を、治療または予防上有効量の前記ＰＬＳＣＲ１−阻害剤が含まれる前記医薬組成物に露出させることを特徴とする請求項１６に記載のＰＬＳＣＲ１−阻害剤の使用。
18. 前記癌を治療または予防するために、前記ＰＬＳＣＲ１−阻害剤が含まれる前記医薬組成物の投与は、他の放射線療法、化学療法、及び免疫調節の療法と組み合わせて適用されることを特徴とする請求項１３に記載のＰＬＳＣＲ１−阻害剤の使用。
19. 前記治療または予防上有効量は、１ｍｇ／ｋｇ乃至１０ｍｇ／ｋｇの範囲にあることを特徴とする請求項１３に記載のＰＬＳＣＲ１−阻害剤の使用。