CN112941081A - 表达量高和活性强的纤连蛋白突变体的编码序列及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种表达量高和活性强的纤连蛋白突变体的编码序列及其应用。本发明提供的纤连蛋白突变体的编码序列如SEQ ID NO.1所示。该编码序列是选择纤连蛋白上促进细胞增殖、促进细胞粘附活性结构域，利用翻译暂停理论，在不改变重组纤连蛋白氨基酸序列的情况下，将重组纤连蛋白最后30个密码子中翻译速度较快的密码子替换成翻译速度较慢的密码子获得。该编码序列显著促进了纤连蛋白突变体在大肠杆菌中的可溶性表达。由此编码序列经构建重组载体、表达、纯化得到的纤连蛋白突变体，其促进细胞增殖活性粘附活性的功能有明显提升。

Description

表达量高和活性强的纤连蛋白突变体的编码序列及其应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种表达量高和活性强的纤连蛋白突变体的编码序列及其应用。

背景技术

纤连蛋白(Fibronectin，FN)是一种多功能的糖蛋白，在血浆中含量丰富，广泛分布于细胞外基质中。纤连蛋白调节多种细胞的粘附、扩散、迁移、增殖、分化，从而在胚胎发育、组织修复中发挥重要作用。纤连蛋白形成细胞运动及定位的基质，介导成纤维细胞、巨噬细胞等参与损伤修复。

纤连蛋白通过与细胞表明的受体结合发挥重要的生理功能，是胚胎发育中必不可少的物质，可以指导胚胎发育过程中细胞黏附和迁移；例如，与细胞表明整合素受体a5β1结合，动物实验结果表明，突变纤连蛋白上与a5β1结合的位点，会导致小鼠胚胎的死亡。纤连蛋白与其他糖蛋白、细胞外基质分子结合，有利于伤口止血及伤口修复；纤连蛋白可以交联胶原蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白多糖等，为细胞提供稳定的基质平台。

纤连蛋白有两个亚基(单体)组成，每个亚基分子量在220～250KDa，两个亚基通过C-末端的二硫键相连。每个纤连蛋白单体主要有12个I型、2个II型、15～17个III型三种类型的重复单元组成。纤连蛋白中含有整合素、胶原蛋白、肝素、纤维蛋白的结合结构域。例如在FN III10中的整合素结合位点Arg-Gly-Asp(RGD)基序，III9中的Pro-His-Ser-Ser-Arg-Asn(PHSRN)基序等。通过基因的选择性剪接以及翻译后修饰，纤连蛋白有大约20种突变体。

纤连蛋白是细胞外基质的重要组成部分，通过与细胞表面受体及细胞外基质分子的相互作用，促进细胞粘附、迁移，促进创伤修复，因此，纤连蛋白在医学、美容、护肤领域有广泛的应用前景。虽然动物组织、血液中含有纤连蛋白，但是含量极为有限，因此，组织来源的纤连蛋白存在产量低，成本高，产品纯度低的缺点。重组DNA技术通过构建线路蛋白基因的表达载体，在原核或者真核生物中表达、制备高纯度的纤连蛋白。纤连蛋白单体约220～250KDa,分子量较大，研究表明，通过选择纤连蛋白上的部分结构域，重组DNA技术制备含有纤连蛋白部分结构域的突变体，具有纤连蛋白的生物学活性。但是，如何筛选纤连蛋白的活性结构域进行重构，获得高活性、高稳定性的纤连蛋白突变体是制约纤连蛋白应用的关键技术之一。此外，重组蛋白异源表达时，往往表达量低，或者以包涵体形式表达，这也是制约纤连蛋白应用的另一关键技术。

最新的研究表明：不同的DNA虽然可以翻译成同样的氨基酸，蛋白质生成的速度(翻译速度)并非恒定，在某些区段上会比较缓慢，这种现象称为翻译暂停(translationalpausing或translational attenuation)翻译暂停位点与蛋白质折叠高度相关，若翻译暂停位点不正确，该慢的地方快了，或者该快的地方慢了，都将导致蛋白质错误折叠聚集，无法得到有功能的可溶性蛋白。也就是说，蛋白质空间构象不仅由氨基酸的序列决定，也由核苷酸序列决定。通过这一理论可以合理重设计和优化蛋白质的核苷酸序列，使其在大肠杆菌中表达过程中以合适速度翻译、折叠，从而促进蛋白质的可溶性表达。

发明内容

为了克服现有技术的缺陷与不足，本发明的首要目的在于提供一种表达量高和活性强的纤连蛋白突变体的编码序列。

本发明的另一目的在于提供通过上述编码序列制备得到的表达量高和活性强的纤连蛋白突变体。

本发明的再一目的在于提供上述表达量高和活性强的纤连蛋白突变体的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种表达量高和活性强的纤连蛋白突变体的编码序列，如SEQ ID NO.1所示。

一种表达量高和活性强的纤连蛋白突变体，由上述编码序列制备得到；优选通过如下方法制备得到：

将上述编码序列克隆到表达载体上，得到重组载体；将重组载体转化到宿主细胞中进行表达、纯化，即获得所述的表达量高和活性强的纤连蛋白突变体。

所述的表达载体优选为pET-28系列载体；更优选为pET-28a。

所述的宿主细胞优选为大肠杆菌；更优选为大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。

所述的方法优选操作如下：

S1、构建重组载体：在所述的表达量高和活性强的纤连蛋白突变体的编码序列的两端分别引入酶切位点，并进行相应的双酶切，然后与经同样双酶切的质粒pET-28a进行重组连接，得到重组载体pET-28a-FN；

S2、诱导表达：将重组载体pET-28a-FN转入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，得到表达菌株；接着使用含有卡那霉素的LB培养基将该表达菌株于37℃、180～200rpm的条件进行培养，在OD₆₀₀＝0.8时，加入终浓度为1mmol/L的IPTG，37℃诱导表达4h后，收集菌体；

S3、纯化：菌体按质量/体积比1：10(g/mL)的比例重新悬于平衡缓冲液后对菌体进行破碎，离心，收集上清；上清经Ni-NTA亲和层析，Sephadex G-25分子筛脱咪唑，以及3KDa的超滤管浓缩，得到纯化后的表达量高和活性强的纤连蛋白突变体。

步骤S1中所述的酶切位点为NdeI和BamHI。

上述表达量高和活性强的纤连蛋白突变体的编码序列，或表达量高和活性强的纤连蛋白突变体在促细胞增殖或粘附活性中的应用，所述的应用为非疾病治疗或诊断的实验研究中的用途。

所述的应用优选为制备促细胞增殖和/或粘附活性药物。

本发明相对于现有技术具有如下有益效果：

(1)本发明提供的重组纤连蛋白突变体，稳定性，可以有效促进细胞增殖活性，提高细胞粘附活性。

(2)本发明提供的重组纤连蛋白突变体的制备过程简单，纯化方便。

附图说明

图1是未优化的纤连蛋白翻译曲线图；1是蓝线，2是红线。

图2是优化的纤连蛋白翻译曲线图；1是蓝线，2是红线。

图3是重组纤连蛋白及其突变体(FN-M1)的上清和沉淀的SDS-PAGE电泳图。

图4是重组纤连蛋白突变体(FN-M1)纯化SDS-PAGE电泳图。

图5是重组纤连蛋白突变体western blot结果图。

图6是重组纤连蛋白突变体促细胞增值率结果图。

图7是重组纤连蛋白突变体促细胞粘附率结果图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

本发明实施例涉及的主要材料如下：大肠杆菌E.coli BL21(DE3)(Merck)、质粒pET-28a(Merck)、预染蛋白Marker购自Fermentas公司，Ni Sepharose6 Fast Flow购自GE公司，CCK-8试剂盒购自美国日本同仁公司。其它试剂均为分析纯试剂。平衡缓冲液(20mmol/L PB、pH 8.0+0.15mol/L NaCl+20mmol/L咪唑)，洗杂缓冲液(20mmol/L PB、pH8.0+0.15mol/L NaCl+40mmol/L咪唑)，洗脱缓冲液(20mmol/L PB、pH 8.0+0.15mol/L NaCl+250mmol/L咪唑)。

实施例1：重组纤连蛋白突变体载体构建

我们选择了纤连蛋白促细胞增殖及粘附的功能结构域，设计了新的纤连蛋白突变体，其氨基酸序列如下：

MAVPPPTDLRFTNIGPDTMRVTWAPPPSIDLTNFLVRYSPVKNEEDVAELSISPSDNAVVLTNLLPGTEYVVSVSSVYEQHESTPLRGRQKTGLDSPTGIDFSDITANSFTVHWIAPRATITGYRIRHHPEHFSGRPREDRVPHSRNSITLTNLTPGTEYVVSIVALNGREESPLLIGQQSTVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRTGGGGSGGGGSILDVPSTVQKTPFVTHPGYDTGNGIQLPGTSGQQPSVGQQMIFEEHGFRRTTPPTTATP。

根据大肠杆菌密码子偏好性，以及通过翻译暂停理论，对纤连蛋白突变体的核苷酸序列进行优化。

未优化的纤连蛋白突变体(FN-M)的核苷酸序列如下：

ATGGCGGTTCCGCCGCCGACCGATCTGCGTTTCACCAACATCGGCCCAGACACGATGCGTGTTACGTGGGCGCCACCACCGAGCATCGATCTGACCAATTTCCTCGTGCGCTACAGTCCGGTGAAAAACGAGGAGGATGTGGCGGAACTGAGCATCAGCCCGAGCGATAACGCCGTTGTGCTCACCAATCTGCTGCCGGGCACCGAATACGTGGTGAGCGTGAGCAGCGTGTATGAACAGCACGAAAGCACGCCACTGCGTGGCCGCCAAAAAACCGGTCTGGATAGCCCAACCGGCATCGACTTTAGCGACATCACGGCCAACAGCTTCACGGTTCATTGGATCGCCCCGCGCGCGACGATTACCGGTTATCGCATTCGCCACCATCCGGAACACTTCAGCGGTCGCCCACGCGAAGATCGCGTTCCACACAGCCGCAACAGTATCACGCTGACCAATCTGACGCCGGGTACGGAATACGTTGTGAGCATTGTGGCGCTGAACGGCCGCGAAGAAAGCCCGCTGCTGATCGGCCAACAGAGTACCGTTAGCGATGTTCCGCGCGATCTGGAAGTTGTGGCCGCGACCCCAACGAGTCTGCTGATTAGCTGGGATGCCCCGGCGGTGACCGTTCGTTACTACCGCATTACCTACGGCGAGACCGGCGGTAATAGCCCAGTTCAAGAATTCACCGTGCCGGGCAGCAAAAGCACCGCCACCATTAGCGGTCTGAAACCGGGCGTGGATTACACGATCACCGTGTACGCCGTTACGGGTCGCGGTGATAGCCCAGCCAGCAGCAAGCCGATTAGCATCAACTACCGTACCGGTGGTGGTGGTAGTGGCGGTGGCGGTAGTATTCTCGACGTGCCGAGCACCGTTCAGAAAACGCCATTCGTTACCCACCCGGGCTACGATACGGGCAATGGCATTCAGCTGCCGGGCACCAGCGGTCAGCAGCCAAGCGTTGGCCAGCAGATGATTTTCGAGGAGCATGGCTTCCGTCGTACCACCCCGCCGACGACCGCGACGCCGTAA；

(1)通过翻译暂停理论设计编码纤连蛋白突变体的核苷酸序列，在不改变纤连蛋白氨基酸序列的情况下，将纤连蛋白最后30个密码子中翻译速度较快的密码子(ATC、ACC、CCG、ACG、GCG)分别替换成翻译速度较慢的密码子(ATA、ACA、CCA、ACA、GCC)，以制造翻译暂停位点(RiboTempo软件计算确定，http://bioinformatics.jnu.edu.cn/software/ribotempo)，优化前后的突变体经RiboTempo软件计算得到的翻译暂停曲线分别如图1、2所示，翻译暂停曲线红线在预定的区域(最后30个密码子)形成了翻译暂停位点(红线低于蓝线)，符合要求。未优化的纤连蛋白突变体在核糖体上的翻译速度比较恒定，在C末端不会有翻译速度降低的情况。优化的纤连蛋白突变体在核糖体上的翻译过程中，在C末端翻译速度会显著降低，使得翻译的纤连蛋白能够有足够的时间进行折叠。

优化得到的编码纤连蛋白突变体(FN-M1)的核苷酸序列如下：

ATGGCGGTTCCGCCGCCGACCGATCTGCGTTTCACCAACATCGGCCCAGACACGATGCGTGTTACGTGGGCGCCACCACCGAGCATCGATCTGACCAATTTCCTCGTGCGCTACAGTCCGGTGAAAAACGAGGAGGATGTGGCGGAACTGAGCATCAGCCCGAGCGATAACGCCGTTGTGCTCACCAATCTGCTGCCGGGCACCGAATACGTGGTGAGCGTGAGCAGCGTGTATGAACAGCACGAAAGCACGCCACTGCGTGGCCGCCAAAAAACCGGTCTGGATAGCCCAACCGGCATCGACTTTAGCGACATCACGGCCAACAGCTTCACGGTTCATTGGATCGCCCCGCGCGCGACGATTACCGGTTATCGCATTCGCCACCATCCGGAACACTTCAGCGGTCGCCCACGCGAAGATCGCGTTCCACACAGCCGCAACAGTATCACGCTGACCAATCTGACGCCGGGTACGGAATACGTTGTGAGCATTGTGGCGCTGAACGGCCGCGAAGAAAGCCCGCTGCTGATCGGCCAACAGAGTACCGTTAGCGATGTTCCGCGCGATCTGGAAGTTGTGGCCGCGACCCCAACGAGTCTGCTGATTAGCTGGGATGCCCCGGCGGTGACCGTTCGTTACTACCGCATTACCTACGGCGAGACCGGCGGTAATAGCCCAGTTCAAGAATTCACCGTGCCGGGCAGCAAAAGCACCGCCACCATTAGCGGTCTGAAACCGGGCGTGGATTACACGATCACCGTGTACGCCGTTACGGGTCGCGGTGATAGCCCAGCCAGCAGCAAGCCGATTAGCATCAACTACCGTACCGGTGGTGGTGGTAGTGGCGGTGGCGGTAGTATTCTCGACGTGCCGAGCACCGTTCAGAAAACGCCATTCGTTACCCACCCGGGCTACGATACGGGCAATGGCATTCAGCTGCCGGGCACCAGCGGTCAGCAGCCAAGCGTTGGCCAGCAGATGATTTTCGAGGAGCATGGCTTCCGTCGTACAACACCACCAACAACAGCCACACCATAA。

(2)构建重组纤连蛋白突变体载体pET-28a-FN

1、委托生物公司全基因合成纤连蛋白突变体FN-M的基因，在FN-M1的N末端引入NdeI酶切位点，在C末端引入BamHI酶切位点，目的基因经NdeI和BamHI双酶切之后，DNA纯化试剂盒回收酶切产物。pET-28a质粒载体经NdeI和BamHI双酶切之后，琼脂糖凝胶电泳，切胶回收质粒酶切的大片段产物。

2、FN-M1和pET-28a双酶切产物经T4 DNA连接酶连接，酶连接产物转化大肠杆菌DH5a，卡那霉素抗性平板筛选阳性克隆，选择平板上的单克隆经菌液PCR鉴定，PCR鉴定的阳性克隆送苏州鸿讯生物科技有限公司测序鉴定。

实施例2：重组纤连蛋白突变体的表达、纯化

(1)纤连蛋白表达工程菌的筛选：

纤连蛋白表达质粒pET-28a-FN转化大肠杆菌感受态细胞BL21，含有50μg/ml卡那霉素、LB固体培养基平板筛选阳性克隆。

挑取阳性克隆到含有5ml LB液体培养基中，待OD₆₀₀＝0.8时，加入1mmol/L IPTG诱导表达，SDS-PAGE电泳鉴定蛋白的表达情况，选择表达量高的工程菌进行保种。

(2)纤连蛋白诱导表达和可溶性分析

将步骤(1)得到的表达菌株pET-28a-Fibronectin接种到50mL含50μg/mL卡那霉素含量的LB培养基中，37℃、180rpm培养，当OD₆₀₀＝0.8时，加IPTG，终浓度为1mmol/L，37℃诱导表达4h后，5000g、4℃离心10min收集菌体。菌体用20mmol/L PB(pH 8.0，0.15mol/LNaCl)缓冲液重悬，高压(600bar)均质破碎细胞，18000g、4℃离心30min，上清和沉淀分别留样待后续的SDS-PAGE电泳(5％浓缩胶、12％分离胶)及Western blot分析。

(3)纤连蛋白及其突变体中试发酵及纯化

一级种子制备：纤连蛋白表达菌，在含有50μg/mL卡那霉素含量的LB固体培养基平板上划线培养。

二级种子制备：纤连蛋白表达菌株分别接种到1L、卡那霉素含量为50μg/mL的LB培养基中，37℃、180rpm培养12h。

100L发酵：将二级种子接种到含有100L TB培养基中，37℃、400rpm培养，当OD₆₀₀＝8时，补加20％的葡萄糖；OD₆₀₀＝18左右时，加入终浓度为1mmol/L IPTG，37℃诱导表达4h后，离心收集菌体。

菌体按质量/体积比1：10(g/mL)比例重新悬于平衡缓冲液中，高压(1000bar)均质破碎细胞。4℃、25000×g、30min离心收集上清。

上清经Ni-NTA亲和层析纯化，柱体积250mL，流速8mL/min，平衡缓冲液洗回基线，洗杂缓冲液洗杂蛋白，洗脱缓冲液洗脱目的蛋白；纯化后的纤连蛋白经Sephadex G-25分子筛脱咪唑以及3KDa的超滤管浓缩，SDS-PAGE电泳鉴定纯化的纤连蛋白的纯度。

结果如图3所示。在相同的菌体破碎条件下，重组纤连蛋白FN主要存在菌体破碎离心之后的沉淀中，而重组纤连蛋白突变体(FN-M)主要存在菌体破碎离心后的上清中，说明经过序列优化之后的纤连蛋白突变体FN-M在大肠杆菌中以可溶性的形式表达。

结果如图4所示。重组纤连蛋白突变体(FN-M1)100L发酵，纤连蛋白突变体(FN-M1)工程菌经IPTG诱导之后4h后，FN-M1在43KDa分子量位置有明显的表达条带。发酵的菌体经高压均质破碎之后，FN-M1蛋白主要存在与菌体破碎离心上清中，说明FN-M1蛋白在100L发酵过程中主要以可溶性的形式表达。破碎离心上清经Ni-NTA亲和层析纯化，G-25凝胶过滤层析脱咪唑，最终分离纯化得到高纯度的重组纤连蛋白，且蛋白纯度>95％。

纯化的纤连蛋白突变体FN-M1经免疫印迹分析，纯化的纤连蛋白突变体FN-M1经SDS-PAGE电泳、转膜、5％脱脂牛奶封闭之后，一抗用抗His-tag的单克隆抗体孵育，ECl显影结果如图5所示，在目的分子量位置有单一条带，结果表明发酵纯化得到的蛋白为纤连蛋白突变体FN-M1。

实施例3：重组纤连蛋白突变体促细胞增殖活性测定

(1)BALB/c 3T3细胞接种于96孔细胞培养板中(5000个细胞/孔)，37℃，5％CO₂细胞培养箱培养24h。

(2)换用DMEM无血清培养基继续培养12h。

(3)分别加纤连蛋白突变体FN-M和重组纤连蛋白突变体FN-M1以及PBS(阴性对照组)，继续培养48～72h。

(4)每孔加入10μL CCK-8试剂，37℃，5％CO₂细胞培养箱孵育2h后取出。

(5)用酶标仪读取96孔板在450nm和630nm的吸光值，以630nm为参比波长，在450nm处测定吸光度，记录测定结果。相对促细胞增殖率＝(实验组450nm吸光值-阴性对照组450nm吸光值)/阴性对照组450nm吸光值×100％。

细胞增殖实验结果如图6所示，结果表明，重组纤连蛋白突变体FN-M1具有明显的促细胞增殖活性，最高促细胞增值率为26.64％，而未优化核苷酸序列的纤连蛋白突变体FN-M最高促细胞增殖活性为9.80％。

实施实例4：重组纤连蛋白突变体促细胞粘附活性测定

(1)纤连蛋白突变体FN-M和重组纤连蛋白突变体FN-M1溶解在PBS中，浓度为20μg/ml，96孔细胞培养板每孔加入50μL纤连蛋白溶液，37℃放置2h。对照孔加PBS。

(2)BALB/c 3T3细胞用胰酶消化，计数，每孔加入5×10⁴个细胞。37℃CO₂培养箱培养30min～2h(培养时间需要摸索实验条件)。

(3)PBS洗2至3遍，洗去未粘附的细胞，在加入200μL细胞培养基。

(4)CCK-8法测定吸光值。

细胞粘附实验结果如图7所示，结果表明，重组纤连蛋白突变体FN-M和FN-M1均具有一定的促细胞粘附活性，但是核苷酸序列优化的纤连蛋白突变体FN-M1促细胞粘附率为36.21％，未优化的纤连蛋白突变体FN-M促细胞粘附率为23.14％，FN-M1促细胞粘附活性显著优于FN-M。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 广州启妆生物科技有限公司

<120> 表达量高和活性强的纤连蛋白突变体的编码序列及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 345

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 纤连蛋白突变体氨基酸序列

<400> 1

Met Ala Val Pro Pro Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn Ile Gly Pro

1 5 10 15

Asp Thr Met Arg Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser Ile Asp Leu Thr

20 25 30

Asn Phe Leu Val Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala

35 40 45

Glu Leu Ser Ile Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu

50 55 60

Leu Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gln

65 70 75 80

His Glu Ser Thr Pro Leu Arg Gly Arg Gln Lys Thr Gly Leu Asp Ser

85 90 95

Pro Thr Gly Ile Asp Phe Ser Asp Ile Thr Ala Asn Ser Phe Thr Val

100 105 110

His Trp Ile Ala Pro Arg Ala Thr Ile Thr Gly Tyr Arg Ile Arg His

115 120 125

His Pro Glu His Phe Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp Arg Val Pro His

130 135 140

Ser Arg Asn Ser Ile Thr Leu Thr Asn Leu Thr Pro Gly Thr Glu Tyr

145 150 155 160

Val Val Ser Ile Val Ala Leu Asn Gly Arg Glu Glu Ser Pro Leu Leu

165 170 175

Ile Gly Gln Gln Ser Thr Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val

180 185 190

Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala

195 200 205

Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn

210 215 220

Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr

225 230 235 240

Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala

245 250 255

Val Thr Gly Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile

260 265 270

Asn Tyr Arg Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Leu

275 280 285

Asp Val Pro Ser Thr Val Gln Lys Thr Pro Phe Val Thr His Pro Gly

290 295 300

Tyr Asp Thr Gly Asn Gly Ile Gln Leu Pro Gly Thr Ser Gly Gln Gln

305 310 315 320

Pro Ser Val Gly Gln Gln Met Ile Phe Glu Glu His Gly Phe Arg Arg

325 330 335

Thr Thr Pro Pro Thr Thr Ala Thr Pro

340 345

<210> 2

<211> 1038

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 未优化的纤连蛋白突变体（FN-M）的核苷酸序列

<400> 2

atggcggttc cgccgccgac cgatctgcgt ttcaccaaca tcggcccaga cacgatgcgt 60

gttacgtggg cgccaccacc gagcatcgat ctgaccaatt tcctcgtgcg ctacagtccg 120

gtgaaaaacg aggaggatgt ggcggaactg agcatcagcc cgagcgataa cgccgttgtg 180

ctcaccaatc tgctgccggg caccgaatac gtggtgagcg tgagcagcgt gtatgaacag 240

cacgaaagca cgccactgcg tggccgccaa aaaaccggtc tggatagccc aaccggcatc 300

gactttagcg acatcacggc caacagcttc acggttcatt ggatcgcccc gcgcgcgacg 360

attaccggtt atcgcattcg ccaccatccg gaacacttca gcggtcgccc acgcgaagat 420

cgcgttccac acagccgcaa cagtatcacg ctgaccaatc tgacgccggg tacggaatac 480

gttgtgagca ttgtggcgct gaacggccgc gaagaaagcc cgctgctgat cggccaacag 540

agtaccgtta gcgatgttcc gcgcgatctg gaagttgtgg ccgcgacccc aacgagtctg 600

ctgattagct gggatgcccc ggcggtgacc gttcgttact accgcattac ctacggcgag 660

accggcggta atagcccagt tcaagaattc accgtgccgg gcagcaaaag caccgccacc 720

attagcggtc tgaaaccggg cgtggattac acgatcaccg tgtacgccgt tacgggtcgc 780

ggtgatagcc cagccagcag caagccgatt agcatcaact accgtaccgg tggtggtggt 840

agtggcggtg gcggtagtat tctcgacgtg ccgagcaccg ttcagaaaac gccattcgtt 900

acccacccgg gctacgatac gggcaatggc attcagctgc cgggcaccag cggtcagcag 960

ccaagcgttg gccagcagat gattttcgag gagcatggct tccgtcgtac caccccgccg 1020

acgaccgcga cgccgtaa 1038

<210> 3

<211> 1038

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 优化得到的编码纤连蛋白突变体（FN-M1）的核苷酸序列

<400> 3

atggcggttc cgccgccgac cgatctgcgt ttcaccaaca tcggcccaga cacgatgcgt 60

gttacgtggg cgccaccacc gagcatcgat ctgaccaatt tcctcgtgcg ctacagtccg 120

gtgaaaaacg aggaggatgt ggcggaactg agcatcagcc cgagcgataa cgccgttgtg 180

ctcaccaatc tgctgccggg caccgaatac gtggtgagcg tgagcagcgt gtatgaacag 240

cacgaaagca cgccactgcg tggccgccaa aaaaccggtc tggatagccc aaccggcatc 300

gactttagcg acatcacggc caacagcttc acggttcatt ggatcgcccc gcgcgcgacg 360

attaccggtt atcgcattcg ccaccatccg gaacacttca gcggtcgccc acgcgaagat 420

cgcgttccac acagccgcaa cagtatcacg ctgaccaatc tgacgccggg tacggaatac 480

gttgtgagca ttgtggcgct gaacggccgc gaagaaagcc cgctgctgat cggccaacag 540

agtaccgtta gcgatgttcc gcgcgatctg gaagttgtgg ccgcgacccc aacgagtctg 600

ctgattagct gggatgcccc ggcggtgacc gttcgttact accgcattac ctacggcgag 660

accggcggta atagcccagt tcaagaattc accgtgccgg gcagcaaaag caccgccacc 720

attagcggtc tgaaaccggg cgtggattac acgatcaccg tgtacgccgt tacgggtcgc 780

ggtgatagcc cagccagcag caagccgatt agcatcaact accgtaccgg tggtggtggt 840

agtggcggtg gcggtagtat tctcgacgtg ccgagcaccg ttcagaaaac gccattcgtt 900

acccacccgg gctacgatac gggcaatggc attcagctgc cgggcaccag cggtcagcag 960

ccaagcgttg gccagcagat gattttcgag gagcatggct tccgtcgtac aacaccacca 1020

acaacagcca caccataa 1038

Claims (10)

1.一种表达量高和活性强的纤连蛋白突变体的编码序列，其特征在于：如SEQ ID NO.1所示。

2.一种表达量高和活性强的纤连蛋白突变体，其特征在于：由权利要求1所述的编码序列制备得到。

3.一种表达量高和活性强的纤连蛋白突变体，其特征在于：通过如下方法制备得到：

将权利要求1所述的编码序列克隆到表达载体上，得到重组载体；将重组载体转化到宿主细胞中进行表达、纯化，即获得所述的表达量高和活性强的纤连蛋白突变体。

4.根据权利要求3所述的表达量高和活性强的纤连蛋白突变体，其特征在于：

所述的表达载体为pET-28系列载体；

所述的宿主细胞为大肠杆菌。

5.根据权利要求4所述的表达量高和活性强的纤连蛋白突变体，其特征在于：

所述的表达载体为pET-28a。

6.根据权利要求4所述的表达量高和活性强的纤连蛋白突变体，其特征在于：

所述的宿主细胞为大肠杆菌E.coliBL21(DE3)。

7.根据权利要求3所述的表达量高和活性强的纤连蛋白突变体，其特征在于：所述的方法的具体操作为：

S1、构建重组载体：在所述的表达量高和活性强的纤连蛋白突变体的编码序列的两端分别引入酶切位点并进行相应的双酶切，然后与经同样双酶切的质粒pET-28a进行重组连接，得到重组载体pET-28a-FN；

S2、诱导表达：将重组载体pET-28a-FN转入大肠杆菌E.coliBL21(DE3)，得到表达菌株；接着使用含有卡那霉素的LB培养基将该表达菌株于37℃、180～200rpm的条件进行培养，在OD₆₀₀＝0.8时，加入终浓度为1mmol/L的IPTG，37℃诱导表达4h后，收集菌体；

S3、纯化：菌体按质量/体积比1：10的比例重新悬于平衡缓冲液后对菌体进行破碎，离心，收集上清；上清经Ni-NTA亲和层析，Sephadex G-25分子筛脱咪唑，以及3KDa的超滤管浓缩，得到纯化后的表达量高和活性强的纤连蛋白突变体。

8.根据权利要求3所述的表达量高和活性强的纤连蛋白突变体，其特征在于：

步骤S1中所述的酶切位点为NdeI和BamHI。

9.权利要求1所述的表达量高和活性强的纤连蛋白突变体的编码序列，或权利要求2～8任一项所述的表达量高和活性强的纤连蛋白突变体在促细胞增殖和/或粘附活性中的应用，所述的应用为非疾病治疗或诊断的实验研究中的用途。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：

所述的应用为制备促细胞增殖和/或粘附活性药物。

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