CN114702571A - 一种具有促进干细胞定植的纤连蛋白及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种具有促进干细胞定植的纤连蛋白及其制备方法，涉及应用于细胞培养、药品和化妆品等领域。提供一种改性的细胞纤连蛋白基因fnE；提供所述的fnE基因所编码的一种对环境温度具有响应性的细胞纤连蛋白CfnE；提供所述的改性细胞纤连蛋白CfnE的制备方法。改性的细胞纤连蛋白基因fnE，来源于人工设计蛋白，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。细胞纤连蛋白CfnE，由所述改性的细胞纤连蛋白基因fnE编码得到，具有新的基因序列，蛋白能够促进干细胞生成的活性；对环境温度具有响应性，具有可逆相变的特性；为FN的大规模制备奠定基础，也将推动单克隆抗体，干细胞培养等产业的发展。
Description
技术领域
本发明涉及应用于细胞培养、药品和化妆品等领域，尤其是涉及一种具有促进干细胞定植的纤连蛋白及其制备方法。
背景技术
细胞纤连蛋白(fibronectin，FN)是一种细胞外糖蛋白，分别以可溶形式存在于体液中，或以不可溶形式存在于细胞外基质中。作为主要的细胞粘附分子之一，FN在许多重要的生理过程中起着关键性作用，如胚胎生成，伤口愈合，止血和血栓形成。纤连蛋白表达的改变，降解以及组合与大量的病理发生密切相关，包括癌症和纤维化。FN一般以二聚体形式分泌，各个单体的分子量为220-250kDa。主要由成纤维细胞、内皮细胞、软骨细胞、神经胶质细胞和肌细胞等合成，并分布在周围。器官移植会激发一系列的免疫级联反应，FN在T细胞活化过程表现为激活因子。所有FN由同一个基因编码产生，因转录后的mRNA经组织特异性的不同切割方式生成不同的翻译产物。FN上的多个结构域能与胶原、纤维蛋白、肝素和特异性细胞膜受体结合。其中广为人知的结合域是Arg-Gly-Asp序列(RGD)，为整合素识别后调控细胞粘附。细胞纤连蛋白及其具有RGD结合域的活性片段具有促进细胞生长，提高细胞贴壁率，缩短细胞生长时间的作用。常用于制备单克隆抗体，病毒抗原和重组蛋白等无血清培养基中。目前细胞纤连蛋白活性片段主要来源为血浆提取纤连蛋白的水解物和基因工程菌的外源表达。前者主要来源于人血浆或胎牛血浆，后者为含细胞纤连蛋白活性片段基因的工程菌表达产物，如细胞纤连蛋白III1-C片段。血浆来源受限于原料成本，价格高昂。工程菌表达受限于传统色谱柱纯化技术的成本高、时间长，导致目前市场上细胞纤连蛋白活性片段产品(sigma)价格高达7000元/mg。因此，降低细胞纤连蛋白活性片段的制备成本，是实现细胞纤连蛋白活性片段产品在单克隆抗体，病毒抗原用无血清培养基等产业的进一步发展的迫切需求。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种改性的细胞纤连蛋白基因fnE；
本发明的第二目的在于提供所述的fnE基因所编码的一种对环境温度具有响应性的细胞纤连蛋白CfnE；
本发明的第三目的在提供所述的改性细胞纤连蛋白CfnE的制备方法。
本发明提供一种改性的细胞纤连蛋白基因fnE，来源于人工设计蛋白，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
本发明提供一种细胞纤连蛋白CfnE，由所述改性的细胞纤连蛋白基因fnE编码得到。
所述细胞纤连蛋白CfnE的制备方法，包括以下步骤：
1)基因合成可进行非色谱纯化的改性细胞纤连蛋白fnE；
2)将所述非色谱纯化的改性细胞纤连蛋白fnE插入表达载体，构建携带所述非色谱纯化的改性细胞纤连蛋白fnE的重组表达载体；
3)将所述重组表达载体转化到大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)中；
4)选取转化后E.coli BL21(DE3)中的阳性克隆于培养基中进行发酵培养；
5)离心收集发酵后的E.coli BL21(DE3)细胞，重悬所述E.coli BL21(DE3)细胞于裂解缓冲液中进行裂解；
6)将步骤5)中裂解后的悬液进行高速离心，收集上清液；
7)向细胞粗提物中加入固体NaCl(1.5～3mol/L)，触发改性蛋白发生相变，35℃～40℃恒温水浴15～25min后，30℃，10000～13200rpm，离心10～20min；
8)弃上清液，往沉淀物中加入4℃～8℃预冷的PBS缓冲溶液以溶解沉淀的蛋白，先用移液枪将沉淀吹打起来，充分混匀，4℃～8℃冰浴30min(尽可能使沉淀的目标蛋白充分溶解)，4℃，10000～13200rpm，离心10～20min，收集上清液；
9)上清液重复步骤7)和8)二次，即可得纯化后改性细胞纤连蛋白CfnE。
在步骤2)中，所述表达载体可为pET-28载体。
在步骤4)中，所述培养基可为含有100μg/mL卡娜霉素的LB培养基，所述发酵条件可为：温度为37℃，摇床培养至OD600＝0.6时，再加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.5mmol/L，在16℃条件下诱导12h。
在步骤5)中，所述裂解缓冲液配方可为：0.3mol/L NaCl，10mmol/L咪唑，50mmol/LNaH2PO4，pH 8.0。
在步骤6)中，所述高速离心为5000rpm，离心20min，4℃。
与现有技术相比，本发明具体以下突出的技术效果和优点：
本发明制备的改性细胞纤连蛋白CfnE，具有新的基因序列，在NCBI数据库中没有相似的完整ORF基因序列。该蛋白能够在E.coli中稳定表达，且促进干细胞生成的活性；本发明采用非色谱纯化技术，重组改性细胞纤连蛋白的制备具有操作简单、环境温和、纯化周期短、纯化成本低等特点。为FN的大规模制备奠定基础，也将推动单克隆抗体，干细胞培养等产业的发展。
本发明所提供的人纤维改性蛋白对环境温度具有响应性，具有可逆相变的特性，在低于相变温度时，高度可溶，但在高于它的相变温度时，会快速聚集，形成聚集物，这个过程是完全可逆的。利用这种相变特性，可以通过非色谱循环技术分离纯化融合蛋白，从而实现简单快速温和的分离纯化融合蛋白的目的。相比色谱等传统的蛋白质纯化方法，这种非色谱纯化方法具有操作简单、回收率高、可对蛋白质进行浓缩富集、成本低、易于扩大等优势。
附图说明
图1为重组改性细胞纤连蛋白CfnE纯化电泳图。其中，M:marker；1:CfnE未诱导；2:CfnE诱导后粗蛋白；3：最后一次离心后上清；4：CfnE纯化一次。
图2为重组改性细胞纤连蛋白CfnE干细胞活性对比图。其中，a为未添加CfnE蛋白的培养基中，铺板后1h未贴壁；b为添加6μmol/L CfnE改性细胞纤连蛋白片段的无血清培养基中，铺板后1h后干细胞已贴壁；c为胎牛血清培养基脐带干细胞3h后不贴壁；d为加入CfnE6μmol/L培养基中,脐带干细胞3h后贴壁效果良好。
图3为重组表达载体质粒谱图。
具体实施方式
以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
所述改性的细胞纤连蛋白基因fnE，来源于人工设计蛋白，其核苷酸序列(5‘-3’)：
GGATCCAATAGACCACAAGCATCTCACATTTCCAAGTACATTCTCAGGTGGAGACCTAAAAATTCTGTAGAGCGTTGGAAGGAAAGTACCATACCAGAGCACTTAAACTCTTACACCATCAAAGAGCTGAAAGCTGGTGTGGTATACGAGGAGCAAGTCATCAAGATCCAAGAGTACGAGCACCAAGAAGTGACTCAGTTTGACTTCACCACCACCAAGACCAAGACACCTGTACCGGGTAAAGGTGTTCCTGAGGTGGGTGTTCCGGAGGTAGGTGTCCCAGGTGTGGAGGTACCGGAGGTTGGTGTTCCTGGTGTCGAGGTACCGGAGGTGGGTGTACCAGGTGTGGAGGTTCCGGGTTTCGAGGTAGCGGAGGTGGAGGTACCGGGTAAAGGTGTTCCTGAGGTGGGTGTTCCGGAGGTAGGTGTCCCAGGTGTGGAGGTACCGGAGGTTGGTGTTCCTGGTGTCGAGGTAGCGGAGGTGGGTGTACCGGGTAAAGGTGTTCCTGAGGTGGGTGTTCCGGAGGTAGGTGTCCCAGGTGTGGAGGTACCGGAGGTTGGTGTTCCTGGTGTCGAGGTACCGGAGGTGGGTGTACCAGGTGTGGAGGTTCCGGGTTTCGAGGTAGCGGAGGTGGAGGTACCGGGTAAAGGTGTTCCTGAGGTGGGTGTTCCGGAGGTAGGTGTCCCAGGTGTGGAGGTACCGGAGGTTGGTGTTCCTGGTGTCGAGGTAGCGGAGGTGGGTCTCGAG。
本申请涉及到一种人工改性可用非色谱纯化的改性细胞纤连蛋白fnE，该蛋白编码基因在公开数据库中尚无报道，即为新的ORF序列。通过在NCBI网站通过BLASTX进行比对，最高相似仅为81.16％，最高覆盖度为27％。
人工设计蛋白，委托上海生物工程公司对上述序列进行合成，并BamHI/XhoI酶切位点克隆至PET28a表达载体。构建后质粒通过测序确定克隆片段准确。
重组表达载体的质粒图谱见图3。
重组蛋白的诱导表达与表达产物的分析：
(1)挑取转化重组表达质粒的BL21单菌落至5mL LB(含100μg/mL卡那霉素)液体培养基中，200rpm 37℃摇培过夜；
(2)按1︰100转移500μL菌液至50mL液体LB(含100μg/mL卡那霉素)培养基中，200rpm 37℃摇2～3h至OD600nm为0.6左右；
(3)加入IPTG至终浓度50μg/ml；
(4)16℃继续摇培12-16h，离心分别收集上清及菌体。将菌体菌体用PBS缓冲液重悬后进行超声破碎，分别收集破碎上清及沉淀。
重组蛋白分离、纯化和验证：
由于pET28a-fnE可通过非色谱方法进行纯化，按实施例1进行重组蛋白进行纯化。并用SDS-PAGE检测纯化效果及目标条带大小。含fnE基因及HIS核苷酸序列共864bp,理论氨基酸大小为30kDa,与SDS-PAGE胶中大小30kDa左右相符。
本发明中所述的非色谱纯化的改性细胞纤连蛋白fnE的特征表现为：
1.具有新的基因序列，在NCBI数据库中没有相似的完整ORF基因序列。
2.能够在E.coli中稳定表达，且促进干细胞生成的活性(图2)。
3.重组改性细胞纤连蛋白的制备具有操作简单，纯化周期短，纯化成本低廉特点。
实施例1
非色谱纯化的改性细胞纤连蛋白fnE编码的重组蛋白的制备方法包括以下步骤：
1)基因合成所述可进行非色谱纯化的改性细胞纤连蛋白fnE；
2)将所述非色谱纯化的改性细胞纤连蛋白fnE插入表达载体，构建携带所述非色谱纯化的改性细胞纤连蛋白fnE的重组表达载体；
3)将所述重组表达载体转化到大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)中；
4)选取转化后E.coli BL21(DE3)中的阳性克隆于培养基中进行发酵培养；
5)离心收集发酵后的E.coli BL21(DE3)细胞，重悬所述E.coli BL21(DE3)细胞于裂解缓冲液中进行裂解；
6)将步骤5)中裂解后的悬液进行高速离心，收集上清液；
7)向细胞粗提物中加入固体NaCl(3mol/L)，触发改性蛋白发生相变，35℃恒温水浴15min后，30℃，10000rpm，离心10min；
8)弃上清液，往沉淀物中加入4℃预冷的PBS缓冲溶液以溶解沉淀的蛋白，先用移液枪将沉淀吹打起来，充分混匀，4℃冰浴30min(尽可能使沉淀的目标蛋白充分溶解)，4℃，10000rpm，离心10min，收集上清液；
9)上清液重复步骤(7)和(8)二次即可得纯化后改性细胞纤连蛋白fnE。(该蛋白纯化电泳图参见图1)。
在步骤2)中，所述表达载体可为pET-28a载体。
在步骤4)中，所述培养基可为含有50μg/mL卡娜霉素的LB培养基，所述发酵条件可为：温度为37℃，摇床培养至OD600＝0.6时，再加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.5mmol/L，在16℃条件下诱导12h。
在步骤5)中，所述裂解缓冲液配方可为：0.3mol/L NaCl，10mmol/L咪唑，50mmol/LNaH2PO4，pH 8.0。
在步骤6)中，所述高速离心为8000rpm，离心20min，4℃。
实施例2
非色谱纯化的改性细胞纤连蛋白fnE编码的重组蛋白的制备方法包括以下步骤：
1)基因合成所述可进行非色谱纯化的改性细胞纤连蛋白fnE；
2)将所述非色谱纯化的改性细胞纤连蛋白fnE插入表达载体，构建携带所述非色谱纯化的改性细胞纤连蛋白fnE的重组表达载体；
3)将所述重组表达载体转化到大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)中；
4)选取转化后E.coli BL21(DE3)中的阳性克隆于培养基中进行发酵培养；
5)离心收集发酵后的E.coli BL21(DE3)细胞，重悬所述E.coli BL21(DE3)细胞于裂解缓冲液中进行裂解；
6)将步骤5)中裂解后的悬液进行高速离心，收集上清液；
7)向细胞粗提物中加入固体NaCl(1.5)，触发改性蛋白发生相变，40℃恒温水浴15～25min后，30℃，13200rpm，离心10～20min；
8)弃上清液，往沉淀物中加入8℃预冷的PBS缓冲溶液以溶解沉淀的蛋白，先用移液枪将沉淀吹打起来，充分混匀，8℃冰浴30min(尽可能使沉淀的目标蛋白充分溶解)，4℃，13200rpm，离心20min，收集上清液；
9)上清液重复步骤(7)和(8)二次即可得纯化后改性细胞纤连蛋白fnE。(该蛋白纯化电泳图参见图1)。
在步骤2)中，所述表达载体可为pET-28a载体。
在步骤4)中，所述培养基可为含有100μg/mL卡娜霉素的LB培养基，所述发酵条件可为：温度为37℃，摇床培养至OD600＝0.6时，再加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.5mmol/L，在16℃条件下诱导12h。
在步骤5)中，所述裂解缓冲液配方可为：0.3mol/L NaCl，10mmol/L咪唑，50mmol/LNaH2PO4，pH 8.0。
在步骤6)中，所述高速离心为8000rpm，离心20min，4℃。
对比例：
现有的细胞纤连蛋白生产技术方案参考文献[6]：
1)粗蛋白液的制备。将7L料液装入10L发酵罐中，接入2％种子液，在常压，25℃，搅拌速度100r/min条件下培养20h，发酵2h后加入诱导剂IPTG，通过流加1.0mol/LHCl控制发酵罐的pH值为6.0。培养后的发酵液在冷冻离心机中4℃经4 800r/min离心10min去除菌体，其上清液即细胞纤连蛋白粗蛋白液；
2)采用不同浓度的硫酸铵和丙酮对粗蛋白液中的蛋白质进行沉淀，并收集不同组分；
3)离子交换层析将沉淀后的蛋白复溶，分离纯化，离子交换层析使用CMSepharoseFastFlow离子交换层析柱用20mmol/L磷酸缓冲液(pH 6.0)平衡离子交换层析柱，将粗蛋白液上样。用20mmol/L磷酸缓冲液洗涤，最后梯度洗脱。将梯度混合器连接到层析柱，左边加入一定体积含有2mmol/L NaCl的20mmol/L磷酸缓冲液，右边加入等量的含有10mmol/LNaCl的20mmol/L磷酸缓冲液。洗脱速度为1mL/min，收集时间为2min/管；
4)超滤浓缩。将收集的有蛋白活力的洗脱液加入超滤离心管中，然后放入冷冻离心机中超滤处理，超滤膜的截留分子质量为10kDa，超滤离心的转速为8 000r/min；
5)凝胶过滤层析凝胶过滤层析使用层析柱Sephadex G-75(Ф1.0cm×80cm)。用20mmol/L磷酸缓冲液(pH 6.0)平衡柱子，将超滤后的蛋白液收集、上样，用20mmol/L磷酸缓冲液洗脱，洗脱流速为0.2m L/min，收集时间为10min/管。在280nm处检测各管吸光值，测定各管洗脱液的蛋白活力。将有蛋白活力部分的洗脱液合并收集起来。
与对比例相比，非色谱纯化细胞纤连蛋白fnE的方法不需要添加硫酸铵和丙酮等试剂，也不需要通过层析柱等高成本填料进行分离，用时短，分离效率高，分离成本低。
本发明的实施提供FN的低成本高效制备方法；而且非色谱纯化技术具有环境温和、周期短，纯化成本低的优点，研究成果可为将来FN的大规模制备奠定基础，也将推动单克隆抗体，干细胞培养等产业的发展。
序列表
<110> 安博威生物科技（厦门）有限公司
<120> 一种具有促进干细胞定植的纤连蛋白及其制备方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 3
<211> 747
<212> DNA
<213> FN 蛋白(Homo sapiens)
<400> 3
ggatccaata gaccacaagc atctcacatt tccaagtaca ttctcaggtg gagacctaaa 60
aattctgtag agcgttggaa ggaaagtacc ataccagagc acttaaactc ttacaccatc 120
aaagagctga aagctggtgt ggtatacgag gagcaagtca tcaagatcca agagtacgag 180
caccaagaag tgactcagtt tgacttcacc accaccaaga ccaagacacc tgtaccgggt 240
aaaggtgttc ctgaggtggg tgttccggag gtaggtgtcc caggtgtgga ggtaccggag 300
gttggtgttc ctggtgtcga ggtaccggag gtgggtgtac caggtgtgga ggttccgggt 360
ttcgaggtag cggaggtgga ggtaccgggt aaaggtgttc ctgaggtggg tgttccggag 420
gtaggtgtcc caggtgtgga ggtaccggag gttggtgttc ctggtgtcga ggtagcggag 480
gtgggtgtac cgggtaaagg tgttcctgag gtgggtgttc cggaggtagg tgtcccaggt 540
gtggaggtac cggaggttgg tgttcctggt gtcgaggtac cggaggtggg tgtaccaggt 600
gtggaggttc cgggtttcga ggtagcggag gtggaggtac cgggtaaagg tgttcctgag 660
gtgggtgttc cggaggtagg tgtcccaggt gtggaggtac cggaggttgg tgttcctggt 720
gtcgaggtag cggaggtggg tctcgag 747
Claims (7)
1.一种改性的细胞纤连蛋白基因fnE，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.一种细胞纤连蛋白CfnE，由如权利要求1所述改性的细胞纤连蛋白基因fnE编码得到。
3.如权利要求2所述一种细胞纤连蛋白CfnE的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)基因合成可进行非色谱纯化的改性细胞纤连蛋白fnE；
2)将所述非色谱纯化的改性细胞纤连蛋白fnE插入表达载体，构建携带所述非色谱纯化的改性细胞纤连蛋白fnE的重组表达载体；
3)将所述重组表达载体转化到大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)中；
4)选取转化后E.coli BL21(DE3)中的阳性克隆于培养基中进行发酵培养；
5)离心收集发酵后的E.coli BL21(DE3)细胞，重悬所述E.coli BL21(DE3)细胞于裂解缓冲液中进行裂解；
6)将步骤5)中裂解后的悬液进行高速离心，收集上清液；
7)向细胞粗提物中加入固体NaCl 1.5～3mol/L，触发改性蛋白发生相变，35℃～40℃恒温水浴15～25min后，30℃，10000～13200rpm，离心10～20min；
8)弃上清液，往沉淀物中加入4℃～8℃预冷的PBS缓冲溶液以溶解沉淀的蛋白，先用移液枪将沉淀吹打起来，充分混匀，4℃～8℃冰浴30min，4℃，10000～13200rpm，离心10～20min，收集上清液；
9)上清液重复步骤7)和8)二次，即可得纯化后改性细胞纤连蛋白CfnE。
4.如权利要求3所述一种细胞纤连蛋白CfnE的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述表达载体为pET-28载体。
5.如权利要求3所述一种细胞纤连蛋白CfnE的制备方法，其特征在于在步骤4)中，所述培养基为含有100μg/mL卡娜霉素的LB培养基，所述发酵条件可为：温度为37℃，摇床培养至OD600＝0.6时，再加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷至终浓度为0.5mmol/L，在16℃条件下诱导12h。
6.如权利要求3所述一种细胞纤连蛋白CfnE的制备方法，其特征在于在步骤5)中，所述裂解缓冲液配方为：0.3mol/L NaCl，10mmol/L咪唑，50mmol/L NaH2PO4，pH 8.0。
7.如权利要求3所述一种细胞纤连蛋白CfnE的制备方法，其特征在于在步骤6)中，所述高速离心为5000rpm，离心20min，4℃。
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