CN101544981A - 一种具有降血糖生物活性的苦瓜多肽基因工程制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种具有降血糖生物活性的苦瓜多肽基因工程制备方法及应用。本发明方法包括表达载体的构建，表达、纯化等。本发明方法能够定向、稳定、高效的表达出具有生物学活性的功能多肽，有利于工业化生产。经动物实验证明采用本发明制备的多肽能显著降低糖尿病模型动物的血糖值，可用于制备防治糖尿病的药物。

Description

一种具有降血糖生物活性的苦瓜多肽基因工程制备方法及应用

技术领域

本发明涉及基因工程，具体涉及一种具有降血糖生物活性苦瓜多肽KGP的基因工程制备方法及其在制备防治糖尿病药物中的应用。

背景技术

糖尿病是现代社会对人类威胁最大的疾病之一，患者呈逐年增加的趋势。目前临床除了静脉注射胰岛素外还主要应用四类口服降血糖药物，它们是磺脲类、双胍类、葡萄糖苷酶抑制剂和噻唑烷酮类。这些口服化学类降糖药物会引起耐药性，乳酸中毒和肝损伤等一系列毒副作用，而采用注射胰岛素疗往往给患者造成很多不便，因此迫切需要一种使用方便、疗效好、副作用小、可长期安全使用的治疗新药。

苦瓜是东南亚国家的一种传统植物药材，经临床实验和动物实验都表明其具有显著的降血糖活性，并且能够缓和和减轻糖尿病引起的并发症。(Kathy Abascal等Alternative & Complementary Therapies，(2005)，179-184)同时在摄入正常剂量的情况下，不会引起任何的肝、肾毒性。(J.K.Grover等Journal ofEthnophamacology，93(2004)123-132)Khanna等在1979年从苦瓜中分离出具有类胰岛素活性的多肽P具有显著的降糖效果。(Pushpa Khanna等Journal of NaturalProducts，44(6)，1979，648-654)其后研究者又从苦瓜中陆续分离出多种物质，包括甙类、蛋白质类等都具有显著的降血糖效果。

由于苦瓜中降血糖活性成分种类多样，作用方式呈多方位多靶点，而其单个活性组分含量较低。因此如何大量提供和生产这些活性组分是作为药品开发需要解决的问题。应用现代生物工程技术将具有降血糖生物活性多肽在生物工程菌中高效表达，实现大规模工业化发酵生产是解决问题的有效途径。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于应用基因工程的方法，克隆目的蛋白基因，在工程菌中高效表达、纯化和功能鉴定具有降血糖生物活性的苦瓜多肽。

本发明提供一种发酵生产具有降血糖生物活性苦瓜多肽KGP的方法。该方法是按照苦瓜中已经公开的降血糖活性多肽的氨基酸序列，根据工程菌偏爱的密码子特性，人工化学合成相应的核苷酸序列，构建表达载体，转化宿主菌，在适当条件下诱导表达，表达的蛋白用亲和层析介质纯化，将纯化的目的蛋白透析去盐，冷冻干燥。

本发明方法包括下列步骤：

(1)PCR法合成两端带有限制性酶切位点的有如SEQ ID：1寡核苷酸序列的具有降血糖生物活性苦瓜多肽KGP核苷酸编码序列，并进一步优化为SEQID：2；

(2)将步骤(1)中得到的核苷酸序列连结到表达载体中，得到重组表达载体；

(3)将步骤(2)中得到的重组表达载体转化到大肠杆菌宿主中，并在表达步骤(1)中所述的核苷酸编码序列的KGP的条件下，培养被转化的宿主细胞；

(4)从步骤(3)培养的宿主细胞的培养基中和细胞内回收并纯化表达产物具有降血糖生物活性的苦瓜多肽。

所述步骤(1)限制性酶切位点N端是BamHI酶切位点，C端是HindIII酶切位点。采用的生物工程菌为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、面包酵母或毕赤酵母。

步骤(2)表达载体是携带T7/T5启动子的pET/pQE质粒及其衍生物。具体表达载体是pET32a/pQE8。步骤(3)的大肠杆菌宿主是大肠杆菌BL21(DE3)/M15细胞系。步骤(4)的回收并纯化采用镍柱亲和纯化。

本发明的具有降血糖生物活性苦瓜多肽KGP核苷酸编码序列是指从SEQID：2核酸序列的第21个碱基至第75个碱基。其中的KGP核苷酸编码序列是从SEQ ID：2的第23位，第35位的密码子为A；第29位，第38位的密码子为T；第68位和第71位的密码子为A和G中的一种。

根据本发明，首先依据已公开的苦瓜降糖活性多肽序列如SEQ ID：3序列，根据大肠杆菌偏爱的密码子，提供了人工设计合成带有BamHI酶切位点和HindIII酶切位点的核苷酸序列如SEQ ID：1序列。经PCR(聚合酶链式反应)扩增(实施例1)和双酶切反应(实施例2)后连接到pET32a或者pQE8表达载体上，从而得到重组表达载体。将重组表达载体转入大肠杆菌宿主BL21或者M15，于37℃在LB+抗生素的培养基中加入0.4mM IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导表达。

根据本发明，重组表达得到的表达产物具有降血糖生物活性的苦瓜多肽N端带有多个(至少5个)连续的组氨酸，最优方案采用镍柱亲和洗脱的方式分离纯化表达产物，步骤少，纯度高，活性损失小。

按照本发明，融合表达的具有降血糖生物活性的苦瓜多肽和非融合表达的具有降血糖生物活性的苦瓜多肽均具有显著的降血糖效应(p<0.01或p<0.05)，采用pET32a和pQE8表达载体表达该活性多肽对其活性基本没有影响。pET和pQE载体其他的衍生物均可用于该多肽的表达。

本发明的另一目的提供了上述具有降血糖生物活性的苦瓜多肽KGP在制备防治糖尿病药物中的应用。

本发明人将上述具有降血糖生物活性的苦瓜多肽用生理盐水配置成高、中、低三个剂量的溶液对糖尿病模型实验动物进行静脉注射，测定不同给药时间动物血糖值，以正常组和模型对照组做参比，确定该苦瓜降糖活性多肽蛋白具有明显的降血糖作用。

本发明人用PCR、双酶切和DNA系列测定表明该具有降血糖生物活性的苦瓜多肽核酸序列约80bp已经整合到表达载体质粒上，SDS-PAGE凝胶电泳图表明经IPTG诱导后，在预测的目的蛋白分子量大小处有新的蛋白出现，亲和层析后的样品经SDS-PAGE凝胶电泳检测表现为一条单一的条带。纯化的目的蛋白苦瓜降糖活性多肽的药理动物实验表明，与模型对照组比较，两种表达载体表达的蛋白苦瓜降糖活性多肽，在静脉给药4小时后均能显著降低四氧嘧啶糖尿病动物模型组血糖值，其中表达载体C血糖值p<0.05，表达载体D血糖值p<0.01，证明目的蛋白苦瓜降糖活性多肽具有明显的降血糖作用。

表1 不同受试药物对四氧嘧啶糖尿病模型小鼠血糖值的影响

(n＝10，x±s)

注：^**表示与正常对照组比较，P<0.01；Δ表示与模型对照组比较，P<0.05；ΔΔ表示与模型对照组比较，P<0.01。其中C为pET32a重组表达载体，D为pQE8重组表达载体。

通过生物工程技术，利用基因工程菌大量生产苦瓜中具有降血糖活性的多肽KGP，经动物实验证明其降血糖生物学活性在细菌中仍然存在，能够显著降低糖尿病模型动物的血糖值，并且维持较长的作用时间。为大规模发酵生产提供有效的途径。

以细菌发酵生产植物活性多肽的方法，具有生长迅速、成本低廉、纯化工艺简单、易于扩大培养等优点，有利于实现规模生产。

序列说明

SEQ ID：1，SEQ ID：2序列中所用的碱基符号含义如下：

R＝A或G；Y＝C或T；H＝A，C或T；N＝A，C，G或T

A：腺嘌呤核苷G：鸟嘌呤核苷C：胞嘧啶核苷T：胸腺嘧啶核苷

附图说明

图1目的蛋白不同诱导时间的12％SDS-PAGE凝胶电泳图

泳道1：加入0.4mM IPTG诱导4h后分离的包涵体；泳道2：加入0.4mMIPTG诱导2h后分离的包涵体；泳道3：加入0.4mM IPTG诱导0.5h后分离的包涵体；泳道4：加入0.4mM IPTG诱导0h后分离的包涵体；泳道5：分子量标准品；泳道6：加入0.4mM IPTG诱导4h后的细胞裂解液；泳道7：加入0.4mM IPTG诱导2h后的细胞裂解液；泳道8：加入0.4mM IPTG诱导0.5h后的细胞裂解液；泳道9：加入0.4mM IPTG诱导0h后的细胞裂解液。

图2过亲和层析柱(Ni-NTA)后样品的12％SDS-PAGE凝胶电泳图

泳道1：洗脱液(elute buffer)洗脱第三次收集的溶液；泳道2：洗脱液(elutebuffer)洗脱第二次收集的溶液；泳道3：洗脱液(elute buffer)洗脱第一次收集的溶液；泳道4：洗涤液(wash buffer)洗脱第二次收集的溶液；泳道5：洗涤液(wash buffer)洗脱第一次收集的溶液；泳道6：细胞裂解液经过Ni-NTA柱后剩余溶液；泳道7：细胞裂解液；泳道8：分子量标准品。

具体实施方式

实施例1

PCR法得到具有降血糖生物活性的苦瓜多肽KGP核苷酸序列片段

根据已经公开的有如SEQ ID：3多肽序列的苦瓜降血糖活性多肽KGP氨基酸序列，按照生物工程菌偏爱的密码子设计并人工化学合成两端带有酶切位点的核苷酸序列，以该序列为模板，用核苷酸序列两端15-35bp的片段(包括酶切位点)合成引物，PCR反应体系如下：

ddH₂O                        18.9μl

PCR缓冲液(10X)               2.5μl

MgCl₂(25mM)                  1.5μl

dNTP mix(10mM)               0.5μl

引物1(10μM)                  0.5μl

引物2(10μM)                  0.5μl

Taq DNA聚合酶(5u/μL)         0.3μl

模板                         03μl

合计                         25ul

PCR循环条件如下：

94℃     3min

72℃     30sec

72℃     5min

PCR产物经1.0-2.5％琼脂糖电泳检测分离，切下苦瓜降糖活性多肽目的条带，用胶回收试剂盒纯化，克隆到中间pMD-18T载体上，转化大肠杆菌DH5α菌株，经PCR鉴定后选择阳性克隆送样测序，鉴定序列顺序正确。

实施例2

表达载体(pET32a-KGP/pQE8-KGP)的构建

用相应的酶切位点分别消化鉴定序列正确的目的基因PCR产物和表达载体pET32a/pQE8，酶切体系如下：

回收的PCR产物     43μl

10×缓冲液        5μl

酶1               1μl

酶2               1μl

合计                   50ul

37℃酶切1-4h用胶回收试剂盒纯化酶切产物。

抽提表达质粒方法如下：

(1)从平板上挑取一个单菌落，转到一个含有5mlLB(Amp⁺)液体培养基的试管中，于37℃剧烈振摇培养16～20h，摇床速度为250rpm；

(2)取菌液于离心管中4℃，12000rpm离心30s，弃上清液，干燥沉淀；

(3)将细菌沉淀重悬于100μl用冰预冷的溶液I中，冰上放置10min；

(4)加入溶液II200μl，快速颠倒5次，置于冰上；

(5)加入溶液III150μl，振荡10s，冰浴10～15min；

(6)4℃，12000rpm离心5min，取上清液于另一试管中；

(7)加入等量的酚：氯仿(1：1)，振荡混合，于4℃，12000rpm离心2min；

(8)取上清液于另一试管中，加入200μg/ml RNA酶5μl在37℃30min后加入等量的氯仿：异戊醇(24：1)混合，于4℃，12000rpm离心2min；

(9)取上清液于另一试管中后加入2倍体积的乙醇，振荡混合，—20℃放置30min；后4℃以12000rpm离心5min，弃上清液；

(10)用1ml70％乙醇洗涤振荡，于4℃，12000rpm离心5min；

(11)弃上清，倒置约30min使其干燥；

(12)加入10～50μl的水溶解，置于冰箱中备用。

其中溶液I，II，III配方按《分子克隆实验指南》附录1：1579-1580。酶切消化载体，体系如下：

载体                     41μl

10×缓冲液               5μl

酶1                      2μl

酶2                      2μl

合计                     50μl

37℃酶切1-4h用胶回收试剂盒纯化酶切产物。

载体和具有降血糖生物活性的苦瓜多肽KGP目的基因的连接连接体系：

10×连接酶缓冲液          2μl

酶切回收后的载体大片段    2μl

酶切后的苦瓜降糖活性多肽目的基因片段       8μl

T4 DNA连接酶             8μl

合计                     20μl

22℃连接0.5-4个小时，将连接反应混合液转入大肠杆菌DH5α菌株中，挑取单菌落，在装有1ml LB+抗生素的1.5ml离心管中37℃培养8～10h。将每管进行编号，每管取50μl培养物，用作模板进行PCR检测。剩余950μl培养物保存于4℃。电泳，检测PCR产物，抽提重组质粒并双酶切鉴定，选择阳性克隆送样测序，进一步确证苦瓜降糖活性多肽目的基因已正确插入到载体中。证明表达载体构建成功。

实施例3

具有降血糖生物活性的苦瓜多肽KGP目的蛋白的表达

抽提重组质粒pET32a-KGP/pQE8-KGP，将重组质粒转化相应表达菌株BL21/M15。随机挑取长出的单菌落，在LB+Amp/Kan(氨苄青霉素/卡那青霉素)(100mg/ml)的液体培养基37℃培养过夜，吸取50μl，然后煮沸5min，2000rpm离心1min，取上清为模板进行PCR扩增反应检测重组子。

将PCR阳性的重组菌接种于1.5ml的LB+Amp/Kan(100mg/ml)的液体培养基中。另外接种一份培养物作为未诱导的对照。37℃振荡培养过夜。再从过夜培养物中各取500μl接种到100ml预热的LB培养液(加入抗生素)中，37℃振荡培养至吸光度OD₆₀₀为0.3-0.9。在菌液中加入IPTG，分几种终浓度(0.1-2.5mM)，筛选最佳诱导浓度，诱导表达，分别在1h、2h、3h、4h、5h、6h取出1ml菌液，12000rpm离心2分钟收集菌体，弃上清。细菌沉淀用100μl1×裂解液(lysisbuffer)(PBS或STE)悬浮，超声破碎，100℃加热5分钟，使蛋白质变性。对照也用同样的方法处理。通过SDS-PAGE检测表达产物随着时间的变化情况。SDS-PAGE检测表达产物

1)在一个三角瓶中配制分离胶溶液(12％)。依次混合各成分，加入TEMED(N，N，N′，N′-四甲基乙二胺)后，迅速在两玻璃板的间隙中灌注丙烯酰胺溶液。在丙烯酰胺溶液上覆盖一层水。放置于室温下至凝胶完全聚合。

2)分离胶聚合完全后，倾出覆盖的水，用去离子水洗涤凝胶顶部数次以除去未聚合的丙烯酰胺。用纸巾吸净残留液体。

3)配制浓缩胶，在已聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶，立即在浓缩胶液体中插入干净的梳子。放置于室温下凝固。

4)浓缩胶聚合完全后，小心移出梳子，用去离子水洗涤加样槽以除去未聚合的丙烯酰胺。加样，每样品加20μl。

5)将电泳装置与电源相接(正极接下槽)，凝胶上所加电压为8V/cm。当染料进入分离胶后，把电压提高到15V/cm。

6)电泳结束后，取出凝胶，放于染色液(甲醇:水:冰乙酸＝4.5:4.5:1，加0.25g考马斯亮蓝)中染色过夜。

7)用脱色液(甲醇:水:冰乙酸＝4.5:4.5:1)脱色至蛋白条带清晰没有背景为止。

注：对于不同的表达载体为了检测表达蛋白具有降血糖生物活性的苦瓜多肽KGP可以适当的提高分离胶的浓度12％-15％。电泳结果显示在预测的具有降血糖生物活性的苦瓜多肽KGP目的蛋白分子量大小处有新的蛋白出现，而对照没有，证明具有降血糖生物活性的苦瓜多肽KGP目的蛋白成功表达，并且随着诱导时间的增加蛋白表达量也增加。

实施例2和3的

(1)LB培养基组成(g/L)

胰化蛋白胨       10

酵母提取物       5

NaCl             10

调pH值至7.0后高压灭菌

(2)12％浓度分离胶的配方：

水                         3.3ml

30％丙烯酰胺溶液           4.0ml

1.5mMTris(pH8.8)           2.5ml

10％SDS                    0.1ml

10％过硫酸铵               0.1ml

TEMED                      0.004ml

(3)浓缩胶的配方：

水                         3.4ml

30％丙烯酰胺溶液           0.83ml

1.0mM Tris(pH6.8)          0.63ml

10％SDS                    0.05ml

10％过硫酸铵               0.05ml

TEMED                      0.005ml

实施例4

目的蛋白具有降血糖生物活性的苦瓜多肽KGP的纯化

1)放大体系诱导表达目的蛋白具有降血糖生物活性的苦瓜多肽KGP，方法同实施例3，诱导时间为2-6小时。

2)12000rpm离心5分钟收集菌体，弃上清。

3)用原始菌液1/25体积的裂解液悬浮菌体，在室温下缓慢搅拌0.5-1小时，超声破碎，裂解完全后菌的悬浮液会变得澄清。

4)12000rpm下离心30分钟以移去细胞碎片，将上清转移到一个新鲜的管内。

5)用裂解液平衡亲和介质。

6)将裂解得到的上清加到平衡好的镍柱柱子上。

7)等液体流尽后，用洗涤液洗柱子，洗三次。

8)用洗脱液洗脱目的蛋白具有降血糖生物活性的苦瓜多肽KGP，收集洗脱液。

9)将含有目的蛋白具有降血糖生物活性的苦瓜多肽KGP的液体放入透析袋内，在蒸馏水中4℃透析过夜，期间经常更换蒸馏水。

10)冷冻干燥，SDS-PAGE检测纯化的目的蛋白具有降血糖生物活性的苦瓜多肽KGP。

SDS-PAGE凝胶电泳显示经过洗脱液洗脱数次后，在目的蛋白分子量大小处，纯化的目的蛋白具有降血糖生物活性的苦瓜多肽KGP表现为单一的条带。

裂解液，洗涤液和洗脱液系Tris-HCl缓冲体系或磷酸缓冲体系pH值6.8-8.5。

实施例5

目的蛋白具有降血糖生物活性的苦瓜多肽KGP降血糖活性药理实验

昆明种小鼠，体重27-30g，雄性，饲养一天后，禁食不禁水12h，尾静脉注射8mg/ml的四氧嘧啶生理盐水溶液50-80mg/kg(iv0.1ml/10g)，诱导小鼠发生糖尿病，4-5小时后，灌胃50％葡萄糖0.8ml/只。72h后(禁食12小时)用稳捷基础加倍型血糖检测仪测定小鼠血糖，选取血糖范围在15-25mmol/L者随机分为9组，每组10只。模型对照组，给予等体积生理盐水；阳性对照组，给予盐酸二甲双胍1250mg/kgBW；C组高、中、低剂量组分别给予本发明表达蛋白具有降血糖生物活性的苦瓜多肽KGP1(融合表达的目的蛋白)，剂量在30mg/kg-2mg/kg范围内；D组高、中、低剂量组，分别给予本发明表达蛋白苦瓜降糖活性多肽2(非融合表达的目的蛋白)，剂量同蛋白具有降血糖生物活性的苦瓜多肽KGP1。空载体组给予空载体5mg/ml。另取10只正常小鼠作为正常对照组。小鼠禁食不禁水12h后，除阳性对照组为灌胃给药外，其余各组均尾静脉注射给予受试药物或等体积生理盐水0.1ml/10g体重，给药后0.5h，2h及4h用试纸法测定空腹血糖值。实验数据用均数±标准差表示，采用SPSS统计软件进行统计处理。

结果显示，与对照组比较，二甲双胍1250mg/kg口服后0.5h、2h、4h均能显著降低四氧嘧啶糖尿病小鼠血糖值P<0.01；C高剂量组和中剂量组静脉给药4h后均能显著降低四氧嘧啶糖尿病小鼠血糖值P<0.05；D低剂量组静脉给药4h后也能显著降低四氧嘧啶糖尿病小鼠血糖值P<0.01，见表1，证明利用生物工程菌能够表达出具有和本发明的具有降血糖生物活性的苦瓜多肽KGP相同功能的活性蛋白。

序列表

SEQ ID：1的信息

序列特征

长度：83个碱基

类型：核酸

链型：单链

拓扑结构：线形

序列描述

CGGGATCCAT  CGAAGGTCGT  

TAAGCT  TGG

SEQ ID：2的信息

序列特征

长度：83个碱基

类型：核酸

链型：单链

拓扑结构：线形

序列描述

CGGGATCCAT  CGAAGGTCGT  

TAAGCT  TGG

SEQ ID：3的信息

序列特征

长度：18个氨基酸

类型：氨基酸

链型：单链

拓扑结构：线形

序列描述

K-T-N-M-K-H-M-A-G-A-A-A-A-G-A-V-V-G

Claims (8)

1、一种具有降血糖生物活性的苦瓜多肽的基因工程制备方法，其特征在于该方法包括下列步骤：

(1)PCR法得到两端带有限制性酶切位点的有如SEQ ID：1寡核苷酸序列的具有降血糖生物活性的苦瓜多肽核苷酸编码序列；并进一步优化为SEQ ID：2；

(2)将步骤(1)中得到的具有降血糖生物活性的苦瓜多肽核苷酸序列连结到表达载体中，得到具有降血糖生物活性的苦瓜多肽重组表达载体；

(3)将步骤(2)中得到的具有降血糖生物活性的苦瓜多肽重组表达载体转化到大肠杆菌宿主中，并在表达步骤(1)中所述的具有降血糖生物活性的苦瓜多肽核苷酸编码序列的条件下，培养被转化的宿主细胞；

(4)从步骤(3)培养的宿主细胞的培养基中和细胞内回收并纯化表达产物具有降血糖生物活性的苦瓜多肽。

2、根据权利要求1所述的一种具有降血糖生物活性的苦瓜多肽的基因工程制备方法，其特征在于所述具有降血糖生物活性苦瓜多肽核苷酸编码序列为SEQID：2核酸序列的第21个碱基至第75个碱基；其中的SEQ ID：2的第23位、第35位的密码子为A；第29位、第38位的密码子为T；第68位和第71位的密码子为A或G。

3、根据权利要求1所述的一种具有降血糖生物活性的苦瓜多肽的基因工程制备方法，其特征在于其中所述步骤(1)的限制性酶切位点N端为BamHI酶切位点，C端为HindIII酶切位点。

4、根据权利要求1所述的一种具有降血糖生物活性的苦瓜多肽的基因工程制备方法，其特征在于其中所述步骤(1)采用的生物工程菌为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、面包酵母或毕赤酵母。

5、根据权利要求1所述的一种具有降血糖生物活性的苦瓜多肽的基因工程制备方法，其特征在于其中所述步骤(2)的表达载体是携带T7/T5启动子的pET/pQE质粒及其衍生物。

6、根据权利要求1所述的一种具有降血糖生物活性的苦瓜多肽的基因工程制备方法，其特征在于其中所述步骤(2)的表达载体是pET32a/pQE8。

7、根据权利要求1所述的一种具有降血糖生物活性的苦瓜多肽的基因工程制备方法，其特征在于其中所述步骤(3)的大肠杆菌宿主是大肠杆菌BL21 DE3/M15细胞系。

8、根据权利要求1所述的一种苦瓜降糖活性多肽的基因工程制备方法，其特征在于其中所述步骤(4)的回收并纯化采用镍柱亲和纯化。

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