CN101791395B - 磷脂爬行酶1在制备抗乙型肝炎病毒感染药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种生物化学物质在制药工程中的新用途，更具体地说就是磷脂爬行酶1(phospholipid scramblase 1，PLSCR1)在制备治疗和预防乙型肝炎病毒(HBV)感染相关疾病的药物中的应用。本实验室通过酵母双杂交技术筛选发现PLSCR1与HBV表面蛋白的PreS1结构域具有相互结合的特性。进一步研究首次证实该蛋白在培养的HepG2.2.15细胞以及HBV1.3转染HepG2细胞模型中均能有效地抑制乙型肝炎病毒的复制和表达。因此，本发明涉及到PLSCR1蛋白成为治疗乙型肝炎病毒相关疾病，减小乙型肝炎相关性疾病危害性的新型药物。

Description

磷脂爬行酶1在制备抗乙型肝炎病毒感染药物中的用途

技术领域

本发明涉及一种生物化学物质在制药工程中的新用途，更具体地说就是磷脂爬行酶1(phospholipid scramblase 1，PLSCR1)在制备治疗和预防乙型肝炎病毒(HBV)感染相关性疾病的药物中的应用。

背景技术

乙型肝炎病毒(HBV)感染严重威胁人类的健康，是导致肝炎、肝硬化、肝癌的重要原因。全世界有3.5亿乙型肝炎病毒携带者，中国约有1.2亿HBV携带者，其中2000多万人为慢性乙肝患者。每年我国在慢性病毒性肝炎方面的直接治疗费用超过500亿人民币。HBV感染不仅给患者及其家庭造成巨大的经济和精神负担，而且给国家造成了巨大的劳动力和经济损失，乃至导致严重的就业等社会问题。然而目前仍然缺乏特别有效的治疗药物，疫苗虽然可起到一定的预防作用，但对已感染者及免疫耐受者无效。临床应用的抗HBV药物主要有干扰素以及一些核苷类似物。干扰素的痊愈率有限，停用后通常会出现复发现象。核苷类似物如拉米夫定、阿德福韦酯、恩替卡韦等是HBV DNA聚合酶的强抑制剂，能有效阻断病毒复制，但长期用药会导致病毒变异，产生耐药性，而且部分病人停药后会复发。因此，新型抗HBV药物的研制具有重大的社会和经济效益。

磷脂爬行酶1(phospholipid scramblase 1，PLSCR1)属于Ca²⁺结合的棕榈酰化II型膜蛋白，非棕榈酰化的PLSCR1蛋白可定位于细胞核内，并与基因组DNA序列结合。最初的研究显示，PLSCR1参与细胞膜磷脂跨膜活动。随后的研究发现多种细胞因子如干扰素、表皮生长因子等能够调节PLSCR1的表达，而且发现，PLSCR1蛋白可与多种蛋白如c-Ab1、EGFR、c-Src、PKCδ和onzin等相互作用，提示PLSCR1在细胞信号传递中的作用。有关磷脂爬行酶1抗乙型肝炎病毒的作用尚未见文献报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种磷脂爬行酶1用于治疗HBV感染相关疾病中的新用途。具体说，本发明涉及磷脂爬行酶1在制备治疗或预防HBV感染引起的相关疾病的药物中的应用。

人磷脂爬行酶1是天然存在于细胞内的一种蛋白，分子量约为37000道尔顿，它是有318个氨基酸残基组成的一条单肽链。一级结构参考NCBI公布的蛋白序列，序列号为NP_066928.1。

本发明提供一种磷脂爬行酶1的医药新用途：以磷脂爬行酶1为活性成分，配以制药可接受的载体，制成多种制剂，用以治疗和预防HBV感染及其相关疾病。

所说的制药可接受的载体包括药用稀释剂、稳定剂、赋形剂、吸收促进剂、促渗透剂、蛋白酶抑制剂、阻聚剂等，如甘氨酸、PH7.0磷酸盐缓冲液、右旋糖酐、乳糖、氯化钠、柠檬酸、明胶、注射用水、生理盐水、脂质体、胆盐、脂肪酸、皂角苷、辛酸钠、月桂酸钠、聚丙烯酸、梭链孢酸衍生物(如牛磺酸二氢梭链孢酸盐、环糊精等)、甘油、A-zone、表面活性剂、脂肪酸、胆盐、水杨酸钠、Zonula occludens toxin(ZOT)、甘胆酸钠、camostatmesilate、bacitracin、aprotinin、大豆胰酶抑制剂、非离子表面活性剂、糖、甘露醇、山梨醇、PEG、人血清白蛋白等，可同时使用其中的一种或多种。

本发明药物可制作适合于静脉注射、肌肉注射、皮下注射、鼻腔给药、肺部给药、口服给药以及透皮给药用剂型，包括溶液型注射剂、冻干粉针、微球、粉末、粉雾剂、气雾剂、肠溶衣、毫微球、微乳、复乳等剂型。

根据本发明，细胞内高表达PLSCR1或者在细胞培养液中加入体外重组表达获得的PLSCR1蛋白或其突变体蛋白均可特异性抑制乙肝病毒的复制和表达，PLSCR1可能成为治疗及预防HBV感染相关疾病的新型生物工程药物。

根据本发明，将含有PLSCR1表达序列标签(CDS)序列的载体转染入HBV1.3瞬时转染HepG2细胞模型以及HepG2.2.15细胞模型，能够特异性抑制乙肝病毒的复制和表达，因此含有PLSCR1 CDS序列的载体可能成为制备治疗及预防HBV感染相关疾病的生物工程药物。

根据本发明，为增强PLSCR1的抗HBV活性，降低PLSCR1的毒性，本发明包含了突变其中部分氨基酸或者增加其它氨基酸序列的PLSCR1蛋白的各种变异体。

根据本发明，氨基酸的长度与其细胞通透性，与作用特异性以及活性等因素相关，PLSCR1氨基酸的长度根据实验确定，羧基端分别缺失28个氨基酸、162个氨基酸，仍然具有显著的抑制HBV复制的作用，因此本发明包含了与PLSCR1具有相同序列的任何长度氨基酸。优选的长度为全长318个氨基酸。

根据本发明，为增强蛋白的生物利用度及组织靶向性等，本发明包含了PLSCR1的各种化学修饰如PEG、跨膜肽、右旋糖酐、肝素、聚乙烯吡咯烷酮、聚氨基酸、多聚唾液酸等修饰。

根据本发明，本发明的蛋白及其修饰物可按本领域已知方法配成制剂。

根据本发明，本发明的蛋白及其修饰物治疗组成可应用单独的有效成分或组合物形式包括联合其他药物等形式。联合的其它药物包括干扰素、拉米夫定、阿德福韦酯、恩替卡韦、替比夫定等用于治疗HBV感染相关疾病的药物。

根据本发明，本发明的治疗组成，依不同情况包括特定药物的药物动力学、药代动力学、给药模式、给药途径、受者的年龄、体重、肝肾功能状态、疾病的性质、程度及治疗时限等，以适宜的剂量给药。

本发明的实施对严重危害人类健康的乙型肝炎及其相关疾病的治疗具有重要的社会效益和经济效益。

附图说明

为了更好的理解本发明的实质，下面将结合图表、附图来说明其在制药领域的新用途。

图1pCMV-HA-PLSCR1真核表达载体转染HepG2细胞后表达的PLSCR1 western检测结果

图2细胞内表达PLSCR1对HBV1.3瞬时转染HepG2细胞中HBV复制的影响

图3细胞内表达PLSCR1对HepG2.2.15细胞中HBV复制的影响

图4带GST标签的PLSCR1-GST蛋白原核诱导表达结果

图5带GST标签的PLSCR1-GST蛋白纯化结果

图6PLSCR1-GST对HepG2细胞增殖的影响

图7PLSCR1-GST对HepG2.2.15细胞增殖的影响

图8PLSCR1-GST对HBV1.3转染HepG2细胞中HBV复制的影响

图9PLSCR1-GST对HepG2.2.15细胞中HBV复制的影响

图10PLSCR1-His蛋白纯化结果

图11PLSCR1-His对HepG2.2.15细胞中HBV复制的影响

图12PLSCR1蛋白纯化结果

图13PLSCR1蛋白对HepG2.2.15细胞中HBV复制的影响

图14PLSCR1各功能域片段表达载体与HBV1.3共转染对HBV复制的影响

具体实施方法

实施例一细胞内表达PLSCR1对HBV复制的抑制作用

材料与方法

1.细胞培养

所用细胞为肝癌细胞系HepG2细胞株以及转染有HBV DNA的HepG2.2.15细胞株。HepG2.2.15细胞来源于HepG2细胞，含有整合的HBV DNA，在细胞培养过程中可持续稳定地向培养液中分泌Dane氏颗粒以及HBsAg，HBV DNA等。HepG2细胞用含有10％胎牛血清(FBS，Gibco)的DMEM细胞培养液培养，HepG2.2.15细胞用含有10％胎牛血清，380μg/mlG418(Promega)的MEM细胞培养液培养。

2.质粒

pCMV-HA-PLSCR1质粒由本实验室构建，根据NCBI公布的PLSCR1序列(NM_021105.2)设计引物，扩增PLSCR1 CDS区，通过克隆的方法将其插入pCMV-HA质粒中，经阳性克隆筛选，测序，BLAST比对结果显示构建的pCMV-HA-PLSCR1完全正确。HBV复制型质粒HBV1.3含1.3拷贝HBV DNA并有完整转录单元，其能在转染细胞内完成病毒的复制，细胞培养液上清中可检测到HBV表面抗原(HBsAg)和e抗原(HBeAg)的分泌，细胞内可检测到病毒复制中间体。

3.细胞转染

HepG2细胞在含10％胎牛血清(Gibco)的DMEM培养液中，于37℃、5％CO₂培养箱中培养。观察细胞生长状态良好，培养至对数生长期后，将HepG2细胞接种24孔板，8×10⁴细胞/孔，37℃，5％CO2孵育24小时，待长至80％-90％细胞汇合后，采用Fugene HD(Roche)转染试剂并参照说明书操作转染，同时设HBV1.3与空质粒(pCMV-HA)共转染作为对照。转染后48h，收集细胞培养液，-20℃保存备用。

为检测pCMV-HA-PLSCR1转染后在细胞内能否表达带HA标签的PLSCR1蛋白，将HepG2细胞接种6孔板，6×10⁵细胞/孔，37℃，5％CO2孵育24小时，待长至80％-90％细胞汇合后，采用Fugene HD(Roche)转染试剂并参照说明书操作转染，转染后48h，提取细胞总蛋白，-20℃保存备用。

Hep2.2.15细胞在含10％胎牛血清(Gibco)及380μg/ml的MEM培养液中，于37℃、5％CO₂培养箱中培养。观察细胞生长状态良好，培养至对数生长期后，将Hep2.2.15细胞接种24孔板，2×10⁵细胞/孔，37℃，5％CO2孵育48-72小时，待长至80-90％细胞汇合后，采用FugeneHD(Roche)转染试剂并参照说明书操作转染，同时设空质粒(pCMV-HA)对照。转染后48h，收集细胞培养液，-20℃保存备用。

4.Western检测

对转染有pCMV-HA-PLSCR1的总蛋白进行10％聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后采用半干转印法将蛋白转至硝酸纤维素膜(

BA-S 83 Reinforced NC，Schleicher&Schuell)上。4℃封闭过夜，封闭液组成：10％脱脂奶粉，1×TBST。然后与鼠抗HA抗体(Santa cruz)结合1h，TBST洗膜3次，每次10min，再与辣根过氧化酶标记的抗鼠二抗(中杉)结合1h，TBST洗膜3次，每次10min，ECL(Pharmacia)显色系统显色，X光片曝光。

5.HBsAg、HBeAg检测

取收集好的细胞培养液，按照HBsAg，HBeAg ELISA检测试剂盒(科华公司)说明书操作步骤检测。取50μl细胞培养液加入乙肝表面抗原或e抗原包被的96孔板中，每孔加入50μl表面抗原或e抗原对应的酶标结合物，37℃孵育1h后，用洗液洗板5次，加入显色液A50μl，再加入显色液B50μl，37℃孵育15min，加入终止液50μl，在多标记检酶联免疫检测仪(VICTOR^TM Wallac 1420 Multilabel Counter，Wallac)上测定450nm处1s吸光值A。根据IR＝(A450_对照-A450_给药)/A450_对照计算抑制率。

6.HBV DNA检测

取细胞培养液，100℃煮沸15min，12000r/min离心10min，取上清作为荧光定量PCR的模板，实验过程按本实验室建立的复合探针PCR定量检测HBV的方法操作(何云燕，王升启等，中华肝脏病杂志，2001，V9N6：376-377)。定量检测HBV DNA的引物序列为：P1：5’-GGAGTA TGG ATT CGC ACT CCT C-3’；P2：5’-TTG TTG TTG TAG GGG ACC TGC CT-3’；荧光探针序列F：5’-ACT TCC GGA AAC TAC TGT TAG ACG A-3’；淬灭探针序列Q：5’-GTA GTT TCCGGA AGT-3’。20μl反应体系含200nmol/L引物，670nmol/L荧光探针F，180nmol/L淬灭探针，200μmol/LdNTP，4.0mmol/L的Mg²⁺，2μl模板，混匀后将各反应管与标准曲线反应管一起放入iCycle自动PCR仪中进行扩增，扩增条件为：94℃30s，55℃30s，72℃30s，共40个循环，反应结束后由电脑自动计算出定量结果。

结果

1.pCMV-HA-PLSCR1质粒转染后PLSCR1表达检测

为检测pCMV-HA-PLSCR1质粒转染细胞是否能够表达PLSCR1，将pCMV-HA-PLSCR1质粒转染HepG2细胞，提取细胞总蛋白，Western检测PLSCR1蛋白表达，结果如图1所示。由图中可见在相应的蛋白位置能够检测到PLSCR1-HA的蛋白表达，表明pCMV-HA-PLSCR1质粒转染细胞后能够在细胞内表达PLSCR1。

2.在HBV1.3瞬时转染细胞模型表达PLSCR1蛋白可抑制HBV的复制

为检测PLSCR1蛋白在HBV1.3瞬时转染细胞模型是否具有抑制HBV复制的作用，将pCMV-HA-PLSCR1与HBV1.3质粒以不同比例共转染HepG2细胞，同时设空质粒与HBV1.3共转染细胞对照。48h后收集细胞培养液，荧光定量PCR检测各组细胞中分泌的HBV DNA拷贝数，按照公式IR＝(C_{空质粒与HBV1.3共转染细胞对照组}-C_{pCMV-HA-PLSCR1与HBV1.3共转染组})/C_{空质粒与HBV1.3共转染细胞对照组}计算抑制率，公式中IR代表抑制率，C代表检测出的细胞培养液中HBV DNA拷贝数。重复三次实验，计算抑制率的平均值。ELISA检测细胞培养液中HBsAg的表达情况，根据公式IR＝(A_{空质粒与HBV1.3共转染 细胞对照组}-A_{pCMV-HA-PLSCR1与HBV1.3共转染组})/A_{空质粒与HBV1.3共转染细胞对照组}计算抑制率，公式中IR代表抑制率，A代表各检测孔在450nm的吸光度。重复三次实验，计算抑制率的平均值。结果如图2所示。由图中可见，PLSCR1可显著抑制HBV1.3瞬时转染细胞模型中HBV的复制，且这种抑制作用具有剂量依赖性。在pCMV-HA-PLSCR1与HBV1.3质粒以4∶1的比值转染时，对细胞培养也中HBV DNA、HBsAg和HBeAg的抑制率分别为51.54％，79.80％和81.02％。

3.在HepG2.2.15细胞中表达PLSCR1蛋白可抑制HBV的复制

为检测瞬时表达PLSCR1对HepG2.2.15细胞中HBV复制的影响，将pCMV-HA-PLSCR1转染HepG2.2.15细胞，48h后收集细胞培养液，ELISA检测PLSCR1对细胞培养液中HBsAg、HBeAg的影响。结果如图3所示。由图中可见，PLSCR1可剂量依赖性地抑制HepG2.2.15细胞中HBV的复制。

结论

细胞内表达PLSCR1可抑制HBV1.3瞬时转染HepG2细胞模型及HepG2.2.15细胞模型中HBV的复制。

实施例二加入外源重组GST-PLSCR1蛋白对HBV复制的抑制作用

材料与方法

1.pGEX-4T-1-PLSCR1质粒构建

pGEX-4T-1-PLSCR1为本实验室构建，根据NCBI公布的PLSCR1序列(NM_021105.2)设计引物，扩增PLSCR1CDS区，通过克隆的方法将其插入pGEX-4T-1质粒中，经阳性克隆筛选，测序，BLAST比对结果显示构建的pGEX-4T-1-PLSCR1完全正确。

2.GST-PLSCR1融合蛋白诱导表达

将转化有表达GST融合蛋白载体pGEX-4T-1-PLSCR1的大肠杆菌DH5α接种到LB培养基中，37℃震荡过夜，再按2％的接种量接种到新鲜的LB培养基中，30℃培养5小时后，加入IPTG至终浓度为0.1mmol/L～1mmol/L，继续16℃或4℃诱导培养过夜。

3.GST-PLSCR1融合蛋白纯化

用GST-Sepharose 4B亲和层析法纯化GST融合蛋白。基本按Pharmacia公司提供的方法进行。收集上述诱导菌，按10∶1的比例加入细胞裂解液，超声破碎，收集上清，加入适量GST-Sepharose 4B，结合3小时。再收集GST-Sepharose 4B小颗粒，充分洗脱后即得到纯化的GST融合蛋白。

4.细胞培养

方法同实施例一。

5.细胞转染和加药

HepG2细胞在含10％胎牛血清(Gibco)的DMEM培养液中，于37℃、5％CO₂培养箱中培养。观察细胞生长状态良好，培养至对数生长期后，将HepG2细胞接种24孔板，8×10⁴细胞/孔，37℃，5％CO2孵育24小时，待长至80％-90％细胞汇合后，采用Fugene HD(Roche)转染试剂并参照说明书操作转染HBV1.3质粒，6小时后加入GST-PLSCR1融合蛋白或GST蛋白，48h后收集细胞培养液，-20℃保存备用。

Hep2.2.15细胞在含10％胎牛血清(Gibco)及380μg/ml的MEM培养液中，于37℃、5％CO₂培养箱中培养。观察细胞生长状态良好，培养至对数生长期后，将Hep2.2.15细胞接种24孔板，2×10⁵细胞/孔，37℃，5％CO2孵育48小时，加入不同浓度的GST-PLSCR1融合蛋白、GST融合蛋白或者IFN。加药后3天换含有等浓度药物的细胞培养液，第6天收集细胞培养液，-20℃保存备用。

6.细胞毒性检测

HepG2细胞、Hep2.2.15细胞培养至对数生长期后，接种96孔板，HepG2细胞铺板密度为0.5×10⁵细胞/孔，Hep2.2.15细胞铺板密度为0.75×10⁵细胞/孔，37℃，5％CO2孵育24h(HepG2)和48h(Hep2.2.15)。加入1.5、3、6、12、100μg/mL的GST-PLSCR1蛋白，并设细胞对照，每浓度重复三孔。HepG2细胞加入蛋白后48h，HepG2.2.15细胞加入蛋白后三天换新鲜培养液并加入新鲜蛋白至第6天，参照MTS(Promega)使用说明书，每孔加入MTS20μl/100μl培养液，37℃避光孵育1.5小时，在多标记酶联免疫检测仪490nm检测吸光度。同时，每日在倒置显微镜下观察细胞形态。

7.HBsAg、HBeAg检测

方法同实施例一。

8.HBV DNA检测

方法同实施例一。

结果

1.GST-PLSCR1蛋白表达纯化

将转化有表达GST融合蛋白载体pGEX-4T-1-PLSCR1的大肠杆菌DH5α经扩增后，加入IPTG至终浓度为0.1mmol/L～1mmol/L，16℃或4℃诱导培养过夜。PAGE胶检测结果如图4所示，显示在63KDa处均能诱导表达出相应的蛋白条带，其中以低转速，温度为16℃，IPTG浓度为0.1mM时，融合蛋白表达量较高。

将上清中表达获得的GST-PLSCR1蛋白经GST-Sepharose 4B亲和层析法纯化获得GST-PLSCR1融合蛋白。PAGE胶检测结果如图5所示。

2.GST-PLSCR1对HepG2、HepG2.2.15细胞增殖的影响

GST-PLSCR1融合蛋白以1.5、3、6、12、100μg/mL的浓度加入HepG2、HepG2.2.15细胞后，每日在倒置显微镜下观察细胞形态，加药组细胞形态与对照组细胞形态无显著变化。细胞增殖实验结果见图6、图7。图中显示在0-100μg/mL范围内，各剂量组OD值与正常细胞对照基本相同。

3.在HBV1.3瞬时转染细胞模型GST-PLSCR1蛋白可抑制HBV的复制

为检测PLSCR1蛋白在HBV1.3瞬时转染细胞模型是否具有抑制HBV复制的作用，将HBV1.3质粒转染HepG2细胞，6h后加入不同浓度的GST-PLSCR1蛋白，以不加蛋白组为空白细胞对照，同时加入12μg/mL GST蛋白作为对照，48h后收集细胞培养液，ELISA检测细胞培养液中HBsAg、HBeAg的表达情况，结果显示加入12μg/mL GST蛋白细胞培养液中HBsAg、HBeAg的分泌量与细胞对照组无显著差异，而加入不同浓度GST-PLSCR1蛋白的细胞培养液中HBsAg和HBeAg分泌量显著降低。根据公式IR＝(A_{对照组-AGST-PLSCR1组})/A_对照组计算抑制率，公式中IR代表抑制率，A代表各检测孔在450nm的吸光度。重复三次实验，计算抑制率的平均值。结果如图8所示。由图中可见，PLSCR1可显著抑制HBV1.3瞬时转染细胞模型中HBV的复制，且这种抑制作用具有剂量依赖性。在GST-PLSCR1融合蛋白浓度为1.5μg/mL时，对培养液中HBsAg、HBeAg的抑制率分别为52.24％、30.60％，而在GST-PLSCR1融合蛋白浓度为12μg/mL时，对培养液中HBsAg、HBeAg的抑制率分别达到72.57％、61.93％。

4.在HepG2.2.15细胞中GST-PLSCR1蛋白可抑制HBV的复制

为检测PLSCR1蛋白在HepG2.2.15细胞是否具有抑制HBV复制的作用，HepG2.2.15细胞铺板后48h，加入12μg/mlGST蛋白以及不同浓度的GST-PLSCR1融合蛋白，以不加任何蛋白细胞为空白细胞对照，以2μg/ml干扰素(IFN)作为阳性药对照组，第6天收集细胞培养液，荧光定量PCR检测各组细胞中分泌的HBV DNA拷贝数，ELISA检测细胞培养液中HBsAg的表达情况，结果显示加入12μg/mL GST蛋白细胞培养液中HBV DNA、HBsAg、HBeAg的分泌量与细胞对照组无显著差异，而加入不同浓度GST-PLSCR1蛋白或者2μg/ml IFN的细胞培养液中HBsAg和HBeAg分泌量显著降低。根据公式IR＝(A_对照组-A_加药组)/A_对照组计算抑制率，公式中IR代表抑制率，A代表各检测孔在450nm的吸光度或者荧光定量PCR检测结果中DNA的拷贝数。重复三次实验，计算抑制率的平均值。结果如图9所示。由图中可见，PLSCR1可显著抑制HepG2.2.15细胞中HBV的复制，且这种抑制作用具有显著的剂量依赖性。在GST-PLSCR1融合蛋白浓度为1.5μg/mL时，对培养液中HBV DNA、HBsAg、HBeAg的抑制率分别为79％、28.69％和20.76％，而干扰素在2μg/mL时对培养液中HBV DNA、HBsAg、HBeAg的抑制率分别为46.58％、39.67％和14.84％。在GST-PLSCR1融合蛋白浓度为12μg/mL时，对培养液中HBV DNA、HBsAg、HBeAg的抑制率分别达到89.69％、46.21％、27.05％。

结论

加入外源重组PLSCR1-GST融合蛋白可抑制HBV1.3瞬时转染HepG2细胞模型及HepG2.2.15细胞模型中HBV的复制。

实施例三加入外源重组His-PLSCR1融合蛋白对HBV复制的抑制作用

材料与方法

1.Pet28a-PLSCR1质粒构建

Pet28a-PLSCR1为本实验室构建，根据NCBI公布的PLSCR1序列(NM_021105.2)设计引物，扩增PLSCR1 CDS区，通过克隆的方法将其插入Pet28a质粒中，经阳性克隆筛选，测序，BLAST比对结果显示构建的Pet28a-PLSCR1完全正确。

2.His-PLSCR1融合蛋白诱导表达和纯化

将含重组表达质粒的大肠杆菌接种琼脂板，从新鲜琼脂平板上挑取单菌落，接种2mlLB培养基，补加适当的抗生素(终浓度100mg/L)在20ml的培养管中，在定轨摇床上培养过夜，按照1∶100比例稀释过夜培养细菌，抗生素浓度不变，37℃培养至OD值约为0.8，加入IPIG至终浓度为0.1mol/L，25℃诱导过夜。8000r/min，4℃，离心10min收集菌体，加适量1×PBS缓冲液重悬菌体，在冰浴条件下超声裂解，12000r/min离心15min，样品沉淀用20mM PBPH 7.8悬起后，8M、1％β-ME脲溶解，离心后上HisTrap^TMHP柱，柱子用结合缓冲液(20mMPB 6M脲1％β-ME PH 7.8)3个柱体积平衡柱子，上样流速调整后，每小时10个柱体积(20ml)，0.3ml/min用结合缓冲液(20mM PB 6M脲1％β-ME PH 7.8)洗柱，6个柱体积用洗涤缓冲液((20mM PB 6M脲1％β-ME PH 6.0)洗柱，4个柱体积用250mM咪唑洗脱缓冲液(含洗涤缓冲液PH6.0)洗脱。洗脱液用20mM PB透析，最后纯化后的融合蛋白用截流分子质量为10000的超滤离心管于4000r/min离心浓缩至1ml，加入ddH₂O洗涤2次并离心浓缩至500ul。得到最终纯化的融合蛋白。

4.细胞培养

方法同实施例一。

5.细胞加药

Hep2.2.15细胞在含10％胎牛血清(Gibco)及380μg/ml的MEM培养液中，于37℃、5％CO₂培养箱中培养。观察细胞生长状态良好，培养至对数生长期后，将Hep2.2.15细胞接种24孔板，2×10⁵细胞/孔，37℃，5％CO2孵育48小时，加入不同浓度的His-PLSCR1融合蛋白。加药后3天换含有等浓度药物的细胞培养液，第6天收集细胞培养液，-20℃保存备用。

6.HBsAg、HBeAg检测

方法同实施例一。

7.HBV DNA检测

方法同实施例一。

结果

1.His-PLSCR1蛋白表达纯化

将转化有表达His标签融合蛋白载体PET28a-PLSCR1的大肠杆菌BL21经扩增后，加入IPTG至终浓度为0.1mmol/L，25℃诱导培养过夜。经HisTrap^TMHP柱纯化，透析复性，超滤浓缩，得到纯化的融合蛋白，PAGE胶检测结果如图10所示。

2.在HepG2.2.15细胞中His-PLSCR1蛋白可抑制HBV的复制

为检测PLSCR1蛋白在HepG2.2.15细胞是否具有抑制HBV复制的作用，HepG2.2.15细胞铺板后48h，加入不同浓度的his-PLSCR1融合蛋白，以不加任何蛋白细胞为空白细胞对照，第6天收集细胞培养液，荧光定量PCR检测各组细胞中分泌的HBV DNA拷贝数，ELISA检测细胞培养液中HBsAg的表达情况，结果显示加入不同浓度His-PLSCR1蛋白的细胞培养液中HBV DNA、HBsAg和HBeAg分泌量显著降低。根据公式IR＝(A_对照组-A_加药组)/A_对照组计算抑制率，公式中IR代表抑制率，A代表各检测孔在450nm的吸光度或者荧光定量PCR检测结果中DNA的拷贝数。重复三次实验，计算抑制率的平均值。结果如图11所示。由图中可见，PLSCR1可显著抑制HepG2.2.15细胞中HBV的复制，且这种抑制作用具有显著的剂量依赖性。在his-PLSCR1融合蛋白浓度为0.01μg/mL时，就显示出抑制HBV复制的作用，在his-PLSCR1融合蛋白浓度达到1μg/mL时，对培养液中HBV DNA、HBsAg、HBeAg的抑制率分别达到62.17％、71.94％和54.73％。

结论

加入外源重组His-PLSCR1蛋白可抑制HepG2.2.15细胞模型中HBV的复制。

实施例四加入外源重组PLSCR1蛋白对HBV复制的抑制作用

材料与方法

1.Pet40b(+)-PLSCR1质粒构建

Pet40b(+)-PLSCR1为本实验室构建，根据NCBI公布的PLSCR1序列(NM_021105.2)设计引物，在上游引物翻译起始密码子前加入肠激酶酶切位点，扩增PLSCR1CDS区，通过克隆的方法将其插入Pet40b(+)质粒中，经阳性克隆筛选，测序，BLAST比对结果显示构建的Pet40b(+)-PLSCR1完全正确。

2.PLSCR1蛋白表达

将含有重组质粒的大肠杆菌接种琼脂平板，从新鲜琼脂平板上挑取单菌落，接种2mlLB培养基，补加适当的抗生素(终浓度100mg/L)在20ml的培养管中，在定轨摇床上培养过夜，按照1∶100比例稀释过夜培养细菌，抗生素浓度不变，37℃培养至OD值约为0.8，加入IPIG至终浓度为0.1mol/L，25℃诱导过夜。

3.PLSCR1蛋白纯化

8000r/min，4℃，离心10min收集菌体，加适量1×PBS缓冲液重悬菌体，在冰浴条件下超声裂解，12000r/min离心15min，用QIAexpress Ni-NTA纯化试剂盒在非变性状态下纯化重组人PLSCR1融合蛋白(具体操作步骤参照试剂盒说明书)；纯化后的融合蛋白用截流分子质量为30000的超滤离心管于4000r/min离心浓缩至500uL，加入10mmol/L Tris-HCI(pH8.0)缓冲液洗涤2次并离心浓缩至500μL。纯化的融合蛋白在酶切反应缓冲液(20mmol/LTris-HCI(pH8.0)，50mmol/L NaCI，2mmol/L CaCl₂)中加入适量的带His标签的肠激酶，于25℃孵育16h，用10mL QIAexpress Ni-NTA纯化试剂盒提供的Native Lysis Buffer稀释后，上样于Ni-NTA柱，立即收集蛋白穿透液，用截流分子质量为10000的超滤离心管于4000r/min离心浓缩至500μL，加入ddH₂O洗涤2次并超滤离心浓缩至500μL，得到最终纯化的PLSCR1蛋白。

4.细胞培养

方法同实施例一。

5.细胞加药

Hep2.2.15细胞在含10％胎牛血清(Gibco)及380μg/ml的MEM培养液中，于37℃、5％CO₂培养箱中培养。观察细胞生长状态良好，培养至对数生长期后，将Hep2.2.15细胞接种24孔板，2×10⁵细胞/孔，37℃，5％CO2孵育48小时，加入不同浓度的PLSCR1蛋白。加药后3天换含有等浓度药物的细胞培养液，第6天收集细胞培养液，-20℃保存备用。

6.HBsAg、HBeAg检测

方法同实施例一。

7.HBV DNA检测

方法同实施例一。

结果

1.PLSCR1蛋白纯化

将转化有PET40b(+)-PLSCR1的大肠杆菌BL21经扩增后，加入IPTG至终浓度为0.1mmol/L，25℃诱导培养过夜。经QIAexpress Ni-NTA柱纯化，超滤浓缩，肠激酶酶切，QIAexpress Ni-NTA柱纯化去除标签蛋白以及肠激酶，经超滤浓缩，得到纯化的PLSCR1蛋白，PAGE胶检测结果如图12所示。

2.在HepG2.2.15细胞中PLSCR1蛋白可抑制HBV的复制

为检测PLSCR1蛋白在HepG2.2.15细胞是否具有抑制HBV复制的作用，HepG2.2.15细胞铺板后48h，加入不同浓度的PLSCR1蛋白，以不加任何蛋白细胞为空白细胞对照，第6天收集细胞培养液，荧光定量PCR检测各组细胞中分泌的HBV DNA拷贝数，ELISA检测细胞培养液中HBsAg的表达情况，结果显示加入不同浓度PLSCR1蛋白的细胞培养液中HBV DNA、HBsAg和HBeAg分泌量显著降低。根据公式IR＝(A_对照组-A_加药组)/A_对照组计算抑制率，公式中IR代表抑制率，A代表各检测孔在450nm的吸光度或者荧光定量PCR检测结果中DNA的拷贝数。重复三次实验，计算抑制率的平均值。结果如图13所示。由图中可见，PLSCR1可显著抑制HepG2.2.15细胞中HBV的复制，且这种抑制作用具有显著的剂量依赖性。在PLSCR1蛋白浓度为0.03μg/mL时，就显示出抑制HBV复制的作用，在PLSCR1蛋白浓度达到1μg/mL时，对培养液中HBV DNA、HBsAg、HBeAg的抑制率分别达到93.17％、83.82％和77.77％。

结论

加入外源重组PLSCR1蛋白可抑制HepG2.2.15细胞模型中HBV的复制。

实施例五PLSCR1蛋白各功能域片段对HBV的复制的影响

材料与方法

1.细胞培养

方法同实施例一。

2.质粒

能够表达包含不同长度氨基酸序列的表达质粒由本实验室构建，根据NCBI公布的PLSCR1序列(NM_021105.2)设计引物，分别扩增PLSCR1 CDS区1-870核酸片段、1-468核酸片段、1-354核酸片段、355-954核酸片段、469-954核酸片段，通过克隆的方法将其插入pCMV-HA质粒中，经阳性克隆筛选，测序，BLAST比对结果显示构建的质粒完全正确，分别命名为pCMV-HA-PLSCR1(1)、pCMV-HA-PLSCR1(2)、pCMV-HA-PLSCR1(3)、pCMV-HA-PLSCR1(4)、pCMV-HA-PLSCR1(5)。这5个质粒转染细胞后，可在细胞内分别表达PLSCR1的第1-290位氨基酸、第1-156位氨基酸、第1-118位氨基酸、第119-318位氨基酸、第157-318位氨基酸。HBV复制型质粒HBV1.3含1.3拷贝HBV DNA并有完整转录单元，其能在转染细胞内完成病毒的复制，细胞培养液上清中可检测到HBV表面抗原(HBsAg)和e抗原(HBeAg)的分泌，细胞内可检测到病毒复制中间体。

3.细胞转染

方法同实施例一。

4.HBsAg、HBeAg检测

方法同实施例一。

结果

1.在HBV1.3瞬时转染细胞模型表达PLSCR1蛋白各功能域片段对HBV的复制的影响

为检测PLSCR1蛋白各功能域片段在HBV1.3瞬时转染细胞模型是否具有抑制HBV复制的作用，将pCMV-HA-PLSCR1、pCMV-HA-PLSCR1(1)、pCMV-HA-PLSCR1(2)、pCMV-HA-PLSCR1(3)、pCMV-HA-PLSCR1(4)、pCMV-HA-PLSCR1(5)分别与等量HBV1.3质粒共转染HepG2细胞，同时设空质粒与HBV1.3共转染细胞对照。48h后收集细胞培养液，ELISA检测细胞培养液中HBsAg的表达情况，根据公式IR＝(A_{空质粒与HBV1.3共转染细胞对照组}-A_{pCMV-HA-PLSCR1与HBV1.3共转染组})/A_{空质粒与HBV1.3共转染细胞对照组}计算抑制率，公式中IR代表抑制率，A代表各检测孔在450nm的吸光度。重复三次实验，计算抑制率的平均值。结果如图14所示。由图中可见，细胞内表达PLSCR1全长(1-318位氨基酸)、表达PLSCR1第1-290位氨基酸以及表达PLSCR1第1-156位氨基酸对HBV的复制均具有显著的抑制作用，以细胞内表达PLSCR1全长蛋白抑制HBV复制的作用最强。在pCMV-HA-PLSCR1与HBV1.3质粒共转染时，对细胞培养液中HBsAg和HBeAg的抑制率分别为77.71％，72.45％；pCMV-HA-PLSCR1(1)与HBV1.3共转染时，对细胞培养液中HBsAg和HBeAg的抑制率分别为44.79％，60％；pCMV-HA-PLSCR1(2)与HBV1.3质粒共转染时，对细胞培养液中HBsAg和HBeAg的抑制率分别为39.75％，51.25％。

结论

细胞内表达PLSCR1不同氨基酸长度的蛋白片段对HBV的复制具有一定的抑制作用。

Claims (6)

1.磷脂爬行酶1在制备治疗和预防HBV感染相关疾病的药物中的用途。

2.根据权利要求1的用途，其中所述磷脂爬行酶1的分子量约为37000道尔顿，由318个氨基酸残基组成一条单链，一级结构为NCBI公布的蛋白序列，序列号为NP_066928.1。

3.根据权利要求1所述的用途，其中所述磷脂爬行酶1为从体内纯化获得的天然蛋白质、体外重组表达的蛋白质或增加了HIS标签序列、GST标签序列、HA标签序列的磷脂爬行酶1蛋白的变异体。

4.根据权利要求1所述的用途，其中所述磷脂爬行酶1为磷脂爬行酶1的1-318氨基酸、1-290氨基酸、1-156氨基酸、1-118氨基酸、157-318氨基酸片段或其组合物。

5.根据权利要求1所述的用途，其中所述磷脂爬行酶1经过聚乙二醇、跨膜肽、右旋糖酐、肝素、聚乙烯吡咯烷酮、聚氨基酸或多聚唾液酸修饰。

6.根据权利要求1所述的用途，其中所述药物含有一种或多种制药可接受的载体。

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