CN1199993C - 一种n－端缺失脂肪细胞补体相关蛋白及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及一种新型重组脂肪细胞补体相关蛋白的蛋白质结构和制备方法及其应用。本发明根据apM1的结构特点和作用方式，获取新型N-端缺失脂肪细胞补体相关蛋白结构。用RT-PCR获取定点突变的N-端缺失基因，然后和原核表达载体pLY4重组，转化大肠杆菌JF1125。经三步法纯化N-端缺失脂肪补体相关蛋白。所得产品冻干后，可降低血糖、血脂，减轻体重，可用于糖尿病、肥胖症治疗。

Description

一种N-端缺失脂肪细胞补体相关蛋白及其制备方法

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及一种新型重组脂肪细胞补体相关蛋白。更具体地，本发明涉及N-端缺失脂肪细胞补体相关蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

全长人脂肪细胞补体相关蛋白(adipose most abundanttranscript 1简称apM1)可由人血浆中提取，其结构分为四部分：N-端信号肽、无同源互补区、胶原类似区和头状结构域区。是一种近年来新发现的为脂肪细胞特异表达分泌的蛋白，该基因在脂肪细胞分化过程中表达可提高100倍。表达产物与补体c1q有40％的同源性，故称其为补体相关蛋白。有研究表明其与肥胖基因产物瘦素在氨基酸序列和蛋白序列上分别有35.7％和48％的相似性。表达产物分泌到血浆中，分泌过程受胰岛素的调控。Norther Blot检测证实该基因仅在白色脂肪中表达。近年来，研究人员发现此蛋白在肥胖病人及肥胖小鼠中显著降低，给予高脂饮食肥胖小鼠静脉注射此蛋白，可在不影响胰岛素和瘦素水平的情况下，显著降低血糖和血脂水平。另有研究报道在血浆中用单抗检测到约为apM1全长70％的蛋白产物。

发明内容

本发明的目的是提供一种兼具降低血糖和减轻体重两种功能的重组蛋白N-端缺失脂肪细胞补体相关蛋白，与全长脂肪细胞补体相关蛋白相比，该蛋白分子量较小，作用更为迅速。

本发明根据apM1的结构特点和作用方式，制备新型N-端缺失脂肪细胞补体相关蛋白，本发明的N-断缺失脂肪细胞补体相关蛋白仅为全长的50％序列，且同时具有降低血脂和血糖，减轻体重的作用。本发明制备工艺简便安全，利用基因工程手段生产，所得产品除了具有全长片段功能外，还能有效、迅速降低血甘油三酯。

全长apM1是含244个氨基酸的蛋白质，分子量约为37KD，主要发挥作用的位点在球状结构域。本发明设计了含球状结构域的缺失体，将Phe176替换为Asp 176，增加了极性，有利于作用的发挥。表1为序列表SEQ ID NO：1，显示本发明N-端缺失脂肪细胞补体相关蛋白的氨基酸序列。

表2为序列表SEQ ID NO：2，显示本发明N-端缺失脂肪细胞补体相关蛋白的核甘酸序列。

本发明的另一目的是提供一种生产本发明的方法，包括克隆编码N-端缺失脂肪细胞补体相关蛋白序列部分的cDNA片段，与载体重组后转化宿主细胞，在适当的条件下进行大规模培养，从宿主细胞中回收和纯化N-端缺失脂肪细胞补体相关蛋白。

本发明中N-端缺失脂肪细胞补体相关蛋白的制备包括RT-PCR克隆和定点突变基因片段，与质粒pLY4重组，DNA限制性内切酶酶切鉴定筛选阳性克隆，核苷酸序列分析验证片段序列及连接是否正确。

将本发明的cDNA片段和表达载体重组，形成表达质粒。本发明不限于特定的表达载体，只要能够与所述的cDNA片段重组，形成适宜表达的质粒。如pLY4和pET32(+)，在一优选实施方案中，本发明使用原核表达载体pLY4。

上述重组表达载体按常规方法导入适宜宿主细胞。本发明不局限于任何特定的宿主细胞，只要它能够表达所述重组表达载体。如大肠杆菌JF1125和大肠杆菌BL21，在一优选的实施方案中，本发明使用大肠杆菌JF1125。

本发明的表达产物在包涵体中，只需进行超声碎菌，变性复性，即可分离和纯化所需产品。

以上技术方案中所有基本分子生物学操作均参照《分子克隆实验指南》。

与全长脂肪细胞补体相关蛋白性质比较表明，本发明N-端缺失体降低血糖和血脂能力较全长要强。

具体实施方式

实施例1.N-端缺失脂肪细胞补体相关蛋白的设计、制备和性质鉴定：

(1)N-端缺失脂肪细胞补体相关蛋白基因的克隆及原核表达质粒gapM1-pLY4的构建

按照N-端缺失脂肪细胞补体相关蛋白的设计氨基酸顺序，按照大肠杆菌的偏好密码子设计核苷酸顺序。设计引物用RT-PCR克隆出基因并进行定点突变。先与pUC19重组，转入大肠杆菌JM109，酶解筛选阳性克隆，核苷酸序列分析证实基因序列与设计相同。再将目的片段切出，与pLY4重组，构成原核表达载体gapM1-pLY4，转入大肠杆菌JF1125，酶解筛选阳性克隆，核苷酸序列分析证实基因序列与设计相同。证实获得阳性克隆。

限制性内切酶购自BRL公司，大肠杆菌JM109、JF1125，质粒pLY4、pUC19为本室保存。

(2)gapM1基因的原核表达

挑取数个阳性克隆菌落，在LB溶液中30℃振荡培养过夜，然后，以M9CA培养基1∶50稀释，30℃振荡培养至A₆₀₀为0.6时升温至42℃，诱导表达3小时。诱导结束后，离心收集细菌，用PBS(PH＝7.4)洗涤2次，用SDS-PAGE分析表达产物，考马斯亮蓝R-250染色后，Pharmacia Imagenaster VDS扫描定纯度、分子量。可见诱导后上清液在分子量约16KD处有一浓集的条带。经扫描，目的蛋白约占菌体总蛋白的30％。筛选高gapM1表达克隆。SDS-PAGE按Laemmli方法进行。

(3)诱导表达工程菌  选取高表达菌株，用5升发酵罐进行低密度发酵，稳度诱导表达后收集菌体，PBS洗涤，-70℃保存待用。发酵参数：30℃，PH6.8，溶氧60％，搅拌速度随氧含量连动，至A₆₀₀为2时升温至42℃诱导表达。

(4)包涵体的分离、溶解与复性

湿菌用PB缓冲液悬浮，以高压匀浆泵压榨。离心后，SDS-PAGE分析目的蛋白的存在状态。结果显示目的蛋白存在于包涵体沉淀中。

压榨离心所得沉淀经洗涤液(0.05MPB，PH7.4，0.1M NaCl)洗涤三次。离心后，以溶解液[0.05MPB(PH7.4)，8M尿素，2.5％蔗糖，0.5％β-巯基乙醇]溶解，室温作用2小时，至澄清透明。超速离心后弃沉淀，取上清稀释复性。复性液为0.05MPB，PH7.4，0.1M NaCl，2.5％蔗糖，0.5％β-巯基乙醇。

(5)凝胶过滤

Sephadex G-50柱(Pharmacis公司)用20mmol/L PB(Ph7.4)平衡后，将稀释复性液直接上柱，然后用PB洗脱，流速10ml/min，收集活性峰。

(6)S-Sepharose Fast Flow柱层析

以10倍体积的50mmol/L PB(Ph6.0)平衡S-Sepharose Fast Flow柱，将凝胶过滤后收集的有效部分上柱，Waters色谱仪控制流速和检测蛋白峰。上样结束后，以50mmol/L PB(pH6.0)缓冲液洗至基线，0-1M NaCl梯度洗脱，收集洗脱组分，SDS-PAGE分析目的蛋白分布，将目的蛋白分装冷冻干燥，-40℃保存。

(7)纯度鉴定及分子量测定：

样品进行15％SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝R-250染色后，Pharmacia Imagenaster VDS扫描定纯度、分子量。所得产品纯度93％以上，分子量约16KD。

(8)测定促脂肪酸氧化活性

将C2C12细胞于分化液(DMEM，2.5％马血清)中培养七天，加入目的蛋白前1小时换成前孵育液(MEM，3mM/L葡萄糖，4mM谷氨酰胺合成酶，25mM Hepes，1％无自由脂肪酸的BSA，0.25mM油酸盐，5ug/ml Gentamycin)。实验开始加入C^-14标记的油酸和5ml纯化的目的蛋白和全长蛋白，孵育90分钟。测定溶液中C^-14标记的CO₂含量。结果显示，N-端缺失体在90分钟时促脂肪酸氧化活性比全长蛋白高约30％。

实施例2  N-端缺失脂肪细胞补体相关蛋白的应用：

应用本发明所制备的N-端缺失脂肪细胞补体相关蛋白进行减肥和降低血糖的实验，证实其在肥胖和II型糖尿病的防治中有重要的作用。

(1)降低体重

给3月龄C57BL/6J小鼠高脂饮食6月形成肥胖小鼠模型。对照组给予生理盐水和继续高脂饮食，gapM1治疗组静脉给予25ugN-端缺失脂肪细胞补体相关蛋白，每天一次，全长治疗组静脉给予全长蛋白25ug，均继续高脂饮食。16天后，治疗组体重开始明显降低。表3为gapM1对高脂饮食喂饲后小鼠的体重的影响。

表3

组别	鼠数	原始体重(g)	16天后体重(g)	下降百分比	P值
						对照组	8	51.2±4.5	51.0±4.2	0.001％	＞0.05
GapM1治疗组	8	54.3±3.2	50.23±2.8	7.5％	0.001
						全长治疗组	8	51.9±4.1	50.04±3.8	3.2％	0.025

(2)降低血糖、血自由脂肪酸和血甘油三酯作用

给予C57BL/6J小鼠高脂饮食，同时对照组(n＝8)静注生理盐水，给药组(n＝8)给予gapM1 25ug，分别于45min和105min测小鼠血糖、血自由脂肪酸和血甘油三酯水平。结果显示，gapM1可显著降低膳食后血糖、血自由脂肪酸和血甘油三酯水平(p＜0.05)见表2。血糖、血自由脂肪酸和血甘油三酯检测应用Sigma公司血葡萄糖、血自由脂肪酸和血甘油三酯检测试剂盒检测。表4为gapM1对膳食后血糖、血自由脂肪酸和血甘油三酯的作用

表4

	组别	45min	105min
				血糖(mg/dl)	对照组	200±7.5	240±2.5
用药组	200±7.5	175±6.5
			血自由脂肪酸(Mm)		对照组	0.9±0.033	1.1±0.03
用药组	0.8±0.025	0.9±0.024
				血甘油三酯(mg/dl)	对照组	130±5	140±16
用药组	140±3	100±4

无需进一步详细阐述，相信采用前面所公开的内容，本领域技术人员可最大限度地应用本发明。因此，前面的优选具体实施方案应被理解为仅是举例说明，而非以任何方式限制本发明的范围。

从以上描述，本领域技术人员可很容易地明了本发明的本质特征，而且在不偏离其主旨和范围的情况下，可对本发明进行各种变更和改进。

表1 SEQ ID NO：1

1                                            30

AYVYRSAFSVGLETYVTIPNMPIRFTKIFY

31                                           60

NQQNHYDGSTGKFHCNIPGLYYFAYHITVY

61                                           90

MKDVKVSLDKKDKAMLFTYDQYQENNVDQ

91                                           120

ASGSVLLHLEVGDQVWLQVYGEGERNGLYA

121

DNDNDSTFTGFLLYHDTN

表2  SEQ ID NO：2

GCC TAT GTA TAC CGC TCA GCA TTC AGT GTG GGA TTG GAG ACT TAC GTT

ACT ATC CCC AAC ATG CCC ATT CGC TTT ACC AAG ATC TTC TAC AAT CAG

CAA AAC CAC TAT GAT GGC TCC ACT GGT AAA TTC CAC TGC AAC ATT CCT

GGG CTG TAC TAC TTT GCC TAC CAC ATC ACA GTC TAT ATG AAG GAT GTG

AAG GTC AGC CTC GAC AAG AAG GAC AAG GCT ATG CTC TTC ACC TAT GAT

CAG TAC CAG GAA AAT AAT GTG GAC CAG GCC TCC GGC TCT GTG CTC CTG

CAT CTG GAG GTG GGC GAC CAA GTC TGG CTC CAG GTG TAT GGG GAA GGA

GAG CGT AAT GGA CTC TAT GCT GAT AAT GAC AAT GAC TCC ACC TTC ACA

GGC TTT CTT CTC TAC CAT GAC ACC AAC

Claims (10)

1、一种新型重组人N-端缺失脂肪细胞补体相关蛋白，其特征在于改变人全长脂肪细胞补体相关蛋白的结构，去除N-端107个氨基酸，将Phe176替换为Asp176，具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列。

2、权利要求1的新型重组人N-端缺失脂肪细胞补体相关蛋白的制备方法，其特征在于采用下列步骤：

(1)设计新型人N-端缺失脂肪细胞补体相关蛋白分子结构，使其氨基酸序列与SEQ ID NO：1完全一致；

(2)从脂肪细胞中获得编码N-端缺失脂肪细胞补体相关蛋白的基因，根据SEQID NO：1的氨基酸序列对该基因进行定点突变，突变后的核苷酸序列与SEQID NO：2完全相同；

(3)在适于表达的载体中表达新型人N-端缺失脂肪细胞补体相关蛋白基因；

(4)用该重组载体转染适于表达的宿主细胞；

(5)在适于表达该cDNA片段的条件下培养宿主细胞，并从中回收和纯化所需产物。

3、根据权利要求2所述的方法，其中所使用的载体不限于特定的表达载体，只要它能够与所述cDNA片段重组，形成适宜表达的质粒。

4、根据权利要求3所述的方法，其中所使用的载体为原核表达载体。

5、根据权利要求4所述的方法，其中所使用的载体为pLY4。

6、根据权利要求2所述的方法，其中所使用的宿主细胞不局限于特定的宿主细胞，只要它能够表达所述重组表达载体。

7、根据权利要求6所述的方法，其中所使用的宿主细胞为大肠杆菌JF1125。

8、根据权利要求2所述的方法，其中培养宿主细胞所使用的方法为发酵方法，用低营养培养基30℃扩增工程菌，达一定浓度后42℃诱导表达，发酵参数为：温度42℃，氧容量控制在33-40％，pH为5，搅拌速度与OD连动。

9、根据权利要求2所述的方法，其中新型重组人N-端缺失脂肪细胞补体相关蛋白的最终产物是通过工程菌发酵后匀浆，经变性、凝胶过滤、离子交换法纯化而获得。

10、权利要求1的人N-端缺失脂肪细胞补体相关蛋白在制备防治肥胖、高血糖和高血脂药物中的应用。