CN102101886A - 构象改变的重组干扰素晶体、其三维结构及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种重组干扰素晶体，其具有(i)与人共有干扰素相同的氨基酸序列，以及(ii)与IFN-α2b相比改变了的三维结构。本发明的干扰素具有增强的生物活性。本发明还提供了一种可用于药物筛选和/或药物设计的结构模型。

Description

构象改变的重组干扰素晶体、其三维结构及应用

技术领域

本发明主要涉及构象改变的重组干扰素晶体、其结晶方法、其三维结构及所述晶体和三维结构的应用。

背景技术

干扰素(IFN)是一种由多种细胞产生的可溶性蛋白质，其具有多种重要的生物功能，包括抗病毒、抗肿瘤和免疫调节功能。根据生产细胞类型、受体、生物活性等的不同，干扰素可分为I型、II型和III型干扰素。I型干扰素主要由病毒及合成的双链RNA所诱导，因此也称为抗病毒干扰素。现有三种类型的I型干扰素：IFNα、INFβ和IFNω。II型干扰素也称为免疫干扰素或IFNγ，由T细胞产生，并且在体内是一种重要的免疫调节因子。III型干扰素则由IFN-λ分子构成。

如大量的相关专利和公开文献所显示的，近年来，世界上许多公司都在参与干扰素的研究。举例来说，美国专利第4,695,623号和第4,897,471号公开了新型人干扰素多肽，其氨基酸序列包含存在于天然α-干扰素多肽中的共同或占优势的氨基酸。该新型干扰素多肽被命名为IFN-con(共有干扰素α)。所公开的氨基酸序列被命名为IFN-con1、IFN-con2和IFN-con3。还公开了编码IFN-cons的基因以及在大肠杆菌中的基因表达。研究表明与白细胞干扰素或其它I型干扰素相比，该重组IFN-con具有更高的体外抗病毒、抗增殖及天然杀伤细胞活性。

美国专利第5,372,808号公开了人IFN-con在疾病治疗中的用途。与之前临床审批通过的α-干扰素如先灵葆雅公司生产的干扰能

(IFN-α2b，SGP)相比，重组人共有干扰素显示具有更低的副作用。1997年底，美国食品与药品管理局(FDA)批准了美国安进(Amgen)公司生产的人共有干扰素作为丙型肝炎临床治疗用药，商品名为干复津(INFERGEN

，interferon alfacon-1)。

美国专利第7,364,724号和中国专利公开号CN1740197均公开了同一种功效增强、副作用更小且能够大剂量使用的重组干扰素。所述重组干扰素具有与干复津相同的氨基酸序列，但其空间构象和生物效力发生了变化。因此，获得所述具有改变的结构和功能的重组干扰素晶体，并确定其三维结构、建立模型并通过利用所述结构和模型来开展药物设计以及改良已有干扰素的效力是非常有意义的。

发明内容

本发明的目的在于提供上述美国专利第7,364,724号和中国专利公开号CN1740197公开的重组干扰素的晶体，以及具有所述重组干扰素的三维结构的蛋白质空间结构模型。

在上述重组干扰素的三维结构中，所述重组干扰素的每个单体都由6段α螺旋、1段3₁₀螺旋及其间的连接肽段构成。所述6段α螺旋对应的氨基酸残基位置分别为13-20、50-68、70-76、79-100、114-133和138-160；所述的1段3₁₀螺旋对应的氨基酸残基位置为40-43。单体结构的折叠方式属于螺旋状细胞因子型(helical cytokine)，特征在于：在将所述重组干扰素的α碳原子(Cα)骨架与IFN-α2b蛋白的α碳原子骨架以最小二乘法方式进行叠合后，该重组干扰素在第25-33位残基上的各α碳原子与所述IFN-α2b蛋白在对应位残基上的各α碳原子的位置均方根偏差(location root-mean-square deviation)为3.63埃。

优选的是，所述重组干扰素与所述IFN-α2b蛋白在第25位残基上的α碳原子的位置均方根偏差为3.291埃；在第26位残基上的α碳原子的位置均方根偏差为4.779埃；在第27位残基上的α碳原子的位置均方根偏差为5.090埃；在第28位残基上的α碳原子的位置均方根偏差为3.588埃；在第29位残基上的α碳原子的位置均方根偏差为2.567埃；在第30位残基上的α碳原子的位置均方根偏差为2.437埃；在第31位残基上的α碳原子的位置均方根偏差为3.526埃；在第32位残基上的α碳原子的位置均方根偏差为4.820埃；在第33位残基上的α碳原子的位置均方根偏差为2.756埃。

还优选的是，所述重组干扰素在第44-52位残基上的各α碳原子与所述IFN-α2b蛋白在对应位残基上的各α碳原子的位置均方根偏差为2.90埃。其中，所述重组干扰素与所述IFN-α2b蛋白在第44位残基上的α碳原子的位置均方根偏差为1.614埃，在第45位残基上的α碳原子的位置均方根偏差为1.383埃，在第46位残基上的α碳原子的位置均方根偏差为2.735埃，在第47位残基上的α碳原子的位置均方根偏差为2.709埃，在第48位残基上的α碳原子的位置均方根偏差为5.018埃，在第49位残基上的α碳原子的位置均方根偏差为4.140埃，在第50位残基上的α碳原子的位置均方根偏差为3.809埃，在第51位残基上的α碳原子的位置均方根偏差为2.970埃，在第52位残基上的α碳原子的位置均方根偏差为0.881埃(上述所列的“位置均方根偏差”均为坐标位置的均方根偏差)。

在一个实施方案中，本发明提供了一种包含本发明的重组干扰素的三维结构的蛋白质空间结构模型。根据基于结构的药物设计方法，该蛋白质空间结构模型可用来开发新型药物并对已知干扰素进行改良，使得干扰素的功效增强、副作用更低并可大剂量使用。

使用基于结构的计算机药物设计方法，本发明的蛋白质空间结构模型可用来开发新型药物并对已知药物如已知干扰素进行改良。基于结构的计算机药物设计是指用计算机模拟来预测一种肽、多肽、蛋白质的构象，或者肽或多肽与一种治疗用化合物之间构象的相互作用。计算机药物设计方法在Maulik等人的1997年出版的《分子生物技术》(MolecularBiotechnology)中有所披露。其中披露了定向设计方法、随机设计方法以及基于网格(grid-based)方法。因此，根据本发明公开的三维结构蛋白质空间结构模型，本领域的技术人员能够对已知干扰素进行改良或者开发出抗病毒活性更强、副作用更低的新型药物。

本发明的重组干扰素在结晶之前的纯化产物是根据美国专利第7,364,724号说明书实施例1和2和/或中国专利公开号CN1740197说明书中第11-17页记载的方法制得的。在一个实施方案中，本发明的重组干扰素的氨基酸序列以及编码所述氨基酸的核苷酸序列分别如下所示：

M  C  D  L  P  Q  T  H  S  L  G  N  R  R  A  L  I  L  L  A

1  ATGTGCGACC TGCCGCAGAC CCACTCCCTG GGTAACCGTC GTGCTCTGAT CCTGCTGGCT

TACACGCTGG ACGGCGTCTG GGTGAGGGAC CCATTGGCAG CACGAGACTA GGACGACCGA

Q  M  R  R  I  S  P  F  S  C  L  K  D  R  H  D  F  G  F  P

61 CAGATGCGTC GTATCTCCCC GTTCTCCTGC CTGAAAGACC GTCACGACTT CGGTTTCCCG

GTCTACGCAG CATAGAGGGG CAAGAGGACG GACTTTCTGG CAGTGCTGAA GCCAAAGGGC

Q  E  E  F  D  G  N  Q  F  Q  K  A  Q  A  I  S  V  L  H  E

121 CAGGAAGAAT TCGACGGTAA CCAGTTCCAG AAAGCTCAGG CTATCTCCGT TCTGCACGAA

GTCCTTCTTA AGCTGCCATT GGTCAAGGTC TTTCGAGTCC GATAGAGGCA AGACGTGCTT

M  I  Q  Q  T  F  N  L  F  S  T  K  D  S  S  A  A  W  D  E

181 ATGATCCAGC AGACCTTCAA CCTGTTCTCC ACCAAAGACT CCTCCGCTGC TTGGGACGAA

TACTAGGTCG TCTGGAAGTT GGACAAGAGG TGGTTTCTGA GGAGGCGACG AACCCTGCTT

S  L  L  E  K  F  Y  T  E  L  Y  Q  Q  L  N  D  L  E  A  C

241 TCCCTGCTGG AAAAATTCTA CACCGAACTG TACCAGCAGC TGAACGACCT GGAAGCTTGC

AGGGACGACC TTTTTAAGAT GTGGCTTGAC ATGGTCGTCG ACTTGCTGGA CCTTCGAACG

V  I  Q  E  V  G  V  E  E  T  P  L  M  N  V  D  S  I  L  A

301 GTTATCCAGG AAGTTGGTGT TGAAGAAACC CCGCTGATGA ACGTTGACTC CATCCTGGCT

CAATAGGTCC TTCAACCACA ACTTCTTTGG GGCGACTACT TGCAACTGAG GTAGGACCGA

V  K  K  Y  F  Q  R  I  T  L  Y  L  T  E  K  K  Y  S  P  C

361 GTTAAAAAAT ACTTCCAGCG TATCACCCTG TACCTGACCG AAAAAAAATA CTCCCCGTGC

CAATTTTTTA TGAAGGTCGC ATAGTGGGAC ATGGACTGGC TTTTTTTTAT GAGGGGCACG

A  W  E  V  V  R  A  E  I  M  R  S  F  S  L  S  T  N  L  Q

421 GCTTGGGAAG TTGTTCGTGC TGAAATCATG CGTTCCTTCT CCCTGTCCAC CAACCTGCAG

CGAACCCTTC AACAAGCACG ACTTTAGTAC GCAAGGAAGA GGGACAGGTG GTGGACGTC

E  R  L  R  R  K  E  (SEQ ID NO：1)

481 GAACGTCTGC GTCGTAAAGA ATAA (SEQ ID NO：2)

CTTGCAGACG CAGCATTTCT TATT (SEQ ID NO：3)

此外，本发明的重组干扰素在肌肉注射给体重指数(BMI)为20-27范围内的人体后，以采血时间对受试人体血清中的2-5A寡聚核苷酸酶浓度作图，所得曲线下的峰面积显著大于在同一条件下注射干复津所获得的曲线下的峰面积。所述曲线一般表现为双峰，虽然该双峰的形态、高度、双峰之间的峰距可能因人的不同而有所差异。有时，所述双峰之间的峰距和两峰的高度差异并不特别显著，甚至其形态接近于梯形峰，但是，在肌肉注射给体重指数为20-27范围内的人体后，以采血时间对受试人体血清中的2-5A寡聚核苷酸酶浓度作图，所得曲线下的峰面积显著大于在同一条件下注射干复津所获得的曲线下的峰面积。此外，本发明的重组干扰素在注射给人体后其在人体内的半衰期比干复津在人体内的半衰期更长。

已进行的实验的结果还证实，本发明的重组干扰素具有比目前投入临床使用的其它任何干扰素(包括干复津)更强的效力。例如，对于乙型肝炎病毒而言，本发明的重组干扰素不仅能抑制乙型肝炎病毒的DNA复制而且还能抑制乙肝病毒表面抗原(HBsAg)和e抗原(HBeAg)的分泌，抑制乙肝病毒核心抗原(HBcAg)DNA复制的效力与干复津相比提高约一倍。本发明的重组干扰素的体外药效学显示它不仅能抑制乙型肝炎病毒的DNA复制，而且能抑制表面抗原和e抗原的分泌，其细胞学毒性仅为临床现用干扰素的1/8，但抗病毒活性却是临床现用干扰素的5-20倍，同时在人体内具有更高更广谱更长时间的生物学应答反应。

此外，无论是就病毒性疾病的预防还是就肿瘤的治疗而言，所述干扰素都具有与其它干扰素相比(包括干复津)，更高的抗病毒活性和更低的副作用。例如，本发明的重组干扰素不但具有强于临床现用干扰素20倍的抗病毒活性，以及明显强于重组人α型干扰素的抗肿瘤增生作用；还极大地降低了毒副作用并可安全的大剂量使用(每剂用量可＞1000万IU)，使需要大剂量用药干扰素的部分病毒性疾病或肿瘤的成功治疗成为可能。

在一个方面，本发明提供了一种鉴定能与本发明的重组干扰素相结合的潜在配体的方法。在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：将在此公开的晶体暴露于一种或多种包含潜在配体的样品，并确定是否形成配体-干扰素分子复合物。

在另一方面，本发明提供了一种获取用于设计能与干扰素形成分子复合物的潜在配体的结构信息的方法。在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：将在此公开的晶体暴露于潜在配体库，并确定是否形成配体-干扰素分子复合物。

在另一方面，本发明提供了一种非配体化的分子；所述分子具有在此公开的干扰素的至少一部分。例如，所述非配体化结合的分子可包含SEQ IDNO：4或SEQ ID NO：5所示序列(分别为在此公开的干扰素的AB环和BC环的序列)。

在另一方面，本发明提供了一种可伸缩(scalable)的由点组成的三维构象，所述点的至少一部分来源于在此披露的结构坐标，或来源于包含本发明的重组干扰素的AB环或BC环的肽。在一个实施方案中，所述可伸缩的由点组成的三维构象展示为全息图、立体图、模型或者计算机显示图片。

在另一方面，本发明提供了一种获取关于未知结构分子或分子复合物的结构信息的方法。在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：结晶所述分子或分子复合物；由所述结晶的分子或分子复合物产生X射线衍射图；以及将所述的X射线衍射图应用于在此公开的干扰素的至少一部分的结构坐标，从而产生所述未知结构分子或分子复合物的至少一部分的三维电子密度图。

在另一方面，本发明提供了一种干扰素同系物的模建方法。在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：将推定的干扰素同系物的氨基酸序列与本发明的重组干扰素的氨基酸序列进行比对并将推定的干扰素同系物的氨基酸序列掺入由在此披露的结构坐标形成的干扰素模型中，从而生成干扰素同系物的初级模型；对所述初级模型进行能量最小化以生成能量最小化模型；重建所述能量最小化模型中违背立体化学约束的区域，从而生成干扰素同系物的最终模型。

在另一方面，本发明提供了一种计算机辅助的用于鉴定、设计或制备潜在干扰素活性调节剂的方法。在一个实施方案中，所述方法包括筛选化学或者生物实体库。

本领域技术人员可应用结晶学手段来筛选并鉴定可能成为干扰素配体的化学或生物实体(见美国专利第6,297,021号)。举例来说，一种优选的方法可包括以下步骤：获得非配体化的干扰素晶体；将所述非配体化的干扰素晶体暴露于一种或多种包含潜在干扰素配体的测试样品；和确定是否形成配体-干扰素分子复合物。可通过多种方法将所述干扰素暴露于潜在配体，所述方法包括但不限于，将干扰素晶体浸泡于含有一种或多种潜在配体的溶液中，或者，在一种或多种潜在配体的存在下共结晶干扰素。

来自所述配体-干扰素复合物的结构信息可优选地用于设计新配体，该新配体较已知配体结合得更紧密、结合得更特异，具有期望的生物活性特性，具有更高的安全性，甚至具有以上优点的结合。举例来说，计算出的电子密度图直接揭示了结合事件，鉴定了结合的化学或者生物实体，并且提供了配体-干扰素复合物的详细三维结构。一旦命中(hit)，就可通过传统的筛选方法找出该命中的一系列具有更紧密结合或期望的生物活性的类似物或衍生物。任选地，可将配体-干扰素迭代暴露于额外的潜在配体，使得两次或更多次命中能优选地结合在一起以鉴定或设计更具效力的配体。

X-射线结晶学分析

在此公开的干扰素的每一个组成氨基酸都通过一组结构坐标得到定义。术语“结构坐标”指由数学方程式导出的笛卡儿坐标，该数学方程式与X-射线单色光通过以晶体形式存在的本发明的干扰素的原子(散射中心)衍射获得的图样相关。衍射数据用于计算晶体重复单元的电子密度图。然后，电子密度图用于建立干扰素蛋白或蛋白/配体复合物的单个原子的位置。

通过数学方式操作所述干扰素或者干扰素/配体结构坐标，还可产生轻微的结构坐标改变。举例来说，在此公开的结构坐标可通过如下手段进行操作：结构坐标的结晶学置换、结构坐标的分段、结构坐标集合的整体加减、结构坐标的翻转，或上述手段的任意组合。而由于氨基酸突变、添加、取代和/或缺失或在任何组成部分中的其他改变而导致的晶体结构的改变，也可引起结构坐标的变化。在个体坐标中这样的轻微变化对总体形状影响不大。如果与原始坐标相比这样的改变处于可接受的标准误差之内，则所得到的三维形状被认为是结构等价的。

应当指出本发明干扰素的个体结构坐标中的轻微变化预计不会明显改变上述实体如可与干扰素或其部分(如上述AB或BC环)结合的配体的特性。在上下文中，短语“与......结合”指配体或其部分与干扰素分子或其部分之间相邻近的情况。这样的结合可以是非共价的，其中这样的相邻近在能量上受益于氢键、范德华力或静电相互作用；所述结合也可以是共价的。因此，作为实例，与干扰素的结合口袋或结合区结合的配体也应预期能结合结构等价的结合口袋或结合区，或与之相互作用。

对于本发明而言，对于任何分子或分子复合物或其任意部分，当叠合到在此描述的相关骨架原子上，具有小于约0.65埃的保守残基骨架原子(如N、Cα、C、O)均方根偏差时，被认为是“结构等价的”。换言之，这两个分子的这些部位的晶体结构在可接受的误差范围内是基本上相同的。特别优选的结构等价的分子或者分子复合物为具有如下限定的分子或者分子复合物：在此公开的结构坐标的完整集合±小于约0.65埃的来自于那些氨基酸的保守骨架原子的均方根偏差。更优选地，所述均方根偏差最多约0.5埃，还更优选最多约0.35埃。本发明的其他实施方案包括具有如下限定的分子复合物：在此公开的AB或BC环的结构坐标±小于约0.65埃的均方根偏差，所述均方根偏差优选最多约0.5埃，还更优选最多约0.35埃。

术语“均方根偏差”指偏差的平方的算术平均值的方根，其用于表示与趋势或对象的偏差或变化。在一个实施方案中，所述“均方根偏差”规定了一种蛋白质骨架相对于如在此描述的结构坐标所限定的干扰素骨架或其部分的变化。

X-射线结构坐标定义了空间中点的独特构象。本领域技术人员应当理解蛋白、或蛋白/配体复合物、或它们的一部分的结构坐标定义了一系列相应的点；而这些点又继而定义了三维构象。如果坐标之间的距离和角度保持基本上相同，则相似或相同的构象可为一组完全不同的坐标所定义。此外，只要保持角度基本上相同，可伸缩的点构象就可通过在坐标之间增加或减少距离来定义。

各种计算分析可用于确定分子或其部分与在此公开的干扰素或其部分是否是根据三维结构定义的“结构等价的”。举例来说，可通过各种计算分析进行不同结构、相同结构的不同构象、或相同结构的不同部分之间的比较。在一个实施方案中，所述分析可包括以下四个步骤：(1)加载需要比较的结构；(2)在这些结构中定义原子等价性；(3)执行拟合操作；和(4)分析结果。

结构同源的分子

在此公开的结构坐标可用于帮助获得关于其他结晶分子或分子复合物的结构信息。本发明的方法可以用于确定与在此公开的干扰素具有一个或多个相似结构特征的分子或者分子复合物的三维结构的至少一部分。所述的分子在此称为“结构同源的”。相似的结构特征可包括例如氨基酸同一性区域、保守的活性位点或结合位点基序、以及相似排列的二级结构元件(例如，α螺旋和β折叠)。在另一个实施方案中，通过比对两条氨基酸序列的残基以优化其序列长度上相同氨基酸的个数来确定结构同源性；在进行比对过程中，允许再这两条序列中的一条或两条中存在空位，以优化相同氨基酸的个数，但是，这些氨基酸必须在其各自序列中保持固有顺序。优选地，结构同源的分子是一种具有与SEQ ID NO：1至少65％同一性的氨基酸序列的蛋白质。更优选地，与本发明的干扰素结构同源的蛋白质包含与SEQ ID NO：1的类似部分具有至少80％氨基酸序列同一性的至少50个氨基酸残基的连续区段。用于生成结构同源分子或分子复合物的结构信息的方法在本领域中是公知的。

在此公开的结构坐标系还可用于解析相关干扰素、干扰素突变体或与各种配体共复合的干扰素同系物的晶体结构。该应用使确定配体和干扰素(如候选的干扰素改性剂和干扰素)之间相互作用的最佳位点得以可能。本方法还适用于鉴定分子的多个结合位点中用于修饰的潜在位点。这一信息的获得为确定最有效的结合相互作用(如在干扰素及其配体之间增强的疏水相互作用)提供了额外的途径。

同源模建

通过同源模建，可构建或优化未被结晶的干扰素同系物的计算机模型。首先，通过序列比对、二级结构预测、结构库筛选或这些技术的任意组合，创建出于扰素同系物的初级模型。计算软件可用于实施所述的序列比对和二级结构预测。诸如在插入或缺少周围形成的结构碎片之类的结构不连贯可通过筛选具有期望长度和合适构象的肽结构库从而模建获得。若所述干扰素同系物已经结晶，则可通过本领域已知技术使用最终的同源模型来解析该同系物的晶体结构。其次，让所述初级模型能量最小化以生成能量最小化模型。该能量最小化模型可包含违背立体化学约束的区域，在这种情况下，可使用本领域已知技术对这些区域重新模建以获得最终的同源模型。

合理药物设计

计算机技术可用于筛选、鉴定、选择和/或设计能与干扰素或结构同源的分子结合的化学实体或配体。在此公开的干扰素的结构坐标的信息使得具有与在此公开的干扰素的构象互补形状的合成化合物和/或其他分子的设计和/或鉴定得以可能。具体而言，计算机技术可用于鉴定或设计与干扰素或其部分(如AB或BC环)结合的化学实体或配体，例如改性剂、激动剂和拮抗剂等。潜在的改性剂可结合干扰素的活性位点或其部分，或干扰之，并可以是竞争性、非竞争性或无竞争性的抑制剂；或通过结合两个单体之间的界面，从而干扰二聚化。一旦针对生物活性进行鉴定或筛选，这些抑制剂/激动剂/拮抗剂就可在治疗上或预防上用于阻断或增强干扰素活性。还可通过计算机技术获得干扰素结合与干扰之的配体类似物的结构-活性数据。

当在本文中使用时，术语“化学实体”指化合物、两种或更多种化合物的复合物、及所述化合物或复合物的片段。被确定能与本发明的干扰素相结合的化学实体就是潜在的药物候选物。因此，如在此所鉴定的本发明的干扰素或结构同源分子或其部分的结果的三维结构图示可有利地用于药物研发。通过本领域可获得的多种计算机方法和技术中某一种，所述化学实体的结构坐标系可用于生成三维图像，该三维图像又可通过计算机与所述干扰素或结构同源分子的三维图像进行拟合。

本发明的药物设计方法的一个实施方案包括评估已知化学实体或配体与所述干扰素或其结构同源分子的潜在结合。因此，所述药物设计方法还包括通过计算机来评估所选择的化学实体或配体与本文所列的任何一种分子或分子复合物的潜在结合。在另一个实施方案中，所述药物设计方法包括与本发明干扰素、其同系物或它们的部分结合的化学实体或配体的计算机辅助设计。化学实体或配体可以步进方式进行设计，一次一条片段，或可作为整体进行设计或“从头(de novo)”设计。

在一个实施方案中，本发明提供了一种包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的重组干扰素的晶体，其中该晶体的空间群为P3₁21，在一个不对称单位中包含2个分子，以及单晶胞参数为：a＝b＝77.92埃，c＝125.935埃，α＝β＝90°，γ＝120°。

在一个实施方案中，将所述重组干扰素的α碳原子骨架与IFN-α2b的α碳原子骨架以最小二乘法方式进行叠合后，该重组干扰素在对应于IFNα2b蛋白质分子中第25-33位残基上的各α碳原子与IFN-α2b蛋白质分子在对应位残基上的α碳原子均方根偏差为3.63埃。更具体来说，与IFNα2b对应位残基相比，所述重组干扰素在第25-33位残基上的α碳原子偏差依次分别是3.291、4.779、5.090、3.588、2.567、2.437、3.526、4.820和2.756埃。

在另一个实施方案中，将所述重组干扰素的α碳原子骨架与IFN-α2b的α碳原子骨架以最小二乘法方式进行叠合后，该重组干扰素在对应于IFNα2b蛋白质分子中第44-52位残基上的各α碳原子与IFNα2b蛋白质分子在对应位残基上的α碳原子均方根偏差为2.90埃。更具体来说，与IFNα2b对应位残基相比，所述重组干扰素在第44-52位残基上的α碳原子偏差依次分别是1.614、1.383、2.735、2.709、5.018、4.140、3.809、2.970和0.881埃。

在一个实施方案中，本发明的重组干扰素晶体进一步包含共价或非共价结合的金属离子。在另一个实施方案中，本发明还提供了一种包含在此公开的重组干扰素晶体的组合物。

本发明还提供了包含在此公开的序列的肽，或其衍生物、活性部分、类似物、变体或模拟物，及其用途。在一个实施方案中，本发明提供了在此公开的干扰素多肽的模拟物。所述模拟物可以是功能性模拟物或结构性模拟物。在另一个实施方案中，所述模拟物包含SPFSCLKDR序列(SEQ IDNO：4，即AB环的序列)，或DGNQFQKAQ序列(SEQ ID NO：5，即BC环的序列)。

本发明包含其中个体氨基酸可被在本领域中被认为密切相关的其他氨基酸所取代的变体肽。举例来说，所述个体氨基酸可由以下方式进行取代：可用任何疏水性脂肪族氨基酸取代其他疏水性脂肪族氨基酸；可用任何疏水性芳香族氨基酸取代其他疏水性芳香族氨基酸；可用任何带有极性侧链的中性氨基酸取代其他带有极性侧链的中性氨基酸；可用任何酸性氨基酸取代其他酸性氨基酸；可用任何碱性氨基酸取代其他碱性氨基酸。当在本文使用时，“模拟物”、“功能性/结构性模拟物”均指具有与在此公开的多肽相同的功能/结构活性的肽变体或有机化合物。这样的模拟物或者类似物的实例包括：被模建以比拟在此公开的干扰素的三维结构，特别是如上所述的氨基酸残基的排列的化合物或肽。

可通过本领域通常所知的模建技术生成适合的模拟物或者类似物。包括设计涉及研究功能相互作用的“模拟物”以及设计包含以使之能产生上述相互作用的方式排列的官能团的化合物。

对已知药学活性化合物设计模拟物是一种基于“前导”化合物用于开发药物的已知方法。这一方法可用于获得不易合成或需高价合成的活性化合物，也可用于改良不宜于常规给药的活性化合物；所述不宜于常规给药的活性化合物包括：会在消化道中被蛋白酶快速分解，从而不宜于口服的活性化合物多肽。模拟物设计、合成和测试可用于避免针对目标性质随机筛选大量分子。

在根据具有给定目标特性的化合物/肽设计模拟物的过程中，通常包括以下几步：首先，确定对于决定目标性质起关键和/或重要作用的化合物/肽的特定部分。就肽而言，可通过系统性地改变肽中的氨基酸残基从而实现这样的确定，例如将每个残基依次取代。构成化合物活性区的这些部分或残基被称为其“药效团”。

一旦发现所述药效团，就可根据其物理性质对其结构进行模建；所述物理性质例如立体化学性、键合、大小和/或电荷、该模建使用了来自多种来源例如光谱技术、X-射线衍射和NMR的数据。计算分析、相似性制图(其模拟了药效团的电荷和/或体积，而非原子间键合)以及其他技术可用于该模建过程中。在该方法的变型中，模建配体及其结合伴侣的三维结构。这一方法特别适用于配体和/或结合伴侣在结合中产生构象变化的情况，从而容许在模拟物设计中对该模型作进一步考虑。

然后，选择可将模拟药效团的化学基团移植到其上的模板分子。可便利地选择所述模板分子及移植到其上的化学基团，从而容易地合成所述模拟物；而所合成的模拟物除了保持前导化合物的生物活性外，还可能是药理学可接受的，并且不会在体内降解。通过这一手段获取的模拟物经筛选后，即可得知其是否具有目标性质或者在什么程度上显示了目标性质。然后，可进行进一步的优化和改性，以获得用于体内或临床测试的一种或多种最终的模拟物。

无论是就本发明而言用于人体给药的多肽、抗体、肽、核酸分子、小分子、模拟物还是其他药学上有用的化合物，优选的给药剂量都是“预防有效剂量”或“治疗有效剂量”(当然预防也可被认为是治疗的一个方面)，这样的剂量足以显示对个体的有益效果。本发明的实际给药剂量、给药频率以及给药时间随受治疗疾病的性质和严重程度而定。治疗处方，如剂量确定等问题，由医生或其他医务工作者按情况而定。药物组合物可依据情况单独给药或联合给药。

根据本发明并供本发明所用的药物组合物，除活性成分外，可包括：药学上可接受的赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂或其它本领域公知的物质。这类物质应当是无毒且不会影响活性成分效力的物质。载体或其他物质的确切性质依据给药方式而定；所述给药方式包括口服和注射；而注射则进一步包括皮下注射、肌肉注射以及静脉注射等。上述技术和给药方案的实例可见Remington′s Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol，A.(编)，1980。

本发明还提供了一种鉴定可与干扰素相互作用的候选化合物的方法，所述方法包括步骤：(a)提供本发明的干扰素晶体；(b)确定步骤(a)中干扰素晶体的原子坐标；和(c)选择包含能与步骤(a)中获得的结构相互作用的结构特征的候选化合物，从而鉴定能与所述干扰素相互作用的候选化合物。蛋白的三维结构可由多种方式展示，包括表面电荷或者疏水核排列。在一个实施方案中，候选化合物的结构特征包括抗原性位点、亲水特性、表面可接近性和结构基序。

在一个实施方案中，基于计算机进行候选化合物的选择和鉴定。举例来说，所述的基于计算机的选择可包括以下步骤：对多个候选化合物生成三维结构；将上述三维结构各自与包含本发明干扰素晶体的原子坐标的三维结构进行拟合，以发现在能量上最有利的相互作用，从而鉴定能与所述干扰素相互作用的候选化合物。

在另一个实施方案中，上述方法进一步包括以下步骤：获取或合成候选化合物；使所述候选化合物与干扰素接触以确定该候选化合物与所述干扰素相互作用的能力。该方法还可包括测定所述干扰素与候选化合物接触时的活性。举例来说，要被测试的干扰素活性包括：抗病毒活性、抗肿瘤活性、抗增殖活性、天然杀伤细胞活性以及免疫调节活性。

本发明还提供了设计干扰素模拟物的方法，包括步骤：(a)对多个模拟物生成三维结构；和(b)将步骤(a)中的各个三维结构与包含本发明干扰素晶体的原子坐标的三维结构进行拟合，以发现所述干扰素的最佳拟合模拟物。

本发明还提供了基于计算机的合理药物设计方法，包括步骤：(a)提供包含本发明干扰素晶体的原子坐标的三维结构；(b)提供多个分子片段；(c)将所述多个分子片段与步骤(a)的结构进行拟合；和(d)将所述分子片段组装到一个分子中，从而得到候选药物。在一个实施方案中，将所述多个分子片段与包含SEQ ID NO：4(AB环的序列)的序列进行拟合。在另一个实施方案中，将所述多个分子片段与包含SEQ ID NO：5(BC环的序列)的序列进行拟合。上述方法还可包含以下步骤：获得或合成候选药物；以及令所述候选药物与干扰素接触，从而确定候选药物与所述干扰素相互作用的能力。所述方法可用于构建干扰素同系物或与所述干扰素相互作用的配体。

本发明将通过下列实施例得以详细描述，所述实施例仅作为解释说明目的，并不意在限制本发明的范围。可对本发明进行修改而不背离的本发明的范围。

所有出版物、专利和专利申请在此以其整体并入作为参考，如同每篇独立出版物、专利或专利申请被明确且单独地指出以其整体并入作为参考一样。

附图说明

图1显示了用于晶体结构分析的本发明的重组干扰素(rSIFN-co)的单晶。

图2显示了rSIFN-co晶体的X-射线衍射图(分辨率为2.6

)。

图3显示了rSIFN-co分子晶体结构中局部2Fo-Fc的1.0σ电子密度图。

图4显示了rSIFN-co的所有原子的平均温度因子随残基的分布图；其中图4a为A链的图；图4b为B链的图。

图5显示了rSIFN-co蛋白质分子结构模型中所有氨基酸残基的(φ，ψ)值在拉氏构象图上的分布，此图参考了分辩率至少2.0埃、R因子低于20％的118个结构，在最佳区域内有90％以上是高质量的模型，其统计数据如下：

统计数据

在最适区域内的残基[A、B、L]                240    90.6％

在附加允许区域内的残基[a、b、l、p]         24     9.1％

在一般允许区域的残基[^-a、^-b、^-l、^-p]       1      0.4％

在不允许区域内的残基                       0      0.0％

-----  ------

除甘氨酸和脯氨酸以外的残基数               265    100.0％

末端残基数(甘氨酸和脯氨酸除外)            127

甘氨酸残基数                              18

脯氨酸残基数                              6

-----

总残基数                                  416

图6显示了rSIFN-co晶胞堆积图。

图7显示了rSIFN-co二聚体结构的组装结构对。

图8显示了rSIFN-co晶体学二聚体的组织(图8a，图8b)及α碳原子的均方根偏差(RMSD，方框代表缺失残基)(图8c)。

图9显示了rSIFN-co单分子的结构(仅示出主肽链)；其中图9a为侧视图；图9b为俯视图；图9c为拓扑示意图；图9d为二级结构的拓扑组织方式。

图10显示了rSIFN-co二级结构与氨基酸序列匹配图；其中灰线方框代表在结构中未搭建的氨基酸残基，蓝线方框代表在结构中构建为Ala或Gly的氨基酸残基，连线为两对二硫键，下标绿色为结构中已构建的1对二硫键。

图11显示了rSIFN-co蛋白与同源IFN多肽的序列对比图。

图12显示了rSIFN-co与IFN-α2b比较结果示意图。

图13显示了rSIFN-co(红色)与IFN-α2b(黄色)二聚体叠合图。

图14显示了(a)IFN-α类蛋白与受体的结合模型；(b)IFN-α类功能区示意图(蓝圈区为重要功能区)。

具体实施方式

实施例1

重组干扰素rSIFN-co的制备

本实施例为重组干扰素rSIFN-co(以下也可称为“rSIFN-co”)(原液)的制备方法(具体参见美国专利第7,364,724号说明书实施例1和2以及中国专利公开号CN1740197说明书中第11-17页记载的方法)。

一、基因克隆：

根据已发表的编码DNA序列及推断的氨基酸序列资料(Klein ML，Bartley TD，Lai PH，et al.，Structural characterization of recombinant consensusinterferon-alpha.Journal of Chromatography，1988；454：205-215)，利用大肠杆菌优先表达密码子(The Wisconsin Package，by Genetics Computer Group，Inc.Copyright 1992，Medison，Wisconsin，USA)，在保证氨基酸序列不变的情况下，对其DNA编码序列进行分子设计，然后人工合成其rSIFN-co全长cDNA编码基因。

大肠杆菌cDNA序列的合成

rSIFN-co cDNA序列的重新设计

合成rSIFN-co cDNA序列

rSIFN-co cDNA 5′-端和3′-端半分子的合成

用PCR方法直接合成rSIFN-co cDNA 5′-端280bp(I片段)和3′-端268bp(II片段)两个cDNA半分子。片段I的3′-端与片段II的5′-端有41bp的核苷酸序列重叠互补。

化学合成如下寡聚脱氧核苷酸片段

Oligomer A：

5′ ATGTGCGACCTGCCGCAGACCCACTCCCTGGGTAACCGTCGTGCTCTGATCCTGCTGGCTCAGATGCGTCGTATCTCCCCGTTCTCCTGCCTGAAAG

OligomerB：

5′CTGAAAGACCGTCACGACTTCGGTTTCCCGCAGGAGAGGTTCGACGGTAACCAGTTCCAGAAAGCTCAGGCTATCTCCGTTCTGCACGAAATGATCCAGCAGACCTTC3′

Oligomer C：

5′GCTGCTGGTACAGTTCGGTGTAGAATTTTTCCAGCAGGGATTCGTCCCAAGCAGCGGAGGAGTCTTTGGTGGAGAACAGGTTGAAGGTCTGCTGGATCATTTC3′

Oligomer D：

5′ATCCCTGCTGGAAAAATTCTACACCGAACTGTACCAGCAGCTGAACGACCTGGAAGCTTGCGTTATCCAGGAAGTTGGTGTTGAAGAAACCCCGCTGATGAAC3′

Oligomer E：

5′GAAGAAACCCCGCTGATGAACGTTGACTCCATCCTGGCTGTTAAAAAATACTTCCAGCGTATCACCCTGTACCTGACCGAAAAAAAATACTCCCCGTGCGCTTGGG3′

Oligomer F：

5′TTATTCTTTACGACGCAGACGTTCCTGCAGGTTGGTGGACAGGGAGAAGGAACGCATGATTTCAGCACGAACAACTTCCCAAGCGCACGGGGAGTATTTTTTTTCGGTCAGG3′

(2)PCR反应

PCR反应I合成rSIFN-co 5′-端半分子：用寡聚脱氧核苷酸片段B作为模板，A和C两个寡聚脱氧核苷酸片段作为引物，进行PCR反应合成长度为280bp的rSIFN-co 5′-端半分子产物。

PCR I反应混合物如下：(单位：μl)(总体积：50μl)

无核酸酶消毒蒸馏水                                  3910×Pfu反应缓冲液(美国Stratagen公司生产)            5dNTP混合物(每一dNTP浓度为2.5mmol/L)                 2A片段引物(25μmol/L)                                1C片段引物(25μmol/L)                                1B片段模板(1μmol/L)                                 1Pfu DNA聚合酶(美国Stratagen公司生产)(25U/μl)       1

PCR I反应周期为：

95℃ 2′→(95℃ 45″→65℃ 1′→72℃ 1′)×25周期→72℃ 10′→4℃

PCR反应II合成rSIFN-co 3′-端半分子：用寡聚脱氧核苷酸片段E作为模板，D和F两个寡聚脱氧核苷酸片段作为引物，进行PCR反应合成长度为268bp的rSIFN-co 3′-端半分子产物。

PCR II反应混合物如下：(单位：μl)(总体积：50μl)

无核酸酶消毒蒸馏水                        3910×Pfu反应缓冲液(美国Stratagen公司生产)  5

dNTP混合物(每一dNTP浓度为2.5mmol/L)           2D片段引物(25μmol/L)                          1E片段引物(25μmol/L)                          1F片段模板(1μmol/L)                           1Pfu DNA聚合酶(美国Stratagen公司生产)(25U/μl) 1

PCR II反应条件和周期同PCR I。

rSIFN-co全长cDNA分子的组装

采用“重叠-延伸PCR”方法将上述PCR合成的I和II片段组装在一起从而得到完整的rSIFN-co cDNA全长分子序列。并且在其5′-端和3′-端分别引入Nde I和Pst I限制性酶切位点，以便于将rSIFN-co cDNA序列克隆到质粒载体中去。

(1)化学合成引物

Oligomer G：5′ATCGGCCATATGTGCGACCTGCCGCAGACCC3′

Oligomer H：5′ACTGCCAGGCTGCAGTTATTCTTTACGACGCAGACGTTCC3′

(2)“重叠-延伸PCR”反应

PCR反应混合物：      (单位：μl)(总体积：50μl)

无核酸酶消毒蒸馏水                            3810×Pfu反应缓冲液(美国Stratagen公司生产)      5dNTP混合物(每一dNTP浓度为2.5mmol/L)           2引物G(25μmol/L)                              1引物H(25μmol/L)                              1*片段I PCR产物(1μmol/L)                      1*片段II PCR产物(1μmol/L)                     1Pfu DNA聚合酶(美国Stratagen公司生产)(25U/μl) 1

注：用美国Stratagen公司生产的StrataPrep PCR纯化试剂盒将PCR产物先进行分离纯化，然后溶于消毒蒸馏水中。

PCR反应条件及周期同前述PCR I。

rSIFN-co基因的克隆及序列分析

选用pLac T7质粒作为rSIFN-co cDNA基因克隆的载体。pLac T7质粒是经pBluescript II KS(+)质粒(美国Stratagen公司生产)改造而成。

用StrataPrep PCR纯化试剂盒(美国Stratagen公司生产)将含rSIFN-co全长cDNA PCR产物进行纯化，然后用NdeI和PstI进行酶切；同时将pLac T7质粒进行NdeI和PstI双重酶切。将这二种酶切DNA片段在1％琼脂糖胶上进行电泳分离，然后用美国Promoga公司的WinzardDNA纯化试剂盒从胶中回收，纯化507bp长的rSIFN-co DNA片段和2.9kb的质粒酶切DNA片段。将二者经T4 DNA连接酶催化连接成重组质粒。将连接反应混合物转化DH5α感受态细胞(美国Gibco公司生产)。经37℃过夜培养后，挑选阳性重组菌落，命名为pHY-1。

按DNA序列分析试剂盒(SequiThermTM Cycle Sequencing Kit，购自美国Epicentre Technologies公司)说明书进行DNA序列测定反应，其中引物为通用T7和T3引物，DNA测序结果显示其与理论设计相符。

纯化的重组rSIFN-co蛋白进行N-末端16个氨基酸及C-末端4个氨基酸序列测定。其结果为：

N端：

Cys-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Asn-Arg-Arg-Ala-Leu-

其N-末端的甲硫氨酸(Met)在成熟蛋白中被切除。

C端：

Arg-Arg-Lys-Glu-COOH。

rSIFN-co全长核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，氨基酸序列如SEQID NO：1所示。

表达载体的构建、转化、酶切鉴定及其遗传稳定性

表达载体的构建、转化

将大肠杆菌表达载体pBAD18质粒先经Nde I酶解，使质粒线性化(Linearized)，然后用Xba I进行充分酶解。经1％琼脂糖凝胶电泳，再用德国QIAGEN公司生产的QIAEX II试剂盒纯化，得到pBAD18经NdeI和XbaI消化的4.8kb片段。

与此同时将pHY-1质粒进行Nde I和Xba I双酶切，同样经1％琼脂糖凝胶电泳分离后，纯化出715bp大小的序列片段。将上述4.8kb的pBAD18片段与715bp的rSIFN-co和pBAD18酶切片段在T4 DNA连接酶催化下连接成重组质粒。将连接反应物转化DH5α感受态细胞，然后将转化细胞涂于LB-Amp琼脂平板，置37℃培养过夜。

阳性克隆菌株的筛选

随机从上述LB平板中挑起单个细菌菌落，用核酸内切酶酶解，PCR分析的方法筛选含rSIFN-co全长编码序列的重组质粒菌株。将其中一个PCR阳性重组质粒命名为pHY-5。将含有pHY-5质粒的菌株命名为PVIII，扩增后加入甘油冻存液冻存于-80℃备用。

rSIFN-co基因在E.coli LMG194中的高效表达

在pHY-5质粒中，rSIFN-co基因处于强启动子P_BAD的调控之中，而P_BAD又受Ara C蛋白的调控。Ara C是由位于同一质粒中的ara C基因编码的蛋白质。在没有阿拉伯糖存在的情况下，Ara C二聚体与O₂及I₂结合形成一个210bp的环。这一结构导致转录的完全抑制。当加入阿拉伯糖时，Ara C二聚体与O₂脱离，并转而与I₁和I₂结合，解除对转录的抑制。阿拉伯糖结合失活、抑制、及激活P_BAD启动子的转录，从而刺激P_BAD介导高水平的rSIFN-co表达。rSIFN-co表达量可达菌体总蛋白的50％。

二、分离纯化：

(1)、制备生产菌种：将含有表达载体pHY-5的E.coli LMG194工程菌种接种在LB培养基中，37℃，摇瓶振荡(200rpm)培养过夜(约18小时)，细菌培养液中加入50％浓度为30％的甘油，混匀分装成1ml每支，-20℃保存，作为生产菌种；

(2)、制备I级种子菌：将生产菌种按1％的比例接入LB培养基(1L中含有胰蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化钠10g)，37℃，200rpm培养过夜，作为I级种子菌；

(3)、发酵、收菌：将I级种子菌再按10％的比例加入RM培养基(1L中含有酪蛋白20g，氯化镁1mmol/L(0.203g)，磷酸氢二钠4g，磷酸二氢钾3g，氯化钠0.5g，氯化胺1g)中，37℃，pH 7.0，发酵至OD₆₀₀值2.0左右加入阿拉伯糖(20％)至终浓度0.02％诱导，4小时后收菌，离心，得到菌体沉淀；

(4)、制备包涵体：将离心后的菌体沉淀用适量缓冲液A(100mmol/L Tris盐酸pH 7.5，10mmol/L EDTA，100mmol/L氯化钠)重混悬，置-20℃冷冻过夜，取出融化后，匀浆机破菌，离心，再用缓冲液B(50mmol/L Tris盐酸pH 7.5，1mol/L尿素，10mmol/L EDTA，0.5％ Triton X-100)、缓冲液C(50mmol/L Tris盐酸、pH 7.5，2mol/L尿素，10mmol/LEDTA，0.5％ Triton X-100)分别洗涤沉淀两次，再用蒸馏水洗涤一次，得到包涵体；

(5)、复性处理：用6mol/L盐酸胍(或尿素)溶解包涵体得到稍浑浊的变性液，10000rpm高速离心，取上清液测定变性液的蛋白浓度；按终蛋白浓度0.3mg/ml，分三次将变性液加入已配制好的复性液(0.5mol/L精氨酸，150mmol/L Tris盐酸pH 7.5，0.2mmol/L EDTA)中，并在4℃连续搅拌过夜(约18小时)；然后，依次用10倍体积的10mol/L磷酸盐缓冲液(PB)、和5mol/L的磷酸盐缓冲液及蒸馏水透析；透析完毕，用2mol/L的醋酸-醋酸钠(pH 5.0)调pH，静置，过滤；

(6)、HS阳离子柱层析：柱体先用20mmol/L的醋酸-醋酸钠(pH5.0)平衡，将步骤(5)得到的复性产物以30ml/min的速度上样，用20个柱体积的20mmol/L醋酸-醋酸钠(pH 5.0)，洗脱杂蛋白；接着，用5个柱体积含0.15mol/L氯化钠的20mmol/L醋酸-醋酸钠(pH 5.0)，洗脱杂蛋白。然后，再用3个柱体积含0.18mol/L氯化钠的20mmol/L醋酸-醋酸钠(pH 5.0)，洗脱杂蛋白；最后，用含0.25mol/L氯化钠的20mmol/L醋酸-醋酸钠(pH 5.0)解离目标蛋白，得到HS解离蛋白液；

(7)、铜离子亲和层析(chelaing sepharoseTM fast flow)：将IIS解离蛋白液加入0.2mol/L、pH 6.6的PB缓冲液中，用4mol/L的氯化钠调到含1mol/L氯化钠，pH 6.0，备上样；柱体用含1mol/L氯化钠的50mmol/L磷酸氢二钠缓冲液(pH 5.5)平衡，以1ml/min的速度上样；接着，用50mmol/L磷酸氢二钠缓冲液(pH 5.0)，洗脱杂蛋白；再用50mmol/L磷酸氢二钠缓冲液(pH 4.0)，洗脱杂蛋白；然后，再用50mmol/L磷酸氢二钠缓冲液(pH 3.6)，解离目标蛋白，得到螯合柱解离目标蛋白液；

(8)、HS柱层析：将螯合柱解离目标蛋白液稀释30倍，并将pH调至5.0，上HS柱，以含0.5mol/L氯化钠的PB缓冲液(pH 7.0)解离，收集，即得所述的重组干扰素(原液)。

实施例2

重组干扰素制剂

冻干注射剂(冻干粉)的配方

本发明rSIFN-co原液    34.5μg/ml

pH 7.0的磷酸盐缓冲液  10mmol/L

甘氨酸                0.4mol/L

制备工艺：按配方称料，无菌无热原注射水溶解，0.22μm孔径滤膜过滤除菌，于6-10℃保存，取样作无菌和热原检查合格后分装西林瓶中，每瓶0.3-0.5的单次剂量，分装后放置至冻干机中冷冻干燥。

水溶液注射剂的配方

本发明rSIFN-co原液    34.5μg/ml

pH 7.0的磷酸盐缓冲液  25mmol/L

氯化钠                0.4mol/L

制备工艺：按配方称料，无菌无热原注射水溶解，0.22μm孔径滤膜过滤除菌，于6-10℃保存，取样作无菌和热原检查合格后分装于密闭容器中，每瓶0.3-0.5的单次剂量，分装后成品置2-10℃暗处保存。

实施例3

重组干扰素的结晶

制备优质rSIFN-co蛋白质单晶是测定其晶体结构的前提条件。用于晶体生长的rSIFN-co样品得自如上所述的本发明rSIFN-co。rSIFN-co的单晶制备的方法、技术流程和结晶条件，及其晶体学参数如下：

将上述本发明的rSIFN-co冻干粉溶解于纯水中并在低温(-20℃)下保存，初始蛋白质浓度为0.42mg/ml。结晶前将rSIFN-co蛋白质样品浓缩至3-3.5mg/ml后立即用于晶体生长实验。晶体培养均在室温下(293k)采用悬滴汽相扩散法进行。

在结晶研究初期，rSIFN-co的微晶可以在多个系列条件中出现，但获得可用于X-射线衍射分析并有足够分辨率的优质单晶十分困难。经过大量结晶条件优化研究，得出所获晶体质量最好的结晶溶液条件为1.2M(mol/L，下同)Li₂SO₄、0.1M CAPS(3-(环己氨基)-1-丙磺酸)，pH 11.1，0.02 MMgCl₂。按此条件配制的结晶溶液静置三天至一周后，获得rSIFN-co蛋白质的优良单晶，晶体为三方晶型，晶体大小为0.42×0.08×0.08mm。用于X-射线衍射晶体结构分析的rSIFN-co蛋白质晶体见图1。

实施例4

晶体X-射线衍射数据的分析

晶体衍射数据收集：

数据收集在日本筑波光子工厂同步辐射站线BL5A，低温条件下(100K)完成。具体操作步骤如下：

(1)在显微镜下仔细小心用安置晶体工具将晶体从母液捞到工具顶部的线圈中；

(2)采用快速冷冻技术(Flash-Cooling)迅速将含有晶体的线圈在防冻试剂parrafin oil(购自hampton Research公司)浸泡几秒后，快速将安置晶体工具放置在衍射仪器测角头上，这时晶体也瞬间处于低温氮气流(100K)中，使数据收集在100K低温下进行；

(3)设定参数后开始进行数据收集，光源波长为1.0

，探测器为ADSC Quantum 315 CCD(电荷偶合器件探测器)，晶体到探测器的距离为310mm；采用回摆法收集数据，每幅画面所用回摆角度为1°，每幅曝光时间为12秒，总共收集了110幅画面(见图2)。

衍射数据处理和分析：

衍射实验首先收集得到一套直观的衍射画面(图2)，这些画面必须经过收集到的全套衍射数据用CCP4程序包进行处理和分析，以应用于衍射数据质量评估和结构解析。这个过程包括：1)指标化：将衍射数据转换为晶体学指标(h，k，l)，并计算出晶胞参数和空间群；2)参数修正：对晶胞参数、晶体和探测器间距离与角度和晶体镶嵌度等参数进行精化；3)积分：从衍射斑点得到强度信息；4)数据合并：将所有对称相关和重复的衍射点合并，产生一套由独立衍射点构成的完整数据；5)将强度数据转化为结构振幅。rSIFN-co晶体衍射数据收集和处理分析的结果详见表1。

表1

rSIFN-co晶体衍射数据收集和处理分析结果

实施例5

晶体结构解析

晶体衍射相位的测定和rSIFN-co分子初始结构模型的建立

rSIFN-co晶体结构采用分子置换法进行相位解析，选择绵羊IFN-τ(其与rSIFN-co序列同源性54％)的晶体结构(PDB编号1B5L)作为分子置换的同源结构模型，用软件程序Phaser，进行旋转函数和平移函数的计算分析，推定rSIFN-co分子在晶胞中的位置和取向。根据劳厄群和系统消光规律，测定空间群为P3121，同时将模型分子进行一些修改(即保留了1B5L结构中的13-25，37-69，79-101，114-151位残基)，计算结果是：Z-score为15.71，IL-gain为307.79，Clash为0。晶胞中分子堆积合理，且在分子置换过程中IL-gain逐步上升，表明获得了正确解，测定了各衍射点的初始相位。进而用Phaser生成的带有初始相位的mtz通过FFT生成电子密度图，获得的rSIFN-co分子的初始结构模型与生成的电子密度图匹配良好，表明已获得rSIFN-co所有衍射点的正确相位解。以所述结果为基础，构建了rSIFN-co分子的初始结构模型。

rSIFN-co结构模型的精化

运用分子模建技术和计算机优化程序，对rSIFN-co分子初始模型中的所有非氢原子的坐标参数和温度因子进行叠代式修正(refinement)，以获得精确的rSIFN-co分子结构模型。

结构修正采用程序CNS 1.1，数据为没有相位的母体数据，从其中随机提取10％作为测试集(testing set)，且至始至终保持同一套随机选取的测试集。结构模型中的所有原子均参与修正，且每个原子的修正参数均为4个，包括坐标(x，y，z)和各向同性温度因子B。整个修正过程中，结构的计算机自动修正与模型的人工调整、搭建(用软件O)交替进行，在修正起始时使用了限制性的NCS，当在结构调整基本完成时，修正中不再使用NCS。当R_work因子(低于0.30)和R_free因子基本不再继续下降时，开始在结构中加入水和溶剂分子，最终完成结构的精化，其主要精化指标为，R_work为0.250，R_free为0.286。最终获得的精化rSIFN-co分子结构的主要指标列于表2。

表2

rSIFN-co分子精化结构模型的主要参数指标和质量统计结果

1 自由不符合指数R_free取不参与修正的10％总衍射点数计算；

2 相对标准键长/键角计算的均方根偏差

3 拉氏构象图(Ramachandran plot)统计所用软件为PROCHECK.

实施例6

rSIFN-co分子结构模型的质量表征

rSIFN-co分子结构模型的质量表征

(1)模型的电子密度图：可以直观、清晰、准确地显示rSIFN-co。图3为一代表性电子密度图与rSIFN-co分子中氨基酸残基结构的配合情况，可清晰辨识不同氨基酸残基的空间位置和取向。

(2)平均温度因子随残基的分布图(见图4)。

(3)分子的立体化学指标——拉氏构象图：rSIFN-co分子的立体化学合理性由拉氏构象图(图5)表征，其结构位于最适允许区的氨基酸残基数占90.6％，位于允许区的9.1％，位于一般允许区的0.4％。表明rSIFN-co分子结构模型具有合理的立体化学。

实施例7

rSIFN-co分子的晶体结构特征

rSIFN-co分子在晶体中的堆积及总体排列

rSIFN-co分子在晶胞中的堆积方式见图6所示。rSIFN-co晶体结构的一个不对称单位中包含2个蛋白质分子(称为晶体学二聚体)(见图7所示)。二聚体间的包埋面积为1033.3

，即每个晶体所贡献的面积为516.6，仅占单体总面积的约6.4％。二聚体中A链的A、B、F面与B链的C、D、E面相对应(见图9所示)；用VADAR软件计算单体，二聚体折叠自由能量分别为-126.9和-257.1，即二聚体折叠自由能与两个孤立单体自由能分别(-126.9×2)很接近。这表明二聚体间相互作用里较弱。同时两者间仅存在两个弱氢键A12(ARG)NH2...NH2 B71(Arg)，3.05埃；A145(Arg)NH1...OH B90(Tyr)，3.14埃。

在纯化过程中证明rSIFN-co蛋白质溶液态下为单体，现有生化功能实验表明IFN-α类功能单位应是单体，因此这个二聚体可能是由于晶体堆积而形成的。

二聚体结构

一个不对称单位中的两个rSIFN-co单分子形成了一个二聚体。图8显示出了rSIFN-co晶体学二聚体的组织方式。A链由11-103和111-163位残基构成(1-10，104-110和164-166由于在电子密度图上没有表现而没有构建)；B链由11-103和110-163位残基构成(1-10，104-109和164-166由于在电子密度图上没有表现而没有构建)。在晶体结构中可见到每个单体的第29位和第139位的Cys形成了分子内二硫键，而第1位和第99位的Cys间的分子内二硫键由于第1位Cys在晶体结构中未构建所以没有体现。另外，A链的30-33、47-49位及B链的30-33、48-50位残基由于侧链的密度没有表现，故这些残基主要构建为Ala或Gly。另外，A链的30-33、47-49位及B链的30-33、48-50位残基由于侧链的密度没有表现，故这些残基主要构建为Ala或Gly。两个单体的结构基本相同，由非晶体学对称性所联系(从B到A，极角Omega、Phi、Kappa分别为170.64、94.56、118.35；平移分数tx、ty、tz分别为-1.061、-0.225、0.155)。对两个单体进行叠合比较(见图8)，除了少数几段分子表面的loop区域柔性比较大以外，绝大部分残基能够很好地叠合(所有α碳原子RMSD随氨基酸的分布如图8c)，其中127个残基(13-30、34-44、53-101、115-163)α碳原子的均方根偏差为0.64埃。局部结构的差异是可能由于蛋白质的较大柔性以及晶体堆积环境的不同而造成的。

单分子结构

每个单体由6段α螺旋(A、C、C’、D、E、F)、一段310螺旋(B)以及它们之间的连接肽段所构成，整个单体结构的折叠方式属于螺旋状细胞因子型(见图9所示)。6段α螺旋(A、C、C’、D、E、F)所对应的氨基酸残基位置分别是：13-20、50-68、70-76、79-100、114-133、138-160。一段310螺旋(B)所对应的氨基酸残基位置是40-43。图8清楚地显示了这些二级结构的分布和组织方式。图10示出了二级结构与氨基酸序列的对应关系。

实施例8

rSIFN-co和IFN-α2b的三维结构

干扰素根据受体的不同，首先可分为两类：I型和II型。I型类群又可分为α、β、ω等，其中IFNα又包括近15种不同的亚型，不同α类蛋白质间的蛋白质序列同源性都在80％以上，但是它们的功能却显示了多样性。rSIFN-co蛋白质属于IFNα类中非天然的人工设计蛋白质，至今I型IFNs只有6个三维结构(表3)，它们的氨基酸序列同源性可见序列对比(如图11所示)。

从表3和图10对比分析可以知道，与rSIFN-co的晶体结构最相近的是IFN-α2b(如图12所示)，在序列上，rSIFN-co主要在45位比IFN-α2b多一个天冬氨酸(D)；在三维结构上，它们主要区别在AB环(25-33位残基)和BC环(44-52位残基)的空间构象有显著不同。IFN-α2b的晶体结构已在2.9埃分辨率解析，但在蛋白质数据库(Protein Data Bank，PDB)中仅有α碳原子的坐标，所有其它原子的坐标数缺失(PDB Code 1RH2)。故rSIFN-co与IFN-α2b的结构比较只能在α碳原子的水平上进行。这两个分子所有α碳原子之间的均方根偏差(RMSD)为1.577埃，但它们在AB环区和BC环区的均方根偏差为3.6埃和2.9埃，分别是其总平均值的2.5倍和2倍。此外，rSIFN-co的晶体结构中不对称单位中含有2个分子，而IFN-α2b的晶体学不对称单位中有6个蛋白质分子，由3个二聚体构成。显然，rSIFN-co的二聚体组织方式与IFN-α2b明显不同。

表3

已测定结构的干扰素分子

现有技术已知，作为细胞因子的干扰素首先与细胞膜上的特异受体结合，以激活多种信号传导途径，使机体产生抗病毒、抗肿瘤等生物学效应。rSIFN-co属于IFN-α类干扰素，其在细胞膜上的受体已知由IFNAR1和IFNAR2共同组成，并由此构建了受体与IFN-α分子结合的三维结构模型(如图14a所示)。以此为基础，一系列分子生物学实验研究显示，IFN-α类蛋白质与受体IFNAR1、IFNAR2相互作用时形成夹层式结构(如图14a所示)，即IFN-α类的A、B、F面与IFNAR2相互作用，而其相对的C、D、E面与IFNAR1相作用。同时，深入的分子生物学定位突变试验揭示IFN-α类功能重要区(如图14所示)，其中AB Loop尤其重要，它是与IFNAR2相互作用的主要分子部位。结构比较显示(如图11、表4所示)，这一重要部位在rSIFN-co和IFN-α2b中明显不同。这一活性重要部位的结构差异，可能通过影响其与受体结合特征的改变，产生不同的生理/药理效应。

显然，rSIFN-co干扰素虽然与IFN-α2b有类似的分子骨架，但却在其功能活性重要区具有显著不同的结构。因此，从药理活性密切相关的分子局部结构看，rSIFN-co是不同于IFN-α2b的新类型分子，从而导致了两者间具有显著不同的生物学和药物学特征。以特殊的关键部位的特征三维结构为基础，干扰素rSIFN-co可能产生独特的生理和药理效应。

表4

rSIFN-co与IFN-α2b的AB环和BC环中碳原子的位置均方根偏差(单位：埃)

构象改变的重组干扰素晶体、其三维结构及应用

序列表

<110>四川省生物工程研究中心

<120>构象改变的重组干扰素晶体、其三维结构及应用

<160>5

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>167

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>重组干扰素的氨基酸序列

<400>1

Met Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu

1               5                   10                  15

Ile Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys

            20                  25                  30

Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln

        35                  40                  45

Phe Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln

    50                  55                  60

Thr Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu

65                  70                  75                  80

Ser Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp

                85                  90                  95

Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu

            100                 105                 110

Met Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Gln Arg Ile

        115                 120                 125

Thr Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val

    130                 135                 140

Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln

145                 150                 155                 160

Glu Arg Leu Arg Arg Lys Glu

                165

<210>2

<211>504

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>编码重组干扰素的核苷酸序列

<400>2

atgtgcgacc tgccgcagac ccactccctg ggtaaccgtc gtgctctgat cctgctggct     60

cagatgcgtc gtatctcccc gttctcctgc ctgaaagacc gtcacgactt cggtttcccg    120

caggaagaat tcgacggtaa ccagttccag aaagctcagg ctatctccgt tctgcacgaa    180

atgatccagc agaccttcaa cctgttctcc accaaagact cctccgctgc ttgggacgaa    240

tccctgctgg aaaaattcta caccgaactg taccagcagc tgaacgacct ggaagcttgc    300

gttatccagg aagttggtgt tgaagaaacc ccgctgatga acgttgactc catcctggct    360

gttaaaaaat acttccagcg tatcaccctg tacctgaccg aaaaaaaata ctccccgtgc    420

gcttgggaag ttgttcgtgc tgaaatcatg cgttccttct ccctgtccac caacctgcag    480

gaacgtctgc gtcgtaaaga ataa                                           504

<210>3

<211>504

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>编码重组干扰素的核苷酸序列

<400>3

tacacgctgg acggcgtctg ggtgagggac ccattggcag cacgagacta ggacgaccga     60

gtctacgcag catagagggg caagaggacg gactttctgg cagtgctgaa gccaaagggc    120

gtccttctta agctgccatt ggtcaaggtc tttcgagtcc gatagaggca agacgtgctt    180

tactaggtcg tctggaagtt ggacaagagg tggtttctga ggaggcgacg aaccctgctt    240

agggacgacc tttttaagat gtggcttgac atggtcgtcg acttgctgga ccttcgaacg    300

caataggtcc ttcaaccaca acttctttgg ggcgactact tgcaactgag gtaggaccga    360

caatttttta tgaaggtcgc atagtgggac atggactggc ttttttttat gaggggcacg    420

cgaacccttc aacaagcacg actttagtac gcaaggaaga gggacaggtg gttggacgtc    480

cttgcagacg cagcatttct tatt                                           504

<210>4

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>AB环的氨基酸序列

<400>4

Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg

1               5

<210>5

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>BC环的氨基酸序列

<400>5

Asp Gly Asn Gln Phe Gln Lys Ala Gln

1               5

Claims (20)

1.一种包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的重组干扰素的晶体，其中该晶体的空间群为P3₁21，在一个不对称单位中包含2个分子，以及单晶胞参数为：a＝b＝77.92埃，c＝125.935埃，α＝β＝90°，γ＝120°。

2.权利要求1的干扰素晶体，其中将所述重组干扰素的α碳原子骨架与IFN-α2b的α碳原子骨架以最小二乘法方式进行叠合后，该重组干扰素在对应于IFNα2b蛋白质分子中第25-33位残基上的各α碳原子与IFNα2b蛋白质分子在对应位残基上的α碳原子均方根偏差为3.63埃。

3.权利要求2的干扰素晶体，其中与IFNα2b对应位残基相比，所述重组干扰素在第25-33位残基上的α碳原子偏差分别是3.291、4.779、5.090、3.588、2.567、2.437、3.526、4.820和2.756埃。

4.权利要求1的干扰素晶体，其中将所述重组干扰素的α碳原子骨架与IFN-α2b的α碳原子骨架以最小二乘法方式进行叠合后，该重组干扰素在对应于IFNα2b蛋白质分子中第44-52位残基上的各α碳原子与IFNα2b蛋白质分子在对应位残基上的α碳原子均方根偏差为2.90埃。

5.权利要求4的干扰素晶体，其中与IFNα2b对应位残基相比，所述重组干扰素在第44-52位残基上的α碳原子偏差分别是1.614、1.383、2.735、2.709、5.018、4.140、3.809、2.970和0.881埃。

6.权利要求1的干扰素晶体，进一步包含共价或非共价结合的金属离子。

7.一种包含权利要求1的干扰素晶体的组合物。

8.权利要求1的干扰素晶体的模拟物。

9.权利要求8的模拟物，其中所述模拟物是功能性模拟物或者结构性模拟物。

10.一种鉴定能与干扰素相互作用的候选化合物的方法，所述方法包括步骤：

(a)提供权利要求1所述的干扰素晶体；

(b)确定步骤(a)中干扰素晶体的原子坐标；和

(c)选择包含能与步骤(a)中获得的结构相互作用的结构特征的候选化合物，从而鉴定能与所述干扰素相互作用的候选化合物。

11.权利要求10的方法，其中所述结构特征选自抗原性位点、亲水特性、表面可接近性和结构基序。

12.权利要求10的方法，其中基于计算机进行候选化合物的选择和鉴定。

13.权利要求12的方法，其中所述基于计算机进行候选化合物的选择和鉴定包括步骤：

(i)对多个候选化合物生成三维结构；和

(ii)将步骤(i)的三维结构各自与包含权利要求1的干扰素晶体的原子坐标的三维结构进行拟合，以发现在能量上最有利的相互作用，从而鉴定能与所述干扰素相互作用的候选化合物。

14.权利要求10的方法，进一步包括步骤：

(i)获取或合成候选化合物；和

(ii)使所述候选化合物与干扰素接触以确定该候选化合物与所述干扰素相互作用的能力。

15.权利要求14的方法，进一步包括测定所述干扰素与候选化合物接触时的活性。

16.权利要求15的方法，其中所述干扰素活性选自抗病毒活性、抗肿瘤活性、抗增殖活性、天然杀伤细胞活性和免疫调节活性。

17.一种设计干扰素模拟物的方法，包括步骤：

(a)对多个模拟物生成三维结构；和

(b)将步骤(a)的各个三维结构与包含权利要求1的干扰素晶体的原子坐标的三维结构进行拟合，以发现所述干扰素的最佳拟合模拟物。

18.一种基于计算机的合理药物设计方法，包括步骤：

(a)提供包含权利要求1的干扰素晶体的原子坐标的三维结构；

(b)提供多个分子片段；

(c)将所述多个分子片段与步骤(a)的结构进行拟合；和

(d)将所述分子片段组装到一个分子中，从而得到候选药物。

19.权利要求18的方法，进一步包括步骤：

(i)获得或合成候选药物；和

(ii)令所述候选药物与干扰素接触，从而确定候选药物与所述干扰素相互作用的能力。

20.权利要求18的方法，其中将所述多个分子片段与包含SEQ ID NO：4或5的序列进行拟合。

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