CN1062565C - 重组人α型复合干扰素及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种重组人α型复合干扰素及其制备方法和用途，人α型复合干扰素通过人α型复合干扰基因的人工构建，并由含其DNA序列表达载体的宿主细胞经发酵及纯化处理而制得，其通式为(Arg²² Ala⁷⁶Asp⁷⁸ Glu⁷⁹ Tyr⁸⁶ Tyr⁹⁰ Leu⁹⁶ Thr¹⁵⁶Asn¹⁵⁷ Val¹⁵⁸)INF-αF。其中第158位设计成中国汉族人特有的Val密码子。本发明的药物用于乙型肝炎、丙型肝炎等病毒性疾病的治疗。与现有α干扰素基因工程药物相比，具有活性更高、副反应更小、病毒清除率更高、更适合于黄种人治疗等特点。

Description

重组人α型复合干扰素及其制备方法和用途

本发明涉及一种干扰素及其制备方法和用途，特别是涉及一种高效低毒的重组人α型复合干扰素及其制备方法和用途。

干扰素是一类具有广谱的抗病毒、抗肿瘤和免疫调节的生物活性的细胞素总称。哺乳动物的干扰素均有α、β、γ等三个型别。其中α型中可分为许多亚型，可分为两大家族。其中人干扰素的αⅠ型约有20个基因成员，其中大部分都编码功能蛋白。

1986年美国FDA首先批准基因工程α2a干扰素(Roche公司生产)和α2b干扰素(Schering公司生产)投放市场：基因工程β、γ干扰素也相继获准上市。我国科学家首创α1b干扰素已于1996年正式获准上市。

经临床大量研究表明，干扰素尤其α型是一种重要的抗病毒、抗肿瘤治疗药物。但现有α干扰素制剂的临床治疗效果尚不理想，存在着大剂量时副作用较大等缺点。

为此美国Amgen公司采用蛋白质工程技术根据1983年已报道的13种α型干扰素的基因序列同源性，设计出一个全新的蛋白质工程药物-INFERGEN，并经FDA批准1997年在美国上市，用以治疗丙型肝炎，其疗效提高，且副作用低。

1995年中国科学家候云德等发现中国汉族人α干扰素等位基因的新变种：Val¹⁵⁸IFN-α1。此发现对于开发适合中国汉族人特点的基因工程药物具有重要意义。

本发明的目的在于将汉族人特有的基因位点引入α干扰素基因工程药物中，而提供一种活性更高、副反应更小、病毒清除率更高、更适合于黄种人治疗用的人α型复合干扰素及其制备方法；本发明的目的还在于将该干扰素用于病毒性疾病的治疗。

为实现上述目的，本发明提供一种重组人α型复合干扰素及其制备方法和用途。

本发明通过比较现已公布的20多种人α型干扰素的基因序列同源性并应用DNA重组技术设计制备人α型复合干扰素，其编码的蛋白质的氨基酸序列如下：CDLPQTHSLG   NRRALILLAQ   MRRISPFSCL

    10           20           30KDRHDFGFPQ   EEFDGNQFQK   AQAISVLHEM

    40           50           60IQQTFNLFST   KDSSAAWDES   LLEKFYTELY

    70           80           90QQLNDLEACV   IQEVGVEETP   LMNVDSILAV

   100          110          120KKYFQRITLY   LTEKKYSPCA   WEVVRAEIMR

   130          140          150SFSLSTNVQE   RLRRKE

   160          166其中，第158位为汉族人特有的Val密码子。

该重组人α型复合干扰素，其表达载体含有与所述的编码氨基酸相应的DNA序列。

所述的表达载体可采用pTrc6、pEt等。

其表达载体的宿主细胞包括细菌、昆虫细胞及哺乳动物细胞。

本发明的人α型复合干扰素可以如下通式表示：

(Arg²² Ala⁷⁶ Asp⁷⁸ Glu⁷⁹ Tyr⁸⁶ Tyr⁹⁰ Leu⁹⁶ Thr¹⁵⁶ Asn¹⁵⁷ Val¹⁵⁸)INF-αF。式中INF-αF为天然干扰素，第158位设计成中国汉族人特有的Val密码子。

本发明提供了该重组人α型复合干扰素的制备方法，该方法包括人α型复合干扰基因的人工构建，并由含其DNA序列表达载体的宿主细胞经发酵及纯化处理而制得。

由上述制备方法制取的人α型复合干扰素可用于乙型肝炎、丙型肝炎等病毒性疾病。

本发明的人α型复合干扰素药物比α1b生物学活性提高了10倍，清除丙型肝炎病毒率达30％多，尤其在α1b和α2a干扰素治疗失败后仍有效。与美国FDA1997年报道上市的INFERGEN临床效果一致，但副反应更低。这表明本研究制备的蛋白蛋工程药物由于引入了汉族人特有的基因位点，更适合于黄种人治疗用。

下面通过本发明的一个优选实施例，对本发明作更详细的描述。

一、人α复合干扰基因构建

根据本发明的人α型复合干扰素编码的蛋白质的氨基酸序列选择大肠杆菌偏爱密码子、消除不利于表达的二级结构设计并考虑到密码子的简并性，而设计出如下优选的DNA序列：Nde ⅠCAT  ATG  TGT  GAT  TTA  CCG  CAA  ACT  CAC  TCT  CTC  GGT  AACCGT CGT GCT CTG ATT CTG CTG GCT CAA ATG CGC CGC ATT

 AGC  CCG  TTT  AGC  TGC  CTG  AAG  GAT  CGC  CAT  GAT  TTT

 GGT  TTT  CCG  CAA  GAA  GAA  TTT  GAT  GGT  AAC  CAG

 TTT  CAG  AAG  GCA  CAG  GCT  ATT  TCT  GTA  CTG  CAT

 GAA  ATG  ATC  CAA  CAG  ACC  TTC  AAC  CTG  TTC  TCT

 ACT  AAG  GAT  AGC  TCT  GCT  GCA  TGG  GAC  GAA  AGC

 CTG  CTG  GAG  AAA  TTC  TAC  ACC  GAA  CTC  TAT  CAG

 CAG  CTG  AAC  GAT  CTC  GAA  GCA  TGC  GTA  ATC  CAG

 GAA  GTA  GGT  GTA  GAA  GAG  ACT  CCA  CTC

 ATG  AAC  GTC  GAC  TCT  ATT  CTG  GCT  GTT

AAG  AAA  TAC  TTC  CAG  CGT  ATT

ACC  CTG  TAC  CTG  ACT  GAA  AAA  AAA  TAT

TCT  CCG  TGC  GCT  TGG  GAA  GTA  GTT  CGT

GCT  GAA  ATT  ATG  CGT  TCC  TTC  TCT  CTG

TCT  ACT  AAC  GTT  CAA  GAG  CGT  CTG  CGT  AAG

                 PST ⅠGAA  TAA  TAG  CTG  CAG

    STOP

根据上述设计的DNA序列，分别合成8个DNA片段，其长度在80bp左右，这八个片段依次重叠，重叠部分在20bp左右使其退火温度在62℃～66℃之间。再合成两个片段在20bp左右的上游引物和下游引物，分别与5’端和3’端配对，且分别包含Nde Ⅰ和Pst Ⅰ两个限制性酶切位点。第一次PCR反应体系包括：4pmol八个片段，0.2mMdNTPs，2 units Deep Vent耐热聚合酶及缓冲液，反应体积为100μl。80℃热启动，95℃30s，59℃30s，72℃1min10s 30个循环。取反应液1/10作第二次PCR的模板，上游引物和下游引物各取100pmoL，0.25mMdNTPs，2 units Deep Vent耐热聚合酶及缓冲液，反应体积为100μl，反应条件同第一次，只减少到25个循环。PCR产物经电泳分离回收500bp大小位置的带，经纯化后双酶切(NdeⅠ+Pst Ⅰ)。本例中优选pTrc6为表达载体(Trc启动子，非融合表达，LacⅠ调控)，同时用Nde Ⅰ和Pst Ⅰ双酶切，将复合干扰素基因克隆至pTrc6。转化E.coliJM109，筛选重组子。重组子经DNA序列分析挑选到一个含正确编码的序列的克隆。命名为pTrcINF。

二、人α型复合干扰素的制备

1、工程菌株的表达与发酵

本例中优选将大肠菌为宿主细胞，将工程菌株大肠菌JM109(pTrcINF)单菌落挑在200mL LB加100μg/mL氨苄液体培养基35℃振荡培养(150rpm)过夜，再分别取20ml作种子液转种至1L LB加100μg/ml氨苄和0.4％的葡萄糖中，振荡(200rpm)4小时，37℃，0D至O.6时加IPTG 0.2mM诱导3hr，离心收菌。经SDS-PAGE检测，表达量达20％。5升摇瓶收集的菌体湿重为12g。

2、复合干扰素纯化：

离心收集发酵的菌体经溶菌酶处理后，超声破菌，3500g离心得到包涵体。包涵体经Berol 185、TE等洗涤。纯化后的包涵体经7M盐酸胍、100mMβ-巯基乙醇、25mM Tris-Cl，1mMEDTA(PH8、0)溶解3hr(20℃)。然后用20mMTris-HCl(pH8.0)，GSH∶GSSG=1mM∶0.1mM稀释10倍，对20mMTris-HCl，(pH8.O)透析，除去盐酸胍和β-疏基乙醇。

图1-3给出了层析图谱，离心上清经SOURSE 15Q、疏水层析和Superdex75分子筛层析得到半成品，分装封口为成品。

三、复合干扰素的应用

本发明的复合干扰素主要用于病毒性疾病的治疗，对滤泡性口炎病毒，单纯疱疹病毒、麻疹病毒、EB病毒等都有抑制繁殖作用。以WISH细胞/VSV系统进行抗病毒活性检测，结果分别为：国产天然干扰毒为0.9×10⁸U/mg，INTRON为2.0×10⁸U/mg，复合干扰素为9×10⁸U/mg，其抗病毒活性明高于前二者。

四、复合干扰素的临床治疗效果与副反应：

用复合干扰素治疗经临床证实为慢性活动性乙肝患者67例，每次900万单位，每2天1次，连续6个月，肌肉注射。治疗后有70％患者临床显效，其中13例HBs抗原阴转(19％)，41例HBe抗原阴转(61％)，10例HBe抗体阳转(14％)，27例HBV-DNA阴转(40％)，48例肝功恢复正常(71％)。

用复合干扰素治疗丙型肝炎患者42例，每次900万单位，每周3次，连续6个月，肌肉注射。治疗后69％患者有临床效果，其中16例丙肝病毒-RNA阳转(38％)，29例肝功恢复正常(69％)。

复合干扰素的临床最大耐受量最可达每次1500万单位，常规用900万单位，临床约有不足40％患者表现出Ⅰ-Ⅱ级(WHO临床分级标准)的副反应，包括38℃以下的轻微发热、恶心、食欲不振。如仅采用每次300万单位的剂量时，则几乎无临床副反发生。

五、复合干扰素与其它同类药的比较：

1、疗效：国外进口INTRON及国产天然干扰素常规剂量为每次300万单位。以治疗丙肝为例，治疗后病毒RNA阴转率只有10％，肝功恢复正常者约40％。复合干扰素与之相比，在相同剂量下可与其达到相同疗效，如提高剂量，则可明显提高疗效。

2、副作用：INTRON等使用后，40％患者表现出Ⅱ级副反应，包括流感样症状，消化系统不适，皮疹等症状；复合干扰素在相同剂量下，几乎无临床副作用，即使剂量增加2倍，其副反应发生率也仅有不足40％且反应程度较轻，在0-Ⅰ级范围内。

3、其它：使用国产天然干扰素治疗丙型肝炎失败后，改用复合干扰素治疗21例患者中15例患者有临床反应(70％)，10例肝功能恢复正常(47％)

图1为本发明的SOURSE 15Q层析洗脱图谱。

图2为本发明的疏水层析洗脱图谱。

图3为本发明的SUPERDEX 75层析洗脱图谱。

Claims (2)

1．一种重组人α型复合干扰素，其特征在于，其编码的蛋白质的氨基酸序列如下：CDLPQTHSLG    NRRALILLAQ    MRRISPFSCL

    10            20            30KDRHDFGFPQ    EEFDGNQFQK    AQAISVLHEM

    40            50            60IQQTFNLFST    KDSSAAWDES    LLEKFYTELY

    70            80            90QQLNDLEACV    IQEVGVEETP    LMNVDSILAV

   100           110           120KKYFQRITLY    LTEKKYSPCA    WEVVRAEIMR

   130           140           150SFSLSTNVQE    RLRRKE

   160           166

其中，第158位为汉族人特有的Val密码子。

2．一种重组人α型复合干扰素的制备方法，包括编码如权利要求1所述的人α型复合干扰素基因的人工构建，并由含其DNA序列表达载体的宿主细胞经发酵及纯化处理而制得。

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