CN109942716A - 一种用于治疗代谢疾病的瘦素融合蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于治疗代谢疾病的瘦素融合蛋白及其制备方法和应用，属于瘦素及成纤维细胞生长因子21技术领域。本发明的技术方案要点为：用于治疗代谢疾病的瘦素融合蛋白是由人FGF21蛋白的N端与人Leptin蛋白融合而成的，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示。本发明还公开了该用于治疗代谢疾病的瘦素融合蛋白的制备方法及其作为治疗糖尿病、肥胖症或代谢综合症药物中的应用。本发明提供的瘦素融合蛋白hLeptin‑hFGF21在糖尿病肥胖模型小鼠上具有良好的降糖和降脂作用，并在体重改善方面也表现出了显著的效果。

Description

一种用于治疗代谢疾病的瘦素融合蛋白及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种用于治疗代谢疾病的瘦素融合蛋白，本发明还涉及该人瘦素（Leptin）和人成纤维细胞生长因子21（FGF21）融合蛋白的制备方法及其在制备治疗代谢疾病药物中的用途，属于瘦素及成纤维细胞生长因子21技术领域。

背景技术

糖尿病是一种由多种病因引起的血中胰岛素绝对或相对不足，导致血糖过高，出现糖尿，进而引起脂肪和蛋白质代谢紊乱的非传染性慢性代谢类疾病，临床上可出现多尿、烦渴、多饮、多食，消瘦等表现，重者容易发生酮症酸中毒等急性并发症或血管、神经等慢性并发症。其患病率、致残率、病死率以及总体健康危害程度，是继心脑血管疾病和癌症之后人类第3大杀手。随着糖尿病在世界范围内发病率日益增加，严重威胁着人类的健康，目前虽已有多种治疗药物，但都具有疗效有限且存在安全性问题的缺点。因此，研制治疗糖尿病有效的新药及制定有效的治疗方案成为许多国家共同努力的目标。

肥胖是一种以身体脂肪含量过多的重要特征的、多病因的、能够并发多种疾病的的慢性病。肥胖发生的原因很多，如饮食、遗传、内分泌失调、精神、生理、环境、运动少等因素，其中摄入过多和运动减少，导致热能入超，造成脂肪堆积，是当今世界肥胖群体增加的普遍原因。肥胖不仅可以影响到机体器官结构，还与一系列的疾病相关，肥胖者多易患肥胖并发症（脂肪肝，糖尿病等）。不仅如此，肥胖是一种慢性炎症或有的称其是一种前炎性状态，肥胖者体内IL-6、TNF-α和C反应蛋白（CRP）等炎性因子的提高在肥胖的并发症如2型糖尿病、高血压、动脉粥样硬化（AS）中起着重要作用。并且有研究报道，腹型肥胖和腹部脂肪所占比例增加是冠心病和2型糖尿病及相关死亡的主要危险因素。

目前，肥胖症已被世界卫生组织列为与癌症并列的21世纪威胁人类健康的最严重的疾病。据世界卫生组织预测，到2015年全世界肥胖人群的数字将达到7亿，而体重超标的人将会达到令人震惊的23亿。故研究肥胖症及其相关疾病的病因及防治措施已成为紧迫的课题。

1994年Zhang等首次成功地克隆了小鼠的肥胖基因（obese gene，ob）ob基因及人类的同源序列。ob基因及表达产物-瘦素（Leptin）的发现使肥胖的研究获得突破性进展，而且近年瘦素与2型糖尿病的研究亦成为热点。在人类基因组中，ob基因是单拷贝序列，全长20kb，位于7q31处，包含二个内含子和三个外显子，Leptin为ob基因的表达产物，由146个氨基酸组成的单链蛋白质。Leptin由脂肪组织分泌后，进入血循环与瘦素受体结合，通过下丘脑调节食欲、能量消耗而控制体重。Leptin的作用包括中枢和外周性，Leptin作用除通过中枢神经系统，还可通过脂肪组织的Leptin受体直接抑制脂肪组织中脂类的合成。Leptin在调节机体摄食和能量代谢中发挥重要作用，在神经内分泌、血管新生、生殖、免疫调节和创伤修复等方面的作用也渐渐被人们重视，同时Leptin在肥胖、糖尿病、心血管疾病和缺血再灌注损伤等方面的作用也被重视。

2000年，Tetsuya Nishimura等人最先在小鼠胚胎中分离出FGF家族中的一个新成员并将其命名为成纤维细胞生长因子-21（FGF21）。FGF21是成纤维细胞生长因子家族的一名新成员，主要在肝脏中表达，蛋白N端前28个氨基酸为信号肽（去除信号肽后的多肽为成熟肽），因此FGF21可以分泌到细胞外。FGF21具有调节血糖、降低血脂和改善胰岛素抵抗等作用，在医药领域有着广泛的应用前景。但长期的研究及临床实验结果显示，FGF21和瘦素使用剂量高，与其它蛋白药物一样，稳定性差、体内半衰期短、易产生抗原抗体反应，这直接影响了其在临床上的治疗效果。本发明将FGF21和Leptin基因融合表达，不但增加了蛋白的可溶性表达量，并且可以显著提高其降低血糖、体重及血脂的能力，进而为糖尿病和肥胖症的治疗提供更安全、经济和有效的候选药物。

发明内容

本发明的目的是提供了一种用于治疗代谢疾病的瘦素融合蛋白及其氨基酸序列和瘦素融合蛋白编码基因的核苷酸序列，还提供了含有人FGF21基因和其与人Leptin基因连接的表达载体以及含有该表达载体的宿主细胞，瘦素融合蛋白可作为药物用于治疗糖尿病、肥胖症或代谢综合症等代谢疾病。

本发明为实现上述目的采用如下技术方案，一种用于治疗代谢疾病的瘦素融合蛋白，其特征在于：所述瘦素融合蛋白是由人FGF21蛋白的N端与人Leptin蛋白融合而成的，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示。

优选的，所述瘦素融合蛋白编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。

优选的，所述瘦素融合蛋白编码基因由人FGF21核苷酸序列与人Leptin基因片段通过连接肽连接而成。

优选的，所述连接肽为GS linker（(Gly₄Ser)₃）。

优选的，含有瘦素融合蛋白编码基因的表达载体为pET-30a，含有瘦素融合蛋白编码基因的宿主细胞为大肠杆菌BL21。

本发明所述的用于治疗代谢疾病的瘦素融合蛋白的制备方法，其特征在于具体过程为：将人Leptin基因通过连接肽GS linker连接到人FGF21基因的N端得到编码瘦素融合蛋白的核苷酸序列，再将得到的编码瘦素融合蛋白的核苷酸序列与表达载体相连接得到重组表达载体；然后将重组表达载体导入大肠杆菌感受态细胞中；筛选稳定高效表达目标蛋白的重组菌，培养细胞并诱导表达融合蛋白，收集菌体、破碎、离心、变性、复性、纯化得到瘦素融合蛋白。

优选的，将重组表达载体转化表达菌株BL21（DE3），转化后的单菌落分别接种至20mL含50 μg/mL Kan的LB培养基中，于37℃培养10 h，以体积比1:100接种于另一20 mL含50μg/mL Kan的LB培养基中，于37℃培养，当A₆₀₀在0.35时，在温度为30℃、IPTG终浓度为0.25mmol/L、转速为60 r/min的条件下诱导5 h，在此条件下进行表达瘦素融合蛋白时，能够显著提高融合蛋白的表达水平。

优选的，将重组表达载体转化宿主细胞，筛选稳定高表达阳性克隆后培养并诱导表达目标融合蛋白，离心收集菌体，超声破碎，离心，对澄清后的上清液进行离子交换层析和凝胶过滤层析分离纯化目标融合蛋白，最终得到高纯度瘦素融合蛋白。

本发明所述的瘦素融合蛋白作为治疗糖尿病、肥胖症或代谢综合症药物中的应用。

本发明与现有技术相比具有以下有益效果：本发明通过细胞试验和动物学试验结果表明，所得瘦素融合蛋白hLeptin-hFGF21相比于hLeptin或hFGF21，生物学活性显著提高，能够更加有效降低糖尿病肥胖小鼠体内的血糖及血脂水平，本发明的瘦素融合蛋白还能较好的控制体重变化。另外，本发明的瘦素融合蛋白可作为药物治疗糖尿病、肥胖症或代谢综合症等代谢疾病。

附图说明

图1是瘦素融合蛋白hLeptin-hFGF21在大肠杆菌中表达的SDS-PAGE分析图；

图2是经纯化后的瘦素融合蛋白hLeptin-hFGF21的SDS-PAGE分析图；

图3是瘦素融合蛋白hLeptin-hFGF21调节ob/ob小鼠血糖水平变化；

图4是瘦素融合蛋白hLeptin-hFGF21调节ob/ob小鼠体重变化；

图5是瘦素融合蛋白hLeptin-hFGF21调节ob/ob小鼠糖耐量变化；

图6是瘦素融合蛋白hLeptin-hFGF21调节ob/ob小鼠甘油三脂水平变化；

图7是瘦素融合蛋白hLeptin-hFGF21调节ob/ob小鼠空腹胰岛素水平变化。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1

瘦素融合蛋白hLeptin-hFGF21的制备

（1）融合蛋白表达

将含有正确序列的重组质粒pET-30a-hLeptin-hFGF21转化至表达菌株BL21（DE3）。转化后的单菌落分别接种至20 mL含Kan（50 μg/mL）的LB培养基中，于37℃培养10 h，以体积比1:100接种于另一20 mL含Kan（50 μg/mL）的LB培养基中，于37℃培养，当A₆₀₀在0.35左右时，加入IPTG至终浓度为0.25 mmol/L进行诱导，诱导温度为30℃，5 h后收获菌体，用lysisbuffer（20 mmol/L Tris，150 mmol/L NaCl，pH 8.0）重悬菌体，破碎菌体后离心，分别取上清和沉淀进行12wt% SDS-PAGE电泳分析。结果显示瘦素融合蛋白hLeptin-hFGF21大部分以可溶性形式表达，如图1所示，泳道1为蛋白标准分子量Marker；泳道2为菌体总蛋白；泳道3为破碎后沉淀；泳道4为破碎后上清。

（2）融合蛋白纯化

向菌体中加入溶菌酶（1 mg/mL），冰上放置30 min，超声波细胞破碎菌体细胞（工作1s，间隔1 s，4 min/次，共3次循环）。破碎彻底后，12000 rpm离心，取上清，上清过0.45 μm滤膜澄清，澄清后液体经AKTA purifier 100系统，与5倍柱体积IEX buffer A（20 mM Tris、50 mM NaCl，pH 8.0）平衡好的Capto Q柱（装于XK16/20空柱，柱高10 cm，流速150 cm/h）完全结合后，用5倍柱体积IEX buffer A冲洗；当紫外曲线达到稳定的基线时，利用IEXbuffer A和IEX buffer B（20 mM Tris、1 M NaCl，pH 8.0）混合液洗脱，20wt%和100wt%IEX bufferB液冲洗杂蛋白，25wt% IEX buffer B液洗脱目标蛋白，收集各洗脱峰，并进行15wt% SDS-PAGE电泳分析。

利用10 kD的中空纤维柱将离子交换洗脱目标峰进行浓缩，浓缩后蛋白通过Superloop进入AKTA purifier 100系统，用2倍柱体积 PBS（pH 7.0）平衡好的Superdex 75凝胶过滤柱（装于XK16/70空柱，柱高60 cm，流速1 mL/min）进行分离纯化，收集各流穿峰，并进行15wt% SDS-PAGE电泳分析。结果显示纯化后蛋白纯度在95%以上，如图2所示，泳道1为蛋白标准分子量Marker；泳道2为离子交换层析洗脱目标峰；泳道3为离子交换层析洗脱杂志峰；泳道4为凝胶过滤层析纯化的目标蛋白。

实施例2

模型动物处理

ob/ob小鼠（2型糖尿病肥胖模型小鼠，SPF级，雄性，10-11周龄）：上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物质量合格证号SCXK 2014-0002(沪)。选取40只成模的血糖和体重接近均值的模型小鼠，分成4组，每组10只，每天给予实验组（Vehicle组、hLeptin-hFGF21（50nmol/kg）组、Leptin（50 nmol/kg）组和FGF21（50 nmol/kg）组）相应的受试物或溶剂一次，皮下注射，连续注射14 d后停药，观察14 d内各实验组小鼠的血糖和体重变化情况。给药结束后，检测各实验组小鼠糖耐量改善情况，并采血测定甘油三脂和胰岛素水平，所得实验数据进行统计学分析。

实施例3

瘦素融合蛋白hLeptin-hFGF21调节ob/ob小鼠血糖水平变化

结果显示，模型对照组小鼠血糖水平相对较高，各给药组小鼠血糖变化趋势一致，但hLeptin给药组和hFGF21给药组小鼠血糖较瘦素融合蛋白给药组（hLeptin-hFGF21组）小鼠血糖下降缓慢且回升快，其中瘦素融合蛋白hLeptin-hFGF21的长期降糖效果和停药后控制模型小鼠血糖能力最佳（如图3所示）。

实施例4

瘦素融合蛋白hLeptin-hFGF21调节ob/ob小鼠体重变化

结果如图4所示，随着时间的变化，模型对照组小鼠体重不断增加，hLeptin给药组和hFGF21给药组小鼠体重变化无明显差异，有轻微的下降趋势，停药后体重迅速增加至起始水平；而瘦素融合蛋白给药组小鼠体重变化较大，体重下降明显，且停药后小鼠体重增加缓慢。以上结果说明了瘦素融合蛋白hLeptin-hFGF21在控制模型小鼠体重方面的能力较强于hLeptin蛋白和hFGF21蛋白。

实施例5

瘦素融合蛋白hLeptin-hFGF21调节ob/ob小鼠糖耐量变化

给药14d后，对各实验组小鼠进行OGTT实验，检测不同重组蛋白对模型小鼠糖耐量改善情况。结果如图5所示，与模型对照组相比，三种重组蛋白在控制小鼠机体血糖能力方面都有很大程度的提高，但在整个实验过程中，瘦素融合蛋白给药组小鼠血糖水平显著低于hLeptin给药组和hFGF21给药组。以上结果表明了瘦素融合蛋白hLeptin-hFGF21在调节模型小鼠糖耐量方面的能力显著强于hLeptin蛋白和hFGF21蛋白。

实施例6

瘦素融合蛋白hLeptin-hFGF21调节ob/ob小鼠甘油三脂水平变化

给药14d后，各实验组小鼠血清甘油三脂水平检测结果如图6所示，相对于生理盐水组，三种重组蛋白都能显著降低模型小鼠甘油三脂含量。而与hLeptin给药组和hFGF21给药组相比，瘦素融合蛋白hLeptin-hFGF21在血脂水平控制上表现出更佳的改善效果。

实施例7

瘦素融合蛋白hLeptin-hFGF21调节ob/ob小鼠空腹胰岛素水平变化

给药14 d后，各实验组小鼠空腹血清胰岛素含量果如图7所示。与对照组相比，三种重组蛋白都能显著降低实验组小鼠的空腹腹胰岛素浓度；而瘦素融合蛋白给药组小鼠空腹胰岛素水平较hLeptin给药组和hFGF21给药组低。结果表明了瘦素融合蛋白hLeptin-hFGF21可明显改善模型小鼠胰岛素抵抗状态，且改善程度显著优于单独给药方式。

以上显示和描述了本发明的基本原理，主要特征和优点，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还有各种变化和改进，这些变化和改进都要求落入本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南师范大学

<120> 一种用于治疗代谢疾病的瘦素融合蛋白及其制备方法和应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> SEQ ID NO:1

<211> 1020

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> SEQ ID NO:1

gttccgatcc agaaagttca ggacgacacc aaaaccctga tcaaaaccat cgttacccgt 60

atcaacgaca tctctcacac ccagtctgtt tcttctaaac agaaagttac cggtctggac 120

ttcatcccgg gtctgcaccc gatcctgacc ctgtctaaaa tggaccagac cctggctgtt 180

taccagcaga tcctgacctc tatgccgtct cgtaacgtta tccagatctc taacgacctg 240

gaaaacctgc gtgacctgct gcacgttctg gctttctcta aatcttgcca cctgccgtgg 300

gcttctggtc tggaaaccct ggactctctg ggtggtgttc tggaagcttc tggttactct 360

accgaagttg ttgctctgtc tcgtctgcag ggttctctgc aggacatgct gtggcagctg 420

gacctgtctc cgggttgcgg tggcggtggc tccggcggtg gtgggtcggg tggcggcgga 480

tcttctgact cttctccgct gctgcagttc ggtggtcagg ttcgtcagcg ttacctgtac 540

accgacgacg ctcagcagac cgaagctcac ctggaaatcc gtgaagacgg taccgttggt 600

ggtgctgctg accagtctcc ggaatctctg ctgcagctga aagctctgaa accgggtgtt 660

atccagatcc tgggtgttaa aacctctcgt ttcctgtgcc agcgtccgga cggtgctctg 720

tacggttctc tgcacttcga cccggaagct tgctctttcc gtgaactgct gctggaagac 780

ggttacaacg tttaccagtc tgaagctcac ggtctgccgc tgcacctgcc gggtaacaaa 840

tctccgcacc gtgacccggc tccgcgtggt ccggctcgtt tcctgccgct gccgggtctg 900

ccgccggctc tgccggaacc gccgggtatc ctggctccgc agccgccgga cgttggttct 960

tctgacccgc tgtctatggt tggtccgtct cagggtcgtt ctccgtctta cacctcttaa 1020

<210> SEQ ID NO:2

<211> 339

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> SEQ ID NO:2

Val Pro Ile Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys Thr Leu Ile Lys Thr Ile ValThr Arg 20

Ile Asn Asp Ile Ser His Thr Gln Ser Val Ser Ser Lys Gln Lys Val Thr GlyLeu Asp 40

Phe Ile Pro Gly Leu His Pro Ile Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gln Thr LeuAla Val 60

Tyr Gln Gln Ile Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val Ile Gln Ile Ser AsnAsp Leu 80

Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser Lys Ser Cys His LeuPro Trp 100

Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser Leu Gly Gly Val Leu Glu Ala Ser GlyTyr Ser 120

Thr Glu Val Val Ala Leu Ser Arg Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Met Leu TrpGln Leu 140

Asp Leu Ser Pro Gly Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly GlyGly Gly 160

Ser Ser Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln Arg TyrLeu Tyr 180

Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly ThrVal Gly 200

Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys ProGly Val 220

Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp GlyAla Leu 240

Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu LeuGlu Asp 260

Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro GlyAsn Lys 280

Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu ProGly Leu 300

Pro Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp ValGly Ser 320

Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro Ser Tyr ThrSer 339

序列表

<110> 河南师范大学

<120> 一种用于治疗代谢疾病的瘦素融合蛋白及其制备方法和应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 3

<211> 1020

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gttccgatcc agaaagttca ggacgacacc aaaaccctga tcaaaaccat cgttacccgt 60

atcaacgaca tctctcacac ccagtctgtt tcttctaaac agaaagttac cggtctggac 120

ttcatcccgg gtctgcaccc gatcctgacc ctgtctaaaa tggaccagac cctggctgtt 180

taccagcaga tcctgacctc tatgccgtct cgtaacgtta tccagatctc taacgacctg 240

gaaaacctgc gtgacctgct gcacgttctg gctttctcta aatcttgcca cctgccgtgg 300

gcttctggtc tggaaaccct ggactctctg ggtggtgttc tggaagcttc tggttactct 360

accgaagttg ttgctctgtc tcgtctgcag ggttctctgc aggacatgct gtggcagctg 420

gacctgtctc cgggttgcgg tggcggtggc tccggcggtg gtgggtcggg tggcggcgga 480

tcttctgact cttctccgct gctgcagttc ggtggtcagg ttcgtcagcg ttacctgtac 540

accgacgacg ctcagcagac cgaagctcac ctggaaatcc gtgaagacgg taccgttggt 600

ggtgctgctg accagtctcc ggaatctctg ctgcagctga aagctctgaa accgggtgtt 660

atccagatcc tgggtgttaa aacctctcgt ttcctgtgcc agcgtccgga cggtgctctg 720

tacggttctc tgcacttcga cccggaagct tgctctttcc gtgaactgct gctggaagac 780

ggttacaacg tttaccagtc tgaagctcac ggtctgccgc tgcacctgcc gggtaacaaa 840

tctccgcacc gtgacccggc tccgcgtggt ccggctcgtt tcctgccgct gccgggtctg 900

ccgccggctc tgccggaacc gccgggtatc ctggctccgc agccgccgga cgttggttct 960

tctgacccgc tgtctatggt tggtccgtct cagggtcgtt ctccgtctta cacctcttaa 1020

<210> 4

<211> 345

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Ser Glu Gln Ile Asp Asn Val Pro Ile Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr

1 5 10 15

Lys Thr Leu Ile Lys Thr Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His

20 25 30

Thr Gln Ser Val Ser Ser Lys Gln Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile

35 40 45

Pro Gly Leu His Pro Ile Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gln Thr Leu

50 55 60

Ala Val Tyr Gln Gln Ile Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val Ile

65 70 75 80

Gln Ile Ser Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu

85 90 95

Ala Phe Ser Lys Ser Cys His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr

100 105 110

Leu Asp Ser Leu Gly Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu

115 120 125

Val Val Ala Leu Ser Arg Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Met Leu Trp

130 135 140

Gln Leu Asp Leu Ser Pro Gly Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

145 150 155 160

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe

165 170 175

Gly Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln

180 185 190

Thr Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala

195 200 205

Ala Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro

210 215 220

Gly Val Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln

225 230 235 240

Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala

245 250 255

Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln

260 265 270

Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro

275 280 285

His Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro

290 295 300

Gly Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln

305 310 315 320

Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser

325 330 335

Gln Gly Arg Ser Pro Ser Tyr Thr Ser

340 345

Claims (9)

1. 一种用于治疗代谢疾病的瘦素融合蛋白，其特征在于：所述瘦素融合蛋白是由人FGF21蛋白的N端与人Leptin蛋白融合而成的，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示。

2.根据权利要求1所述的用于治疗代谢疾病的瘦素融合蛋白，其特征在于：所述瘦素融合蛋白编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。

3.根据权利要求2所述的用于治疗代谢疾病的瘦素融合蛋白，其特征在于：所述瘦素融合蛋白编码基因由人FGF21核苷酸序列与人Leptin基因片段通过连接肽连接而成。

4.根据权利要求3所述的用于治疗代谢疾病的瘦素融合蛋白，其特征在于：所述连接肽为GS linker（(Gly₄Ser)₃）。

5.根据权利要求1所述的用于治疗代谢疾病的瘦素融合蛋白，其特征在于：含有瘦素融合蛋白编码基因的表达载体为pET-30a，含有瘦素融合蛋白编码基因的宿主细胞为大肠杆菌BL21。

6.一种权利要求1所述的用于治疗代谢疾病的瘦素融合蛋白的制备方法，其特征在于具体过程为：将人Leptin基因通过连接肽GS linker连接到人FGF21基因的N端得到编码瘦素融合蛋白的核苷酸序列，再将得到的编码瘦素融合蛋白的核苷酸序列与表达载体相连接得到重组表达载体；然后将重组表达载体导入大肠杆菌感受态细胞中；筛选稳定高效表达目标蛋白的重组菌，培养细胞并诱导表达融合蛋白，收集菌体、破碎、离心、变性、复性、纯化得到瘦素融合蛋白。

7.根据权利要求6所述的用于治疗代谢疾病的瘦素融合蛋白的制备方法，其特征在于：将重组表达载体转化表达菌株BL21（DE3），转化后的单菌落分别接种至20 mL含50 μg/mLKan的LB培养基中，于37℃培养10 h，以体积比1:100接种于另一20 mL含50 μg/mL Kan的LB培养基中，于37℃培养，当A₆₀₀在0.35时，在温度为30℃、IPTG终浓度为0.25 mmol/L、转速为60 r/min的条件下诱导5 h，在此条件下进行表达瘦素融合蛋白时，能够显著提高融合蛋白的表达水平。

8.根据权利要求6所述的用于治疗代谢疾病的瘦素融合蛋白的制备方法，其特征在于：将重组表达载体转化宿主细胞，筛选稳定高表达阳性克隆后培养并诱导表达目标融合蛋白，离心收集菌体，超声破碎，离心，对澄清后的上清液进行离子交换层析和凝胶过滤层析分离纯化目标融合蛋白，最终得到高纯度瘦素融合蛋白。

9.权利要求1-5中任意一项所述的瘦素融合蛋白作为治疗糖尿病、肥胖症或代谢综合症药物中的应用。