CN109790536A - 用于干细胞产生的纤连蛋白片段 - Google Patents
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Abstract
在新的重组纤连蛋白片段存在下，通过培养干细胞可以有效地增殖干细胞。
Description
技术领域
本发明涉及一种产生干细胞的方法，所述干细胞保持分化为各种细胞的能力。
背景技术
干细胞被定义为具有分裂以产生与自身相同的细胞的能力(自我更新能力)和分化为另一种类型的细胞的能力并能无限增殖的细胞。当从干细胞生成的两个子细胞中至少一个继续为与干细胞相同的细胞时，可以提供分化的细胞。
目前，关于制备干细胞的方法，研究正在积极进行中。例如，小鼠来源的饲养细胞、基质胶(Matrigel)、细胞外基质例如层粘连蛋白和纤连蛋白等可用作培养干细胞的基层。
例如，可引用非-专利文件1作为关于利用纤连蛋白或纤连蛋白片段制备干细胞的方法的研究。非-专利文件1公开了一种使人胚胎干细胞(ES细胞)在保持其多能性的同时增殖的方法，该方法包括在120 kDa纤连蛋白片段(此后称为120 k-fr)上培养人ES细胞。然而，细胞在120 k-fr上的增殖速率低于在全长纤连蛋白上的增殖速率。此外，为了使干细胞在再生医学中得到应用，必须保证质量和安全性，但是由于全长纤连蛋白和商业上可获得的120 k-fr是从天然纤连蛋白衍生而来的，存在由原始生物体具有的病毒等携带进来的高风险。
如上所述，利用纤连蛋白或纤连蛋白片段在短时间内产生足够数量的干细胞的技术尚未建立。
现有技术文件
非-专利文件
非-专利文件1：Journal of The Royal Society Interface, Vol. 10, No. 83,20130139 (2013)
本发明的公开内容
本发明要解决的问题
本发明的目的是解决干细胞生产的传统方法中存在的问题，并提供一种利用纤连蛋白片段在短时间内产生大量干细胞的方法。
问题的解决方案
作为解决上述问题的深入研究的结果，本发明人发现干细胞通过在一种新的重组纤连蛋白片段存在下培养干细胞而有效地增殖，并完成了本发明。
具体来说，本发明涉及以下内容：
[1] 一种产生干细胞的方法，该方法包括在以下多肽的存在下培养干细胞的步骤：
(a) 包含选自人纤连蛋白III-1至III-7的重复序列的重组多肽，或包含氨基酸序列的重组多肽，所述氨基酸序列具有在选自III-1至III-7的重复序列的氨基酸序列中的一个或数个氨基酸的置换、缺失、插入或添加；
(b) 包含人纤连蛋白III-8至III-10重复序列的重组多肽，或包含氨基酸序列的重组多肽，所述氨基酸序列具有在III-8至III-10重复序列的氨基酸序列中的一个或数个氨基酸的置换、缺失、插入或添加；和
(c) 包含人纤连蛋白III-12至III-14重复序列的重组多肽，或包含氨基酸序列的重组多肽，所述氨基酸序列具有在III-12至III-14重复序列的氨基酸序列中的一个或数个氨基酸的置换、缺失、插入或添加；
[2] 依据[1]的产生方法，其包括在重组多肽的存在下培养干细胞的步骤，所述重组多肽包括在相同的分子中的重组多肽(a)、(b)和(c)；
[3] 依据[1]或[2]的产生方法，其中重组多肽(a)是包含人纤连蛋白III-1至III-3重复序列或III-4至III-6重复序列的重组多肽，或包含氨基酸序列的重组多肽，所述氨基酸序列具有在III-1至III-3重复序列或III-4至III-6重复序列的氨基酸序列中的一个或数个氨基酸的置换、缺失、插入或添加；
[4] 依据[3]的产生方法，其中重组多肽是包含SEQ ID NO: 19或20的氨基酸序列的重组多肽，或包含氨基酸序列的重组多肽，所述氨基酸序列具有在SEQ ID NO: 19或20的氨基酸序列中的一个或数个氨基酸的置换、缺失、插入或添加；
[5] 依据[1]-[4]的任一项的产生方法，其中在重组多肽的存在下培养干细胞的步骤在包被有重组多肽的固相与干细胞接触的情况下进行；
[6] 依据[5]的产生方法，其中固相是用于细胞培养的装置或用于细胞培养的载体；
[7] 依据[5]的产生方法，其中固相是皿、平板、瓶、袋、珠、膜或载玻片；
[8] 依据[1]-[7]的任一项的产生方法，其中干细胞是源自人的多能干细胞或神经干细胞；
[9] 依据[8]的产生方法，其中干细胞是诱导的多能干细胞；
[10] 一种重组多肽，其包含在相同分子中的以下多肽：
(a) 包含选自人纤连蛋白III-1至III-7的重复序列的重组多肽，或包含氨基酸序列的重组多肽，所述氨基酸序列具有在选自III-1至III-7的重复序列的氨基酸序列中的一个或数个氨基酸的置换、缺失、插入或添加；
(b) 包含人纤连蛋白III-8至III-10重复序列的重组多肽，或包含氨基酸序列的重组多肽，所述氨基酸序列具有在III-8至III-10重复序列的氨基酸序列中的一个或数个氨基酸的置换、缺失、插入或添加；和
(c) 包含人纤连蛋白III-12至III-14重复序列的重组多肽，或包含氨基酸序列的重组多肽，所述氨基酸序列具有在III-12至III-14重复序列的氨基酸序列中的一个或数个氨基酸的置换、缺失、插入或添加；
[11] 依据[10]的多肽，其中重组多肽(a)是包含人纤连蛋白III-1至III-3重复序列或III-4至III-6重复序列的重组多肽，或包含氨基酸序列的重组多肽，所述氨基酸序列具有在III-1至III-3重复序列或III-4至III-6重复序列的氨基酸序列中的一个或数个氨基酸的置换、缺失、插入或添加；
[12] 依据[10]的重组多肽，其是包含SEQ ID NO: 19或20的氨基酸序列的重组多肽，或包含氨基酸序列的重组多肽，所述氨基酸序列具有在SEQ ID NO: 19或20的氨基酸序列中的一个或数个氨基酸的置换、缺失、插入或添加；
[13] 一种固相，其包被有依据[10]-[12]的任一项的重组多肽；
[14] 依据[13]的固相，其是包被有重组多肽的用于细胞培养的装置或用于细胞培养的载体；和
[15] 依据[13]的固相，其是包被有重组多肽的皿、平板、瓶、袋、珠、膜或载玻片。
本发明的效果
依据本发明，提供一种产生干细胞的方法。依据本发明的方法，有可能使干细胞有效增殖，维持干细胞的未分化状态，和有效诱导干细胞。该方法导致高的细胞增殖率。由本发明获得的干细胞具有分化为所需细胞的能力，因此，例如，它们适合用于再生医学。因此，期望本发明的方法为医学领域做出巨大贡献。此外，依据本发明，提供一种新的重组纤连蛋白片段。
附图简述
图1是显示纤连蛋白的结构域结构的示意图。
图2是实施例5中显示细胞增殖的图表。
图3是实施例6中显示细胞增殖的图表。
图4是实施例7中显示细胞增殖的图表。
图5是实施例8中显示细胞增殖的图表。
图6是显示纤连蛋白片段的结构域结构的示意图。
实施本发明的方式
本发明在下文详细描述。
<纤连蛋白>
源于人类和哺乳动物的纤连蛋白已经得到充分研究。下文描述了主要关于源自人类的血浆纤连蛋白的研究结果。
纤连蛋白是一种具有分子量约为250 kDa (单体)的巨大糖蛋白，其存在于血液、细胞表面、细胞外基质等中。已知纤连蛋白具有多种功能如细胞粘附。纤连蛋白由结构域结构组成(见图1)，且其氨基酸序列含有3种类似的序列。3种类似的序列称为I型重复序列、II型重复序列和III型重复序列。其中，III型重复序列由87-96个氨基酸残基组成，重复序列之间的氨基酸序列同源性为17-40%。15个III型重复序列存在于纤连蛋白中。其中，第一、第二和第三重复序列(此后分别称为III-1、III-2和III-3)包含在自缔合结构域中，第四、第五和第六重复序列(此后分别称为III-4、III-5和III-6)包含在DNA结合结构域中，第八、第九和第十重复序列(此后分别称为III-8、III-9和III-10)包含在细胞结合结构域中，和第十二、第十三和第十四重复序列(此后分别称为III-12、III-13和III-14)包含在肝素结合结构域中。III-10含有具有结合整联蛋白α5β1 (也称为VLA-5)的活性的区域，和核心序列是RGD。此外，在接近纤连蛋白的C-末端的位置存在一个称为IIICS的区域。IIICS含有由25个氨基酸组成的称为CS-1的序列，且该序列显示结合整联蛋白α4β1 (也称为VLA-4)的活性。
人纤连蛋白III-1至III-14和CS-1的氨基酸序列在本申请的序列表中分别显示为SEQ ID NOs: 1-14和15。
1. 本发明的产生干细胞的方法
本发明的产生干细胞的方法的特征是包括在多肽的存在下培养干细胞的步骤，所述多肽为重组纤连蛋白片段。
本发明所使用的干细胞不受限制，只要它具有分裂以产生与自身相同的细胞的能力(自我更新能力)和分化为其他类型的细胞的能力。根据分化能力，干细胞被如下所述进行分类，但是在本发明中可以使用任何干细胞。
(1) 全能干细胞：指可以分化为形成个体(包括体外组织，如胎盘)的所有类型的细胞的干细胞。其例子包括受精卵(及至多第四至第八卵裂)。
(2) 多能干细胞(pluripotent stem cell)：指不形成个体，但可以分化为属于三个胚层(内胚层、中胚层和外胚层)的所有细胞谱系的干细胞。没有特别的限制，但其例子包括胚泡期的内细胞团、由内细胞团建立的胚胎干细胞(ES细胞)、诱导的多能干细胞(iPS细胞)、胚胎肿瘤细胞(EC细胞)、胚胎生殖细胞(EG细胞)、核转移胚胎干细胞(ntES细胞)等。多能干细胞有时被称为多能细胞。
(3) 专能干细胞(multipotent stem cell)：指可以分化成多种类型的细胞的干细胞(尽管可分化的细胞谱系是有限的)。虽然不特别受限，但其例子包括造血干细胞、间充质干细胞、肝干细胞、胰腺干细胞、皮肤干细胞等。一般来说，在胚层之外是不可能分化的，但也有例外。
(4) 少向性干细胞：指只能分化成几种细胞类型的干细胞。虽然不特别受限，但其例子包括神经干细胞等。
(5) 单能干细胞：指其可分化的细胞类型限于一种类型的干细胞。单能干细胞可以作为干细胞分裂和增殖，或者可以分化或改变成干细胞以外的细胞类型。虽然不特别受限，但其例子包括肌肉干细胞、种系干细胞(卵原细胞和精原细胞)等。单能干细胞有时被称为前体细胞。
本发明使用的干细胞的来源不特别受限，而且可以使用来自任何生物体(优选哺乳动物)的干细胞。生物体的年龄和性别不受特别限制。在一个实施方案中，使用来自灵长类动物(例如黑猩猩、日本猴和人)的细胞。最优选地，使用来自人的细胞，但本发明并不限于此。
在本发明的合适的方面，干细胞优选地是多能干细胞，更优选地是iPS细胞，且甚至更优选地是人iPS细胞。已知各种制备iPS细胞的方法。本发明的方法的使用不仅仅限于通过特定方法制备的iPS细胞的使用。本发明的方法也可应用于已建立的iPS细胞，如已建立的人iPS细胞系(品系253G1)等。
在通过本发明的方法产生干细胞以供给予人的情况下，优选地，从具有与受体的类型相同或相似的组织相容性抗原类型的供体收集的细胞进行干细胞的产生。例如，从受体自身收集的细胞进行干细胞的产生。
本发明的产生干细胞的方法是一种产生干细胞的方法，其特征是包括在下面描述的多肽存在下的培养步骤(此后有时称为本发明的培养步骤)。
在本发明的产生干细胞的方法中，干细胞在多肽(a)、多肽(b)和多肽(c)的存在下培养。本发明的方法可在多肽(a)、多肽(b)和多肽(c)的存在下进行。干细胞的培养可以在两种多肽的混合物，即包含在相同分子中的多肽(a)和多肽(b)的多肽以及多肽(c)的存在下，在两种多肽的混合物，即多肽(a)和包含在相同分子中的多肽(b)和多肽(c)的多肽的存在下，在两种多肽的混合物，即包含在相同分子中的多肽(a)和多肽(b)的多肽以及包含在相同分子中的多肽(b)和多肽(c)的多肽的存在下，或在包含在相同分子中的多肽(a)、多肽(b)和多肽(c)的一种多肽的存在下进行。然而，上述的包含在相同分子中的多肽(a)、多肽(b)和多肽(c)的一种多肽不同于全长纤连蛋白。
多肽(a)是包含选自人纤连蛋白III-1至III-7的重复序列的重组多肽或包含氨基酸序列的重组多肽，所述氨基酸序列具有在选自III-1至III-7的重复序列的氨基酸序列中的一个或数个氨基酸的置换、缺失、插入或添加。在多肽(a)中，"选自人纤连蛋白III-1至III-7的重复序列"可以是至少1个重复序列，优选3个重复序列，或可以是全部7个重复序列。多肽(a)特别优选地是包含III-1、III-2和III-3重复序列的多肽，或包含III-4、III-5和III-6重复序列的多肽，或包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列具有在III-1至III-3重复序列或III-4至III-6重复序列的氨基酸序列中的一个或数个氨基酸的置换、缺失、插入或添加。
多肽(b)是包含人纤连蛋白III-8至III-10重复序列的重组多肽或包含氨基酸序列的重组多肽，所述氨基酸序列具有在III-8至III-10重复序列的氨基酸序列中的一个或数个氨基酸的置换、缺失、插入或添加。即是说，多肽(b)是包含III-8、III-9和III-10的全部的多肽。
多肽(c)是包含人纤连蛋白III-12至III-14重复序列的重组多肽或包含氨基酸序列的重组多肽，所述氨基酸序列具有在III-12至III-14重复序列的氨基酸序列中的一个或数个氨基酸的置换、缺失、插入或添加。即是说，多肽(c)是包含III-12、III-13和III-14的全部的多肽。
包含在相同分子中的多肽(a)和多肽(b)的多肽的例子包括120 kDa纤连蛋白片段(120k-fr)。120k-fr是一种具有分子量约120 kDa的蛋白，其从N-末端侧按顺序包含III-1、III-2、III-3、III-4、III-5、III-6、III-7、III-8、III-9和III-10。120 k-fr的预测的氨基酸序列(932个氨基酸残基)在本申请的序列表中作为SEQ ID NO: 16显示。120 k-fr可以通过制备编码120 k-fr的氨基酸序列的DNA，并将其与合适的宿主载体系统结合，作为重组多肽产生。也可使用市售可获得的120k-fr。
包含在相同分子中的多肽(b)和多肽(c)的多肽的例子包括CH-271和CH-296。
CH-271是具有分子量约60 kDa (549个氨基酸残基)的重组蛋白，其从N-末端侧按顺序包含III-8、III-9、III-10、III-12、III-13和III-14。CH-271的氨基酸序列在本申请的序列表中作为SEQ ID NO: 17显示。
CH-296是具有分子量约63 kDa (574个氨基酸残基)的重组蛋白，其从N-末端侧按顺序包含III-8、III-9、III-10、III-12、III-13、III-14和CS-1。CH-296的氨基酸序列在本申请的序列表中作为SEQ ID NO: 18显示。CH-296可作为RetroNectin (注册商标，由TAKARA BIO INC.生产)经市售获得。
例如，本发明的产生干细胞的方法可通过联合使用120 k-fr与CH-271或CH-296进行。
包含在相同分子中的多肽(a)、多肽(b)和多肽(c)的多肽也可用于本发明的产生干细胞的方法。虽然本发明不受特别限制，但包含在相同分子中的多肽(a)、多肽(b)和多肽(c)的多肽的例子包括如下所述的FCH-296和DCH-296。
FCH-296是具有分子量约96 kDa (881个氨基酸残基)的重组多肽，其从N-末端侧按顺序包含III-1、III-2、III-3、III-8、III-9、III-10、III-12、III-13、III-14和CS-1。FCH-296的氨基酸序列在本申请的序列表中作为SEQ ID NO: 19显示。SEQ ID NO: 19的氨基酸1-298对应于多肽(a)，SEQ ID NO: 19的氨基酸299-307对应于GS接头，SEQ ID NO: 19的氨基酸308-585对应于多肽(b)，和SEQ ID NO: 19的氨基酸586-856对应于多肽(c)，和SEQ ID NO: 19的氨基酸857-881对应于CS-1。同时，SEQ ID NO: 19的氨基酸94-111形成在III-1和III-2之间存在的并非III型重复序列的区域。FCH-296是本发明首次产生的一种新型多肽。
DCH-296是具有分子量约93 kDa (851个氨基酸残基)的重组多肽，其从N-末端侧按顺序包含III-4、III-5、III-6、III-8、III-9、III-10、III-12、III-13、III-14和CS-1。DCH-296的氨基酸序列在本申请的序列表中作为SEQ ID NO: 20显示。SEQ ID NO: 20的氨基酸1-268对应于多肽(a)，SEQ ID NO: 20的氨基酸269-277对应于GS接头，SEQ ID NO: 20的氨基酸278-555对应于多肽(b)，SEQ ID NO: 20的氨基酸556-826对应于多肽(c)，和SEQID NO: 20的氨基酸827-851对应于CS-1。DCH-296是本发明首次产生的一种新型多肽。
本发明所用的多肽(a)-(c)的每一个可包含氨基酸序列，其具有在选自III-1至III-7的重复序列的氨基酸序列、III-8至III-10重复序列的氨基酸序列或III-12至III-14重复序列的氨基酸序列中的一个或数个氨基酸的置换、缺失、插入或添加，只要它在功能上是等价的，或保留了使干细胞增殖的功能，维持干细胞未分化状态的功能，或诱导干细胞的功能。在本申请中，"一个或数个"是指但不限于在1-15的范围内，优选在1-10的范围内，更优选在1-5的范围内，和特别优选在1-3的范围内。例如，多肽包括，但不限于，代替III-1(SEQ ID NO: 1)包含缺失了III-1的N-末端9个氨基酸的氨基酸序列(SEQ ID NO: 23)、缺失了III-1的N-末端5个氨基酸的氨基酸序列(SEQ ID NO: 24)或缺失了III-1的N-末端3个氨基酸的氨基酸序列(SEQ ID NO: 25)的多肽。而且，包含多肽(a)-(c)的多肽的例子包括包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列具有在FCH-296 (SEQ ID NO: 19)的氨基酸序列或DCH-296 (SEQ ID NO: 20)的氨基酸序列中的一个或数个氨基酸的置换、缺失、插入或添加。更具体的例子包括，但不限于，缺失了N-末端9个氨基酸的FCH-296 (SEQ ID NO: 29)，缺失了N-末端6个氨基酸的FCH-296 (SEQ ID NO: 30)，缺失了N-末端5个氨基酸的FCH-296(SEQ ID NO: 31)，缺失了N-末端3个氨基酸的FCH-296 (SEQ ID NO: 32)，插入了N-末端3个氨基酸的FCH-296 (SEQ ID NO: 33)，插入了N-末端6个氨基酸的FCH-296 (SEQ ID NO:34)，插入了N-末端9个氨基酸的FCH-296 (SEQ ID NO: 35)，插入了N-末端11个氨基酸的FCH-296 (SEQ ID NO: 36)，插入了N-末端12个氨基酸的FCH-296 (SEQ ID NO: 37)，插入了N-末端14个氨基酸的FCH-296 (SEQ ID NO: 38)，插入了N-末端15个氨基酸的FCH-296(SEQ ID NO: 39)，插入了N-末端HKRHEEGH的FCH-296 (SEQ ID NO: 40)，插入了N-末端HKRH的FCH-296 (SEQ ID NO: 41)，插入了N-末端HH的FCH-296 (SEQ ID NO: 42)，插入了N-末端HHH的FCH-296 (SEQ ID NO: 43)，具有N-末端His-标记的FCH-296 (SEQ ID NO:21)，和具有N-末端His-标记的DCH-296 (SEQ ID NO: 22)。
此外，本发明所用的多肽(a)-(c)的每一个可包含与选自III-1至III-7的重复序列的氨基酸序列、III-8至III-10重复序列的氨基酸序列或III-12至III-14重复序列的氨基酸序列具有同一性的氨基酸序列，只要它在功能上是等价的，或保留了使干细胞增殖的功能，维持干细胞未分化状态的功能，或诱导干细胞的功能。其例子包括，但不限于，具有氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与选自III-1至III-7的重复序列的氨基酸序列、III-8至III-10重复序列的氨基酸序列或III-12至III-14重复序列的氨基酸序列具有80%或更多，优选90%或更多，且特别优选95%或更多同一性。
氨基酸的置换、缺失、插入或添加(此后有时称为"氨基酸置换等")可优选进行至这样的程度，即在能够维持原始多肽的功能的范围内可改变多肽的物理化学性质等。例如，氨基酸置换等优选在基本上不改变原始多肽所具有的性质(如疏水性、亲水性、电荷、pK等)的范围内保守。例如，氨基酸置换是在以下每一组中的置换：1. 甘氨酸和丙氨酸；2. 缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸；3. 天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；4. 丝氨酸和苏氨酸；5. 赖氨酸和精氨酸；和6. 苯丙氨酸和酪氨酸。氨基酸缺失、添加或插入优选是在基本上不改变多肽中目标位点周围的性质的范围内，具有与目标位点周围的性质相似的性质的氨基酸的缺失、添加或插入。
氨基酸置换等可能是由于物种差异或个体差异而自然发生的，或者可能是人工引入的。人工引入可以用已知的方法进行，而且没有特别的限制。例如，可以使用通过已知方法在编码上述多肽的核酸中引入碱基的置换、缺失、添加或插入而获得的核酸。利用该核酸，可以产生具有在上述多肽的氨基酸序列中的一个或数个氨基酸置换等的氨基酸序列的多肽。
在本说明书中，术语"功能上是等价的"或"等同功能"意指与没有向其中引入氨基酸置换等的相应多肽在功能上等价或等同功能。也就是说，这意味着当使用待比较的多肽进行稍后描述的干细胞的生产时，获得干细胞的细胞增殖率，其等于在使用没有向其中引入氨基酸置换等的相应多肽时获得的细胞增殖率；或保持干细胞的未分化状态，其等于使用没有向其中引入氨基酸置换等的相应多肽的未分化状态；或获得干细胞的等效诱导率。也就是说，根据在后面描述的实施例中描述的方法，通过评估多肽的性质，可以适当地确定多肽的功能。
本发明所用的多肽可含有并非上述III型重复序列的肽或氨基酸残基，和/或存在于纤连蛋白中的并非上述III型重复序列的区域，例如CS-1，只要本发明所用的多肽在培养干细胞方面没有失去它的效用。例如，任何肽或氨基酸残基可被引入并非上述III型重复序列的区域，并且其例子包括氨基酸残基或肽作为在重复序列之间的接头插入其中的本发明的多肽，和向其中加入可用于纯化重组多肽的肽(标记)的本发明的多肽。接头的例子包括，但不限于，甘氨酸-丝氨酸接头(GS接头)。标记的例子包括，但不限于，多组氨酸-标记(His-标记)、Flag-标记和谷胱甘肽S-转移酶标记(GST-标记)。本发明所用的多肽的例子包括，但不限于，具有在N-末端的His-标记的FCH-296多肽(SEQ ID NO: 21)，和具有在N-末端的His-标记的DCH-296多肽(SEQ ID NO: 22)。
在本发明的培养步骤中，干细胞以高的细胞增殖率培养，同时干细胞保持未分化状态。如下面描述的实施例中所述，本发明的产生干细胞的方法是非常有用的，因为与单独使用120 k-fr、CH-271和CH-296 (它们是已知的纤连蛋白片段)的每一个的方法比较，本发明的产生干细胞的方法具有明显较高的细胞增殖率，并能高度保持未分化状态。而且，当将上述方法应用于干细胞的扩增时，有一个很大的优点，即可以在不使用饲养细胞的情况下实现高的细胞增殖率和未分化状态的维持。
关于多肽的制备，有关纤连蛋白的信息可以在Kimiduka F., et al., J.Biochem., Vol. 110, 第284-291页(1991), Kornbrihtt A. R., et al., EMBO J.,Vol. 4, No. 7, 1755-1759 (1985), Sekiguchi K., et al., Biochemistry, Vol. 25,No. 17, 4936-4941 (1986)等中看到。此外，编码纤连蛋白的核苷酸序列和纤连蛋白的氨基酸序列在GenBank登录号NM_002026和NP_002017中公开。
本发明所用的多肽用重组DNA技术产生。从生产或处理重组体的角度，本发明所用的多肽的分子量优选地是100 kDa或更小。本说明书中的多肽还包括化学修饰的多肽，如乙酰化多肽。
在本发明的合适的方面，在包被有多肽的固相与干细胞接触的情况下进行干细胞的培养。上述固相的例子包括用于细胞培养的容器或载体(微珠等)。上述包被有多肽的固相具有稳定保留干细胞的能力，并且可用于培养细胞。培养容器可以由任何材料制成，只要它不抑制细胞的维持、存活、分化、成熟和自我更新，并且可以具有任何形状，只要它不抑制细胞的维持、存活、分化、成熟和自我复制。用于培养容器的材料的例子包括玻璃、合成树脂(包括无纺织物)、天然树脂、金属等。培养容器的形状的例子包括多边形柱体，例如三角形棱柱、立方体和长方形平行六面体，圆柱体，多边形锥体，例如三棱锥和四棱锥，圆锥体，任意形状，如葫芦、球形、半球形、圆形、椭圆形、半圆形等。
可用于培养干细胞的细胞培养装置的例子包括，但不限于，皿、平板、瓶、袋、膜、载玻片、大型培养池、生物反应器、中空纤维型培养装置等。优选地，使用平板，更优选地使用组织培养处理板。
可使用的袋子的例子包括用于细胞培养的CO2气体渗透袋。当大量干细胞被工业化生产时，可以使用大型培养池。培养可以在开放的系统中进行，或者可以在封闭的系统中进行，但是从获得的干细胞的安全性角度，优选在封闭的系统中进行培养。
固相的包被，即在固相表面上固定多肽，可以用一种已知的方法进行。例如，用与WO 97/18318 A和WO 00/09168 A中所描述的纤连蛋白片段固定相同的方法进行包被是可能的。当将多肽固定在固相上时，通过本发明的方法获得干细胞后，只通过将细胞和固相分离，就很容易分离本发明的细胞和多肽。因此，可以防止干细胞受到多肽等的污染。
更具体地说，通过将多肽溶解在灭菌的蒸馏水、缓冲液、生理盐水等中制备包被溶液，包被溶液可用于固定化。优选地，可使用使用磷酸盐缓冲盐水(PBS)，特别优选Dulbecco's PBS (D-PBS)作为溶剂而获得的包被溶液。
包被溶液中多肽的摩尔浓度不特别受限，但其例子包括1-100,000 nM，优选10-2000 nM，且更优选30-1000 nM。当FCH-296被用作多肽时，上述摩尔浓度被表示为0.1-1000μg/mL，优选地1-200 μg/mL，且更优选地3-100 μg/mL的重量浓度。
包被可以通过将上述包被溶液添加到培养容器中并保存一段适当的时间来进行。保持包被溶液的条件可以适当地确定，但条件的例子包括在室温1小时的条件，或在4℃过夜的条件。
包被有纤连蛋白片段的容器可以按原样使用，或者可以在低温下，例如在0到10℃的温度下保存，直到使用为止。在临用前，将包被溶液从培养装置中移除，培养装置用例如D-PBS清洗两次，必要时再用细胞培养基清洗一次，然后使培养装置经受细胞培养。
本发明的产生干细胞的方法通过在产生干细胞的整个培养期或培养期的任何部分中在多肽的存在下执行培养步骤来进行。也就是说，本发明包括任何方法，其包括将所述培养步骤作为干细胞生产过程的一部分。
本发明的培养步骤包括干细胞的诱导、干细胞的维持和干细胞的扩增培养，或干细胞的维持和干细胞的扩增培养。因此，本发明提供一种产生干细胞的方法，其包括在上述重组多肽(a)、(b)和(c)的存在下诱导、维持和扩增培养干细胞，和一种产生干细胞的方法，其包括在上述重组多肽(a)、(b)和(c)的存在下维持和扩增培养干细胞。在本发明的产生干细胞的方法中，可用于再生医学等的干细胞，可通过在要经历该方法、培养条件等的细胞类型的适当调整的条件下进行干细胞培养来产生。在本说明书中，干细胞是指含有干细胞的细胞群。
为了诱导干细胞的目的，在本发明的培养步骤中，在培养开始时使用的细胞类型和用于诱导干细胞的方法不是特别受限的。培养开始时的细胞可以是分化的细胞(有时称为体细胞)，例如成纤维细胞、肝细胞、脂肪细胞、心肌细胞、造血细胞(T细胞、B细胞、造血干细胞等)，或可以是与诱导的干细胞不同类型的干细胞。用于诱导干细胞的方法不受特别的限制，只要它是已知的方法，其例子包括包括将低分子量化合物与细胞接触的方法或包括将低分子量化合物引入细胞的方法，包括在细胞中引入重编程因子的方法，包括将细胞核移植到细胞的方法等。可将重编程因子作为蛋白质引入细胞，或直接或使用载体将编码重编程因子的核酸(RNA、DNA)引入细胞。载体的例子包括逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、仙台病毒载体、麻疹病毒载体、附加体载体等。
为了维持和扩增培养干细胞的目的，在本发明的培养步骤中，培养开始时的细胞浓度不特别受限，但例如，它是0.005-20 x 105个细胞/mL，优选0.02-5 x 105个细胞/mL，且更优选0.05-2 x 105个细胞/mL。
用于培养干细胞的各种培养基可用于本发明的培养步骤。当培养多能干细胞时，可使用例如Cellartis (注册商标) DEF-CS培养基(由TAKARA BIO INC.生产)。优选的例子包括不含异源成分如胎牛血清(FBS)或胎牛血清(FCS)和绵羊血清的培养基、无血清培养基、不含未知成分的培养基(定义培养基)等。这样一种不含异源成分的xeno-free培养基可被适当地制备，但已知的培养基或市售可获得的培养基可以按原样使用或改良。例如，Cellartis (注册商标) DEF-CS Xeno-Free培养基(由TAKARA BIO INC.生产)、DXF (由PromoCell GmbH生产)和TeSR-E8培养基(由STEMCELL Technologies Inc.生产)可用作市售可获得的不含异源成分的培养基。当培养神经干细胞时，可使用例如RHB-A培养基(由TAKARA BIO INC.生产)。
用于细胞的培养条件没有特别的限制，可使用普通的细胞培养条件。培养条件的例子包括在37℃的温度、95%的湿度和5%的CO2浓度的培养条件，但本发明不限于这样的条件。其例子包括在30-40℃的温度、90-98%的湿度和3-7%的CO2浓度的培养条件，但可使用并非以上范围的温度、湿度和CO2浓度，只要所需的细胞增殖可以实现。在培养期间，优选的是通过以适当的时间间隔将新鲜的培养基加入到细胞培养基中稀释细胞培养基，用新鲜培养基交换培养基，或更换用于细胞培养的装置。要使用的培养基、同时要使用的其他组分等可适当地确定。
在本发明的合适的方面，为了维持和扩增培养干细胞的目的，干细胞在包被有本发明所用多肽的容器中在适当的培养基中培养。例如，它们被培养5天或更长，优选10天或更长，同时交换培养基并传代。通过这种培养，干细胞可以增殖。也就是说，通过所述培养获得的80%或以上、优选90%或以上的细胞群体是干细胞。
在本发明的合适的方面，为干细胞的单细胞克隆的目的，将系列稀释的干细胞接种于包被有本发明所用的多肽的容器中。此后，使用适当的培养基，继续培养直到出现集落，例如5天或更多天，优选10天或更多天，同时交换培养基。干细胞的单细胞克隆可以通过获得集落来进行。即是说，通过所述培养获得的集落中80%或更多、优选90%或更多的细胞是干细胞。
通过本发明的培养步骤获得的干细胞可根据形态学特征而与其他细胞区分开来。在多能干细胞的情况下，细胞也可以根据标记分子的表达来证实，标记分子是未分化状态的指示物，例如碱性磷酸酶、阶段特异性胚胎抗原(SSEA)例如SSEA-4、肿瘤排斥抗原(TRA)例如TRA-1-60和TRA-1-81，以及OCT4和NANOG。上述分子(阳性标记)的表达可例如使用识别上述分子的抗体来证实。关于碱性磷酸酶，它的表达也可以根据其酶活性来证实。在另一方面，在神经干细胞的情况下，虽然没有特别的限制，它也可以根据神经干细胞标记分子例如巢蛋白(Nestin)的表达来证实。
通过本发明的培养步骤获得的80%或更多、优选90%或更多、更优选95%或更多的干细胞表达阳性标记。
而且，干细胞可从通过本发明的培养步骤获得的细胞群分离，从而可获得与其他细胞分离的干细胞。识别干细胞的特征性分子的抗体可用于分离和纯化依据本发明获得的干细胞。如此分离的干细胞可用已知的方法建立作为细胞系。即是说，作为本发明的一个方面，可提及一种用于产生干细胞的方法，该方法包括用于产生含有本发明的干细胞的细胞群的过程的步骤以及从所获得的细胞群中分离干细胞的步骤。此外，还可以通过分化用已知方法如此获得的干细胞来产生各种分化的细胞。
本发明获得的干细胞和从干细胞获得的分化细胞也可用于例如，关于干细胞分化、各种疾病的药物筛选、药物候选化合物的疗效和安全性评价等方面的研究。依据本发明，许多干细胞可通过单次操作获得。因此，与传统方法不同，可以在不受细胞批次间的差异影响的情况下获得可重复的研究结果。
2. 本发明的多肽
本发明提供一种新的可用于产生干细胞的重组多肽。所述多肽是包含如在"1. 本发明的产生干细胞的方法"中所述的相同分子中的多肽(a)-(c)的重组多肽，并可用于该方法中。本发明的多肽具有使干细胞增殖的功能，维持干细胞未分化状态的功能，和/或诱导干细胞的功能。本发明的多肽具有等同于全长纤连蛋白的功能或高于现有的纤连蛋白片段的功能。
本发明的多肽是包含在相同分子中的以下多肽(a)-(c)的重组多肽：
(a) 包含选自人纤连蛋白III-1至III-7的重复序列的重组多肽或包含氨基酸序列的重组多肽，所述氨基酸序列具有在选自III-1至III-7的重复序列的氨基酸序列中的一个或数个氨基酸的置换、缺失、插入或添加；
(b) 包含人纤连蛋白III-8至III-10重复序列的重组多肽或包含氨基酸序列的重组多肽，所述氨基酸序列具有在III-8至III-10重复序列的氨基酸序列中一个或数个氨基酸的置换、缺失、插入或添加；和
(c) 包含人纤连蛋白III-12至III-14重复序列的重组多肽或包含氨基酸序列的重组多肽，所述氨基酸序列具有在III-12至III-14重复序列的氨基酸序列中一个或数个氨基酸的置换、缺失、插入或添加。
以上重组多肽(a)、(b)和(c)如在"1. 本发明的产生干细胞的方法"中所述。
本发明的多肽的例子包括，但不限于，从N-末端侧具有多肽(a)、(b)和(c)的多肽。还优选的是，多肽(b)和(c)的每一个具有结合整联蛋白α5β1 (也称为VLA-5)的活性和结合肝素的活性。
本发明的多肽的一个特别合适的方面是包含序列表中SEQ ID NO: 19或20的氨基酸序列的多肽。此外，以下重组多肽包括在本发明中，其包含在序列表的SEQ ID NO: 19或20的氨基酸序列中具有一个或数个氨基酸的置换、缺失、插入或添加的氨基酸序列，和具有等同于包含SEQ ID NO: 19或20的氨基酸序列的重组多肽的功能，或保持使干细胞增殖的功能，维持干细胞未分化状态的功能，和/或诱导干细胞的功能。例如，所述多肽包括，但不特别限于，包含具有III-1的N-末端9个氨基酸缺失的氨基酸序列(SEQ ID NO: 23)、具有III-1的N-末端5个氨基酸缺失的氨基酸序列(SEQ ID NO: 24)，或具有III-1的N-末端3个氨基酸缺失的氨基酸序列(SEQ ID NO: 25)代替III-1 (SEQ ID NO: 1)的多肽。更具体地，多肽的例子包括具有N-末端9个氨基酸缺失的FCH-296 (SEQ ID NO: 29)，具有N-末端6个氨基酸缺失的FCH-296 (SEQ ID NO: 30)，具有N-末端5个氨基酸缺失的FCH-296 (SEQ IDNO: 31)，具有N-末端3个氨基酸缺失的FCH-296 (SEQ ID NO: 32)，插入了N-末端3个氨基酸的FCH-296 (SEQ ID NO: 33)，插入了N-末端6个氨基酸的FCH-296 (SEQ ID NO: 34)，插入了N-末端9个氨基酸的FCH-296 (SEQ ID NO: 35)，插入了N-末端11个氨基酸的FCH-296(SEQ ID NO: 36)，插入了N-末端12个氨基酸的FCH-296 (SEQ ID NO: 37)，插入了N-末端14个氨基酸的FCH-296 (SEQ ID NO: 38)，插入了N-末端15个氨基酸的FCH-296 (SEQ IDNO: 39)，插入了N-末端HKRHEEGH的FCH-296 (SEQ ID NO: 40)，插入了N-末端HKRH的FCH-296 (SEQ ID NO: 41)，插入了N-末端HH的FCH-296 (SEQ ID NO: 42)，插入了N-末端HHH的FCH-296 (SEQ ID NO: 43)，具有N-末端His-标记的FCH-296 (SEQ ID NO: 21)，和具有N-末端His-标记的DCH-296 (SEQ ID NO: 22)。
本发明的多肽可通过使用已知的重组DNA技术产生。可使用已知的宿主和载体。例如，可使用宿主，包括细菌(大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等)、酵母、丝状真菌、昆虫细胞和动物细胞(哺乳动物细胞，包括人细胞等)，和可使用与各个宿主相容的载体。载体携带编码本发明的多肽的核酸。核酸可以通过修饰天然核酸(例如编码人纤连蛋白的DNA)来制备，或者可以经化学合成。在携带核酸的载体引入的宿主中表达的本发明多肽，或分泌到宿主的培养上清液中的本发明多肽，可通过已知的蛋白质纯化方法纯化到所需的纯度。
3. 包被有本发明的多肽的固相
本发明提供包被有本发明的多肽的固相。所述固相是如在"1. 本发明的产生干细胞的方法"中描述的固相并可用于该方法。
本发明的固相是具有将多肽固定于其表面的合适的固相。固相的例子包括用于细胞培养的装置和用于细胞培养的载体，特别是皿、平板、瓶、袋、珠、膜和载玻片。这些没有特别的限制，只要它们可用于本发明的产生干细胞的方法。为使多肽固定在固相上，可采用如对本发明的产生干细胞的过程描述的方法。
由于本发明的固相能稳定地保持在固相表面上的干细胞，因此有可能提高培养操作例如培养基交换的效率。此外，通过预先准备本发明的固相，有可能直接进行本发明的生产干细胞的过程。
实施例
本发明更具体地通过以下实施例来描述，本发明的范围不限于所述实施例。
实施例1 FCH-296的制备
具有在N-末端由甲硫氨酸残基和6个组氨酸残基组成的His-标记的FCH-296多肽(SEQID NO: 21)由下列程序制备。
编码多肽的DNA经人工合成，并将其掺入表达质粒中。大肠杆菌用质粒转化，得到的转化子在允许多肽表达的条件下进行培养。从培养中收集的微生物细胞用超声波破碎机(由KUBOTA Corporation制造)破坏，以获得无细胞的提取物。使用提取物作为起始原料，FCH-296用Ni-Chelating Sepharose (由GE Healthcare制造)、羟磷灰石(40 μm，由Bio-Rad Laboratories, Inc.制造)和SP-Sepharose (由GE Healthcare制造)的一系列柱层析纯化。用SDS-PAGE/CBB染色对纯化过程中的FCH-296进行了确证。得到的样本的缓冲液用缓冲液[0.2 g/L KCl、0.2 g/L KH2PO4、8 g/L NaCl、1.15 g/L Na2HPO4]替换以获得6 mLFCH-296样品。
FCH-296样品用SDS-PAGE/CBB染色呈现出单条带。FCH-296样品的蛋白浓度是1.21mg/mL (从分子量计算为12.4 μM)，如使用BCA蛋白定量试剂盒(由Pierce生产)测量的。
实施例2 DCH-296的制备
具有在N-末端由甲硫氨酸残基和6个组氨酸残基组成的His-标记的DCH-296多肽(SEQID NO: 22)通过下列程序制备。
编码多肽的DNA经人工合成，并将其掺入表达质粒中。大肠杆菌用质粒转化，得到的转化子在允许多肽表达的条件下进行培养。从培养中收集的微生物细胞用超声波破碎机破坏，以获得无细胞的提取物。使用提取物作为起始原料，DCH-296用Ni-ChelatingSepharose、羟磷灰石和SP-Sepharose的一系列柱层析纯化。用SDS-PAGE/CBB染色对纯化过程中的DCH-296进行了确证。得到的样本的缓冲液用缓冲液[0.2 g/L KCl、0.2 g/L KH2PO4、8 g/L NaCl、1.15 g/L Na2HPO4]替换以获得3 mL DCH-296样品。
DCH-296样品用SDS-PAGE/CBB染色呈现出单色带。DCH-296样品的蛋白浓度是1.03mg/mL (从分子量计算为11.0 μM)，如使用BCA蛋白定量试剂盒测量的。
实施例3 各种纤连蛋白片段对人iPS细胞的附着的评价
使全长纤连蛋白(源自人血浆；由Sigma-Aldrich Co. LLC.生产, F0895, 最终浓度：50 μg/ml)、120k-fr (由Millipore Corporation生产, F1904, 最终浓度：40 μg/ml)、CH-271 (J. Biochem., Vol. 110, p. 284-291 (1991), 最终浓度：25 μg/ml)和CH-296(RetroNectin：由Takara Bio Inc.生产, 最终浓度：20 μg/ml)各自溶于D-PBS (由PromoCell GmbH生产, C-40232)以制备包被溶液。在包被溶液按0.4 mL/孔加入到12孔组织培养处理板(由Corning Incorporated生产, 3513)后，对板加盖，使之在4℃放置过夜。第二天，从板除去包被溶液，然后用1 mL/孔的D-PBS洗涤板两次以获得用每一种多肽包被的板。对于两种纤连蛋白片段的包被，用第一包被溶液包被板后，以0.4ml/孔将第二包被溶液加到板上，然后将板在4℃放置过夜，并以与第一包被相同的方式清洗。对已准备好的板加盖并在4℃贮存待用。
将用Cellartis (注册商标) DEF-CS培养基(由TAKARA BIO INC.生产, Y30010)传代培养的人iPS细胞(品系253G1) (由Center for iPS Cell Research andApplication, Kyoto University制造)以8 x 104个细胞/孔接种在板上，并于37℃、5% CO2下在相同培养基中培养。自次日起每天交换培养基，在开始培养后第6天观察细胞。结果示于表1。
| [表1] | ||
| 第一包被 | 第二包被 | 细胞脱离(无：-，存在：+) |
| 纤连蛋白 | 无 | - |
| 120k-fr | 无 | + |
| CH-271 | 无 | + |
| CH-296 | 无 | + |
| 120k-fr | CH-271 | - |
| 120k-fr | CH-296 | - |
用120k-fr/CH-271包被的板和用120k-fr/CH-296包被的板上均未观察到细胞脱离。这些结果表明合并现有纤连蛋白片段可增加细胞对板的附着。
实施例4 FCH-296和DCH-296对人iPS细胞的附着的评价
使全长纤连蛋白、120 k-fr、CH-271、CH-296、FCH-296和DCH-296各自溶于D-PBS以制备包被溶液。此外，关于CH-296，制备高浓度的包被溶液。对于FCH-296和DCH-296的每一种，还制备低浓度的包被溶液。以与实施例3中相同的方式，使用这些包被溶液包被12孔组织培养处理板。
用DEF-CS培养基传代培养的人iPS细胞(品系253G1)按8 x 104个细胞/孔接种于板上，并于37℃、5% CO2下培养。自次日起每天交换培养基，在开始培养后第5、8和11天观察细胞。结果示于表2中。
[表2]
在第8天，在用现有纤连蛋白片段(120k-fr, CH-271，和CH-296)包被的板上观察到细胞脱离。在另一方面，在用DCH-296和FCH-296分别包被的板上，在第8天未观察到细胞脱离。特别是，在FCH-296的情况下，甚至在包被有低浓度的包被溶液的孔中，在第11天完全未观察到细胞脱离。这些结果表明，在培养人iPS细胞中，FCH-296具有与全长纤连蛋白等同的细胞附着。
实施例5 人iPS细胞的长期培养(DEF-CS培养基)
使全长纤连蛋白和FCH-296各自溶于D-PBS以制备各个浓度的包被溶液。24孔组织培养处理板(由Corning Incorporated制造)的包被以与实施例3中相同的方式，使用这些包被溶液进行。
使人iPS细胞(品系253G1)悬浮于DEF-CS培养基中，然后接种于板上。从次日开始每日更换培养基，使细胞每3-4天传代培养。细胞增殖的结果示于图2。此外，在开始培养后第35天(第10代)，用流式细胞术检测TRA-1-60阳性细胞率和SSEA4阳性细胞率。结果示于表3。TRA-1-60和SSEA4是多能干细胞的标记物。
[表3]
甚至在包被有FCH-296的板上，人iPS细胞在保持多能性的同时也能增殖，就像包被有纤连蛋白的板一样。以上结果表明人iPS细胞可在用FCH-296包被的板上长时间培养。
实施例6 人iPS细胞的长期培养(DEF-CS Xeno-Free培养基)
检查了人iPS细胞是否能在包被有FCH-296的板上长期培养，甚至在不含源自动物或人的成分的培养基中，也就是说在xeno-free培养基中。
使全长纤连蛋白和FCH-296各自溶于D-PBS以制备各个浓度的包被溶液。24孔组织培养处理板的包被使用这些包被溶液，以与实施例3中相同的方式进行。包被也使用对DEF-CS Xeno-Free培养基(由Takara Bio Inc.生产)所建议的Synthemax (注册商标) II-SC基层(由Corning Incorporated制备)进行。
使人iPS细胞(品系253G1)悬浮于DEF-CS Xeno-Free培养基中，然后接种于板上。从次日开始每日更换培养基，使细胞每3-4天传代培养。细胞增殖的结果示于图3。在开始培养后第35天(第10代)，用流式细胞术检测TRA-1-60阳性细胞率和SSEA4阳性细胞率。结果示于表4。TRA-1-60和SSEA4是多能干细胞的标记物。
[表4]
在包被有FCH-296的板上，人iPS细胞在保持多能性的同时增殖，就像包被有纤连蛋白的板或Synthemax一样。以上结果表明人iPS细胞可在用FCH-296包被的板上长时间培养，甚至在DEF-CS Xeno-Free培养基中。
实施例7 人iPS细胞的长期培养(TeSR-E8培养基)
TeSR-E8培养基是只含有维持人iPS/ES细胞所必需的最低8种要素的xeno-free培养基。检查了人iPS细胞是否能在用FCH-296包被的板上长期培养，甚至在TeSR-E8培养基中。
使全长纤连蛋白和FCH-296各自溶于D-PBS以制备各个浓度的包被溶液。24孔组织培养处理板的包被使用这些包被溶液，以与实施例3中相同的方式进行。包被也使用对TeSR-E8培养基(由STEMCELL Technologies Inc.生产)所建议的玻连蛋白XF (由CorningIncorporated制造)进行。
使人iPS细胞(品系253G1)悬浮于TeSR-E8培养基中，然后接种于板上。从次日开始每日更换培养基，使细胞每3-4天传代培养。细胞增殖的结果示于图4。在开始培养后第27天(第7代)，用流式细胞术检测TRA-1-60阳性细胞率和SSEA4阳性细胞率。结果示于表5。TRA-1-60和SSEA4是多能干细胞的标记物。
[表5]
在包被有FCH-296的板上，人iPS细胞在保持多能性的同时增殖，就像包被有纤连蛋白或玻连蛋白的板一样。以上结果表明人iPS细胞可在用FCH-296包被的板上长时间培养，甚至在TeSR-E8培养基中。
实施例8 人神经干细胞的长期培养
检查了人神经干细胞能否在用FCH-296包被的板上长期培养。
使FCH-296溶于D-PBS以制备30 μg/ml包被溶液。12孔组织培养处理板的包被使用这些包被溶液，以与实施例3中相同的方式进行。包被也使用对RHB-A培养基(由TAKARA BIOINC.生产)所建议的层粘连蛋白(由Gibco生产，10 μg/ml)进行。将人神经干细胞以1.5-2.0x 105个细胞/孔接种于包被的板上并于37℃、5% CO2下培养。从次日开始每两天更换培养基，使细胞每4-8天传代培养。细胞增殖的结果示于图5。
当巢蛋白(一种神经干细胞标记物)的表达在培养开始后第28天(第5代)经免疫染色证实时，细胞保持巢蛋白的表达，甚至在用FCH-296包被的板上，就像用层粘连蛋白包被的板一样。以上结果表明人神经干细胞可在用FCH-296包被的板上长时间培养。
实施例9 人iPS细胞的单细胞克隆
使全长纤连蛋白和FCH-296各自溶于D-PBS以制备各个浓度的包被溶液。96孔半区域组织培养处理板(由Corning Incorporated制造)的包被使用这些包被溶液，以与实施例3中相同的方式进行。
使人iPS细胞(品系253G1)悬浮于DEF-CS培养基中，然后以1个细胞/孔接种于板上。从第二天开始每两天交换培养基。表6显示在第10天获得的集落出现率。
[表6]
甚至在包被有FCH-296的板上，也能获得各自来自单个人iPS细胞的集落，就像包被有纤连蛋白的板一样。一些集落被传代培养并扩增。当在第16天用流式细胞术测量TRA-1-60阳性细胞率和SSEA4阳性细胞率时，它们在所有的传代培养和扩增的集落中为90%或更多。以上结果表明人iPS细胞的单细胞克隆在用FCH-296包被的板上是可能的。
实施例10 对人iPS细胞(F1CH-296、F2CH-296和F3CH-296)的附着性评估
为了研究在III-1、III-2和III-3中哪个重复序列是重要的，制备如图6所示的三种多肽(F1CH-296、F2CH-296和F3CH-296)。即是说，各自在N-末端具有由甲硫氨酸残基和6个组氨酸残基组成的His-标记的F1CH-296 (SEQ ID NO: 26)、F2CH-296 (SEQ ID NO: 27)和F3CH-296 (SEQ ID NO: 28)以与实施例1相同的方式制备。
使全长纤连蛋白、CH-296、FCH-296、F1CH-296、F2CH-296和F3CH-296各自溶于D-PBS以制备各个浓度的包被溶液。24孔组织培养处理板的包被使用这些包被溶液，以与实施例3中相同的方式进行。在此，50 μg/ml纤连蛋白相当于约200 nM，而20 μg/ml CH-296、30μg/ml FCH-296和24 μg/ml F1CH-296分别相当于约320 nM。
使人iPS细胞(品系253G1)悬浮于DEF-CS培养基中，然后接种于板上。从次日开始每天更换培养基，并在开始培养后第3、6、8和10天观察细胞。结果示于表7 (无细胞脱离：-，存在细胞脱离：+)。
[表7]
3种多肽(F1CH-296、F2CH-296和F3CH-296)显示出类似的倾向。即是说，例如，在24 μg/ml的条件下，第8天观察到细胞脱离。相比之下，在包被有CH-296的板上，第3天观察到细胞脱离，在包被有FCH-296的板上，没有观察到细胞脱离。这些结果表明3种多肽(F1CH-296、F2CH-296和F3CH-296)的附着活性高于CH-296的附着活性和低于FCH-296的附着活性。以上结果表明3种III型重复序列(III-1、III-2和III-3)具有相同的细胞附着性，和当含有所有3种III型重复序列时，细胞附着活性是最高的。
实施例11 具有各种N-末端序列的FCH-296的评估
制备具有各种N-末端序列的多种FCH-296。即是说，制备具有N-末端9个氨基酸缺失的FCH-296 (SEQ ID NO: 29)，具有N-末端6个氨基酸缺失的FCH-296 (SEQ ID NO: 30)，具有N-末端5个氨基酸缺失的FCH-296 (SEQ ID NO: 31)，具有N-末端3个氨基酸缺失的FCH-296(SEQ ID NO: 32)，FCH-296 (SEQ ID NO: 19)，插入了N-末端3个氨基酸的FCH-296 (SEQID NO: 33)，插入了N-末端6个氨基酸的FCH-296 (SEQ ID NO: 34)，插入了N-末端9个氨基酸的FCH-296 (SEQ ID NO: 35)，插入了N-末端11个氨基酸的FCH-296 (SEQ ID NO: 36)，插入了N-末端12个氨基酸的FCH-296 (SEQ ID NO: 37)，插入了N-末端14个氨基酸的FCH-296 (SEQ ID NO: 38)，插入了N-末端15个氨基酸的FCH-296 (SEQ ID NO: 39)，插入了N-末端HKRHEEGH的FCH-296 (SEQ ID NO: 40)，插入了N-末端HKRH的FCH-296 (SEQ ID NO:41)，插入了N-末端HH的FCH-296 (SEQ ID NO: 42)，和插入了N-末端HHH的FCH-296 (SEQID NO: 43)。
使用具有各种N-末端序列的上述FCH-296代替用于实施例5-9的FCH-296 (具有His-标记，SEQ ID NO: 21)，进行在实施例5-9中描述的实验。具有各种N-末端序列的FCH-296具有与FCH-296相同的效果。
工业实用性
依据本发明，提供了在短时间内产生大量干细胞的方法和用于该方法的多肽。
序列表自由文本
SEQ ID NO:1；称为III-1的纤连蛋白的分区
SEQ ID NO:2；称为III-2的纤连蛋白的分区
SEQ ID NO:3；称为III-3的纤连蛋白的分区
SEQ ID NO:4；称为III-4的纤连蛋白的分区
SEQ ID NO:5；称为III-5的纤连蛋白的分区
SEQ ID NO:6；称为III-6的纤连蛋白的分区
SEQ ID NO:7；称为III-7的纤连蛋白的分区
SEQ ID NO:8；称为III-8的纤连蛋白的分区
SEQ ID NO:9；称为III-9的纤连蛋白的分区
SEQ ID NO:10；称为III-10的纤连蛋白的分区
SEQ ID NO:11；称为III-11的纤连蛋白的分区
SEQ ID NO:12；称为III-12的纤连蛋白的分区
SEQ ID NO:13；称为III-13的纤连蛋白的分区
SEQ ID NO:14；称为III-14的纤连蛋白的分区
SEQ ID NO:15；称为CS-1的纤连蛋白的分区
SEQ ID NO:16；称为120k-fr的纤连蛋白片段
SEQ ID NO:17；称为CH-271的纤连蛋白片段
SEQ ID NO:18；称为CH-296的纤连蛋白片段(RetroNectin)
SEQ ID NO:19；称为FCH-296的纤连蛋白片段
SEQ ID NO:20；称为DCH-296的纤连蛋白片段
SEQ ID NO:21；His-标记FCH-296
SEQ ID NO:22；His-标记DCH-296
SEQ ID NO:23；N-末端9a.a.缺失的III-1
SEQ ID NO:24；N-末端5a.a.缺失的III-1
SEQ ID NO:25；N-末端3a.a.缺失的III-1
SEQ ID NO:26；His-标记F1CH-296
SEQ ID NO:27；His-标记F2CH-296
SEQ ID NO:28；His-标记F3CH-296
SEQ ID NO:29；N-末端9a.a.缺失的FCH-296
SEQ ID NO:30；N-末端6a.a.缺失的FCH-296
SEQ ID NO:31；N-末端5a.a.缺失的FCH-296
SEQ ID NO:32；N-末端3a.a.缺失的FCH-296
SEQ ID NO:33；N-末端3a.a.插入的FCH-296
SEQ ID NO:34；N-末端6a.a.插入的FCH-296
SEQ ID NO:35；N-末端9a.a.插入的FCH-296
SEQ ID NO:36；N-末端11a.a.插入的FCH-296
SEQ ID NO:37；N-末端12a.a.插入的FCH-296
SEQ ID NO:38；N-末端14a.a.插入的FCH-296
SEQ ID NO:39；N-末端15a.a.插入的FCH-296
SEQ ID NO:40；N-末端HKRHEEGH插入的FCH-296
SEQ ID NO:41；N-末端HKRH插入的FCH-296
SEQ ID NO:42；N-末端HH插入的FCH-296
SEQ ID NO:43；N-末端HHH插入的FCH-296。
Claims (15)
1.一种产生干细胞的方法，该方法包括在以下多肽的存在下培养干细胞的步骤：
(a) 包含选自人纤连蛋白III-1至III-7的重复序列的重组多肽，或包含氨基酸序列的重组多肽，所述氨基酸序列具有在选自III-1至III-7的重复序列的氨基酸序列中的一个或数个氨基酸的置换、缺失、插入或添加；
(b) 包含人纤连蛋白III-8至III-10重复序列的重组多肽，或包含氨基酸序列的重组多肽，所述氨基酸序列具有在III-8至III-10重复序列的氨基酸序列中的一个或数个氨基酸的置换、缺失、插入或添加；和
(c) 包含人纤连蛋白III-12至III-14重复序列的重组多肽，或包含氨基酸序列的重组多肽，所述氨基酸序列具有在III-12至III-14重复序列的氨基酸序列中的一个或数个氨基酸的置换、缺失、插入或添加。
2.依据权利要求1的产生方法，其包括在重组多肽的存在下培养干细胞的步骤，所述重组多肽包括在相同的分子中的重组多肽(a)、(b)和(c)。
3.依据权利要求1或2的产生方法，其中重组多肽(a)是包含人纤连蛋白III-1至III-3重复序列或III-4至III-6重复序列的重组多肽，或包含氨基酸序列的重组多肽，所述氨基酸序列具有在III-1至III-3重复序列或III-4至III-6重复序列的氨基酸序列中的一个或数个氨基酸的置换、缺失、插入或添加。
4. 依据权利要求3的产生方法，其中重组多肽是包含SEQ ID NO: 19或20的氨基酸序列的重组多肽；或包含氨基酸序列的重组多肽，所述氨基酸序列具有在SEQ ID NO: 19或20的氨基酸序列中的一个或数个氨基酸的置换、缺失、插入或添加。
5.依据权利要求1-4的任一项的产生方法，其中在重组多肽的存在下培养干细胞的步骤在包被有重组多肽的固相与干细胞接触的情况下进行。
6.依据权利要求5的产生方法，其中固相是用于细胞培养的装置或用于细胞培养的载体。
7.依据权利要求5的产生方法，其中固相是皿、平板、瓶、袋、珠、膜或载玻片。
8.依据权利要求1-7的任一项的产生方法，其中干细胞是源自人的多能干细胞或神经干细胞。
9.依据权利要求8的产生方法，其中多能干细胞是诱导的多能干细胞。
10.一种重组多肽，其包含在相同分子中的以下多肽：
(a) 包含选自人纤连蛋白III-1至III-7的重复序列的重组多肽，或包含氨基酸序列的重组多肽，所述氨基酸序列具有在选自III-1至III-7的重复序列的氨基酸序列中的一个或数个氨基酸的置换、缺失、插入或添加；
(b) 包含人纤连蛋白III-8至III-10重复序列的重组多肽，或包含氨基酸序列的重组多肽，所述氨基酸序列具有在III-8至III-10重复序列的氨基酸序列中的一个或数个氨基酸的置换、缺失、插入或添加；和
(c) 包含人纤连蛋白III-12至III-14重复序列的重组多肽，或包含氨基酸序列的重组多肽，所述氨基酸序列具有在III-12至III-14重复序列的氨基酸序列中的一个或数个氨基酸的置换、缺失、插入或添加。
11.依据权利要求10的多肽，其中重组多肽(a)是包含人纤连蛋白III-1至III-3重复序列或III-4至III-6重复序列的重组多肽，或包含氨基酸序列的重组多肽，所述氨基酸序列具有在III-1至III-3重复序列或III-4至III-6重复序列的氨基酸序列中的一个或数个氨基酸的置换、缺失、插入或添加。
12. 依据权利要求10的重组多肽，其是包含SEQ ID NO: 19或20的氨基酸序列的重组多肽；或包含氨基酸序列的重组多肽，所述氨基酸序列具有在SEQ ID NO: 19或20的氨基酸序列中的一个或数个氨基酸的置换、缺失、插入或添加。
13.一种固相，其包被有依据权利要求10-12的任一项的重组多肽。
14.依据权利要求13的固相，其是包被有重组多肽的用于细胞培养的装置或用于细胞培养的载体。
15.依据权利要求13的固相，其是包被有重组多肽的皿、平板、瓶、袋、珠、膜或载玻片。
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