CN111701075A - 一种软骨修复材料、软骨重建生物支架及制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种软骨修复材料、软骨重建生物支架及制备方法，软骨修复材料包括生物基质和固化液，其中，生物基质包括胶原蛋白、纤连蛋白和软骨形态发生蛋白，混合制成溶液或冻干粉形式进行使用；固化液包括DMEM培养基、血清和Hepes缓冲液；使用时，既可以将生物基质和固化液混合后直接填充到软骨缺损处，也可以在体外预先固化成型，做成软骨重建生物支架，再用于软骨贴补。使用时，还可以包括软骨细胞或干细胞，从而进一步提高软骨修复材料的分化能力。本发明的有益效果是：能够有效填充软骨上的缺损，保证机械强度的同时还具有软骨传导和诱导能力；另外软骨修复材料能够保持被移植的软骨细胞在缺损位置上有长久保留并保持分化能力，促进其再生。

Description

一种软骨修复材料、软骨重建生物支架及制备方法
技术领域
本发明属于组织工程及再生医学领域，尤其是涉及一种软骨修复材料、软骨重建生物支架及制备方法。
背景技术
运动医学是一门新兴的综合性应用学科，主要涉及膝，肩，踝，肘等关节损伤和骨关节病。特别是关节软骨损伤，是一种普遍的，对病人造成很大痛苦的病症。骨头和软骨的损伤是关节炎的发病机理，并且是外伤伤势和内假肢松动方面的重要因素。此类疾病可以通过自体组织或者同源异体材料及可替代的材料进行相应的治疗。自体材料及同源异体材料受到材料来源及感染的风险无法规模化应用及医学转化，因此可替代材料成为了行业发展的趋势。如在硬骨成型及再造方面美国Medtronic，Inc公司的INFUSE Bone Graft、华东医药集团的“骨诱导”等产品都做了较大的贡献。同时专利CN106421901A公布一种可注射兼具缓释性能的骨修复生物活性材料及其制备方法，弥补了硬骨再造方面可注射修复的缺损。在软骨重建方面，利用同体的软骨移植(ACT)技术对软骨损伤进行治疗的方法，首次证实在损伤的关节软骨中有透明软骨的再生。但是受限于自体软骨细胞培养时间较长，及操作难度较大等问题，仅限于实验室研究，无法应用于临床。同时在软骨可替代材料方面，诸如由聚-D-丙交酯，多聚-L-丙交酯，多聚-D、L- 丙交酯，羟磷灰石，磷酸钙形成的可替代材料；由I、II型胶原蛋白形成的纳米微球型软骨修复材料；由胶原蛋白形成的三维网络支架等新型材料在软骨修复及重建的过程中都做了一定的贡献。
但是以上的材料，都存在着以下几个方面的问题。首先，可替代的材料或支架缺乏软骨的传导及诱导能力，缺乏一定的机械强度；同时，作为支架材料，被移植或者培养的软骨细胞无法重新达到其原来的合成性，能即软骨细胞(P0)会在体外的培养条件下去分化，从而丢失胶原蛋白的合成性能。在迄今为止的方法中，用于培养软骨细胞的已知的三维结构无法专门适应每一种软骨缺损。此外，也无法保证被移植的软骨细胞在缺损的位置上长久并且保持分化能力，从而使软骨再生。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种软骨修复材料、软骨重建生物支架及制备方法。
本发明采用的技术方案是：一种软骨修复材料，包括生物基质和固化液，
生物基质由胶原蛋白、纤连蛋白和软骨形态发生蛋白组成；
固化液包括DMEM培养基、血清和Hepes缓冲液。
优选地，还包括软骨细胞或干细胞。
优选地，胶原蛋白为I型胶原蛋白，I型胶原蛋白为鼠尾胶原、牛跟腱胶原或重组人胶原蛋白，I型胶原蛋白浓度为2-10mg/mL，优选为4-8mg/mL，进一步优选为6mg-7mg/mL。
优选地，I型胶原蛋白为鼠尾胶原，制备方法如下：
取鼠尾表皮杀菌处理，取鼠尾中间段尾腱，并去除尾腱上多余的多糖及脂肪得到预处理尾腱；
向预处理尾腱中加入预冷醋酸，再加入胃蛋白酶，低温震荡反应至溶液澄清透明，离心取上清；
向上清液中加入氯化钠析出并收集蛋白沉淀，再通过透析纯化沉淀物得到鼠尾胶原；
优选地，按照投料比为1:10-100向预处理尾腱中加入0.01-0.1M预冷醋酸；
优选地，胃蛋白酶添加量为体积比0.5-5％；
优选地，收集蛋白沉淀具体为：向上清液中加入2M氯化钠，沉淀2-8h，离心去上清后向沉淀物中再次加入0.01-0.1M预冷醋酸重悬溶解，再重复加入2M 氯化钠析出并重新收集蛋白沉淀；
优选地，采用30-50KDa透析膜。
优选地，纤连蛋白为重组人源截断型胶原蛋白或猪血纤连蛋白，含量为 100-1000ug/mL。
优选地，纤连蛋白为重组人源截断型胶原蛋白，序列如SEQ NO：1所示。
优选地，软骨形态发生蛋白为软骨组织提取物或重组人软骨源性形态发生蛋白，重组人软骨源性形态发生蛋白为CDMP1或CDMP2，含量为10-200ng/mL，优选为80-120ng/mL。
优选地，软骨形态发生蛋白为重组人软骨源性形态发生蛋白CDMP1，序列如SEQNO：2所示。
优选地，固化液为由50-80％的2×DMEM培养基、10-30％的血清、1-5％的 10-50mM的Hepes缓冲液组成的溶液；
优选地，固化液为由75-80％的2×DMEM培养基、15-25％的血清、2-4％的 20-30mM的Hepes缓冲液组成的溶液，其中血清进一步优选为20％，Hepes缓冲液进一步优选为3％。
由软骨修复材料体外构建软骨重建生物支架的方法，向固化液中按照1:1体积比添加生物基质，
混匀后转入模具固化培养，修剪后形成能够用于软骨损伤修复的软骨重建生物支架；
或，混匀后作为3D打印生物墨水，根据损伤三维结构3D打印得到软骨重建生物支架。
优选地，预先使用固化液重悬软骨细胞或干细胞，细胞浓度为2×105/mL，再加入生物基质。
使用软骨重建生物支架构建方法构建得到的软骨重建生物支架在软骨修复中的应用，将软骨重建生物支架通过生物胶贴敷于软骨损伤区，优选地，生物胶为纤维蛋白连接胶。
包括软骨修复材料的注射型软骨修复材料，隔离储存生物基质和固化液，使用前混合并填充到软骨损伤处。
软骨修复材料在美容整形中面部和胸部的修补材料中的应用。
本发明具有的优点和积极效果是：使用本发明所涉及的软骨修复材料，使得医生能够更好的处理软骨疾病，尤其针对软骨缺损，能够有效填充软骨上的缺损，保证机械强度的同时还具有软骨传导和诱导能力；另外本发明所涉及的软骨修复材料能够保持被移植的软骨细胞在缺损位置上有长久保留并保持分化能力，促进其再生；由软骨修复材料制得的软骨生物修复支架，可以解决待移植细胞的去分化的问题，去分化的移植细胞在本发明的支架中进行预培养仍然具备再分化及代谢功能。
具体实施方式
本发明涉及一种软骨修复材料，包括生物基质和固化液，其中，生物基质包括胶原蛋白、纤连蛋白和软骨形态发生蛋白，混合制成溶液或冻干粉形式进行使用；固化液包括DMEM培养基、血清和Hepes缓冲液。使用时，既可以将生物基质和固化液混合后直接填充到软骨缺损处，也可以在体外预先固化成型，做成软骨重建生物支架，再用于软骨贴补。使用时，还可以包括软骨细胞或干细胞，从而进一步提高软骨修复材料的分化能力。本发明的工作机理为，利用胶原蛋白配合固化液形成三维骨架结构，填充于软骨缺损处，或通过移植的软骨细胞重建软骨，通过纤维连接蛋白及软骨形态发生蛋白诱导、迁移、分化软骨细胞或干细胞爬行实现软骨修复。
本发明某些实施例中，胶原蛋白为I型胶原蛋白，I型胶原蛋白为鼠尾胶原、牛跟腱胶原或重组人胶原蛋白，I型胶原蛋白浓度为2-10mg/mL，优选为 4-8mg/mL，进一步优选为6mg-7mg/mL。鼠尾胶原、牛跟腱胶原以及重组人胶原蛋白均可选用现有已知生物材料。
本发明某些实施例中，I型胶原蛋白采用鼠尾胶原时，因其胶原蛋白的三螺旋结构及生物功能，其机械性能更佳。为了提高鼠尾胶原的收率和纯度，本发明可采用醋酸和胃蛋白酶同时处理鼠尾制备鼠尾胶原，先取鼠尾表皮杀菌处理，取鼠尾中间段尾腱，并去除尾腱上多余的多糖及脂肪得到预处理尾腱；再向预处理尾腱中加入预冷醋酸，再加入胃蛋白酶，低温震荡反应至溶液澄清透明，离心取上清；向上清液中加入氯化钠析出并收集蛋白沉淀，再通过透析纯化沉淀物得到鼠尾胶原；具体步骤如下：
1在万级净化环境中，将鼠尾浸泡于-20℃的75％乙醇溶液或者3％的过氧化氢溶液中5-10min，用以表皮的杀菌处理。
2剥离表皮，去头、尾留取中间段，抽取银白色尾腱。按投料比1:10加入含有1MNaCL的0.05M Tris-HCL溶液(pH7.5)浸泡24h，以脱除尾键多余的多糖及脂肪，过滤去除滤液。
3按投料比为1：10-100向预处理后的银白色尾腱中加入0.01-0.1M的预冷的醋酸溶液中，按体积比加0.5-5％的胃蛋白酶，4℃低温震荡反应24-96h，至溶液逐渐澄清透明；在4℃条件下，5000g离心20min，取上清液；
4加入氯化钠至浓度为2M，沉淀2-8小时，5000g，离心20分钟去上清收集沉淀；再次使用上述醋酸溶液充悬溶解，加入氯化钠至浓度为2M充分混匀，沉淀2-8小时，5000g，离心20分钟收集沉淀
5采用30-50KDa透析膜，在上述醋酸缓冲液中透析1-3天，每天更换透析液3次；以脱除无机盐及小分子胶原。
本发明某些实施例中，I型胶原蛋白采用重组人胶原蛋白，将I型胶原蛋白、 II型胶原蛋白和功能蛋白拼接在一起形成，具体结构为3Cg2-ET-Cg1-ET-3Cg2，蛋白序列如SEQNO：4所示，其对应的优化后的DNA编码序列为SEQ NO：5 所示。
SEQ NO：4
GPPGPCCGGGGPPGPCCGGGGPPGPCCGGGVPGVGPPGEPGNPGKPGSPGPA GSNGEPGPAGSPGEKGSQGSNGNPGPAGNQGQPGNKGSPGNPGKPGEPGSNG PQGEPGSQGNPGKNGQPGSPGSQGSPGNQGQPGKPGQPGEQGSPGNQGPAGN EGPKGQPGQNGKPVPGVGGPPGPCCGGGGPPGPCCGGGGPPGPCCGGG
SEQ NO：5
ATGGGTCCGCCGGGTCCGTGCTGCGGTGGTGGTGGTCCGCCGGGTCCGTG CTGCGGTGGTGGTGGTCCGCCGGGTCCGTGCTGCGGTGGTGGTGTTCCGG GTGTTGGTCCGCCGGGTGAACCGGGTAACCCGGGTAAACCGGGTTCTCCG GGTCCGGCTGGTTCTAACGGTGAACCGGGTCCGGCTGGTTCTCCGGGTGA AAAAGGTTCTCAGGGTTCTAACGGTAACCCGGGTCCGGCTGGTAACCAGG GTCAGCCGGGTAACAAAGGTTCTCCGGGTAACCCGGGTAAACCGGGTGAA CCGGGTTCTAACGGTCCGCAGGGTGAACCGGGTTCTCAGGGTAACCCGGG TAAAAACGGTCAGCCGGGTTCTCCGGGTTCTCAGGGTTCTCCGGGTAACCA GGGTCAGCCGGGTAAACCGGGTCAGCCGGGTGAACAGGGTTCTCCGGGTA ACCAGGGTCCGGCTGGTAACGAAGGTCCGAAAGGTCAGCCGGGTCAGAA CGGTAAACCGGTTCCGGGTGTTGGTGGTCCGCCGGGTCCGTGCTGCGGTG GTGGTGGTCCGCCGGGTCCGTGCTGCGGTGGTGGTGGTCCGCCGGGTCCG TGCTGCGGTGGTGGTTAA
本发明某些实施例中，纤连蛋白为重组人源截断型胶原蛋白或猪血中提取的纤连蛋白，含量为100-1000ug/mL，优选为重组人源截断型胶原蛋白，重组人源截短型纤连蛋白为根据纤连蛋白的结构进行重新编码的蛋白序列，其蛋白序列如 SEQ NO：1所示。上述序列经密码子优化后插入pET28a载体进行检验，经原核表达、纯化后使用，检测其分子量约为60KDa。
SEQ NO：1rhFn
PTDLRFTNIGPDTMRVTWAPPPSIDLTNFLVRYSPVKNEEDVAELSISPSDNAV VLTNLLPGTEYVVSVSSVYEQHESTPLRGRQKTGLDSPTGIDFSDITANSFTVH WIAPRATITGYRIRHHPEHFSGRPREDRVPHSRNSITLTNLTPGTEYVVSIVAL NGREESPLLIGQQSTVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGE TGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINY RTEIDKPSMAIPAPTDLKFTQVTPTSLSAQWTPPNVQLTGYRVRVTPKEKTGP MKEINLAPDSSSVVVSGLMVATKYEVSVYALKDTLTSRPAQGVVTTLENVSP PRRARVTDATETTITISWRTKTETITGFQVDAVPANGQTPIQRTIKPDVRSYTIT GLQPGTDYKIYLYTLNDNARSSPVVIDASTAIDAPSNLRFLATTPNSLLVSWQ PPRARITGYIIKYEKPGSPPREVVPRPRPGVTEATITGLEPGTEYTIYVIALKNN QKSEPLIGRKKTDELPQLVTLPHPNLHGPEILDVPST
本发明某些实施例中，软骨形态发生蛋白为软骨组织提取物或重组人软骨源性形态发生蛋白，重组人软骨源性形态发生蛋白为CDMP1或CDMP2，含量为 10-200ng/mL，优选为80-120ng/mL。
其中，去除蛋白中无功能序列，软骨形态发生蛋白优选为重组人软骨源性形态发生蛋白CDMP1，具体为人源软骨源性形态发生蛋白的成熟肽的阶段截短性序列，序列如SEQNO：2所示。上述序列经密码子优化后插入pET28a载体进行检验，经原核表达、纯化后使用，检测其分子量约为13.2KDa。利用同样的方法制得rhCDMP2，序列如SEQ NO：3所示。经试验比较，rhCDMP1在软骨重建的促进效果上要优于rhCDMP2。
SEQ NO：2rhCDMP1
APLATRQGKRPSKNLKARCSRKALHVNFKDMGWDDWIIAPLEYEAFHCEGL CEFPLRSHLEPTNHAVIQTLMNSMDPESTPPTCCVPTRLSPISILFIDSANNVVY KQYEDMVVESCGCR
SEQ NO：3rhCDMP2
TAFASRHGKRHGKKSRLRCSKKPLHVNFKELGWDDWIIAPLEYEAYHCEGVC DFPLRSHLEPTNHAIIQTLMNSMDPGSTPPSCCVPTKLTPISILYIDAGNNVVYK QYEDMVVESCGCR
固化液为由50-80％的2×DMEM培养基、10-30％的血清、1-5％的10-50mM 的Hepes缓冲液组成的溶液，pH6.8-8.2；进一步地，固化液为由75-80％的 2×DMEM培养基、2-4％的血清、2-4％的20-30mM的Hepes缓冲液组成的溶液， pH7.4-7.6。其中血清进一步优选为20％，Hepes缓冲液进一步优选为3％。
软骨修复材料可以根据临床用途制成软骨重建生物支架及注射型软骨修复材料。其中软骨重建生物支架可用于大面积软骨缺损及软骨再造，注射型软骨修复材料可用于小面积软骨缺损。
本发明某些实施例中，可以由软骨修复材料体外构建软骨重建生物支架，再植入患者体内，用于修复软骨损伤。临床使用过程中可根据需要，向固化液中按照1:1体积比添加生物基质，转入膜具33-35℃固化后无菌培养5-7天，根据损伤情况进行修剪后，使用生物胶贴敷于软骨损伤区域，缝合伤口即可，生物胶可以为纤维蛋白连接胶；或者可将固化液与生物基质的混合液作为3D打印生物墨水，根据损伤三维结构3D打印得到软骨重建生物支架，在无菌条件下培养5-7 后用于软骨修复。在构建体外支架的时候，预先使用固化液重悬软骨细胞或干细胞，使其终浓度达到细胞浓度为2×105/mL，再加入生物基质，能够进一步提高软骨修复材料的分化能力。
本发明某些实施例中，可以将软骨修复材料作为注射软骨修复材料进行使用，分别将生物基质与固化液预灌封到两个密闭的隔离腔室中，放置于 -20℃～-80℃冷冻保存。使用前放置于0℃-4℃环境中解冻，升温至30℃-35℃后连接两个隔离腔室进行混合，填充至软骨损伤处。
本发明某些实施例中，软骨修复材料同样可以作为面部胸部修补材料应用于医美美容整形中的面部、胸部的修补。本发明所涉及胶原制备、rhFn制备工艺同样可以医用于护肤品及创伤性医疗器械。
下面结合实施例对本发明做出进一步说明。
实施例1：鼠尾胶原的制备
1.1在万级净化环境中，将SD大鼠鼠尾浸泡于-20摄氏度的75％乙醇溶液中 10分钟，用以表皮的杀菌处理。剥离表皮，去头、尾留取中间段，抽取银白色尾腱。按投料比1:10加入含有1M NaCL的0.05M Tris-HCL溶液(pH7.5)浸泡 24小时，以脱除尾键多余的多糖及脂肪，过滤去除滤液。
1.2按投料比为1：20向预处理后的银白色尾腱中加入0.05M的预冷的醋酸溶液中，按体积比加2％的胃蛋白酶，4℃低温震荡反应36h，至溶液逐渐澄清透明。在4℃条件下，5000g离心20min，取上清液；
1.3加入氯化钠至浓度为2M，沉淀4小时，5000g，离心20分钟去上清收集沉淀；再次使用上述醋酸溶液充悬溶解，加入氯化钠至浓度为2M充分混匀，沉淀2-8小时，5000g，离心20分钟收集沉淀，重复操作一次。
1.4采用75-100KDa透析膜，在上述醋酸缓冲液中透析1-3天，每天更换透析液3次；以脱除无机盐及小分子胶原。
1.5经SDS-PGAGE电泳检测与标准品一致，产品收率可以控制在40％。
1.6将透析完全的胶原溶液，调整浓度至6mg/mL，作为标准溶液。考虑冻干工艺会影响胶原的三螺旋结构，将标准溶液直接使用或无菌分装后于-20℃冷冻保存，备用。
实施例2：重组人源截短型纤连蛋白rhFn、重组人源截短型软骨形态发生蛋白rhCDMF1的制备
2.1根据GenBank中人源纤连蛋白的全基因序列，进行蛋白功能及结构分析，重构适合软骨细胞分化、迁移、定位的截短型rhFn蛋白序列，序列如SEQ NO： 1所示；
2.2根据GenBank中人源纤连蛋白的全基因序列，进行蛋白功能及结构分析，重构适合软骨细胞分化、迁移、定位的截短型rhCDMP1蛋白序列，序列如 SEQ NO：2所示；
2.3将rhFn蛋白序列、rhCDMP1蛋白序列根据原核细胞密码子偏好性进行编译DNA序列，上述序列经密码子优化后插入pET28a载体，经原核表达、纯化后使用。
2.4经SDS-PAGE电泳检测，rhFN分子量约为60kda，rhCDMP1分子量为 13.2Kda，与理论值一致；经CE电泳检测两种的蛋白的纯度均大于99％。
2.5将纯化后的蛋白，经冻干工艺冻干，-80℃保存备用。
实施例3注射型软骨修复材料的制备
3.1生物基质的制备
取实施例1中标准胶原溶液100ml，定量加入实施例2的rhFN中至其浓度为100ug/mL，再加入rhCDMP1至其浓度为100ng/mL；根据实际用量进行无菌分装，于-20℃冷冻保存。
3.2固化液的制备
取75ml的2×DMEM培养基加入20％血清混合均一后，加入预先配置的 25uM的Hepes缓冲液(pH7.6)5ml，充分混匀，过滤除菌后，根据实际用量进行无菌分装，于-20℃冷冻保存。
3.3直接将生物基质、固化液无菌灌注于预灌封注射器的双腔中，旋紧无菌封头，与混合腔、注射腔一起置于铝箔泡罩内，-20℃冷冻保存极为注射型软骨生物修复材料。
实施例4软骨重建生物支架的制备
生物基质和固化液的制备可与实施例3相同。
取生物基质与固化液在百级环境下，4℃进行解冻。取固化液50mL，加入软骨细胞或干细胞，至细胞浓度为2×105/mL，使用移液器轻柔混匀。加入等量的生物基质溶液，充分混匀后，转移至特定的模具内，37℃进行凝胶相变为固态凝胶。转移至细胞培养箱中培养一周，即可根据软骨缺损进行修剪后再生物胶的作用下，粘结到缺损区。
将培养一周后的胶原块，无菌切除1×1cm大小，抽提RNA，分别利用I型胶原蛋白、II型胶原蛋白、CDMP1的核酸探针进行RT-PCR检测各个细胞因子的表达丰度，证实在本发明的生物支架中预培养的软骨细胞具备初代细胞的分化能力及细胞代谢功能。
表1软骨细胞在生物支架中培养情况
Figure BDA0002554596830000101
软骨细胞与其他细胞相比的非常难以培养，常规条件下的体外培养的软骨细胞处于去分化状态，在形态和生理上与成纤维细胞相似，丧失初代软骨细胞(从软骨组织中分离)的细胞功能及代谢能力。结合实验结果可以明确，初代软骨细胞(P0) 在体外培养过程中，所形成的P1及P2都存在明显的去分化现象，丢失初代软骨细胞合成I、II型胶原的细胞代谢能力；进一步地，利用本实施例软骨再生生物支架共培养的软骨细胞，因特殊的三维结构，再现软骨细胞的分化的微环境，进而保留了初代细胞的再分化及代谢能力。
实施例5软骨重建生物支架的制备
生物基质和固化液的制备可与实施例3相同。
取生物基质和固化液按照实施例4中方法解冻并混合，将混匀后的软骨修复材料溶液作为3D打印生物墨水，根据损伤的三维结构进行3D打印后，在无菌条件下培养5-7后，应用软骨修复。
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。
Figure BDA0002554596830000121
Figure BDA0002554596830000131
Figure BDA0002554596830000141
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Figure BDA0002554596830000171
Figure BDA0002554596830000181
。

Claims (10)

1.一种软骨修复材料，其特征在于：包括生物基质和固化液，
生物基质由胶原蛋白、纤连蛋白和软骨形态发生蛋白组成；
固化液包括DMEM培养基、血清和Hepes缓冲液。
2.根据权利要求1所述的软骨修复材料，其特征在于：还包括软骨细胞或干细胞。
3.根据权利要求1或2所述的软骨修复材料，其特征在于：所述胶原蛋白为I型胶原蛋白，所述I型胶原蛋白为鼠尾胶原、牛跟腱胶原或重组人胶原蛋白，所述I型胶原蛋白浓度为2-10mg/mL，优选为4-8mg/mL，进一步优选为6mg-7mg/mL；优选地，所述I型胶原蛋白为鼠尾胶原，制备方法如下：
取鼠尾表皮杀菌处理，取鼠尾中间段尾腱，并去除尾腱上多余的多糖及脂肪得到预处理尾腱；
向预处理尾腱中加入预冷醋酸，再加入胃蛋白酶，低温震荡反应至溶液澄清透明，离心取上清；
向上清液中加入氯化钠析出并收集蛋白沉淀，再通过透析纯化沉淀物得到鼠尾胶原；
优选地，按照投料比为1:10-100向预处理尾腱中加入0.01-0.1M预冷醋酸；
优选地，胃蛋白酶添加量为体积比0.5-5％；
优选地，收集蛋白沉淀具体为：向上清液中加入2M氯化钠，沉淀2-8h，离心去上清后向沉淀物中再次加入0.01-0.1M预冷醋酸重悬溶解，再重复加入2M氯化钠析出并重新收集蛋白沉淀；
优选地，采用30-50KDa透析膜。
4.根据权利要求1或2所述的软骨修复材料，其特征在于：所述纤连蛋白为重组人源截断型胶原蛋白或猪血纤连蛋白，含量为100-1000ug/mL。
优选地，所述纤连蛋白为重组人源截断型胶原蛋白，序列如SEQ NO：1所示。
5.根据权利要求1或2所述的软骨修复材料，其特征在于：所述软骨形态发生蛋白为软骨组织提取物或重组人软骨源性形态发生蛋白，所述重组人软骨源性形态发生蛋白为CDMP1或CDMP2，含量为10-200ng/mL，优选为80-120ng/mL。优选地，所述软骨形态发生蛋白为重组人软骨源性形态发生蛋白CDMP1，序列如SEQ NO：2所示。
6.根据权利要求1或2所述软骨修复材料，其特征在于：固化液为由50-80％的2×DMEM培养基、10-30％的血清、1-5％的10-50mM的Hepes缓冲液组成的溶液；
优选地，固化液为由75-80％的2×DMEM培养基、15-25％的血清、2-4％的20-30mM的Hepes缓冲液组成的溶液。
7.由权利要求1-6中任一所述软骨修复材料体外构建软骨重建生物支架的方法，其特征在于：向固化液中添加生物基质，
混匀后转入模具固化培养，修剪后形成能够用于软骨损伤修复的软骨重建生物支架；优选地，预先使用固化液重悬软骨细胞或干细胞，再加入生物基质。
或，混匀后作为3D打印生物墨水，根据损伤三维结构3D打印得到软骨重建生物支架。
8.使用权利要求7所述的软骨重建生物支架构建方法构建得到的软骨重建生物支架在软骨修复中的应用，其特征在于：将软骨重建生物支架通过生物胶贴敷于软骨损伤区，优选地，生物胶为纤维蛋白连接胶。
9.包括权利要求1-6中任一所述软骨修复材料的注射型软骨修复材料，其特征在于：隔离储存生物基质和固化液，使用前混合并填充到软骨损伤处。
10.权利要求1-6中任一所述的软骨修复材料在美容整形中面部和胸部的修补材料中的应用。
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