JP5709800B2 - 変えられた空間構造を備えるインターフェロン及びその応用 - Google Patents
変えられた空間構造を備えるインターフェロン及びその応用 Download PDFInfo
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Description
o)は、幾つかの天然ヒトα-インターフェロンサブタイプ中に最もよく見られる保存的アミノ酸構造を遺伝子工学の手法により構築された一種の新しいインターフェロン分子である。米国特許4695623、4897471にこのインターフェロンについて記載された。rSIFN-coは幅広いインターフェロンの活性と強い抗ウィルス、抗腫瘍及び天然キラー細胞活性を有することが証明された。米国特許5372808において、rSIFN-coにより疾病を治療する方法が公開された(Amgen Inc.);中国特許97193506.8において、rSIFN-coを用いて、C型肝炎を再治療する方法が公開された(Amgen Inc.);中国特許98114663.5において、rSIFN-coの作製方法とB型肝炎とC型肝炎を治療する方法が公開された(Shenzhen Jiusheng Bio-engineering Ltd.)。
上部呼吸器感染のほぼ78〜80%は下記のウィルスにより引き起こされる:呼吸器系総合ウィルス、アデノウィルス、ライノウィルス、コクサッキウィルス、コロナウィルス及びその変異体、インフルエンザウィルスA及びその変異体、インフルエンザウィルスB及びその変異体、パラインフルエンザウィルス及びその変異体、またはエンテロウイルス(enterovirus)及びその変異体。成人の上部呼吸器感染の一つの主な原因はライノウィルスである。児童の上部呼吸器感染の二つの主な原因は、呼吸系総合ウィルスとパラインフルエンザウィルスである。
1.感受性を有する細胞表面に付着して、抗ウィルスタンパク質の産生を誘導して、生体内でウィルスの複製と再生を阻止する。
2.組換え高率複合インターフェロン(rSIFN-co)は免疫反応を調節して、T細胞の免疫反応、天然キラー細胞の活性、単核体の呑食作用、さらに生体内で抗体を産生する。
四川省(中国の一つの省)のSARSの予防とコントロールのワーキンググループの許可を得た上で、組換え高率複合インターフェロン (rSIFN-co)の配布を2003年5 月から始めた。組換え高率複合インターフェロンスプレー剤はSARSの感染の高危険区の病院の医者、看護婦及びSARSを予防とコントロールする国家機関に配られた。2003年12月19日までに、スプレー剤の3000名の使用者は使用後の副作用は報告されなかった。その他、四川省の医者、看護婦、その他、組換え高率複合インターフェロンスプレー剤を使用した人はSARSに感染しなかった。
(実施例1)
組換え高率複合インターフェロン(rSIFN-co)は、幾つかの天然ヒトα型インターフェロンサブタイプの保存的なアミノ酸配列を遺伝子工学的方法により構築された一種の新たなインターフェロン分子である。rSIFN-coは幅広いインターフェロンの活性を有することが証明される。例えば強い抗ウィルス、腫瘍を抑制する活性、特に、抗慢性C型肝炎の活性を有する。
rSIFN-co cDNA配列を新たに設計する
大腸菌に高発現するために、大腸菌のコドンの頻度に基づいて、rSIFN-co cDNA配列を新たに設計する。新たに設計されたrSIFN-co cDNA配列から推断したアミノ酸配列は発表されたrSIFN-coのアミノ酸原始配列と完全に一致した(図1を参照)。
rSIFN-co cDNA の5’-端と3’-端の半分子の合成
PCR法で直接的にrSIFN-co cDNA の5’-端の280bp(I断片)と、3’-端の268bp(II断片)と二つの半分子を合成する。断片Iの3’-端と断片IIの5’-端には41bpのヌクレオチド配列を重ねている。
「重ね-伸びるPCR」方法で上記PCRに合成された断片Iと断片IIを組み立てて、完全なrSIFN-co cDNAの全長分子配列を得る。その上、NdeIとPstI制限酵素サイトを介して、rSIFN-co cDNA配列をプラスミドにクローンする。
Oligomer G:5'ATCGGCCATATGTGCGACCTGCCGCAGACCC3'
Oligomer H:5'ACTGCCAGGCTGCAGTTATTCTTTACGACGCAGACGTTCC3'
2.「重ね-伸びるPCR」反応
PCR反応条件及び循環は前記PCRIと同じである。
pLac T7プラスミドをクローンベクターとして用いる。pLac T7プラスミドはpBluescriptIIKS(+)プラスミド(米国Stratagen社製)を新たに構築したものである(図3を参照)。
N- Cys-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Asn-Arg-Arg-Ala-Leu-
発現ベクターの構築、形質転換
大腸菌の発現ベクターpHY-4プラスミド(図3を参照、)をまずNdeI酵素で消化し、プラスミドを 直線化(linearize)させる。そして、XbaI酵素で充分に消化する。1%アガロースゲルで電気泳動後、4.8kbのpHY-4の消化産物をドイツのQIAGEN社製のQIAEXIIキットで精製する。
上記のLBプレートからランダムに単一の細菌菌株を拾って、エンドヌクレアーゼで酵素分解して、PCR分析方法でrSIFN-coを含む組換えプラスミド菌株をスクリーニングする。その中の一つのPCR陽性組換えプラスミドをpHY-5と名づけた。pHY-5プラスミドを含有する菌株をPVIIIと名づけ、増殖させてから、グリセロールに入れて-80℃に保存した。
pHY-5プラスミドにおいて、rSIFN-co遺伝子は強いプロモータPBADに調節した。また、PBADはAra Cタンパクに調節した。Ara Cは転写因子であり、アラビノースと複合体になる。アラビノースが存在しない場合には、Ara C二量体はO2及びI1と結合して210bpのループになる。この構造は転写を完全に抑制した。アラビノースを加える場合には、Ara C二量体はO2と離れて、I1及びI2と結合することになる。転写の抑制を解除する。アラビノースの結合が失活、抑制、及びPBADプロモータの転写を活性化する。そして、PBADを刺激して、それを介して、高いレベルのrSIFN-coを発現させる。rSIFN-coの発現量は菌体PVIIIタンパク総量の50%まで至る。
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推断されるrSIFN-coアミノ酸配列
rSIFN-coの分離、精製
1、発酵
遺伝子組換え菌株をLB培地に接種して、37℃で振とうして(200 rpm)オーバナイト(約18時間)培養する。培養液に30 %濃度のグリセロールを入れて、終濃度が15%になるように混合して、それぞれ1 mlずつ分けて、-20 ℃に保存して、生産菌種とする。
6 mol/L濃度のグアニジン塩酸(または尿素)で封入体を溶解して、若干混濁した変性液を得る。10000 rpmで高速遠心して、上清を分取して変性液のタンパク質濃度を測定する。タンパク質の終濃度が0.3 mg/mlになるように、三段階で、変性液を再生液に加えて、4℃、オーバナイトで連続撹拌(約18 h)する。次いで、順次に10 mol/L、5 mol/LのPB緩衝液及び蒸留水で透析する。透析が終われば、2 mol/Lの酢酸−酢酸ナトリウム(pH 5.0)によりpHを調節して、放置、濾過する。
POROS HS/M 陰イオンクロマトグラフィー:
まず20 mmol/Lの酢酸−酢酸ナトリウム(pH 5.0)によりカラムを平衡化する
↓
30 ml/minの速度でサンプルを入れる
↓
20カラム体積の20 mmol/L酢酸−酢酸ナトリウム(pH 5.0)(雑タンパクを溶出する)
↓
5カラム体積の0.15 mol/L塩化ナトリウム+20 mmol/L酢酸−酢酸ナトリウム(pH 5.0)(雑タンパクを溶出する)
↓
3カラム体積の0.18 mol/L塩化ナトリウム+20 mmol/L酢酸−酢酸ナトリウム(pH 5.0)(雑タンパクを溶出する)
↓
0.25 mol/L塩化ナトリウム+20 mmol/L酢酸−酢酸ナトリウム(pH 5.0)(目的タンパクを溶離する)
↓
1 ml/minの速度でサンプルを入れる
↓
緩衝液E(雑タンパクを溶出する)
↓
緩衝液F(雑タンパクを溶出する)
↓
緩衝液G(溶離目的タンパク)
緩衝液A:100 mmol/L Tris-HCl pH 7.5-10 mmol/L EDTA-100 mmol/L NaCl
緩衝液B:50 mmol/L Tris-HCl pH 7.5-1 mol/L 尿素―10 mmol/L EDTA-0.5% Triton X-100
緩衝液C:50 mmol/L Tris-HCl pH 7.5-2 mol/L 尿素―10 mmol/L EDTA-0.5% Triton X-100
緩衝液D:1 mol/LNaCl―――50 mmol/L Na2HPO4(pH 5.5)
緩衝液E:1 mol/LNaCl―――50 mmol/L Na2HPO4(pH 5.0)
緩衝液F:1 mol/LNaCl―――50 mmol/L Na2HPO4(pH 4.0)
緩衝液G:1 mol/LNaCl―――50 mmol/L Na2HPO4(pH 3.6)
再生液:0.5 mol/Lアルギニン−150 mmol/L Tris塩酸pH 7.5-0.2 mmol/L EDTA
LB培地:1 L
Tryptone 10 g, 酵母エキス5 g、塩化ナトリウム10 g
RM培地:1 L
カゼイン20 g, MgCl 1 mmol/L(0.203 g),Na2HPO4 4 g,KH2PO4 3 g,NaCl 0.5 g,NH4Cl 1 g
精製工程の全ての段階で、タンパク質の含量、タンパク質の純度、比活性及びパイロジェンの検定を行わなければならない。タンパク質原液が得られた後、下表の順番に従い、各種の検定を行った。
《中国生物製品規程》,潘正安、張興輝、段志兵等;中国生物製品標準化委員会;化学工業出版社;2000年。
組換え高率複合インターフェロン注射用凍乾粉針剤の安定性
組換え高率複合インターフェロン凍結乾燥製剤を三バッチで各二種のサンプルに対して、安定性の実験を行った。実験の開始は2000年4月である。
サンプルは四川輝陽生命工程株式会社に提供した。許可番号はそれぞれ:990101-03、990101-05、990102-03、990102-05、990103-03、990103-05である。
本実験にする各サンプルは実験用のため、下表の内容を満たすものである。
2〜8℃でサンプルの考察:考察されるサンプルを2〜8℃の冷蔵庫に置いて、それぞれ第1、3、6、9、12、18、24、30、36月の時点でサンプルを取って、上記の指標を測定し、記録した。
(1)サンプルを37℃に置いて観察する。異なる時点で、サンプルを取って、各指標を検定した。実験の前と比べると、第6ヶ月から有効性が下がる傾向になって、その三バッチのサンプルの有効性の変化は似ていた。他の検定指標は変化がなかった。
(2)サンプルを25℃に置いて観察する。異なる時点で、サンプルを取って、各指標を検定した。実験の前と比べると、9ヶ月以内に有効性の変化が大きくなく、その三バッチのサンプルの変化は似ていた。他の検定指標は変化がなかった。
(3)サンプルを2〜8℃に置いて観察する。異なる時点で、サンプルを取って、各指標を検定した。実験の前と比べると、有効性が安定していた。他の検定指標には変化がなかった。
(実施例3.5)
1. 生産方法
1.1 発酵
LB+M9混合物を培地として用いる。菌種の接種量が1.5 %、32℃で振とうして培養する。OD600=0.4(約3.5時間)になってから、42℃までに温度を上げて、続いて振とうして6時間培養すると、rSIFN-coの発現量が最高レベルに達する。SDS-PAGEにより電気泳動し、ゲルのスキャンにより、rSIFN-coの発現量が総タンパク量の57%に占めることを示す。中国の最高レベルに達する。
遠心で菌体を回収する
↓
生理食塩水で二回洗う
↓
溶菌する緩衝液(50mM Tris−HCl,1mM EDTA,100mM NaCl,1% Triton X−100,1−2 M Urea)を加えて、超音波で20〜30分破菌する
↓
沈殿用緩衝液で真っ白になるまで数回洗う
↓
7Mグアニジン塩酸により変性する
↓
変性液を希釈して再生、オーバナイト
↓
Sephadex G25カラムで塩を脱する
↓
0.1M NaClをCM-Sepharoseに加える
↓
段階で溶出し、活性ピークを採集する
↓
活性ピークの塩を脱した後、HPLC陽性カラムに加える
↓
0.1MNaClにより段階で溶出し、活性ピークを採集し、即ちrSIFN-coの完成品
↓
保護キャリヤー剤及び凍乾賦形剤を加える
↓
凍乾(rSIFN−co)を分ける
HPLCにより精製して、2%人血清アルブミン、1%蔗糖,1%グルコースを加えて、分けて包装し、凍結乾燥して針剤サンプルを得る。国際通用Wish-VVSシステムにより検定し、針剤の活性は全て 4.5×108IUである。《中華人民共和国薬典》の要求に準じて、サンプルに対して、無菌検査とパイロジェン検定を行った結果、陰性であった。静脈注射の要求を満たした。
2.1生物学の特性
(1)LB+M9で菌種を培養する。典型的な大腸菌の菌落の状態で、他の雑菌は検出されない。
(2)スライスに塗って、グラム染色してから、顕微鏡で観察した結果、グラム陰性菌であった。
(3)抗生物質に対する抵抗性は原始の菌種と一致した。
(4)電子顕微鏡で典型的な大腸菌の形態と検定され、またマイコプラズマ、ウィルス様のもの及び他の微生物の汚染が排除された。
(5)生物化学反応は大腸菌の生物学特性と一致する。
(1)インターフェロン発現量(揺る培養)は原始菌種の発現量と相同である。
(2)抗インターフェロン血清により実験を行って、反応することが証明された。
(3)プラスミド鑑定:酵素のサイトは原プラスミドと相同であった。
実例1.2に示された工程により製造された菌種を生産菌種と呼ばれる。
生産菌種から選ばれた菌種を発酵用として用いて、種液と呼ばれる。種液の量、培養時間や最適なOD値は菌種により選択できるが、汚染菌の防止措置が必要である。
菌種継代は無菌室で行うべきである。同一の無菌室で他の菌種の操作を行わない。原始菌種から種液まで同一の培地を使い、普通はLB培地を用いる。
(1)接種する前に発酵室を清潔にする。無菌操作を行って、同一発酵時間内に他の菌の発酵を行わない。
(2)発酵缶及び配管をともに二回清潔にする。それぞれ培地を配置された前後に行う。所定温度まで冷却し、種液を接種する;
(3)培地中の細胞の生長に影響を及ぼすので、抗生物質の使用を避ける。
(4)発酵条件、例えば温度、pH、酸素の溶解、発酵時間等のパラメータに対して、菌種により具体的な条件を規定する。
(1)発酵後、遠心または他の方法で菌体を回収する。用具は清潔に維持する。遠心分離後の廃棄液は殺菌処理しないで排出しない;
(2)回収された菌体は24時間内に破菌する場合には、4〜8℃に置けるが、そうしない場合には-30℃以下の冷凍庫で冷凍するべき、-30℃に保存された菌体は6ヶ月以内は使用できる。
(1)適当な緩衝液で菌体をバラバラにする。物理的、化学的または生物学的の方法により細胞溶解を行って、高速遠心機で沈殿させて、上清液を粗インターフェロンとする。
(2)化学的方法で細胞溶解する場合には、人体に対して有害な化学試薬を使用してはいけない。
(1)精製方法は殆どの非インターフェロン物質を排除できる。精製過程において、人体に対する有毒、有害な物質を加えてはいけない。
(2)抗体により親和クロマトグラフィーを行って精製する場合には、その由来及び純度を説明するべきである。また、その抗体の微量IgGの検定方法を提供するべきである。
(3)精製過程において、特に、パイロジェンを除去することに注意するべきである。また、措置を採用して、容器の汚染により製品にパイロジェンが増加することを防ぐ。
(4)精製濃縮した後、最後に得られる精製インターフェロンは「半完成品原液」となる。純度検定後、早速ヒトアルブミンを最終含量が2%になるように加えて、「加アルブミン半完成品」となり、検定後、-30℃に保存する。使用前に出来るだけ、凍結融解を避ける。「加アルブミン半完成品」は-30℃での保存が半年を超えてはいけない。
(5)保護剤として用いる人アルブミンは相応する製造、検査の規程や要求に満たすべきである。RBSAG検査が陰性、また、モノマー、二量体、多量体の比例について、説明するべきである。
(1)濾過で除菌する:0.22μのメンブレン濾過により除菌する。濾過後、無菌実験を行って、サンプルを取って、インターフェロンの有効性を測定する;
(2)希釈:「加アルブミン半完成品」を無菌の2%アルブミン緩衝液で所要濃度までに希釈する。防腐剤を入れてはいけない。希釈後の「加アルブミン半完成品」はパイロジェン測定を行って、無菌実験が合格した後、凍結乾燥する。
凍結乾燥工程はインターフェロンの活性を損害しないようにする。また、凍結乾燥後の製品に水分を維持する。
rSIFN-coは二種類のタイプに調製できる。一つは注射用剤で、もう一つは外用剤である。その質の基準は異なるので、それぞれ規定される。また、いずれの製品も半完成品と完成品の検定に分けられる。注射用剤の半完成品は精製インターフェロン、加アルブミン半完成品、除菌加アルブミン半完成品を指す。注射用剤の完成品は凍結乾燥製品のみを指す。外用剤インターフェロン半完成品は精製インターフェロンを指す;完成品は分包後の液体または凍結乾燥製品を指す。
外用剤と注射用剤インターフェロンの包装は明確に区別するべきである。
本製品は4℃に保存する。液体製品は凍結保存をしてはいけない。
凍結乾燥製品の有效期限は凍結乾燥日から2年である。液体製品の有效期限は分包の日から6ヶ月である。
rSIFN-coはHBV-DNAの複製及びHBsAgとHBeAgの分泌を抑制する
材料
溶媒及び調製方法:バイアルに1ml生理食塩水を入れる。溶解してから、設定される剤量組の濃度に基づいて、MEM培養液で調製する。現場調整である。
2.2.15細胞の培養:2.2.15細胞がコンフレントになった培養ボトルに0.25%膵酵素を入れて、37℃、3分で消化し、培養液を入れてピペッティングして、1:3で継代培養し、10日でコンフレントになる。
実験結果は表4.1、表4.2、表4.3に示すように:最大の毒なし濃度で2.2.15細胞に入れたサンプルを8日培養し、高率複合インターフェロンの最大の毒なし濃度9.0±0×106IU/mlサンプルはHBeAgに対して平均抑制率が46.0±5.25%(P<0.001)で、IC50が4.54±1.32×106IU/ml、選択指数SIが3.96である。HBsAgに対して平均抑制率が44.8±6.6%,IC50が6.49±0.42×106IU/ml、選択指数SIが2.77である。従って、組換え高率複合インターフェロンはB型肝炎の表面抗原とe抗原を明らかに抑制する活性を有するが、対照群のインターフェロンとINFERGENは上記活性を有しない。臨床病例に於いても、慢性活動性B型肝炎の患者は組換え高率複合インターフェロンを用いて、B型肝炎の表面抗原とe抗原の陽性を低減し、または正常なレベルに回復する。
rSIFN-co製剤
凍結乾燥注射剤の作製
組換え高率複合インターフェロン原液 34.5 μg/ml
PB pH7.0 10 mmol/L
グリシン 0.4 mol/L
組換え高率複合インターフェロン原液 34.5 μg/ml
PB pH7.0 25 mmol/L
塩化ナトリウム 0.1 mol/L
rSIFN-coの急性毒性実験
本実験はマウスの筋肉内に高率複合インターフェロンを一回に150μg/kg(成人のkg体重用量の1000倍と相当する)注射する。動物の毒性反応及び死亡状況を観察する。結果は:注射後24時間内に動物に異常がなく、一部分の動物を殺し、解剖して観察した結果:各主要臓器に異常な変化は認められなかった。他のマウスは2週間内に異常反応はなく、一匹も死亡しなかった。第14日目体重を測定すると、投与群と対照群のマウスの何れの群も体重は増加し、且つ両群の体重の増加値は有意差は認められなかった(P>0.05)。二週間後のマウスにより各主要臓器に異常は認められなかった。
1.1実験動物
成年の健康なマウス40匹、体重18〜22g、メス、オスそれぞれ半分になる。質のコントロール:四川省実験動物コントロールセンター。
1.2実験の薬品
高率複合インターフェロン(rSIFN-co)は四川省生物工程研究センターから提供された。無菌液体,0.15mg/ml,許可番号:981201
注射用生理食塩水により所要濃度に調整して使用した。
40匹のマウスをランダムに2群に分けて、それぞれ生理食塩水の陰性対照群と高率複合インターフェロン群(150μg/kg)である。それぞれマウス一匹ずつ筋肉内に生理食塩水と相応する薬物を注射し、投与容積は何れも0.1ml/10gで、一回投与後、各マウスの急性毒性反応を観察した。投与後24時間に各群の動物を半分殺した(メス、オス各半分)。死体を解剖してマウスの心、肝、脾、肺、腎、副腎、胃、十二指腸など主要臓器に病変があるかどうかを観察した。もし病変が有れば、病理組織学の検査を行った。他の動物を継続して観察した。投与後第14日目、体重を測定した後殺し、死体を解剖して、各マウスの主要臓器に病変があるかどうかを観察した。もし有れば、病理組織学の検査を行った。投与群のマウスの体重変化値と陰性対照組マウスの体重値とを検定して、顕著な差異が有るかどうかを判定した。
以下の結果がある。マウスの筋肉内に高率複合インターフェロンを一回に150μg/kg(人の用量の1000倍と相当する)注射すると、マウスは毒性反応がなく、投与後14日内に、各マウスの摂食、摂水、活動、毛髪、大小便などは異常がない、且つマウスは一匹も死亡しない。投与後24時間にマウスの各臓器を観察して、異常変化がない。ほかのマウスは投与後第14日目に殺され、その死体を解剖したが各主要臓器には異常が認められなかった。且つ投与群と陰性対照群のマウスの体重は何れも増加した、その体重の増加値は陰性対照組と比べて、顕著な差異がない(P>0.05)、結果は表6.1に示す。
本実験の条件において、一回筋肉に高率複合インタフェロンを150μg/kg注射すると、マウスは何れも毒性反応が見られない。従って、高率複合インタフェロンを筋肉に注射することに対して、マウスの最大耐量は150μg/kgを超える。人の用量の1000倍に相当する。
組換え高率複合インターフェロン(rSIFN-co)の臨床効果
本発明の組換え高率複合インターフェロン(rSIFN-co)は主にウィルス性疾患の治療、特に肝炎の治療に用いられる。同時に、EBウィルス、VSV、単純水疱症ウィルス、コロナウィルス、麻疹ウィルス等を抑制できる。WISH細胞/VSVシステムにより抗ウィルスの活性を検定する。それぞれの結果は:国産天然インターフェロンが0.9×108U/mgで、Intron Aが2.0×108IU/mgで、rSIFN-coが9×108IU/mg、その抗ウィルス活性は明らかに前二者より高い。
1 .患者選択の基準:標準1−4はrSIFN-co(9μg)とIFN-α1b (5MU, 50μg)との両処置を効果、標準1−5はrSIFN-co(15μg)で処置した効果である。
1) 年齢18〜65才;
2) HBsAgの持続陽性は少なくとも6ヶ月以上で、HBeAg陽性、 PCR検定でHBV-DNA>105コピー数/ml;
3) ALT>2倍の正常値の上限,
4) インターフェロンの抗HBV治療を受ける事がない;またはlamividineの治療を受けたが、無効または再発者
5) 6ヶ月前に他のインターフェロン(3MUまたは5MU)を用いて、SFDAに規定される治療コース及び剤量で治療したが、無効または再発。
第10回中国ウィルス性肝炎及び肝病学術会議を参考し、ALTのレベルに基づいて、HBV-DNAとHBeAgを測定し、治療効果を三段階に分けた。
部分的応答:ALT 正常レベル、HBV-DNA陰性、あるいはHBeAg陰性
無応答:ALT、HBV-DNA、HbeAgいずれも変化なし
A群:: rSIFN-co(9μg) 治療群
B群:: IFN-α1b (5MU, 50 μg) 治療群
インターフェロン類の副作用は発熱、吐き気、筋肉痛、食欲不振、脱髪、白血球及び血小板の減少などを包含する。IFN-α1bの臨床の最大使用量は毎回5MIUで、通常毎回3MIUを用いる。通常の使用量を用いる時、臨床で約90%の患者はI−II段階(WHOの臨床分類標準)の副作用が現れた。38℃以下の軽い発熱、吐き気、筋肉痛、食欲不振等を包含する。最大用量を用いる時、約50%の患者は投与後一ヶ月時に白血球及び血小板の軽い減少が現れるが、投薬を中止して一週間後、白血球及び血小板は正常に回復し、安全に投薬を続けられた。
1. 患者選択基準:
1)年齢18〜65才;
2)HCV抗体が陽性
3)正常値のALT>1.5倍、且つ6ヶ月以上持続する
応答:ALT正常値、HCV-RNA陰性
部分的な応答:ALT正常値、HCV-RNA変化なし
無応答:ALTと、HCV-RNA変化なし
臨床試験はB型肝炎と同時に行った。46例の患者が一回9μg、皮下投与、毎日24週間処置を受けた。治療後、46名中26名の患者に臨床効果(56.52%)があり、その中の12例はHCV-RNAが陰性(26.08%)となり、26例は肝機能が正常(56.52%)に回復した。
組換え高率複合インターフェロンのスプレー剤
主要活性成分:組換え高率複合インターフェロン
性状:液体、不溶性物質はない。
薬理作用:組換え高率複合インターフェロンは幅広い抗ウィルス活性を有している。その効果は市場で有用とされる他のインターフェロンに比較して5-20倍高い。それは細胞培養でコロナウィルスの増殖を抑制できる。その抗ウィルスのメカニズムは主にインターフェロンと標的細胞表面のインターフェロン受容体と結合することにより、標的細胞内の2'5'−A合成酵素、タンパクキナーゼRなど多種の抗ウィルスタンパクを誘導し、ウィルスタンパク質の合成を阻止し、多種抗ウィルスタンパクを誘発することにより、ウィルスの細胞内での複製を抑制し、NK細胞の活性を増強させ、また他の免疫調節作用により、効率的にウィルスの侵入と感染を抑制する。
急性毒性:全てのマウスは最大投与量(成人の用量の1000倍と相当する)の皮下注射で前例生存していた。LD50を測定できなかった。
適応症:重症急性呼吸器症候群を予防する。
用量と投与法:鼻腔、喉をそれぞ1日三回のスプレー。
不良反応:インターフェロンスプレー剤の不良反応についての報告はまだない。一般には、アレルギーを起すことはない、投与期間中に人によってはたまに軽い刺激及び胃腸反応を起こすが、ほかの顕著な反応がなければ、治療を停止せず、自ら緩和できる。
警告:αIFNや大腸菌の産物に対してアレルギー反応がある患者は使用できない。
注意事項:本産品を初めて使用する前に、空気を排除するために二回スプレーしなければならない。もし混濁した沈殿物質があれば、また期間を超えて失効になれば、使用してはいけない。
児童への使用:まだ不明。
老年患者への使用:まだ不明。
妊婦及び哺乳する女性への使用:禁止
薬物の相互作用:まだ不明。
薬物の過量:この薬を人体に使用する時、一回の用量が150 ug (7.5×107 IU)を超えると、発熱、食欲不振、筋肉痛、悪寒等の発生率が高くなる。それらは重篤な副作用ではない。
規格:1スプレー/パック、20μg(1×107 IU)/3ml、を含む。
貯蔵:4-8℃、遮光の下で保存する、冷凍してはいけない。
有効期間:約一年。
製造企業:四川輝陽生命工程株式会社
住所:四川省成都市玉沙路8号のA座の902室。
SARS関連コロナウィルスに対する新型組換え複合インターフェロンの体外効果
サンプルの提供:四川輝陽生命工程株式会社
実験者:軍事医学科学院微生物流行病の研究所
元の資料保存場所:軍事医学科学院微生物流行病の研究所ファイル保存室
1. 実験材料:
薬品:新型組換え高率複合インターフェロン、各々9μg。四川輝陽生命工程株式会社に提供される。許可番号20020501。
細胞:Vero E6細胞、軍事医学科学院微生物流行病の研究所分子生物学研究室に提供される。
ウィルス:SARSに関連コロナウィルス、BJ-01株、軍事医学科学院微生物流行病の研究所ウイルス室に提供される
細胞の培養液:10%牛胎児血清を含むDMEM培養液。
TCID50のCPE法(細胞毒性効果)測定:Vero E6細胞の100μlがウエル当たり2×104細胞を96穴プレートに播いた。37℃で24時間培養後、Vero E6の単層細胞に、10倍に希釈したSARS関連コロナウィルスを9段階濃度で一濃度に4ウエルずつ播いた。5%CO2のインキュベータ中で37℃で培養した。毎日顕微鏡により細胞病変(CPE)を観察する。細胞の病変が25%以下の場合に+、病変が26-50%の場合に++、病変が51-75%の場合に+++、病変が76-100%の場合に++++である。細胞の病変程度を記録する。Reed-Muench法により、ウィルスの半数感染量を計算した(TCID50)。
ウィルスの毒性:ウィルスのTCID50は10-8であった。
薬物の細胞毒性:新型遺伝子組換え高率複合インターフェロンの細胞毒濃度は18μg/mlである。この濃度で細胞形態は正常対照群と同じであり、病変は現れない。
薬物の抗ウィルス作用:実験の結果は表9-A.1と表9-A.2に示す。
新型遺伝子組換え高率複合インターフェロンは細胞の無毒濃度が18μg/mlである。ウィルス濃度が10-5(1000 TCID50)、10-4(1000 TCID50)と10-3(100000 TCID50)にする時、インターフェロンのIC50はそれぞれが1.27、2.25と4.04μg/ml(表9-A.3)になる。
実験者:趙艶紅、紀暁光、張敏、趙花
資料の保存場所:軍事医学科学院微生物流行病の研究所ファイル保存室
実験の期日:2003年5月12-30日
新型組換え複合インターフェロンとインターフェロン-α2bのSARS関連コロナウィルスの体外での抑制作用の比較
実験単位:軍事医学科学院微生物流行病の研究所
資料の保存場所:軍事医学科学院微生物流行病の研究所ファイル保存室
1.実験材料:
薬品:新型遺伝子組換え高率複合インターフェロン、618μg/ml、四川輝陽生命工程株式会社に提供される;Anfulong(注射用重組インターフェロンα-2b)、天津Hua-li-da生物工程株式会社製、30μg/支(300万IU/支)、許可番号20030105。
細胞: Vero E6細胞、軍事医学科学院微生物流行病の研究所分子生物学研究室に提供される。;
ウィルス:SARS関連コロナウィルス、BJ-01株、軍事医学科学院微生物流行病の研究所ウィルス室に提供される;
実験条件:ウィルスの測定は生物安全性の三級実験室で行われた。
CPE法によってTCID50を測定された:Vero E6細胞を96ウェルプレートに播く、100μl/ウェル、細胞数2×104個/ウェル、37℃で24時間培養した。細胞が単層になってから、10倍希釈の9段階の濃度のウィルス培養液を加えて、各濃度を4ウェルずつ入れ、細胞対照群を設定した。37℃で、5%CO2のインキュベータ中で培養した。毎日顕微鏡により細胞病変(CPE)を観察した。細胞の病変が25%以下の場合に+、病変が26-50%の場合に++、病変が51-75%の場合に+++、病変が76-100%の場合に++++とした。細胞の病変程度を記録する。TCID50はReed-Muench法により計算した。
ウィルスのTCID50:ウィルスのTCID50は10-7であった。
体外の実験から、新型遺伝子組換え高率複合インターフェロンと注射用組換えインターフェロンα-2bは何れもVero E6細胞に対して保護作用を有し、抗ウィルス活性を有する。三回の実験で新型遺伝子組換え高率複合インターフェロンは10000、1000と100の濃度で TCID50 SARS関連ウィルスに対する半数抑制濃度(IC50)を測定したけっか、それぞれ0.92、0.18と0.10 μg/mlであり、治療指数は151.28、773.32と1391.80であった。;注射用組換えインターフェロンα-2bは10000、1000と100 の濃度でTCID50 SARS関連ウィルスに対して半数抑制濃度(IC50)を測定した結果、それぞれ4.75、1.16と0.28 μg/mlであり、治療指数は3.62、14.78と61.36であった。
すでに3万部のrSIFN-coスプレー剤を四川省の看護婦、医者及び高度のリスクのある人々に用いられた。結果は四川省の看護婦及び医者は一人もSARSを感染しなかった。
実験者:趙艶紅、紀暁光、張敏、趙京花
実験の期日:2003年7月1-30日
B型肝炎ウィルスの遺伝子の発現に対する異なるインターフェロンの抑制効果の比較
B型肝炎ウィルス(HBV)は転写活性化されたタンパク質の共通配列を有する。このタンパク質の結合活性はインターフェロンで調節される。HBVを形質導入された肝細胞はインターフェロンによりHBV遺伝子の発現が抑制される。本研究の目的は異なるインターフェロンによりHBV転写に対する影響を調べる。HBVのエンヘンサーEnH I、EnH IIとコアプロモーターに調節される蛍のルシフェラーゼ遺伝子を含むリポータープラスミド(reportor plasmid)により、一時的に人肝癌細胞に形質導入して、三種のインターフェロンの転写活性に対する影響を調べた。
1.インターフェロン:IFN-con1(INFERGEN)、IFN-Hui−Yang(rSIFN-co)及び(IFN-β1b)。
異なるインターフェロンにより溶菌産物のルシフェラーゼ活性の発現
rSIFN-coを用いて、その副作用と体温変化を調べる。
従来のインターフェロンは副作用が多く、よく見られるのは、例えば吐き気、筋肉痛、食欲不振、脱髪、白血球や血小板の減少などである。
受験者は2組に分けられる。A組の11名受験者は9μgINFERGENを注射する、B組の10名受験者は9μgrSIFN-coを注射する。注射後、2組の受検者は全て48時間の臨床観察を行う。注射1時間後、第一回観察結果を記録して、そして2時間ごとに一回の観察を記録した。
rSIFN-coを注射する受験者の副作用がより小さくて、その副作用は一般的なインフルエンザ様症状で、例えば、頭痛、虚弱、悪寒、筋肉痛、発汗、関節痛。INFERGENを注射した受検者の副作用は明らかにrSIFN-coを注射した受検者より多かった。
(実施例12)
rSIFN-coの結晶研究。系統的な模索や実験を経て、二種類の結晶が得られた(図10−12参照)。
1.結晶成長
rSIFN-coタンパク質を純水(H2O)で、終濃度3mg/mlになるように溶解する。結晶化の条件はHampton社のHampton Research Crystal Screen I and IIを使用した。蒸気拡散法を用いて、溶液500μl、液滴1μlタンパク+1μl液、温度293K。表12.1に示すように、二種類の異なるタイプの小さい結晶が得られた。
結晶 IはX線回折データの採集と初歩的な結晶学の解析を行って、結晶学のパラメータの測定が行われた。解析データの採集は常温で行って、結晶I(条件I)を薄い壁の石英管に封入した。BrukerAXS Smart CCD探測機を用いて、Nonius FR591のX線発生器より産生されるCuKα放射線(λ=1.5418Å)を光源として使用した。光源の出力は2000KW(40Kv×50mA)、波長1.00Å、感光時間60秒、Δφ=2o、結晶と探測機の間の距離は50mmである。データ処理はBruker社のProteum procedure packageにより行われる。結晶の回折チャート(局部)は図12に示す。処理結果は表12.2に示す。
Claims (16)
- 被験体においてウイルス疾患を処置するための組成物であって、
前記組成物は、図1記載のポリヌクレオチド配列(SEQ ID No.1)を大腸菌に導入する工程によって得られる組換えインターフェロンを含み、
前記ウイルス疾患が、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、または他の型の肝炎であることを特徴とする組成物。 - 被験体においてウイルス疾患を処置するための組成物であって、
前記組成物は、図1記載のポリヌクレオチド配列(SEQ ID No.1)を大腸菌に導入する工程によって得られる組換えインターフェロンを含み、
前記ウイルス疾患が、EBウイルス、サイトメガロウイルス、単純性水泡症ウイルス、他の水泡症ウイルス、パポーバウイルス、ポックスウイルス、ピコルナウイルス、アデノウイルス、ライノウイルス、I型ヒトT細胞白血病ウイルス、II型ヒトT細胞白血病ウイルス、III型ヒトT細胞白血病ウイルス、またはインフルエンザウイルスによって引き起こされることを特徴とする組成物。 - 被験体において腫瘍を処置するための組成物であって、前記組成物は、図1記載のポリヌクレオチド配列(SEQ ID No.1)を大腸菌に導入する工程によって得られる組換えインターフェロンを含むことを特徴とする組成物。
- 前記腫瘍が、非小細胞肺癌または小細胞肺癌であることを特徴とする請求項3に記載の組成物。
- 前記腫瘍が、基底細胞癌、悪性黒色腫、肝癌、腎細胞癌、鼻咽頭癌、前立腺癌、胃癌、腹部癌、食道癌、直腸癌、膵癌、乳腺癌、卵巣癌、表在性膀胱癌、血管腫、子宮頚癌、神経膠腫、急性白血病、慢性白血病、慢性骨髄白血病、有毛細胞白血病、リンパ節腫、多発性骨髄腫、赤血球増加症、またはカポジ肉腫であることを特徴とする請求項3に記載の組成物。
- 前記インターフェロンが、経口投与を介して、静脈注射を介して、筋肉注射を介して、腹膜注射を介して、皮下注射を介して、鼻腔内投与を介して、粘膜投与を介して、または吸入を介して、投与されることを特徴とする請求項1乃至5のいずれか1つに記載の組成物。
- 前記組換えインターフェロンが、錠剤、カプセル、経口で服用する剤、貼剤、注射剤、スプレー剤、坐剤、溶液製剤として調製されることを特徴とする請求項1乃至5のいずれか1つに記載の組成物。
- 適切なキャリヤーも含有する、請求項1乃至7のいずれか1つに記載の組成物。
- 被験体においてウイルス疾患を処置するための薬物を製造するための組換えインターフェロンの使用であって、
前記組換えインターフェロンは、図1記載のポリヌクレオチド配列(SEQ ID No.1)を大腸菌に導入する工程によって得られ、
前記ウイルス疾患が、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、または他の型の肝炎であることを特徴とする使用。 - 被験体においてウイルス疾患を処置するための薬物を製造するための組換えインターフェロンの使用であって、
前記組換えインターフェロンは、図1記載のポリヌクレオチド配列(SEQ ID No.1)を大腸菌に導入する工程によって得られ、
前記ウイルス疾患が、EBウイルス、サイトメガロウイルス、単純性水泡症ウイルス、他の水泡症ウイルス、パポーバウイルス、ポックスウイルス、ピコルナウイルス、アデノウイルス、ライノウイルス、I型ヒトT細胞白血病ウイルス、II型ヒトT細胞白血病ウイルス、III型ヒトT細胞白血病ウイルス、またはインフルエンザウイルスによって引き起こされることを特徴とする使用。 - 前記インターフェロンが、経口投与を介して、静脈注射を介して、筋肉注射を介して、腹膜注射を介して、皮下注射を介して、鼻腔内投与を介して、粘膜投与を介して、または吸入を介して、投与されることを特徴とする請求項9又は10に記載の使用。
- 前記組換えインターフェロンが、錠剤、カプセル、経口で服用する剤、貼剤、注射剤、スプレー剤、坐剤、溶液製剤として調製されることを特徴とする請求項9又は10に記載の使用。
- 被験体において腫瘍を処置するための薬物を製造するための組換えインターフェロンの使用であって、前記組換えインターフェロンは、図1記載のポリヌクレオチド配列(SEQ ID No.1)を大腸菌に導入する工程によって得られることを特徴とする使用。
- 前記腫瘍が、基底細胞癌、悪性黒色腫、肝癌、腎細胞癌、鼻咽頭癌、前立腺癌、胃癌、腹部癌、食道癌、直腸癌、膵癌、乳腺癌、卵巣癌、表在性膀胱癌、血管腫、子宮頚癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、神経膠腫、急性白血病、慢性白血病、慢性骨髄白血病、有毛細胞白血病、リンパ節腫、多発性骨髄腫、赤血球増加症、またはカポジ肉腫であることを特徴とする請求項13に記載の使用。
- 前記インターフェロンが、経口投与を介して、静脈注射を介して、筋肉注射を介して、腹膜注射を介して、皮下注射を介して、鼻腔内投与を介して、粘膜投与を介して、または吸入を介して、投与されることを特徴とする請求項13又は14に記載の使用。
- 前記組換えインターフェロンが、錠剤、カプセル、経口で服用する剤、貼剤、注射剤、スプレー剤、坐剤、溶液製剤として調製されることを特徴とする請求項13又は14に記載の使用。
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